JP2023511823A - Ａ型肝炎ウイルスの製造方法及び前記方法により製造されたａ型肝炎ウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、Ａ型肝炎ウイルスの生産方法及びこの方法により生産されたＡ型肝炎ウイルスに関するものであり、より詳細にはＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含むベクターで宿主細胞を形質転換して得られたウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階を含むＡ型肝炎ウイルスの生産方法及びこの方法により生産されたＡ型肝炎ウイルスに関するものである。【選択図】図１

Description

本出願は、2019年12月19日に出願された大韓民国特許出願第10-2019-0171279号を優先権として主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。

本発明は、Ａ型肝炎ウイルスの生産方法及びこの方法により生産されたＡ型肝炎ウイルスに関するものであり、より詳細にはＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）が挿入されたベクターで宿主細胞を形質転換して得られたウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階を含むＡ型肝炎ウイルスの製造方法及びこの方法により製造されたＡ型肝炎ウイルスに関するものである。

Ａ型肝炎は、韓国の成人急性ウイルス肝炎の７０％以上を占める最も重要な原因である。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）はピコルナウイルス科に属し、エンベロープのない約２７ｎｍサイズであり、一本鎖ＲＮＡを核酸として有する。平均２８日間の潜伏期の後、発熱、食欲不振、嘔気および嘔吐、腹痛、暗尿、黄疸などの臨床症状を特徴とする急性肝疾患をもたらす（ＳＭ Ｌｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ 、６８（１）：１６７－ １８４（２０１８）；Ｔｏｔｓｕｋａ ａｎｄ Ｍｏｒｉｔｓｕｇｕ 、 Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ 、４２：６３－６８（１９９９））。最近１０年間の調査によると、米国西部地域、中東地域、一部アジア地域においてＡ型肝炎患者が増えており、世界的なＡ型肝炎疾患の拡散が懸念されている。韓国でも最近免疫力のない１０、２０代の若い層でＡ型肝炎感染者が急速に増え始めている（Ｎｗａｃｈｕｋｕ ａｎｄ Ｇｅｒｂａ， Ｒｅｖ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｃｏｎｔａｍ ． Ｔｏｘｉｃｏｌ ． １８６：
１－５６ （２００６）； Ｋｉｍ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ
， ５３（１）： １０－１４ （２０１０）； 疾病管理本部（ＫＣＤＣ）感染病ポータル法定感染病における疾病別統計－Ａ型肝炎）。特に、学習期の青少年や受験生の場合、Ａ型肝炎ウイルス感染時の入院と治療による個人的被害、経済的被害が誘発される。米国の場合、Ａ型肝炎患者１人当たりかかる直接的・間接的費用は、大人は２，５００ドル、１８歳以下は１，５００ドル程度の費用がかかり、Ａ型肝炎による医療費は年間約３億ドル以上であることが知られている（World Health Organization 、1999）。

Ａ型肝炎の主な伝播経路は糞便－経口通路であり、汚染された食品や食水によって伝染される。予防接種の実施に関する諮問委員会（Ａｄｖｉｓｏｒｙ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ （ＡＣＩＰ））はＡ型肝炎ウイルス風土性（ｅｎｄｅｍｉｃｉｔｙ）のある地域への旅行者（ｏｕｔｂｏｕｎｄ ｔｒａｖｅｌｅｒｓ）および該当の地域での業務遂行者、男性間性交渉者（ｍｅｎ ｗｈｏ ｈａｖｅ ｓｅｘ ｗｉｔｈ ｍｅｎ （ＭＳＭ））該当者、Ｂ型肝炎疾患者、慢性肝疾患者および慢性腎不全、Ａ型肝炎の頻度が高い地域に居住する小児群において予防接種を推奨している（Ｎｅｌｓｏｎ ＮＰ、Ｗｅｎｇ ＭＫ、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ＭＧ、ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ： Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ， ２０２０． ＭＭＷＲ Ｒｅｃｏｍｍ Ｒｅｐ ２０２０；６９（Ｎｏ． ＲＲ－５）：１－３８． ＤＯＩ： ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／ １０．１５５８５／ｍｍｗｒ．ｒｒ６９０５ａ１）。

Ａ型肝炎ワクチンを製造するためには、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ、ＨＡＶ）の製造が必須に伴わなければならないが、Ａ型肝炎ウイルスは複製速度が非常に遅い（Ｃｒｏｍｅａｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ ． ７０ ：２０５１－２０６２（１９８９））。通常、ヒトに感染されるウイルスは、短くは２～３日間、長くは７日間培養すればウイルスが複製して分離することができるが、Ａ型肝炎ウイルスの場合、短く１ヶ月ほど培養するとウイルスを収得することができる。１ヶ月に当たる期間さえウイルスが培養細胞に上手く適応できる場合のみに限る。Ａ型肝炎ウイルスの増幅に使用するＡ型肝炎ウイルスに対して感受性の高い細胞株（例えば、Ｐｒｉｍａｒｙ ＡＧＭＫ ｃｅｌｌ、ＦＲｈＫ－４、ＢＳ－Ｃ－１）は、ワクチンを産生するための細胞としては適していない。これらは、人体用ワクチン生産用細胞株として使用するのに適した細胞株特性分析及び安定性は検証されなかった。特に、例の細胞は、フラスコなどでの体外培養が可能な細胞株として確立されたが、ＣＩＴＥＳ条約の制限を受ける国際絶滅危機種である尾長猿科に属するヒマラヤ猿（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）およびサバンナ猿（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉ）に由来の物質として分類され、商業的に細胞株を分譲販売するＡＴＣＣ(ＵＳ)などから国内への輸入が難しい。

ヒトの糞便検体から分離し、ウイルスの生産細胞株を高収率で製造するには、ＨＡＶを生産細胞株に適応させるための５０回内外のウイルス感染継代培養が必要である。一例として、商業用ワクチンハブリックスのマスターシードウイルス（ＨＡＶ ４３８０またはＭＲＣ５／９，Ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ）の場合、ヒトに由来のｗｔ ＨＭ－１７５（ヒトの糞便の懸濁液（ｈｕｍａｎ ｓｔｏｏｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ））を一次ＡＧＭＫ（ｐｒｉｍａｒｙ Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）細胞において３２継代を経て細胞培養に適応したウイルスを確認した後、当該ウイルス（Ｐ－３２ ＡＧＭＫ ｃｅｌｌ－ａｄａｐｔｅｄ）をＭＲＣ－５細胞株でパサージュ３７まで培養した後、ウイルスクローン（ｃｌｏｎｅ ２５－４－２１）に分離し、このクローンを再びＭＲＣ－５で１回培養した後（パサージュ ３８）、さらに３回ＭＲＣ－５細胞でウイルス感染継代を行ったパサージュ４１のウイルスをマスターシードストック（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）とし、これをＨＡＶ ４３８０と明示している（ＵＳ６４２３３１８Ｂ１）。

Ａ型肝炎ワクチンは、国で指定した必須予防接種の対象であるが、ＨＡＶが流行る時期に頻繁に供給不足を経ている実情である。全世界的に最も高い頻度で使用されているＡ型肝炎ワクチンであるグラクソ・スミスクライン社のハーブリックス（ Ｈａｖｒｉｘ，ＧＳＫ）やメルク社（ＭＥＲＣＫ社）のバクター（Ｖａｑｔａ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）など、２０１９年のＡ型肝炎が大きく流行った韓国で売り切れ、２０１９年末までに供給が中断されるなど、需給に大きな困難を経たことがある。このようなワクチン需給の不均衡問題は、２０１７年にも同様に発生したことであるが、Ａ型肝炎の突然の流行が発生した２０１９年にも受給不安定は解消されなかった。現在、保健福祉部のワクチン需給の安定化のための２０２０年の国家予防接種ワクチン備蓄計画にＡ型肝炎ワクチンが含まれ、これを解消するための試みが進行中である。このような需給不安定は、現在のＡ型肝炎ワクチンが国内技術にて開発された商業用ワクチンがないことにおける理由を提供する。

本発明者は、前述の技術的課題を解決し、Ａ型肝炎ウイルスを安定的かつ迅速な生産が可能な方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、従来のウイルスの取得に必要であった５０回内外の継代培養段階を単なる６回に短縮してウイルスを収得する方法と、ウイルス産生細胞株に更なる高収率で発現する最適な遺伝子発現カセットの組み合わせとを見出し、Ａ型肝炎ウイルスの遺伝子および機能的領域を含む発現ベクターを宿主細胞に感染させ
て得たウイルス継代培養を重ねるほど、驚くほどに速い速度で複製し、迅速かつ安定的にＡ型肝炎ウイルスを産生することができることを見出し、本発明の完成を成し遂げた。

よって、本発明の目的は、配列番号１で表されるＡ型肝炎ウイルス遺伝子を提供することである。

本発明の他の目的は、配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を提供することである。

本発明の他の目的は、前記発現カセットを含むＡ型肝炎ウイルスの製造用ベクターを提供することである。

本発明の他の目的は、前記ベクターで製造されたＡ型肝炎ウイルスを提供することである。

本発明の他の目的は、（ａ）配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス調製用発現カセットが挿入されたベクターを宿主細胞に形質転換する段階；（ｂ）前記宿主細胞からウイルスを習得する段階；（ｃ）前記収得したウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階；（ｄ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階を含む、ワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、前記方法によって製造された肝炎ウイルスを提供することである。

本発明の他の目的は、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むＡ型肝炎ワクチン組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記肝炎ウイルスからなるＡ型肝炎ワクチン組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記肝炎ウイルスで必修的に構成されるＡ型肝炎ワクチン組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記ワクチン組成物を含むキットを提供することである。

本発明の他の目的は、ワクチン組成物を充填したプレフィルドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）を提供することである。

本発明の他の目的は、Ａ型肝炎ワクチンを製造するための前記肝炎ウイルスの使用を提供することである。

本発明の他の目的は、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物のＡ型肝炎予防の使用を提供することである。

本発明の他の目的は、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含むＡ型肝炎予防方法を提供することである。

前記本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１で表されるＡ型肝炎ウイルス遺伝子を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を
含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセットを提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記発現カセットを含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現ベクターを提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ベクターにて製造されたＡ型肝炎ウイルスを提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）が挿入されたベクターを宿主細胞に形質転換させる段階；（ｂ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階；（ｃ）前記収得したウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階；（ｄ）前記宿主細胞から細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れる場合にウイルスを収得する段階を含む、ワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記方法により製造された肝炎ウイルスを提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むＡ型肝炎ワクチン組成物を提供する。

また、本発明は、前記肝炎ウイルスからなるＡ型肝炎ワクチン組成物を提供する。

また、本発明は、前記肝炎ウイルスで必須的に構成されるＡ型肝炎ワクチン組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ワクチン組成物を含むキットを提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ワクチン組成物を充填したものであるプレフィルドシリンジを提供する。

本発明の他の目的を達成するためにＡ型肝炎ワクチンを製造するための前記肝炎ウイルスの使用を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物のＡ型肝炎予防の使用を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含むＡ型肝炎予防方法を提供する。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、配列番号１で表されるＡ型肝炎ウイルス遺伝子を提供する。

また、本発明は、配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセットを提供する。

本発明が提供する前記配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子は、商業用Ａ型ウイルス株（
ＡＴＣＣ ＶＲ－１４０２）の遺伝子に比べてＡ２８７６Ｔ及びＡ３８９１Ｔ点突然変異を含み、これにより高収率及び速い継代培養に適したものであることを特徴とする。

特に、３８９１番位置は、アミノ酸がＭＥＴからＬＥＵに変化する主要な突然変異である。さらに、継代培養が容易であり、収率を高めることができる主要部位に突然変異を与え、本発明の組換え塩基配列を完成した。

