CN102202687A - 复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体，和对应的组合物和方法。

Description

复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体

发明领域

本发明涉及复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体，和对应的组合物和方法。

发明背景

黄病毒分布于全世界，且代表一个全球性公共卫生问题。黄病毒作为兽医病原体也具有重要影响。黄病毒病原体包括黄热病(YF)、登革热型1-4(DEN1-4)、日本脑炎(JE)、西尼罗河(WN)、蜱传脑炎(TBE)和来自TBE血清复合物的其它病毒，例如基亚萨努森林病(KFD)和鄂木斯克出血热(OHF)病毒。可得到抗YF[减毒活疫苗(LAV)菌株17D]、JE[灭活疫苗(INV)和LAV]和TBE(INV)的疫苗。目前不可得到许可的抗DEN和WN的人疫苗。兽医疫苗已经在使用，包括，例如，在亚洲分别用于预防马的脑炎和猪的死产的抗马的WN(INV，重组的和活的嵌合疫苗)、JE(INV和LAV)的疫苗，在英国用于预防绵羊的神经学疾病的抗羊跳跃病黄病毒的疫苗(INV)，和在捷克共和国用于耕种动物的抗TBE的疫苗(INV)(Monath和Heinz，Flaviviruses，见Fields等人编，Fields Virology，第3版，Philadelphia，New York，Lippincott-Raven Publishers，1996，961-1034页)。

蜱传脑炎(TBE)是人类的最重要的蜱传播的病毒病。它是欧洲和北亚的部分地方的地方病，每年造成超过10,000人住院治疗，在欧洲的病死率是0.5-1.5％，在西伯利亚和远东是6-40％。高比例的患者遭受长期的神经精神病学后遗症。已经证实，在鸡胚细胞培养物中生产的灭活疫苗可以有效地预防该病。例如，覆盖奥地利人口的86％(在欧洲国家中最高)的疫苗接种，已经导致住院病例减少了约90％(Heinz和Kunz，Arch.Virol.Suppl.18：201-205，2004)。灭活疫苗是昂贵的，且初次免疫需要接种3次。需要周期性加强(每隔2-5年)来维持免疫。因此，需要花费更低的TBE疫苗，其在1-2次给药后是有效的，且提供持久的、例如终身的免疫(类似于用YF 17D免疫接种实现的免疫)，实际上已经被WHO鉴定为特别优选。在过去的几个世纪，借助于TBE病毒亲本本身的经验的或理性的减毒，或TBE或兰加特(LGT，与TBE密切相关(血清学地)的天然减毒的黄病毒)病毒与登革热4病毒的嵌合，对TBE LAV候选物的开发，已经面临困难，这是由于候选物的残余毒力和/或低免疫原性/过度减毒的问题(Wright等人，Vaccine 26：882-890，2008；Maximova等人，J.Virol.82：5255-5268，2008；Rumyantsev等人，Vaccine 24：133-143，2006；Kofler等人，Arch.Virol.Suppl.18：191-200，2004；和其中的参考文献)。

黄病毒是小的、有被膜的、正链RNA病毒，主要通过节肢动物媒介(蚊子或蜱)传递到天然宿主，后者主要是脊椎动物，例如各种哺乳动物，包括人类和禽类。黄病毒基因组RNA分子的长度是约11,000个核苷酸(nt)，且包括长开放读码框(ORF)，后者侧接长度分别为约120和500个核苷酸的5’和3’不翻译末端区域(UTR)。所述ORF编码多蛋白前体，后者在翻译同时和翻译后被切割，产生单个病毒蛋白。以下述次序编码蛋白：C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5，其中C(核心/衣壳)、prM/M(膜前/膜)和E(被膜)是结构蛋白，即病毒颗粒的组分，而NS蛋白是非结构蛋白，其参与细胞内病毒复制。黄病毒复制发生在胞质中。在感染细胞并翻译基因组RNA后，多蛋白的加工从多蛋白的prM部分易位进受感染的细胞的内质网(ER)内腔开始，随后是E和NS1部分的易位，这由prM、E和NS1蛋白的疏水信号指导。prM、E和NS1蛋白的氨基末端由细胞信号肽酶切割产生，该酶位于ER膜的腔侧上，得到的单个蛋白保持羧基末端锚定在膜中。非结构区中的大部分剩余切割由病毒的NS2B/NS3丝氨酸蛋白酶来完成。该病毒蛋白酶也负责产生在后代病毒体中发现的成熟C蛋白的C-末端。新合成的基因组RNA分子和C蛋白形成致密的球形核衣壳，后者被其中嵌入E和prM蛋白的细胞膜包围。通过切割prM生成成熟的M蛋白，之后不久由细胞的弗林蛋白酶或类似的蛋白酶释放出病毒。E(被膜的主要蛋白)是中和抗体的主要靶物，是抗黄病毒感染的免疫的主要关联物。病毒特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)应答是免疫的其它关键特质。已经在不同的黄病毒结构和非结构蛋白中表征出多种CD8+和CD4+CTL表位。另外，先天的免疫应答有助于病毒清除和调节适应性免疫应答和免疫记忆的发展。

除了上面讨论的抗黄病毒的灭活的(INV)和减毒活的(LAV)疫苗以外，已经开发出其它疫苗平台。一个实例是基于嵌合的黄病毒，其包括黄热病病毒衣壳和非结构序列和来自寻求免疫的其它黄病毒的prM-E蛋白。该技术已经用于开发抗登革热(DEN)、日本脑炎(JE)、西尼罗河(WN)和圣路易脑炎(SLE)病毒的疫苗候选物(参见，例如，美国专利号6,962,708和6,696,281)。基于黄热病病毒的嵌合黄病毒已经在临床试验中产生了非常有前景的结果。

另一种黄病毒疫苗平台是基于假感染病毒(PIV)技术的应用(Mason等人，Virology 351：432-443，2006；Shustov等人，J.Virol.21：11737-11748，2007；Widman等人，Adv.Virus.Res.72：77-126，2008；Suzuki等人，J.Virol.82：6942-6951，2008；Suzuki等人，J.Virol.83：1870-1880，2009；Ishikawa等人，Vaccine 26：2772-2781，2008；Widman等人，Vaccine26：2762-2771，2008)。PIV是通过删除减毒的复制缺陷型病毒。不同于活的黄病毒疫苗，它们在体内经历单轮复制(或任选地有限轮数，对于双组分构建体；参见下文)，其可以提供安全性方面的益处。PIV也不诱导病毒血症和全身感染。此外，不同于灭活的疫苗，PIV会模仿完整病毒感染，由于有力的B-和T-细胞应答的诱导，这可以导致增加的功效、更高的免疫持久性和降低的剂量需求。类似于完整病毒，PIV疫苗靶向抗原呈递细胞例如树突细胞，刺激toll-样受体(TLRs)，并诱导平衡的Th1/Th2免疫。另外，已经证实，PIV构建体可以在基质细胞中生长至高滴度，几乎没有或根本没有细胞病变效应(CPE)，这允许高产率生产、任选地多次收获和/或繁殖受感染的基质细胞。

在图1和2中解释了PIV技术的原理。该技术存在两种变体。在第一种变体中，构建大量缺失衣壳蛋白(C)的单组分假感染病毒(s-PIV)，使突变体病毒不能在正常细胞中形成感染性病毒颗粒(图1)。所述缺失不去除C蛋白的前～20个密码子(它们含有RNA环化序列)和在C末端的类似数目的密码子(它们编码病毒蛋白酶切割位点和prM的信号肽)。s-PIV可以繁殖，例如，在生产过程中，在其中以反式提供C蛋白的基质(辅助)细胞培养物中，例如，在生产C蛋白(或包含C蛋白的更大辅助盒)的稳定转染的细胞中，或在含有表达C蛋白的α病毒复制子[例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)复制子]或另一种表达C蛋白的细胞内表达载体的细胞中。在体内接种后，例如，免疫接种后，PIV在没有反式互补缺失的情况下在受感染的细胞中经历单轮复制，不扩散至周围细胞。受感染的细胞生成空的病毒样颗粒(VLP)，它们是PIV中的prM-E基因的产物，导致中和抗体应答的诱导。通过病毒表位的MHCI呈递，也会诱导T-细胞应答。该方案已经应用于YF 17D病毒和WN病毒和WN/JE和WN/DEN2嵌合病毒(Mason等人，Virology 351：432-443，2006；Suzuki等人，J.Virol.83：1870-1880，2009；Ishikawa等人，Vaccine 26：2772-2781，2008；Widman等人，Vaccine 26：2762-2771，2008；WO 2007/098267；WO2008/137163)。

在第二种变体中，构建双组分PIV(d-PIV)(图2)。用2种缺陷型病毒RNA转染基质细胞，一种缺失C基因，另一种缺失prM-E被膜蛋白基因。2种有缺陷的基因组彼此互补，导致2类PIV在细胞培养基中累积(Shustov等人，J.Virol.21：11737-11748，2007；Suzuki等人，J.Virol.82：6942-6951，2008)。任选地，可以在适当的辅助细胞系中分开生产2种PIV，然后在双组分制剂中混合。后者可以提供下述优点：调节两种组分的相对浓度，增加免疫原性和功效。由于有些细胞在接种部位被两种组分共感染，这类PIV疫苗在体内应当能经历有限的扩散。预期这种扩散是自限制的，因为在组织中存在比起初共感染的细胞生产的病毒颗粒更多的细胞。另外，相对高的MOI对于有效的共感染而言是必需的，预见到在接种部位以外的细胞不会被有效地共感染(例如，在排出淋巴结中)。仅被ΔC PIV感染的细胞生成高免疫原性的VLP。共感染的细胞生成两类包装的有缺陷的病毒颗粒，它们也刺激中和抗体。预期有限的感染会导致比s-PIV更强的中和抗体应答和T-细胞应答。为了降低在生产过程中或在体内重组的机会(包括与循环的黄病毒)，可以在s-PIV和d-PIV中修饰病毒序列，例如，使用同义密码子替换来减少核苷酸序列同源性，和突变互补的环化5’和3’元件。

发明内容

本发明提供了复制缺陷型(或有缺陷的)假感染黄病毒，其包含黄病毒基因组，后者包含：(i)编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，和(ii)编码一种或更多种异源病原体、癌症或变态反应相关免疫原的序列。例如，所述缺失/突变可以是在衣壳(C)序列；膜前(prM)和/或被膜(E)序列；衣壳(C)、膜前(prM)和被膜(E)序列；或非结构蛋白1(NS1)序列内。

异源免疫原可以来自，例如，选自下述的病原体：狂犬病病毒(例如，狂犬病病毒G蛋白表位)，博氏疏螺旋体(例如，OspA免疫原，或其免疫原性片段)，蜱(例如，选自64TRP、Isac和Salp20的蜱唾液蛋白，或其免疫原性片段)，流感病毒(例如，流感病毒M2，血凝素(HA)，或神经氨酸酶(NA)表位，或其免疫原性片段)，人免疫缺陷病毒(例如，密码子优化的HIV gag、tat/nef或gp120蛋白，或其免疫原性片段)，猿免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒(例如，HPV16或HPV18衣壳蛋白L1或L2，或其免疫原性片段)，呼吸道合胞病毒(例如，呼吸道合胞病毒F或G糖蛋白)，疟原虫，和结核分支杆菌(也参见下文)。

复制缺陷型假感染黄病毒可以包含编码膜前(prM)和/或被膜(E)蛋白的序列。此外，复制缺陷型假感染黄病毒基因组可以选自下述病毒的基因组：黄热病病毒，西尼罗河病毒，蜱传脑炎病毒，兰加特病毒，日本脑炎病毒，登革热病毒，和圣路易脑炎病毒，它们的减毒株，和它们的嵌合体(也参见下文)。在不同的实施例中，所述嵌合体包括：第一种黄病毒(例如，蜱传脑炎病毒或兰加特病毒)的膜前(prM)和被膜(E)序列，和第二种不同黄病毒(例如，黄热病，西尼罗河，或兰加特病毒)的衣壳(C)和非结构序列。

复制缺陷型假感染黄病毒基因组可以包装在颗粒中，所述颗粒包含与基因组相同或不同的来自黄病毒的膜前(prM)和被膜(E)序列。此外，可以在一种或更多种蛋白缺失或突变的位置，或与之组合地，插入编码异源免疫原的序列。

编码异源免疫原的序列可以插入黄病毒基因组中的编码被膜(E)蛋白的序列内，编码非结构1(NS1)蛋白的序列内，编码膜前(prM)蛋白的序列内，基因间地插入编码被膜(E)蛋白和非结构蛋白1(NS1)的序列之间，基因间地插入编码非结构蛋白2B(NS2B)和非结构蛋白3(NS3)的序列之间，和/或作为黄病毒基因组的3’非翻译区中的双顺反子插入。

本发明也包括组合物，其包含如上所述的第一种复制缺陷型假感染黄病毒，和第二种(或其它)不同复制缺陷型假感染黄病毒，后者包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)。在这些组合物中，第二种不同复制缺陷型假感染黄病毒中由发生缺失或突变的序列编码的一种或更多种蛋白不同于第一种复制缺陷型假感染黄病毒中由发生缺失的序列编码的一种或更多种蛋白。

本发明另外包括在受试者中诱导对免疫原的免疫应答的方法，它包含，给所述受试者施用一种或更多种如本文所述的复制缺陷型假感染黄病毒和/或组合物。在不同的实施例中，所述受试者处于病原体感染或与癌症或变态反应相关免疫原有关的疾病或病症的危险中，但是不患有。在其它实施例中，所述受试者具有病原体感染或与癌症或变态反应相关免疫原有关的疾病或病症。本发明因而包括预防和治疗方法。在这些方法中，所述免疫原可以来自，例如，选自下述的病原体：狂犬病病毒，博氏疏螺旋体，蜱，流感病毒，人免疫缺陷病毒，猿免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒，呼吸道合胞病毒，疟原虫，和结核分支杆菌(也参见下文)。此外，所述方法可以用于诱导抗黄病毒基因组编码的蛋白(除了免疫原来源之外)的免疫应答。在不同的实施例中，所述受试者处于与假感染黄病毒的基因组(其包含编码黄病毒膜前和/或被膜蛋白的序列)相对应的黄病毒的感染的危险中，但是不患有。在其它实施例中，所述受试者具有与假感染黄病毒的基因组(其包含编码黄病毒膜前和/或被膜蛋白的序列)相对应的黄病毒的感染。

本发明也包括活的、减毒的嵌合黄病毒，其包括黄热病病毒，其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列，且所述嵌合黄病毒的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列包括黄热病病毒和蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的杂种，或其变体。在不同的实施例中，嵌合黄病毒的衣壳/膜前信号序列包括在氨基末端区域中的黄热病病毒序列和在羧基末端区域中的蜱传脑炎或兰加特病毒序列(参见下文)。

此外，本发明包括活的、减毒的嵌合黄病毒，其包括西尼罗河病毒，其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列，且所述嵌合黄病毒的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列包括蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列，或其变体。

本发明也包括药物组合物，其包括一种或更多种本文所述的假感染黄病毒、组合物、或活的、减毒的黄病毒，和药学上可接受的载体或稀释剂。此外，所述组合物可以包括佐剂。

本发明也包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含黄病毒基因组，后者含有在编码非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)或非结构蛋白5(NS5)的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变。

此外，本发明包括核酸分子，其与假感染黄病毒的基因组或本文所述的活的、减毒的黄病毒的基因组相对应，和其补体。

本发明也提供了制备本文所述的复制缺陷型假感染黄病毒的方法，该方法包含，将如上所述的一个或更多个核酸分子导入细胞中，所述细胞表达与复制缺陷型假感染黄病毒的黄病毒基因组中缺失的任意序列相对应的蛋白。在这些方法中，所述蛋白可以在细胞中从第二种(或其它)不同复制缺陷型假感染黄病毒的基因组表达。在其它实施例中，所述蛋白从复制子(例如，α病毒复制子，例如委内瑞拉马脑炎病毒复制子；参见下文)表达。

