CN1322120C - 乙肝乙脑双价疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防和治疗流行性乙型脑炎(又称日本脑炎，简称“乙脑”)和乙型肝炎(简称“乙肝”)的乙肝乙脑双价疫苗。此双价疫苗由乙肝病毒抗原基因插入到减毒乙脑病毒的基因组中构建而成，既能以减毒乙脑病毒为载体高效率地表达乙肝病毒的抗原，又保持了乙脑减毒活疫苗的安全性和免疫原性，因而是一种能够同时预防和治疗乙脑和乙肝的双价疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组领域，具体地涉及以乙脑病毒为载体构建的重组病毒疫苗。
背景技术
乙脑(Japanese encephalitis)和乙肝(Hepatitis B)均为亚洲多发的传染性疾病。乙脑是由乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起，病死率接近40％，10％～30％的幸存者留有严重的永久性神经学后遗症。
目前，全世界有两类获得上市许可的乙脑疫苗：灭活疫苗和减毒活疫苗。乙脑减毒活疫苗实质上是一种活的减毒乙脑病毒(live attenuated JEV)，我国选用的毒株为SA14-14-2，它于1988年在我国获得上市许可，目前为止已有约2亿儿童使用，一次免疫的有效率达95％，两次免疫的有效率达98％，无严重副反应，保护期长达30年以上，其安全性和有效性均超过了灭活疫苗。并且，乙脑减毒活疫苗的免疫费用远低于灭活疫苗，应用减毒活疫苗比灭活疫苗节约47％的免疫费用(Ding Ding，et al.Cost-effectivess of routine immunization to control Japanese encephalitis inShanghai，China.Bulletin of the World Health Organization 2003，81(5)：334-342)。已有一些亚洲国家开始进行乙脑减毒活疫苗的临床试验，如韩国、尼泊尔等。乙脑减毒活疫苗的安全、高效，显示出其作为基因治疗载体的美好前景，但由于乙脑减毒活疫苗近几年才逐步获得国际上的认可，以及其RNA基因组重组技术的复杂性，迄今为止，尚无任何以乙脑减毒活疫苗为载体的生物制品的研究报道。
乙肝是广泛存在于亚洲的、危害最严重的传染性疾病。现在，乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染已成为世界性的健康问题，全球HBV感染者约3亿，每年约100万感染者死于肝硬化或肝癌等HBV相关疾病。中国是乙肝高发区，约有1亿HBV感染者，部分地区感染率可高达14.29％，每年约有30万人死于肝硬化或肝癌，每年报告的急性肝炎病例约270万，其中10％～30％为急性乙肝病例。
乙肝疫苗是预防和控制HBV感染的重要手段。现在，国际市场上的乙肝疫苗基本均为基因工程HBV亚单位疫苗，其安全性和有效性及已得到充分的证实，但生产成本较高，且需接种3次(即第一次接种后1个月和6个月各接种一次)。另外乙肝疫苗的有效保护率为80-95％，免疫后体内保护性抗体浓度逐年下降，7年后约有30～50％的免疫者体内基本检测不到抗体，因此，乙肝疫苗一般应每隔5～7年重复免疫一次。
据1999年底由卫生部疾控司、中国预防医科院全国计划免疫指导中心联合组织的调查结果，全国新生儿乙肝疫苗平均接种率达70.7％，其中城镇接种率88.5％，农村62.7％。从总体看，我国仍有近1/3新生儿在乙肝免疫保护之外，而且全国平均第一针及时接种率(出生24小时之内接种)仅有29％，平均全程合格接种率仅有28.4％。接种不及时和未全程接种的情况，农村明显比城市严重。影响乙肝疫苗效果和普及的主要原因在于疫苗成本较高、需多次重复免疫。目前，国际上正在开发的乙肝疫苗种类有合成肽疫苗、DNA疫苗以及以沙门氏菌(Salmonella)为载体的基因工程疫苗等，然而这些乙肝疫苗在免疫效率和生产成本等方面还不令人满意。
因此，本领域迫切需要开发免疫效率高、生产成本低的新型疫苗。
发明内容
本发明提供了基于减毒乙脑病毒的新型疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种重组乙脑病毒，所述的重组乙脑病毒由乙脑病毒衣壳和重组乙脑病毒基因组构成，所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且重组后的基因组保留了自我复制功能。
在另一优选例中，所述的外源核酸中含有编码抗原、抗原决定簇、细胞因子、生长因子、多肽类激素、酶、受体、抗体和/或癌相关蛋白的核酸序列。
在另一优选例中，所述的外源核酸序列含有乙肝病毒抗原或抗原决定簇的核酸序列。
在另一优选例中，外源核酸的插入位点选自下组：
(i)在乙脑病毒基因组的NS2B和NS3编码区之间；
(ii)在乙脑病毒基因组的E和NS1编码区之间；
(iii)在乙脑病毒基因组的C和prM编码区之间。
在另一优选例中，所述的乙脑病毒基因组缺失了部分乙脑病毒结构蛋白基因序列。更佳地，所述缺失的结构蛋白基因序列选自下组：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述的乙脑病毒是减毒的，例如毒株SA14-14-2。
