TW202404629A - 用於針對輪狀病毒疫苗接種之免疫原性組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含以重組方式構築之多肽的免疫原性組合物，其適用於製備尤其用於減少由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵的疫苗。更特定言之，本發明係針對一種免疫原性組合物，其含有：(i)在N端至C端方向上包含(A)輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段及(B)諸如例如IgG Fc片段之免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白；及(ii)不同於該融合蛋白的免疫原性物質，其中該免疫原性組合物適用於一種減少由豬的輪狀病毒感染引起的一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中。

Description

用於針對輪狀病毒疫苗接種之免疫原性組合物
本發明係關於包含以重組方式構築之多肽的免疫原性組合物，其適用於減少由輪狀病毒感染引起的一或多個臨床病徵。更特定言之，本發明係針對一種免疫原性組合物，其含有：(i)在N端至C端方向上包含(A)輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段及(B)諸如IgG Fc片段之免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白；及(ii)不同於該融合蛋白的免疫原性物質，其中該免疫原性組合物適用於一種減少由豬的輪狀病毒感染引起的一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中。
輪狀病毒為包含呼腸孤病毒科( Reoviridae)內之病毒屬的雙股RNA病毒。已知輪狀病毒感染會引起腸胃疾病且被視為嬰兒之胃腸炎的最常見病因。輪狀病毒係藉由糞便-經口途徑傳播且感染穿過小腸之細胞。受感染細胞產生腸毒素，其誘發胃腸炎，導致嚴重腹瀉且有時脫水死亡。
輪狀病毒具有由11個雙股RNA (dsRNA)區段構成之基因體，且當前基於如由國際病毒分類委員會(International Commitee on Taxonomy of Viruses；ICTV)定義且由Matthijnssens等人(Arch Virol 157:1177-1182 (2012))概述之內部病毒衣殼蛋白6 (VP6)之抗原特性及基於序列之分類分為八組(A-H)，其中本文所提及之此公開案及以下公開案以全文引用之方式併入。
輪狀病毒之基因體編碼六種結構蛋白(VP1至VP4、VP6及VP7)及六種非結構蛋白(NSP1至NSP6)，其中基因體區段1至10各編碼一種輪狀病毒蛋白質，且基因體區段11編碼兩種蛋白質(NSP5及NSP6)。
在輪狀病毒A之情形下，不同病毒株可基於結構蛋白VP7及VP4分類為基因型(由比較序列分析及/或核酸雜交資料定義)或血清型(由血清學分析定義)。VP7及VP4為最外部蛋白質層之組分(外部衣殼)，且兩者均攜帶中和抗原決定基。VP7為形成病毒粒子之外層或表面的醣蛋白(因此稱為「G」)。VP7決定病毒株之G型且G血清型及G基因型之名稱相同。VP4為蛋白酶敏感的(因此稱為「P」)且決定病毒之P型。與G型相比，針對P血清型及基因型指定之數字不同(Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56)。因此，P血清型稱為P，繼之以指定之數字，且P基因型稱為P，繼之以方括號中指定之數字(例如，「P[7]」或「P[13]」)。屬於相同基因型之病毒株具有高於89%之胺基酸序列一致性(Estes及Kapikian. Rotaviruses. 在Knipe, D.M.; Howley, P.M. Fields Virology, 第5版; Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health: Philadelphia, PA, USA (2007); Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A. 87(18):7155-9 (1990)中)。
輪狀病毒尤其亦為具有針對接近100%之豬中所存在之A族及C族輪狀病毒之抗體的豬之胃腸炎的主要原因(Vlasova等人Viruses. 9(3): 48 (2017))。當前，僅針對輪狀病毒A可獲得經修飾之存活或經殺滅疫苗。無法在實驗室中培養輪狀病毒C會妨礙研發針對此族之疫苗，該研發則會增加重組疫苗之吸引性。
重組抗輪狀病毒疫苗之產生受輪狀病毒衣殼之複雜性阻礙，該輪狀病毒衣殼由配置於三個層中之四種蛋白質構成。最內層由60個具有T=1對稱性之VP2二聚體構成。對於中間層之恰當排序，需要VP2層，該中間層由260個具有T=13對稱性之VP6三聚體形成。VP2與VP6之間的所得對稱性錯配產生五個不同的VP6三聚體位置及三種不同孔隙類型。在VP2不存在之情況下，VP6易於以可表示病毒組裝之副產物的鹽及pH依賴性方式形成有序高分子量微管及球體。在衣殼中，VP6層由VP7之260個Ca2+依賴性三聚體覆蓋，該等三聚體充當使VP4刺突蛋白保持在適當位置之夾具。VP7為醣基化的或G型抗原，且含有中和抗原決定基。大部分中和抗體僅識別三聚VP7且被認為藉由防止VP7三聚體解離而起作用，繼而阻斷刺突蛋白之釋放。輪狀病毒刺突蛋白以60個VP4之三聚體形式存在，該等三聚體僅在II型孔隙處插入VP6層中。VP4含有中和抗原決定基且為P型抗原，藉由胰蛋白酶裂解為刺突蛋白鹼基VP5*及細胞相互作用頭VP8*，其在裂解後保持與VP5*相關。胰蛋白酶消化進入刺突蛋白用於細胞進入，在此期間刺突蛋白經歷深入的結構重排以暴露用於宿主細胞上之受體結合的活性位點。忽略以上組裝方法之複雜性，難以在促進適當組裝之環境條件下達成輪狀病毒衣殼蛋白之化學計算量表現。
鑒於輪狀病毒衣殼組裝之困難，開始關注次單位疫苗方法。VP7及VP4為含有中和抗原決定基之兩種蛋白質，然而VP7之使用將由於其醣基化及鈣依賴性三聚而變得複雜。VP4之使用因其三聚、胰蛋白酶消化及潛在構形狀態範圍而變得複雜。VP8蛋白，亦稱為VP8域或VP8*，其藉由VP4之胰蛋白酶消化產生，含有中和抗原決定基，為單體，其結構經測定為高解析度(Dormitzer等人EMBO J. 21(5):  885-897 (2002))且經描述為高度穩定的。
此外，VP8蛋白被視為與宿主受體相互作用且涉及病毒附著至宿主細胞的凝集素樣域(aa65-224) (Rodriguez等人, PloS Pathog. 10(5):e1004157 (2014))。
已描述研發針對兒童之輪狀病毒次單位疫苗之方法，其中N端連接至破傷風類毒素通用CD4 +T細胞抗原決定基(aa830-844) P2之截短VP8蛋白(VP8*之胺基酸殘基64 (或65)-223)產生於大腸桿菌中(Wen等人Vaccine. 32(35): 4420-7 (2014))，且在嬰兒及幼童中進行測試(Groome等人Lancet Infect Dis.17(8):843-853 (2017))。然而，由於單價次單位疫苗(基於輪狀病毒基因型P[8]之截短VP8蛋白)之此使用引發針對異型輪狀病毒病毒株之不良反應，因此最近亦測試三價疫苗調配物(包含用於組合基因型P[4]、P[6]、P[8]抗原之三種蛋白質) (Groome等人Lancet Infect Dis. S1473-3099(20)30001 (2020))。
在另一方法中，N端截短VP8蛋白「VP8-1」(aa26-241)之N端或C端與霍亂毒素(CTB)之五聚無毒性B次單位融合。在所得五聚融合蛋白(CTBA-VP8-1、VP8-1-CTB)中，在小鼠模型中，相比於VP8-1-CTB，僅CTB-VP8-1 (亦即N端融合至CTB之VP8-1)被視為用於進一步研發之可行候選物，其展示較高的與GM1或與針對VP8*具有特異性之構形敏感性中和單株抗體之結合活性，且引起較高效價之中和抗體且賦予較高的保護功效(Xue等人Hum Vaccin Immunother. 12(11) 2959-2968 (2016))。
然而，鑒於在輪狀病毒衣殼組裝中之困難，開始關注替代的次單位疫苗方法，尤其是因為次單位疫苗一般被視為非常安全。此外，強烈需要有效的輪狀病毒次單位抗原之重組表現，其使得難以培養之此類輪狀病毒之疫苗抗原得以簡單產生。此外，因為輪狀病毒為豬胃腸炎之主要原因，所以尤其非常需要用於豬之次單位疫苗，其包括使得功效與當前可商購的用於豬之MLV輪狀病毒疫苗相當或甚至比其更高效的抗原。
以上技術問題之解決方案係藉由本發明及申請專利範圍中所表徵之實施例實現。
因此，本發明在其不同態樣中根據申請專利範圍實施。
本發明係基於以下驚人發現：即使當在投與之前將該多肽與額外免疫原性物質混合時，經由被動傳遞中和抗體，在用輪狀病毒攻毒之後向母豬投與包含輪狀病毒VP8蛋白之片段，亦即連接於IgG Fc片段之C端處之N端延伸之凝集素樣域的多肽顯著減少其後代之腹瀉及糞便排出。
因此，在第一態樣中，本發明係關於一種免疫原性組合物，其包含 (i)多肽，該多肽包含： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -   免疫球蛋白Fc片段， 及 (ii)至少一種不同於該多肽的免疫原性物質， 其中該免疫原性組合物在下文中亦稱為「本發明之免疫原性組合物」。
因此，本發明之免疫原性組合物特定言之為一種包含兩個組分 (i； ii)之組合物，亦即 (i)多肽，其包含： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -   免疫球蛋白Fc片段， 其中該多肽在下文中亦分別稱為「本發明之免疫原性組合物之組分 (i)」或「組分 (i)」，及 (ii)至少一種不同於該多肽的免疫原性物質， 其中該至少一種免疫原性物質在下文中亦分別稱為「本發明之免疫原性組合物之組分 (ii)」或「組分 (ii)」。
該多肽包含： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -   免疫球蛋白Fc片段， 其描述於本文中，在本發明之上下文中在下文中亦稱為「本發明之多肽」。
因此，本發明之免疫原性組合物之組分 (i)為本發明之多肽。
較佳地，組分 (ii)由兩種、三種或更多種免疫原性物質組成，其中所有該等免疫原性物質 不同於組分 (i)，且 彼此不同。
在本發明之上下文中，亦出乎意料地發現，由於本發明之多肽在細胞中產生時係自細胞釋放且隨後可自細胞周圍之上清液而非自細胞本身回收，故此免疫原性組合物可簡單地產生。隨後，可容易地將回收之多肽與其他組分混合，以產生本發明之免疫原性組合物，該其他組分包括至少一種不同於該多肽之免疫原性物質。
本發明之多肽之另一優點為必要時，其可製備為包含/呈現不同輪狀病毒之兩個免疫原性片段的一種多肽，藉此使得不必分別製備兩種不同的單價多肽，隨後需要組合該等多肽以用於相同目的。
較佳地，將如本文所描述之免疫球蛋白Fc片段連接至 -      輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端，或 -      輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端。
特定言之，該免疫球蛋白Fc片段較佳 -      經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端，或 -      經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端。
在另一較佳態樣中，如本文所描述之免疫球蛋白Fc片段 -   經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端，或 -   經由該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端。
最佳地，如本文所描述之免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端。
因此，本發明之多肽尤其為一種多肽，其包含： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -   免疫球蛋白Fc片段， 其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端。
本文所用之術語「多肽」尤其係指藉由肽鍵連接在一起之胺基酸殘基之任何鏈，且並非係指產物之特定長度。舉例而言，「多肽」可指胺基酸殘基之長鏈，例如長度為150至600個胺基酸殘基或更長的胺基酸殘基。術語「多肽」包括具有一或多個轉譯後修飾之多肽，其中轉譯後修飾包括例如醣基化、磷酸化、脂質化(例如豆蔻醯化等)、乙醯化、泛素化、硫酸化、ADP核糖基化、羥基化、Cys/Met氧化、羧化、甲基化等。術語「多肽」及「蛋白質」在本發明之上下文中可互換地使用。
術語「免疫原性片段」尤其理解為係指蛋白質之片段，其至少部分保留衍生其之蛋白質之免疫原性。因此，「輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段」尤其應理解為係指輪狀病毒VP8蛋白之片段，其至少部分保留全長VP8蛋白之免疫原性。
「免疫原性物質」係指能夠引發尤其對分子之體液及/或細胞免疫反應的任何物質，諸如能夠引發、產生或生成動物之免疫反應的肽或多肽。
如本文所描述，術語「VP8蛋白」應理解為尤其等效於「VP8域」、「VP8*」或「VP4之VP8片段」，如在輪狀病毒之情形下頻繁使用。
如本文所用，術語「免疫球蛋白Fc片段」係指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)，且更特定言之，不含有免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區及輕鏈恆定區1 (CL1)的蛋白質。其可進一步包括免疫球蛋白之鉸鏈區或鉸鏈區之一部分(亦即，重鏈恆定區處之鉸鏈區)。此外，免疫球蛋白Fc片段可含有重鏈恆定區1 (CH1)之一部分或全部。
應理解，如本文所用，術語「免疫球蛋白Fc片段」等效於「免疫球蛋白Fc域」。
本文所用之術語「連接至」尤其係指用於在多肽內將免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP蛋白之免疫原性片段之C端或N端的任何方式。連接方式之實例包括(1.)免疫球蛋白Fc片段藉由插入部分間接連接至輪狀病毒VP 8蛋白之免疫原性片段之C端，該插入部分直接連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端，且亦結合該免疫球蛋白Fc片段；及(2.)藉由共價鍵結將免疫球蛋白Fc片段直接連接至輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之C端。術語「連接至」及「與......連接」在本發明之上下文中可互換地使用。
特定言之，應理解，措辭「包含 -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -   免疫球蛋白Fc片段之多肽， 其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端」， 如本文所用，尤其等效於措辭 「在N端至C端方向上包含 -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段的胺基酸序列，及 -   免疫球蛋白Fc片段之胺基酸序列的多肽」， 或等效於措辭 「包含 -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -     連接至該免疫原性片段之C端的免疫球蛋白Fc片段」。
根據一最佳態樣，免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端。
如本文在本發明之上下文中所描述之連接部分較佳為肽連接子。
如本文所用之術語「肽連接子」係指包含一或多個胺基酸殘基的肽。更特定言之，如本文所用之術語「肽連接子」係指能夠連接兩種可變蛋白質及/或域之肽，例如輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段及免疫球蛋白Fc片段。
在一尤佳態樣中，免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端，其中 -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段經由連接部分之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至連接部分，且 -   連接部分經由免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與連接部分之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至免疫球蛋白Fc片段。
此外，免疫球蛋白Fc片段可較佳經由免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段。
應理解，本發明之多肽尤其為融合蛋白質。
如本文所用，術語「融合蛋白」意謂藉由融合(亦即接合)兩種或更多種不同多肽之全部或部分所形成之蛋白質。通常，使用重組DNA技術，端對端接合編碼兩種或更多種多肽之聚核苷酸來製得融合蛋白。更特定言之，術語「融合蛋白」因此係指由組合編碼第一多肽之第一核酸序列及至少編碼第二多肽之第二核酸產生的核酸轉錄物轉譯之蛋白質，其中融合蛋白並非天然存在之蛋白質。核酸構築體可編碼兩種或更多種在融合蛋白中接合之多肽。
在另一較佳態樣中，本發明之多肽為式x-y-z之融合蛋白，其中 x由輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段組成或包含該免疫原性片段； y為連接部分；且 z為免疫球蛋白Fc片段。
式x-y-z尤其應理解為輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端胺基酸殘基與該連接部分連接，較佳經由肽鍵與該連接部分之N端胺基酸殘基連接，且該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與該連接部分連接，較佳經由肽鍵與該連接部分之C端胺基酸殘基連接。
如本文所描述，措辭「x係由輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段組成」尤其理解為等效於「x為輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段」。
在一較佳態樣中，如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳能夠在投與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的個體內誘導針對輪狀病毒之免疫反應。
在另一較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段為長度為50至200個、較佳140至190個胺基酸殘基之多肽。
本文所提及之輪狀病毒較佳選自由輪狀病毒A及輪狀病毒C組成之群。因此，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳選自由以下組成之群：輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段及輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段。
如本文分別提及之術語「輪狀病毒A」及「輪狀病毒C」分別係指如由ICTV (由Matthijnssens等人Arch Virol 157:1177-1182 (2012)概述)所定義之輪狀病毒A及輪狀病毒C。
根據另一較佳態樣，本文所提及之輪狀病毒為豬輪狀病毒。
在一個尤佳態樣中，本文所提及之輪狀病毒為輪狀病毒A。因此，如本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳為輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段。
在另一較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段包含輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域。如本文所提及，「輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域」應較佳理解為輪狀病毒A VP8蛋白之凝集素樣域。
術語「輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域」尤其係指輪狀病毒VP8蛋白之殘基65-224或分別對應於由輪狀病毒VP8蛋白之胺基酸殘基65-224組成之胺基酸序列，且其中輪狀病毒VP8蛋白之該等胺基酸殘基65-224較佳為輪狀病毒A VP8蛋白之胺基酸殘基65-224。
因此，「輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域」較佳由輪狀病毒VP8蛋白，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之胺基酸殘基65-224的胺基酸序列組成。
較佳地，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段為輪狀病毒VP8蛋白之N端延伸之凝集素樣域，其中N端延伸長度為1至20個胺基酸殘基，尤其5至15個胺基酸殘基。最佳地，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段為輪狀病毒VP8蛋白之N端延伸之凝集素樣域，其中N端延伸長度為八個胺基酸殘基。
該N端延伸之胺基酸序列較佳為在輪狀病毒VP8蛋白之胺基酸序列中側接凝集素樣域之N端胺基酸殘基的各別長度之胺基酸序列。
因此，在一特定態樣中，如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳由以下組成：輪狀病毒VP8蛋白，尤其輪狀病毒A蛋白之胺基酸殘基60-224、胺基酸殘基59-224、胺基酸殘基58-224、胺基酸殘基57-224、胺基酸殘基56-224、胺基酸殘基55-224、胺基酸殘基54-224、胺基酸殘基53-224、胺基酸殘基52-224、胺基酸殘基51-224、胺基酸殘基50-224或胺基酸殘基49-224之胺基酸序列。
最佳地，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由輪狀病毒VP8蛋白，尤其輪狀病毒A蛋白之胺基酸殘基57-224的胺基酸序列組成。
以上胺基酸殘基編號(例如「65-224」或「57-224」)較佳參考野生型輪狀病毒VP8蛋白，尤其野生型輪狀病毒A VP8蛋白之胺基酸序列。該野生型輪狀病毒VP8蛋白較佳為SEQ ID NO: 1中所列之蛋白質。
根據另一較佳態樣，本文所提及之輪狀病毒為選自由以下組成之群的輪狀病毒，尤其輪狀病毒A：基因型P[6]輪狀病毒、基因型P[7]輪狀病毒及基因型P[13]輪狀病毒。因此，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳選自由以下組成之群：基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段、基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段及基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，且尤其選自由以下組成之群：基因型P[6]輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段、基因型P[7]輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段及基因型P[13]輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段。
如本文所用之術語「基因型P[6]輪狀病毒」、「基因型P[7]輪狀病毒」、「基因型P[13]輪狀病毒」及「基因型P[23]輪狀病毒」尤其係指輪狀病毒之已確立VP4 (P)基因型分類(例如P[6]、P[7]、P[13]或P[23])，其描述於Estes及Kapikian. Rotaviruses. 在Knipe, D.M.; Howley, P.M. Fields Virology, 第5版；Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health: Philadelphia, PA, USA (2007)；Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A. 87(18):7155-9 (1990)中。
最佳地，本文所提及之輪狀病毒為基因型P[7]輪狀病毒。因此，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段最佳為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，尤其基因型P[7]輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段。
本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白最佳包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 1之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列。
如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域較佳包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 2之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實例中，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列組成。
在另一較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由以下組成或為以下之共有序列：輪狀病毒VP8蛋白之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之一部分。
如本文所用，術語「共有序列」係指由相關序列家族中最頻繁出現之胺基酸(或核苷酸)形成之序列(參見例如Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987))。在蛋白質家族中，共有序列中之各位置由該家族中最頻繁出現於該位置處之胺基酸佔據。術語「共有序列」因此表示所推斷之胺基酸序列(或核苷酸序列)。共有序列表示複數個類似序列。共有序列中之各位置對應於藉由比對三個或更多個序列所確定之該位置處最頻繁出現之胺基酸殘基(或核苷酸鹼基)。