本发明也包括含有2种或更多种复制缺陷型假感染黄病毒的组合物，其中2种复制缺陷型假感染黄病毒选自：(a)包含含有日本脑炎病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有登革热病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒；(b)包含含有黄热病病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有登革热病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒；和(c)包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码博氏疏螺旋体免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码蜱唾液蛋白免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，或包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码博氏疏螺旋体免疫原和蜱唾液蛋白免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒。

本发明也包括药物组合物，其含有本文所述的活的、减毒的嵌合黄病毒。此外，本发明包括在受试者中诱导对蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的免疫应答的方法，该方法包含，给所述受试者施用这样的药物组合物。在不同的实施例中，所述受试者处于发展蜱传脑炎病毒或兰加特病毒感染的危险中，但是不患有。在其它实施例中，所述受试者被蜱传脑炎病毒或兰加特病毒感染。

本发明另外包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述黄病毒基因组包括其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列的黄热病病毒序列，且编码黄病毒基因组的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列的序列包括编码黄热病病毒和蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的序列杂种，或其变体。在不同的实施例中，所述编码黄病毒基因组的衣壳/膜前信号序列的序列包括在5’区的黄热病病毒序列和在3’区的蜱传脑炎或兰加特病毒序列。

此外，本发明包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述黄病毒基因组包括其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列的西尼罗河病毒序列，且编码黄病毒基因组的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列的序列包括编码蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的序列，或其变体。

另外，本发明包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中黄病毒基因组中的任意衣壳(C)和非结构(NS)蛋白来自兰加特病毒，且任意膜前(prM)和被膜(E)蛋白来自蜱传脑炎病毒。

“复制缺陷型假感染黄病毒”或“PIV”是指，由于黄病毒基因组中的缺失和突变，复制有缺陷的黄病毒。所述缺失或突变可以是，例如，大序列的缺失，例如本文所述的大部分衣壳蛋白(保留环化序列；参见下文)。在其它实施例中，缺失编码不同蛋白(例如，prM，E，NS1，NS3，和/或NS5；参见下文)或蛋白组合(例如，prM-E或C-prM-E)的序列。如果PIV要用作递送异源免疫原的载体，这类缺失可能是有利的，因为缺失可以允许插入例如至少多达缺失序列的大小的序列。在其它实施例中，突变可以是，例如，点突变，条件是，它导致如上讨论的复制缺陷。因为缺失和突变，基因组不编码生成完整黄病毒颗粒所需的所有蛋白。缺失序列可以由构建成表达该缺失序列的补偿细胞系以反式提供(例如，利用复制子；s-PIV；参见下文)，或通过2个复制缺陷型基因组在相同细胞中的共表达，其中所述2个复制缺陷型基因组当一起考虑时，会编码生产所需的所有蛋白(d-PIV系统；参见下文)。

在导入不表达补偿蛋白的细胞中后，基因组复制，且在有些情况下，产生“病毒-样颗粒”，它们从细胞释放出来，且能离开细胞和成为免疫原性的，但是不能感染其它细胞和导致其它颗粒的生成。例如，在包含衣壳蛋白编码序列的缺失的PIV的情况下，感染不表达衣壳的细胞后，包含prM-E蛋白的VLP从细胞释放出来。因为缺少衣壳蛋白，VLP缺少衣壳和核酸基因组。在d-PIV方案的情况下，在被两种PIV感染的细胞中，其它PIV的生产是可能的，所述两种PIV在所有需要的蛋白的生产方面彼此互补(参见下文)。

本发明提供了几个优点。例如，本发明的PIV载体和PIV是高度减毒的，且在1-2次给药后是非常有效的，会提供持久的免疫。此外，不同于灭活的疫苗，PIV会模仿完整病毒感染，由于有力的B-和T-细胞应答的诱导，这可以导致增加的功效、更高的免疫持久性和降低的剂量需求。另外，类似于完整病毒，PIV疫苗靶向抗原呈递细胞例如树突细胞，刺激toll-样受体(TLRs)，并诱导平衡的Th1/Th2免疫。还已经证实，PIV构建体会在基质细胞中生长至高滴度，几乎没有或根本没有CPE，这允许高产率生产、任选地多次收获和/或繁殖受感染的基质细胞。此外，本发明的PIV载体会提供开发疫苗的选择，所述疫苗针对目前不可得到其疫苗的非黄病毒病原体。

从下面的详述、附图和权利要求书中，会明白本发明的其它特征和优点。

附图简述

图1是单组分PIV(s-PIV)技术的示意图。

图2是双组分PIV(d-PIV)技术的示意图。

图3是在小鼠中测试PIV的免疫原性和功效的一般实验设计的示意图。

图4中的图对比了PIV-WN(RV-WN)和YF/WN LAV(CV-WN)在小鼠中诱导的体液免疫应答。

图5中的一系列图显示了用仓鼠改造的Asibi(PIV-YF和YF17D疫苗)和野生型WN-NY99(PIV-WN和YF/WN LAV疫苗)挑战用PIV-YF(RV-YF)、YF17D、PIV-WN(RV-WN)和YF/WN LAV(CVWN)免疫的仓鼠的结果。

图6中的表显示了YF/TBE和YF/LGT病毒滴度和用指示的嵌合黄病毒得到的噬斑形态学。

图7中的表显示了WN/TBE PIV滴度和含有指示的PIV的细胞的免疫荧光的实例。

图8中的一组图显示了YF/TBE LAV和PIV-WN/TBE在Vero和BHK细胞系中的复制动力学(CV-Hypr＝YF/Hypr LAV；CV-LGT＝YF/LGT LAV；RV-WN/TBEV＝PIV-WN/TBEV)。

图9中的一系列图显示了在神经毒力实验中在大脑内接种PIV-TBE和YF/TBE LAV构建体的小鼠的存活率(3.5周龄ICR小鼠；RV-WN/Hypr＝PIV-WN/TBE(Hypr)；CV-Hypr＝YF/TBE(Hypr)LAV；CV-LGT＝YF/LGT LAV)。

图10中的图显示了在神经侵染力实验中腹膜内接种PIV-WN/TBE(Hypr)(RV-WN/Hypr)、YF/TBE(Hypr)LAV(CV-Hypr)和YF/LGT LAV(CV-LGT)构建体和YF17D的小鼠的存活率(3.5周龄ICR小鼠)。

图11中的一系列图解释了用s-PIV-TBE候选物(左上图)、YF/TBE和YF/LGT嵌合病毒(右上图)和对照(YF 17D，人杀死的TBE疫苗，和假的；底图)免疫的组在TBE病毒挑战后通过体重减少动力学测量的小鼠发病率。

图12是表达病病毒G蛋白的PIV构建体的图示，以及包装构建体来制备假感染病毒和免疫接种的图解。

图13是产生活的/表达构建体的插入设计的图示(以狂犬病G为例)。

图14是显示免疫荧光分析的一系列图像，和显示用指示的PIV-WN构建体(ΔC-狂犬病G，ΔPrM-E-狂犬病G，和ΔC-PrM-E-狂犬病G)转染的细胞的生长曲线的图。

图15中的一系列图像显示了在用指示的PIV构建体(ΔC-狂犬病G，ΔPrM-E-狂犬病G，和ΔC-PrM-E-狂犬病G)转染的Vero细胞的质膜上表达的RabG的免疫荧光分析。

图16是PIV-WN-狂犬病G构建体的示意图，和证实该构建体在辅助细胞中扩散、但是在原初细胞中不扩散的一系列图像。

图17中的一系列图显示了狂犬病G蛋白基因在PIV-WN载体中的稳定性。

图18中的一组图像显示了单组分和双组分PIV-WN-狂犬病G变体在Vero细胞中的扩散的对比。

图19中的一组免疫荧光图像显示了转染后辅助细胞中d-PIV-WN的ΔprM-E组分对全长RSV F蛋白的表达(菌株A2)。

发明详述

本发明提供了包含黄病毒序列的复制缺陷型(或有缺陷的)假感染病毒(PIV)载体，其可以用于诱导抗异源病原体、癌症和插入所述载体中的变态反应相关免疫原、以及任选地所述载体本身的免疫的方法中。本发明也包括包含本文所述PIV和/或PIV载体的组合的组合物，和使用这样的组合物诱导抗插入的免疫原序列和/或PIV序列本身的免疫应答的方法。此外，本发明包括具体的PIV和活的、减毒的嵌合黄病毒(包括蜱传脑炎病毒)序列、和有关的载体、组合物、和使用方法。下面进一步描述了本发明的PIV载体、PIV、活的减毒的嵌合黄病毒、组合物和方法。

PIV载体和PIV

本发明的PIV载体和PIV可以基于上述的单或双组分PIV(也参见WO 2007/098267和WO 2008/137163)。因而，例如，在单组分PIV的情况下，PIV载体和PIV可以包括含有衣壳蛋白编码序列中的大缺失的基因组，且在以反式生成衣壳蛋白的补偿细胞系中生产(单组分；图1和图12)。根据该方案，删除大部分衣壳编码区，这可以阻止PIV基因组在正常细胞系(即，不表达衣壳序列的细胞系)和免疫接种的受试者中生产传染性后代。衣壳缺失通常不会破坏基因组环化所需的RNA序列(即，编码在位置1-26的区域中的氨基酸的序列)，和/或prM向M突变所需的prM序列。在特定实施例中，缺失的序列与编码C蛋白的氨基酸26-100、26-93、31-100或31-93的那些相对应。

单组分PIV载体和PIV可以在表达C或C-prM-E盒的细胞系中繁殖，它们在其中复制至高水平。可以用于表达单组分PIV载体和PIV的示例性的细胞系包括BHK-21(例如，ATCC CCL-10)，Vero(例如，ATCCCCL-81)，C7/10，和脊椎动物或蚊子起源的其它细胞。利用病毒载体衍生的复制子，例如α病毒复制子(例如，基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)或罗斯河病毒的复制子)，可以在这样的细胞中表达C或C-prM-E盒。为了降低PIV载体/PIV和补偿序列之间的生产重组的可能性，复制子中的序列(编码C，prM，和/或E)可以包括核苷酸突变。例如，编码补偿C蛋白的序列可以包括非天然的环化序列。突变可以源自密码子优化，其可以在PIV产率方面提供额外益处。此外，在表达C蛋白序列(且不是C-prM-E盒)的补偿细胞的情况下，可以有益地包括在C蛋白的羧基末端的锚定序列，包括，例如，prM的约20个氨基酸(参见，例如，WO 2007/098267)。

本发明的PIV载体和PIV也可以基于上述的双组分基因组技术。该技术采用两部分基因组构建体，每一个都有生产复制所需的至少一种蛋白(衣壳或prM/E)的表达缺陷，但是当存在于同一个细胞中时，导致产生PIV必需的所有组分的生产。因而，在双组分基因组技术的一个实例中，第一种组分包括C的大缺失，如上面关于单组分PIV所述，且第二种组分包括prM和E的缺失(图2和图12)。在另一个实例中，第一种组分包括C、prM和E的缺失，且第二种组分包括NS1的缺失(图12)。两种组分可以包括RNA复制所需的顺式作用启动子元件和非结构蛋白的完整集合，它们形成复制酶复合物。因而，两种有缺陷的基因组可以包括5’-非翻译区和随后的天然蛋白编码序列的至少约60个核苷酸(元件1)，后者包含衣壳蛋白的氨基末端片段。该序列之后可以是蛋白酶切割序列，例如，泛素或口蹄疫病毒(FAMDV)-特异性的2A蛋白酶序列，其可以与衣壳或被膜(prM-E)编码序列融合。此外，人工的、密码子优化的序列可以用于排除两种有缺陷的病毒基因组之间重组的可能性，所述重组可能导致形成能复制的病毒(参见，例如，WO 2008/137163)。双组分基因组方案的应用不需要形成表达补偿基因组的细胞系，例如上面关于单组分PIV方案所讨论的用复制子转化的细胞。可以用于双组分基因组方案中的示例性的细胞系包括Vero(例如，ATCC CCL-81)，BHK-21(例如，ATCC CCL-10)，C7/10，和脊椎动物或蚊子起源的其它细胞。

可以用于本发明中的d-PIV方案的其它实例是基于包含NS3或NS5序列中的缺失的补偿基因组的应用。可以使用在例如NS1、NS3或NS5蛋白中的缺失，长至ORF中的数百氨基酸，去除整个选择的蛋白序列，或短至1个氨基酸，使蛋白酶活性(例如，NS5RNA聚合酶活性，NS3螺旋酶活性，等)灭活。或者，可以将点氨基酸变化(少至1个氨基酸突变，或任选地更多突变)导入任意NS蛋白，使酶活性灭活。另外，可以在一个辅助分子中组合几个ΔNS缺失。可以替换第二种组分中的NS缺失，或与之组合地，表达相同的异源基因(即由第一种d-PIV组分表达)，增加表达的免疫原的量。特别地，辅助分子的插入能力会相应增加NS缺失的大小。或者，可以在辅助分子缺失的位置插入不同的外来免疫原，生成多价疫苗。

此外，可以用于制备本发明使用的PIV载体和PIV的其它方案，描述在，例如，WO 99/28487，WO 03/046189，WO 2004/108936，US2004/0265338，US 2007/0249032，和美国专利号7,332,322中。

本发明的PIV载体和PIV可以包含来自单个黄病毒类型(例如，蜱传脑炎(TBE，例如，菌株Hypr)，兰加特(LGT)，黄热病(例如，YF17D)，西尼罗河，日本脑炎，登革热(血清型1-4)，圣路易脑炎，库宁，罗氏脑炎，伊列乌斯，中欧脑炎，西伯利亚脑炎，俄罗斯春夏型脑炎，基亚萨努森林病，鄂木斯克出血热，羊跳跃病，Powassan，Negishi，Absettarov，Hansalova，和Apoi病毒)的序列，或可以包含来自2种或更多种不同黄病毒的序列。这些病毒的有些菌株的序列可从普遍可接近的序列数据库容易地得到；通过本领域熟知的方法，可以容易地测定其它菌株的序列。在PIV载体和PIV包含超过一种黄病毒的序列的情况下，所述序列可以是上述的嵌合黄病毒的序列(也参见，例如，美国专利号6,962,708；美国专利号6,696,281；和美国专利号6,184,024)。在某些实施例中，所述嵌合体包括来自一种黄病毒(例如可能希望对它产生免疫的黄病毒)的膜前和被膜序列，和来自第二种不同黄病毒的衣壳和非结构序列。在一个具体的实例中，第二种黄病毒是黄热病病毒，例如疫苗菌株YF17D。其它实例包括下述的YF/TBE、YF/LGT、WN/TBE和WN/LGT嵌合体。另一个实例是LGT/TBE嵌合体，它基于含有TBE病毒prM-E蛋白的LGT病毒主链。基于该遗传背景的PIV疫苗具有一项优点，因为LGT在体外会非常有效地复制，且对于人而言是高度减毒的和免疫原性的。因而，预期嵌合的LGT/TBE PIV疫苗会在人体中提供抗TBE的有力的特异性的免疫应答，特别是由于包含TBE prM-E基因。

本发明的载体可以基于本文所述的PIV构建体或活的、减毒的嵌合黄病毒(具体地，YF/TBE、YF/LGT、WN/TBE和WN/LGT；参见下文)。PIV构建体作为载体的应用，在某些情况下会提供特殊的优点，因为这些构建体必然包括大缺失，它们会使构建体更顺从至少高达缺失序列大小的插入的调节，而不引起复制效率的丧失。因而，PIV载体一般而言可以包含非常小的插入(例如，范围是6-10、11-20、21-100、101-500或更多氨基酸残基，其与ΔC缺失或其它缺失相组合)，以及相对大的插入或中等大小的插入(例如，范围是501-1000、1001-1700、1701-3000或3001-4000或更多残基)。相反，在某些实施例中，可能有利地在活的减毒的病毒中表达相对短的序列，特别是在没有对应缺失的情况下产生插入时。下面提供了关于可以用于本发明中的插入位点的其它信息。另外，如下面进一步讨论的，非黄病毒免疫原在本发明的PIV和嵌合黄病毒中的表达可以产生双效疫苗，其引起抗黄病毒载体病毒病原体和目标异源免疫原(例如，病原体(例如细菌、病毒、寄生虫或真菌病原体)，癌症，或变态反应相关免疫原)的保护性免疫。