在本发明的第二方面，提供了本发明所述的重组乙脑病毒的用途，它被用于制备治疗性或预防性的疫苗，尤其是制备用于防治乙脑和乙肝的双价疫苗。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明所述的重组乙脑病毒和药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种制备重组乙脑病毒的方法，包括步骤：
(a)将乙脑病毒基因组引入包装细胞，其中所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且缺失了选自下组的结构蛋白基因序列：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合，并且重组后的基因组保留了自我复制功能；
而所述的包装细胞选自下组：
(i)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞，
(ii)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和
(iii)基因组整合有所述病毒缺失的结构蛋白基因的细胞；
(b)培养步骤(a)的包装细胞；
(c)从培养物中分离出重组乙脑病毒。
当乙脑病毒基因组不缺失结构蛋白时，将其直接引入可被乙脑病毒感染的宿主细胞即可生产得到重组乙脑病毒。
本领域技术人员可以从下文更详细的描述中理解本发明的目的、优点、实施方式等具体内容。
附图说明
图1为乙脑病毒的RNA基因结构示意图。
图2为把乙脑病毒RNA转化成四段乙脑病毒cDNA片段的流程图。
图3为制备全长的乙脑病毒cDNA克隆的流程图。
图4为制备插入点在NS2B和NS3之间的双价疫苗的流程图。
图5为制备插入点在E和NS1之间的双价疫苗的流程图。
图6为制备插入点在C和prM之间的双价疫苗的流程图。
图7为制备含有JEV亚基因组的乙肝乙脑双价疫苗的流程图。
具体实施方式
本发明提供了重组乙脑病毒的构建和应用方法，在减毒乙脑病毒基因组中插入了外源(即非JEV)核酸序列，且外源核酸序列的插入不影响基因组的自我复制功能。本发明提供的这种重组乙脑病毒，不仅具有乙脑减毒活疫苗的全部免疫活性，而且能在使用者(患者、易感人群等)体内表达外源核酸产生外源多肽。这种重组乙脑病毒能引发使用者机体对外源多肽的免疫应答，进而达到预防和/或治疗外源多肽相关疾病的作用。
本发明所述的乙脑病毒基因组，可以是全基因组，也可以是缺失部分核酸序列的亚基因组。在本发明的一个实施方案中，所述的乙脑病毒基因组是全基因组。在本发明的另一个实施方案中，所述的乙脑病毒基因组是缺失了部分结构蛋白基因序列的亚基因组，其中，缺失的结构蛋白基因序列选自下列基因：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。
本发明所述的外源核酸序列，可以编码一种或几种多肽，编码的多肽类型包括但不限于抗原或其决定簇、细胞因子、癌相关蛋白、生长因子、多肽类激素、受体、酶、抗体等。如果外源核酸含有编码某种病原的抗原或抗原决定簇的序列，则该重组乙脑病毒可以激发人体对JEV和该病原的免疫应答，起到同时预防和/或治疗JEV和该病原相关疾病的作用。
本发明提供了重组乙脑病毒中外源核酸序列的插入方法。在本发明中，所述的外源核酸序列的插入位点可以是JEV基因组的任何适宜位置，但外源核酸序列的插入不能造成JEV基因组的移码突变，不能影响JEV非结构蛋白的功能，也不能影响重组基因组的自我复制功能。在本发明的一些实施方案中，外源核酸序列的插入位置选自下组：在JEV基因组的NS2B和NS3编码区之间；在JEV基因组的E和NS1编码区之间；在JEV基因组的C和prM编码区之间。
本发明提供了重组乙脑病毒的生产方法。对于含有JEV全基因组的重组乙脑病毒，可采用现有乙脑减毒活疫苗的生产方法。对于含有JEV亚基因组的重组乙脑病毒，需要制造一种特殊的包装细胞用以生产重组乙脑病毒。
术语
本文所述的“乙脑病毒”一般是指减毒的乙脑病毒，感染后不能造成神经系统疾病或其他严重的病理变化，既可以是我国现在使用的乙脑减毒活疫苗一毒株SA14-14-2，也可以是其它减毒的乙脑病毒。特别优选的已经用于临床的减毒乙脑病毒。
本文所述的“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。
本文所述的“使用者”指需要进行预防接种或诊断、治疗的任何个体，包括人和动物，特别是那些易被JEV感染的物种。
本文所述的“抗原”是指能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与抗体或效应细胞在体内或体外发生特异性反应的物质。包括但不限于病原(细菌、病毒等病原微生物)的表面抗原、肿瘤抗原等。
本文所述的“包装细胞”是指能提供重组JEV基因组不能表达的JEV蛋白的细胞。包装细胞内含有乙脑病毒亚基因组缺失的JEV核酸序列，并能表达该序列所编码的蛋白，因此，当重组乙脑病毒亚基因组转入包装细胞后，可以获得自我组装所需的全部JEV蛋白，进而包装成重组乙脑病毒颗粒。
本文所述的“辅助病毒载体”是指含有乙脑病毒亚基因组缺失的JEV核酸序列的异种病毒或其核酸(包括但不限于DNA、RNA和cDNA)，转染JEV宿主细胞后，被转染的细胞株可成为包装细胞。
重组乙脑病毒
本发明提供了一种重组乙脑病毒的构建和应用方法。该重组乙脑病毒可携带外源核酸进入人体，适用于传染性疾病的预防免疫和一些恶性疾病的基因治疗。
外源核酸编码的外源多肽可以是各种功能蛋白，HBV表面抗原仅是其中一种非限制性的示例。以下对重组HBV表面抗原的乙脑病毒的描述通常也可用于其它重组乙脑病毒。
