CN116554358A - 一种乙型脑炎疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型脑炎E重组蛋白，所述的乙型脑炎E重组蛋白包括乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2，所述乙型脑炎E重组蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙型脑炎E重组蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明同时公开了一种乙型脑炎亚单位疫苗，所述的疫苗含有所述的乙型脑炎E重组蛋白1或乙型脑炎E重组蛋白2。本发明制备的乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2均具有良好的免疫原性，且乙型脑炎E重组蛋白2较乙型脑炎E重组蛋白1具有更好的免疫原性。因此，本发明公开的这2个乙型脑炎E重组蛋白均可以作为乙型脑炎亚单位疫苗的重要的备选抗原，为乙型脑炎亚单位疫苗的研发提供重要的参考和借鉴。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种乙型脑炎疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
流行性乙型脑炎，又称日本乙型脑炎，简称乙脑，是由黄病毒科乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的人畜共患急性蚊媒病毒性传染病，发病高峰在蚊虫滋生的7-9月。乙脑最早发现于日本。1871年才对该病有了初步的临床认识。乙脑对生猪养殖行业造成严重危害的重大疫病，主要影响母猪的繁殖性能，如妊娠母猪发生流产、死胎和木乃伊胎，公猪发生睾丸炎，可引起成年猪和育肥猪的持续高热，导致新生仔猪发生脑炎。
1935年，日本学者首次分离到JEV。1940年我国分离到JEV。JEV属于黄病毒科、黄病毒属，黄病毒属包含超过70种病毒，最主要的是导致人致病的黄热病毒(YFV)、JEV、西尼罗病毒(WNV)和登革热病毒(DV)。JEV分3个血清型：JaGAr、Nakayama和Mie(IntermediateType)，它们的生物学特性(包括生长特性和毒力)不同。
JEV是单股正链RNA病毒，基因组长度为11kb，基因组结构如下图所示(图2)，JEV至少编码三种结构蛋白：核心蛋白(C)、膜蛋白(pr M/M)以及囊膜糖蛋白(E)。C蛋白C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，有助装配成包裹基因组的核衣壳，使之免受核酸酶的破坏。M蛋白的前体蛋白Pr M对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配至关重要。E蛋白，主要结构蛋白是病毒粒子表面最重要的成分，它与病毒的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。
现阶段针对JEV的防控主要是灭活疫苗和活疫苗，如地鼠肾细胞灭活疫苗、地鼠肾细胞减毒活疫苗。但是由于地鼠肾原代细胞基质缺乏WHO的认证，目前该疫苗主要在我国和韩国使用。因此，急需开发一种新型的乙型脑炎疫苗。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乙型脑炎乙型脑炎E重组蛋白及其制备方法和应用。
因此，本发明一方面提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为乙型脑炎E重组蛋白，所述的乙型脑炎E重组蛋白包括乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2，所述乙型脑炎E重组蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙型脑炎E重组蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，本发明所述的乙型脑炎E重组蛋白2由B细胞抗原表位、结合MHC I类分子的抗原表位、乙型脑炎E重组蛋白1的aa3～aa400、诱导产生IFN-γ的抗原表位、6His标签以及连接子组成。
优选地，本发明所述的B细胞抗原表位的氨基酸序列为SEKIFEIRFETNDK KS。
优选地，本发明所述的结合MHC I类分子的抗原表位的氨基酸序列为YTY NFDFDY。
优选地，本发明所述的诱导产生IFN-γ的抗原表位的氨基酸序列分别为LKPLKFNTE。