較佳地，如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白之一部分之共有序列可藉由包含以下步驟之方法獲得： -   將編碼輪狀病毒VP8蛋白之一部分的複數個核苷酸序列轉譯為胺基酸序列， -   將該等胺基酸序列與已知輪狀病毒VP8蛋白比對，較佳藉由使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數， -   對該等比對序列進行種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建，尤其將該等比對胺基酸序列導入MEGA7軟體以用於種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建， -   使用泊松(Poisson)校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)， -   按比例繪製最優樹，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離， -   將自助重抽叢聚關聯大於70%的節點視為顯著的， -   將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚，以及 -   選擇叢聚及藉由鑑別該叢聚內每個比對位置之最大頻率來產生共有序列， -   且視情況，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及預定產品保護概況選擇胺基酸殘基。
舉例而言，在此情形下，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳由與選自由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在另一較佳態樣中，本文所提及之輪狀病毒為輪狀病毒C。根據此態樣，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳為輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段。
在此態樣之情形下，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段較佳由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
根據本發明，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段因此較佳由以下組成或為以下： -  輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者，或 -  輪狀病毒VP8蛋白之一部分，諸如輪狀病毒A VP8蛋白之一部分之共有序列，較佳在共有序列之情形下，本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段中之任一者，或 -  輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒C VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者。
在一尤佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段為由與選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列組成的多肽。
本文所描述之免疫球蛋白Fc片段之長度較佳為至少220個胺基酸殘基，且長度最佳為220至250個胺基酸殘基。
根據另一尤佳態樣，本文所描述之免疫球蛋白Fc片段未經醣基化。如本文所用，術語「未經醣基化」尤其意謂免疫球蛋白Fc片段不具有附著至其上之寡醣分子。
較佳地，如本文所提及之免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成： -  免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)，及 -  免疫球蛋白之重鏈恆定區3 (CH3)， -  及視情況存在之鉸鏈區或鉸鏈區之一部分。
根據另一較佳態樣，本文所提及之免疫球蛋白係選自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM組成之群。因此，免疫球蛋白Fc片段較佳選自由以下組成之群：IgG Fc片段、IgA Fc片段、IgD Fc片段、IgE Fc片段及IgM Fc片段。
根據一最佳態樣，本文所描述之免疫球蛋白Fc片段為IgG Fc片段。
如本文所提及之IgG較佳選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5及IgG6。因此，根據另一較佳態樣，本文所提及之免疫球蛋白Fc片段係選自由以下組成之群：IgG1 Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段、IgG4 Fc片段、IgG5 Fc片段及IgG6 Fc片段。
最佳地，免疫球蛋白Fc片段為由腸細胞易受如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段所衍生之輪狀病毒感染的物種之基因體編碼的蛋白質。舉例而言，若輪狀病毒VP8蛋白之片段為豬輪狀病毒VP8蛋白之片段，則免疫球蛋白Fc片段較佳為由豬基因體編碼之免疫球蛋白Fc片段。根據另一實例，若輪狀病毒VP8蛋白之片段為雞輪狀病毒VP8蛋白之片段，則免疫球蛋白Fc片段較佳為由雞基因體編碼之免疫球蛋白Fc片段。
更特定言之，免疫球蛋白Fc片段較佳為豬IgG Fc片段。
在另一較佳態樣中，免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列。
本文所分別提及之連接部分或肽連接子為長度較佳為1至50個胺基酸殘基，尤其長度為3至20個胺基酸殘基之胺基酸序列。舉例而言，連接部分可為長度為3、8或10個胺基酸殘基之肽連接子。
視目的而定，可能需要短連接子以降低融合蛋白搭配物之間的蛋白質水解風險。因此，在本發明之上下文中所描述之肽連接子較佳具有1至5個胺基酸殘基、更佳2至4個胺基酸殘基且最佳三個胺基酸殘基之長度，或分別由其組成。
根據一較佳態樣，連接部分包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的序列具有至少66%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列。
如本文所提及之「SEQ ID NO: 9」係指胺基酸序列(針對胺基酸殘基單字母編碼)：GGS，其習知三字碼為Gly-Gly-Ser。
因此，在本發明之上下文中，「SEQ ID NO: 9」表示胺基酸序列Gly-Gly-Ser或對應地在以下序列表中針對序列SEQ ID NO: 9所列的「Gly Gly Ser」。
較佳地，本發明之多肽具有側接輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基。
根據另一較佳態樣，本發明之多肽包含連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白之另一免疫原性片段。
輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段較佳由以下組成或為以下： -  輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者，或 -  輪狀病毒VP8蛋白之一部分，諸如輪狀病毒A VP8蛋白之一部分之共有序列，較佳在共有序列之情形下，本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段中之任一者，或 -  輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒C VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者。
特定言之，輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段較佳包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 2至6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一尤佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段不同於C端連接至該免疫球蛋白Fc片段之輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段。
輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段較佳經由連接部分，尤其經由本文所描述之連接部分中之任一者連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。較佳地，輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段經由輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段的N端胺基酸殘基與連接部分之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至連接部分。
替代地，輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段經由輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段之N端胺基酸殘基與該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。
在一尤佳態樣中，本發明之多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：與選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%序列一致性之胺基酸序列。
較佳地，本發明之多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的胺基酸序列。
應理解，如本文所用，措辭「由胺基酸序列組成(consisting of an amino acid sequence或consists of an amino acid sequence)」分別尤其亦關於由表現蛋白質或蛋白質域之細胞實現之胺基序列的任何一或多個共轉譯及/或轉譯後修飾。因此，除非另外明確提及，否則如本文所描述之措辭「由胺基酸序列組成(consisting of an amino acid sequence或consists of an amino acid sequence)」分別亦關於具有一或多個由表現蛋白質或蛋白質域之細胞實現之修飾，尤其在蛋白質生物合成及/或蛋白質加工中實現之胺基酸殘基之修飾，較佳選自由糖基化、磷酸化及乙醯化組成之群的修飾的胺基酸序列。
關於如本發明之上下文中所提及之術語「至少90%」，應理解，該術語較佳地係指「至少91%」、更佳「至少92%」、再更佳「至少93%」或尤其「至少94%」。
關於如本發明之上下文中所提及之術語「至少95%」，應理解，該術語較佳地係指「至少96%」、更佳「至少97%」、再更佳「至少98%」或尤其「至少99%」。
關於如本發明之上下文中所提及之術語「至少99%」，應理解，該術語較佳地係指「至少99.2%」、更佳「至少99.4%」、再更佳「至少99.6%」或尤其「至少99.8%」。
更特定言之，術語「至少99%序列一致性」係指99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性。
如本文所用，術語「具有100%序列一致性」應理解為等效於術語「為一致的」。
序列一致性百分比具有此項技術中公認的含義且存在多種方法量測兩個多肽或聚核苷酸序列之間的一致性。參見例如Lesk編, Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988)；Smith編, Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993)；Griffin及Griffin編, Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994)；von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987)；以及Gribskov及Devereux編, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)。用於比對聚核苷酸或多肽之方法編碼於電腦程式中，包括GCG程式包(Devereux等人, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul等人, J. Molec. Biol. 215:403 (1990))及Bestfit程式(Wisconsin Sequence Analysis Package, 用於Unix之版本8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)，該Bestfit程式使用史密斯及Waterman之局部同源演算法( Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))。舉例而言，可使用採用FASTA演算法之電腦程式ALIGN，其中存在空隙開放罰分-12及空隙擴展罰分−2之仿射空隙搜尋。出於本發明之目的，使用DNASTAR公司之MegAlign軟體版本11.1.0 (59), 419中之Clustal W方法，使用程式中之預設多序列比對參數設定比對核苷酸序列(空隙罰分=15.0，空隙長度罰分=6.66，延遲發散序列(%)=30%，DNA轉化權重=0.50及DNA權重矩陣=IUB)，且蛋白質/胺基酸序列分別使用DNASTAR公司之MegAlign軟體版本11.1.0 (59), 419中之Clustal W方法，使用程式中之預設多序列比對參數設定比對(Gonnet連續蛋白質權重矩陣，其中空隙罰分=10.0、間隙長度罰分=0.2及延遲發散序列(%)=30%)。
如本文所用，尤其應理解術語「與SEQ ID NO: X之序列之序列一致性」分別等效於術語「在SEQ ID NO: X之長度上與SEQ ID NO: X之序列的序列一致性」或等效於術語「在SEQ ID NO: X之全長上與SEQ ID NO: X之序列的序列一致性」。在此情形下，「X」係選自1至25之任何整數，使得「SEQ ID NO: X」表示本文所提及之SEQ ID NO中之任一者。
如本文所用，措辭「由SEQ ID NO: […]、…及SEQ ID NO: […]組成之群」與「由SEQ ID NO: […]之序列、…及SEQ ID NO: […]之序列組成之群」可互換。在此上下文中，「[…]」為該序列之數字的占位符。舉例而言，措辭「由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群」與「由SEQ ID NO: 3之序列、SEQ ID NO: 4之序列、SEQ ID NO: 5之序列及SEQ ID NO: 6之序列組成之群」可互換。
根據另一尤佳態樣，本發明之多肽由以下組成： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者， -   側接輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基，以及 -   免疫球蛋白Fc片段，尤其本文所描述之免疫球蛋白Fc片段中之任一者， 其中該免疫球蛋白Fc片段尤其經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端，其中該連接部分較佳為本文所描述之連接部分中之任一者， -   及視情況存在之尤其經由連接部分連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白之另一免疫原性片段，其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段較佳為輪狀病毒VP8蛋白之本文所描述之其他免疫原性片段中之任一者，且其中該連接部分較佳為本文所描述之連接部分中之任一者。
在又一較佳態樣中，本發明之多肽與本發明之另一多肽形成二聚體。最佳地，本發明之多肽與另一一致多肽形成同二聚體。
因此，尤其應理解，術語「本發明之多肽」進一步涵蓋由本發明之兩種多肽構成之任何二聚體，且尤其涵蓋由本發明之兩種一致多肽構成之任何同二聚體。
根據另一尤佳態樣，本發明提供一種多聚體，其包含複數種本發明之多肽或由該等多肽構成，且其中該多聚體在下文中亦稱為「本發明之多聚體」。
較佳地，本發明之多聚體為由本發明之一種多肽與本發明之另一一致多肽形成之同二聚體。
尤其應理解，術語「本發明之多聚體」進一步涵蓋本發明之不同多聚體之任何混合物，例如以下之混合物： -  由本發明之一種多肽與本發明之另一一致多肽形成的同二聚體，及 -  由本發明之相同多肽中之超過兩者形成的一或多種多聚體。
因此，都在一個尤佳實例中，本發明之免疫原性組合物之組分 (i)存在於 -   由本發明之一種多肽組成的單體，及/或 -   由本發明之兩種一致多肽組成之同二聚體， -  及/或由本發明之三種一致多肽組成的視情況存在之同三聚體中， 其中較佳地 -  本發明之該兩種一致多肽中之每一者， -  及視情況存在之本發明之該三種一致多肽中之每一者， 包含與本發明之該一種多肽相同的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
或更一般而言，本發明亦涵蓋一種免疫原性組合物，其包含： (i)多肽，其包含： -  輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -  免疫球蛋白Fc片段， 其中視情況，該多肽包括於包含複數種該多肽或由該等多肽組成的多聚體中， 及 (ii)至少一種不同於該多肽的免疫原性物質。
本文描述至少一種不同於該多肽之免疫原性物質，該多肽較佳地由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中所有該等免疫原性物質 不同於該多肽，且 彼此不同。
因此，本發明之免疫原性組合物之組分 (ii)較佳地由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等免疫原性物質中之每一者不同於本發明之免疫原性組合物之組分 (i)，且其中所有該等免疫原性物質彼此不同。
較佳地，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種包含不同於該免疫原性片段之呼腸孤病毒抗原或由該呼腸孤病毒抗原組成的免疫原性物質。因此，組分 (ii)較佳地為至少一種包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段的呼腸孤病毒抗原或由該呼腸孤病毒抗原組成的免疫原性物質。
如本文所用，術語「呼腸孤病毒抗原」尤其係指一種包含由對屬於呼腸孤病毒科( Reoviridae)家族之病毒具特異性之抗體識別的抗原決定基的肽或蛋白質，或其部分。
在一個較佳態樣中，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含呼腸孤病毒抗原或由其組成，且其中所有該等抗原不同於該免疫原性片段且彼此不同。因此，組分 (ii)較佳地由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含呼腸孤病毒抗原或由其組成，且其中所有該等抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。
在另一較佳態樣中，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種包含不同於該免疫原性片段之呼腸孤病毒抗原或由該呼腸孤病毒抗原組成的蛋白質。因此，組分 (ii)較佳地為至少一種包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段的呼腸孤病毒抗原或由該呼腸孤病毒抗原組成的蛋白質。
在再一較佳態樣中，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質由兩種或更多種蛋白質組成，其中該等蛋白質中之每一者包含呼腸孤病毒抗原或由其組成，且其中所有該等呼腸孤病毒抗原不同於該免疫原性片段且彼此不同。因此，組分 (ii)較佳地由兩種或更多種蛋白質組成，其中該等蛋白質中之每一者包含呼腸孤病毒抗原或由其組成，且其中所有該等抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。
較佳地，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種包含不同於該免疫原性片段之輪狀病毒抗原或由該輪狀病毒抗原組成的免疫原性物質。因此，組分 (ii)較佳地為至少一種包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段的輪狀病毒抗原或由該輪狀病毒抗原組成的免疫原性物質。
如本文所用，術語「輪狀病毒抗原」尤其係指一種包含由對屬於輪狀病毒屬之病毒具特異性之抗體識別的抗原決定基的肽或蛋白質，或其部分。
在一個較佳態樣中，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含輪狀病毒抗原或由其組成，且其中所有該等抗原不同於該免疫原性片段且彼此不同。因此，組分 (ii)較佳地由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含輪狀病毒抗原或由其組成，且其中所有該等抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。
在另一較佳態樣中，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種包含不同於該免疫原性片段之輪狀病毒抗原或由該輪狀病毒抗原組成的蛋白質。因此，組分 (ii)較佳地為至少一種包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段的輪狀病毒抗原或由該輪狀病毒抗原組成的蛋白質。
在再一較佳態樣中，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質由兩種或更多種蛋白質組成，其中該等蛋白質中之每一者包含輪狀病毒抗原或由其組成，且其中所有該等輪狀病毒抗原不同於該免疫原性片段且彼此不同。因此，組分 (ii)較佳地由兩種或更多種蛋白質組成，其中該等蛋白質中之每一者包含輪狀病毒抗原或由其組成，且其中所有該等抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。
在一尤佳態樣中，本發明之免疫原性組合物較佳地為如下免疫原性組合物，其中 (i)該多肽為第一多肽； 及 (ii)至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種不同於該第一多肽的其他多肽。
較佳地，該至少一種免疫原性物質包含或為 包含不同於該免疫原性片段之呼腸孤病毒抗原或由該呼腸孤病毒抗原組成的第二多肽， 且視情況包含不同於該等第一及第二多肽之第三多肽， 且視情況包含不同於所有該等第一至第三多肽的第四多肽。
較佳地，該第三多肽包含不同於該免疫原性片段及第二多肽之呼腸孤病毒抗原兩者的呼腸孤病毒抗原。
該第四多肽較佳地包含不同於以下所有之呼腸孤病毒抗原： -   該免疫原性片段， -   第二多肽之呼腸孤病毒抗原，及 -   第三多肽之呼腸孤病毒抗原。
在另一尤佳態樣中， 本發明之免疫原性組合物之組分 (i)為第一多肽 且本發明之免疫原性組合物之組分 (ii)為至少一種不同於該第一多肽的其他多肽， 且其中較佳地，組分 (ii)-   包含或為第二多肽，該第二多肽包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段之輪狀病毒抗原，且 -   較佳地包含不同於該等第一及第二多肽之第三多肽，且 -   視情況包含不同於所有該等第一至第三多肽的第四多肽。
較佳地，該第三多肽包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段及第二多肽之輪狀病毒抗原兩者的輪狀病毒抗原。
根據一較佳態樣，該第二多肽為如本文所描述之本發明之多肽中之任一者，其限制條件為該第二多肽不同於該第一多肽， 且較佳地，該第三多肽為如本文所描述之本發明之多肽中之任一者，其限制條件為該第三多肽不同於該等第一及第二多肽兩者， 且視情況，該第四多肽為如本文所描述之本發明之多肽中之任一者，其限制條件為該第四多肽不同於所有該等第一至第三多肽。
在另一較佳態樣中，本發明之免疫原性組合物較佳地為如下免疫原性組合物，其中 (i)該多肽為第一多肽，其包含： -  輪狀病毒VP8蛋白之第一免疫原性片段，及 -  免疫球蛋白Fc片段； 且 (ii)該至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： -   第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，其中該第二免疫原性片段不同於該第一免疫原性片段， -   及較佳之第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段，其中該第三免疫原性片段不同於該等第一及第二免疫原性片段兩者， -   及視情況存在之第四多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第四免疫原性片段，其中該第四免疫原性片段不同於所有該等第一至第三免疫原性片段。
較佳地，該等第二至第四免疫原性片段中之每一者個別地選自由以下組成之群： -  輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者， -  輪狀病毒VP8蛋白之一部分，諸如輪狀病毒A VP8蛋白之一部分之共有序列，較佳在共有序列之情形下，本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段中之任一者，及 -  輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段，尤其輪狀病毒C VP8蛋白之本文所描述之免疫原性片段中之任一者， 特定言之，其限制條件為所有該等第二至第四免疫原性片段不同於該第一免疫原性片段且彼此不同。
更特定言之， 該第一免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC，及/或 該第二免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC，及/或 該第三免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC，及/或 該第四免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC； 其中 X7表示基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， X13表示基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， X6表示基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，且 XC表示輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段， 特定言之，其限制條件為所有該等第二至第四免疫原性片段不同於該第一免疫原性片段且彼此不同。