JEV为球形，直径40nm。病毒基因组为单股正链RNA，全长11kb，自5’至3’端依次编码结构蛋白C、prM(M蛋白的前体)、E以及非结构蛋白NS1～NS5，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白。
插入重组乙脑病毒的外源核酸长度通常小于5kb，可编码单个多肽或多个多肽。由于JEV自身的基因组较小，所以最适的外源核酸长度约为200～2500bp。为保证外源多肽在使用者体内能正常发挥其功能，通常在外源核酸序列前后各连接一段编码蛋白水解酶的序列(即释放元件)，以便其在宿主细胞内表达时能释放出完整的、不含无关序列的外源多肽。在本发明的实施例中，该蛋白酶序列为口蹄疫病毒2A序列。
可从公用数据库(包括，如GenBank)获得若干减毒乙脑病毒毒株的核苷酸序列。示范毒株是“SA14-14-2”。可在GenBank登记号AF315119获得JEV SA14-14-2基因组的核苷酸序列。减毒乙脑病毒颗粒的生产可采用本领域所熟知的生产方法。许多减毒的乙脑病毒毒株可市售获得，例如从ATCC获得。
本发明的外源多肽位于乙脑病毒基因组的不同位点。作为非限制性例子，可将外源核酸序列插入以下的一个或多个位置：(1)病毒多肽的N-末端；(2)病毒蛋白质C和prM之间；(3)病毒蛋白质NS2A和NS2B之间；(4)病毒蛋白质NS2B和NS3之间；(5)病毒蛋白质NS3和NS4A之间；(5)NS4A和NS4B之间；(6)E编码区和NS1编码区之间。外源核酸也可插入乙脑病毒基因组的其它位点。最好是，外源核酸的插入不致破坏乙脑病毒蛋白质的功能、和/或病毒多肽的蛋白水解加工、和/或病毒的复制。
用含有HBV表面抗原的重组乙脑病毒感染宿主细胞，可在宿主细胞中表达相应的HBV表面抗原，从而引发针对HBV表面抗原的免疫反应。因此，本发明的重组乙脑病毒可用作乙肝的预防性疫苗。
本发明的重组乙脑病毒会持续繁殖/在宿主细胞内复制重组乙脑病毒基因组，直到免疫系统被充分活化从而制止重组乙脑病毒感染或清除重组乙脑病毒基因组，因而能引发足够强度的免疫应答。
药物组合物
本发明还提供了包含上述重组乙脑病毒的各种组合物，包括药用组合物，尤其是疫苗组合物。
包含重组乙脑病毒的各种组合物可以包含按重组乙脑病毒实际用途选用的缓冲剂，以及适用于特定用途的其它物质。本领域技术人员熟知的各种缓冲剂以及适用子特定用途的各种物质均可用于药物组合物中。该组合物可含有药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，如“Remington：药学和药学实践”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可将药用组合物制备成各种剂型，包括但不限于《中华人民共和国药典》2000年版所述的各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。另外，适用于口服或局部用药的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含重组乙脑病毒的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。在药物组合物中，还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类、维持不同pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，本发明的重组乙脑病毒可采用各种方法进行配制。通常，可以采用本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或介质配制本发明的疫苗。无菌盐水是一种适宜的疫苗介质，其它本领域技术人员所熟知的水性和非水性等渗无菌注射液、悬浮液等也可用于疫苗配制。并且，本发明疫苗组合物的配制还可含有疫苗领域技术人员所熟知的其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’sTiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分。
重组乙脑病毒的使用方法
本发明提供了多种引发对外源多肽的免疫应答的方法，包括对使用者施用本发明提供的重组乙脑病毒或其组合物，使重组乙脑病毒进入细胞，表达并释放外源多肽，进而引发对外源多肽的免疫应答。
在一些实施方案中，外源多肽是病原的抗原/抗原决定簇。将这种重组乙脑病毒施予使用者，可预防或治疗由该病原引起的疾病。该方案特别适合预防和治疗细胞内感染的病原(病毒、细菌、原虫等)导致的疾病。外源多肽是一种病原的抗原/抗原决定簇时，重组乙脑病毒可以作为乙脑病毒和该病原的双价疫苗；当外源多肽是两种以上病原的抗原时，重组乙脑病毒可以作为乙脑病毒和含有上述抗原/抗原决定簇的病原的多价疫苗。
在另一些实施方案中，外源多肽是肿瘤抗原。该方案适用于肿瘤患者或肿瘤高危人群。肿瘤抗原的免疫原性通常较弱，以乙脑病毒作为肿瘤抗原载体，可以增强免疫应答。
在其它实施方案中，外源多肽还可以是细胞因子、多肽类激素、酶、抗体等，适用于特定的基因治疗方案。
给予方式和剂量
将本发明所述的重组乙脑病毒用作疫苗时，通常采用与常规的疫苗给予途径和/或模拟病原感染途径接种这些疫苗。当以组合物形式施用时，疫苗制剂中除含有重组乙脑病毒外，还可包括药学上可接受的载体，以及任选的佐剂、矫味剂或稳定剂等。