如上面讨论的，本发明的PIV载体和PIV可以包含嵌合黄病毒的序列，例如，包含第一种黄病毒(例如，希望对它产生免疫的黄病毒)的膜前和被膜序列和诸如黄热病病毒(例如，YF 17D；参见上面和美国专利号6,962,708；美国专利号6,696,281；和美国专利号6,184,024)的第二种不同黄病毒的衣壳和非结构序列的嵌合黄病毒。此外，用作构建PIV的来源或疫苗/疫苗载体本身的本发明的嵌合黄病毒，可以任选地包括一种或更多种具体的减毒突变(例如，E蛋白突变，prM蛋白突变，C蛋白中的缺失，和/或3′UTR中的缺失)，例如在WO 2006/116182中所述的那些中的任一种。例如，C蛋白或3’UTR缺失可以直接应用于YF/TBE或YF/LGT嵌合体。可以设计类似的缺失，并导入其它嵌合的LAV候选物，例如基于LGT/TBE、WN/TBE和WN/LGT基因组。关于E蛋白突变，可以设计与在WO 2006/116182中关于YF/WN嵌合体所述的那些类似的减毒突变，例如，基于E蛋白的晶体结构的知识(Rey等人，Nature375(6529)：291-298，1995)，并采用。此外，在表9中提供了关于TBE病毒和其它黄病毒所述的减毒E蛋白突变的其它实例。它们可以类似地导入嵌合疫苗候选物中。

本发明也提供了新的、特殊的嵌合黄病毒，其可以用作设计PIV载体和PIV的基础，用作活的减毒的嵌合黄病毒载体，和用作抗嵌合体的膜前和被膜组分的来源的疫苗。这些嵌合体包括蜱传脑炎(TBE)病毒或相关的prM-E序列。因而，嵌合体可以包括来自例如TBE或兰加特(LGT)病毒的Hypr菌株的prM-E序列。嵌合体的衣壳和非结构蛋白可以包括来自黄热病病毒(例如，YF17D)或西尼罗河病毒(例如，NY99)的那些。

这些示例性的YF/TBE、YF/LGT、WN/TBE和WN/LGT嵌合体的重要特征是衣壳和prM蛋白之间的信号序列。如在下面的实施例中所证实的，我们已经发现，在基于YF的PIV嵌合体的情况下，有利地使用包含黄热病和TBE序列的信号序列(参见下文)。在一个实例中，信号序列包括在氨基末端区域的黄热病序列(例如，SHDVLTVQFLIL)和在羧基末端区域的TBE序列(例如，GMLGMTIA)，产生序列SHDVLTVQFLILGMLGMTIA。我们还已经发现，在基于WN的PIV嵌合体的情况下，有利地使用包含TBE序列的信号序列(例如，GGTDWMSWLLVIGMLGMTIA)。本发明因而包括YF/TBE、YF/LGT、WN/TBE和WN/LGT嵌合体，PIV和LAV，其包括上述的信号序列或其具有例如1-8、2-7、3-6或4-5个氨基酸置换、缺失或插入的变体，所述置换、缺失或插入基本上不影响在信号序列处的加工。在不同的实施例中，置换是“保守置换”，其特征在于将一个氨基酸残基替换为另一个生物学上类似的残基。保守置换的实例包括将一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸置换为另一个，或将一个极性残基置换为另一个，例如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酸和天冬氨酸之间，或谷氨酰胺和天冬酰胺之间，等。下面在实施例中提供了关于这些嵌合体的其它信息。

插入位点

编码免疫原的序列可以插入本发明载体内的一个或更多个不同位点处。相对短的肽可以在PIV或LAV糖蛋白(例如，prM，E，和/或NS1蛋白)的表面上和/或在其它蛋白的背景下(以分别主要诱导B-细胞和T-细胞应答)递送。可以基因间地，在多蛋白的N-和C-末端，或双顺反子地(例如，在内部核糖体进入位点下的ORF中，或在内部核糖体进入位点下的3’UTR中；关于其它细节，参见，例如，WO 02/102828，WO2008/036146，WO 2008/094674，WO 2008/100464，WO 2008/115314，和下面)，表达其它插入物，其包含外来蛋白的更大部分以及完整蛋白。在PIV构建体中，存在在导入缺失的位置直接插入外来氨基酸序列的其它选择。插入可以发生在，例如，ΔC，ΔprM-E，ΔC-prM-E，ΔNS1，ΔNS3，和ΔNS5。因而，在一个实例中，在s-PIV和d-PIV的ΔC组分的情况下，可以在缺失的衣壳序列的位置插入免疫原编码序列。免疫原编码序列也可以任选地插入d-PIV的ΔprM-E组分中的缺失的prM-E序列的位置处。在另一个实例中，在ΔC-prM-E构建体中的缺失的序列处，或与之组合地，插入序列。在下面的实施例部分中，提供了这样的插入的实例。

在使插入进入PIV缺失的情况下，可以用在外来免疫原的N-和/或C-末端的少数(例如，1，2，3，4或5)额外载体特异性的残基(如果序列简单地融合在框架内(例如，如果该序列替换ΔC缺失，C蛋白的前面约20个氨基酸和少数最后的残基))，或不用它们(如果外来免疫原侧接本领域熟知的适当元件(例如，病毒蛋白酶切割位点；细胞蛋白酶切割位点，例如信号肽酶，弗林蛋白酶，等；自体蛋白酶(autoprotease)；终止密码子；和/或内部核糖体进入位点元件))，产生插入。

如果在连续的病毒开放读码框(ORF)之外表达蛋白，例如，如果载体和非载体序列被内部核糖体进入位点(IRES)隔开，可以实现产物的胞质表达，或使用适当的信号/锚节段将产物导向分泌途径，视需要而定。如果在载体ORF内表达蛋白，重要的考虑包括：从新生的多蛋白序列切割外来蛋白，和维持外来蛋白和所有病毒蛋白相对于内质网膜的正确拓扑学(以确保载体生存力)，例如，分泌的蛋白向内质网内腔中的易位，或保持胞质蛋白或膜-相关蛋白在胞质中/与内质网膜结合。

更详细地，上述产生插入的方案可以利用例如包含在糖蛋白插入物的N和C末端的适当载体衍生的、插入物衍生的、或不相关的信号和锚序列。标准的自体蛋白酶，例如FMDV 2A自体蛋白酶(～20氨基酸)或泛素(基因～500核苷酸)，或侧接病毒NS2B/NS3蛋白酶切割位点，可以用于指导表达的产物从生长的多肽链的切割，以从载体多蛋白释放外来蛋白，并确保构建体的生存力。任选地，使用终止密码子，例如，在外来基因插入物之后，可以终止多蛋白链的生长，且通过掺入内部核糖体进入位点元件，例如，在RNA病毒载体领域常用的脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点，可以重新启动构建体中剩余蛋白的合成。可以从辅助细胞(或正常细胞，对于d-PIV形式而言)回收活的重组体。任选地，可以重排主链PIV序列，例如，如果后者导致外来基因的更有效表达。例如，已经将基因重排应用于TBE病毒，其中prM-E基因移动到在内部核糖体进入位点控制下的基因组的3’末端(Orlinger等人，J.Virol.80：12197-12208，2006)。可以将prM-E或任意其它基因的易位应用于根据本发明的PIV黄病毒疫苗候选物和表达载体。

关于可以用于本发明中的不同插入位点的其它细节如下(也参见WO 02/102828，WO 2008/036146，WO 2008/094674，WO 2008/100464，WO 2008/115314，如上所述)。肽序列可以插入被膜蛋白内，后者是中和抗体的主要靶物。所述序列可以插入被膜中，例如，在与日本脑炎病毒被膜蛋白的氨基酸位置59、207、231、277、287、340和/或436相对应的位置(参见，例如，WO 2008/115314和WO 02/102828)。为了鉴别不同黄病毒中的对应基因座，将黄病毒序列与日本脑炎病毒序列进行比对。由于可能不存在准确匹配，应当理解，在非日本脑炎病毒中，插入位点可以在任意方向相差例如1、2、3、4或5个氨基酸。此外，在鉴别出这样的位点是在日本脑炎中允许的情况下，它们也可以在日本脑炎中在任意方向相差例如1、2、3、4或5个氨基酸。使用诸如转座子诱变等方法(参见，例如，WO 02/102828和WO 2008/036146)，可以鉴别出其它允许的位点。通过仅插入指示氨基酸的C-末端(即，在氨基酸51-52、207-208、231-232、277-278、287-288、340-341和436-437之间)，或在指示氨基酸(或在其1-5个位置内，在任意方向)处开始的短缺失(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸的缺失)的位置，可以在指示的氨基酸处产生插入。

除了被膜蛋白以外，可以使插入进入其它病毒蛋白，包括，例如，膜/膜前蛋白和NS 1(参见，例如，WO 2008/036146)。例如，可以使插入进入在衣壳/膜前切割位点之前(在例如，-4，-2，或-1)或在膜前蛋白的前50个氨基酸内(例如，在位置26)和/或在NS1的氨基酸236和237之间(或在指示的序列周围的区域中，如上所述)的序列。在其它实施例中，可以在基因间产生插入。例如，可以在E和NS1蛋白之间和/或NS2B和NS3蛋白之间产生插入(参见，例如，WO 2008/100464)。在基因间插入的一个实例中，插入的序列可以在E蛋白的C-末端信号/锚序列之后与载体的E蛋白的C-末端融合，插入可以包括C-末端锚/信号序列，其与载体NS1序列融合。在基因间插入的另一个实例中，可以将插入的具有侧接蛋白酶切割位点(例如，YF 17D切割位点)的序列插入导入在NS2B/NS3接头的唯一限制位点(WO 2008/100464)。

在其它实施例中，可以将序列插入内部核糖体进入位点(IRES，例如，源自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES)的背景，如上所述，例如插入3’-非翻译区(WO 2008/094674)。在这样的采用例如黄热病病毒序列的载体的一个实例中，可以将IRES-免疫原盒插入多克隆位点，所述多克隆位点构建进载体的3’-非翻译区，例如，在多蛋白终止密码子之后的缺失(例如，在基于黄热病病毒的实例的情况下，136核苷酸缺失)中(WO2008/094674)。

在下面的实施例3中，提供了关于将狂犬病病毒G蛋白和全长呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白插入本发明的s-PIV和d-PIV载体中的细节。在实施例3中提供的信息可以应用于本文所述的其它载体和免疫原的背景中。

免疫原

如上所述的基于黄病毒序列和活的、减毒的嵌合黄病毒(例如，YF/TBE、YF/LGT、WN/TBE和WN/LGT)的PIV(s-PIV和d-PIV)，可以在本发明中用于递送外来(例如，非黄病毒)病原体(例如，病毒的、细菌的、真菌的和寄生虫病原体)、癌症、和变态反应相关的免疫原。如下面在某些实施例中进一步讨论的，可以有利地靶向在特定地理区域中占据相同生态小境的几种病原体。下面提供了这样的免疫原的具体的非限制性实例。

除了TBE病毒以外，已知蜱会传播另一种重要疾病，莱姆病。因而，在第一个实例中，本发明的PIV，例如包含TBE/LGT序列的PIV，以及包含TBE序列的嵌合黄病毒(例如，YF/TBE，YF/LGT，WN/TBE，LGT/TBE，和WN/LGT；在所有情况下，当指示“TBE”时，它包括使用Hypr菌株的选择)，可以用作递送莱姆病病原体(蜱传播的螺旋体博氏疏螺旋体)的保护性免疫原的载体。靶向两种传染因子(TBE和博氏疏螺旋体)的该组合是有利的，因为TBE和莱姆病是两种蜱传播的疾病。PIV方案可以应用于根据本发明的嵌合体(例如，YF/TBE，YF/LGT，WN/TBE，或WN/LGT)，以及非嵌合的TBE和LGT病毒。可以用于本发明中的来自博氏疏螺旋体的一个示例性的免疫原是OspA(Gipson等人，Vaccine 21：3875-3884，2003)。任选地，为了增加安全性和/或免疫原性，可以突变OspA，以减少自身免疫应答的机会和/或消除脊椎动物细胞中不希望的翻译后修饰的位点，例如N-连接的糖基化，其可能影响表达产物的免疫原性。减少自身免疫的突变可以包括，例如，Willett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：1303-1308，2004所述的那些。在一个实例中，改变FTK-OspA，一种推定的交叉反应的T细胞表位BbOspA_165-173(YVLEGTLTA)，以模拟阿氏疏螺旋体的对应肽序列(FTLEGKVAN)。在FTK-OspA中，对应的序列是FTLEGKLTA。

OspA的序列如下：

1 mkkyllgigl ilaliackqn vssldeknsv svdlpgemkv lvskeknkdg kydliatvdk

61 lelkgtsdkn ngsgvlegvk adkskvklti sddlgqttle vfkedgktlv skkvtskdks

121 steekfnekg evsekiitra dgtrleytgi ksdgsgkake vlkgyvlegt ltaekttlvv

181 kegtvtlskn isksgevsve lndtdssaat kktaawnsgt stltitvnsk ktkdlvftke

241 ntitvqqyds ngtklegsav eitkldeikn alk

全长序列和/或全长序列的免疫原性片段可以用于本发明中。示例性的片段可以包括结构域1(氨基酸34-41)、2(氨基酸65-75)、3(氨基酸190-220)和4(氨基酸250-270)中的一个或更多个(Jiang等人，Clin.Diag.Lab.Immun.1(4)：406-412，1994)。

因而，例如，可以递送包含下述序列(它们包括可以包含在上面列出的序列中的序列变体，以任意组合)中的任意一个(或更多个)的肽：LPGE/GM/IK/T/GVL；GTSDKN/S/DNGSGV/T；N/H/EIS/P/L/A/SK/NSGEV/IS/TV/AE/ALN/DDT/SD/NS/TS/TA/Q/RATKKTA/GA/K/TWN/DS/AG/N/KT；SN/AGTK/NLEGS/N/K/TAVEIT/KK/TLD/KEI/LKN。

除了博氏疏螺旋体免疫原以外，可以表达蜱唾液蛋白，例如64TRP、Isac和Salp20，例如，以产生三价特异性(TBE+莱姆病+蜱)的疫苗候选物。或者，可以在含有TBE序列的载体中表达蜱唾液蛋白，以替换博氏疏螺旋体免疫原。另外，存在许多可以用于根据本发明的蜱载体疫苗开发中的其它候选蜱唾液蛋白(Francischetti等人，Insect Biochem.Mol.Biol.35：1142-1161，2005)。可以在s-PIV-TBE中表达这些免疫原中的一种或更多种。但是，也可以选择d-PIV-TBE，因为它的大插入能力。除了PIV-TBE以外，其它PIV疫苗可以用作载体，例如，保护免于莱姆病和另一种黄病毒疾病，例如西尼罗河病毒。可以在细胞培养物中评价这些免疫原的表达，并在可利用的动物模型中检查免疫原性/保护(例如，如Gipson等人，Vaccine 21：3875-3884，2003；Labuda等人，Pathog.2(e27)：0251-0259，2006所述)。为了制备多价疫苗候选物，除了莱姆病和蜱免疫原以外，可以类似地表达其它病原体的免疫原。可以用于本发明中的示例性的蜱唾液免疫原包括下述的：

64TRP(AF469170)