本発明の一実施態様によれば、図８および図１１のように町中で収得が可能である野生型Ａ型肝炎ウイルスに比べた場合、本発明に係る配列番号１で表される遺伝子のＡ型肝炎ウイルスの生産性がさらに優れることが確認できた。

従来技術においては、Ａ型肝炎ウイルスを収得するために少なくとも４７回の継代培養を進めなければならないし（図４）、煩わしい上に長時間がかかり、高費用がかかる短所があった（Ｔ．Ｃｒｏｍｅａｎｓ ｅｔ ａｌ 、Ｊ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
２２ ：４５－５６、１９８７）。通常、ＨＡＶの１回分の継代培養に約１ヶ月が所要するが、従来技術によりワクチン製造用Ａ型肝炎ウイルスをヒトの糞便から収得するには数十ヶ月を所要するが、本発明においては、前記遺伝子変異を有する配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子およびこれを含む発現カセットを用いてＡ型肝炎ウイルスの生産期間を４～５ヶ月に短縮させたことに技術的特徴がある。

本発明における「発現カセット」とは、プロモーターとシグナルペプチドをコードする塩基配列および目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、シグナルペプチドの下流に作動可能に連結されている目的タンパク質の分泌産生のために発現することができる単位カセットを意味する。このような発現カセットの内側または外側には、前記目的タンパク質の効率的な生産を補うことができる様々な要因が含まれ得る。

本発明における「遺伝子」とは、生物学的機能に関連するポリヌクレオチドの任意のセグメントを言及するのに大幅に用いられる。よって、遺伝子またはポリヌクレオチドは、ゲノム配列などのイントロンおよびエクソン、またはｃＤＮＡなどのコード配列、例えば、開始コドン（メチオニンコドン）から始まり、終結シグナル（終了コドン）で終結するオープン解読フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が含まれる。また、遺伝子およびポリヌクレオチドは、転写開始、翻訳および転写終了など、その発現を調節する領域を含んでもよい。よって、また、プロモーターおよびリボソーム結合領域（一般的には、コード配列または遺伝子の開始コドンの上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）におよそ６０～２５０ヌクレオチド上に置かれたこれらの調節要素、転写ターミネーター（一般的に、ターミネーターはコード配列または遺伝子の停止コドンの下流においておよそ５０ヌクレオチド以内に位置する）が含まれる。遺伝子またはポリヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡまたは機能性ＲＮＡを発現するか、特定のタンパク質をコードし、調節性配列を含む核酸断片も指す。

本発明で提供する発現カセットが前記配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有りしながら、ウイルスの抗原性または免疫原性のような生物学的特性が実質的に同一であるポリペプチドを符号化する塩基配列を含むことができることは、当業者には明らかに理解され得る。

本発明の一実施態様によれば、発現カセットは、プロモーター、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよびヘパチチスデルタウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ， ＨＤＶ）リボザイムを含むことができる。

好ましくは、前記発現カセットは、前記Ａ型肝炎ウイルス遺伝子の５’末端に順にＣＭＶ
プロモーター、Ｔ７プロモーター、マルチクローニング領域（ＭＣＳ）、ＨＨリボザイム領域を含み、前記Ａ型肝炎ウイルス遺伝子の３’末端方向に順にヘパチチスデルタウイルスリボザイム、ＭＣＳ、ポリＡ鎖を含むことができる。
本発明の好ましい一実施態様によれば、ＣＭＶ／Ｔ７プロモーターは配列番号２で、ＭＣＳ配列は配列番号３または６で、ＨＨリボザイムは配列番号４で、ＨＤＶリボザイムは配列番号５で、ポリＡ鎖は配列番号７で表示することができる。本発明の一実施例においては、遺伝子発現のために発現カセットにＣＭＶプロモーター部位およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる体外転写（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）が可能なＴ７プロモーター領域を挿入した（配列番号２）。制限酵素が利用できるように、ＭＣＳを遺伝子５’末端のプロモーターの後側（配列番号３）、ポリＡ鎖配列の前側に配置（配列番号６）した。自己切断（Ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖａｇｅ）機能を有するカタリーチックＲＮＡ切断構造としてＨＨリボザイム（配列番号４）、ＨＤＶリボザイム（配列番号５）領域がＨＡＶ配列部位であるＵＴＲ－ＨＡＶポリタンパク質－ＵＴＲ領域の両側に位置し、ターゲットとするＨＡＶ ｍＲＮＡ構造のみで単離できるように発現カセットを設計した。

本発明の好ましい一実施態様によれば、前記発現カセットは配列番号８の塩基配列を含んでもよい。

また、本発明は、前記発現カセットが挿入されたＡ型肝炎ウイルス調製用ベクターを提供する。

本発明において「ベクター」とは、適切な宿主細胞において目的タンパク質を発現することができるベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構築物を示す。本発明において「作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を遂行するために核酸発現調節配列と、目的とするタンパク質とをコードする核酸配列とが機能的に連結されていることを示す。ベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で周知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断および連結は、本発明が属する技術分野で一般的に知られている酵素などを用いて容易な遂行ができる。

本発明において使用できそして適したベクターは、前記配列番号１のＡ型肝炎遺伝子の他にも、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、リボザイムおよびエンハンサーのような発現調節エレメントに加えて、膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。

開始コドンおよび終止コドンは、一般的に免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされ、遺伝子構築物が投与されたときに宿主細胞において必ず作用を示し、コード配列とインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）に在りするべきだ。一般プロモーターは構成的または誘導性でもよい。プロモーターには、ヒト伸長因子‐１α（ＥＦ-１α）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、β-アクチンプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあるが、これらに限定されない。

ベクターが複製可能な発現ベクターである場合、複製が開始される特定の核酸配列である複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を含んでもよい。組換え発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミドなどの様々な形態のベクターを用いてもよい。組換えベクターの種類は、真核細胞の各種宿主細胞における所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を産生する機能をする上のみで特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保ちながら、自然状態に類似した形態の外来タンパク質を大
量生産することができるベクターが好ましい。

前記配列番号１のＡ型肝炎遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセットを挿入することができる真核（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）発現ベクターが当該業界に公知となっている。その非限定的例としては、ｐＵＣ５７ベクター、ｐｃＤＮＡ３.１ベクター、ｐＶＡＸ１ベクター（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、フランスのセルジーポントワーズ）、ｐＢｕｄＣＥ４.１（ライフテクノロジー）を含み、本明細書に開示または言及されているか、または関連技術分野の当業者に公知となっているベクターらは、本発明の前記発現ベクターの制作に使用することができる。好ましくは、ｐＵＣ５７ベクターを使用してもよい。

本発明の好ましい他の一実施態様によれば、前記ベクターは、図２に開示されたＨＡＶウイルス遺伝子およびウイルスの生成のための遺伝子発現に関与する因子らの開裂マップを表すことでもよい。

本発明は、（ａ）配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセットが挿入されたベクターを宿主細胞に形質転換する段階；（Ｂ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階；（Ｃ）前記収得したウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階；（Ｄ）前記宿主細胞から細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れたときにウイルスを収得する段階を含む、ワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法を提供する。

（ａ）配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）が挿入されたベクターを宿主細胞に形質転換する段階；前記「発現カセット」および「ベクター」については、前述の通りに同様に適用することができる。

本発明において、前記「宿主細胞」とは、遺伝的に変更されたか、外因性ポリヌクレオチド、例えば、組換えプラスミドまたはベクターの投与によって遺伝的に変更ができる真核細胞を意味する。遺伝的に改変された細胞を指す場合、その用語は、最初に改変された細胞またはその子孫を全部含む。前記配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子配列を含むポリヌクレオチドまたは発現カセットをクローニングベクターおよび発現ベクターの中に挿入し、その後、ベクターを複製および増幅に適した宿主細胞に注入することができる。

本発明の前記（ａ）段階においてベクターが注入される宿主細胞は、その種類が特に制限されるものではないが、ＨＡＶの自然宿主（例えば、チンパンチ、猿、ヒトなど）に由来の細胞やワクチン生産用細胞であってもよい。前記「ワクチン生産用細胞」とは、細胞基質（ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とも表現することができ、バイオ医薬品または細胞培養医薬品の製造原料としてヒトまたは動物に由来の細胞株のうち医薬品を生産する能力を有するものと定義してもよい。

特に、本発明において、前記宿主細胞はヒトワクチン生産用細胞として安全性が立証され、当該業界において生物学的医薬品の生産に利用されていることが好ましい。ヒトワクチン生産用細胞としての安全性が立証された細胞につく具体的な説明は、Ｊｏｒｄａｎ ａｎｄ Ｓａｎｄｉｇ、Ｖｉｒｕｓｅｓ、６：１６７２－１７００（２０１４）；ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｎｏ． ９７８、Ａｎｎｅｘ ３を参照してもよく、これらの文献の全ての内容は、本発明の内容に参考となり得る。

本発明の一態様によれば、前記ワクチン生産用細胞は、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４、ＷＩ－３８、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、Ｈｉ５、ＣＥＦ、Ｓ９、ヒト胚性肺線維芽細胞（例、ＭＲＣ－５など）、ＰＥＲ.Ｃ６、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ－Ｋ１およびそれらの無血清適応細胞から
なる群から選択されてもよい。好ましくは、前記ワクチン生産用細胞は、ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏまたはその無血清適応細胞が選択されてもよい。より好ましくは、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞でもよい。

本発明の一態様によれば、宿主細胞の培養は以下のように行うことができる。ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞株は２％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ（２％ＦＢＳ－ＥＭＥＭ）培地を使用し、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株は無血清のＥＭＥＭ培地（ＳＦ－ＥＭＥＭ）２ｍＬに交換し、３０～４０℃（好ましくは、３５℃）、３～７％（好ましくは、５％）ＣＯ_２インキュベーターで２～４週間（好ましくは、３週間）の間培養することができる。

当該温度範囲、二酸化炭素濃度範囲、および培養日数を満たしていないか、または超過する場合、適切な数の細胞株が生成できない可能性があり、ＨＡＶ遺伝子構築物を形質転換するのに適切な条件が形成されない可能性がある。

血清を含有しない培地における培養に対する細胞適応は、細胞が血清を含有しない培地内で成功的に生存且つ増殖ができるまで、血清の量が減少する培地において細胞を徐々に継代培養することにより、関連技術分野の通常の技術者によって容易に達成することができ、前記各細胞株の無血清適応細胞株は通常の技術者によって容易に得ることができる。

本発明におけるベクターは、当該業界に公知の任意の方法によって宿主細胞に注入してもよい。前記配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）が挿入されたベクターは、細胞内移入、形質転換、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の成分を使用する形質転換；微細粒子投影法；リポフェクション；及びウイルスベクター注入（例えば、レトロウイルスベクター）をはじめとする多数の適切な手段によって宿主細胞の中に注入してもよい。

（ｂ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階；
前記（ａ）段階の以後に、ベクターで形質転換させた宿主細胞を栄養培地で培養することにより、シード（ｓｅｅｄ）として使用するＡ型肝炎ウイルスを収得することができ、この場合、使用される培地と培養条件は宿主細胞によって寛容されることを適宜選択して利用することができる。培養時の細胞の生育やウイルスの生産に適するように、温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件らを適宜調節することができる。前述のように宿主細胞内における産生または分泌ができるウイルスは、培養培地の上澄液または細胞分解物から回収することができ、通常のタンパク質およびウイルスの分離技術によって、分離、精製が可能である。

前記（ｂ）段階において収得したウイルスは、以後に宿主細胞に感染されて増幅されるためのシード（ｓｅｅｄ）として活用され、本発明の一実施例ではこれをパサージュ０（Ｐ０）ウイルスと命名した。