给予重组乙脑病毒或其组合物时，可通过常规的、药学上可接受的各种途径，如：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、经阴道、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径等。另外，还可根据需要组合给药途径，或按抗原种类和疾病特点进行调节。
疫苗组合物可以单剂量、多剂量加强剂量给予，以引发和/或维持免疫力。应以“有效量”给予重组乙脑病毒或其组合物，即重组乙脑病毒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效地促使保护宿主抵抗乙脑病毒和含有外源抗原的病原的感染。
在疫苗制剂中重组乙脑病毒的单份剂量，是按可引发免疫保护性应答而无明显副作用的剂量而定。通常，重组乙脑病毒疫苗的有效剂量的一般范围约为102-108蚀斑形成单位(plaque forming units，Pfu)，较佳的约为103-107Pfu，最佳的为104-106Pfu。当疫苗采用注射方式施用时，一般给予10ul～1ml的注射液，其中含有重组乙脑病毒和药学上可接受的载体和/或稀释剂。疫苗的最佳用量可通过本领域的标准方法来确定，如抗体效价测定等。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要加强免疫。在疫苗中加入佐剂和/或免疫刺激剂可提高使用者机体对外源多肽的免疫应答。
本发明的一个主要优点是安全，它所提供的重组乙脑病毒的毒性低于或类似于现有的乙脑减毒活疫苗。
本发明的另一个优点是高效，它所提供的重组乙脑病毒能在宿主细胞内进行重组JEV基因组的自我复制，并在一段时间内持续表达外源多肽，因此，可引发高效的免疫应答。
本发明的其它优点是使用成本低。依据本发明提供的制造方法生产重组乙脑病毒，其成本相当于或略高于现有的乙脑减毒活疫苗。
本发明还提供了一种含有编码HBV抗原的重组乙脑病毒。在本发明的一个优选方案中，外源核酸编码HBV表面抗原/抗原决定簇，所得的重组乙脑病毒可作为预防乙脑和乙肝的双价疫苗。与现有技术相比，本发明提供的乙肝乙脑双价疫苗具有如下优点：
1.高效
1)能在细胞内持续表达HBV表面抗原，比不能在体内增殖的乙肝亚单位疫苗具有更高的免疫原性。应用该疫苗无需多次重复免疫即可实现长期保护，因而减少了接种者的痛苦，节约了医疗资源，避免了因漏种而导致的免疫效果不良及免疫失败；
2)该疫苗是一种重组乙脑病毒，其预防乙脑的效果同亲代病毒——乙脑减毒活疫苗。
3)同时预防乙肝和乙脑两种高危传染病，省去了两种疫苗需要分别接种的麻烦，同时也减少了接种者的痛苦，节约了医疗资源。
2.安全
该疫苗是一种重组的乙脑病毒，组成重组乙脑病毒的所有JEV功能蛋白与亲代病毒——乙脑减毒活疫苗相同，重组病毒的生长特性、宿主专一性也与乙脑减毒活疫苗相同，因此，其安全性与乙脑减毒活疫苗相近。对于缺失部分JEV结构蛋白基因的重组病毒，由于在体内不能自我增殖，不会产生继发感染，因而其安全性高于乙脑减毒活疫苗。
3.低成本
该疫苗的生产成本等同或略高于乙脑减毒活疫苗。相对于现有的乙脑疫苗和乙肝疫苗，相当于节约了乙肝疫苗的生产成本，而现有的乙肝疫苗售价远远高于乙脑疫苗，因此该疫苗具有极高的经济价值。
该疫苗的低生产成本和低接种成本(免疫次数少)，有助于提高疫苗接种的覆盖率，提高人们的健康水平，并减少因漏种疫苗而发生的脑炎、神经系统障碍、急慢性肝炎及肝癌等疾病的医疗费用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不能限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体细节的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等编著的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：乙脑病毒全长cDNA克隆的制备过程：
用图1、图2、图3所示的流程，将把全长乙脑病毒cDNA整合到pRS424质粒内，所述的乙脑病毒SA14-14-2(ATCC#：VR-1255)和pRS424质粒(ATCC#：77105)购自美国典型培养物保藏中心ATCC。
a)用RT-PCR的方法把乙脑病毒RNA转化成四段乙脑病毒cDNA片段(5’端cDNA，3’端cDNA和2个中间段cDNA)，在5’端cDNA片段的5’端加上Not I酶切位点和Sp6增强子序列；在5’端cDNA片段的3’端加上EcoR I酶切位点；在3’端片段的3’端加上Kpn I酶位点；近5’端的中间片段的两头包括部分与5’端cDNA片段的3’端和3’端cDNA片段的5’端相同的基因序列；近3’端的中间片段cDNA的两头包括部分与近5’端的中间片段cDNA的3’端和3’端cDNA片段的5’端相同的基因序列。
所使用的DNA引物的序列如下：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| 1a | AAATATGCGGCCGCATTTAGGTGACACTATAGAGAAGTTTATCTGTGTGAACTTCTTGG | 1 |
| 1b | TTATGAATTCCGGGGCAAAGAGGATGCT | 2 |
| 2a | CGCCTATCCATGACGCAAGAGAAG | 3 |
| 2b | ATGTATCCCAGCTTTTGGACGCCTGAGCCTTCCACTCCACCTCCTGAATTCCACCTTGGTAGCAATGTATCC | 4 |