MKAFFVLSLL STAALTNAAR AGRLGSDLDT FGRVHGNLYAGIERAGPRGY PGLTASIGGE VGARLGGRAG VGVSSYGYGYPSWGYPYGGY GGY

Isac(AF270496)

MRTAFTCALL AISFLGSPCS SSEDGLEQDT IVETTTQNLYERHYRNHSGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLN HLPPVVNATWEGIRHRINKT IPQ

Salp20(EU008559)

MRTALTCALL AISFLGSPCS SSEGGLEKDS RVETTTQNLYERYYRKHPGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLS LLPLSVNTTWEGIRHRINKT IPEFVNLICN FTVAMPDQFY LVYMGSNGNSYSEEDEDGKT GSSAAVQVTE QLIIQAEENC TAHITGWTTEAPTTLEPTTE TQFEAIS

在下面的实施例2中，提供了关于TBE-相关的PIV和LAV的其它细节。

本发明另外提供了以PIV和LAV为载体的抗其它非黄病毒病原体的疫苗，包括引起抗黄病毒(由载体被膜蛋白决定)和非黄病毒病原体(由表达的免疫决定基决定)的保护性免疫的双效疫苗。这些类似于上述的PIV-TBE-莱姆病-蜱载体疫苗的实例。如上所述，通过表达来自例如病毒、细菌、真菌和寄生虫病原体的免疫原和与癌症和变态反应有关的免疫原，可以开发抗广范围病原体的这样的双效疫苗。作为具体的非限制性实例，我们在本文中描述了以PIV为载体的狂犬病和呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗候选物的设计和生物学性质，所述疫苗候选物通过替代单和双组分PIV载体中的不同缺失或与之组合地表达狂犬病病毒G蛋白或全长RSV F蛋白来构建(参见下面的实施例3)。

如在下面的实施例中证实的，s-PIV构建体可以有利地用于稳定地递送相对短的外来免疫原(类似于莱姆病因子OspA蛋白和蜱唾液蛋白)，因为插入与相对短的ΔC缺失相组合。双组分PIV载体可以有利地用于稳定地表达相对大的免疫原，例如狂犬病G蛋白和RSV F，因为在这样的载体中插入与例如大ΔprM-E、ΔC-prM-E和/或ΔNS1缺失相组合。可以生产有些d-PIV组分，并单独用作疫苗，例如，下述的含有ΔC-prM-E缺失的PIV-RSV F构建体。在该情况下，疫苗诱导主要针对表达的蛋白、但是不针对黄病毒载体病毒病原体的免疫应答(例如，中和抗体)。在本发明的其它实例中，通过具有诱导的针对载体和插入组分的免疫，获得双重免疫。另外，因为PIV载体的大插入能力和使用双组分基因组的选择，PIV载体会提供同时靶向几种非黄病毒病原体的机会，例如，通过在d-PIV的双组分中表达来自2种不同非黄病毒病原体的外来免疫原。

除了作为上述外来免疫原的实例的RSV F蛋白、狂犬病G蛋白、莱姆病保护性免疫原和蜱唾液蛋白以外，可以表达其它外来免疫原，以靶向各种疾病，包括，例如，甲型和乙型流感病毒免疫原。在这些实施例中，可以使用病毒颗粒蛋白的几个短表位和/或整个基因，例如甲型流感的M2、HA和NA基因和/或乙型流感的NB或BM2基因。也可以使用M2、NB和BM2的更短的片段，与例如M2e(M2的胞外片段)相对应。另外，可以使用HA基因的片段，包括鉴别为HA0的表位(长度为23个氨基酸，与HA中的切割位点相对应)。可以用于本发明中的流感相关序列的具体实例包括

PAKLLKERGFFGAIAGFLE(HA0)，PAKLLKERGFFGAIAGFLEGSGC(HA0)，NNATFNYTNVNPISHIRGS(NBe)，MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(M2e)，MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(M2e)，MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(M2e)，EVETPTRN(M2e)，SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(M2e)，和SLLTEVETPIRNEWGCR(M2e)。可以用于本发明中的其它M2e序列包括来自乙型流感的BM2蛋白的胞外结构域的序列(共有序列MLEPFQ，例如，LEPFQILSISGC)和来自H5N1禽流感的M2e肽(MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD)。

可以在本发明的载体中递送的病原体免疫原的其它实例包括：密码子优化的SIV或HIV gag(55kDa)，gp120，gp160，SIV mac239-rev/tat/nef基因或来自HIV的类似物，和其它HIV免疫原；来自HPV病毒的免疫原，例如HPV16，HPV18，等，例如，自装配成HPV-样颗粒的衣壳蛋白L1，衣壳蛋白L2或它的免疫显性部分(例如，氨基酸1-200，1-88，或17-36)，参与转化哺乳动物细胞并使其永生的、融合到一起且适当突变的E6和E7蛋白(2个基因的融合产生称作E6E7Rb^-的融合蛋白，它比转化成纤维细胞的能力低约10倍，在2个残基处的E7组分的突变使得到的融合蛋白突变体不能诱导转化)(Boursnell等人，Vaccine 14：1485-1494，1996)。其它免疫原包括来自HCV、CMV、HSV2、病毒、疟原虫、造成结核病的结核分支杆菌、艰难梭状芽胞杆菌和本领域已知的其它医院感染的保护性免疫原，以及可以用作疫苗靶物的真菌病原体、癌症免疫原和与变态反应有关的蛋白。

可以以多种方式修饰本发明的外来免疫原插入物。例如，使用密码子优化来增加表达水平，并消除核苷酸序列中的长重复序列，以增加PIV载体的RNA基因组中的插入物稳定性。通过蛋白与本领域熟知的免疫刺激部分的嵌合，可以增加免疫原性，所述免疫刺激部分例如TLR激动剂、刺激细胞因子、补体的组分、热休克蛋白等(例如，综述见“Immunopotentiators in Modern Vaccines，”Schijns和O’Hagan编，2006，Elsevier Academic Press：Amsterdam，Boston)。

关于抗狂犬病和其它黄病毒疾病的双效疫苗的构建，其它组合，例如TBE+狂犬病、YF+狂犬病等，在对应地理区域的人和兽医用途是令人感兴趣的，因而可以类似地生产。表达构建体的可能的设计不限于本文所述的那些。例如，可以修饰缺失和插入，可以重排遗传元件，或可以使用其它遗传元件(例如非黄病毒、非狂犬病的分泌信号，细胞内运输决定基，免疫刺激部分例如细胞因子、TLR激动剂例如鞭毛蛋白、多聚化组分例如亮氨酸拉链、和增加蛋白在血液中的循环周期的肽的包含或融合)来促进抗原呈递和增加免疫原性。此外，这样的设计可以应用于s-PIV和d-PIV疫苗候选物，其基于其它黄病毒的载体基因组，并表达其它病原体的免疫原，例如，包括但不限于本文别处所述的病原体。

本发明的PIV和LAV载体的其它实例包括组合疫苗例如DEN+奇孔古尼亚病毒(CHIKV)和YF+CHIKV。CHIKV(一种α病毒)是非洲、东南亚、印度次大陆和岛屿和太平洋岛特有的，且与YF和DEN1-4共有生态/地理小境。它在大多数患者中造成主要与严重疼痛(关节炎，与DEN类似的其它症状)和持久的后遗症有关的严重疾病(Simon等人，Med.Clin.North Am.92：1323-1343，2008；Seneviratne等人，J.Travel Med.14：320-325，2007)。本发明的PIV和LAV载体的其它实例包括YF+埃博拉或DEN+埃博拉，它们在非洲共传播。

上述的非黄病毒病原体的免疫原(其序列是本领域熟知的)，可以包括CMV的糖蛋白B或pp65/IE1融合蛋白(Reap等人，Vaccine25(42)：7441-7449，2007；和其中的参考文献)，几种TB蛋白(综述见Skeiky等人，Nat.Rev.Microbiol.4(6)：469-476，2006)，疟原虫抗原例如RTS，S(一种红细胞前环子孢子蛋白，CSP)和其它抗原(例如，综述见Li等人，Vaccine 25(14)：2567-2574，2007)，CHIKV被膜蛋白E1和E2(或C-E2-E1，E2-E1盒)，形成HCV结构蛋白C-E1-E2的VLP(Ezelle等人，J.Virol.76(23)：12325-12334，2002)或诱导T-细胞应答的其它蛋白，埃博拉病毒糖蛋白GP(Yang等人，Virology 377(2)：255-264，2008)。

除了上述的免疫原以外，本文所述的载体可以包括一种或更多种源自一种或更多种病毒(例如，病毒靶抗原)或指导针对它们的免疫应答的免疫原，所述病毒包括，例如，dsDNA病毒(例如，腺病毒，疱疹病毒，EB病毒，1型单纯疱疹，2型单纯疱疹，8型人单纯疱疹病毒，人巨细胞病毒，水痘-带状疱疹病毒，痘病毒)；ssDNA病毒(例如，细小病毒，乳头状瘤病毒(例如，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，BPV1，BPV2，BPV3，BPV4，BPV5，和BPV6(见Papillomavirus and Human Cancer，H.Pfister编(CRCPress，Inc.1990))；Lancaster等人，Cancer Metast.Rev.页6653-6664，1987；Pfister等人，Adv.Cancer Res.48：113-147，1987))；dsRNA病毒(例如，呼肠病毒)；(+)ssRNA病毒(例如，微小RNA病毒，柯萨奇病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，披膜病毒，风疹病毒，黄病毒，丙型肝炎病毒，黄热病病毒，登革热病毒，西尼罗河病毒)；(-)ssRNA病毒(例如，正粘液病毒，流感病毒，杆状病毒，副粘病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，杆状病毒，狂犬病病毒)；ssRNA-RT病毒(例如，反转录病毒，人免疫缺陷病毒(HIV))；和dsDNA-RT病毒(例如肝DNA病毒，乙型肝炎病毒)。免疫原也可以源自上面没有列出、但是本领域技术人员可利用的其它病毒。

关于HIV，免疫原可以选自任意HIV分离物。如本领域熟知的，HIV分离物现在分为离散的基因亚型。已知HIV-1包含至少10个亚型(A，B，C，D，E，F，G，H，J，和K)。已知HIV-2包含至少5个亚型(A，B，C，D，和E)。已经将亚型B与全世界的同性恋男性和静脉内嗜药者的HIV流行病相关联。大部分HIV-1免疫原，实验室适应的分离物、试剂和绘图的表位属于亚型B。在撒哈拉沙漠以南的非洲、印度和中国(新HIV感染的发病率较高的区域)，HIV-1亚型B仅占感染的少数，且亚型HIV-1C似乎是最常见的感染亚型。因而，在某些实施方案中，可能希望从HIV-1亚型B和/或C选择免疫原。可能希望在单一免疫组合物中包含来自多个HIV亚型(例如，HIV-1亚型B和C，HIV-2亚型A和B，或HIV-1和HIV-2亚型的组合)的免疫原。合适的HIV免疫原包括，例如，ENV，GAG，POL，NEF，以及它们的变体、衍生物和融合蛋白。

免疫原也可以源自一个或更多个细菌物种(例如，细菌靶抗原)或指导针对它们的免疫应答，所述细菌物种包括，例如，杆菌属(例如，炭疽杆菌)，博德特氏菌属(例如，百日咳杆菌)，疏螺旋体属(例如，博氏疏螺旋体)，布鲁氏菌属(例如，流产杆菌，犬布鲁氏菌，羊流产布鲁氏菌，猪流产布鲁氏菌)，弯曲杆菌属(例如，空肠弯曲杆菌)，衣原体属(例如，肺炎衣原体，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体)，梭菌属(例如，肉毒梭状芽胞杆菌，艰难梭状芽胞杆菌，产气荚膜梭状芽胞杆菌，破伤风梭状芽胞杆菌)，棒状杆菌属(例如，白喉棒杆菌)，肠球菌属(例如，粪肠球菌，屎肠球菌)，埃希氏杆菌属(例如，大肠杆菌)，弗朗西丝氏菌属(例如，土拉热弗朗西丝氏菌)，嗜血杆菌属(例如，流感嗜血杆菌)，缠绕杆菌属(例如，幽门螺旋杆菌)，军团杆菌属(例如，嗜肺性军团病杆菌)，钩端螺旋体属(例如，问号钩端螺旋体)，李斯特菌属(例如，单核细胞增多性李斯特菌)，分支杆菌属(例如，麻风分支杆菌，结核分支杆菌)，支原体属(例如，肺炎支原体)，奈瑟氏菌属(例如，淋病奈瑟氏菌，脑膜炎奈瑟氏菌)，假单胞菌属(例如，绿脓假单胞菌)，立克次氏体(例如，立克氏立克次氏体)，沙门氏菌属(例如，伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌)，志贺菌属(例如，索氏志贺菌)，葡萄球菌属(例如，金黄色葡萄球菌，)表皮葡萄球菌，腐生性葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌(例如，美国专利号7,473,762))，链球菌属(例如，无乳链球菌，肺炎链球菌，热原链球菌)，密螺旋体属(例如，梅毒密螺旋体)，弧菌属(例如，霍乱弧菌)，和耶尔森菌属(鼠疫耶尔森菌)。免疫原也可以源自上面没有列出、但是本领域技术人员可利用的其它细菌物种，或指导针对它们的免疫应答。

免疫原也可以源自一种或更多种寄生生物体(物种)(例如，寄生虫靶抗原)或指导针对它们的免疫应答，所述寄生生物体包括，例如，钩口线虫属属(例如，十二指肠钩口线虫)，异尖属，蛔虫，结肠小袋虫，多节绦虫属，臭虫属，华支睾吸虫，分支双腔吸虫，牛双腔吸虫，阔节裂头绦虫，龙线虫属，棘球绦虫属(例如，细粒棘球绦虫，多房棘球绦虫)，痢疾变形虫，蛲虫，片吸虫属(例如，肝片吸虫，巨形拟片吸虫，巨大片吸虫，杰氏片吸虫)，布氏姜片吸虫，贾第虫属(兰伯贾第虫)，颚口线虫属，膜壳绦虫属(例如，短膜壳绦虫，缩小膜壳绦虫)，利什曼原虫属，非洲眼线虫，次睾吸虫属(小次睾吸虫，白次睾吸虫)，美洲钩虫，Oestroidea属(例如，肤蝇)，Onchocercidae属，后睾吸虫属(例如，麝猫后睾吸虫，猫后睾吸虫，Opisthorchis guayaquilensis，和犬后睾吸虫)，疟原虫属(例如，镰状疟原虫)，Protofasciola robusta，Parafasciolopsis fasciomorphae，卫氏并殖吸虫，血吸虫属(例如，曼森血吸虫，日本血吸虫，湄公河血吸虫，埃及血吸虫)，刺猬绦虫，粪类圆线虫，绦虫属(例如，牛肉绦虫，猪肉绦虫)，弓蛔虫属(例如，犬弓蛔虫，猫弓蛔虫)，弓形体属(例如，鼠弓形体)，Trichobilharzia regenti，旋毛线虫，鞭虫，恙螨属，锥虫属，穿皮蚤骚，和/或斑氏线虫。免疫原也可以源自上面没有列出、但是本领域技术人员可利用的其它寄生生物体，或指导针对它们的免疫应答。