因此，如本文中所提及， 「 X7」意謂基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， 「 X13」意謂基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， 「 X6」意謂基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，且 「 XC」意謂輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段。
如本文中所提及， X7較佳地由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
如本文中所提及， X13較佳地由與SEQ ID NO: 5之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
如本文中所提及， X6較佳地由與SEQ ID NO: 4之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
如本文中所提及， XC較佳地由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
特定言之，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含第二多肽或由該第二多肽組成，該第二多肽包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，且 該等第一及第二免疫原性片段中之每一者個別地選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段係選自由 X13、 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段係選自由 X7、 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段係選自由 X7、 X6及 XC組成之群， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段係選自由 X7、 X13及 X6組成之群。
更特定言之，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，及 第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段， 且該等第一至第三免疫原性片段中之每一者個別地選自由 X7、 X13、 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段為 X13且該第三免疫原性片段係選自由 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X6及 XC組成之群， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X13及 X6組成之群。
更特定言之，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，及 第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段，及 第四多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第四免疫原性片段， 其中該等第一至第四免疫原性片段中之每一者個別地選自由 X7、 X6、 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段為 X13，該第三免疫原性片段為 X6，且該第四免疫原性片段為 XC， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段為 X7，該第三免疫原性片段為 X13，且該第四免疫原性片段為 XC， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段為 X7，該第三免疫原性片段為 X6，且該第四免疫原性片段為 XC， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段為 X7，該第三免疫原性片段為 X13，且該第四免疫原性片段為 X6。
較佳地， 該本文提及之第一免疫原性片段為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段( X7)，及/或 該本文提及之第二免疫原性片段為基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段( X13)，及/或 該本文提及之第三免疫原性片段為基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段( X6)，及/或 該本文提及之第四免疫原性片段為輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段( XC)。
最佳地，該第一免疫原性片段為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段( X7)，且 該第二免疫原性片段為基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段( X13)，且 該第三免疫原性片段為基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段( X6)， 且視情況，該第四免疫原性片段為輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段( XC)。
較佳地， 該第一免疫原性片段由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，且 該第二免疫原性片段由與SEQ ID NO: 5之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，且 該第三免疫原性片段由與SEQ ID NO: 4之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，且 視情況，該第四免疫原性片段由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在另一較佳態樣中， 如本文所提及，該第一多肽係選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC，及/或 如本文所提及，該第二多肽係選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC，及/或 該第三多肽係選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC，及/或 該第四多肽係選自由組成之群： R7、 R13、 R6及 RC； 其中 R7為包含與選自由SEQ ID NO: 12組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， R13為包含與選自由SEQ ID NO: 14組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， R6為包含與選自由SEQ ID NO: 13組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，且 RC為包含與選自由SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， 特定言之，其限制條件為所有該等第二至第四多肽不同於該第一多肽且彼此不同。
較佳地，至少一種不同於該第一多肽之免疫原性物質包含輪狀病毒VP8蛋白之第二多肽或由該第二多肽組成，且 該等第一及第二多肽中之每一者個別地選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽係選自由 R13、 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽係選自由 R7、 R13及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽係選自由 R7、 R6及 RC組成之群， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽係選自由 R7、 R13及 R6組成之群。
特定言之，至少一種不同於該第一多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，及 第三多肽， 且該等第一至第三多肽中之每一者個別地選自由 R7、 R13、 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽為 R13且該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R13及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R13及 R6組成之群。
更特定言之，至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，及 第三多肽，及 第四多肽， 其中該等第一至第四多肽中之每一者個別地選自由以下組成之群： R7、 R6、 R13及 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽為 R13，該第三多肽為 R6，且該第四多肽為 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽為 R7，該第三多肽為 R13，且該第四多肽為 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽為 R7，該第三多肽為 R6，且該第四多肽為 RC， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽為 R7，該第三多肽為 R13，且該第四多肽為 R6。
根據一較佳態樣， 該本文提及之第一多肽為包含與SEQ ID NO: 12之序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，且 該本文提及之第二多肽為包含與選自由SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，且 較佳地，該本文提及之第三多肽為包含與選自由SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， 且視情況，該本文提及之第四多肽為包含與選自由SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。
特定言之，本發明之免疫原性組合物較佳，其包含： (i)包含與SEQ ID NO: 12之序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 (ii)包含與選自由SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。
最特定言之，本發明之免疫原性組合物較佳，其包含： (i)包含與選自由SEQ ID NO: 12組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 (ii)包含與選自由SEQ ID NO: 14組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 包含與選自由SEQ ID NO: 13組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， 及視情況存在之包含與選自由SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。
本發明之免疫原性組合物較佳地包含濃度為至少100 nM、較佳地至少250 nM、更佳至少500 nM且最佳至少1 µM的組分 (i)及組分 (ii)之物質中的每一者。
根據另一較佳態樣，本發明之免疫原性組合物含有濃度為100 nM至50 µM、較佳地250 nM至25 µM且最佳1至10 µM的組分 (i)及組分 (ii)之物質中的每一者。
特定言之，向個體投與1 mL或視具體情況，2 mL本發明之免疫原性組合物。因此，待投與個體之本發明之免疫原性組合物的劑量較佳具有1 mL或2 mL之體積。
較佳地，向個體投與一劑或兩劑免疫原性組合物。
本發明之免疫原性組合物較佳全身性或局部投與。習知使用之適合的投與途徑為非經腸或經口投與，諸如肌肉內、皮內、靜脈內、腹膜內、皮下、鼻內以及吸入。然而，視化合物之性質及作用模式而定，免疫原性組合物亦可藉由其他途徑投與。最佳為肌肉內投與免疫原性組合物。本發明之免疫原性組合物較佳進一步包含醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑。
如本文所用，「醫藥學或獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似物。在一些較佳實施例及尤其包括凍乾免疫原性組合物之實施例中，用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。
在一些實施例中，本發明之免疫原組合物含有佐劑。
如本文所用，「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、例如Quil A之皂苷、QS-21 (Cambridge Biotech公司, Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals公司, Birmingham, AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可尤其基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopeia)類型)；諸如鯊烷或鯊烯之類異戊二烯油；由烯烴，尤其異丁烯或癸烯寡聚產生之油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子界面活性劑，尤其視情況經乙氧基化的脫水山梨糖醇、二縮甘露醇(例如，油酸無水甘露糖醇)、乙二醇、聚丙三醇、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，尤其普洛尼克(Pluronic)產品，尤其L121。參見Hunter等人, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁(1995)，及Todd等人, Vaccine 15:564-570 (1997)。例示性佐劑為描述於「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」, M. Powell及M. Newman編, Plenum Press, 1995之第147頁上之SPT乳液或描述於此同一本書之第183頁上之乳液MF59。
佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物為尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯之丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物藉由術語卡波姆(carbomer)已知(Phameuropa第8卷, 第2期, 1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其描述與具有至少3個羥基、較佳不超過8個羥基之聚羥基化合物交聯之此類丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂族基團置換。較佳基團為含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團本身可含有其他取代基，諸如甲基。以名稱CARBOPOL®出售之產品(BF Goodrich, Ohio, USA)為尤其適合的。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。尤其可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳為使用CARBOPOL® 971P。順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物尤其為共聚物EMA (Monsanto)，其為順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。此等聚合物溶解於水中產生酸溶液，較佳地將該酸溶液中和至生理pH，以便得到併入免疫原性、免疫或疫苗組合物本身之佐劑溶液。
可自其選擇佐劑之其他適合的佐劑尤其包括但不限於：RIBI佐劑系統(Ribi公司)、Block共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、Avridine脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(E. coli) (重組或以其他方式)之不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽，或天然存在或重組細胞介素或其類似物，或內源性細胞介素釋放刺激劑等等。
預期佐劑可以每劑約100 µg至約10 mg之量、較佳每劑約100 µg至約10 mg之量、更佳每劑約500 µg至約5 mg之量、甚至更佳每劑約750 µg至約2.5 mg之量及最佳每劑約1 mg之量添加。替代地，佐劑可以最終產物之體積計在約0.01%至50%之濃度下、較佳在約2%至30%之濃度下、更佳在約5%至25%之濃度下、仍更佳在約7%至22%之濃度下且最佳在10%至20%之濃度下。
「稀釋劑」可包括水、生理鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。
根據一尤佳態樣，本發明亦提供一種免疫原性組合物，尤其本發明之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含以下或由以下組成： -   組分 (i)， -   組分 (ii)， -   醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑， -   及視情況存在之佐劑。
在本發明之上下文中，佐劑較佳選自由乳化水包油佐劑及卡波姆組成之群。
術語「免疫原性組合物」係指包含至少一種抗原之組合物，其在投與免疫原性組合物之宿主中引起免疫反應。此類免疫反應可為對根據本發明之免疫原性組合物的細胞及/或抗體介導之免疫反應。宿主亦描述為「個體」。較佳地，本文所描述或提及之宿主或個體中之任一者為動物。
如本文所用，術語「動物」尤其係指哺乳動物，較佳豬(swine)，更佳豬(pig)，最佳豬崽。
通常，「免疫反應」包括但不限於：以下效果中之一或多個：產生或活化特異性針對本發明之免疫原性組合物中所包括之一或多種抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞。較佳地，宿主將呈現保護性免疫反應或治療反應。
「保護性免疫反應」將由以下情形證明：受感染宿主通常所呈現之一或多種臨床病徵的減少或消失、恢復時間加快及/或感染持續時間減少，或受感染宿主之組織或體液或排泄物中之病原體效價降低。
如本文所提及之「病原體」或「特定病原體」尤其係有關衍生出輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段的輪狀病毒。舉例而言，如本文所提及之病原體為輪狀病毒A或輪狀病毒C。
在宿主呈現保護性免疫反應使得對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度將降低的情況下，將免疫原性組合物描述為「疫苗」。
如本文所描述之「抗原」係指但不限於在宿主中引起針對包含此類抗原或其免疫活性組分之所關注的免疫原性組合物或疫苗的免疫反應的組分。特定言之，如本文所用之術語「抗原」係指一種蛋白質或蛋白質域，其若向宿主投與，則可在宿主中引起免疫反應。
術語「治療及/或預防」係指畜群中之特定病原體感染之發病率之減少，或由特定病原體感染所引起或與特定病原體感染有關的一或多臨床病徵之嚴重程度之降低。因此，術語「治療及/或預防」亦係指與動物未接受此類免疫原性組合物的動物組相比，在動物接受有效量之如本文所提供之免疫原性組合物的動物組中，畜群中感染特定病原體之動物數目減少(=特定病原體感染之發病率減少)或通常與病原體感染有關或由病原體感染所引起之一或多臨床病徵之嚴重程度降低。
「治療及/或預防」一般涉及向需要此類治療/預防或可受益於此類治療/預防之個體或個體群投與有效量之本發明之免疫原性組合物。術語「治療」係指一旦個體或畜群中之至少一些動物已感染此類病原體且其中此類動物已展示由此類病原體感染造成或與此類病原體感染相關聯之一些臨床病徵，則投與有效量之免疫原組合物。術語「預防」係指在此類個體感染任何病原體之前或至少在此類動物或動物組中之所有動物未展現由此類病原體感染所引起或與此類病原體感染有關之一或多種臨床病徵的情況下向個體投與。
如本文所用之術語「有效量」意謂但不限於引起或能夠引起個體之免疫反應的抗原，尤其本發明之多肽的量。此類有效量能夠降低畜群中特定病原體感染之發生率或降低特定病原體感染之一或多種臨床病徵之嚴重程度。較佳地，與未經處理或未經在本發明之前可獲得之免疫原性組合物處理，但隨後感染特定病原體之個體相比，一或多種臨床病徵之發生率或嚴重程度減輕至少10%、更佳至少20%、再更佳至少30%、甚至更佳至少40%、再更佳至少50%、甚至更佳至少60%、再更佳至少70%、甚至更佳至少80%、再更佳至少90%及最佳至少95%。
如本文所用，術語「臨床病徵」係指個體感染特定病原體之病徵。感染之臨床病徵取決於所選病原體。此類臨床病徵之實例包括但不限於：腹瀉、嘔吐、發熱、腹痛及脫水。
減少個體中由特定病原體感染引起或與特定病原體感染相關之一或多種臨床病徵之發生率或降低其嚴重程度可藉由向個體投與一或多劑本發明之免疫原性組合物來達成。
術語「減少糞便排出」意謂但不限於減少每mL糞便之病原病毒(諸如輪狀病毒)之RNA拷貝之數目或每分升糞便之溶菌斑形成集落之數目，與未接受組合物且可變得感染之個體相比，接受本發明之組合物之個體之糞便減少至少50%。更佳地，接受本發明之組合物之個體中糞便排出量減少至少90%、較佳至少99.9%、更佳至少99.99%且甚至更佳至少99.999%。
如本文所用，術語「糞便排出」根據其在藥品及病毒學中之普通含義使用且係指自個體之細胞產生病毒且經由個體之大便將病毒自感染個體釋放至環境中。
本發明之多肽較佳為重組蛋白，尤其重組桿狀病毒表現之蛋白質。
如本文所用，術語「重組蛋白」尤其係指藉由重組DNA技術產生之蛋白質，其中通常將編碼所表現蛋白質之DNA插入適合的表現載體中，其繼而用於轉型或在病毒載體之情況下感染宿主細胞以產生異源蛋白質。因此，如本文所用之術語「重組蛋白」尤其係指自重組DNA分子表現之蛋白質分子。如本文所用，「重組DNA分子」係指由藉助於分子生物技術接合在一起之DNA區段構成之DNA分子。用於產生重組蛋白之適合的系統包括但不限於：昆蟲細胞(例如桿狀病毒)、原核系統(例如大腸桿菌( Escherichia coli))、真菌(例如嗜熱毀絲菌( Myceliophthora thermophile)、米麴黴( Aspergillus oryzae)、玉米黑粉菌( Ustilago maydis))、酵母菌(例如釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、甲醇酵母( Pichia pastoris))、哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢、HEK293)、植物(例如紅花)、海藻、禽類細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞及無細胞系統(例如家兔網狀紅血球溶解物)。
根據另一態樣，本發明提供一種聚核苷酸，其包含編碼本發明之多肽之序列，其中該聚核苷酸，在下文中亦稱為「根據本發明之聚核苷酸」較佳為經分離之聚核苷酸。
較佳地，根據本發明之聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的核苷酸序列。
本文所描述之聚核苷酸之產生屬於此項技術中之技術範圍內且可在其他場合根據Sam brook等人, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Amusable等人, 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY；Innis等人(編), 1995, PCR Strategies, Academic Press公司, San Diego；以及Erlich (編), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York中所描述之重組技術進行，所有文獻均以引用之方式併入本文中。
在另一態樣中，本發明提供一種含有編碼本發明之多肽之聚核苷酸的載體。