（ｃ）前記収得したウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階；
本発明の前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階で収得したＰ０ウイルスを宿主細胞に感染させて繰り返しの継代培養をすることにより、宿主細胞に適応し、速い速度で増幅できるウイルスを生成する段階である。

本発明の一実施態様によれば、感染継代の進行において、宿主細胞ＭＡ１０４およびＶｅｒｏは１×１０^５～１×１０^７細胞／５ｍＬで、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞は５×１０^５～５×１０^７細胞／５ｍＬで準備することでもよい。当該濃度より少なく宿主細胞を準備する場合、満足できる力価を得ることが困難である可能性があり、当該濃度より多く宿主細胞を
準備する場合、宿主細胞の感染が均一に行われず、経済的でないことがある。

本発明の一実施態様によれば、宿主細胞培養は３０～４０℃（好ましくは、３５℃）、３～７％（好ましくは、５％）ＣＯ_２培養器で２～４週間（好ましくは、３週間）培養することでもよい。当該温度範囲、二酸化炭素の濃度範囲、および培養日数を満たしていないかまたは超える場合、適切な数の細胞株が生成できない可能性があり、継代培養に適切な条件が形成されないことがある。

本発明の一実施態様によれば、Ｐ１感染継代の進行において、Ｍ１０４およびＶＥＲＯ細胞は５×１０^５～５×１０^７細胞／３０ｍＬで、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞は８×１０^５～８×１０^７細胞／３０ｍＬで準備を行い、感染の直前に準備した細胞から同様に培地を除去し、３０ｍＬのＤＰＢＳで１～３回洗浄してもよい。当該条件を満たしていないか、または超過する場合、最適の収率でウイルスが収得できない可能性がある。

本発明の一実施態様によれば、Ｐ１～Ｐ４感染継代の進行において、感染培地１～１０ｍＬ、Ｐ５～Ｐ６の感染継代は、感染培地２０～５０ｍＬを使用してもよい。当該条件を満たしていないか、または超過する場合、最適の収率でウイルスが収得できない可能性がある。

本発明において、前記継代は、宿主細胞にウイルスを感染させた後に培養上のウイルス増殖の実験的確認、つまり、細胞病変効果やウイルスの検出が確認されなくても、ウイルスに感染された宿主細胞の継代を持続的に維持することを示す。

前記（ｃ）段階において、ウイルスに感染させる宿主細胞は、前記（ａ）段階においてＰ０ウイルスを製造するために使用した宿主細胞と同一のものを用いることが好ましい。

本発明の一実施態様によれば、継代培養は、具体的には以下の方法に従って進行してもよい。前記Ｐ０ウイルスを宿主細胞に処理して感染させた後、それを培養する。培養後、宿主細胞を破砕し、遠心分離して細胞残渣を除去した後、上澄液のみを収得する。前記収得した上澄液パサージュ１（Ｐ１）を用いて再度宿主細胞感染を行う。

前述した宿主細胞感染－宿主細胞培養－宿主細胞破砕－上澄液の収得過程を１サイクル（ｃｙｃｌｅ）として繰り返し継代を進行する。

本発明の前記１サイクルの継代過程において、宿主細胞の培養は、好ましくは、５日～３０日間行うことができ、より好ましくは、１０日～２５日、更により好ましくは、１７日～２１日、最も好ましくは、１９日から２１日の日の間に行うことができます。

前記各継代培養過程において、ウイルスの増殖は、宿主細胞が一般に培養される培地組成物で行われる。宿主細胞は、中性の緩衝ｐＨ（例えば、７．０～７．２の間のｐＨ）を維持するのに適したＣＯ_２濃度および調節できた湿度下で、血清（例えば、１０％ウシ胎児血清）を補充した培地または無血清培地のような標準市販の培養培地で培養する。選択的に、培地は、例えば、Ｌ－グルタミン、ビタミン、糖、アミノ酸、ペプチド、微量元素、ナトリウム・ピルビン酸、ペプトン、ビタミン、糖（例えば、グルコース）、非必須アミノ酸などの付加栄養剤、望ましい成長特性を促進する付加的なサプリメント（例えば、トリプシン、β－メルカプトエタノール、インスリン、成長因子、アミノ酸複合剤など）などを含んでもよい。

一部の場合において、例えば、ウイルスの製造のためには、宿主細胞を無血清の条件下で成長させることが好ましい。細胞は小規模、例えば、２５ｍＬ未満の培地、培養チューブ
またはフラスコ、または大型フラスコ（例えば、Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）で付着培養が可能であり、攪拌される大型フラスコ、ローテーターボトル、反応器培養液内の微細担体（例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で培養してもよい。微細担体ビーズは、細胞培養物の体積当たりの接着性細胞増殖のための大きな表面積を提供する小さな球である（直径５０～１００μｍの範囲）。例えば、ワクチン生産のような商業的ウイルス生産の場合、生物反応器または発酵器にて細胞を培養することがしばしば好ましい。生物反応器は、１Ｌ以下から１００Ｌ超過までの体積にて利用が可能であり、例えば、ＮＢＳ生物反応器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ）またはｓｃａｌｅ－Ｘ生物反応器（ｓｃａｌｅ－Ｘ ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ；Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）における実験室の用量および商業的規模の生物反応器を用いてもよい。

本発明において、培養体積にかかわらず、Ａ型肝炎ウイルスの効果的な製造を保障するために、培養物を３５℃以下の温度で維持することが重要である。一般的に、モジュレーター、例えば、恒温器、または細胞培養システムの温度を感知し維持するための他の装置を利用し、ウイルス複製期間の間に温度が３５℃を超えないようにすることが好ましい。

培養中の細胞を維持する過程は広く報告されており、当該業界に公知となっている。一般的なプロトコルは当該業界に公知となっており、細胞培養過程中の条件変化は日常的な実験を通して容易に決定することができる。

一方、本発明において、前記継代培養は、前述した１サイクルの１継代を２回～３０回繰り返してもよく、好ましくは２回～２０回、さらに好ましくは４回～２０回、さらにより好ましくは４～１５回、最も好ましくは４～１０回繰り返してもよい。

（ｄ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階；
本発明の前記（ｄ）段階は、前記（ｃ）段階において繰り返しで前記宿主細胞とその培養液を収得し、ワクチン生産用ウイルスを回収する段階である。

好ましくは、前記段階（ｄ）は宿主細胞において細胞変性効果が示される場合にウイルスを収得することができる。

本発明において、前記細胞変性効果とは、Ａ型肝炎ウイルス感染により引き起こされる細胞における全ての効果を意味する。これは、プラーク形成、細胞顆粒化に連れた断片化（ｃｅｌｌ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および支持体（例えば、細胞－ウイルス培養フラスコ）からの細胞剥離、細胞萎縮、細胞凝集、細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）、セル・ラウンディング（ｃｅｌｌ ｒｏｕｎｄｉｎｇ）の変性、浮腫形成（ｓｏｕｇｈｉｎｇ）、アポトーシスの誘導などが含まれるが、これらに限定されない。前記細胞変性効果は、一般に顕微鏡で観察するか、肉眼で観察して確認することもできる。

一方、本発明の前記（ｄ）段階では、宿主細胞における細胞変性効果が現れた後に細胞培養液及び細胞からウイルスを収得した後、追加の継代培養を行い、毎継代ごとに目的とする量のウイルスを収得し、再度継代を繰り返す方式にて前記（ｄ）段階を進行してもよい。

本発明において、前記ウイルスの量とは、ウイルス力価（詳細には、Ａ型肝炎抗原の含量）、プラークのサイズまたは形態、粒子密度または当該業界に公知となった他の手段によ
って測定されるウイルス量を意味する。

本発明の一実施態様によれば、前述の方法に従って繰り返しで継代を進行した宿主細胞は、３継代以降から細胞病変効果（ＣＰＥ）が観察され始め、４継代または５継代以降から培養液として放出されたウイルスおよび細胞内ウイルスの量が著しく増加することが確認できた。また、培養液として放出されたウイルスおよび細胞内ウイルスの量は、継代が持続しても減少せず維持されることが確認できた。代表例として、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株において感染３継代でウイルス粒子を電子顕微鏡（ＴＥＭ）にて確認し、図５ａ～図５ｃに製造したウイルス粒子の電子顕微鏡の写真を示した。

よって、本発明において、前記（ｄ）段階は、前記（ｃ）段階における継代培養を少なくとも２回以上、好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上行った後に進行するものであってもよいが、これに限定されるものではない。宿主細胞における細胞変性効果が観察された後であってもウイルス量をさらに増幅する場合には、繰り返しで継代培養を行うことにより、目的とするレベルのウイルス量が得られた時点でウイルスを得ることができる。

本発明の方法は、前記（ｄ）段階の以降後に得られたウイルスをワクチンとして利用するために、ウイルスの精製段階およびウイルスの不活化段階をさらに含んでもよい。

本発明において、前記精製は、主要精製方法または主要精製段階、例えば、クロマトグラフィー、または密度勾配超遠心分離精製法を通じて行ってもよい。前記クロマトグラフィーは、レジンイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、メンブレン・クロマトグラフィーなどであってもよい。また、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーを同時に行ってもよく、イオン交換クロマトグラフィーとマルチモード（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）クロマトグラフィーを同時に行ってもよい。

本発明において、前記不活化段階は、ウイルス感染性の完全な除去のために行われ、一般的に、これは化学的または物理的な手段で行われてもよい。化学的不活化は、例えば、ホルムアルデヒドまたはベータプロピオラクトン（ｂｅｔａ－ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ）は、適切な濃度で含まれる不活化試液にてウイルスの不活化処理を行ってもよい。必要に応じて、残りの不活化物質は、以後に中和されてもよい。ホルムアルデヒドで不活化された物質は、例えば、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムを含む中和剤(ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｒ)で中和してもよく、静溶濾過(ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)を通じてリン酸塩バッファー、生理食塩水もしくはウイルスの安全性を維持させるバッファーにて交換されてもよい。

本発明において、前記精製及び不活化段階は、その順序が特に限定されず、精製後に不活化段階を経るか、又は不活化後に精製段階を経てもよい。好ましくは、不活化後に精製段階を経てもよい。

また、本発明は、前記（ａ）乃至（ｄ）段階を含む方法に従って製造されたＡ型肝炎ウイルスを提供する。

本発明の前記方法により製造したＡ型肝炎ウイルスは、ワクチン生産細胞株としての安全性が確保または立証されて産業的に使用されているか、またはＷＨＯを含む各国の保健当局に生物学的医薬品の生産における細胞基質として許可または認証された細胞株における増幅速度が非常に速い。また、宿主細胞内における長期間の継代培養を繰り返しても安定的なウイルス増幅が可能であり、Ａ型肝炎ワクチンの生産に非常に有用に活用できる。

また、本発明は前記ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物を提供する。

本発明において、ワクチンは生ワクチン、弱毒化されたワクチンまたは不活化ワクチンでもよい。

前記「生ワクチン」とは、生きているウイルス活性成分を含むワクチンを意味する。前記「弱毒化」とは、生きているウイルスの病原性を人工的または自然的な要因によって弱めたものであり、体内で疾病を起こすことができず、免疫系のみを刺激して免疫性を誘導することを意味する。ウイルスの弱毒化は、ウイルス粒子熱処理（ｈｅａｔ）、ウイルスへの紫外線照射、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で高次連続継代培養または培養フラスコなどの体外培養容器内の培養細胞におけるウイルス連続継代培養を数回実施することを通して達成することができる。また、弱毒化は、明確な遺伝的変化を作ることによって、例えば、毒性を提供することとして知られているウイルス配列の特定の欠失またはウイルスゲノム内への配列の挿入によって達成することができる。前記「不活化ワクチン」とは、インアクティブ・ワクチンとも呼ばれ、感染性が除去されたウイルスを含むワクチンである。その例として、全ウイルスワクチン（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）および分割ワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）があり、それらは公知の方法により容易な製造が可能である。