免疫原可以源自肿瘤靶抗原(例如，肿瘤靶抗原)或指导针对它们的免疫应答。术语肿瘤靶抗原(TA)可以包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性的抗原(TSA)，其中癌细胞是抗原的来源。TA可以是在肿瘤细胞表面上表达的抗原(其量高于在正常细胞上观察到的量)或在胚胎发育过程中在正常细胞上表达的抗原。TSA通常是肿瘤细胞独有的、不在正常细胞上表达的抗原。根据它们的表达模式、功能或遗传起源，通常将TA分成5类：癌-睾丸(CT)抗原(即，MAGE，NY-ESO-1)；黑素细胞分化抗原(例如，Melan A/MART-1，酪氨酸酶，gp100)；突变抗原(例如，MUM-1，p53，CDK-4)；过表达的“自身”抗原(例如，HER-2/neu，p53)；和病毒抗原(例如，HPV，EBV)。合适的TA包括，例如，gp100(Cox等人，Science264：716-719，1994)，MART-1/Melan A(Kawakami等人，J.Exp.Med.，180：347-352，1994)，gp75(TRP-1)(Wang等人，J.Exp.Med.，186：1131-1140，1996)，酪氨酸酶(Wolfel等人，Eur.J.Immunol.，24：759-764，1994)，NY-ESO-1(WO 98/14464；WO 99/18206)，黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom等人，J.Immunol.，130：1467-1472，1983)，MAGE家族抗原(例如，MAGE-1，2，3，4，6，和12；Van der Bruggen等人，Science254：1643-1647，1991；美国专利号6,235,525)，BAGE家族抗原(Boel等人，Immunity 2：167-175，1995)，GAGE家族抗原(例如，GAGE-1，2；Van denEynde等人，J.Exp.Med.182：689-698，1995；美国专利号6,013,765)，RAGE家族抗原(例如，RAGE-1；Gaugler等人，Immunogenetics44：323-330，1996；美国专利号5,939,526)，N-乙酰葡糖氨基转移酶-V(Guilloux等人，J.Exp.Med.183：1173-1183，1996)，p15(Robbins等人，J.lmmunol.154：5944-5950，1995)，β-连环蛋白(Robbins等人，J.Exp.Med.，183：1185-1192，1996)，MUM-1(Coulie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7976-7980，1995)，细胞周期蛋白依赖性的激酶-4(CDK4)(Wolfel等人，Science 269：1281-1284，1995)，p21-ras(Fossum等人，Int.J.Cancer 56：40-45，1994)，BCR-abl(Bocchia等人，Blood85：2680-2684，1995)，p53(Theobald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：11993-11997，1995)，p185 HER2/neu(erb-B 1；Fisk等人，J.Exp.Med.，181：2109-2117，1995)，表皮生长因子受体(EGFR)(Harris等人，BreastCancer Res.Treat，29：1-2，1994)，癌胚抗原(CEA)(Kwong等人，J.Natl.Cancer Inst.，85：982-990，1995)美国专利号5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710；和EP784483；癌相关的突变的粘蛋白(例如，MUC-1基因产物；Jerome等人，J.Immunol.，151：1654-1662，1993)；EBV的EBNA基因产物(例如，EBNA-1；Rickinson等人，Cancer Surveys 13：53-80，1992)；人乳头状瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing等人，J.Immunol.154：5934-5943，1995)；前列腺特异性的抗原(PSA；Xue等人，The Prostate 30：73-78，1997)；前列腺特异性的膜抗原(PSMA；Israeli等人，Cancer Res.54：1807-1811，1994)；个体基因型表位或抗原，例如，免疫球蛋白独特型或T细胞受体独特型(Chen等人，J.Immunol.153：4775-4787，1994)；KSA(美国专利号5,348,887)，驱动蛋白2(Dietz，等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.275(3)：731-738，2000)，HIP-55，TGFβ-1抗细胞凋亡因子(Toomey等人，Br.J.Biomed.Sci.58(3)：177-183，2001)，肿瘤蛋白D52(Bryne等人，Genomics35：523-532，1996)，H1FT，NY-BR-1(WO 01/47959)，NY-BR-62，NY-BR-75，NY-BR-85，NY-BR-87，和NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens，见Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，New York，NY)，和/或胰腺癌抗原(例如，美国专利号7,473，531的SEQ ID NO：1-288)。免疫原也可以源自上面没有列出、但是本领域技术人员可利用的TA，或指导针对它们的免疫应答。

除了上面列出的具体免疫原序列以外，本发明也包括所述序列的类似物的应用。这样的类似物包括与参照序列具有例如至少80％、90％、95％或99％同一性的序列，或其片段。类似物也包括参照序列的片段，其包括例如所述序列的一个或更多个免疫原性表位。此外，类似物包括在任一端或两端截短或延长(例如，插入额外的/重复的免疫显性的/辅助表位)例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-20等个氨基酸的所述序列。截短可以去除免疫学上不重要的或妨碍序列，例如，在已知的结构/免疫结构域内，或在结构域之间；或可以删除整个不希望的结构域；这样的修饰可以是在21-30、31-50、51-100、101-400、等个氨基酸的范围内。所述范围也包括，例如，20-400、30-100和50-100个氨基酸。

液体混合物

本发明也包括组合物，包括2种或更多种本文所述的PIV和/或PIV载体的混合物。如上面讨论的，当希望诱导对超过一种免疫原和/或病原体的免疫时，这样的混合物或液体混合物的应用可能是特别有利的。这可以用于，例如，针对不同黄病毒的疫苗接种，所述不同黄病毒可能是疫苗受体居住的区域特有的。这也可以用于施用针对相同靶物的多种免疫原的背景中。

包括在本发明中的PIV液体混合物的非限制性实例是包括PIV-JE+PIV-DEN和PIV-YF+PIV-DEN的那些。在这2个实例中，任一种或两种组分的PIV可以是如上所述的单或双组分PIV。另外，在PIV-DEN的情况下，PIV可以包括选自登革热血清型1-4的仅一种登革热血清型的序列，或液体混合物可以包括来自2、3或所有4种血清型的PIV表达序列。此外，本文所述的TBE/博氏疏螺旋体/蜱唾液蛋白(例如，64TRP，Isac，Salp20)疫苗可以基于(包括)在单个PIV或活的减毒的黄病毒内的不同免疫原，或可以基于PIV(或LAV)的混合物，它们各自包括一种或更多种免疫原。本发明的液体混合物可以原样配制，或可以在即将施用前混合。

使用、制剂和施用

本发明包括PIV载体、PIV、LAV载体和LAV、以及对应的核酸分子、药物或疫苗组合物和它们的使用和制备方法。本发明的PIV载体、PIV、LAV载体和LAV可以用于，例如，疫苗接种方法，以诱导对TBE或其它黄病毒和/或本文所述的另一种表达的免疫原的免疫应答。这些方法可以是预防性的，在该情况下，将它们施用给受试者(例如，人受试者或其它哺乳动物受试者)，所述受试者不具有由TBE或另一种黄病毒和/或其它表达的免疫原的来源病原体造成的感染或疾病，但是处于发展所述感染或疾病的危险中。所述方法也可以是治疗性的，在该情况下，将它们施用给已经具有一种或更多种相关病原体的感染的受试者。此外，所述病毒和载体可以单独地或与另一种或其它疫苗组合地使用。根据本发明的方法治疗的受试者包括人以及非人哺乳动物(例如，家畜，例如，牛，猪，马，绵羊，和山羊，和家养动物，包括狗和猫)。

使用本领域的标准方法，可以配制本发明的PIV载体、PIV、LAV载体和LAV。许多用于疫苗制品中的药学上可接受的溶液是众所周知的，且可以由本领域技术人员为用于本发明容易地改造(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版)，A.Gennaro编，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。在2个具体的实例中，在含有7.5％乳糖和2.5％人血清白蛋白的最低基础培养基Earle氏盐(MEME)或含有10％山梨醇的MEME中，配制PIV载体、PIV、LAV载体和LAV。但是，可以在生理上可接受的溶液例如无菌盐水或无菌缓冲盐水中，简单地稀释PIV载体、PIV、LAV载体和LAV。

使用本领域熟知的方法，可以施用本发明的PIV载体、PIV、LAV载体和LAV，且本领域技术人员可以容易地确定要施用的病毒和载体的适当量。要施用的病毒的适当量，可以由下述考虑因素决定，例如，要施用病毒的受试者的体重和一般健康。例如，在本发明的活的、减毒的病毒的情况下，可以将病毒配制成0.1-1.0ml给药体积的无菌水溶液，其含有10²至10⁸、例如10³至10⁷个传染单位(例如，噬斑形成单位或组织培养物传染剂量)。可以以类似的剂量和以类似的体积施用PIV；但是，通常以例如焦点形成单位(通过焦点的免疫染色来测定)测量PIV滴度，因为这些有缺陷的构建体不倾向于形成病毒样噬斑。剂量范围可以是10²至10⁸FFU，且以0.1-1.0ml的体积施用。

本发明的所有病毒和载体可以通过例如真皮内的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的或经口的途径施用。在特定实施例中，真皮内的或经皮的施用靶向树突细胞，使用例如显微操作针或微磨损(microabrasion)装置。此外，本发明的疫苗可以以单次剂量施用，或任选地，施用可以包含，使用初次剂量，然后施用加强剂量，例如，在2-6个月后，在本领域技术人员认为适当时。任选地，使用本领域技术人员已知的方法(Chang等人，Nat.Biotechnol.26：571-577，2008；Kofler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：1951-1956，2004)，通过DNA或RNA免疫接种，可以施用PIV疫苗。

任选地，本领域技术人员已知的佐剂可以用于施用本发明的病毒和载体。可以用于增强病毒的免疫原性的佐剂包括，例如，脂质体制剂，合成佐剂，例如(例如，QS21)，胞壁酰二肽，单磷酰脂质A，聚磷腈，CpG寡核苷酸，或似乎通过激活细胞表面上或细胞内核膜上的Toll-样受体(TLR)分子起作用的其它分子。尽管这些佐剂通常用于增强针对灭活疫苗的免疫应答，它们也可以用于活的或复制缺陷型疫苗。TLR的激动剂或拮抗剂都可以用于活的或复制缺陷型疫苗的情况。疫苗候选物可以设计成表达TLR激动剂。在通过粘膜途径递送病毒的情况下，例如，经口地，粘膜佐剂例如大肠杆菌的不耐热毒素(LT)或LT的突变衍生物可以用作佐剂。另外，可以将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入疫苗候选物。因而，编码希望的细胞因子(例如GM-CSF，IL-2，IL-12，IL-13，IL-5，等)的基因，可以与外来免疫原基因一起插入，以生成导致增强的免疫应答的疫苗，或调节更特异性地针对细胞的、体液的或粘膜的应答的免疫(例如，综述见“Immunopotentiators in Modern Vaccines”，Schijns和O’Hagan编，2006，Elsevier Academic Press：Amsterdam，Boston，等)。任选地，含有适当的毒素衍生的佐剂层的贴剂，可以应用于注射部位上。毒素促进吸引淋巴细胞的局部炎症，这导致更有力的免疫应答。

实施例

在下面的实施例中提供了关于本发明的其它细节。在实施例中，描述了实验，其中测试了基于WN、JE和YF病毒的PIV(参见，例如，WO 2007/098267和WO 2008/137163)。首先，我们证实了与可得到的LAV对照(YF 17D，YF/JE LAV，和YF/WN LAV)相比，构建体在敏感的哺乳小鼠神经毒力模型(在所有测试的剂量零死亡率)中的毒性明显更低。我们首次证实，d-PIV构建体在该模型中是无毒的，因而双组分PIV不会在体内经历失控的(无限制的)传播，且不会造成临床征兆。其次，我们对比了PIV和LAV的免疫原性和功效，并证实PIV疫苗可以诱导与LAV相当的免疫应答，且是同样有效的(例如，用PIV-WN和YF/WN LAV疫苗对观察到)。在检查的一对中，YF 17D LAV的免疫原性比PIV-YF明显更高。因而，VLP的生产可以在不同的、类似设计的PIV构建体之间有所差异。具体地，我们提出，与PIV-WN(WN VLP)相比，PIV-YF不会产生大量的YF VLP，且通过次优PIV构建体中C/prM接头处的遗传修饰，可以实现VLP的增加生产。具体地，C/prM接头是黄病毒多蛋白中的重要位置，其掌控病毒被膜的形成和病毒蛋白的合成(Yamshchikov和Compans，Virology 192：38-51，1993；Amberg和Rice，J.Virol.73：8083-8094，1999；Stocks和Lobigs，J.Virol.72：2141-2149，1998)。我们提出，通过解偶联接头处的病毒蛋白酶和信号肽酶切割，或使用强的异源信号肽(tPA，等)替代prM的信号，或通过prM的信号的诱变，可以增加VLP在PIV感染的细胞中的分泌(不同于病毒颗粒在完整病毒中的生产)。在黄病毒的C/prM接头的信号肽酶切割的效率较低(Stocks和Lobigs，J.Virol.72：2141-2149，1998)，例如，通过SignalP 3.0在线程序测得。预见到，可以如下实现更有效的切割效率：用SignalP 3.0分析在切割位点附近的特异性氨基酸置换(例如，如在申请WO2008/100464中所述)，随后将选择的突变掺入PIV基因组，回收PIV后代，并测量VLP分泌。通过本领域的标准方法，插入非黄病毒信号。可以如下实现病毒蛋白酶和信号肽酶切割之间的解偶联：用任意的非保守突变(例如，YF17D C中的RRS突变成RRA或GRS或RSS，等)，切除病毒的切割位点，或删除整个位点或它的3个残基中的某些。如果必要，可以使用诸如下述的元件，形成外来蛋白的信号的游离N-末端：自体蛋白酶，或终止密码子，其后是内部核糖体进入位点。或者，可以切除C的天然AUG起始密码子(在其中C蛋白序列不是必需的构建体中，例如，ΔC PIV)，并将AUG置于外来基因前面。可以如下优化载体信号：通过随机诱变，例如，通过插入合成的随机化的序列，随后鉴别具有增加的VLP分泌的活的PIV变体。

我们还已经发现，与皮下途径相比，当通过腹膜内途径施用时，PIV构建体在仓鼠中具有实质上更高的免疫原性。我们的结论是，这最可能是由于淋巴组织中抗原呈递细胞的靶向，所述淋巴组织大量存在于腹部，但是不大量存在于皮下组织。基于这些观察，我们的结论是，通过皮肤接种，例如通过皮肤微磨损或使用显微操作针的真皮内注射(Dean等人，Hum Vaccin.1：106-111，2005)，可以使PIV有效地靶向皮肤中大量存在的树突细胞。

此外，我们已经进行了实验来证实施用不同PIV的混合物或液体混合物的可行性，所述PIV例如本文所述的那些(例如，JE+DEN和YF+DEN)。为了施用液体混合物，重要的是证实共同施用的组分之间没有干扰，且会诱导平衡的免疫应答。使用几种PIV混合物来免疫啮齿动物，并将免疫应答与单个施用PIV构建体时进行对比。在混合物中没有观察到干扰，因而液体混合物形式的PIV疫苗是可行的。在不同黄病毒共传播的地理区域，这样的制剂可能是特别重要的。这也可以用于同时施用几种抗非黄病毒病原体的基于PIV的疫苗。

此外，我们已经证实，施用PIV至少2次后，没有诱导抗包装被膜的中和抗体应答(且因而引起针对从受感染的细胞分泌的VLP的抗体)。这如下证实：使用单个包装的d-PIV的辅助(ΔprM-E)组分(参见图2)，或通过测量针对异源包装被膜(例如，在以反式提供WN-特异性的C-prM-E蛋白的辅助细胞中用于包装PIV-JE的WN被膜)的中和抗体。后一种观察支持了在通用辅助包装细胞系中生产的不同PIV疫苗的先后使用，和以不同重组PIV为载体的疫苗在上面所讨论的相同个体中的先后使用。另外，我们证实了以前的观察，即PIV构建体可以在体外稳定地繁殖至高产率，且在基质细胞中长期传代后，不会发生恢复完整病毒的重组(Mason等人，Virology 351：432-443，2006；Shustov等人，J.Virol.21：11737-11748，2007)。