出於本發明之目的，「載體」以及「含有編碼本發明之多肽之聚核苷酸的載體」係指適合的表現載體，較佳桿狀病毒表現載體，其繼而用於轉染或在桿狀病毒表現載體之情況下用於感染宿主細胞以產生由DNA編碼之蛋白質或多肽。載體及用於製備及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可尤其藉由以下或類似於以下所揭示之方法製得或進行：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」, PNAS USA 93: 11349-11353, 1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」, PNAS USA 93: 11341-11348, 1996年10月；Smith等人, 美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press公司)；Smith等人, 「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology, 1983年12月, 第3卷, 第12期, 第2156-2165頁；Pennock等人, 「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology 1984年3月, 第4卷, 第3期, 第406頁；EPA0 370 573；1986年10月16日申請之美國申請案第920,197號；歐洲專利申請案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors」, PNAS USA 93:11307-11312, 1996年10月；Andreansky等人, 「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」, PNAS USA 93: 11313-11318, 1996年10月；Robertson等人, 「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340, 1996年10月；Frolov等人, 「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications」, PNAS USA 93: 11371-11377, 1996年10月；Kitson等人, J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；均在1996年7月3日申請之所允許之美國申請案系列第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)；Grunhaus等人, 1992, 「Adenovirus as cloning vectors」, Seminars in Virology (第3卷) 第237-52頁, 1993；Ballay等人EMBO Journal, 第4卷, 第3861-65頁, Graham, Tibtech 8, 85-87, 1990年4月；Prevec等人, J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；以及McClements等人, 「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420, 1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號以及第5,580,859號，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人, Nature, 及Furth等人, Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors。亦參見WO 98/33510；Ju等人, Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人, 美國專利第4,945,050號；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人, Seminars in Immunology 第9卷, 第271-283頁(1997), (DNA載體系統)；Szoka等人, 美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞之方法)；McCormick等人, 美國專利第5,677,178號(細胞病變病毒之用途)；以及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文所引用之其他文獻。
較佳病毒載體包括桿狀病毒，諸如BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)，特定言之，其限制條件為產生細胞為昆蟲細胞。儘管桿狀病毒表現系統為較佳的，但熟習此項技術者應理解包括上文所描述之彼等表現系統之其他表現系統將有效達成本發明之目的，亦即重組蛋白之表現。
因此，本發明亦提供一種含有聚核苷酸之桿狀病毒，該聚核苷酸包含編碼本發明之多肽之序列。該桿狀病毒，在下文中亦稱為「根據本發明之桿狀病毒」，較佳為經分離之桿狀病毒。
此外，本發明因此亦提供一種質體，較佳表現載體，其包含有包含編碼本發明之多肽之序列的聚核苷酸。該質體，在下文中亦稱為「根據本發明之質體」，尤其為經分離之質體。
本發明亦提供一種由桿狀病毒感染及/或含有桿狀病毒之細胞，其包含有包含編碼本發明之多肽之序列的聚核苷酸；或一種質體，較佳表現載體，其包含有包含編碼本發明之多肽之序列的聚核苷酸。該細胞，在下文中亦稱為「根據本發明之細胞」，較佳為經分離之細胞。
當用於經分離之細胞之上下文中時，術語「經分離」係因人工而離開其天然環境存在且因此不為自然界產物之細胞。
在再一態樣中，本發明亦係關於本發明之免疫原性組合物用於製備藥物，較佳疫苗的用途。
在此上下文中，本發明亦提供一種產生本發明之免疫原性組合物之方法，其中該方法包含用根據本發明之桿狀病毒感染細胞，較佳昆蟲細胞之步驟。
此外，本發明亦提供一種產生本發明之多肽之方法，其中該方法包含用根據本發明之質體轉染細胞之步驟。
本發明之多肽較佳以足夠穩定自組裝隨後可用於疫苗接種的病毒樣粒子之高量表現。
如本文所用，術語「疫苗接種(vaccination/vaccinating)」意謂但不限於一種方法，其包括向個體投與抗原(諸如免疫原性組合物中所包括之抗原)，其中當向該個體投與時，該抗原(例如本發明之多肽)引起或能夠引起該個體中之保護性免疫反應。
本發明亦提供本發明之免疫原性組合物，其用作藥物，較佳用作疫苗。
特定言之，提供本發明之免疫原性組合物用於減少或預防由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵或疾病的方法中，其中輪狀病毒較佳為具有編碼輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之基因體的群組中之輪狀病毒。尤其提供本發明之免疫原性組合物以用於減少或預防由輪狀病毒感染引起之糞便排出的方法中，其中病毒較佳為具有編碼輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段的基因體的群組中之輪狀病毒。因此，在一個特定實例中，若如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由輪狀病毒A之基因體編碼，則本發明之免疫原性組合物用於減少或預防由輪狀病毒A感染引起之一或多種臨床病徵、死亡、糞便排出或疾病的方法中。
更特定言之，提供本發明之免疫原性組合物以用於減少或預防個體之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中或用於治療或預防個體之輪狀病毒感染的方法中。
如本文所提及之輪狀病毒感染尤其係指感染輪狀病毒A或輪狀病毒C。
此外，提供本發明之免疫原性組合物以用於誘導針對個體之輪狀病毒的免疫反應。
如本文所提及，個體較佳為哺乳動物，諸如豬或牛；或鳥類，諸如雞。特定言之，個體為豬，且其中豬較佳為豬崽或母豬，諸如懷孕母豬。最佳地，在誘導針對個體內之輪狀病毒的免疫反應之情形下，該個體為懷孕母豬。在減少或預防個體中之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出或治療或預防個體之輪狀病毒感染之情形下，該個體最佳為豬崽。
根據一個較佳態樣，本發明之免疫原性組合物用於減少或預防豬崽中之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中，其中該豬崽將由已投與免疫原性組合物的母豬哺乳。已投與免疫原性組合物之該母豬較佳為已在該母豬尤其懷有該豬崽時投與免疫原性組合物之母豬。
此外，本發明係關於一種用於治療或預防輪狀病毒感染，減少、預防或治療由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出，或預防或治療由輪狀病毒感染引起之疾病的方法，其包含向個體投與本發明之免疫原性組合物。
此外，提供一種用於在較佳懷孕母豬中誘導產生對輪狀病毒具有特異性之抗體的方法，其中該方法包含向該母豬投與本發明之免疫原性組合物。
此外，本發明提供一種減少或預防豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法，其中該方法包含： -  向母豬投與本發明之免疫原性組合物，及 -  允許該母豬哺乳該豬崽， 且其中該母豬較佳為懷孕母豬，尤其懷有該小豬。
較佳地，該兩種前述方法包含以下步驟： -   向懷有該豬崽之母豬投與本發明之免疫原性組合物， -   允許該母豬生產該豬崽，以及 -   允許該母豬哺乳該豬崽。
此外，提供一種減少豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法，其中豬崽由已投與本發明之免疫原性組合物的母豬哺乳。
如本文所提及之一或多種臨床病徵較佳選自由以下組成之群： -  腹瀉， -  輪狀病毒拓殖，尤其腸道輪狀病毒拓殖， -  病變，尤其宏觀病變，以及 -  減少之平均每日體重增加。
根據一個實例，本文所提及之一或多種臨床病徵為腸道，尤其小腸之輪狀病毒拓殖。根據另一實例，本文所提及之一或多種臨床病徵為腸病變，尤其宏觀腸病變。
根據另一尤佳態樣，本發明之免疫原性組合物用於上文所描述之任一方法中，其中 -   該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， -   該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， -   針對輪狀病毒之該免疫反應為針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒的免疫反應，或 -   對輪狀病毒具有特異性之該等抗體為對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體， 且其中較佳地，本發明之該免疫原性組合物包含本文所描述之包含基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段的本發明之多肽中之任一者，該免疫原性片段尤其由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在一個特定態樣中，如本文所提及之「感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒」為感染基因型P[23]輪狀病毒。
在另一較佳態樣中，如本文所提及之「感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒」為感染基因型P[23]輪狀病毒及基因型P[7]輪狀病毒。
在一個特定態樣中，如本文所提及之「針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒之免疫反應」為針對基因型P[23]輪狀病毒之免疫反應。
在另一較佳態樣中，如本文所提及之「針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒之免疫反應」為針對基因型P[23]輪狀病毒及基因型P[7]輪狀病毒之免疫反應。
在一個特定態樣中，如本文所提及之「對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體」為對基因型P[23]輪狀病毒具有特異性之抗體。
在另一較佳態樣中，如本文所提及之「對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體」包含或為對基因型P[23]具有特異性之抗體及對基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體。
在另一態樣中，投與本發明之免疫原性組合物以在動物中，較佳在懷孕母豬中誘導對輪狀病毒C具有特異性之抗體的產生。較佳地，在此另一態樣中，本發明之該免疫原性組合物分別包含本文所描述之包含輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段的本發明之多肽中之任一者，該免疫原性片段尤其由與SEQ ID NO: 15之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
本發明進一步提供一種產生本發明之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含用本發明之質體轉染細胞。
此外，提供一種產生本發明之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含用本發明之桿狀病毒感染細胞，較佳昆蟲細胞。
此外，本發明係關於一種產生本發明之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a)    允許用包含編碼本發明之多肽之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該多肽由該載體表現； (b)    其後尤其在該經培養細胞之上清液中回收該多肽，其中細胞碎片較佳經由分離步驟與該多肽分離，該分離步驟較佳地包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾，其中該至少一個過濾器之孔徑較佳為約1至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm； (c)    藉由向步驟(b)之混合物中添加二元伸乙基亞胺(BEI)使載體不活化； (d)    藉由添加硫代硫酸鈉至由步驟(c)產生之混合物中來中和BEI；以及 (e)    藉由利用過濾器之過濾步驟自該混合物移除一部分液體來濃縮由步驟(d)產生之該混合物中之多肽，該過濾器之濾膜之分子量截止值在約5 kDa與約100 kDa之間，較佳在約10 kDa與約50 kDa之間； 且其中該方法包含以下步驟： (f)    將在步驟(e)之後剩餘的混合物與至少一種不同於該多肽的免疫原性物質摻合； (g)    及視情況將在步驟(f)之後剩餘之混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合， 或其中該方法包含以下步驟： (f)    將在步驟(e)之後剩餘的混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合，及 (g)    將在步驟(f)之後剩餘的混合物與至少一種不同於該多肽的免疫原性物質摻合。
對於該與至少一種不同於該多肽之免疫原性物質摻合，分別使用尤其本文所描述之 至少一種不同於該多肽的免疫原性物質， 或組分 (ii)中之任一者。
在該方法之步驟(a)中，該等細胞較佳為昆蟲細胞且該載體較佳為本發明之桿狀病毒。
在該方法之步驟(b)中，該多肽最佳於該等經培養細胞之上清液中回收，而非自細胞內部回收。
此外，本發明提供本發明之免疫原性組合物及該免疫原性組合物在本文所描述之方法中之任一者中的用途，其中該免疫原性組合物可藉由前述產生本發明之免疫原性組合物的方法獲得。
實例以下實例僅意欲說明本發明。其不應以任何方式限制申請專利範圍之範疇。
實例 1 融合蛋白之設計、生產及測試 ： 構築體設計 ：輪狀病毒A VP4序列最初自豬糞便樣本獲得，其最緊密匹配GenBank序列JX971567.1且歸類為P[7]基因型。使用VP4胺基酸57-224 (SEQ ID NO: 3)，在下文中亦命名為「AVP8」，且其對應於VP8蛋白之凝集素樣域，但其中N端延長八個胺基酸殘基。連接部分為Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 9)。豬IgG Fc序列(SEQ ID NO: 7)匹配IgG重鏈恆定前驅體之胺基酸242-470 (Genbank序列BAM75568.1)。接收編碼AVP8之IDT Gblock、Gly-Gly-Ser連接子及豬IgG Fc序列(SEQ ID NO:17)，其所有密碼子均針對昆蟲細胞最佳化且在本文中命名為AVP8-IgG Fc。由AVP8-IgG Fc編碼之蛋白(SEQ ID NO: 12)在本文中亦稱為「AVP8-IgG Fc蛋白」。 選殖、表現及純化 ：
AVP8-IgG Fc為TOPO選殖的，且隨後使用BamHI及NotI限制位點插入桿狀病毒轉移質體pVL1393中，接著與BaculoGold共轉染至Sf9細胞中以產生重組桿狀病毒。產生AVP8-IgG Fc蛋白係如下進行：在0.2 MOI下，於3 L轉瓶中之1L Sf+細胞用捕獲4DPI之消耗培養基感染，在15,000 g下離心20分鐘且經0.2 µm過濾。添加1 mL之MabSelect SuRE LX樹脂漿料(GE Healthcare，目錄號17-5474-01)且在4℃下藉由適度攪拌培育過夜。藉由過濾再捕獲樹脂，經4×10 mL之溫和結合緩衝液(Pierce，目錄號21012)洗滌且在7×5 mL體積之溫和溶離緩衝液(Pierce，目錄號21027)中溶離。合併溶離份且在4℃下針對3.5 L TBS透析一次緩衝液變化。進行BCA分析(Thermo Scientific，目錄號23227)以測定濃度(80 µg/mL)。 血清學研究 ：用具有87.5%抗原及12.5%佐劑之Emulsigen D調配蛋白質A純化之AVP8-IgG Fc蛋白。大約七週齡之豬藉由IM在頸部側接受2 mL劑量，其中21天後增強。每週收集血清樣本持續七週。藉由如下文所描述(「用於ELISA之方案」)之ELISA (圖1)及如下文所描述(「用於病毒中和分析之方案」)之病毒中和分析法(圖2)評估來自疫苗接種AVP8-IgG Fc蛋白之豬的血清。與非相關疫苗對照相比，來自疫苗接種AVP8-IgG Fc蛋白之豬的IgG ELISA結果顯示在第14天SP比率峰值增加且在第21天增強之後再次升高。病毒中和效價類似地在第7天及第14天顯示增加，接著在第21天增強後於第28天顯示第二峰值。
用於 ELISA 之方案對於IgA ELISA，用稀釋於1×PBS 1:16中之完全輪狀病毒抗原塗佈培養基蛋白結合96孔ELISA培養盤。在4℃下培育培養盤隔夜。培育之後，使用1×PBST洗滌培養盤且隨後在37℃下用酪蛋白阻斷溶液阻斷1小時。在洗滌之後，將100 µL於阻斷緩衝液中稀釋至1:40之最終稀釋液的初級抗體添加至培養盤中且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，孔塗佈有100 µl之辣根過氧化酶(HRP)結合山羊抗豬IgA之1:3200稀釋液且在37℃下培育一小時。在洗滌之後，在室溫下用3,5,3',5'-四甲基聯苯胺顯影培養盤15分鐘，且在450 nm處之光學密度(OD)量測之前，用1 N HCl來終止反應。包括陽性及陰性對照之樣本在重複孔中運作且結果報導為(樣本-陰性對照)與(陽性-陰性對照)比率(S-N)/(P-N)之平均值。
對於IgG ELISA，用稀釋於1×PBS 1:8中之完全輪狀病毒抗原塗佈培養基蛋白結合96孔ELISA培養盤。在4℃下培育培養盤隔夜。培育之後，使用1×PBST洗滌培養盤且隨後在37℃下用墨點級阻斷溶液阻斷1小時。在洗滌之後，將100 µL於阻斷緩衝液中稀釋至1:625之最終稀釋液的初級抗體添加至培養盤中且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，孔塗佈有100 µl之辣根過氧化酶(HRP)結合山羊抗豬IgG之1:8000稀釋液且在37℃下培育一小時。在洗滌之後，在室溫下用3,5,3',5'-四甲基聯苯胺顯影培養盤10分鐘，且在450 nm處之光學密度(OD)量測之前，用1 N HCl來終止反應。包括陽性及陰性對照之樣本在重複孔中運作且結果報導為(樣本-陰性對照)與(陽性-陰性對照)比率(S-N)/(P-N)之平均值。
用於病毒中和分析之方案將所有血清及乳汁樣本在56℃下加熱不活化30分鐘。將樣本在輪狀病毒生長培養基(MEM + 2.5% HEPES + 0.3%胰蛋白磷酸酯培養液+ 0.02%酵母+ 10 µg/mL胰蛋白酶)中自1:40連續稀釋至1:2,560。將輪狀病毒A分離株(效價7.0對數TCID 50/mL) 1:25,000稀釋至輪狀病毒生長培養基中。將總共200 µl經稀釋之血清添加至200 µl經稀釋之病毒中；在37℃± 5% CO 2下培育混合物一小時。自接種有MA104細胞之三四天齡之96孔培養盤無菌移除生長培養基。在培育之後，將200 µl之病毒-血清混合物轉移至細胞培養盤中。在37℃± 5% CO 2下培育細胞72小時。在使用當天滴定儲備液及經稀釋之病毒以確定分析中所使用之稀釋度。在培育之後，丟棄上清液且將培養盤用200微升/孔1×PBS洗滌一次。為固定，添加100微升/孔之50%/50%丙酮/甲醇。將培養盤在室溫下培育15分鐘，風乾，隨後用100微升/孔1×PBS復水。初級抗體(兔抗輪狀病毒A多株血清，內部產生)在1×PBS中1:1000稀釋。添加100微升/孔之經稀釋之初級抗體，且將培養盤在37℃± 5% CO 2下培育一小時。在培育之後，培養盤用100微升/孔1×PBS洗滌兩次。將二級抗體(Jackson ImmunoResearch FITC標記之山羊抗家兔IgG，目錄號111-095-003)在1×PBS中以1:100稀釋。添加100微升/孔之經稀釋之二級抗體，且將培養盤在37℃± 5% CO 2下培育一小時。在培育之後，培養盤用100微升/孔1×PBS洗滌兩次。使用紫外輻射顯微鏡讀取培養盤之螢光存在。若發現經稀釋之病毒之效價(使用Reed-Muench方法產生)為2.8 ± 0.5對數TCID 50/mL，則該分析視為有效的。另外，各分析中包括已知陽性及陰性樣本作為對照。血清效價報導為最高稀釋度，其中未觀測到染色。
實例 2 攻毒研究： 此研究之主要目的為評價向豬提供針對毒力輪狀病毒A攻毒之被動保護的習知母豬投與原型疫苗，在本文中亦稱為「IgG:AVP8」，包括AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)及非相關對照疫苗，在本文中稱為「安慰劑」。此外，為了比較，在該研究中使用可商購的MLV輪狀病毒痘苗(ProSystem® Rota, Merck Animal Health)，在本文中亦稱為「商業產品」或「商業疫苗」。以與上文實例1中所描述之產生類似之方式產生原型疫苗，但其中將不同體積用於感染且培育時段更長，如下文章節「 IgG:AVP8 之產生」中所描述。商業產品係根據用於疫苗ProSystem® TGE/Rota之由製造商提供之標籤說明書(劑量及方向，以及用於豬之口服疫苗接種的建議方法)。
研究中包括總共16隻母豬。將母豬隨機分為三個處理組及一個嚴格對照組，如下表1中所描述。將T02及T04中之母豬共混於三個房間之間。將T06及T07中之母豬圈養在兩個單獨的房間中。所有母豬均藉由如表1中所列之適當途徑接種適當物質。T07中之母豬保持未經疫苗接種(嚴格對照)。在整個疫苗接種時段期間定期自母豬收集血清且分析血清轉化之證據。在分娩之前收集糞便樣本且藉由RT-qPCR篩選以證實母畜在分娩之前未主動排出輪狀病毒。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。使分娩天然進行直至母豬到達妊娠第114天。此後，誘導分娩。在分娩時，豬崽入選試驗中。僅將在出生時健康之豬崽標記，根據設施標準操作程序處理且包括於試驗中。當豬為零至五日齡時，對其進行抽血，收集糞便拭子，且對豬進行攻毒(不包括T07)。在攻毒時，向豬胃內投與5 mL劑量之碳酸氫鈉，隨後胃內投與5 mL劑量之攻毒物質。在整個攻毒時段，每日監測所有動物是否存在腸道疾病(腹瀉及行為變化)。在整個攻毒時段定期收集糞便樣本。在攻毒後兩天(DPC 2)，使大致三分之一的來自各窩之豬安樂死。安樂死之後，進行屍體剖檢且評估豬之宏觀病變。收集腸切片用於顯微及免疫組織化學評價。收集腸拭子用於RT-qPCR評價。在DPC 21，對所有剩餘豬進行稱重、抽血且收集糞便拭子。在樣本收集之後，將豬安樂死。評價豬之宏觀病變且收集腸拭子。 表 1 ：研究設計
組別 N ( 母豬 ) N ( 豬崽 ) 房間 母豬疫苗接種 ( 分娩前 6 及 2週 ) 豬崽攻毒 (DPC0 ； 0-5 日齡 ) 屍體剖檢
描述 途徑 / 劑量 *
T02 6 57 共混於房間115、116及117之間 安慰劑 2mL IM + 2mL IN 組織勻漿1:2稀釋1 mL胃內劑量 在DPC2對1/3豬進行屍體剖檢；在DPC21對剩餘豬進行屍體解剖
T04 5 46 IgG:AVP8 2mL IM
T06 2 22 118 商業疫苗 在分娩5及2週口服2 mL+在分娩之前1週IM 2 mL
T07 3 27 114 嚴格對照 不適用 無 不適用
*IM=肌肉內，IN=鼻內            
在整個研究中，來自T07 (嚴格對照)之母豬的血清VN效價保持恆定或下降，指示缺乏暴露及有效研究(如上文在實例1中所描述來評估病毒中和(「 用於 病毒中和分析之方案」)，結果展示於 圖 3)。在疫苗接種階段，在疫苗接種IgG:AVP8 (T04)原型疫苗之母豬血清中觀測到最高平均VN效價。在此組中，在分娩前六週投與之一劑導致在T04 (IgG:AVP8)中之3/5動物到D14時效價增加四倍或更多。在豬攻毒之前，T04 (IgG:AVP8)中之5/5隻動物之效價增加四倍或更多。在疫苗接種階段，安慰劑組(T02)中之母豬之血清VN效價無顯著增加(＜2倍)。直至D35，在T06 (商業疫苗)中之母豬之血清VN效價無顯著增加(＜2倍)。在豬攻毒之前，T06 (商業疫苗)之兩隻母豬之效價增加四倍。在外肌暴露至攻毒物質之後，T02 (安慰劑)及T06 (市售疫苗)中之母豬之VN血清效價增加。反之，在4/5母豬中，T04 (IgG:AVP8)中之母豬之VN血清效價保持恆定或降低。關於初乳及乳汁VN效價，在組T04 (IgG:AVP8)中，在分娩時VN效價最高，在攻毒前樣本中降低且在攻毒後樣本中進一步降低。在安慰劑組(T02)中，在分娩及攻毒前VN效價較低，但在外肌暴露至攻毒物質之後增加。
在攻毒前豬血清中之VN效價在T04 (IgG:AVP8)中之大部分豬中較高(＞1280)，表明來自母豬之免疫性被動轉移至豬。反之，T02 (安慰劑)及T06 商業疫苗)中之豬之大部分效價較低(＜1280)。
在整個攻毒階段中，在T02 (安慰劑)中觀測到最高死亡數目，其中8/57 (14.0%)之豬死亡。反之，在T04 (IgG:AVP8)中僅1/46 (2.2%)豬死亡，在T06 (商業疫苗)中1/22 (4.5%)豬死亡，且在T07 (嚴格對照)中1/27 (3.7%)豬死亡。在整個研究中，在T07 (嚴格對照)中之豬中未觀測到腹瀉之臨床病徵。在攻毒後(DPC)第1天或第2天，T02 (安慰劑)中之豬開始腹瀉之臨床病徵且在DPC10在大部分動物中消退。總體而言，在研究期間至少一次在T02 (安慰劑)中之44/57 (77.2%)之動物中觀測到腹瀉之臨床病徵。在此等44隻動物中，腹瀉在29 (65.9%)隻動物中視為嚴重的。相比之下，在T04 (IgG:AVP8)中之豬中腹瀉之臨床病徵減少。關於各組之臨床腹瀉結果之概述，參見下表2。 表 2 ： 各組具有異常腹瀉 ( 曾有 ) 之動物之百分比
組別 曾經異常* 曾經嚴重**
T02-安慰劑 44/57 (77.2%) 29/44 (65.9%)
T04- IgG:AVP8 15/46 (32.6%) 8/15 (53.3%)
T06-商業疫苗 13/22 (59.1%) 10/13 (76.9%)
T07-嚴格對照 0/27 (0.0%) 不適用
*包括在研究期間至少一次分數為1或2的豬除以每組豬之總數 **包括在研究期間至少一次分數為2的豬除以曾經異常之豬的總數
在攻毒之前，藉由RT-qPCR未偵測到輪狀病毒A RNA，表明為有效研究。另外，在整個研究中，在來自T07 (嚴格對照)母豬或豬中藉由RT-qPCR未偵測到輪狀病毒A RNA。在攻毒之後的豬中，在T02 (安慰劑)中之排出最普遍。在大部分豬中，在DPC1-3開始排出且持續直至DPC14。最關注的係與T02 (安慰劑)及T06 (商業疫苗)相比，T04 (IgG:AVP8)中觀測到之排出減少。排出之百分比及所偵測之RNA之中值量均減少(參見 圖 4，關於研究日之組中值對數輪狀病毒A RNA基因體拷貝數(gc)/mL糞便)；測試如下文所描述進行(「 用於 輪狀病毒 A qRT-PCR 之方案」) 。
將來自各組之隨機選擇之豬子集安樂死且在DPC2進行屍體剖檢。評價豬之存在宏觀腸病變(薄壁、氣擴張之小腸、純液體含量等)、顯微病變(萎縮性腸炎)及藉由免疫組織化學(IHC)特定染色之輪狀病毒A。下表3呈現在按組屍體剖檢時具有腸病變之豬的數目。攻毒視為成功的，因為安慰劑組(T02)中之84.2% (16/19)豬具有宏觀病變且彼等之63.2% (12/19)具有染色。最關注的係在T04 (IgG:AVP8)中僅1/15豬缺乏輪狀病毒A染色。另外，相比於T02 (安慰劑)及商業產品(T06)，在T04 (IgG:AVP8)中具有宏觀病變之豬之百分比降低。 表 3. 在按組屍體剖檢時具有腸病變及 IHC 染色之動物之百分比 .