本発明のワクチン組成物は、前述のウイルスの他にも、１、２、または３つ以上の免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含んでもよい。用語「免疫補助剤」とは、抗原に対する免疫反応を増大させる化合物または混合物を指す。免疫補助剤は、主に伝達システムとして作用するか、主に免疫調節剤として作用するか、または前記両方の強い特徴を有してもよい。適切な免疫補助剤は、ヒトを含む哺乳動物に使用するのに適したものが含まれる。

本発明のワクチン組成物の有効性を高めるのに適した免疫補助剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。

（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムリン酸塩、硫酸アルミニウムなど）。

（２）水中油型エマルジョン剤型（ムラミルペプチドまたは細菌の細胞壁の成分のような他の特定の免疫刺激剤を含有または含有しない）、

（３）クイル・エイ（Ｑｕｉｌ Ａ）またはスチムロン（ＳＴＩＭＵＬＯＮ^）ＴＭ ＱＳ－２１［Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ］（米国特許第５，０５７，５４０号）のようなサポニンアジュバントが使用されるか、またはそれから生成された粒子；

（４）合成ポリヌクレオチド；

（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など。

特定の実施例において、アルミニウム系の免疫補助剤を使用してもよい。アルミニウム塩免疫補助剤は、アルミニウム沈殿ワクチン（ａｌｕｍ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）であるか、またはアルミニウム吸着ワクチン（ａｌｕｍ－ａｄｓｏｒｂｅｄ
ｖａｃｃｉｎｅ）であってもよい。アルミニウム塩には、アルミナ水和物、酸化アルミ
ニウム、アルミニウム三水和物、リン酸アルミニウムゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、アンポジェル、水酸化アルミニウム（^２）、アルミニウムヒドロキシリン酸塩硫酸塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＡＰＡ）、無定型アルミナなどが含まれるが、これらに限定されない。アルミニウム塩は、２～３週間徐々に抗原を放出する抗原貯蔵所を形成し、非特異的にマクロファージ、補体、先天性免疫メカニズムを活性化させる。

さらに他の特定の実施例において、本発明に開示されたワクチン組成物は、免疫補助剤としてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を指し、よって、前記用語は、他の指示がない限り互換的に使用される。

前記免疫補助剤は、組成物のうち接合体の量と価数によって適宜選択するが、アルミニウム系の免疫補助剤を用いる場合、アルミニウム元素を基準にして組成物の中にアルミニウム元素が０．０１ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬで含まれるように添加されたものであってもよい。好ましくは、組成物の中にアルミニウム元素が０．１ｍｇ／ｍＬ～０．６ｍｇ／ｍＬ、または０．１ｍｇ／ｍＬ～０．４ｍｇ／ｍＬで含まれてもよく、さらに好ましくは、組成物の中にアルミニウム元素が０．１５ｍｇ／ｍＬ～０．３５ｍｇ／ｍＬで含まれてもよい。

本発明のワクチン組成物は、その目的効果を達成する限り、前記組成物を提供する製剤が特に制限されない。

本発明のワクチン組成物は、液体形態（つまり、溶液または懸濁液）または凍結乾燥形態で剤型化することができる。一実施態様において、本発明のワクチン組成物は液体形態、好ましくは水性液体形態である。液体剤型として提供される場合、本発明のワクチン組成物は前記液体剤型が容器（好ましくは、シリンジ）にパッケージング形態で提供され、再分散などの別途のワクチン組成物の再現過程なしの上にすぐ投与することができ、よって、前記液体剤型は、水性媒体の中における再懸濁を必要とする凍結乾燥できた剤型の組成物とは異なり、注射および一定の効果を再現するのに理想的でもある。

本発明のワクチン組成物の剤型化は、当該業界に公知の様々な方法を用いて行うことができる。例えば、Ａ型肝炎ウイルスを生理学的に許容できる担体として剤型化し、組成物を製造することができる。前述のような担体の例には、非限定的に、水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体型ポリエチレングリコール）、ポリソルベート２０およびデキストロース溶液が含まれる。

本明細書は、本発明に開示されたＡ型肝炎ウイルスおよび薬学的に許容できる賦形剤、担体、等張化剤または希釈剤を含むワクチン組成物を提供する。これらの賦形剤、担体または希釈剤の種類は、後述の薬学的組成物の投与経路に応じて使用される種類が当該業界に公知となっている。

一例として、液状製剤に使用される薬学的に許容できる担体としては、水性または非水性溶媒、懸濁液、エマルジョン、油がある。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチルオレートがある。水性溶媒には、水、水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水、バッファー溶液が含まれる。薬学的組成物は、等張性、低張性、または高張性でもよい。しかしながら、注射にて投与する薬学的組成物は、基本的に等張性が好ましい。よって、等張性または高張性が組成物の貯蔵に有利であり得る。薬学的組成物が高張性である場合、投与前に等張性になるように希釈してもよい。等張化剤は、イオン性等張化剤であるか、または非イオン性等張化剤であってもよい。イオ
ン性等張化剤には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどが含まれるが、これに限定されるものではない。非イオン性等張化剤にはソルビトール、グリセロールなどが含まれるが、これに限定されるものではない。好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容できる緩衝液を含む。例えば、薬学的組成物が注射剤である場合、ｐＨ５．０～ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０～ｐＨ８．０、ｐＨ６．８～ｐＨ７．５で緩衝能を有する緩衝液で構成されたものが好ましい。緩衝液は、リン酸カリウム、リン酸一水素ナトリウム、グルタメート、カーボネート、ホウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、グリシン、トリエタノールアミンなどで構成された緩衝液を選択してもよい。

本明細書のワクチン組成物は、緩衝剤、塩、二価カチオン、界面活性剤（特に、非イオン性洗剤）、低温保護物質（例えば、糖）、酸化防止剤（例えば、キレート剤、保存剤）および抗菌剤からなる群から選択される１つ以上のものをさらに含んでもよい。

前記緩衝剤は、当該業界における薬学的組成物、特にワクチン組成物に使用されるものとして知られているものであれば、その種類は特に限定されないが、ヒスチジン、クエン酸、リン酸塩、コハク酸塩、またはＨｅｐｅｓ（４－（２）－ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)として使用できる。これらは任意の化合物の形態で使用してもよく、例えば、リン酸塩はリン酸ナトリウム、リン酸カリウムの形態で使用してもよい。

一実施態様において、本発明のワクチン組成物は塩を含む。前記塩の種類は、当該業界において薬学的組成物、特にワクチン組成物に用いられることとして知られているものであれば、その種類が特に限定されないが、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化ホウ酸塩及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものを使用してもよい。

一実施態様において、本発明のワクチン組成物は界面活性剤を含む。好ましい一実施態様において、非イオン性洗剤が使用される。一実施態様において、前記界面活性剤は、ポリソルベート２０（ツイン（商標）２０）、ポリソルベート４０（ツイン（商標）４０）、ポリソルベート６０（ツイン（商標）６０）、ポリソルベート６５ （ツイン（商標）６５）、ポリソルベート８０（ツイン（商標）８０）、ポリソルベート８５（ツイン（商標）８５）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｎ－１０１、トリトン（商標）Ｘ－１００、オクトキシノール４０、ノノキシノール-９、トリエタノールアミン、トリエタノールアミン・ポリペプチドオリエート、ポリオキシエチレン-６６０・ヒドロキシステアレート（ＰＥＧ‐１５、ソルトール（ Ｓｏｌｕｔｏｌ）Ｈ １５）、ＯＴＧ（ｏｃｔｙｌｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ）、ＯＧ（ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、ＮＭ（ｎｏｎｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、ＬＤＡＯ（ｌａｕｒｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、ＤＤＭ（ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）からなる群から選択される。

本発明において、用語「単一用量」とは、「単位用量」または「単回用量」と同じ意味で使用され、本明細書において、相互互換的に用語を使用してもよい。好ましくは、前記単位用量は、動物、好ましくは哺乳動物、特に、ヒトに単回投与量として適切な単位を指すことができ、それぞれの単位は当業者が目的とする疾病の予防効果または免疫化効果を生成できるよう（特に、同時に深刻な副作用の危険がないように）に計算された抗原性物質を含む。好ましい実施態様において、本発明で提供されるワクチン組成物は単位用量形態で提供されてもよい。

前記用量は、その投与手段または投与経路などの薬学的製剤分野の技術常識に従って当業者が適切な量を設定して使用してもよく、一例として、注射用１回投与量は０．５ｍＬ、
０．６ｍＬ、０．７ｍＬ、０．８ｍＬ 、０．９ｍＬ、または１．０ｍＬでもよいが、これらに限定されない。

前述の本発明のワクチン組成物を使用者に直接提供するためのより便利な手段として、本発明は、前述のワクチン組成物のうちいずれか一つのことで充填された容器を提供する。

前記容器は、当該業界に薬学的組成物またはワクチン組成物を提供するために使用されることとして知られているものであれば、その種類は特に限定されない。一実施態様において、前記容器はプレフィルドシリンジ、バイアル、シリンジ、滅菌注射針（ｓｉｎｇｌｅ
ｕｓｅ ｎｅｅｄｌｅ）、マイクロニードルパッチ、アンプル（ａｍｐｌｅ）、および投与カートリッジからなる群から選択される。

本発明のワクチン組成物の典型的な１回分注射用量は０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ、より好ましくは投与群に応じて０．５ｍＬまたは１．０ｍＬの体積で提供されるものでもよい。

よって、前記定義された通りの容器または注射器は、本発明のワクチン組成物が前記１回分注射用量の体積で充填されてから提供されるものでもよい。一実施態様において、前記容器または注射器は、一例として、０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ体積の本発明において定義されたワクチン組成物のうちいずれか一つのもので充填されてから提供されるものでもよい。

また、本発明は、前述の本発明のワクチン組成物を含むキットを提供する。前記キットの具体的な構成品は、組成物の提供形態に応じて当該業界にその提供形態が知られたことを参考にしてもよい。前述のワクチン組成物で充填された任意の容器が本キットに含まれることは明らかである。

一例として、キットは、本発明のワクチン組成物（液体剤型であっても凍結乾燥製剤であっても）が含まれているか、または含まれていない１つ以上のバイアル、本発明のワクチン組成物が含まれているか、または含まれていない１つ以上の注射器、またはそれぞれを１つ以上を全部含むキットを提供してもよい。

また、本発明のワクチン組成物が液状の剤型として提供される場合には、ワクチン物質がプレフィルドシリンジに含まれ、この場合の物質は患者投与のための物質となる。プレフィルドシリンジの入口に滅菌注射針を装着して患者に投与してもよい。

また、前記キットは使用者に提供される使用説明書を含んでもよい。

本発明において、前記キットは、ワクチン組成物を単回接種スケジュールのための用量として提供してもよく、また、多回（分割）接種スケジュールのための用量で提供してもよい。

一実施態様において、本発明に開示されるワクチン組成物は薬剤（薬学的組成物）として使用するためのものである。本発明に開示されたワクチン組成物は、対象における細菌感染、疾病または状態の予防、治療または改善のための様々な治療学的または予防学的な方法にて薬学的組成物として使用することができる。特に、本発明に開示されたワクチン組成物は、対象におけるＡ型肝炎ウイルスによる感染、疾病または状態の予防、治療または改善のために使用してもよい。

また、本発明は、前記本発明のワクチン組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与
することを特徴とするＡ型肝炎を予防するためのワクチン化方法を提供する。