在下面的实施例中进一步描述了本发明的这些和其它方面。

实施例1.假感染病毒平台开发研究

哺乳小鼠神经毒力(NV)模型中的减毒

在表1和其中引用的参考文献中，描述了在下述研究中使用的材料。它们包括：s-PIV-WN(基于野生型WN病毒菌株NY99序列)，s-PIV-JE，s-PIV-WN/JE(基于野生型WN病毒主链和来自野生型JE病毒Nakayama菌株的prM-E基因)，s-PIV-YF/WN(YF 17D主链和来自WN病毒的prM-E基因)，和s-PIV-YF(基于YF 17D序列)。其它材料包括：d-PIV-YF(YF d-PIV，生长于正常的BHK细胞中；Shustov等人，J.Virol.21；11737-11748，2007)，和双组分d-PIV-WN(生长于正常的Vero细胞中；Suzuki等人，J.Virol.82：6942-6951，2008)。

使用非常易感的5天龄ICR小鼠，在哺乳小鼠NV实验(大脑内接种)中，将这些PIV原型的减毒与LAV YF 17D、嵌合的YF/JE病毒和嵌合的YF/WN病毒进行对比(所述嵌合病毒包括黄热病衣壳和非结构序列，和JE或WN prM-E序列)。接受PIV构建体的动物都没有表现出临床征兆或死亡，而在接种LAV的动物中观察到死亡(表2)。YF 17D病毒对于所有年龄的小鼠而言是神经毒力的，而嵌合疫苗对于成年小鼠而言是无神经毒力的，但是在更敏感的哺乳小鼠中可以造成剂量依赖性的死亡(Guirakhoo等人，Virology 257：363-372，1999；Arroyo等人，J.Virol.78：12497-12507，2004)。因此，90％-100％的接受剂量低至1PFU的YF17D的哺乳小鼠死亡。如预期的，YF/JE和YF/WN LAV在高得多的剂量(分别＞2log₁₀PFU和3log₁₀PFU)造成部分死亡，死亡的动物具有更长的平均存活时间(AST)。因而，PIV构建体在该敏感模型中是完全无毒的(其神经毒力比许可的YF 17D疫苗低至少20,000-200,000倍)。

YF d-PIV和WN d-PIV没有造成死亡或临床征兆。因而，理论上可以在来自两种组分共感染的细胞的脑组织内传播的双组分PIV变体不会造成疾病。此外，我们尝试通过滴定检测该实验中其它动物(在接种后6天处死)的脑中的d-PIV，没有检出(将来自10和11只分别接受4log₁₀FFU的YF d-PIV和WN d-PIV的小鼠的脑组织匀浆化，并用于滴定)。因而，d-PIV不会造成完整病毒特有的传播性感染。已经证实，YF/JE LAV会在通过大脑内途径接种的成年ICR小鼠的脑中复制，在第6天达到～6log₁₀PFU/g的峰滴度，尽管没有临床征兆(Guirakhoo等人，Virology257：363-372，1999)。d-PIV的组分对细胞的共感染，显然是比完整病毒的感染更低效率的过程。数据表明，d-PIV体内复制很快受到先天免疫应答(和老龄动物中的适应性应答)的控制。

在小鼠和仓鼠中的免疫原性/功效

将上述PIV原型与嵌合LAV副本和YF 17D在小鼠和叙利亚仓鼠中的免疫原性/功效进行了对比。在图3中解释了一般实验设计(小鼠，腹膜内免疫接种)。同样地进行在仓鼠中的实验(±几天，皮下或腹膜内接种下面指示的剂量)。用分级剂量的PIV构建体(4-6log₁₀FFU/给药)或嵌合LAV和YF 17D LAV对照(4log₁₀PFU)腹膜内免疫3.5周龄ICR小鼠(对于s-PIV-WN和-YF，YF/WN LAV，和YF 17D组)或C57/BL6小鼠(对于s-PIV-JE和YF/JE LAV组)。选择PIV-WN，-JE和-YF组，在第21天用5log₁₀FFU的对应构建体加强(表3)。通过标准的PRNT₅₀，测定动物血清中抗YF/WN或/JE LAV或YF 17D病毒的中和抗体应答。在有或没有加强的情况下，PIV-WN在所有组中诱导非常高的WN-特异性的中和抗体应答，这通过在第20和34天来自免疫的动物的血清库中测得的PRNT₅₀滴度(其与YF/WN LAV对照组相当)来证实。因此，用PIV-WN和YF/WNLAV免疫的动物被保护度过第35天的野生型WN病毒的致死挑战(腹膜内，270LD₅₀)，但是假免疫的动物则没有(表3)。当在来自单个小鼠的血清中测量WN中和抗体时，观察到免疫应答的高一致性(图4)。因而，单轮PIV疫苗的免疫原性和有效性可以象对应的LAV一样。PIV-JE也是高度免疫原性的(黑色小鼠)，而PIV-YF的免疫原性显著低于YF 17D对照(ICR小鼠)。然而，在用野生型YF菌株Asibi病毒进行严重的致死的大脑内挑战(500LD₅₀)后，观察到PIV-YF免疫的动物的剂量依赖性的保护(但是假免疫的动物则没有)(表3)，这与低至1∶10的中和抗体滴度可抗黄病毒感染的保护作用的知识相一致。

YF 17D对照病毒是高度免疫原性的(例如，在第34天，PRNT₅₀滴度1∶1,280)，因而它能感染细胞，并在体内有效地复制，且它的被膜是强免疫原。因此，PIV-YF的低免疫原性不可能是由于它不能感染细胞或在受感染的细胞中体内地有效复制。我们认为，PIV-YF的低免疫原性(例如，相对于PIV-WN)最可能是由于YF-特异性的VLP在PIV-YF感染的细胞中的低水平生产(而PIV-WN感染的细胞中的VLP分泌是高的)。如上面讨论的，我们提出，可以显著增加PIV-YF的免疫原性，例如，通过在C/prM接头的适当修饰，例如，通过使发生在该接头的两种蛋白酶切割(病毒蛋白酶和信号肽酶切割)解偶联，和/或通过使用强异源信号[例如，狂犬病病毒G蛋白信号，或真核组织纤溶酶原激活剂(tPA)信号(Malin等人，Microbes and Infection，2：1677-1685，2000)，等]替代prM的YF信号。

在～4.5周龄叙利亚仓鼠中进行了类似的实验，以对比PIV构建体与LAV对照在该模型中的免疫原性。用分级剂量的实验物皮下免疫动物(表4)。PIV-WN是高度免疫原性的，例如，在分别接受5、6和6(初次)+5(加强)log₁₀FFU剂量的组中，在第38天(挑战前)的WN-特异性的PRNT₅₀滴度是1∶320、1∶640和1∶1280。这比YF/WN LAV 4log₁₀PFU对照(≥1∶2560)稍低。PIV-JE和-YF诱导可检测的特异性的中和抗体应答，尽管与YF/JE LAV和YF 17D对照相比滴度更低。用PIV-WN和YF/WN免疫的所有动物被稳固地保护度过野生型WN病毒的致死挑战，这通过没有死亡和发病(例如，挑战后的体重减轻)以及挑战后没有或显著减轻的WN病毒病毒血症来证实。假免疫的动物没有被保护(表4)。PIV-JE和-WN以剂量依赖性的方式保护动物度过各自的挑战。在图5中另外解释了该实验中的保护功效。例如，在假免疫的动物中观察到YF病毒(仓鼠改造的Asibi菌株)挑战后的高病毒血症，在第3天达到峰值，滴度＞8log₁₀PFU/ml(左上图)；所有动物体重减轻，4只中有1只死亡(右上图)。相反，在用PIV-YF(2次给药；尽管相对低的中和滴度)或YF 17D免疫的仓鼠中，病毒血症显著减轻或不存在；这些动物都没有体重减轻。类似地，在挑战后WN病毒病毒血症和体重减轻/死亡方面，用PIV-WN或YF/WN LAV免疫的动物与假对照相比被显著地或完全地保护(在底图中对比)。因而，在第二种动物模型中证实了PIV的高免疫原性/功效。

在另一个仓鼠实验中，通过腹膜内途径2次给药，用PIV构建体免疫动物。表5对比了在上述实验(皮下接种)中合并的仓鼠血清中测得的中和免疫应答(对每种疫苗特异性的)与第一次给药(第20-21天)和第二次给药(第34-38天)腹膜内免疫接种PIV-WN、-YF/WN、-WN/JE和-YF后的应答。在第一次和第二次给药后，观察到免疫接种途径的明显效应。例如，对于第一次给药后的PIV-WN，皮下免疫接种导致1∶40的WN-特异性的PRNT50滴度，而腹膜内接种导致高得多的滴度1∶320(且在第二次给药后，滴度是类似的)。在第一次和第二次给药后，观察到其它构建体更突出的效应。令人感兴趣地，通过腹膜内途径，PIV-YF/WN的免疫原性非常高(第一次腹膜内给药后滴度是1∶320，而皮下是1∶20，且第二次给药后是1∶1,280，而皮下是1∶160)。类似地，PIV-JE的免疫原性显著增加(例如，2次腹膜内给药后是1∶640的JE-特异性的滴度)。因而，淋巴细胞、具体地抗原呈递细胞(与皮下组织相比，它们在腹部更丰富)的更好的靶向，是使用PIV疫苗的重要考虑因素。在人类中，皮肤的树突细胞的有效靶向(会增加免疫应答的强度)可以通过真皮内递送来实现，因而我们提议将其作为PIV免疫接种人类的途径。

在上述实验中，我们也测定了是否诱导了针对包装被膜的中和抗体应答(相对于针对由PIV构建体编码的和由受感染的细胞分泌的VLP的应答)。通过用5log₁₀FFU的WN d-PIV的第二种组分免疫的动物中的PRNT₅₀，没有检测出WN-特异性的中和抗体，所述第二种组分含有ΔC-prM-E缺失，且因而不编码VLP，但是在BHK-CprME(WN)辅助细胞中被包装进WN被膜，且在用4log₁₀FFU的包装进YF被膜中的YFd-PIV的第二种组分免疫的动物的血清中，没有发现YF-特异性的中和活性。包装进YF被膜中的PIV-YF/WN的2次给药没有诱导YF-特异性的中和应答，类似地，包装进WN被膜中的PIV-JE的2次给药没有诱导WN-特异性的应答。针对包装被膜的中和应答的缺失，允许在一种(通用)生产辅助细胞系中生产不同的PIV疫苗，或用根据本发明的基于相同载体的不同重组疫苗免疫接种一个个体。

PIV液体混合物

因为PIV在体内经历单个(任选地几个，但是有限的)轮回的复制，我们认为，可以施用不同PIV疫苗的混合物，且混合物(液体混合物)中的各个构建体之间没有干扰。为了阐明PIV疫苗是否可以用于液体混合物制剂中，将小鼠和仓鼠中对作为混合物施用的几种PIV构建体的免疫应答与单个施用的相同构建体进行了对比。在两种动物模型中得到了类似的结果。在表6中显示了小鼠实验的结果。在来自施用一次或两次PIV-JE+PIV-WN混合物或单独的PIV-JE的动物的血清集合中，观察到类似的抗-JE中和抗体滴度(对于一次和两次给药，分别是1∶20对1∶80，和1∶640对1∶160)。类似地，针对PIV-JE+PIV-WN混合物和单独的PIV-WN的WN-特异性的滴度是类似的(对于一次和两次给药，分别是1∶320对1∶640，和1∶5,120对1∶5,120)。PIV-JE或-WN没有诱导或诱导极其微弱的交叉特异性的应答。通过测量来自各个动物的血清中的PRNT₅₀滴度，也证实了该结果。因而，显然，PIV疫苗可以作为液体混合物有效地施用，诱导抗2种或更多种黄病毒病原体的免疫。另外，如上面讨论的，可以在非黄病毒PIV疫苗之间，或在任意的黄病毒和非黄病毒PIV疫苗之间，制备不同的液体混合物。

体外研究

将不同的PIV原型在辅助BHK细胞中(对于s-PIV)或在正常的Vero细胞中(对于d-PIV)连续传代高达10次。通过免疫染色，滴定在Vero细胞中每次传代后收获的样品。构建体生长至高滴度，没有观察到恢复完整病毒的重组。例如，PIV-WN在BHK-CprME(WN)辅助细胞(含有表达WN病毒C-prM-E蛋白的VEE复制子)中连续生长至滴度7-8log₁₀FFU/ml，且WN d-PIV在Vero细胞中生长至超过8log₁₀FFU/ml的滴度，没有重组。

实施例2.PIV-TBE

完全基于来自野生型TBE病毒或血清学上密切相关的兰加特(LGT)病毒(天然减毒的病毒，例如野生型菌株TP-21，或它的经验地减毒的变体菌株E5)的序列，或基于含有来自YF 17D或诸如WN病毒的其它黄病毒的主链(衣壳和非结构序列)和来自TBE、LGT或其它血清学上有关的黄病毒(其来自TBE血清复合物)的prM-E被膜蛋白基因的嵌合序列，可以装配PIV-TBE疫苗候选物。类似于其它嵌合的LAV疫苗，基于来自YF 17D的主链和来自TBE或相关病毒(例如，LGT的E5菌株)的prM-E基因，构建YF/TBE LAV候选物。

使用反求遗传学领域的标准方法，通过将适当的遗传元件分别克隆进PIV-WN的质粒(Mason等人，Virology 351：432-443，2006；Suzuki等人，J.Virol.82：6942-6951，2008)或嵌合LAV的质粒(例如，pBSA-AR1，asingle-plasmid version of infectious clone of YF/JE LAV；WO2008/036146)，构建PIV-TBE和YF/TBE LAV疫苗原型。首先对TBE病毒菌株Hypr(GenBank登录号U39292)和LGT菌株E5(GenBank登录号AF253420)的prM-E序列进行计算机密码子优化，以符合人基因组中的偏好密码子选择，并消除长度超过8个核苷酸的核苷酸序列重复，从而确保插入物的高遗传稳定性(如果确定是必要的，可以进一步缩短核苷酸序列重复)。化学地合成基因，并克隆进PIV-WN和YF/JE LAV的质粒，以替代对应的prM-E基因。使得到的质粒在体外转录，并用RNA转录物转染适当的细胞(对于嵌合病毒，是Vero；对于PIV，是是辅助BHK细胞)，以产生病毒/PIV样品。

YF/TBE LAV构建体

在含有TBE Hypr(质粒p42，p45，和p59)或LGT E5(质粒P43)prM-E基因的YF/TBE构建体中，首先检查了2种不同类型的C/prM接头(参见图6；C/prM接头仅显示在序列附录1中，且覆盖NS1区域的5’UTR-C-prM-E-开端的完整5’-末端序列显示在序列附录2中)。p42-衍生的YF17D/Hypr嵌合体含有prM蛋白的杂种YF17D/Hypr信号肽，而p45-衍生的YF17D/Hypr嵌合体含有prM的杂种YF17D/WN信号肽(序列附录1)。前一种嵌合病毒在P0(转染后不久)和P 1(在Vero细胞中的下一代)代生成非常高的滴度，最高达7.9log₁₀PFU/ml，比后一种病毒高0.5log₁₀倍；另外，它在Vero细胞中形成明显更大的噬斑(图6)。因而，prM的信号肽中的TBE-特异性的残基会赋予明显胜过含有WN--特异性残基的信号的生长优点。p43-衍生的YF17D/LGT嵌合体具有与p42-衍生的病毒相同的prM信号；它也在P0和P1代生成非常高的滴度(最高达8.1log₁₀PFU/ml)，并形成大噬斑。还从质粒p59生成p42-衍生的病毒的衍生物，所述质粒p59含有以前在YF/WN LAV疫苗病毒的背景中表征的强减毒突变，具体地，YF17D-特异性的C蛋白中的3-氨基酸缺失(PSR，在α-螺旋I开始处的残基40-42；WO 2006/116182)。如预期的，与亲本p42-衍生的嵌合体相比，p59病毒生长至更低的滴度(在P0和P1，分别是5.6和6.5log₁₀PFU/ml)，并形成小噬斑(在分开的滴定实验中测定，因而未显示在图6中)。对YF/TBE LAV原型的生长性质的这些初步观察，和体外复制与噬斑形态学的关联，已经在生长曲线实验中得到证实(图8)。