| 3a | CCCGGCGGTATCATCAGCGTACAT | 5 |
| 3b | CACCGACCCAGCCAGTATAGCCGC | 6 |
| 4a | GAGCCGAGAGAATTCAGGAGGTGG | 7 |
| 4b | AAATATGGTACCAGATCCTGTGTTCTTCCTCACCAC | 8 |
获得4个修饰后的乙脑病毒cDNA片段，长度分别为2.9kb、2.8kb、3.8kb和1.8kb。
b)依次把修饰后的5’端片段和3’端片段用传统方法连接、克隆到pRS424质粒内。
c)利用在酵母菌(S.Cerevi siae YPH857)(ATCC76628)中相同序列的DNA重组，把修饰后的近5’端的中间片段cDNA插到上述克隆中。
d)利用在酵母(ATCC76628)中相同序列的DNA重组，把修饰后的近3’端的中间片段cDNA插到上述克隆中，产生全长的乙脑病毒cDNA克隆。
实施例2：制备插入点在NS2B和NS3之间的双价疫苗
参见图4。
1)将实施例1所得的全长乙脑病毒cDNA克隆用BspE I内切酶和BamH I内切酶切去一约2.1kb长的片段，此片段包括乙脑病毒cDNA序列3445-5576的碱基。
2)以实施例1所得的全长乙脑病毒cDNA克隆为模板，分别以GGCATAGTCTTGGACTTTGAT(SEQ ID NO：9)和GACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCGGGGCT TTCGGTTATTGGCTCACTTTA(SEQ ID NO：10)，以CCATGCCCTGTCTGGTATC TC(SEQ ID NO：11)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTT AAGAAGGTCAAAATTCAACAGCTGTGGGGATGGCGTGTCCCAAAACAC(SEQ ID NO：12)为引物，用PCR的方法产生两个DNA片段。以融合PCR(Fusing PCR)方法将上述两个DNA片段连接成一个在NS2B和NS3基因之间含有口蹄疫病毒2A基因序列(2A序列中间引入了一个Afl II酶切位点)的DNA片段，其两端分别含有BspE I和BamH I的酶切位点序列。
3)将步骤1中切去约2.1kb的乙脑病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段转化酵母菌(ATCC 76628)，得到修饰后的全长乙脑病毒cDNA克隆。
4)以HBV的DNA质粒(ATCC#45020D)为模板，以GACACGCCATCCCCACAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTGGCCGGCGACGTCGAGTCCAACCCCGGCCCCATGGAGAACATCACATCGGGA(SEQ ID NO：13)和GGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCGT CTCCCGCAAGCTTAAGCAGGTCAAAATTCAACAGCTGAATGTATACCCAAAGACAAAA(SEQ ID NO：14)为引物，用PCR方法合成一段含有HBV表面抗原的DNA片段(HBsAg)，其5’端和3’端包括口蹄疫病毒2A基因序列(SEQ ID NO：36)。
5)用Afl II内切酶将步骤3中产生的修饰后的乙脑病毒cDNA线性化。
6)将线性化的修饰后的乙脑病毒cDNA和步骤4中产生的HBsAg片段转化酵母菌(ATCC 76628)，得到含有HBsAg的重组乙脑病毒(简称重组乙脑病毒，rJEV)cDNA。
7)用Kpn I内切酶将步骤6中产生的重组乙脑病毒cDNA线性化。
8)用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)将线性化的重组乙脑病毒cDNA转录成RNA。
9)用电击的方法(electroporation)，把重组乙脑病毒RNA转染到宿主细胞BHK-21(Baby hamster kidney)内(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到每毫升106的重组乙脑病毒颗粒(rJEV)，即乙肝乙脑双价疫苗。
实施例3：制备插入点在E和NS 1之间的双价疫苗
参见图5。
1)将实施例1所得的全长乙脑病毒cDNA克隆用BsrG I内切酶和BspE I内切酶切去约1.6kb长的片段。此片段包括乙脑病毒cDNA序列1887-3445。
2)以实施例1所得的全长乙脑病毒cDNA克隆为模板，分别以CAGGCCACCTGAAATGTAGGC(SEQ ID NO：15)和GACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAAA ATTCAACAGCTGTCCAGTGTCAGCATGCACATT(SEQ ID NO：16)，以CTTCTTAA GCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCCGATCAATTGCTTTGGCCTTC(SEQ ID NO：17)和ATCATGCATAACAGGTCTGAT(SEQ ID NO：18)为引物，用PCR方法产生两个DNA片段。以融合PCR方法将上述两个DNA片段连接成一个在E和NS1基因之间含有2A基因序列(2A序列中间引入了一个Afl II酶切位点)的DNA片段，其两端分别含有BsrG I和BspE I酶切位点序列。