本発明において、前記「有効量」とは、個体に投与した場合、Ａ型肝炎ウイルスの死滅またはＡ型肝炎ウイルスに関連の感染、疾患または状態の改善、治療、予防効果を示す量を示す。

一実施態様において、前記有効量は免疫学的有効量である。免疫学的有効量とは、当業者に公知の標準分析法で測定した場合、細胞性（Ｔ細胞）または体液性（Ｂ細胞または抗体）反応のうちいずれか一つの免疫応答を誘発するのに十分な抗原またはワクチンの量を示す。免疫原としての抗原、例えば、ウイルス抗原またはそのワクチンによって誘発された抗原特異的抗血清（ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）または抗原中和血清のレベルを測定することを通じて、またはウイルス抗原によって刺激されたＴ細胞が分泌するサイトカインの検出を通じて測定してもよい。また、免疫応答の保護レベルは、免疫化された個体における抗原に由来のウイルス感染の減少または感染によって発病する疾病の予防を確認することによって測定することができる。

一実施態様において、前記有効量は予防的有効量である。本発明における用語「予防」とは、疾患または疾病を有すると診断されたことはないが、そのような疾患または疾病にかかりやすい傾向がある個体における疾患または疾病の発生を抑制することを意味する。よって、本明細書における用語「予防的有効量」は、前記薬理学的効果を達成するのに十分な量を意味する。

具体的な実施態様において、本発明に開示されたワクチン組成物は、対象におけるＡ型肝炎を予防するために使用してもよい。よって、本発明は、前述の本発明のワクチン組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とするＡ型肝炎を予防する方法を提供する。

本発明において、用語「個体」とは、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」と相互互換的に用語を使用してもよく、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含み、猫、羊、豚、馬、牛または犬などの哺乳動物であってもよく、動物に由来の細胞、組織、器官などであってもよい。前記個体は、前記効果を必要とする患者でもよい。

本発明の一実施態様において、本発明に開示された免疫が低下された個体は、任意の男性のヒトまたは女性のヒトである。

本発明のワクチン組成物は、体内においてその目的とする効果を達成する限り、その投与経路が特に制限されないが、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、直腸内、全身または粘膜経路を通じて前記ワクチン組成物を投与することにより、Ａ型肝炎ウイルス感染に敏感なヒトを保護または治療するのに使用してもよい。

本発明のワクチン組成物は、１回分用量または多回分用量で提供してもよい。一部の場合、本発明によるワクチン組成物の１回分用量のほどに少量が必要であるが、一部の状況、例えば、より大きな免疫不全の状態下では、第２、第３または第４用量が提供されてもよい。初期ワクチン化に連れて、対象は１回または数回（複数回）のさらなる免疫化を適切な間隔で行ってもよい。

また、本発明は前記ワクチン組成物を含むキットを提供する。
また、本発明はワクチン組成物を充填したプレフィルドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）を提供する。

前記キットとプレフィルドシリンジは、前記ＨＡＶワクチン組成物および薬学的に許容できる担体を含んでもよい。また、前記キットとプレフィルドシリンジは、ＨＡＶ感染を予防するために遵守するべき基本的な事項（投与時の注意事項、投与サイクル、保管温度、有効期間など）の指針をさらに含んでもよい。

本発明は、Ａ型肝炎ワクチンを製造するための前記ウイルスの使用を提供する。

本発明は、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物のＡ型肝炎予防の使用を提供する。

本発明は、前記肝炎ウイルスを有効成分として含むワクチン組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含むＡ型肝炎予防方法を提供する。

本明細書において、用語「～を含む」とは、「含有する」または「～を特徴とする」と同じ意味で使用され、本発明による組成物または方法において、具体的に言及されていない追加の構成成分または方法の段階などを排除しない。また、用語「～からなる／～で構成される」とは、別途の記載がない追加の要素、段階、または成分などを除外することを意味する。用語「必須的に～で構成される」とは、組成物または方法の範囲において、記載の材料または段階に加えてその基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない物質または段階などを含み得ることを意味する。

本発明が提供するＡ型肝炎ウイルスの製造方法によれば、短期間内に安定して増幅するＡ型肝炎ウイルスを製造することができ、Ａ型肝炎ワクチンウイルス原料物質として非常に有用に活用することができる。

図１は、本発明の方法によるワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を生産する方法を示す図である。 ＨＡＶ遺伝子を含むベクターで形質転換された宿主細胞からシードウイルスを収得し、前記シードウイルスを同一の宿主細胞に感染させて継代培養することによりＨＡＶを迅速かつ安定的に増幅することができる。 図２は、本発明において、シードウイルスを製造するために宿主細胞の形質転換に用いたベクターの開裂マップを示す図である。 、 図３ａおよび図３ｂは、本発明の方法によるＭＡ１０４細胞およびＶｅｒｏ細胞でＨＡＶを製造する方法（図３ａ）および無血清適応Ｖｅｒｏ細胞（ＳＦ－Ｖｅｒｏ）でＨＡＶを製造する方法（図３ｂ）を段階別で示した図である。 図４は、従来技術におけるＨＡＶの製造方法を段階的に示す図である。 、 、 図５ａ～図５ｃは、本発明の方法により製造したシードウイルスをＭＡ１０４（図５ａ）、Ｖｅｒｏ（図５ｂ）、ＳＦ－Ｖｅｒｏ（図５ｃ）に感染させた後、３継代（Ｐ３）に分離したウイルスを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した図である。 図６は、本発明の図３ａおよび図３ｂの過程のうち、Ｐ０以降のウイルスのレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）のためのブラインド・パサージュ段階であるパサージュ １（Ｐ１）で、パサージュ ５（Ｐ５）で確認できたウイルス含量（力価）を確認した結果である。Ｐ１～Ｐ５の各継代細胞溶解物および培養上澄液におけるウイルスの力価を吸光度値で測定した。 、 図７ａ及び図７ｂは、本発明の図３ａ及び図３ｂの手順のｐ６で分離された細胞溶解物試料から確認できたウイルスの含量（力価）を定量分析して示した結果であり（図７ａ）、Ｐ６継代培養で作られたシードウイルスをＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞に感染させた後、細胞内の感染したウイルスを免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ，ＩＦＡ）で検出した結果を一緒に示した（図７ｂ）。 図８は、通常の方法によって商業的に購買可能なＨＡＶを宿主細胞（ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ、ＳＦ－Ｖｅｒｏ）に感染させるか（図８の「Ａ」） 、図３ａおよび図３ｂの方法によって製造されたシードウイルスを同一の宿主細胞に感染させた後（図８の「Ｂ」）、連続的にウイルス感染継代１から６の継代まで行った後、ウイルス含量を測定したものである。ＥＬＩＳＡを介して６回の各継代で回収した感染された宿主細胞溶解物および培養上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）からウイルスの力価を吸光度で測定し、「Ａ」と「Ｂ」の宿主細胞におけるウイルス増殖を相対的に比較した結果である。 、 図９ａ及び図９ｂは、図３ｂの方法により製造されたシードウイルスをＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株とＭＲＣ－５細胞株に感染した後、ウイルスの力価を上澄液と細胞で１０回にわたって確認した結果である。 図１０は、Ｔフラスコ（１７５ｃｍ^２）において、ウイルス培養日数（ｄａｙｓ）によるウイルスの力価（抗原含量）を確認したことである。発明のシードウイルスの感染後のウイルス成長（ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｗｔｈ）様相を確認するために、３～４日間隔で感染試料を回収し、上澄液と細胞溶解物からウイルスの力価を測定して示した。 図１１は、通常の方法により商業的に購入可能なＨＡＶをセルファクトリー１０（ＣＦ１０）の培養容器の宿主細胞に感染させるか（Ａ）、または本発明の方法により製造されたシードウイルスを宿主細胞（ＭＡ１０４、ＶｅｒｏまたはＳＦ－Ｖｅｒｏ）に感染させ（Ｂ）、Ｐ１１継代の細胞溶解物でウイルスの力価を確認した結果である。 図１２は、本発明の方法により製造されたＨＡＶの不活化抗原または商業的ＨＡＶワクチン（ハブリックス、ＧＳＫ）のそれぞれを実験動物に接種する前（５日目（Ｄａｙ-５））、２週間間隔で２回目接種した後（２８日目（Ｄａｙ２８））、および３回目接種後（４２日目（Ｄａｙ４２））、動物の血液で分析した抗ＨＡＶ血清の力価を示す図である。ＳＫ１４４およびＳＫ７２は、本発明のウイルスを精製後に不活化し、それぞれ１４４ ＥＬ．Ｕ (３.０ ＩＵ)、７２ ＥＬ．Ｕ(１.５ ＩＵ)を投与したものであり、ＨＶＲ１４４、ＨＶＲ７２は商用製品であるハブリックス（Ｈａｖｒｉｘ）を１４４ ＥＬ．Ｕ、７２ ＥＬ．Ｕで投与したグループである。試験の陰性対照として、正常（Ｎｏｒｍａｌ）群はウイルス抗原の代わりに生理食塩水を投与し、アルム（Ａｌｕｍ）群は抗原を除いたアルム・アジュバント（ａｌｕｍ ａｄｊｕｖａｎｔ）のみを投与した。 図１３は、前記図１２による実験を進行する過程のうち、各動物群の平均体重を観察し、抗原接種による異常反応の有無を観察した図である。

以下、本発明を以下の実施例を通して詳細に説明する。但し、以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明がこれらによって限定されるものではない。

実験方法
本発明で行った実験方法を図１にまとめて示した。

１. 遺伝子の合成及びベクターの制作
本発明において、遺伝子の合成に用いたＨＡＶ遺伝子の塩基配列は、配列番号１で示した。 ＨＡＶ遺伝子は機能的に５－末端ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ)、ポリプロティン遺伝子、３'－末端ＵＴＲの順に塩基配列が構成される。ＨＡＶ遺伝子の５'－末端方向にＣＭＶプロモーター-Ｔ７プロモーター(配列番号２)、マルチクローニングサイト(ＭＣＳ、配列番号３)、ＨＨ(ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）) リボザイム(配列番号４)の塩基配列を含み、３－末端方向にはヘパチチスデルタウイルス（
ＨＤＶ）リボザイム（配列番号５）、ＭＣＳ（配列番号６）、ｂＧＨ ｐｏｌｙ Ａ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（配列番号７）の塩基配列が位置する。配列番号１の塩基配列からなるＨＡＶ遺伝子およびプロモーターなどの他の機能的領域を全て含む塩基配列は配列番号８で示した。

前記合成された配列番号８のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を、ＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）およびＳａｌＩ （ＧＴＣＧＡＣ）制限酵素を用いてｐＵＣ５７ベクターにクローニングした。完成したプラスミド構造マップ（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｐ）を図２に示し、ＨＡＶ発現ベクターと命名した。

２. ＨＡＶ発現ベクターを用いた形質転換
６ウェル・培養プレートにそれぞれＭＡ１０４ （ＥＣＡＣＣ，８５１０２９１８）、Ｖｅｒｏ （ＷＨＯ）（ＥＣＡＣＣ， ８８０２０４０１）細胞株を２×１０^５細胞／ウェル／２ｍＬの条件で１０％および５％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）培地にそれぞれ準備し、Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｖｅｒｏ細胞（Ｖｅｒｏ（ＷＨＯ）に由来の無血清適応細胞、ＳＦ－Ｖｅｒｏ）は、４×１０^５細胞／ウェル／２ｍＬ条件で無血清のＥＭＥＭ培地に調製し、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターで培養した。細胞の準備に用いた培地は、各細胞の培養培地となる。