PIV-TBE构建体

构建了PIV-WN/TBE变体，且包装的PIV样品源自质粒p39和p40(图7；关于C/prM接头序列，见序列附录1；关于NS1序列的完整的5’UTR-ΔC-prM-E-开端，见序列附录3)。它们分别含有完整的Hypr或WN prM信号。成功地回收两种PIV，并在BHK-CprME(WN)或BHK-C(WN)辅助细胞中繁殖(Mason等人，Virology 351：432-443，2006；Widman等人，Vaccine 26：2762-2771，2008)。p39变体的P0和P1样品滴度比p40变体高0.2-1.0log₁₀倍。另外，在使用多克隆TBE-特异性的抗体的免疫荧光测定中，与p40相比，被p39变体感染的Vero细胞的染色更亮，这指示更有效的复制(图7)。在生长曲线实验中，证实了p39候选物比p40候选物更高的复制速率(图8)。在后一种实验中，两种候选物在BHK-C(WN)辅助细胞中都显得比BHK-CprME(WN)生长得更好，p39变体在第5天达到～7log₁₀PFU/ml的滴度(注意：没有达到峰滴度)。prM信号对PIV和嵌合LAV疫苗候选物的复制速率的影响的发现，和产生最有效复制的和免疫原性的(参见上面)构建体的不同信号的头对头对比，是我们的方案的区别特征。如上面讨论的，本发明也包括：使用其它黄病毒信号，包含具有适当突变，解偶联在C/prM接头处病毒蛋白酶和信号肽酶切割，例如，通过突变或删除在prM信号前面的C的C-末端处的病毒蛋白酶切割位点，使用强非黄病毒信号(例如，tPA信号，等)替代prM信号，以及优化在信号肽酶切割位点下游的序列。

完全基于野生型TBE(Hypr菌株)和LGT病毒(TP21野生型菌株或减毒的E5菌株)和嵌合的YF 17D主链/prM-E(TBE或LGT)序列的其它PIV-TBE变体，也包括在本发明中。借助于稳定的DNA转染，或通过使用适当的载体，例如α病毒复制子，例如基于VEE菌株TC-83，用抗生素选择含有复制子的细胞，可以构建为反式补偿提供适当的C、C-prM-E等蛋白(例如，TBE-特异性的)的辅助细胞。Vero和BHK21细胞可以用于实现本发明。前者是经批准的用于人疫苗生产的基质；也可以使用人和/或兽医疫苗生产可接受的任意其它细胞系。除了s-PIV构建体以外，也可以装配d-PIV构建体。为了再确定疫苗和环境的安全性，可以采用适当的修饰，包括在5’和3’CS元件中使用简并密码子和补偿突变，以使理论上可产生活病毒的重组的机会最小化。构建后，可以在体外评价所有疫苗候选物的可生产性/稳定性，并在可得到的临床前动物模型中在体内评价减毒作用和免疫原性/功效，所述模型例如在TBE和YF疫苗的开发和质量控制中使用的那些。

PIV-TBE和YF/TBE LAV构建体在小鼠中的神经毒力和神经侵染力

通过大脑内途径(测量神经毒力)或腹膜内途径(测量神经侵染力(和以后的免疫原性/功效))，给年轻的成年ICR小鼠(～3.5周龄)接种分级剂量的PIV-TBE和YF/TBE LAV候选物。通过两种途径接受5log₁₀FFU的PIV-Hypr(p39和p40)变体的动物存活下来，且没有表现出疾病征兆，类似于假接种的动物(表7)，因而PIV-TBE疫苗是完全无毒的。大脑内接种YF 17D对照(1-3log₁₀PFU)的小鼠表现出剂量依赖性的死亡，而腹膜内接种(5log₁₀PFU)的所有动物存活下来，这与YF 17D病毒是没有神经侵染力的知识相一致。接受YF/TBE LAV原型p42、p45、p43和p59的分级大脑内给药(2-4log₁₀PFU)的所有动物死亡(人道地处死濒死的动物)。这些变体表现得比YF 17D减毒更少，例如，通过完全死亡和在2log₁₀PFU剂量(对于YF/TBE LAV候选物测试的最低剂量)时更短的AST可以证实。在图9中也解释了PIV-TBE的无神经毒力的表型、YF/TBE LAV的有毒力的表型和YF 17D的中间毒力表型，该图显示了大脑内接种后小鼠的存活曲线。应当指出，p43(LGT prM-E基因)和p59(YF/Hypr LAV的dC2缺失变体)的神经毒力的比p42和p45YF/Hypr LAV构建体更少，这通过对应剂量的更大AST值证实(表7)。另外，p43和p59候选物是无神经侵染力的，而p42和p45在腹膜内接种(5log₁₀PFU/给药)后造成部分死亡(表7；图10)。但是，应答指出，所有YF/TBE LAV构建体与野生型TBE病毒相比显著减毒，例如，与野生型TBE Hypr病毒相比，后者在非常低的大脑内(LD₅₀～0.1PFU)和腹膜内(LD₅₀≤10PFU)剂量对小鼠而言一致地非常有毒力(Wallner等人，J.Gen.Virol.77：1035-1042，1996；Mandl等人，J.Virol.72：2132-2140，1998；Mandl等人，J.Gen.Virol.78：1049-1057，1997。

PIV-TBE和YF/TBE LAV构建体在小鼠中的免疫原性/功效

测量了用上述的PIV-TBE或YF/TBE LAV变体或人福尔马林灭活的TBE疫苗对照(人剂量的1/30)的一次或两次给药腹膜内免疫的小鼠中的TBE-特异性的中和抗体应答。已经用腹膜内高剂量(500PFU)的野生型Hypr TBE病毒挑战动物；监视挑战后的发病率(例如，体重减轻)和死亡率。

PIV-TBE和YF/TBE LAV构建体在小鼠中的免疫原性/功效

在第20天，通过抗野生型TBE Hypr病毒的PRNT₅₀，测量一次或两次施用上述的PIV-TBE或YF/TBE LAV变体(来自表7中的实验)或人福尔马林灭活的TBE疫苗对照(人剂量的1/20；1或2次给药)或YF 17D和假对照腹膜内免疫的小鼠中的TBE-特异性的中和抗体应答(表8；在第14天，第二次施用指示的实验物)。[在单个的血清中，或在大多数情况下在来自2只动物的合并的血清中，或对于YF17D和假阴性对照，在来自4只动物的合并的血清中，测定滴度]。在表8中提供了单个实验样品中的滴度以及每组的几何平均滴度(GMT)。实验样品中的滴度在每组内是相似的，例如，在用PIV免疫的组中，这指示动物中免疫应答的高度一致性。如预期的，在阴性对照组(YF 17D和假的；几何平均滴度＜1∶10)中没有检测出TBE-特异性的中和抗体；因此，在用腹膜内高剂量(500PFU)的野生型Hypr TBE病毒免疫后第21天，这些组中的动物没有被保护度过挑战。在表8中提供了来自部分观察(在挑战后第9天；继续观察)的死亡率，在图11中显示了指示发病率的挑战后平均体重的动力学。在杀死的疫苗对照中检测了中和抗体，它们在2次给药后特别高(几何平均滴度1∶1,496)；2次给药组的动物被完全保护，因为没有死亡或体重减少(但是1次给药组的动物则不然)。接受PIV-Hypr p39的1和2次给药的动物具有非常高的抗体滴度(几何平均滴度1∶665和1∶10,584)，且被稳固地保护，表明s-PIV-TBE缺陷型疫苗可以诱导有力的保护性免疫。用YF/Hypr p42嵌合体免疫接种的存活下来的2只动物(参见表7)也具有高抗体滴度(几何平均滴度1∶6,085)，且被保护(表8；图11)。令人感兴趣地，PIV-Hypr p40和YF/Hypr p45的免疫原性较差(几何平均滴度分别是1∶15和1∶153(对于1和2次给药)和1∶68)。如上面讨论的，它们在prM的信号中含有WN-特异性的序列，而高免疫原性的PIV-Hypr p39和YF/Hypr p42构建体含有TBE-特异性的信号序列。与上面的讨论相一致，该结果证实选择正确的prM信号(例如，TBE-特异性的信号)的重要性，以实现高水平复制/VLP分泌，它们在该体内实验中导致显著不同的免疫应答。可以预见到，YF/LGT p43和YF/Hypr dC2p59嵌合体的免疫原性相对较低，分别因为异源被膜(LGT，不同于挑战TBE病毒)的使用和dC2缺失的高减毒作用。

实施例3.外来基因表达

在下述的重组PIV构建体的实施例中，对目标基因进行密码子优化(例如，为了在目标疫苗接种宿主中有效表达)，并消除长核苷酸序列重复，以增加插入物稳定性(≥8个核苷酸长度；如果必要，可以进一步缩短重复序列)，然后化学地合成。使用本领域熟知的分子生物学标准方法，将基因克隆进PIV-WN载体质粒，并回收包装的PIV，随后体外转录，并转染适当的辅助(对于s-PIV)或正常(对于d-PIV)细胞。

狂犬病病毒G蛋白在WN s-PIV和d-PIV中的表达

狂犬病病毒(弹状病毒科)是一种重要的人和兽病原体。尽管可利用几种(杀死的)疫苗，兽和人用途仍然需要改良的疫苗(例如作为廉价的暴露前预防疫苗)。狂犬病病毒糖蛋白G介导该病毒进入细胞，且是主要免疫原。为了开发兽用疫苗，已经在其它载体中表达它(例如，Pastoret和Brochier，Epidemio.Infect.116：235-240，1996；Li等人，Virology356：147-154，2006)。

对全长狂犬病病毒G蛋白(最初的Pasteur病毒分离物，GenBank登录号NC_001542)进行密码子优化，化学地合成，并在邻近ΔC、ΔprM-E和ΔC-prM-E缺失的位置插入PIV-WN载体(图12)。在序列附录4中提供了构建体的序列。在图13中解释了构建体的一般设计。将含有它自身的信号肽的整个G蛋白在框架内插入WN C蛋白的下游，所述WN C蛋白含有ΔC缺失(ΔC和ΔC-prM-E构建体)或不含有(ΔprM-E)和来自prM信号的几个残基。将口蹄病病毒(FMDV)2A自体蛋白酶放在G的跨膜C-末端锚的下游，以在翻译过程中从病毒多蛋白切割G的C-末端。FMDV 2A元件之后是prM和prM-E-NS1-5基因的WN-特异性的信号(在ΔC构建体中)或NS1和NS1-5基因的信号(在ΔprM-E和ΔC-prM-E构建体中)。

通过转染补偿PIV载体缺失的辅助BHK细胞[含有委内瑞拉马脑炎病毒(菌株TC-83)复制子，其表达用于反式补偿的WN病毒结构蛋白]，生产包装的WN(ΔC)-狂犬病G、WN(ΔprME)-狂犬病G和WN(ΔCprME)-狂犬病G PIV。通过使用抗-狂犬病G单克隆抗体(RabG-Mab)的免疫染色和免疫荧光测定(IFA)，通过BHK-C(WN)和/或BHK-C-prM-E(WN)辅助细胞以及正常BHK细胞的转染/感染，证实3种构建体对狂犬病G蛋白的有效复制和表达(图14)。通过使用Mab或抗-WN病毒多克隆抗体的免疫染色，测定Vero细胞中的滴度。在图14的底图中，显示了体外RNA转录物转染后，BHK-CprME(WN)细胞中的构建体的生长曲线。PIV有效地生长至滴度～6至＞7log₁₀FFU/ml。重要的是，通过RabG-Mab和WN--抗体染色，检测到几乎相同的滴度，这是插入物的遗传稳定性的第一个证据。在PIV-感染的Vero细胞(它们被固定，但是没有被透化)中，通过RabG-Mab染色观察到强烈的膜染色，表明产物被有效地递送至细胞表面(图15)。已知后者是表达的G的高免疫原性的主要先决条件。在感染辅助BHK细胞后，单个的包装的PIV可以传播，但是不能在正常细胞中传播，如在图16中关于WN(ΔC)-狂犬病G PIV所例证的。在原初BHK细胞中不传播的事实，证实重组的RNA基因组不能非特异性地包装进含有G蛋白的膜囊泡中(如果由PIV感染的细胞生产)。用另一种杆状病毒疱疹性口炎病毒(VSV)的G蛋白得到了相同的结果，不同于以前观察到的表达VSV G蛋白的塞姆利基森林病毒(SFV)复制子的非特异性包装(Rolls等人，Cell 79：497-506，1994)。后者是一种希望的安全性特征。[或者，有些非特异性的包装会导致PIV的体内有限传播，潜在地增强抗-狂犬病免疫应答。后者也是有益的特征，只要证明这样的PIV是安全的]。通过以高或低的MOI(0.1或0.001FFU/细胞)在辅助BHK-CprME(WN)细胞中连续传代，证实了狂犬病G插入物在3种PIV中的稳定性。在每一代，收集细胞上清液，通过使用抗-WN多克隆抗体的免疫染色，在正常细胞(例如，Vero细胞)中滴定，以测定总PIV滴度，或使用抗-狂犬病G单克隆抗体，测定含有G基因的颗粒的滴度(在图17中，关于MOI 0.1进行例证；在MOI 0.001，得到类似的结果)。WN(ΔC)-狂犬病G PIV在5代中是稳定的，而含有插入物的PIV的滴度从第6代开始下降，这指示插入物不稳定性。这可以预见到，因为在该构建体中，大G基因插入物(～1500核苷酸)与小ΔC缺失(～200核苷酸)相组合，这显著增加了重组的RNA基因组的总大小。相反，在WN(ΔprME)-狂犬病G和WN(ΔCprME)-狂犬病G PIV中，所述插入物与大的多的缺失(～2000核苷酸)相组合。因此，在检查的所有10代中，这些构建体稳定地维持插入物(图17)。此外，从图17可以看出，在有些代，用所有3种PIV达到高达8log₁₀FFU/ml或更高的滴度，进一步证实了PIV可以容易地繁殖至高产率。

单个地体内接种后，预见到WN(ΔC)-狂犬病G s-PIV会诱导抗狂犬病和WN病毒的强中和抗体免疫应答，以及T-细胞应答。WN(ΔprME)-狂犬病G和WN(ΔCprME)-狂犬病G PIV会诱导仅抗狂犬病的体液免疫应答，因为它们不编码WN prM-E基因。WN(ΔC)-狂犬病G s-PIV构建体也可以与WN(ΔprME)-狂犬病G构建体在d-PIV制剂中共接种(参见图12)，增加表达的G蛋白的剂量，并增强抗两种病原体的免疫(由于有限的传播)。作为传播的一个实例，在图18中显示了s-PIV样品WN(ΔprME)-狂犬病G和d-PIV样品WN(ΔprME)-狂犬病G+WN(ΔC)PIV(后者不编码狂犬病G蛋白)在Vero细胞中的滴度结果。用s-PIV感染原初Vero细胞，仅能使单个细胞(或由于细胞分裂形成的小簇)成为RabG-Mab可染色的。相反，在用d-PIV样品感染后，观察到大焦点(图18，右图)，它们是2种PIV类型共感染的产物。