3)将步骤1中切去约1.6kb的乙脑病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段转化酵母菌(ATCC76628)，得到修饰后的全长乙脑病毒cDNA克隆。
4)其余步骤采用同实施例2的方法。
实施例4：制备插入点在C和prM之间的双价疫苗
参见图6
1)将实施例1所得的全长乙脑病毒cDNA克隆用Spe I内切酶切去612bp的片段。此片段包括乙脑病毒cDNA序列175-785。
2)以实施例1所得的全长乙脑病毒cDNA克隆为模板，分别以GGTAAAAACCGGGCTA TCAAT(SEQ ID NO：19)和AGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAAAATTCAACAG CTGGGCTCCTGCACAAGCTATGAC(SEQ ID NO：20)，以GGAGACGTCGAGTCCAA CCCTGGCCCCGGAGGAAATGAAGGCTCAATC(SEQ ID NO：21)和TCAGTTTTCATGAGATATCGT(SEQ ID NO：22)为引物，用PCR的方法产生两个DNA片段。以融合PCR方法将上述两个DNA片段连接成一个在C和prM基因之间含有2A基因序列(2A序列中间引入了一个Afl II酶切位点)的DNA片段，其两端分别含有Spe I酶切位点序列。
3)将步骤1中切去612bp的乙脑病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段转化酵母菌(ATCC76628)，得到修饰后的全长乙脑病毒cDNA克隆。
4)其余步骤采用同实施例2的方法。
实施例5：乙肝乙脑双价疫苗的神经毒性
将实施例2所得的重组乙脑病毒颗粒、实施例3所得的重组乙脑病毒颗粒以及JEV减毒株SA14-14-2病毒颗粒分别以104PFU的剂量(0.5ml)分别腹腔注射3组4周龄的ICR小鼠，每组小鼠5只。14天内小鼠无异常死亡。在接种后1、3、5、7、14天取脑(每次每组取小鼠1只)，将鼠脑用PBS缓冲液研磨乳化制成10％(w/v)脑悬液，8000g离心30min取上清。加入BHK21细胞进行病毒蚀斑实验。以100PFU的乙脑病毒SA14作为对照组。结果试验组均未检测出蚀斑，对照组蚀斑数为84。该实验说明两种重组乙脑病毒(双价疫苗)和乙脑减毒活疫苗对4周龄小鼠均无神经毒性。
实施例6：中和试验
乙脑病毒中和抗体测定采用蚀斑减少试验。将实施例2所得的重组乙脑病毒颗粒(双价疫苗)和乙脑减毒活疫苗(SA14-14-2)分别以106PFU的剂量(0.5ml)分别腹腔注射2组4周龄的ICR小鼠，免疫7天后采血，分离血清。将两组血清分别与稀释好的乙脑病毒P3(约200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释好的病毒再1：2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蚀斑计数，计算血清蚀斑减数中和效价，其中，病毒对照组的蚀斑平均数为80，双价疫苗的抗体中和效价为1：20，乙脑减毒活疫苗(阳性对照)的抗体中和效价为1：20。
双价疫苗免疫4周后采血，分离血清，中和抗体采用美国Abbott单克隆酶联免疫试剂测定，抗HBs平均几何滴度为650mIU/ml。
实施例7：制备重组JEV亚基因组
参见图7。本实施例制备去除了JEV结构蛋白C序列的cDNA克隆。
1.将实施例4得到的含有HBsAg序列的重组乙脑病毒cDNA克隆用Apa I酶切成线性。
2.用融合PCR的方法，制备一段102碱基长的DNA片段，这个片段5’端的72bp包括结构蛋白C的前20个密码子及其相连的部分5’非编码区序列，3’端的30bp包括结构蛋白的第106到第116密码子。
3.将线性的重组乙脑病毒cDNA和102bp的cDNA片段转化酵母菌(ATCC76628)，得到去除了JEV结构蛋白C序列的重组乙脑病毒cDNA克隆(ΔC-rJEV cDNA)。
4.用Kpn I内切酶将步骤3中产生的ΔC-rJEV cDNA线性化。
5.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)将线性化的ΔC rJEV cDNA转录成RNA，即ΔC-rJEV RNA。
实施例8：制备含有JEV亚基因组的乙肝乙脑双价疫苗
1.以pCI(购自PROMEGA，USA)作为模板，以5’CMV和3’CMV作为引物，用PCR方法制备CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的DNA片段(简称CMV)。CMV作为早期增强子和启动子，其长度为631bp。以实施例1得到的全长乙脑病毒cDNA克隆为模板，以5’JEV5’end和3’JEV5’end作为引物，用PCR的方法制备JEV cDNA的5’端片段(简称JEV5’end)。以上述2个DNA片段作为模板，以5’CMV和3’JEV5’end作为引物，用fusing PCR的方法制备CMV-JEV 5’end的DNA片段(简称CMV-JEV 5’end)。