优选地，本发明所述的连接子的氨基酸序列分别为GGGGSGGGGS。
再一方面，本发明还提供了一种乙型脑炎亚单位疫苗，所述的疫苗含有所述的乙型脑炎E重组蛋白1。
再一方面，本发明还提供了一种乙型脑炎亚单位疫苗，所述的疫苗含有所述的乙型脑炎E重组蛋白2。
本发明制备的乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2均具有良好的免疫原性，且乙型脑炎E重组蛋白2较乙型脑炎E重组蛋白1具有更好的免疫原性。因此，本发明公开的这2个乙型脑炎E重组蛋白均可以作为乙型脑炎亚单位疫苗的重要的备选抗原，为乙型脑炎亚单位疫苗的研发提供重要的参考和借鉴。
附图说明
图1乙型脑炎E蛋白跨膜区分析结果。Inside表示胞内区，inside数值越大，表示该氨基酸位于胞内区的可能性越大；Outside表示胞外区，outside数值越大，表示该氨基酸位于胞外区的可能性越大；Transmembrane表示跨膜区，Transme mbrane数值越大，表示该氨基酸在跨膜区的可能性越大。
图2乙型脑炎E重组蛋白2的SDS-PAGE图，其中1是纯化后的乙型脑炎E重组蛋白2。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：乙型脑炎E重组蛋白的制备
1.1乙型脑炎E重组蛋白1的制备
从NCBI中选择一株近年分离鉴定毒株的E蛋白(GenBank:UQR78754.1)，对其跨膜区进行分析，结果如图1所示，N端450氨基酸为胞外区，因此，去除N端451～500氨基酸，对剩余的450氨基酸的蛋白(SEQ ID NO.1所示，为区别后续重组蛋白，将其命名为乙型脑炎E重组蛋白1)进行重组蛋白的制备(制备时在C端增加6His标签，以方便纯化)。
使用常规的昆虫杆状病毒表达体系对上述的乙型脑炎E重组蛋白1进行表达。简述如下：
选用密码子优化的乙型脑炎E重组蛋白1核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)，以此为模板，插入BamHI和XhoI酶切位点及6His标签，然后将目的基因和载体pFastBac1进行双酶切，连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取阳性菌扩增培养并提取重组质粒(pFastBac1-E1)，将鉴定阳性的重组质粒加入E.coli DH10Bac感受态细胞中进行转座，选取白斑菌鉴定培养获得重组Bac mid。在转染试剂Cellfectin ReagentⅡ的作用下，转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒种毒。
将Bac-PEDV-E1病毒液接种细胞悬液，按MOI＝1的比例接种于生长状态良好SF9细胞(汇合度＞80％)，于28℃、120rpm振荡培养96小时，若细胞出现明显病变(细胞变大变圆)，收集细胞培养液，6000r/min 4℃离心10分钟，取上清备用；用镍柱纯化蛋白，用400mM咪唑溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；透析换液后过0.22μm滤膜除菌，置于-80℃保存备用。
经过上述步骤，虽然能成功的制备、纯化得到乙型脑炎E重组蛋白1，但是产量较低(＜50mg/L)，可溶性较差。因此，乙型脑炎E重组蛋白1在乙型脑炎的疫苗中的应用有限(成本较高，配制成疫苗稳定性较差)。因此，本研究人员在该工作的基础上，对乙型脑炎E重组蛋白1进行进一步的研究和分析。
1.2乙型脑炎E重组蛋白2的制备
在乙型脑炎E重组蛋白1的基础上，通过软件分析以及实际表达验证，进一步截短蛋白，先去除N端的2个氨基酸，再去除C端的50个氨基酸(即保留乙型脑炎E重组蛋白1的aa3～aa400)；同时为了增强重组蛋白的免疫原性，在N端增加B细胞抗原表位(氨基酸序列为SEKIFEIRFETNDKKS)和结合MHC I类分子的抗原表位(氨基酸序列为YTYNFDFDY)，C端增加诱导产生IFN-γ的抗原表位(氨基酸序列为LKPLKFNTE)和6His标签，其与主蛋白之间用连接子(氨基酸序列为GGGGSGGGGS)连接。经过该设计的蛋白命名为乙型脑炎E重组蛋白2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