１８～２４時間後、培養プレートから培養培地を除去し、２ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、培養培地をウェルに２ｍＬずつ添加した。ＨＡＶ発現ベクター（プラスミド）１．０μｇ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ－Ｐｌｕｓ（ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３５μＬ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ）９６０μＬをコニカルチューブで混合し、室温に１５分間放置した。混合液を２００μＬずつプレートウェルに添加し、５％ＣＯ_２、３７℃インキュベーターで培養した。２４時間後、全ての細胞の上澄液を除去し、ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞株は２％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ（２％ＦＢＳ－ＥＭＥＭ）で、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株は無血清のＥＭＥＭ培地（ＳＦ－ＥＭＥＭ）２ｍＬで交換し、３５℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３週間培養した。培養したＭＡ１０４、ＶｅｒｏおよびＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞を５００μＬのＥＭＥＭ培地に回収して浮遊させ、フリーズ／タウイングを３回行った。破砕され残った細胞片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去するために１０，０００ｇで１分間遠心分離を行い、上澄液のみを集め直し、ウイルスＰ０（シードウイルス）とした。

３. ウイルスの分離（Ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｃｕｅ）のための盲目継代（Ｂｌｉｎｄ ｐａｓｓａｇｅ）
Ｐ０ウイルスを用いて最初のブラインド・パサージュであるＰ１で感染継代進行の場合は、Ｔ２５フラスコにＭＡ１０４およびＶｅｒｏ １×１０^６細胞／５ｍＬ、ＳＦ－Ｖｅｒｏ ５×１０^６細胞／５ｍＬで感染する２４時間前に準備した。Ｐ１－Ｐ４感染継代時にはＴ２５フラスコにＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞は７×１０^５細胞／５ｍＬの濃度で、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞は１×１０^６細胞／５ｍＬ、培養培地で３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。２４時間後、準備した細胞から培養培地を除去し、ＤＰＢＳを５ｍＬずつ添加して感染の直前に２回洗浄した。Ｐ５およびＰ６感染継代では、Ｐ４からの感染継代の進行する１日前に、Ｔ１７５フラスコにＭＡ１０４およびＶｅｒｏ細胞を５×１０^６細胞／３０ｍＬ、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞は８×１０^６細胞／３０ｍＬで準備し、感染の直前に用意した細胞から同様に培地を除去し、３０ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。

２％ ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地はＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞株でウイルス感染培地（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）であり、ＦＢＳを含まないＥＭＥＭはＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株の感染培地として使用した。Ｐ１－Ｐ４感染継代は各細胞の感染培地５ｍＬを、Ｐ５－Ｐ６の感染継代は感染培地３５ｍＬを使用した。Ｐ６継代においては、５つのＴ１７
５フラスコを用いて感染継代を行った。用意したＰ０の試料を用意の細胞に添加し、３５℃、５％ＣＯ_２で１時間放置した後、感染培地５ｍＬ（３５ｍＬ）を添加した。

Ｐ０試料の感染後の２１日間、７日間隔で培養培地を交換し、感染細胞を維持した。感染後の２１日目に細胞成分（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を回収し、Ｐ０の回収時と同様に凍結（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）／融氷（ｔｈａｗｉｎｇ）（－７０℃／３７℃）を３回行い、細胞片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去して遠心分離した後、上澄液だけを集めてこれをウイルス培養液とし、パサージュ１（Ｐ１）とした。Ｐ０からＰ１に進行の際には毎週培地交換を行ったが、Ｐ１からＰ６継代の時には感染後から７日目にのみ培地交換を行った。２０-２１日を１回の継代期間として総６回の継代を連続的に行った。上述の細胞感染および継代進行の過程を図３ａおよび図３ｂに示した。

１回の継代が終了した後、ウイルスが感染したフラスコから培養上澄液と細胞溶解物をそれぞれ回収した。細胞溶解物の回収時、上澄液を除去したフラスコにトリプシン－Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｌｏｎｚａ）溶液を２ｍＬ添加して洗浄後除去し、再びトリプシン－Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を２ｍＬ添加して３７℃インキュベーターで５分間放置した後、細胞を剥がし出した。細胞を浮遊させた２ｍＬのトリプシン－Ｖｅｒｓｅｎｅ懸濁液をコニカルチューブに移し、遠心分離してセルペレット状態に集めた。

細胞溶解物（ペレット）にＥＭＥＭ １ｍＬ（Ｔ２５，Ｐ１－Ｐ４）または５ｍＬ（Ｔ１７５，Ｐ５）を添加して凍結／融氷を３回行って遠心分離を行い、以後に細胞片を除去した上澄液（細胞溶解物試料）で用意した。回収した各感染継代の培養上澄液と遠心分離後、細胞溶解物試料から２００μＬずつウイルスの力価分析用にマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）チューブに移し、分析するまで冷凍保存した。分析用を除いた残りの細胞溶解物試料をすべて次回の感染に使用した。

Ｐ１－Ｐ５はＥＬＩＳＡ定性分析で力価を測定した。パサージュ６においては、培養上澄液を除去し、感染細胞を全部集め、無血清のＥＭＥＭ ５ｍｌを浮遊した後、５回の凍結―融氷を行った後に遠心分離で細胞片を除去した後、上澄液のみを回収してシードウイルスで保存した。ＥＬＩＳＡ定性分析によりＰ６ウイルスの力価を測定した。

４. ブラインド・パサージュ過程の細胞変性効果の確認
ウイルス感染による宿主細胞の細胞変性（ＣＰＥ）は顕微鏡検鏡で行った。ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞株においては、Ｐ４継代までウイルスによる細胞変性効果は見られなかったが、Ｐ５継代から細胞片及び分離などのウイルスによるＣＰＥが確認され、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株においてはＰ３継代進行後に軽度（ｍｉｌｄ）のＣＰＥを示した。

５. ＨＡＶ抗原分析ＥＬＩＳＡ
ウイルスのブラインド・パサージュのうちに収集された試料中のＨＡＶ抗原測定は、定性分析および定量分析によって測定した。定性分析はＨＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより吸光度(450nm)で抗原を確認し、定量分析は標準品（Iｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＡＶ ＢＲＰ，１３５０ ＩＵ／ｍＬ，Ｙ０００１１９２，ＥＤＱＭ）を適用して標準曲線を作成、検体内のＨＡＶウイルスの力価（抗原の含量）を測定した。分析用キットＨＡＶ-Ａｎｔｉｇｅｎ ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ、Ｅ１２）を用い、ウイルスの力価単位は標準品に応じてＩＵ／ｍＬで表記した。使用した商業用Ａ型肝炎ウイルス株（ＡＴＣＣ
ＶＲ－１４０２）も同様の方法で定量した。

６. 透過電子顕微鏡法(ＴＥＭ)
図３ａ及び図３ｂのＰ６継代培養後に回収した細胞溶解物の一部を用い、透過電子顕微鏡像を観察した。ｆｏｒｍｖａｒ-ｃａｒｂｏｎ ｃｏａｔｅｄ ＥＭ ｇｒｉｄを用いて2%
酢酸ウラにルで１５秒間陰性染色（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行い、透過電子顕微鏡(ＪＥＭ－１０１１, ＪＥＯＬ)で観察し、Cａｍｅｒａ－Mｅｇａｖｉｅｗ ＩＩＩ Ｉｍａｇｉｎｇ装置でウイルス粒子を確認した。

７. 免疫蛍光アッセイ (ＩＦＡ)
２４ウェル培養プレートに５×１０^３細胞／ウェル／０．５ｍＬの条件でＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞を、８×１０^３細胞／ウェル／０．５ｍＬの濃度でＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞を各培養培地に浮遊させて調製し、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。培養された細胞から培地を除去し、３００μＬ／ウェルでＤＰＢＳを添加して洗浄した。図３で製造したシードウイルスを各細胞の感染培地で希釈して０．１ＩＵ／ウェルの濃度で細胞に処理し、感染培地０．５ｍＬずつ各ウェルに添加し、３５℃５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。感染日から７日目に細胞の上澄液を全て除去し、０．５ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞に残ったＤＰＢＳを全て除去し、３．７％ホルマルデヒド溶液を０．２ｍＬ添加した後、室温で３０分間放置した。ホルマルデヒド溶液を除去し、前述と同様にＤＰＢＳで３回洗浄した。０．２％トリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）バッファー溶液を２５０μＬ／ウェルで添加し、室温で５分間放置した後、０．５ｍＬのＤＰＢＳで３回洗浄した。１次抗体を（Ａｎｔｉ－ＨＡＶ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｇ，Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ）１／５００でＰＢＳに希釈し、２５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。その後、２次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１／４０００に希釈し、１次抗体の処理容量と同様に細胞に添加した後、室温で１時間放置した後、ＤＰＢＳで５回洗浄して除去した。細胞に２５０μＬ／ウェルでＤＰＢＳを添加し、蛍光顕微鏡（Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１００ｘ，Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｓ２－ＦＬ，Ｎｉｋｏｎ）で撮影した。

８.シードウイルス感染の確認（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）
図３ａおよび図３ｂで製造したシードウイルスと商業用Ａ型肝炎ウイルス株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１４０２）との感染パターンを比較した。このために、本特許に記載のＥＬＩＳＡで商業用ウイルス株のウイルスの力価（含量）を定量した。ウイルス感染の２４時間前にＴ７５フラスコにＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ細胞株は２×１０^６細胞で、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株は３．５×１０^６細胞で１２ｍＬの培地に用意した。シードウイルスおよび商業用ウイルス株を２．０ＩＵずつ１ｍＬ感染培地に浮遊させ、ＤＰＢＳ １０ｍＬで洗浄して用意したＴ７５フラスコの各細胞に添加した。３５℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１時間反応した後、感染培地１１ｍＬを添加して培養した。２１日間培養し、感染後の７日目には培地を新しくした感染培地と交換した。２１日間培養の１回のウイルス感染継代を総１０回進行し、ウイルスの含量分析のための試料の回収および連続的感染継代は、ブラインド・パサージュと同様であり、細胞溶解物試料の収集時に５ｍＬの血清を含まないＥＭＥＭに最終的に浮遊させて次の感染継代のためのサンプルとして使用した。

また、Ｔ７５フラスコに総細胞数が８×１０^６細胞／１２ｍＬであるの上にＭＲＣ－５（ＥＣＡＣＣ，０５０１１８０２）細胞株を用意し、ＳＦ－Ｖｅｒｏは３．５×１０^６細胞／１２ｍＬの細胞濃度で用意し、図３ｂで製造したシードウイルスを上述のＴ７５フラスコ感染と同じ条件で総６回の連続的感染継代を行った。各ウイルス感染継代において回収した一部の上澄液および一部の細胞溶解物の試料内のウイルスの力価（含量）を測定および比較した。ＭＲＣ－５細胞株の培養培地はＥＭＥＭ培地内のＦＢＳ１０％、感染培地は２％濃度で含まれた状態で使用した。ウイルス感染後の上澄液および細胞回収の方法は、凍結／融氷を繰り返すこととして同じことであり、詳細な方法は、ブラインド・パサージュの遂行方法に記載のことと同様である。

９. シードウイルスの成長（Ｇｒｏｗｔｈ）確認試験
感染の１日前Ｔ１７５フラスコにＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞を２×１０^７細胞／３５ｍＬでシー
ド（ｓｅｅｄ）後、３７℃ 、５％ＣＯ_２条件で培養した。同じ細胞密度のＴ１７５フラスコを全て９つ用意し、８つのフラスコはウイルス感染、残りは正常細胞対照群とした。感染当日、全てのフラスコの培養培地を除去した後、各フラスコにＤＰＢＳ３０ｍＬを用いて細胞を洗浄した。培養培地３５ｍＬにＳＦ－Ｖｅｒｏに由来のシードウイルス １５ＩＵを含むウイルス感染液を製造し、洗浄したＴ１７５フラスコに添加した。総８個のフラスコに同様に１５ＩＵが感染させるようにした。感染させた細胞を３５℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養しながら感染後の３、７、１０、１４、１７、２１、２４、２８日目（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｄｐｉ）にそれぞれ上澄液と細胞溶解物を回収してウイルスの力価（含量）を測定した。