WN(ΔCprME)-狂犬病G构建体也可以用于d-PIV制剂中，如果它与以反式提供C-prM-E的辅助基因组共接种(参见图12)。例如，它可以是缺失NS蛋白之一(例如，NS1，NS3，或NS5)的WN病毒基因组，所述NS蛋白已知是可反式补偿的(Khromykh等人，J.Virol.73：10272-10280，1999；Khromykh等人，J.Virol.74：3253-3263，2000)。我们已经构建了WN-ΔNS 1基因组(序列提供在序列附录4中)，并通过免疫染色，得到了WN(ΔprME)-狂犬病G或WN(ΔCprME)-狂犬病G构建体共感染和体外传播的证据。在这样的d-PIV的情况下，也可以插入狂犬病G蛋白，并在辅助基因组(例如，WN-ΔNS1基因组)中表达，以增加表达的狂犬病G蛋白的量，导致增加的抗-狂犬病免疫应答。关于任意的dPIV形式，一种免疫原可以来自一种病原体(例如，狂犬病G)，其它免疫原来自第二种病原体，导致疫苗的3种抗原特异性。如上面讨论的，在其它实施例中，ΔNS1缺失可以替换为ΔNS3和/或ΔNS5缺失/突变，或与之组合使用。

RSVF蛋白在WNs-PIV和d-PIV中的表达

在世界范围内，呼吸道合胞病毒(RSV)(副粘病毒科的成员)是幼儿的严重呼吸道疾病的主要原因(Collins和Crowe，Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus，见：Knipe等人编，Fields Virology，第5版，Philadelphia：Wolters Kluwer/Lippincott Williams and Wilkins，2007：1601-1646)。该病毒的融合蛋白F是用于开发安全且有效的疫苗的主要病毒抗原。为了避免以前用福尔马林灭活的疫苗候选物观察到的RSV感染的疫苗接种后恶化，需要针对F的平衡的Th1/Th2应答，这可以通过更好的TLR刺激来实现，后者是诱导高亲和力抗体的先决条件(Delgado等人，Nat.Med.15：34-41，2009)，也可以通过在有力的基于病毒的载体中递送F来实现。我们以前已经证实了基于黄热病病毒的嵌合LAV载体的在体内诱导针对流感抗原的强烈的、平衡的Th1/Th2应答的能力(WO 2008/036146)。在本发明中，基于黄热病病毒的嵌合LAV和PIV载体都用于递送RSV F，以诱导最佳的免疫应答。本文所述的其它LAV和PIV载体也可以用于该目的。

如上所述，对病毒的A2菌株的全长RSV F蛋白(GenBank登录号P03420)进行密码子优化，合成，并通过应用分子生物学的标准方法，使用在图12和13中关于狂犬病G蛋白所示的插入方案，克隆进PIV-WN s-PIV和d-PIV的质粒。在序列附录5中提供了插入的确切序列和周围的遗传元件。使用得到的WN(ΔC)-RSV F、WN(ΔprME)-RSV F和WN(ΔCprME)-RSV F PIV构建体的体外RNA转录物，转染辅助BHK-CprME(WN)细胞。通过用抗-RSV F Mab对转染的细胞进行免疫染色，首先证实了RSV F蛋白的有效复制和表达，如图19中关于WN(ΔprME)-RSV F构建体所例证的。通过Vero细胞中的免疫染色滴定，确定包装的PIV在来自受感染的细胞的上清液中的存在(滴度高达7log10FFU/ml)。另外，可以使用含有修饰的全长F蛋白基因的类似构建体。具体地，在修饰的F蛋白中，将F的N-末端天然信号肽替换为来自狂犬病病毒G蛋白的该肽。所述修饰意在阐明异源信号的使用是否会增加F蛋白合成和/或PIV复制的速率。

表1.在平台开发研究中使用的PIV原型构建体

表2.安全性：哺乳小鼠神经毒力¹

¹单次给药，大脑内接种，ICR 5天龄小鼠，施用分级的log剂量。

²死亡小鼠的平均存活时间；na，不适用。

表3.PIV在小鼠中是高免疫原性的和有效的¹

¹腹膜内免疫接种(d0初次，d21在选择的组中加强)；在d35挑战：野生型WN NY99，3log₁₀PFU腹膜内，270LD50；野生型YF Asibi，3log₁₀PFU大脑内，500LD50；N/D，未检出。

表4.PIV在仓鼠中是免疫原性的，且保护度过挑战¹

¹叙利亚仓鼠，皮下接种(d0，和d21在选择的组中)；挑战(d39)：野生型WN NY385/996log₁₀PFU腹膜内，野生型JE Nakayama 5.8log₁₀PFU大脑内，或仓鼠改造的YF Asibi 7 log₁₀PFU腹膜内(McArthur等人，J.Virol.77：1462-1468，2003；McArthur等人，Virus Res.110：65-71，2005)。

表5.用PIV免疫接种仓鼠：皮下和腹膜内途径的对比

表6.对PIV液体混合物的免疫应答(小鼠)¹

¹C57/BL6小鼠，在第0和21天腹膜内接种；合并的血清PRNT滴度。

表7.PIV-TBE和YF/TBE疫苗构建体在成年ICR小鼠中的神经毒力(大脑内接种)和神经侵染力(腹膜内接种)

¹死亡小鼠的平均存活时间。

表8.腹膜内免疫的小鼠中的中和抗体滴度(PRNT₅₀)(针对野生型TBE病毒Hypr测定)和保护度过挑战(挑战后观察，第9天)

¹括号内的数字对应着测试的每个合并的血清样品中小鼠的数目。

²显示了在9天的死亡率。

表9.可以用于使嵌合的TBE LAV候选物减毒的公开的减毒的E蛋白突变的实例

参考文献：Hasegawa等人，Virology 191(1)：158-165；Schlesinger等人，J.Gen.Virol.1996，77(Pt 6)：1277-1285，1996；Labuda等人，Virus Res.31(3)：305-315，1994；Wu等人，Virus Res.51(2)：173-181，1997；Holzmann等人，J.Gen.Virol.78(Pt 1)：31-37，1997；Bray等人，J.Virol.72(2)：1647-1651，1998；Guirakhoo等人，Virology 194(1)：219-223，1993；Pletnev等人，J.Virol.67(8)：4956-4963，1993；Kawano等人，J.Virol.67(11)：6567-6575，1993；Jennings等人，J.Infect.Dis.169(3)：512-518，1994；Mandl等人，J.Virol.63(2)：564-571，1989；Chambers等人，J.Virol.75(22)：10912-10922，2001；Cecilia等人，Virology 181(1)：70-77，1991；Jiang等人，J.Gen.Virol.74(Pt 5)：931-935，1993；Gao等人，J.Gen.Virol.75(Pt 3)：609-614，1994；Holzmann等人，J.Virol.64(10)：5156-5159，1990；Hiramatsu等人，Virology 224(2)：437-445，1996；Lobigs等人，Virology176(2)：587-595，1990；Campbell等人，Virology 269(1)：225-237，2000；Gritsun等人，J.Gen.Virol.82(Pt 7)：1667-1675，2001.

序列表附件4.WN PIV构建体，其表达狂犬病病毒

WN(ΔCprME)-狂犬病PIV序列(部分)

WN(ΔC)-狂犬病G PIV

WN(ΔprME)-狂犬病G PIV序列(部分)

其它实施方案

在本说明书中提及的所有出版物、专利申请和专利，都通过参考引用整体并入本文，如同具体地且单个地指出每篇单独的出版物、专利申请或专利通过参考引用并入本文。

所述的病毒、载体、组合物和本发明的方法的各种改进和变体，是本领域技术人员显而易见的，不会脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合具体的实施方案描述了本发明，应当理解，要求保护的本发明不应当不适当地限于这样的具体实施方案。实际上，医学、药理学领域或相关领域的技术人员显而易见的所述的本发明实现方式的各种改进，都在本发明的范围内。本文中的单数形式的使用，例如“一”和“所述”不排除对应的复数形式的指示，除非上下文有相反指示。类似地，复数术语的使用，不排除对应的单数形式的指示。其它实施方案在下述权利要求的范围内。

Claims (50)

1.复制缺陷型假感染黄病毒，其包含黄病毒基因组，后者包含：(i)编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，和(ii)编码一种或更多种异源病原体、癌症或变态反应相关免疫原的序列。

2.权利要求1的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述一个或更多个缺失或突变是在黄病毒基因组的衣壳(C)序列内。

3.权利要求1的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述一个或更多个缺失或突变是在黄病毒基因组的膜前(prM)和/或被膜(E)序列内。

4.权利要求1的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述一个或更多个缺失或突变是在黄病毒基因组的衣壳(C)、膜前(prM)，和被膜(E)序列内。

5.权利要求1的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述一个或更多个缺失或突变是在黄病毒基因组的非结构蛋白1(NS1)序列内。

6.权利要求1-5中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原来自选自下述的病原体：狂犬病病毒，博氏疏螺旋体，蜱，流感病毒，人免疫缺陷病毒，猿免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒，呼吸道合胞病毒，疟原虫，和结核分支杆菌。

7.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含狂犬病病毒G蛋白免疫原或其免疫原性片段。

8.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含博氏疏螺旋体OspA免疫原或其免疫原性片段。

9.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含选自64TRP、Isac和Salp20的蜱唾液蛋白，或其免疫原性片段。

10.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含流感病毒M2，血凝素(HA)，或神经氨酸酶(NA)表位，或其免疫原性片段。

11.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含密码子优化的HIV gag，tat/nef，或gp120蛋白，或其免疫原性片段。

12.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含HPV16或HPV18衣壳蛋白L1或L2，或其免疫原性片段。

13.权利要求6的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述异源免疫原包含呼吸道合胞病毒F或G糖蛋白。

14.权利要求1-13中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述黄病毒基因组包含编码膜前(prM)和/或被膜(E)蛋白的序列。

15.权利要求1-14中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述黄病毒基因组选自下述病毒的基因组：黄热病病毒，西尼罗河病毒，蜱传脑炎病毒，兰加特病毒，日本脑炎病毒，登革热病毒，和圣路易脑炎病毒序列，和它们的嵌合体。

16.权利要求15的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述嵌合体包含：第一种黄病毒的膜前(prM)和被膜(E)序列，和第二种不同黄病毒的衣壳(C)和非结构序列。

17.权利要求16的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述第一种黄病毒是蜱传脑炎病毒或兰加特病毒。

18.权利要求16或17的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述第二种不同黄病毒是黄热病病毒或西尼罗河病毒或兰加特病毒。

19.权利要求1-18中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述基因组包装在颗粒中，所述颗粒包含与基因组相同或不同的来自黄病毒的膜前(prM)和被膜(E)序列。

20.权利要求中1-19任一项的复制缺陷型假感染黄病毒，其中在一种或更多种蛋白的一个或更多个缺失或突变的位置，或与之组合地，插入编码所述异源免疫原的序列

21.权利要求1-20中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒，其中编码所述异源免疫原的序列插入黄病毒基因组中的编码被膜(E)蛋白的序列内，编码非结构1(NS1)蛋白的序列内，编码膜前(prM)蛋白的序列内，基因间地插入编码被膜(E)蛋白和非结构蛋白1(NS1)的序列之间，基因间地插入编码非结构蛋白2B(NS2B)和非结构蛋白3(NS3)的序列之间，或作为黄病毒基因组的3’非翻译区中的双顺反子插入。

22.组合物，其包含权利要求1-21中任一项的第一种复制缺陷型假感染黄病毒，和第二种不同复制缺陷型假感染黄病毒，后者包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中第二种不同复制缺陷型假感染黄病毒中由发生一个或更多个缺失或突变的序列编码的一种或更多种蛋白不同于第一种复制缺陷型假感染黄病毒中由发生一个或更多个缺失或突变的序列编码的一种或更多种蛋白。

23.在受试者中诱导对免疫原的免疫应答的方法，该方法包含，给所述受试者施用一种或更多种权利要求1-21中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒和/或权利要求22的组合物。

24.权利要求23的方法，其中所述受试者处于所述病原体感染或与所述癌症或变态反应相关免疫原有关的疾病或病症的危险中，但是不患有。

25.权利要求23的方法，其中所述受试者具有所述病原体感染或与所述癌症或变态反应相关免疫原有关的疾病或病症。

26.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述免疫原来自选自下述的病原体：狂犬病病毒，博氏疏螺旋体，蜱，流感病毒，人免疫缺陷病毒，猿免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒，呼吸道合胞病毒，疟原虫，和结核分支杆菌。

27.权利要求23-26中任一项的方法，其中所述方法用于诱导针对除免疫原来源之外的黄病毒基因组编码的蛋白的免疫应答。

28.权利要求27的方法，其中所述受试者处于与包含编码黄病毒膜前和/或被膜蛋白的序列的假感染黄病毒基因组相对应的黄病毒的感染的危险中，但是不患有。

29.权利要求27的方法，其中所述受试者具有与包含编码黄病毒膜前和/或被膜蛋白的序列的假感染黄病毒基因组相对应的黄病毒的感染。

30.活的、减毒的嵌合黄病毒，其包括黄热病病毒，其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列，且所述嵌合黄病毒的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列包含黄热病病毒和蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的杂种，或其变体。

31.权利要求30的活的、减毒的嵌合黄病毒，其中所述嵌合黄病毒的衣壳/膜前信号序列包含在氨基末端区域中的黄热病病毒序列和在羧基末端区域中的蜱传脑炎或兰加特病毒序列。

32.活的、减毒的嵌合黄病毒，其包括西尼罗河病毒，其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列，且所述嵌合黄病毒的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列包括蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列，或其变体。

33.药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项的假感染黄病毒、权利要求22的组合物、或权利要求30-32中任一项的活的、减毒的黄病毒，和药学上可接受的载体或稀释剂。

34.权利要求33的药物组合物，另外包含佐剂。

35.复制缺陷型假感染黄病毒，其包含黄病毒基因组，后者含有在编码非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)或非结构蛋白5(NS5)的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变。

36.核酸分子，其与权利要求1-21或35中任一项的假感染黄病毒的基因组或权利要求30-32中任一项的活的、减毒的黄病毒的基因组相对应。

37.制备权利要求1-21或35中任一项的复制缺陷型假感染黄病毒的方法，该方法包含，将权利要求36的核酸分子导入细胞中，所述细胞表达与复制缺陷型假感染黄病毒的黄病毒基因组中缺失的任意序列相对应的蛋白。

38.权利要求37的方法，其中所述蛋白在细胞中从第二种不同复制缺陷型假感染黄病毒的基因组表达。

39.权利要求37的方法，其中所述蛋白从复制子表达。

40.权利要求39的方法，其中所述复制子是α病毒复制子。

41.权利要求40的方法，其中所述α病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。

42.组合物，其含有2种或更多种复制缺陷型假感染黄病毒，其中2种复制缺陷型假感染黄病毒选自：

(a)包含含有日本脑炎病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有登革热病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒；

(b)包含含有黄热病病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有登革热病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒；和

(c)包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码博氏疏螺旋体免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码蜱唾液蛋白免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，或包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码博氏疏螺旋体免疫原和蜱唾液蛋白免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒。

43.药物组合物，其含有权利要求30-32中任一项的活的、减毒的嵌合黄病毒。

44.在受试者中诱导对蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的免疫应答的方法，该方法包含，给所述受试者施用权利要求43的药物组合物。

45.权利要求44的方法，其中所述受试者处于发展蜱传脑炎病毒或兰加特病毒感染的危险中，但是不患有。

46.权利要求44的方法，其中所述受试者被蜱传脑炎病毒或兰加特病毒感染。

47.复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS 1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述黄病毒基因组包含其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列的黄热病病毒序列，且编码黄病毒基因组的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列的序列包含编码黄热病病毒和蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的序列杂种，或其变体。

48.权利要求47的复制缺陷型假感染黄病毒，其中所述编码黄病毒基因组的衣壳/膜前信号序列的序列包含在5’区的黄热病病毒序列和在3’区的蜱传脑炎或兰加特病毒序列。

49.复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS 1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述黄病毒基因组包包含其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列的西尼罗河病毒序列，且编码黄病毒基因组的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列的序列包含编码蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的序列，或其变体。

50.复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳(C)、膜前(prM)、被膜(E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述黄病毒基因组中的任意衣壳(C)和非结构(NS)蛋白来自兰加特病毒，且任意膜前(prM)和被膜(E)蛋白来自蜱传脑炎病毒。

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