2.将步骤1产生的CMV-JEV 5’end与pRS424质粒(ATCC#：77105)用Not I和ApaI进行酶切。用Qiagen spin column(购自QIAGEN Inc.)对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(购自New England Bio lab)连接，并转化至大肠杆菌内。筛选得到CMV-JEV 5’end克隆(简称pRS/CMV-JEV 5’end)。
3.以实施例1得到的全长乙脑病毒cDNA为模板，以5’JEV3’end和3’JEV3’end作为引物，用PCR方法制备JEV cDNA的3’端片段(简称JEV 3’end)。以5’HDVr和3’HDVr作为引物，用融合PCR方法制备肝炎delta病毒抗原血症核酶(hepatitisdelta virus antigenomic ribozyme，HDVr)的DNA片段(简称HDVr)。以pcDNA3(购自Invitrogen)作为模板，以5’pA和3’pA作为引物，用PCR的方法制备牛生长激素poly A(bovine growth hormone poly A，BGH pA)的DNA片段(简称pA)。以上述三个片段为模板，以5’JEV3’end和3’pA作为引物，用融合PCR方法制备JEV3’end-HDVr-pA的DNA片段。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | SEQ IDNO： |
| 5’CMV | AAATATGCGGCCGCTTGACATTGATTATTGACTAGTTA | 23 |
| 3’CMV | AGTTCACACAGATAAACTTCTCGGTTCACTAAACGAGCTCTG | 24 |
| 5’JEV5’end | AGAAGTTTATCTGTGTGAACT | 25 |
| 3’JEV5’end | TTTTTACCGGGCCCTCCTGGT | 26 |
| 5’JEV3’end | GCTGCAGGGCCCGGAGATCTTCTGCTCTATCTC | 27 |
| 3’JEV3’end | GTGGAGATGCCATGCCGACCCAGATCCTGTGTTCTTCCTCAC | 28 |
| 5’HDVr | GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCG | 29 |
| 3’HDVr | CTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACC | 30 |
| 5’pA | CCACTCGGATGGCTAAGGGAGAATAAAATGAGGAAATTGCATCGC | 31 |
| 3’pA | TATATCCGCGGATAGAATGACACCTACTCAGACAA | 32 |
4.将上述步骤2生成的pRS/CMV-JEV5’end与步骤3生成的JEV3’end-HDVr-pA的DNA片段用Apa I and Sac II进行酶切，用Qiagen spin column对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶连接，并转化至大肠杆菌内。筛选得到pRS/CMV-JEV5’end-JEV3’end-HDVr-pA的克隆。
5.将上述步骤4生成的pRS/CMV-JEV5’end-JEV3’end-HDVr-pA的克隆用Apa I进行酶切，将实施例1得到的全长乙脑病毒cDNA克隆用Not1 and Kpn I进行酶切。将上述酶切产物进行纯化，并将纯化产物转化至酿酒酵母，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，得到修饰后的全长JEVcDNA克隆(简称pRS/CMV/JEV)。
6.将步骤5产生的pRS/CMV/JEV用BamH I进行酶切，得到线性的pRS/CMV/JEV克隆。以GATTCCAATGGAGACATTATAGGCCTATAGCTGCTTAGGACGGCTGACCTC(SEQ ID NO：33)和CCACACCGGGAGGTCAGCCGTCCTAAGCAG(SEQ ID NO：34)为引物，用融合PCR方法生成一个60bp长的DNA片段，其序列为GATTCCA ATGGAGACATTATAGGCCTATAGCTGCTTAGGACGGCTGACCTCCCGGTGTGG(SEQ ID NO：35)。将上述线性的pRS/CMV/JEV克隆和60bp长的DNA片段一同转化至酵母菌(ATCC76628)，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，将线性的pRS/CMV/JEV克隆中部分JEV NS3编码区基因序列(nt5059-6215)切除，得到NS3缺失的JEV cDNA克隆。
7.将上述步骤6产生的NS3缺失的JEV cDNA克隆和pcDNA3(购自INVITROGEN)同时转染BHK-21cell(ATCC#：CCL-10)。该细胞培养一天后，转换为含有G418(购自SIGMA)的细胞培养液。用实施例7得到的ΔC rJEV RNA转化抗G418细胞株，挑选出包装细胞系。该细胞系的产量可以达到每毫升106重组乙脑病毒颗粒(ΔC-rJEV)，即乙肝乙脑双价疫苗。
实施例9-13：重组乙脑病毒(含有全JEV基因组)的各种构建体
采用与实施例2～4的相似的方法构建了下列重组乙脑病毒，不同点仅在于插入的外源核酸和插入位点不同。
| 实施例 | 外源核酸来源 | 外源核酸编码的多肽 | 插入的位点 |
| 9 | HIV | gp120 | E-NS1 |