１０. シードウイルスのセルファクトリーの培養
各細胞に由来のシードウイルスを同じ方法でＴ１７５フラスコで追加感染継代を進行し、１１継代（ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ）および１２継代（ＳＦ－Ｖｅｒｏ）まで進行してウイルスの細胞適応度を高め、その過程の感染細胞を収集した。追加感染継代の方法は、Ｐ６で収穫した最初のシードウイルスをＴ１７５フラスコで２回感染培養してＰ８継代のウイルスを得て、Ｐ９への感染時にはＰ８で得たウイルス試料を定量して１５ ＩＵ／Ｔ１７５濃度で感染した。同様に、Ｐ１１およびＰ１２まで感染と回収を繰り返しつつ継代した。シードウイルスのＰ１１（ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ）およびＰ１２（ＳＦ－Ｖｅｒｏ）継代ウイルスは定量し、５００ ＩＵに相当するウイルスを別途のｃｒｙｏｖｉａｌに分注した。商業用ウイルスは、図６の６回の継代後に収得した商業用ウイルス試料を用いて、上述の追加感染継代と同様にＰ１１（ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ）、Ｐ１２（ＳＦ－Ｖｅｒｏ）で感染継代してウイルスを得た。追加の感染継代における上澄液は回収せず、感染細胞のみを回収し、Ｓｏｎｉｆｉｅｒで４０秒間細胞を破砕し、遠心分離した後、上澄液を回収して使用した。シードウイルスおよび商業用ウイルスをそれぞれ５００ＩＵ同量でＣＦ１０（６３２０ｃｍ^２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の宿主細胞の感染に使用した。ＣＦ１０における感染方法は以下の通りである。ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞を培養培地２．０×１０^８細胞／１．５Ｌで用意した。１６～１８時間後に培養培地を除去し、細胞をＤＰＢＳ ５００ｍＬで１回洗浄して除去した。ＥＭＥＭ培地２００ｍＬに用意した５００ ＩＵのウイルスを添加してウイルス感染液を製造し、洗浄したＣＦ１０に添加した。３５℃５％ＣＯ_２条件で６０分間培養し、１５分毎にフラスコを傾けて、ウイルス希釈液が細胞に均一に吸着できるようにした。ウイルスの吸着後に各細胞の感染培地を（ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏ：２％ＦＢＳ－ＥＭＥＭ、ＳＦ－Ｖｅｒｏ：ＳＦ－ＥＭＥＭ）１．５Ｌ添加し、３５℃５％ＣＯ_２条件で２１日間培養した。ウイルス培養７日目に、新たな感染培地で培地交換した。

感染後のＣＦ１０へのウイルス感染培養の収穫の手順は以下の通りである。感染したＣＦ１０容器から上層培養液を除去した。ＣＦ１０をＤＰＢＳ ５００ｍＬで洗浄後除去し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）２００ｍＬを添加し、３～５分間３７℃のインキュベーターで反応させた。血清を含まないＥＭＥＭ２００ｍＬを添加し、約４００ｍＬの容量の感染細胞懸濁液で２Ｌのスクエアボトル（Ｓｑｕａｒｅ Ｂｏｔｔｌｅ）に回収した。回収した懸濁液を５０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄液を捨て、細胞ペレットのみを回収した。細胞ペレットにリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１００ｍＬを添加し浮遊させた後、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ＳＦＸ５５０、Ｂｒａｎｓｏｎ）で音波処理して（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ４０％、２分）細胞破砕した。約１００ｍＬの細胞破砕液を遠心分離（５０００ｇ、Ａｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ、ＳＸ４７５０Ａ）し、上澄液を滅菌した新しい１Ｌスクエアボトルに移した。遠心分離後、上清１００ｍＬのうちの一部の１００μＬを保管し、ＥＬＩＳＡ分析に使用した。４００ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を加えて精製プロセスに使用した。ＭＡ１０４、Ｖｅｒｏに由来の細胞破砕液は別途に保管し、動物試験投与のための抗原精製はＳＦ－Ｖｅｒｏで培養したウイルス感染細胞の破砕液を用いた。

１１.ウイルスの精製及び不活成化
回収した細胞破砕液をカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ３、５μｍ 、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）およびデプスフィルター（Ｓｕｐｒａ ５０、０５０ＰＤＨ４、ＰＡＬＬ）を用いて順次精製した。精製された収穫物は、１００ｋＤａ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＵＦ／ＤＦ）フィルター（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ(R)２ Ｍｉｎｉ，Ｐ２Ｂ１００Ａ０１，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に緩衝交換し、濾過および１０倍濃縮後のベンゾン１単位）処理した。リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いて、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を１０ｍＬ／分の速度で行った。約２００ｍＬの画分を集め、１０ｋＤａのＵＦ／ＤＦフィルター（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ （登録商標）２ミニ、Ｐ２Ｂ０１０Ａ０１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に緩衝交換し、５倍濃縮した。濃縮物は、ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１ｍＬ／分の速度でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。

ＳＥＣを行った後、約４０ｍＬの抗原画分を集め、１０ｋＤａ（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ （登録商標）２Ｍｉｎｉ、Ｐ２Ｂ０１０Ａ０１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを用いて８０倍濃縮して精製ＨＡＶ抗原を収得した。ウイルス不活化のために収得した抗原に２７０～３７０μｇ／ｍＬの濃度でホルムアルデヒドを添加して３７℃で５日間反応させた。その後、１０ｋＤａフィルターで分解ダイアフィルトレーションし、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）Ｇｏｌｄ）で除菌濾過した。動物試験の各投与回数の投与２４時間前、吸着バッファー（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．１～８．０）にアリウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を浮遊させて抗原と混合した後、４℃で１６時間以上攪拌した。

１２. 動物実験
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢、群当たり１０個体）に前記Ａｌｕｍに吸着の抗原を投与した。動物試験の対照群として、商業用ＨＡＶワクチン（Ｈａｂｒｉｃｓ、ＧＳＫ）を用い、マウスに投与した抗原（３．０ＩＵおよび１．５ＩＵ）および対照群の用量（１４４ＥＬ．Ｕおよび７２ＥＬ．Ｕ、ＥＬＩＳＡ Ｕｎｉｔ）は商業用ワクチンに提示されたヒト（成人および小児）投与量の１／１０に設定した。投与抗原の用量設定は、対照群（商業用ワクチン）に結合しているａｌｕｍ塩を脱着させ、抗原のみに分離した後、特許の抗原とその量を一緒に測定及び比較して用量を同じレベルに合わせた。動物試験において、抗原は筋肉（ＩＭ、ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）にて２週間隔で３回投与した。投与後、マウス全血から血清を分離し、Ａｎｔｉ－Ｔｏｔａｌ ＨＡＶ抗体の価を測定した。標準対照物質として９７／６４６（ＮＩＢＳＣ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ａｎｔｉ－Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ， Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を設定し、測定時にＡｎｔｉ－ＨＡＶ ＥＬＩＳＡ （Ｅ１０， Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ），またはＡｎｔｉ－Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ｖｉｒｕｓ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（４６６０， ＡＬＰＨＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用した。

実験結果
本発明において、ＨＡＶ遺伝子を発現できるように遺伝子発現カセットを設計し、当該カセットを合成してカセット発現ベクターを確保した。合成ベースのＨＡＶ発現ベクターを３種類の細胞株(ＭＡ１０４,Ｖｅｒｏ,ＳＦ－Ｖｅｒｏ)に形質転換し、遺伝子が形質転換された細胞(ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ)を破砕して同一の細胞に感染させ、ウイルス粒子
が確認されるまで継代（ブラインド・パサージュまたはウイルス感染・パサージュ）を行ってウイルスを分離した。これにより、一定のウイルス量を確認し、今後のワクチンの製造及び研究に活用可能なシードウイルスで製造した。シードウイルスは６回の継代培養のみで製造され、製造後にマイコプラズマおよび不稔性試験を行い、無菌状態で製造できたことを確認した。

従来の商業用ワクチンの場合、ワクチン生産に使用するウイルス（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ ｌｏｔ）を製造するために、１次ＡＧＭＫの培養および血清を必須に要するＭＲＣ－５で継代培養してウイルスを樹立する数回目のウイルスの細胞適応（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）過程を行うが、本発明においてはこれとは異なり、遺伝子発現ベクターを用いてウイルスを分離する方法を考案、適用した。考案された方法で製造されたシードウイルスのうち、無血清培養のワクチン生産細胞株（ＳＦ－Ｖｅｒｏ）において製造したシードウイルス（９２６ ＩＵ／ｍＬ）はワクチン用細胞株に由来のウイルスであり、商業的にワクチンを開発する時の適用可能性が高いと見做される。当該シードウイルスを増幅、精製、感染性の除去をする不活化過程を経た後、アジュバントの吸着後にマウスに投与し、商業用ワクチンに対比の特許の投与抗原に対する抗血清価が類似であることを確認した。

前述のベクターを用いたウイルスの製造方法及びウイルスの制作に用いたＨＡＶ発現カセットを図式化し、それぞれ図１及び図２に記載した。図１の過程は、ＭＡ１０４およびＶｅｒｏ細胞株、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株で行った２つの培養過程を列挙し、形質転換、ブラインド・パサージュの過程を所要期間とともに図３ａおよび図３ｂに示した。Ｐ１からＰ５までの感染継代を行った後、各継代において回収し測定した上澄液と細胞溶解物内のウイルスの力価（含量）を図６の通りに確認した。形質転換後に数回の継代が過ぎなかったにもかかわらず、ＥＬＩＳＡ検出相のウイルスが確認でき、上澄液および細胞溶解物試料において安定的にウイルスが増幅されたことを確認した。相対的ウイルス検出量は、上澄液に比べて細胞溶解物で高いことが確認されており、これは非臨床的ＨＡＶの特徴を反映したことと判断できる。次回分であるＰ６継代培養が終了した直後、細胞溶解物からウイルス粒子を電子顕微鏡で確認し（図５ａ～図５ｃ）、ウイルスの含量を定量して２３７１
ＩＵ／ｍＬ（ＭＡ１０４）、５８６ＩＵ／ｍＬ（Ｖｅｒｏ）、９２６ＩＵ／ｍＬ（ＳＦ－Ｖｅｒｏ）で同定した（図７ａ）。ＭＡ１０４細胞株は、Ａ型肝炎ウイルスのように胃腸管で増殖するウイルス（ｅｎｔｅｒｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ）の感染研究に活用された点を参照して（ＪＨ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、当該細胞株から研究用シードウイルスを増幅して確保するために使用された。ＶｅｒｏおよびＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株はその起源が同一であるが、血清の有無条件によりそのウイルスの培養条件が異なる。特に、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞は、無血清条件においても、発明のウイルスがスムーズに増幅され得ることを確認するために一緒に選択した。シードウイルスの含量は、無血清培養条件で培養および分離されたＳＦ－Ｖｅｒｏに由来のシードウイルスがＶｅｒｏ細胞に由来のシードウイルスに対して相対的に高い含量であることが確認できた。製造されたシードウイルスを２４ウェルプレートで０．１ＩＵ／ウェルの含量で感染させ、７日目に免疫蛍光反応でウイルスの感染性を確認した（図７ｂ）。