組別 在 DPC2 處之腸病變 * 在 DPC2 處之 IHC 染色 **
位置 % 分數 1 之數目 分數 2 之數目 分數 3 之數目
T02-安慰劑 16/19 (84.2%) 12/19 (63.2%) 2/12 (16.7%) 2/12 (16.7%) 8/12 (66.6%)
T04- IgG:AVP8 4/15 (26.7%) 1/15 (6.7%) 0/1 (0.0%) 0/1 (0.0%) 1/1 (100.0%)
T06-商業疫苗 4/8 (50.0%) 4/8 (50.0%) 3/4 (75.0%) 1/4 (25.0%) 0/4 (0.0%)
T07-嚴格對照 不適用 § 不適用 §
*表示在DPC2處具有腸病變之豬之數目除以DPC2處之豬屍體剖檢之總數目
**其中分數1=＜10%之絨毛含有抗原，分數2=10%至50%之絨毛含有抗原，分數3=＞50%之絨毛含有抗原
§不適用，因為來自T07之豬不進行屍體剖檢
計算存活豬之平均每日體重增加(以kg為單位)且呈現於下表4中。在來自T04 (IgG:AVP8)之豬中觀測到ADWG中之最高數值益處。疫苗接種後ADWG之增加與T02 (安慰劑)相比顯著不同。 表 4. 按組之以 kg 為單位之平均每日體重增加 ( 標準差 ).
組別 以 kg 為單位之 ADWG 平均值 ( 標準差 )
T02-安慰劑 0.15 (0.13)
T04- IgG:AVP8 0.25 (0.08)
T06-商業疫苗 0.22 (0.11)
T07-嚴格對照 0.23 (0.07)
總之，用IgG:AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO: 12之多肽)在分娩前六週及兩週對習知母豬進行疫苗接種在母豬血清及初乳中產生較高中和抗體效價。如藉由在來自疫苗接種之母豬的豬血清中偵測高效價(＞1280)所證明，此等中和抗體被動傳輸至出生後的豬。豬中存在較高中和抗體效價引起臨床保護。特定言之，相比於安慰劑對照及商購疫苗生出的豬，接種疫苗之母豬生出的豬具有減少的輪狀病毒A RNA之糞便排出、降低之死亡率、減少之腹瀉臨床病徵、減少之在DPC2處之輪狀病毒A之拓殖、減少之在DPC2處之宏觀病變及增加之ADWG。
用於輪狀病毒 A qRT-PCR 之方案為了測定糞便樣本中之輪狀病毒A RNA，定量一步RT-PCR套組(iTaq Universal一步RT-PCR套組；BioRad，目錄號1725140)用於分析。關於引子及探針資訊參見下表5。 表 5 ： 引子 (F/R) 及探針 (Pr1/Pr2) 資訊
名稱 序列 大小 位置
RVA F 5′-GCT AGG GAY AAA ATT GTT GAA GGT A-3′ (SEQ ID NO:22) 25 40..64
RVA R 5′-ATT GGC AAA TTT CCT ATT CCT CC-3′ (SEQ ID NO:23) 23 145..167
RVA Pr1 5′-FAM-ATG AAT GGA AAT GAY TTT CAA AC-MGB-3′ (SEQ ID NO:24) 23 121..143
RVA Pr2 5′-FAM-ATG AAT GGA AAT AAT TTT CAA AC-MGB-3′ (SEQ ID NO:25) 23 121..143
在含有5 µl之所提取總核酸、1 µl之各探針(5 µM)、1 µl之各引子(10 µM)、10 µl之2×RT-PCR混合物、0.5 µl iScript逆轉錄酶及0.5 µl之經DEPC處理之水的20 µl反應物中進行即時RT-PCR。使用CFX96即時PCR偵測系統(BioRad)在以下條件下進行反應：初始逆轉錄在50℃下10 min，接著初始變性在95℃下3 min，40個週期之95℃下之變性15 s及60℃下退火及延伸45 s。為產生相對定量資料，兩種輪狀病毒A g阻斷液之連續稀釋液包括於各運行中。使用5.0×10 7個基因體拷貝/微升作為起始濃度，在運行中包括相等量之g阻斷液中之每一者。使用CFX管理器軟體分析光學資料。對於各測定，使用循環臨限值(Ct)測定模式之回歸設置自動地計算臨限值線。使用減去基線之模式自動進行基線減除。人工校正基線末端值小於10之曲線。
IgG:AVP8 之產生在5 L搖瓶中用1.7 mL之含有輪狀病毒A VP8核-豬IgG Fc融合蛋白(BaculoGold (BG)/pVL1393-AVP8-IgG；1.18×10 8TCID50/mL)之重組桿狀病毒儲備液感染於搖瓶中之大致1×10 6個細胞/mL濃度之2 L Sf+ (草地黏蟲 Spodoptera frugiperda))細胞。將搖瓶在28℃± 2℃下在以90 rpm之持續攪拌下培育五天。將細胞及培養基無菌轉移至3×1 L離心瓶中，且在4℃下以10,000 g使細胞集結20分鐘。使所得上清液通過0.2 µm過濾器(Thermo Scientific，目錄號567-0020)，隨後在4℃下在適度攪拌下用2.5 mL之MabSelect SuRe LX蛋白A樹脂(GE Healthcare，目錄號17-5474-01)培育隔夜。樹脂藉由0.2 µm過濾(Thermo Scientific，目錄號567-0020)回收，隨後用12×10 mL體積之溫和Ag/Ab結合緩衝液(Thermo Scientific，目錄號21012)洗滌。使用7×10 mL體積之溫和Ag/Ab溶離緩衝液(Thermo Scientific，目錄號21027)自樹脂溶離AVP8-IgG。將VP8-IgG相對於3.5 L之20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl滲析一次緩衝液變化。在37℃下將殘餘桿狀病毒用5 mM BEI不活化24小時。所得物質在1×PBS (Gibco，目錄號10010-023)中稀釋至70 µg/mL之目標濃度。用12.5% Emulsigen D調配經稀釋之物質。
實例 3 血清學研究 ： 此研究之主要目的為評價向習知母豬投與原型疫苗(包括AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12))及對照疫苗(本文中稱為「安慰劑」)是否產生針對輪狀病毒A之血清學反應。原型疫苗(包含Emulsigen D或Carbopol作為佐劑，參見下表7 A及表7 B)，在本文中亦稱為「IgG-AVP8」係以類似於上文在實例1及2中所描述之產生方式產生，但其中不同體積用於感染及更長的培育期，如下文在章節「 疫苗產生： IgG-AVP8」中所描述。
研究中包括總共20隻母豬。將母豬隨機分為四個處理組，如下表6中所描述。在整個研究中，將母豬共混。所有母豬在D0及D21時肌肉內疫苗接種適當物質，如表4中所列出。在整個研究中定期自母豬收集血清且藉由病毒中和分析來分析血清轉化之證據。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。在D42終止研究。 表 6 ：研究設計
組別 N 在 D0 及 D21 時用於 IM* 疫苗接種之物質 血液收集日期 研究終止
T02 8 IgG-AVP8 / Emulsigen D D0、7、14、21、28、35、42 D42
T03 8 IgG-AVP8 / Carbopol
T06 2 安慰劑/ Emulsigen D
T07 2 安慰劑/ Carbopol
*IM =肌肉內      
在整個研究中，來自T06及T07 (安慰劑組)中之母豬之血清VN效價保持恆定或下降，表明缺乏暴露及有效研究(病毒中和係如上文在實例1中所描述評估(「 用於 病毒中和分析之方案」)，其中評價增加之稀釋度-1:40至1:40,960之修改)。在疫苗接種階段，經IgG-AVP8/Emulsigen D (T02)及IgG-AVP8/Carbopol (T03)原型疫苗接種之母豬的效價顯著增加(＞4倍)。對於兩組(T02及T03)，在一次疫苗接種後各組平均效價高於640且在整個研究時段中保持高於640。相比之下，安慰劑組(T06及T07)中之母豬在整個研究中血清VN效價無顯著增加(＜2倍)。
總之，用IgG-AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO: 12之多肽)在分娩前六週及兩週對習知母豬進行疫苗接種在母豬血清中產生較高中和抗體中和抗體。
疫苗產生： IgG-AVP8對於0.22之MOI，用1.19×10 8TCID50/mL之15 mL BG/pVL1393-AVP8-IgG感染於有夾套之10 L Sartorius Biostat B玻璃容器中之8 L之1.00×10 6個細胞/mL的Sf+細胞。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運作且在0.3 slpm下鼓泡氧氣。在6 DPI下捕獲容器，在10,000 g及4℃下離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare,目錄號6715-7582)。在27℃下用5 mM BEI使2750 mL之澄清上清液不活化五天。在殘餘BEI用硫代硫酸鈉中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE,目錄號UFP -10-C-4MA)濃縮2750 mL大致12×至225 mL。濃度測定為255 µg/mL。 表 7 A. 疫苗調配物
組分 目標 體積 濃度
AVP8-IgG蛋白質 抗原 16.5 mL 27.5%
PBS 稀釋液 31.5 mL 52.5%
Carbopol 佐劑 12 mL 20%
表 7 B. 疫苗調配物
組分 目標 體積 濃度
AVP8-IgG蛋白質 抗原 16.5 mL 27.5%
PBS 稀釋液 36 mL 60%
Emulsigen D 佐劑 7.5 mL 12.5%
實例 4此研究之主要目的為評價經IgG-AVP8 (包括AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12))疫苗接種之動物是否能夠交叉中和除P[7]以外的各種G型及P型之各種輪狀病毒A血清型/基因型，AVP8-IgG Fc蛋白係自該研究設計。此將指示AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)針對其他分離株具有保護性之能力。
簡言之，來自經IgG-AVP8疫苗接種之豬的熱不活化血清以1:200開始在自列A至列G之稀釋阻斷液中在MEM中稀釋2倍。列H不含血清。在另一稀釋阻斷液中，各種G型及P型之輪狀病毒A在來自第1行至第11行之6.0 Log 10TCID 50/mL開始的整個稀釋盤中稀釋1.5倍。第12行不含病毒。將來自相應孔之250 µL病毒及250 µL血清合併且在37℃下培育1小時。在培育1小時之後，將100 µL病毒-血清混合物覆蓋於單層MA104細胞上，且在37℃下培育72小時並且藉由IFA染色且讀取病毒之存在。病毒之存在記錄為培養盤上之『+』且病毒之缺乏記錄為『0』。隨後將此等結果轉移至表8。
將以下六種輪狀病毒A分離株與此分析進行比較：G9P[7]、G9P[23]、G4P[23]、G3P[7]、G5P[7]及G4P[7]。表1中之結果表明P型P[23]交叉中和P[7]。包括P[7]或P[23]之所有G型亦經中和，指示在此分析中，G型在病毒之中和中並不顯著。 表 8 ：研究設計及結果
                                      
G9P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600     D + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + + + 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + + 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + 0 + + + 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + 0 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
                                   
G9P[23] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + + + + 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + + + + + + 0
無血清 H + + + + + + + + + + + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
                                   
G4P[23] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
無血清 H + + + + + + + + + 0 + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
                                   
G3P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + 0 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
                                   
G5P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + + + + + + 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + + + + + 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + + + + + 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
                                   
G4P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + 0 0 0 0 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
總之，經IgG-AVP8 (包括AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12))疫苗接種之動物將交叉中和輪狀病毒基因型P[7]及P[23]。G型在病毒中和方面發揮顯著作用。
實例 5 豬中之概念實驗驗證 ：總共40隻動物用於此研究。豬隨機分為四個處理組，每組10隻豬。在整個研究中，將豬共混。在處理之前獲取整體健康狀況觀測結果、篩選前血清樣本及篩選前糞便樣本以確認動物健康，確定對輪狀病毒A之基線血清學反應且在疫苗接種之前或在疫苗接種時證實無活性輪狀病毒A感染。研究第零天(D0)時，動物肌肉內疫苗接種以下物質：T01：IgG-P[7] AVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 12之多肽)；T02：IgG-P[13] AVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 14之多肽)；T03：P[7] AVP8-IgG-P[13] AVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 16之多肽)；T04：安慰劑。在研究第0、7、14、21、28、36、42及49天採集血清樣本。在研究D49時在屍體剖檢時對所有動物進行人道安樂死。藉由病毒中和分析法測試血清樣本以測定隨時間推移對疫苗原型之血清學反應。經T01疫苗接種之動物具有抗體中和輪狀病毒基因型P[7]及P[23]，經T02疫苗接種之動物具有抗體中和輪狀病毒基因型P[13]且經T03疫苗接種之動物具有抗體中和輪狀病毒基因型P[7]、P[13]及P[23]。
實例 6 SDS PAGE ： 存在及不存在DTT ( 圖 5 A))之經蛋白質A純化之AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)產物的SDS-PAGE：產生用於SDS-PAGE影像之樣本的方法簡化如下:在37℃下用10 mM BEI不活化桿狀病毒收穫上清液36小時且隨後中和。隨後使用蛋白A樹脂純化樣本。所有樣本隨後使用具有25 mM DTT (最終)或等體積水之NuPAGE 4×LDS樣本緩衝液(Invitrogen，目錄號NP0007)變性，且在95℃下加熱10分鐘。樣本在180 V下之4%-12% SDS-PAGE凝膠(Invitrogen，目錄號NP0335BOX)上運行45分鐘且染色(eStain L1，GenScript目錄號M00548-1；destain目錄號M00549-1)。
因此，發現在具有還原(+DTT (二硫蘇糖醇))樣本之色帶中,主要一個條帶(單體AVP8-IgG Fc蛋白，其結合下文所描述之西方墨點法之結果考慮)。在用未經還原之樣本(-DTT)運行的色帶中可見其他條帶。額外條帶之分子量範圍各自為單體之倍數。
西方墨點法 ： 抗豬IgG Fc片段西方墨點法( 圖 5 B))：在BEI添加之前，用1 mL樣本收集在生物反應器中產生之AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)產物。樣本在20,000g及4℃下離心5分鐘，將上清液傾析至新試管中，且將集結粒與上清液儲存於-70℃下。集結粒及上清液經解凍，將集結粒再懸浮於1 mL 8 M脲中，隨後在還原條件(+DTT)下在SDS-PAGE上運行等量集結粒及上清液，且轉移至PVDF膜。用HRP結合山羊抗豬之1:1000稀釋液來探測西方墨點以偵測豬IgG Fc片段。
因此，未在細胞集結粒樣本中出乎意料地發現AVP8-IgG Fc蛋白。實際上，在細胞培養物上清液樣本中有利地發現所有AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)。
實例 7 共有序列之產生 ： 產生SEQ ID NO: 4 (基於基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白)及SEQ ID NO: 5 (基於基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白)之共有序列，如下文中所描述： 序列由公開可獲得之豬輪狀病毒VP4核苷酸序列自NCBI病毒變化資料庫及內部衍生之輪狀病毒分離序列編譯。亦編譯序列之額外後設資料，包括用於以下之後設資料：分離株名稱、分離株P型、地理來源及可獲得時之分離日期。將核苷酸序列轉譯成蛋白質序列，且使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數比對至已知VP8蛋白。修整未比對之VP5胺基酸且丟棄。將VP8比對蛋白序列導入MEGA7軟體以進行種系發生分析，且基於VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建。使用泊松校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)且按比例繪製，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離。其中將自助重抽法叢聚關聯大於70%之節點視為顯著的。將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚。將不擬合至大叢聚中之離群序列個別地針對序列品質及P型來源進行評估。自分析中移除疑似低品質序列，而保留來自在豬輪狀病毒中很少觀測到之P型的序列。基於所需產物保護概況以及活體外血清交叉中和研究選擇用於產生共有序列之叢聚。根據每個比對位置之最大頻率產生共有序列，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及產物保護概況選擇胺基酸殘基。
實例 8 攻毒研究： 此研究之主要目的為評價向豬提供針對毒力輪狀病毒A攻毒之被動保護的習知母畜投與原型疫苗，在本文中亦稱為「IgG#AVP8」，包括AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)及非相關對照疫苗，在本文中稱為「安慰劑」。以與上文實例1中所描述之生產類似之方式生產原型疫苗，但其中不同體積用於感染及不同的純化方法，如下文章節「 IgG#AVP8 之 生產」中所描述。
研究中包括總共20隻母畜。將母畜隨機分為兩個處理組及一個嚴格對照組，如下表9中所描述。將T01及T03中之母畜在三個房間之間共混。將T07中之母畜圈養在獨立的房間中。所有母畜均藉由如表9中所列之適當途徑接種適當物質。T07中之母畜保持未經疫苗接種(嚴格對照)。在整個疫苗接種時段期間定期自母畜收集血清且分析血清轉化之證據。在分娩之前收集糞便樣本且藉由RT-qPCR篩選以證實母畜在分娩之前未主動排出輪狀病毒。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。使分娩天然進行直至母豬到達妊娠第114天。此後，誘導分娩。在分娩時，豬崽入選試驗中。僅將在出生時健康之豬崽進行標記，根據設施標準操作程序處理且包括於試驗中。當豬一至五日齡時，對其進行抽血，收集糞便拭子，且攻毒豬(不包括T07)。在攻毒時，向豬胃內投與5 mL劑量之碳酸氫鈉，隨後胃內投與1 mL劑量之攻毒物質。在整個攻毒時段，每日監測所有動物是否存在腸道疾病(腹瀉及行為變化)。在攻毒後一天(DPC1)收集糞便樣本。在DPC2，使T01及T03中之所有豬安樂死。收集腸切片用於顯微及免疫組織化學評價。 表 9 ：研究設計
組別 N ( 母畜 ) N ( 豬崽 ) 房間 母豬疫苗接種 ( 分娩前 6 週及 2 週 ) 豬崽攻毒 (DPC0 ； 1-5 日齡 ) 屍體剖檢
描述 途徑 / 劑量 *
T01 8 67 在房間CC1、CC2、CC3之間共混 安慰劑 2mL IM 輪狀病毒A P[7]組織勻漿1:2稀釋液 胃內1 mL劑量 DPC2
T03 8 72 IgG#AVP8 2mL IM
T07 4 35 CB8 嚴格對照 不適用 無 不適用
*IM =肌肉內
在整個研究中，來自T07 (嚴格對照)之母畜的血清VN效價增加低於4倍，表明缺乏暴露及有效的研究(如上文實例1 (「 用於病毒中和分析之方案」)中所描述來評估病毒中和，結果展示於表10及 圖 6中)。在疫苗接種階段，在疫苗接種原型疫苗IgG#AVP8 (組T03)之母畜血清中觀測到最高平均VN效價。在此組中，在分娩前六週投與之一劑導致T03 (IgG#AVP8)中6/8動物到D14時效價增加四倍或更多。在疫苗接種階段，組T01 (安慰劑)中之母畜中無一者具有顯著的血清VN效價增加(＜2倍)。母畜初乳VN效價：組T03 (IgG#AVP8)中之母畜具有相比於組T01 (安慰劑)中之母畜更高的平均VN效價。 表 10 ： VN 結果
組別 母畜 血清 初乳
D0 D14 D21 D28 DPC0 DOF*
T01 887 160 320 320 453 320 160
7768 320 160 320 320 320 1280
7777 320 320 640 640 640 226
7785 320 640 905 905 1810 640
7795 160 80 640 640 640 1280
7802 320 113 453 320 640 1280
7813 320 640 640 905 453 905
7821 160 320 320 160 113 320
T03 1051 320 1280 320 1280 320 640
7767 160 640 1280 905 1280 2560
7772 160 1280 1280 1280 2560 2560
7774 160 1280 1280 1280 2560 1280
7781 320 640 905 640 640 453
7783 160 640 1280 905 2560 2560
7798 113 226 640 640 1280 453
7807 160 1280 1280 453 1280 2560
T07 886 226 80 160 1280 320 320
889 160 320 320 320 453 1280
7770 226 113 320 226 320 1280
7778 226 453 320 320 640 80
*DOF =分娩日
在攻毒前豬血清中之VN效價在組T03 (IgG#AVP8)中之大部分豬中較高(＞1280)，表明來自母畜之免疫性被動轉移至豬。反之，在T02 (安慰劑)中之豬中大部分效價較低(＜1280)。
在組T01 (安慰劑)及T03 (IgG#AVP8)中，若輪狀病毒抗原係藉由至少一個腸部分中之免疫組織化學(IHC)來偵測，則豬被定義為感染的，且動物在攻毒後至少一天具有異常糞便分數。頻率分佈列於下表11中。基於此案例定義之用途，在分娩前6週及2週用原型疫苗IgG#AVP8 (組T03)疫苗接種母畜在用異源輪狀病毒A P[7]攻毒物質攻毒之後的豬中避免輪狀病毒相關之疾病；預防分率0.926，95%信賴區間0.734, 0.979。 表11.案例定義之頻率分佈
  組別 總計 案例定義 *
  0 1
  N % N %
  T01 67 42 62.7 25 37.3
  T03 72 70 97.2 2 2.8
*案例定義：若回腸或空腸組織樣本中之一或多者對輪狀病毒A為IHC陽性(分數＞0)且在攻擊後之任一天具有至少一個異常糞便分數，則豬被視為感染的。分數0=未感染；1=感染的
總之，在分娩前六週及兩週用原型疫苗IgG#AVP8 (包含SEQ ID NO: 12之多肽)對習知母畜進行疫苗接種在母豬血清及初乳中產生較高中和抗體效價。如藉由在來自疫苗接種之母畜的豬血清中偵測高效價(＞1280)所證明，此等中和抗體被動傳輸至出生後的豬。豬中存在較高中和抗體效價引起臨床保護。特定言之，相比於安慰劑對照生出的豬,疫苗接種之母畜生出的較少的豬視為感染的。
IgG#AVP8 之生產將兩個10 L有夾套之Sartorius Biostat B玻璃容器以1.00×10 6個細胞/mL接種3 L Sf+細胞。在接種之後三天，各容器以0.1之MOI感染且使用實例細胞420無血清培養基(SAFC目錄號14420C-1000 mL)將各容器之體積調節至8 L。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運行，其中溶氧設定為40%或高於40%，且CCA覆層在1.3 slpm下。在接種後7天收集容器；在4℃下以10,000 g使流體離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare，目錄號6715-7582)。在37℃下藉由5 mM BEI在有夾套之Sartorius Biostat B玻璃容器中使澄清的上清液(8升/容器)不活化三天。在不活化之後，用硫代硫酸鈉中和殘餘BEI。在中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE，目錄號UFP-10-C-5A)將7000 mL濃縮大致10×至700 mL。用5個體積(3500 mL)之1×PBS對經濃縮之物質進行透濾。疫苗用12.5% Emulsigen D、28%濃縮物質及59.5% 1×PBS (體積:體積)調配。
實例 9 豬中之概念實驗驗證 ：總共20隻動物用於此研究。豬隨機分為兩個處理組，每組10隻豬。在整個研究中，將豬共混。在處理之前獲取整體健康狀況觀測結果、篩選前血清樣本及篩選前糞便樣本以確認動物健康，確定對輪狀病毒C之基線血清學反應且在疫苗接種之前或在疫苗接種時證實無活性輪狀病毒C感染。研究第零天(D0)及D28時，動物肌肉內疫苗接種以下物質：T01：IgG-P CVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 15之多肽)；T02：安慰劑。在研究第0、7、14、21、28、36及42天採集血清樣本。在研究D42時在屍體剖檢時對所有動物進行人道安樂死。藉由ELISA測試血清樣本以測定隨時間推移對疫苗原型之血清學反應。經T01疫苗接種之動物的抗輪狀病毒C抗體平均含量高於經T02疫苗接種之動物，其效價未增加。