按照1.1的方法使用昆虫杆状病毒系统制备乙型脑炎E重组蛋白2，其密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。经此方法制备的乙型脑炎E重组蛋白2的SDS-PAGE纯度能达到90％以上(图2所示)，SDS-PAGE分子量(图2所示)约为55KD(比预测略大，为部分糖基化导致)；经过计算，乙型脑炎E重组蛋白2在该系统中的表达量能达到100～150mg/L，且可溶性较好，使用常规的PBS缓冲液即可溶解，因此，乙型脑炎E重组蛋白2较乙型脑炎E重组蛋白1具有更高的表达产量和更好的可溶性，在制备亚单位疫苗时具有较好的优势。
实施例2：乙型脑炎亚单位疫苗的制备
将实施例1制备的乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2分别稀释至100μg/ml，分别取稀释后的重组蛋白200ml，分别按照质量比1:1的比例与ISA 201VG佐剂(购自法国赛彼克公司)乳化制备疫苗，每批疫苗制备约400ml疫苗，其中疫苗中含乙型脑炎E重组蛋白1或乙型脑炎E重组蛋白2浓度均约为50μg/ml。按照现行《中国兽药典》附录进行检验，两组疫苗检验结果符合要求。将检验合格的疫苗置于2～8℃保存备用。
实施例3：与市场疫苗的比较研究
3.1安全性试验
将制备的两组疫苗(试验组)与市售的弱毒疫苗(由武汉科前生物生产，由猪乙型脑炎活疫苗SA-14-14-2株制得，可市售购得)分别免疫30～45周龄仔猪，每组5头，每头颈部肌肉注射相应疫苗4.0ml，注射后，每天检测体温，连续检测7日；并每天观察猪只健康状态，连续观察14日。
结果显示，三组疫苗的安全性均合格，注射后，体温保存稳定(均在38.9℃～39.6℃之间)，在观察的14日内，猪只精神、食欲正常，未见异常，且注射部位均无肉眼可见的异常(如肿胀、结节、溃烂等)。
3.2效力试验
将制备的两组疫苗(试验组)与市售的弱毒疫苗(由武汉科前生物生产，由猪乙型脑炎活疫苗SA-14-14-2株制得，可市售购得)分别免疫30～45周龄仔猪，每组5头，两组试验疫苗每头颈部肌肉注射2.0ml(对照疫苗按照说明书免疫一头份)，同时设置5头不免疫作为对照组，在免疫后2周以相同途径和剂量进行二免。在免疫前、二免前和二免后14日采血进行中和抗体检测。
结果显示：三组疫苗免疫组在二免前(一免14日)的中和抗体效价基本相当；但是在二免14日，乙型脑炎E重组蛋白1疫苗组的中和抗体与对照疫苗组基本相当，而乙型脑炎E重组蛋白2疫苗组较另外两组免疫组的中和抗体要高。说明，本发明制备的乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2均具有良好的免疫效果，且乙型脑炎E重组蛋白2具有更好的免疫效果，适合大规模推广应用。结果如表1所示。
表1免疫后中和抗体检测结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种重组蛋白，所述重组蛋白为乙型脑炎E重组蛋白，其特征在于，所述的乙型脑炎E重组蛋白包括乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2，所述乙型脑炎E重组蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙型脑炎E重组蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的乙型脑炎E重组蛋白2由B细胞抗原表位、结合MHCI类分子的抗原表位、乙型脑炎E重组蛋白1的aa3～aa400、诱导产生IFN-γ的抗原表位、6His标签以及连接子组成。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述的B细胞抗原表位的氨基酸序列为SEKIFEIRFETNDKKS。
4.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述的结合MHCI类分子的抗原表位的氨基酸序列为YTYNFDFDY。
5.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述的诱导产生IFN-γ的抗原表位的氨基酸序列分别为LKPLKFNTE。
6.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述的连接子的氨基酸序列分别为GGGGSGGGGS。
7.一种乙型脑炎亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有权利要求1所述的乙型脑炎E重组蛋白1。
8.一种乙型脑炎亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有权利要求1所述的乙型脑炎E重组蛋白2。
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