| 10 | HPV | E7-E6 | C-prM |
| 11 | HPV | E7-E6-IL2 | C-prM |
| 12 | HPV | L1 | NS2B-NS3 |
| 13 | JEV2 | prME | C-prM |
实施例14-16：重组乙脑病毒(含有JEV亚基因组)的各种构建体
采用如实施例7和8的相似的方法构建了下列重组JEV亚基因组和重组乙脑病毒，外源核酸插入位置仍然为JEV基因组去除结构蛋白基因处，不同点仅在于插入的外源核酸不同。
| 实施例 | 外源核酸来源 | 外源核酸编码的多肽 |
| 14 | HIV | gp120 |
| 15 | HPV | E7-E6 |
| 16 | JEV2 | prME |
实施例17：重组乙脑病毒疫苗的中和试验
对实施例8、9-16制备的重组乙脑病毒，用实施例6相同的蚀斑减少试验进行乙脑病毒中和抗体测定，结果各重组乙脑病毒的抗体中和效价为1∶5～1∶20。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海天甲生物医药有限公司
美国天甲生物医药有限公司
北京东方天甲科技发展有限公司
<120>乙肝乙脑双价疫苗
<130>041890 PCWO
<150>CN 03115912.5
<151>2003-03-20
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<170>PatentIn version 3.1
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<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)
<400>36
cagctgttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa ccctggcccc 60
Claims (10)
1.一种重组乙脑病毒，其特征在于，所述的重组乙脑病毒由乙脑病毒衣壳和重组乙脑病毒基因组构成，所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且重组后的基因组保留了自我复制功能；
其中外源核酸序列的插入位点选自：病毒蛋白质C和prM之间；病毒蛋白质NS2A和NS2B之间；病毒蛋白质NS2B和NS3之间；病毒蛋白质NS3和NS4A之间；NS4A和NS4B之间；或E编码区和NS1编码区之间；
所述的外源核酸中含有编码抗原和/或抗原决定簇的核酸序列，并且外源核酸长度小于5kb；
并且，所述的乙脑病毒是减毒的。
2.如权利要求1所述的乙脑病毒，其特征在于，所述的外源核酸中还含有编码细胞因子、生长因子、多肽类激素、酶、受体、抗体和/或癌相关蛋白的核酸序列。
3.如权利要求1所述的乙脑病毒，其特征在于，所述的外源核酸序列含有乙肝病毒抗原或抗原决定簇的核酸序列。
4.如权利要求1所述的乙脑病毒，其特征在于，外源核酸的插入位点选自下组：
(i)在乙脑病毒基因组的NS2B和NS3编码区之间；
(ii)在乙脑病毒基因组的E和NS1编码区之间；
(iii)在乙脑病毒基因组的C和prM编码区之间。
5.如权利要求1所述的乙脑病毒，其特征在于，所述的乙脑病毒基因组缺失了部分乙脑病毒结构蛋白基因序列，并且所述的缺失的结构蛋白基因序列是C蛋白。
6.如权利要求1所述的乙脑病毒，其特征在于，所述的 外源核酸序列的长度为200～2500bp。
7.如权利要求1所述的乙脑病毒，其特征在于，所述的外源核酸序列编码乙肝病毒的表面抗原、HIV病毒的gp120、HPV病毒的E7-E6、HPV病毒的E7-E6-IL2、或HPV病毒的L1。
8.如权利要求1所述的重组乙脑病毒的用途，其特征在于，用于制备治疗性或预防性的疫苗。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的重组乙脑病毒和药学上可接受的载体。
10.一种制备重组乙脑病毒的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将乙脑病毒基因组引入包装细胞，其中所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且缺失了选自下组的结构蛋白基因序列：C蛋白，并且重组后的基因组保留了自我复制功能；
其中外源核酸序列的插入位点选自：病毒蛋白质C和prM之间；病毒蛋白质NS2A和NS2B之间；病毒蛋白质NS2B和NS3之间；病毒蛋白质NS3和NS4A之间；NS4A和NS4B之间；或E编码区和NS1编码区之间；
所述的外源核酸中含有编码抗原和/或抗原决定簇的核酸序列，并且外源核酸长度小于5kb；
并且，所述的乙脑病毒是减毒的；
而所述的包装细胞选自下组：
(i)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞，
(ii)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和
(iii)基因组整合有所述病毒缺失的结构蛋白基因的细胞；
(b)培养步骤(a)的包装细胞；
(c)从培养物中分离出重组乙脑病毒。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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