實例 10 豬中之概念實驗驗證 ：此研究之主要目的為評價向豬提供針對毒力輪狀病毒A攻毒之被動保護的習知母畜投與原型疫苗，在本文中亦稱為「IgG:AVP8 P[6,7,13]」，包括三種AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14)及非相關對照疫苗，在本文中稱為「安慰劑」。以與上文實例1中所描述之產生類似之方式產生原型疫苗之組分且隨後如下文章節「 IgG:AVP8 P[6,7,13] 之 產生」中所描述混合。
研究中包括總共32隻母畜。將母畜隨機分為兩個處理組及一個嚴格對照組，如下表12中所描述。將T01及T03中之母畜共混於七個房間之間。將T04中之母畜圈養在獨立的房間中。所有母畜均藉由如表12中所列之適當途徑接種適當物質。T04中之母畜保持未經疫苗接種(嚴格對照)。在整個疫苗接種時段期間定期自母畜收集血清且藉由病毒中和(VN)及酶聯免疫吸附分析法(ELISA)分析血清轉化之證據。在分娩之前收集糞便樣本且藉由RT-qPCR篩選以證實母畜在分娩之前未主動排出輪狀病毒。在此研究期間，如上文實例2(「 輪狀病毒 A qRT-PCR 之方案」)中所描述進行RT-qPCR。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。使分娩天然進行直至母豬到達妊娠第115天。此後，誘導分娩。在分娩時，豬崽入選試驗中。僅將在出生時健康之豬崽標記，根據設施標準操作程序處理且包括於試驗中。當豬為零至五日齡時，對其進行抽血，收集糞便拭子，且對豬進行攻毒(不包括T04)。在攻毒時，向豬胃內投與5 mL劑量之碳酸氫鈉，隨後胃內投與1 mL劑量之攻毒物質。在整個攻毒時段，每日監測所有動物是否存在腸道疾病(腹瀉及行為變化)。在攻毒(DPC1)及DPC3後一天期集糞便樣本。在DPC3，使T01及T03中之所有豬安樂死。收集腸切片用於顯微及免疫組織化學評價。 表 12 ：研究設計
組別 N ( 母畜) 母畜疫苗接種 ( 分娩前6 及2 週) 豬崽攻毒 (DPC0 ；0-5 日齡) 屍體剖檢
描述 途徑/ 劑量*
T01 14 安慰劑 2mL IM 輪狀病毒A P[7]組織勻漿1:2稀釋液 1mL胃內劑量 DPC3
T03 14 IgG:AVP8 P[6,7,13] 2mL IM
T04 4 嚴格對照 不使用 無 不適用
*IM = 肌肉內
在整個研究中，來自T04 (嚴格對照)之母畜的血清VN效價增加4倍或低於4倍，表明缺乏暴露及有效的研究(如下文所描述(「用於病毒中和分析之方案」)中所描述來評估病毒中和，結果展示於表13及 圖 7中)。在疫苗接種階段，組T01 (安慰劑)中之母畜中無一者具有顯著的血清VN效價增加(≤2倍)。在D14、D21、D27及D47，與經疫苗接種安慰劑之母畜(組T01)相比，經疫苗接種原型疫苗IgG:AVP8 P[6,7,13](組T03)的母畜之血清中之VN效價顯著更高(p＜0.01)。與組T01 (安慰劑)中之母畜相比，組T03 (IgG:AVP8 P[6,7,13])中之母畜的平均初乳VN效價亦顯著更高。 表 13 ： VN 結果
組別 母畜 血清 初乳
D0 D14 D21 D28 D47 DOF*
T01 1054 226 320 226 226 160 320
1154 80 80 160 160 113 320
1155 113 113 160 226 160 320
1160 113 453 226 226 80 226
1162 226 320 640 320 320 640
1163 160 226 226 160 320 1280
8093 80 80 160 130 160 453
8101 320 160 320 320 320 320
8105 320 1280 453 905 453 640
8107 160 320 320 320 226 40
8120 226 320 226 320 320 640
8121 226 320 160 640 226 320
8127 160 160 320 226 160 160
8131 320 320 453 453 640 640
T03 1045 1280 1280 1280 1280 2560 640
1053 320 2560 1280 1280 1280 2560
1055 320 905 1280 1280 640 3620
1158 320 453 905 1280 640 2560
1159 160 320 905 640 1810 5120
1161 320 320 640 320 1280 1280
8100 226 2560 1810 622 10240 14482
8102 320 640 905 640 5120 3620
8103 320 1280 640 453 1280 1810
8108 320 1810 1280 640 1280 2560
8117 453 320 640 905 640 2560
8118 320 905 1280 640 1280 905
8122 160 320 640 320 1280 640
8130 113 640 640 905 1280 10240
T04 1046 320 640 640 640 1280 453
1164 320 320 226 320 320 1280
8123 640 640 1280 640 905 640
8126 226 320 640 320 640 2560
在攻毒前豬血清中之VN效價在組T03 (IgG:AVP8 P[6,7,13])中之大部分豬中較高(＞1280)，表明來自母畜之免疫性被動轉移至豬。反之，T01 (安慰劑)中之豬之VN效價都不高(＞1280)。
與VN資料類似，在D47於經疫苗接種IgG:AVP8 P[6,7,13]原型(組T03)之母畜中，但未在經疫苗接種安慰劑(組T01)之母畜中偵測到抗輪狀病毒AVP8 P[6]及抗輪狀病毒AVP8 P[13]抗體之量增加。如下文所描述(分別「 IgG:AVP8 P[13] ELISA 之 方案」及「 IgG:AVP8 P[6] ELISA 之 方案」進行此等分析。結果顯示於 圖 8及 圖 9中。
在組T01 (安慰劑)及T03 (IgG:AVP8 P[6,7,13])中，若輪狀病毒抗原係藉由至少一個腸部分中之免疫組織化學(IHC)來偵測，則豬被定義為感染的，且動物在攻毒後至少一天具有異常糞便分數。頻率分佈列於下表14中。基於此案例定義之用途，在分娩前6週及2週用原型疫苗IgG:AVP8 P[6,7,13] (組T03)疫苗接種母畜在用異源輪狀病毒A P[7]攻毒物質攻毒之後的豬中避免輪狀病毒相關之疾病；預防分率0.567，95%信賴區間-0.086, 0.827。 表14.案例定義之頻率分佈
組別 案例定義* 總計
0 1
N % N %
T01 78 60.9 50 39.1 128
T03 113 83.1 23 16.9 136
*病例定義：若回腸或空腸組織樣本中之一或多者為輪狀病毒A IHC陽性(分數＞0)且攻毒後任一天具有至少一個異常糞便分數，則將豬視為感染的。分數0=未感染；1=感染的
總之，用原型疫苗IgG:AVP8 P[6,7,13] (包含SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14之多肽) 在分娩前六週及兩週疫苗接種的習知母畜的母豬之血清及初乳中產生高中和抗體效價。如藉由在來自疫苗接種之母畜的豬血清中偵測高效價(＞1280)所證明，此等中和抗體被動傳輸至出生後的豬。豬中存在較高中和抗體效價引起臨床保護。特定言之，相比於安慰劑對照生出的豬，疫苗接種之母畜生出的較少的豬視為感染的。
IgG:AVP8 P[6,7,13] 之產生 原型疫苗含有三個部分。分開地進行且在下文描述每一個部分的產生。用12.0% Emulsigen D、7% IgG:AVP8 P[7]部分、4.4% IgG:AVP8 P[6]部分、1.8% IgG:AVP8 P[13]部分及47.8% 1×PBS (體積:體積)調配疫苗。
用0.75×10 6個細胞/mL之3L Sf+細胞接種IgG:AVP8 P[7]部分:一個有夾套之10L Sartorius Biostat B玻璃容器。在接種之後兩天，容器以0.1之MOI感染且使用實例細胞420無血清培養基(SAFC目錄號14420C-1000 mL)將容器之體積調節至8 L。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運行，其中溶氧設定為40%或高於40%，且CCA覆層在1.3 slpm下。在接種後7天收集容器；在4℃下以10,000 g使流體離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare，目錄號6715-7582)。在37℃下藉由5 mM BEI在有夾套之Sartorius Biostat B玻璃容器中使澄清的上清液(8升/容器)不活化三天。在不活化之後，用硫代硫酸鈉中和殘餘BEI。在中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE，目錄號UFP-10-C-5A)將大致7000 mL濃縮大致10×至700 mL。用5個體積(3500 mL)之1×PBS對經濃縮之物質進行透濾。
用0.75×10 6個細胞/mL之3L Sf+細胞接種IgG:AVP8 P[6]部分:一個有夾套之10L Sartorius Biostat B玻璃容器。在接種之後兩天，容器以0.1之MOI感染且使用實例細胞420無血清培養基(SAFC目錄號14420C-1000 mL)將容器之體積調節至8 L。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運行，其中溶氧設定為40%或高於40%，且CCA覆層在1.3 slpm下。在接種後8天收集容器；在4℃下以10,000 g使流體離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare，目錄號6715-7582)。在37℃下於有夾套之Sartorius Biostat B玻璃容器中用10mM BEI使澄清之上清液(8升/容器)不活化24小時。在不活化之後，用硫代硫酸鈉中和殘餘BEI。在中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE，目錄號UFP-10-C-5A)將大致7000 mL濃縮大致10×至600 mL。用5個體積(3500 mL)之1×PBS對經濃縮之物質進行透濾。
用0.75×10 6個細胞/mL之3L Sf+細胞接種IgG:AVP8 P[13]部分:一個有夾套之10L Sartorius Biostat B玻璃容器。在接種之後兩天，容器以0.1之MOI感染且使用實例細胞420無血清培養基(SAFC目錄號14420C-1000 mL)將容器之體積調節至8 L。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運行，其中溶氧設定為40%或高於40%，且CCA覆層在1.3 slpm下。在接種後7天收集容器；在4℃下以10,000 g使流體離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare，目錄號6715-7582)。在37℃下於有夾套的Sartorius Biostat B玻璃容器中用10mM BEI使澄清之上清液(8升/容器)不活化24小時。在不活化之後，用硫代硫酸鈉中和殘餘BEI。在中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE，目錄號UFP-10-C-5A)將大致7000 mL濃縮大致10×至750 mL。用5個體積(3500 mL)之1×PBS對經濃縮之物質進行透濾。
IgG:AVP8 P[13] ELISA 之 方案 ：Nuc MaxiSorb 96孔ELISA培養盤(Thermo)塗佈有稀釋於1×PBS 1:10中的輪狀病毒A VP8 P[13]純化蛋白。將培養盤在37℃下培育1小時。在培育之後，使用1×PBST洗滌培養盤，隨後在37℃下用3% BSA於PBST中阻斷1小時。在洗滌之後，將於1×PBS中稀釋至1:512之最終稀釋度的100 µL測試血清添加至培養盤且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，孔塗佈有100 µl辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗豬IgG抗體(Jackson ImmunoResearch)之1:25,000稀釋液，且在37℃下培育一小時。在洗滌之後，在室溫下用3,5,3',5'-四甲基聯苯胺(1-Step Ultra TMB-ELISA, Thermo)顯影培養盤10分鐘，且在450 nm處之光學密度(OD)量測之前，用終止溶液(Sigma)來終止反應。包括陽性及陰性對照之樣本在重複孔中運作且結果報導為(樣本-陰性對照)與(陽性-陰性對照)比率(S-N)/(P-N)之平均值。
IgG:AVP8 P[6] ELISA 之 方案 ：Nuc MaxiSorb 96孔ELISA培養盤(Thermo)塗佈有稀釋於1×PBS 1:10中的輪狀病毒A VP8 P[6]純化蛋白。將培養盤在37℃下培育1小時。在培育之後，使用1×PBST洗滌培養盤，隨後在37℃下用3% BSA於PBST中阻斷1小時。在洗滌之後，將於1×PBS中稀釋至1:512之最終稀釋度的100 µL測試血清添加至培養盤且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，孔塗佈有100 µl辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗豬IgG抗體(Jackson ImmunoResearch)之1:25,000稀釋液，且在37℃下培育一小時。在洗滌之後，在室溫下用3,5,3',5'-四甲基聯苯胺(1-Step Ultra TMB-ELISA, Thermo)顯影培養盤10分鐘，且在450 nm處之光學密度(OD)量測之前，用終止溶液(Sigma)來終止反應。包括陽性及陰性對照之樣本在重複孔中運作且結果報導為(樣本-陰性對照)與(陽性-陰性對照)比率(S-N)/(P-N)之平均值。
用於病毒中和分析之方案將所有血清及乳汁樣本在56℃下加熱不活化30分鐘。將樣本在輪狀病毒生長培養基(MEM + 2.5% HEPES + 0.3%胰蛋白磷酸酯培養液+ 0.02%酵母+ 10 µg/mL胰蛋白酶)中自1:40連續稀釋至1:40,960。向培養基添加抗生素以進行乳汁樣本測試。將輪狀病毒A分離株(效價大致6.5對數TCID 50/mL) 1:78,000稀釋至輪狀病毒生長培養基中。將總共250 µl經稀釋之血清添加至250 µl經稀釋之病毒中；在37℃± 5% CO 2下培育混合物一小時。自接種有MA104細胞之三四天齡之96孔培養盤無菌移除生長培養基。在培育之後，將200 µl之病毒-血清混合物轉移至細胞培養盤中。在37℃± 5% CO 2下培育細胞3-4天。在使用當天滴定儲備液及經稀釋之病毒以確定分析中所使用之稀釋度。在培育之後，丟棄上清液。為固定，添加100微升/孔之50%/50%丙酮/甲醇。將培養盤在室溫下培育15分鐘，風乾，隨後用100微升/孔1×PBS復水。初級抗體(兔抗輪狀病毒A多株血清，內部產生)在1×PBS中1:1000稀釋。添加100微升/孔之經稀釋之初級抗體，且將培養盤在37℃± 5% CO 2下培育一小時。在培育之後，培養盤用100微升/孔1×PBS洗滌兩次。將二級抗體(Jackson ImmunoResearch FITC標記之山羊抗家兔IgG，目錄號111-095-003)在1×PBS中以1:100稀釋。添加100微升/孔之經稀釋之二級抗體，且將培養盤在37℃± 5% CO 2下培育一小時。在培育之後，培養盤用100微升/孔1×PBS洗滌兩次。使用紫外輻射顯微鏡讀取培養盤之螢光存在。若發現經稀釋之病毒之效價(使用Reed-Muench方法產生)為2.8 ± 0.5對數TCID 50/mL，則該分析視為有效的。另外，各分析中包括已知陽性及陰性樣本作為對照。血清效價報導為最高稀釋度，其中未觀測到染色。
實例 11 豬中之概念實驗驗證 ：此研究之主要目的為評價向豬提供針對毒力輪狀病毒A攻毒之被動保護的習知母畜投與原型疫苗，在本文中亦稱為「IgG:AVP8 P[6,7,13]」 + IgG:CVP8，包括三種AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14)及一種CVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 15)以及非相關對照疫苗，在本文中稱為「安慰劑」。研究中包括總共24隻母畜。將母畜隨機分為兩個處理組及一個嚴格對照組，如下表15中所描述。講T01及T02中之母畜共混於三個房間之間。T03中之母畜圈養於單獨的房間。所有母畜均藉由如表15中所列之適當途徑接種適當物質。T03中之母畜保持未經疫苗接種(嚴格對照)。在整個疫苗接種時段期間定期自母畜收集血清且分析血清轉化之證據。在分娩之前收集糞便樣本且藉由RT-qPCR篩選以證實母畜在分娩之前未主動排出輪狀病毒。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。使分娩天然進行直至母豬到達妊娠第114天。此後，誘導分娩。在分娩時，豬崽入選試驗中。僅將在出生時健康之豬崽標記，根據設施標準操作程序處理且包括於試驗中。當豬為零至五日齡時，對其進行抽血，收集糞便拭子，且對豬進行攻毒(不包括T03)。在攻毒時，向豬胃內投與5 mL劑量之碳酸氫鈉，隨後胃內投與1 mL劑量之攻毒物質。在整個攻毒時段，每日監測所有動物是否存在腸道疾病(腹瀉及行為變化)。在攻毒後一天(DPC1)收集糞便樣本。在DPC3，使T01及T02中之所有豬安樂死。收集腸切片用於顯微及免疫組織化學評價。與不具有效價增加的經疫苗接種T02 (安慰劑)之動物相比，組T01 中之母畜(IgG:AVP8 P[6,7,13] + IgG:CVP8)具有針對輪狀病毒A基因型PP[6]、P[7]及P[13]以及輪狀病毒C的更高平均抗體量。與組T02 (安慰劑)中之母畜相比，組T01 (IgG:AVP8 P[6,7,13] + IgG:CVP8)中之母畜具有較少受感染豬崽(藉由臨床病徵及免疫組織化學評價測定)。 表 15 ：研究設計
組別 N ( 母畜) 母畜疫苗接種 ( 分娩前6 及2 週) 豬崽攻毒 (DPC0; 1-5 日齡) 屍體剖檢
描述 途徑/ 劑量*
T01 10 IgG:AVP8 P[6,7,13] + IgG:CVP8 2mL IM 輪狀病毒A P[7]組織勻漿1:2稀釋液 1mL胃內劑量 DPC2
T02 10 安慰劑 2mL IM
T03 4 嚴格對照 不適用 無 不適用
*IM = 肌肉內
在序列表中 / 來源及地理來源 ( 在適用情況下 ) ：SEQ ID NO: 1對應於源於North Carolina, USA之農場的(基因型P[7])輪狀病毒VP8蛋白之序列， SEQ ID NO: 2對應於源於North Carolina, USA之農場的(基因型P[7])輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域之序列， SEQ ID NO: 3對應於源於North Carolina, USA之農場的(基因型P[7])輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之序列， SEQ ID NO: 4對應於輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之序列，亦即，輪狀病毒VP8蛋白(基於基因型P[6])之一部分的共有序列， SEQ ID NO: 5對應於輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之序列，亦即，輪狀病毒VP8蛋白(基於基因型P[13])之免疫原性片段之一部分的共有序列， SEQ ID NO: 6對應於輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段之序列， SEQ ID NO: 7對應於豬IgG Fc片段之序列， SEQ ID NO: 8對應於天竺鼠IgG Fc片段之序列， SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)對應於連接部分之序列， SEQ ID NO: 10對應於連接部分之序列， SEQ ID NO: 11對應於連接部分之序列， SEQ ID NO: 12對應於包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白)之序列， SEQ ID NO: 13對應於包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白)之序列， SEQ ID NO: 14對應於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白)之序列， SEQ ID NO: 15對應於包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白)之序列， SEQ ID NO: 16對應於包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 5之序列的多肽(融合蛋白)之序列， SEQ ID NO: 17對應於編碼SEQ ID NO: 12之多肽(融合蛋白)之聚核苷酸的序列， SEQ ID NO: 18對應於編碼SEQ ID NO: 13之多肽(融合蛋白)之聚核苷酸的序列， SEQ ID NO: 19對應於編碼SEQ ID NO: 14之多肽(融合蛋白)之聚核苷酸的序列， SEQ ID NO: 20對應於編碼SEQ ID NO: 15之多肽(融合蛋白)之聚核苷酸的序列， SEQ ID NO: 21對應於編碼SEQ ID NO: 16之多肽(融合蛋白)之聚核苷酸的序列， SEQ ID NO: 22-25：引子及探針序列(表5)。
本文中亦揭示以下條項。因此 ， 本發明進一步包括由以下條項特性化之態樣 ：1. 一種免疫原性組合物，其包含： (i)多肽，其包含： -  輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 -  免疫球蛋白Fc片段； 及 (ii)至少一種不同於該多肽的免疫原性物質。 2. 如條項1之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端。 3. 如條項1或2之免疫原性組合物，其中 該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端。 4. 如條項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的N端。 5. 如條項1至4中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端。 6. 如條項1至5中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的C端。 7. 如條項1至6中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽為融合蛋白。 8. 如條項1至7中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽為式x-y-z之融合蛋白，其中 x由輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段組成； y為連接部分；且 z為免疫球蛋白Fc片段。 9. 如條項1至8中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段能夠在投與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的個體內誘導針對輪狀病毒之免疫反應。 10.      如條項1至9中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之長度為50至200個、較佳140至190個胺基酸殘基。 11.      如條項1至10中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒為豬輪狀病毒。 12.      如條項1至11中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒係選自由輪狀病毒A及輪狀病毒C組成之群。 13.      如條項1至12中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒為輪狀病毒A。 14.      如條項1至13中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段包含輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域。 15.      如條項1至14中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段為輪狀病毒VP8蛋白之N端延伸之凝集素樣域，其中該N端延伸之長度為1至20個胺基酸殘基，較佳5至15個胺基酸殘基。 16.      如條項14或15之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域係由輪狀病毒VP8蛋白之胺基酸殘基65-224之胺基酸序列組成。 17.      如條項15或16之免疫原性組合物，其中該N端延伸之胺基酸序列為在輪狀病毒VP8蛋白之胺基酸序列中側接凝集素樣域之N端胺基酸殘基的各別長度之胺基酸序列。 18.      如條項1至17中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段係由以下之胺基酸序列組成： 輪狀病毒VP8蛋白之胺基酸殘基60-224、胺基酸殘基59-224、胺基酸殘基58-224、胺基酸殘基57-224、胺基酸殘基56-224、胺基酸殘基55-224、胺基酸殘基54-224、胺基酸殘基53-224、胺基酸殘基52-224、胺基酸殘基51-224、胺基酸殘基50-224或胺基酸殘基49-224。 19.      如條項1至18中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段係由輪狀病毒VP8蛋白之胺基酸殘基57-224的胺基酸序列組成。 20.      如條項16至19中任一項之免疫原性組合物，其中該胺基酸殘基之編號係指野生型輪狀病毒VP8蛋白，尤其野生型輪狀病毒A VP8蛋白之胺基酸序列，且其中該野生型輪狀病毒VP8較佳為SEQ ID NO: 1中所列之蛋白質。 21.      如條項1至20中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：基因型P[7]輪狀病毒、基因型P[6]輪狀病毒及基因型P[13]輪狀病毒。 22.      如條項1至21中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒VP8蛋白包含與SEQ ID NO: 1之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 23.      如條項14至22中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之凝集素樣域由與SEQ ID NO: 2之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 24.      如條項1至23中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 25.      