図７ａの製造した３種類のシードウイルスと商業用ウイルス（ＡＴＣＣ ｓｔｏｃｋ、２２７ＩＵ／ｍＬ）を「実験方法８．シードウイルス感染の確認方法」に述べたように、２．０ ＩＵを感染し、発明のシードウイルスと商業用ウイルスが同様の細胞株に感染した場合の増幅度を比較した。総６回の連続的感染継代を行った感染培養の上澄液と細胞溶解物からウイルスを検出し、商業用ウイルス株（図８の「Ａ」）に比べて、発明のシードウイルス（図８の「Ｂ」）がウイルスの力価が安定的でありつつ相対的に高く測定されることを確認した（図８）。

また、従来のＡ型肝炎ワクチンの生産細胞として使用されており、培養時に血清を要求するＭＲＣ－５細胞株と、本特許におけるウイルスの製造および感染に使用した無血清培養のワクチン生産細胞であるＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株を感染細胞とし、図３ｂのＳＦ－Ｖｅｒｏで製造したシードウイルスを２．０ ＩＵ感染して比較した。総１０回の継代の進行中に上澄液と細胞溶解物に対してＥＬＩＳＡ分析を行ってウイルスの力価（含量）を吸光度値で相対比較した結果、ＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞におけるウイルスの生産は感染後の１回目の継代からウイルスが検出され始め、継代２回目からは、細胞溶解物で測定されたウイルスの力価がＥＬＩＳＡ反応で一定に検出されるパターンを示した（図９ａ）。ＭＲＣ－５における継代では、回収した細胞溶解物試料におけるウイルスの検出が類似のレベルで測定された継代回次があるが、一定のウイルスの力価の増加パターンを示さなかった。特に、ワクチン生産用のＳＦ－Ｖｅｒｏにおける感染継代の結果とは対照的に、上澄液におけるウイルスの検出は低かった（図９ｂ）。これにより、発明の方法にて製造したシードウイルスがＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞におけるウイルスの増幅が円滑であり、感染継代後の培養によるウイルスの細胞適応度がＭＲＣ－５細胞に対してＳＦ－Ｖｅｒｏ細胞株で高いことが確認できた。グラフと共に測定された吸光度結果値を報告した（図９ａおよび図９ｂ）。

動物実験に使用するウイルスを得るためのＣＦ１０培養を行う前に、Ｔ１７５フラスコに発明で製造したＳＦ－Ｖｅｒｏに由来のシードウイルスに感染し、培養日数によるウイルスの力価（含量）の変化を３-４日の間隔で確認した（図１０）。これは、ウイルス感染される細胞の培養単位面積当たりのウイルスの含量を設定するとともに、発明のウイルスの培養期間を確認するために優先的に遂行した。ウイルスの感染後の測定の結果、感染後の１０日を起点に細胞内のウイルスの量が増加しており、前述の図面（図６，図７ａ及び図７ｂ、図８、図９）と同様に、細胞内で増幅したウイルスが上澄液に比べて高い力価であることが確認できた。特に、感染後の２０～２１日頃にウイルスの含量が最大であることが確認できた。最初の感染ウイルス量（１５ ＩＵ）に比べて約２３０倍のウイルス増幅（３５３７ ＩＵ、２１ ｄｐｉ）を確認した（図１０）。

図１１を参照すると、同一条件の感染継代回数を有するシードウイルスと商業用ウイルスをＣＦ１０で同一に培養して得たウイルスの力価を測定した結果、本発明の方法に従って製造して継代を進行したウイルスの力価（Ｂ）の場合、長期間所要の通常の方法（Ａ）によって得た商業用ウイルスを同様に培養して得たウイルスの力価（Ａ）と比較して著しく高く測定されることを確認した。著しいレベルとは、同一のウイルスの培養面積、同一の培養方法を前提とした発明の方法による力価（Ｂ）が（Ａ）に比べてその含量が１５０％（ＭＡ１０４、１．５３倍）、４７０％（Ｖｅｒｏ、４．７０）倍）、２５１％（ＳＦ－Ｖｅｒｏ、２.５１倍）増加したことを示す。同一条件で継代培養を進行した場合、本発明の方法が通常の方法と比べてウイルスの力価がより高いことが確認できたということは、本発明の方法がＨＡＶウイルスをより迅速かつ安定的に製造できることを意味する。各細胞株間のウイルスの力価の違いは、Ａ型肝炎ウイルス感染に対する感受性（Ｃｃｅｌｌ
ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の違いによると推測されるが、以後、本発明のシードウイルスの特性研究を通じて確認すべきであると考えられる。とりわけ、本発明では、既存のＭＲＣ－５を基盤とするＡ型肝炎ワクチンの商業的生産を超え、新しいウイルス株を開発し、それをワクチン生産株に適用し、その培養可能性を確認したことに意義があるといえる。

一方、図１２は、本発明で制作したシードウイルスを培養、精製して不活化した後、マウス実験動物に２週間隔で３回投与した後、採集したマウス全血から分離した血清で投与した不活化抗原に対する抗体生産の有無を確認したことである。図１３は、動物実験進行中の各群別動物の体重平均値を示す図である。ＳＫ１４４およびＳＫ７２は、発明のウイルスを精製後に不活化し、それぞれ３ ＩＵ(１４４ ＥＬ.Ｕ)、１.５ ＩＵ(７２ ＥＬ.Ｕ)を投与した群であり、ＨＶＲ１４４およびＨＶＲ７２は商業用製品ハブリックスを１４４
ＥＬ.Ｕ、７２ ＥＬ.Ｕで投与した群である。

図１２を参照すると、５日目（Ｄａｙ-５）は初回投与の５日前のマウス血清、２８日目（Ｄａｙ２８）は２回目投与後の１４日目の血清、４２日目（Ｄａｙ４２）は３回目投与後の１４日目の血清を意味する。各投与群の棒グラフは、各日付に回収したマウス血清内に存在する抗ＨＡＶ抗体（総ＩｇＧ抗ＨＡＶ血清）の濃度を意味する。血清の濃度は、前記実験方法「１２．動物実験」項に記載の抗体価分析方法で測定した。

各投与群の投与前の５日目の血清では、全ての群において抗ＨＡＶ血清の増加は確認できなかった。２８日目の血清分析では、ＳＫ１４４群（平均抗体が５．７４２ｍＩＵ／ｍＬ）とＨＶＲ１４４群（平均抗体が５．７８３ｍＩＵ／ｍＬ）との抗体価と（ｐ＞０．９９９９）、ＳＫ７２群（４．３７７ｍＩＵ／ｍＬ）とＨＶＲ７２群（４．８７５ｍＩＵ／ｍＬ）の抗体も類似のレベル（ｐ＝０．３８９５）であることが確認できた。４２日目の血清分析では、ＳＫ１４４群（平均抗体が６．００２ｍＩＵ／ｍＬ）とＨＶＲ１４４群（平均抗体が６．２２３ｍＩＵ／ｍＬ）との抗体価と（ｐ＝０．８８２５）、ＳＫ７２群（５．４３２ｍＩＵ／ｍＬ）とＨＶＲ７２群（５．４４６ｍＩＵ／ｍＬ）の抗体も類似のレベル（ｐ＞０．９９９９）であることが確認できた。

図１２は、製品化されたＡ型肝炎ワクチン（ハブリックス）に比べて、本発明の方法に従って調製されたＨＡＶ抗原の免疫学的有効性において有効な差異がないことを示す。参考までに、マウスにはヒトの用量で投与できないため、１／１０のヒトの容量を使用したものであり、商用化のＡ型肝炎ワクチンの成人投与用量である１４４０ ＥＬ．Ｕ／感染用量と小児用量７２０ ＥＬ．Ｕ／感染用量を基準にした上に算定した。

図１３を参照すると、動物試験開始日から終了日まで、肉眼で観察上の原因不明の異常反応、マウスのストレス及び免疫原性の測定に影響を及ぼし得る抗原投与後の即時の異常反応、体重減少は発見されなかった。また、目視的観察においても、投与された発明の精製された不活化抗原および対照物質による異常反応も確認されなかった。

本発明が提供するＡ型肝炎ウイルスの製造方法によれば、短期間で安定的に増幅するＡ型肝炎ウイルスを製造することができ、Ａ型肝炎ワクチンの製造に非常に有用に活用することができ、産業上利用可能性が高い。また、韓国に国内技術で開発されていないＡ型肝炎ワクチン技術開発の源泉技術として活用することができる。

Claims (24)

1. 配列番号１で表されるＡ型肝炎ウイルス遺伝子。
2. 請求項１に記載のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）。
3. 前記発現カセットが、プロモーター、ＨＨ（ハンマーヘッド（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ））リボザイムおよびヘパチチスデルタウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄｅｌｔａ Ｖｉｒｕｓ、ＨＤＶ）リボザイムを含む、請求項２に記載の発現カセット。
4. 前記発現カセットが配列番号８の塩基配列を含む、請求項２に記載の発現カセット。
5. 請求項２乃至請求項４のうちいずれか一項に記載の発現カセットを含むＡ型肝炎ウイルス製造用ベクター。
6. 請求項５に記載のベクターで製造されたＡ型肝炎ウイルス。
7. （ａ）配列番号１のＡ型肝炎ウイルス遺伝子を含むＡ型肝炎ウイルス製造用発現カセットを含むベクターを宿主細胞に形質転換する段階；
   （ｂ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階；
   （ｃ）前記収得したウイルスを宿主細胞に感染させて継代培養する段階；
   （ｄ）前記宿主細胞からウイルスを収得する段階を含む、ワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
8. 前記発現カセットが、前記Ａ型肝炎ウイルス遺伝子の５'末端方向に順にＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーター、マルチクローニング領域（ＭＣＳ）、ＨＨ（ハンマーヘッド（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ））リボザイム領域を含み、前記Ａ型肝炎ウイルス遺伝子の３'末端方向に順にヘパチチスデルタウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄｅｌｔａ Ｖｉｒｕｓ、ＨＤＶ）リボザイム、ＭＣＳおよびポリＡ鎖を含む、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
9. 前記発現カセットが配列番号８の塩基配列を含む、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
10. 前記宿主細胞がＶｅｒｏ、ＭＡ１０４、ＷＩ－３８、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、Ｈｉ５、ＣＥＦおよびＳｆ９からなる群から選択される、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
11. 前記細胞が無血清培地で適応された細胞である、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
12. 前記継代培養が２乃至３０回行われることである、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
13. 前記（ｄ）段階において、宿主細胞が３回以上の継代培養において細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ）が現れることである、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
14. 前記（ａ）段階および前記（ｃ）段階の宿主細胞が同一細胞である、請求項７に記載のワ
    クチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
15. 前記（ｄ）段階以後にウイルスの精製段階、不活化段階、または精製および不活化段階をさらに含む、請求項７に記載のワクチン製造のためのＡ型肝炎ウイルスの製造方法。
16. 請求項７乃至請求項１５のうちいずれか一項に記載の方法によって製造されたＡ型肝炎ウイルス。
17. 請求項１６に記載のウイルスを有効成分として含むＡ型肝炎ワクチン組成物。
18. 前記ワクチンが生ワクチン、弱毒化されたワクチンまたは不活化ワクチン（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ）である、請求項１７に記載のＡ型肝炎ワクチン組成物。
19. 前記組成物が免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含む、請求項１８に記載のＡ型肝炎ワクチン組成物。
20. 請求項１７に記載のワクチン組成物を含むキット。
21. 請求項１７に記載のワクチン組成物が充填されているプレフィルドシリンジ（Ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）。
22. Ａ型肝炎ワクチンを製造するための請求項１６に記載のウイルスの使用。
23. 請求項１６に記載のウイルスを有効成分として含むワクチン組成物のＡ型肝炎予防の使用。
24. 請求項１６に記載のウイルスを有効成分として含むワクチン組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含む、Ａ型肝炎の予防方法。

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