如條項1至24中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段由以下組成或為以下之共有序列：輪狀病毒VP8蛋白之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之一部分， 且其中輪狀病毒VP8蛋白之一部分之該共有序列較佳可藉由包含以下步驟之方法獲得： -   將編碼輪狀病毒VP8蛋白之一部分的複數個核苷酸序列轉譯為胺基酸序列， -   將該等胺基酸序列與已知輪狀病毒VP8蛋白比對，較佳藉由使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數， -   對該等比對序列進行種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建，尤其將該等比對胺基酸序列導入MEGA7軟體以用於種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建， -   使用泊松校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)， -   按比例繪製最優樹，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離， -   將自助重抽叢聚關聯大於70%的節點視為顯著的， -   將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚，以及 -   選擇叢聚及藉由鑑別該叢聚內每個比對位置之最大頻率來產生共有序列， -   且視情況，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及預定產品保護概況選擇胺基酸殘基。 26.      如條項1至25中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由與選自由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 27.      如條項1至26中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒為輪狀病毒C。 28.      如條項1至27之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 29.      如條項1至28中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段係由以下組成或為以下： -  輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段，如條項9至24中任一或多項所指定，或 -  輪狀病毒VP8蛋白之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之一部分的共有序列，如條項9至13、25及26中任一項所指定，或 -  輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段，如條項9至12、27及28中任一項所指定。 30.      如條項1至29中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段由與選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 31.      如條項1至30中任一項之免疫原性組合物， 其中該免疫球蛋白Fc片段之長度為至少220個胺基酸殘基，較佳長度為220至250個胺基酸殘基， 及/或其中該免疫球蛋白Fc片段未經醣基化。 32.      如條項1至31中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成：免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)及視情況存在之鉸鏈區或鉸鏈區之一部分。 33.      如條項1至32中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白係選自由以下組成之群：IgG、IgA、IgD、IgE及IgM。 34.      如條項1至33中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為由其腸道細胞易受輪狀病毒感染的物種之基因體編碼的免疫球蛋白Fc片段，輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段衍生自該輪狀病毒。 35.      如條項1至34中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為豬IgG Fc片段。 36.      如條項1至35中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段包含與選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 37.      如條項3至36中任一項之免疫原性組合物，其中該連接部分為長度為1至50個胺基酸殘基的胺基酸序列。 38.      如條項3至37中任一項之免疫原性組合物，其中該連接部分包含與選自由SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的序列具有至少66%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 39.      如條項5至38中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽具有側接輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基。 40.      如條項5至39中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽包含連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白之另一免疫原性片段。 41.      如條項1至40中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽包含： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段(1)， -   免疫球蛋白Fc片段，及 -   輪狀病毒VP8蛋白之另一免疫原性片段(2)， 其中該免疫球蛋白Fc片段連接至該免疫原性片段(1)的C端， 且其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段(2)連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。 42.      如條項40或41之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段係由以下組成或為以下： -   輪狀病毒A VP8蛋白之免疫原性片段，如條項9至24中任一或多項所指定；或 -   輪狀病毒VP8蛋白之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之一部分的共有序列，如條項9至13、25及26中任一項所指定；或 -   輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段，如條項9至12、27及28中任一或多項所指定。 43.      如條項40至42中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段包含與選自由SEQ ID NO: 2至6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成， 及/或其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段不同於C端連接至該免疫球蛋白Fc片段的輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段。 44.      如條項40至43中任一項之免疫原性組合物， 其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段經由連接部分連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端，其中該連接部分較佳地為如條項37或38中所指定的連接部分， 或其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段經由輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段之N端胺基酸殘基與該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。 45.      如條項1至44中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽由以下組成： -   輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，尤其如條項9至30中任一或多項所指定之輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， -   側接輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基，以及 -   免疫球蛋白Fc片段，尤其如條項31至36中之任一或多項所指定之免疫球蛋白Fc片段， 其中該免疫球蛋白Fc片段尤其經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端，其中該連接部分較佳地為如條項37或38中所指定的連接部分， -   及視情況存在的尤其經由連接部分連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白之另一免疫原性片段，其中輪狀病毒VP8蛋白之該另一免疫原性片段較佳地為如條項41至44中之任一或多項中所指定之另一免疫原性片段，且其中該連接部分較佳地為如條項37或38中所指定之連接部分。 46.      如條項1至45中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：與選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。 47.      如條項1至46中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽為重組蛋白，尤其重組桿狀病毒表現之蛋白質。 48.      如條項1至47中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽與另一一致多肽形成同二聚體。 49.      如條項1至48中任一項之免疫原性組合物，其中組分 (i)存在於包含複數種該多肽或由複數種該多肽構成的多聚體中，且其中該多聚體較佳地為由該多肽與另一一致多肽形成的同二聚體。 50.      如條項1至49中任一項之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽的免疫原性物質由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中所有該等免疫原性物質 不同於該多肽，且 彼此不同。 51.      如條項1至50中任一項之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種包含不同於該免疫原性片段之呼腸孤病毒抗原的免疫原性物質。 52.      如條項1至51中任一項之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽之免疫原性物質由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含呼腸孤病毒抗原，且其中所有該等呼腸孤病毒抗原不同於該免疫原性片段且彼此不同。 53.      如條項1至52中任一項之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽之免疫原性物質至少為包含不同於該免疫原性片段之呼腸孤病毒抗原的蛋白質。 54.      如條項1至53中任一項之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽之免疫原性物質由兩種或更多種蛋白質組成，其中該等蛋白質中之每一者包含呼腸孤病毒抗原，且其中所有該等呼腸孤病毒抗原不同於該免疫原性片段且彼此不同。 55.      如條項1至54中任一項之免疫原性組合物，其中組分 (ii)由至少一種包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段之輪狀病毒抗原的免疫原性物質組成。 56.      如條項1至55中任一項之免疫原性組合物，其中組分 (ii)由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含輪狀病毒抗原，且其中所有該等輪狀病毒抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。 57.      如條項1至56中任一項之免疫原性組合物，其中組分 (ii)由至少一種包含不同於組分 (i)之該免疫原性片段之輪狀病毒抗原的蛋白質組成。 58.      如條項1至57中任一項之免疫原性組合物，其中組分 (ii)由兩種或更多種蛋白質組成，其中該等蛋白質中之每一者包含輪狀病毒抗原，且其中所有該等輪狀病毒抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。 59.      如條項1至58中一或多項之免疫原性組合物，其中 該多肽為第一多肽； 且 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種不同於該第一多肽的其他多肽。 60.      如條項59之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽的免疫原性物質包含或為： -   不同於該第一多肽之第二多肽， 且較佳地包含不同於該等第一及第二多肽之第三多肽，且 視情況包含不同於所有該等第一至第三多肽的第四多肽。 61.      如條項59或60之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽的免疫原性物質包含或為： -   包含不同於該免疫原性片段之呼腸孤病毒抗原之第二多肽， 且較佳地包含不同於該等第一及第二多肽之第三多肽，且 視情況包含不同於所有該等第一至第三多肽的第四多肽。 62.      如條項61之免疫原性組合物，其中該第三多肽包含不同於該免疫原性片段及第二多肽之呼腸孤病毒抗原兩者的呼腸孤病毒抗原， 且其中視情況，該第四多肽包含不同於以下所有之呼腸孤病毒抗原： -   該免疫原性片段， -   第二多肽之呼腸孤病毒抗原，及 -   第三多肽之呼腸孤病毒抗原。 63.      如條項51至54及61至62中一或多項之免疫原性組合物，其中該呼腸孤病毒抗原為輪狀病毒抗原，且該等呼腸孤病毒抗原分別為輪狀病毒抗原。 64.      如條項60至63中一或多項之免疫原性組合物， 其中該第二多肽為如條項1至49中任一項所指定之多肽，且其中該第二肽不同於該第一多肽， 且其中較佳地，該第三多肽為如條項1至49中任一項中所指定的多肽，且其中該第三多肽不同於該等第一及第二多肽兩者， 且其中視情況，該第四多肽為如條項1至49中任一項中所指定之多肽，且其中該第四多肽不同於全部該等第一至第三多肽。 65.      如條項1至64中一或多項之免疫原性組合物，其中 該多肽為第一多肽，其包含： -  輪狀病毒VP8蛋白之第一免疫原性片段，及 -  免疫球蛋白Fc片段； 且 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，其中該第二免疫原性片段不同於該第一免疫原性片段， 及較佳之第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段，其中該第三免疫原性片段不同於該等第一及第二免疫原性片段兩者， 及視情況存在之第四多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第四免疫原性片段，其中該第四免疫原性片段不同於所有該等第一至第三免疫原性片段。 66.      如條項65之免疫原性組合物，其中該等第二至第四免疫原性片段中之每一者個別地選自由以下組成之群： -  如條項9至24中任一或多項所指定之免疫原性片段， -  輪狀病毒VP8蛋白之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之一部分的共有序列，如條項9至13、25及26中任一或多項所指定， 及 -   輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段，如條項9至12、27及28中任一或多項所指定， 特定言之，其限制條件為所有該等第二至第四免疫原性片段不同於該第一免疫原性片段且彼此不同。 67.      如條項65或66之免疫原性組合物，其中 該第一免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC，及/或 該第二免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC，及/或 該第三免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC，及/或 該第四免疫原性片段係選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC； 其中 X7表示基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， X13表示基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， X6表示基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， 且 XC表示輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段。 68.      如條項67之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽的免疫原性物質包含或為： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段， 且其中該等第一及第二免疫原性片段中之每一者個別地選自由以下組成之群： X7、 X13、 X6及 XC， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段係選自由 X13、 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段係選自由 X7、 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段係選自由 X7、 X6及 XC組成之群， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段係選自由 X7、 X13及 X6組成之群。 69.      如條項67或68之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，及 第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段， 其中該等第一至第三免疫原性片段中之每一者個別地選自由 X7、 X13、 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段為 X13且該第三免疫原性片段係選自由 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X6及 XC組成之群， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X13及 X6組成之群。 70.      如條項67至69中一或多項之免疫原性組合物，其中至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，及 第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段，及 第四多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第四免疫原性片段， 且其中該等第一至第四免疫原性片段中之每一者個別地選自由 X7、 X13、 X6及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段為 X13，該第三免疫原性片段為 X6，且該第四免疫原性片段為 XC， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段為 X7，該第三免疫原性片段為 X13，且該第四免疫原性片段為 XC， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段為 X7，該第三免疫原性片段為 X6，且該第四免疫原性片段為 XC， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段為 X7，該第三免疫原性片段為 X13，且該第四免疫原性片段為 X6。 71.      如條項67至70中一或多項之免疫原性組合物，其中 X7由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，及/或 X13由與SEQ ID NO: 5之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，及/或 X6由與SEQ ID NO: 4之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，及/或 XC由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 72.      如條項65至71中一或多項之免疫原性組合物，其中該第一免疫原性片段為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，且 該第二免疫原性片段為基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， 且較佳地，該第三免疫原性片段為基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，且 且視情況，該第四免疫原性片段為輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段。 73.      如條項65至72中一或多項之免疫原性組合物，其中 該第一免疫原性片段由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，且 該第二免疫原性片段由與SEQ ID NO: 5之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成， 且較佳地，該第三免疫原性片段由與SEQ ID NO: 4之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成，且 且視情況，該第四免疫原性片段由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 74.      如條項59至73中一或多項之免疫原性組合物，其中 74.該第一多肽係選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC，及/或 該第二多肽係選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC，及/或 該第三多肽係選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC，及/或 該第四多肽係選自由組成之群： R7、 R13、 R6及 RC； 其中 R7為包含與選自由SEQ ID NO: 12組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， R13為包含與選自由SEQ ID NO: 14組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， R6為包含與選自由SEQ ID NO: 13組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，且 RC為包含與選自由SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 75.      如條項59至74中一或多項之免疫原性組合物，其中 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含或為輪狀病毒VP8蛋白之第二多肽，且其中 該等第一及第二多肽中之每一者個別地選自由以下組成之群： R7、 R13、 R6及 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽係選自由 R13、 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽係選自由 R7、 R13及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽係選自由 R7、 R6及 RC組成之群， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽係選自由 R7、 R13及 R6組成之群。 76.      如條項74或75之免疫原性組合物，其中 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含輪狀病毒VP8蛋白之第二多肽或由該第二多肽組成，且其中 該等第一及第二多肽中之每一者個別地選自由以下組成之群： R7、 R13及 R6， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽係選自由 R13及 R6組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽係選自由 R7及 R13組成之群， 且其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽係選自由 R7及 R6組成之群。 77.      如條項74至76中一或多項之免疫原性組合物，其中 該第一多肽為 R7且該第二多肽係選自由 R13及 R6組成之群。 78.      如條項74至77中一或多項之免疫原性組合物，其中 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，及 第三多肽， 且其中該等第一至第三多肽中之每一者個別地選自由 R7、 R13、 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽為 R13且該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R13及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R13及 R6組成之群。 79.      如條項74至78中一或多項之免疫原性組合物，其中 該第一多肽為 R7，且 該第二多肽為 R13，且 該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群。 80.      如條項74至79中一或多項之免疫原性組合物，其中 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，及 第三多肽， 且其中該等第一至第三多肽中之每一者個別地選自由以下組成之群： R7、 R13及 R6， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽為 R13且該第三多肽為 R6， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽為 R13， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽為 R6。 81.      如條項74至80中一或多項之免疫原性組合物，其中 至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，及 第三多肽，及 第四多肽， 且其中該等第一至第四多肽中之每一者個別地選自由以下組成之群： R7、 R6、 R13及 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽為 R13，該第三多肽為 R6，且該第四多肽為 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽為 R7，該第三多肽為 R13，且該第四多肽為 RC， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽為 R7，該第三多肽為 R6，且該第四多肽為 RC， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽為 R7，該第三多肽為 R13，且該第四多肽為 R6。 82.      如條項74至81中一或多項之免疫原性組合物，其中 該第一多肽為 R7，且 該第二多肽為 R13，且 該第三多肽為 R6，且 該第四多肽為 RC。 83.      一種免疫原性組合物，尤其如條項1至82中任一項之免疫原性組合物，其包含： -   包含與SEQ ID NO: 12之序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 -   包含與選自由SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 84.      一種免疫原性組合物，尤其如條項1至83中任一項之免疫原性組合物，其包含： -   包含與SEQ ID NO: 12之序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 -   包含與SEQ ID NO: 14之序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 85.      如條項84之免疫原性組合物，其包含： -   包含與選自由SEQ ID NO: 13組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 86.      如條項84或85之免疫原性組合物，其包含： -   包含與選自由SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 87.      如條項1至86中任一項之免疫原性組合物，其中免疫原性組合物進一步包含醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑。 88.      如條項1至87中任一項之免疫原性組合物，其中免疫原性組合物進一步包含佐劑。 89.      如條項1至88中任一項之免疫原性組合物，其包含： -   醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑， -   及視情況存在之佐劑。 90.      如條項88或89之免疫原性組合物，其中該佐劑為乳化水包油佐劑。 91.      如條項88或89之免疫原性組合物，其中佐劑為卡波姆。 92.      如條項1至91中任一項之免疫原性組合物的用途，其用於製備藥物，較佳疫苗。 93.      如條項1至91中任一項之免疫原性組合物，其用作藥物。 94.      如條項1至91中任一項之免疫原性組合物，其用作疫苗。 95.      如條項1至91中任一項之免疫原性組合物，其用於誘導個體之針對輪狀病毒之免疫反應的方法中。 96.      如條項1至91中任一項之免疫原性組合物，其用於一種減少或預防個體之由輪狀病毒感染引起的一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中或用於一種治療或預防個體之輪狀病毒感染的方法中， 97.      如條項95或96之免疫原性組合物，其中該個體為哺乳動物或鳥類，且其中該鳥類較佳為雞。 98.      如條項95至97中任一項之免疫原性組合物，其中個體為哺乳動物，且其中哺乳動物較佳地為豬或牛。 99.      如條項95至98中任一項之免疫原性組合物，其中個體為豬，且其中豬較佳為豬崽或母豬。 100.    如條項95之免疫原性組合物，其中個體為懷孕母豬。 101.    如條項96之免疫原性組合物，其中個體為豬崽。 102.    如條項1至91中任一項之免疫原性組合物，其用於減少或預防豬崽中之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中，其中豬崽將由已投與免疫原性組合物的母豬哺乳。 103.    如條項102之免疫原性組合物，其中已投與免疫原性組合物之該母豬為已在該母豬尤其懷有該豬崽時投與免疫原性組合物之母豬。 104.    一種用於治療或預防輪狀病毒感染，減少、預防或治療由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出，或預防或治療由輪狀病毒感染引起之疾病的方法，其包含向個體投與如條項1至91中任一項之免疫原性組合物。 105.    一種用於在母豬中誘導產生對輪狀病毒具有特異性之抗體的方法，其中該方法包含向該母豬投與如條項1至91中任一項之免疫原性組合物。 106.    一種減少或預防豬崽的由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法，其中該方法包含： -  向母豬投與如條項1至91中任一項之免疫原性組合物，及 -  允許該母豬哺乳該豬崽。 107.    如條項106之方法，其中該母豬為懷孕母豬，尤其懷有該豬崽。 108.    如條項106或107之方法，其包含以下步驟： -   向懷有該豬崽之母豬投與如條項1至91中任一項之免疫原性組合物， -   允許該母豬生產該豬崽，以及 -   允許該母豬哺乳該豬崽。 109.    一種減少豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法，其中豬崽由已投與如條項1至91中任一項之免疫原性組合物之母豬哺乳。 110.    如條項96至103中任一項之免疫原性組合物或如條項104至109中任一項之方法，其中該一或多種臨床病徵係選自由以下組成之群： -  腹瀉， -  輪狀病毒拓殖， -  病變，尤其宏觀病變， -  減少之平均每日體重增加，以及 -  胃腸炎。 111.    如條項110之免疫原性組合物或如條項110之方法，其中該輪狀病毒拓殖為腸之輪狀病毒拓殖，及/或其中該等病變為腸病變。 112.    如條項95至103、110及111中任一項之免疫原性組合物或如條項104至111中任一項之方法，其中 -   該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， -   該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， -   針對輪狀病毒之該免疫反應為針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒的免疫反應，或 -   對輪狀病毒具有特異性之該等抗體為對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體。 113.    如條項112之免疫原性組合物或方法，其中該免疫原性組合物包含如條項21至26及29至48中任一項所指定之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段。 114.    如條項113之免疫原性組合物，其中基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 115.    一種產生如條項1至91中任一項之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a)    允許用包含編碼如條項1至48中任一項所指定之多肽之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該多肽由該載體表現； (b)    其後尤其在細胞培養物上清液中回收該多肽，其中細胞碎片較佳經由分離步驟與該多肽分離，該分離步驟較佳地包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾，其中至少一個過濾器之孔徑較佳為約1至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm； (c)    藉由向步驟(b)之混合物中添加二元伸乙基亞胺(BEI)使載體不活化； (d)    藉由添加硫代硫酸鈉至由步驟(c)產生之混合物中來中和BEI；以及 (e)    藉由利用過濾器之過濾步驟自混合物移除一部分液體來濃縮由步驟(d)產生之混合物中之多肽，該過濾器之濾膜之分子量截止值在約5 kDa與約100 kDa之間，較佳在約10 kDa與約50 kDa之間； 且其中該方法包含以下步驟： (f)    將在步驟(e)之後剩餘的混合物與至少一種不同於該多肽的免疫原性物質摻合； (g)    及視情況將在步驟(f)之後剩餘之混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合， 或其中該方法包含以下步驟： (f)    將在步驟(e)之後剩餘的混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合，及 (g)    將在步驟(f)之後剩餘的混合物與至少一種不同於該多肽的免疫原性物質摻合。 116.    如條項115之方法，其中該至少一種免疫原性物質為至少一種如條項50至76中任一項所指定的免疫原性物質。 117.    如條項115或116之方法，其中在步驟(a)中，如條項1至48中任一項所指定之多肽為包含與選自由SEQ ID NO: 12組成之群之序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 118.    如條項115至117中任一項之方法，其中該至少一種不同於該多肽之免疫原性物質為至少一種選自由以下組成之群的蛋白質： 包含與選自由SEQ ID NO: 14組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， 包含與選自由SEQ ID NO: 13組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 包含與選自由SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。 119.    如條項1至91、93至103及110至114中任一項之免疫原性組合物、如條項92之用途或如條項104至112、113及114中任一項之方法，其中免疫原性組合物可藉由如條項115至118中任一項之方法獲得。
圖 1：針對豬輪狀病毒A疫苗接種經Emulsigen D調配之AVP8-IgG Fc蛋白(在標記中稱為「AVP8-IgG」)或安慰劑(「非相關對照」)之豬的血清IgG反應。 圖 2：在疫苗接種經Emulsigen D調配之AVP8-IgG Fc蛋白(在標記中稱為「AVP8-IgG」)或安慰劑(「非相關對照」)之豬的樣本中，為了偵測及定量能夠中和豬輪狀病毒A病毒之抗體所進行之VN (病毒中和)分析之結果。 圖 3：根據組別及研究日，針對母豬血清中之輪狀病毒之平均VN效價，其中研究日D0及D28表示時間點「分娩前六週及兩週」(亦即，當試驗用產品分別投與研究組T02及T04時)，且研究日D7、D28及D35表示時間點「分娩前五週、兩週及一週」(亦即，當商用疫苗投與T06時)。 圖 4：根據研究日，糞便中之組中值對數輪狀病毒A RNA基因體拷貝數(gc)/mL。 圖 5：A)經二硫蘇糖醇還原(「+DTT」)或未還原(「-DTT」)之經蛋白質A純化之AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)產物樣本之SDS-PAGE；B) AVP8-IgG Fc蛋白(SEQ ID NO: 12)生物反應器產物之西方墨點法，其中樣本經離心以分離出細胞集結粒部分(「集結粒」)及上清液部分(「上清液」)，該樣本在冷凍-解凍製程之後在還原條件(+DTT)下溢流於SDS-PAGE上，轉移至PVDF膜且經HRP結合山羊抗豬抗體探測以偵測豬IgG Fc片段。 圖 6：根據組別及研究日，針對母豬血清中之輪狀病毒之平均VN效價，其中研究日D0及D28表示時間點「分娩前六週及兩週」(亦即，當試驗用產品分別投與研究組T01及T03時)。 圖 7：根據組別及研究日，針對母豬血清中之輪狀病毒的平均VN效價，其中研究日D0表示第一次分別向研究組T01及T03投與試驗用產品的時間點。 圖 8：「IgG:AVP8 P[6] ELISA」之結果，其中將塗佈有輪狀病毒A VP8 P[6]蛋白之ELISA盤與經稀釋之測試血清一起培育，且其中隨後藉由使用HRP結合山羊抗豬IgG抗體來偵測抗輪狀病毒AVP8 P[6]抗體。 圖 9：「IgG:AVP8 P[13] ELISA」之結果，其中將塗佈有輪狀病毒A VP8 P[13]蛋白之ELISA盤與經稀釋之測試血清一起培育，且其中隨後藉由使用HRP結合山羊抗豬IgG抗體來偵測抗輪狀病毒AVP8 P[13]抗體。
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Claims (23)

  1. 一種免疫原性組合物，其包含： (i)多肽，其包含： 輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，及 免疫球蛋白Fc片段， 及 (ii)至少一種不同於該多肽的免疫原性物質。
  2. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段的該C端。
  3. 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該多肽為式x-y-z之融合蛋白，其中 x由輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段組成； y為連接部分；且 z為免疫球蛋白Fc片段。
  4. 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒為豬輪狀病毒， 及/或其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：輪狀病毒A及輪狀病毒C。
  5. 如請求項1至4中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段為輪狀病毒VP8蛋白之N端延伸之凝集素樣域，其中該N端延伸之長度為1至20個胺基酸殘基，較佳5至15個胺基酸殘基。
  6. 如請求項1至5中任一項之免疫原性組合物，其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：基因型P[7]輪狀病毒、基因型P[6]輪狀病毒及基因型P[13]輪狀病毒。
  7. 如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段由以下組成或為以下之共有序列：輪狀病毒VP8蛋白之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白之一部分， 且其中輪狀病毒VP8蛋白之一部分之該共有序列較佳可藉由包含以下步驟之方法獲得： 將編碼輪狀病毒VP8蛋白之一部分的複數個核苷酸序列轉譯為胺基酸序列， 將該等胺基酸序列與已知輪狀病毒VP8蛋白比對，較佳藉由使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數， 對該等比對序列進行種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建，尤其將該等比對胺基酸序列導入MEGA7軟體以用於種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白序列產生鄰近連接種系發生重建， 使用泊松(Poisson)校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)， 按比例繪製最優樹，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離， 將自助重抽叢聚關聯大於70%的節點視為顯著的， 將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚，以及 選擇叢聚及藉由鑑別該叢聚內每個比對位置之最大頻率來產生共有序列， 且視情況，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及預定產品保護概況選擇胺基酸殘基。
  8. 如請求項1至7中任一項之免疫原性組合物，其中輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段由與選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
  9. 如請求項1至8中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為由其腸道細胞易受該輪狀病毒感染的物種之基因體編碼的免疫球蛋白Fc片段，輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段衍生自該輪狀病毒， 及/或其中該免疫球蛋白Fc片段較佳為豬IgG Fc片段， 及/或其中該免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之免疫原性組合物，其中該連接部分為長度為1至50個胺基酸殘基的胺基酸序列， 及/或其中該連接部分包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 9 (Gly-Gly-Ser)、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的序列具有至少66%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：與選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之免疫原性組合物，其中不同於該多肽的該至少一種免疫原性物質由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中所有該等免疫原性物質 不同於該多肽，且 彼此不同。
  13. 如請求項1至12中任一項之免疫原性組合物，其中組分 (ii)由兩種或更多種免疫原性物質組成，其中該等物質中之每一者包含輪狀病毒抗原，且其中所有該等輪狀病毒抗原不同於組分 (i)之該免疫原性片段且彼此不同。
  14. 如請求項1至13中任一項之免疫原性組合物，其中 該多肽為第一多肽，其包含： 輪狀病毒VP8蛋白之第一免疫原性片段，及 免疫球蛋白Fc片段； 且 該至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，其中該第二免疫原性片段不同於該第一免疫原性片段， 及較佳之第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段，其中該第三免疫原性片段不同於該等第一及第二免疫原性片段兩者， 及視情況存在之第四多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第四免疫原性片段，其中該第四免疫原性片段不同於所有該等第一至第三免疫原性片段。
  15. 如請求項14之免疫原性組合物，其中該至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第二免疫原性片段，及 第三多肽，其包含輪狀病毒VP8蛋白之第三免疫原性片段， 且其中該等第一至第三免疫原性片段中之每一者個別地選自由 X7、 X6、 X13及 XC組成之群， 其中 X7表示基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， X6表示基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段， X13表示基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段，且 XC表示輪狀病毒C VP8蛋白之免疫原性片段； 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X7時，則該第二免疫原性片段為 X6且該第三免疫原性片段係選自由 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X6時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X13及 XC組成之群， 其限制條件為當該第一免疫原性片段為 X13時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X6及 XC組成之群， 且其限制條件為當該第一免疫原性片段為 XC時，則該第二免疫原性片段為 X7且該第三免疫原性片段係選自由 X6及 X13組成之群。
  16. 如請求項14或15之免疫原性組合物，其中該至少一種不同於該多肽之免疫原性物質包含以下或由以下組成： 第二多肽，及 第三多肽， 且其中該等第一至第三多肽中之每一者個別地選自由 R7、 R13、 R6及 RC組成之群， 其中 R7為包含與選自由SEQ ID NO: 12組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， R13為包含與選自由SEQ ID NO: 14組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質， R6為包含與選自由SEQ ID NO: 13組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，且 RC為包含與選自由SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質； 其限制條件為當該第一多肽為 R7時，則該第二多肽為 R13且該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R6時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R13及 RC組成之群， 其限制條件為當該第一多肽為 R13時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R6及 RC組成之群， 且其限制條件為當該第一多肽為 RC時，則該第二多肽為 R7且該第三多肽係選自由 R13及 R6組成之群。
  17. 如請求項1至16中任一項之免疫原性組合物，其包含： (i)包含與選自由SEQ ID NO: 12組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質，及 (ii)包含與選自由SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、再更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的蛋白質。
  18. 如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物，其用作藥物，較佳地用作疫苗。
  19. 如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物，其用於一種減少或預防個體之由輪狀病毒感染引起的一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法中或用於一種治療或預防個體之輪狀病毒感染的方法中， 及/或用於一種誘導個體針對輪狀病毒之免疫反應的方法中。
  20. 一種減少或預防豬崽的由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床病徵、死亡或糞便排出的方法，其中該方法包含： 向母豬投與如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物，及 允許該母豬哺乳該豬崽。
  21. 如請求項19之免疫原性組合物或如請求項20之方法，其中該等一或多種臨床病徵係選自由以下組成之群： 腹瀉， 輪狀病毒拓殖，尤其腸道輪狀病毒拓殖， 病變，尤其宏觀病變， 減少之平均每日體重增加，以及 胃腸炎。
  22. 如請求項19或21之免疫原性組合物或如請求項20或21之方法，其中 該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， 該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒，或 針對輪狀病毒之該免疫反應為針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒的免疫反應。
  23. 一種產生如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a)    允許用包含編碼如請求項1至11中任一項所指定之多肽之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該多肽由該載體表現； (b)    其後尤其在細胞培養物上清液中回收該多肽，其中細胞碎片較佳經由分離步驟與該多肽分離，該分離步驟較佳地包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾，其中該至少一個過濾器之孔徑較佳為約1至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm； (c)    藉由向步驟(b)之混合物中添加二元伸乙基亞胺(BEI)使載體不活化； (d)    藉由添加硫代硫酸鈉至由步驟(c)產生之混合物中來中和該BEI；以及 (e)    藉由利用過濾器之過濾步驟自該混合物移除一部分液體來濃縮由步驟(d)產生之該混合物中之多肽，該過濾器之濾膜之分子量截止值在約5 kDa與約100 kDa之間，較佳在約10 kDa與約50 kDa之間； 且其中該方法包含以下步驟： (f)    將在步驟(e)之後剩餘的混合物與至少一種不同於該多肽的免疫原性物質摻合； (g)    及視情況將在步驟(f)之後剩餘之混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合， 或其中該方法包含以下步驟： (f)將在步驟(e)之後剩餘的混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合，及 (g)    將在步驟(f)之後剩餘的混合物與至少一種不同於該多肽的免疫原性物質摻合。
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