KR102277089B1 - A형 간염 바이러스의 제조방법 및 상기의 방법에 따라 제조된 a형 간염 바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 A형 간염 바이러스의 생산방법 및 이 방법에 따라 생산된 A형 간염 바이러스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression cassette)를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 얻어진 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계를 포함하는 A형 간염 바이러스 생산방법 및 이 방법에 따라 생산된 A형 간염 바이러스에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 A형 간염 바이러스 제조방법에 따르면 짧은 기간 내에 안정적으로 증폭하는 A형 간염 바이러스를 제조할 수 있어, A형 간염 백신 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

A형 간염 바이러스의 제조방법 및 상기의 방법에 따라 제조된 A형 간염 바이러스{Method for Preparing Hepatitis A Virus and Hepatitis A Virus Prepared by the Method}

본 발명은 A형 간염 바이러스의 생산방법 및 이 방법에 따라 생산된 A형 간염 바이러스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트 (Expression cassette)가 삽입된 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 얻어진 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조방법 및 이 방법에 따라 제조된 A형 간염 바이러스에 관한 것이다.

A형 간염은 우리나라 성인 급성 바이러스 간염의 70% 이상을 차지하는 가장 중요한 원인이다. A형 간염 바이러스(HAV)는 Picornaviridae에 속하며 외피(envelop)가 없는 약 27 nm 크기로, 단일가닥 RNA를 핵산으로 가진다. 평균 28일의 잠복기 후 발열, 식욕부진, 구역 및 구토, 복통, 암뇨, 황달 등의 임상증상 특징으로 하는 급성 간질환을 유발한다 (SM Lemon et al. J. Hepatol, 68(1): 167-184 (2018); Totsuka and Moritsugu, Intervirology, 42: 63-68 (1999)). 최근 10년간의 조사에 따르면 미 서부지역, 중동 지역, 일부 아시아 지역에서 A형 간염 환자가 늘고 있어 세계적인 A형 간염 질병의 확산이 우려되고 있다. 우리나라에서도 최근 면역력이 없는 10, 20 대의 젊은 층에서 A형 간염 감염자가 급속히 늘기 시작하고 있다 (Nwachuku and Gerba, Rev. Environ. Contam. Toxicol. 186: 1-56 (2006); Kim and Lee, Intervirology, 53(1): 10-14 (2010); 질병관리본부(KCDC) 감염병포털 법정감염병 질병별 통계-A형간염). 특히 학습기 청소년이나 수험생의 경우 A형 간염 바이러스 감염 시 입원과 치료로 인한 개인적, 경제적 피해가 유발된다. 미국의 경우 A형 간염 환자 1명당 소요되는 직·간접비용은 성인에서는 $2,500, 18세 이하에서는 $1,500 정도의 비용이 소요되고 A형 간염으로 인한 의료비는 연간 약 3억불 이상인 것으로 알려져 있다 (World Health Organization, 1999).

A형 간염의 주된 전파경로는 분변-경구 통로이며, 오염된 음식물이나 식수에 의하여 전염된다. Advisory committee on immunization practices (ACIP)는 A형 간염 바이러스 풍토성 (endemicity)이 있는 지역으로의 여행자 (outbound travelers) 및 해당지역에서의 업무수행자, men who have sex with men (MSM) 해당자, B형 간염 질환자, 만성 간질환자 및 만성 신부전(chronic renal failure), A형 간염의 빈도가 높은 지역에 거주하는 소아 군에서 예방 접종을 권고하고 있다 (Nelson NP, Weng MK, Hofmeister MG, et al. Prevention of Hepatitis A Virus Infection in the United States: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices, 2020. MMWR Recomm Rep 2020;69(No. RR-5):1-38. DOI: http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.rr6905a1).

A형 간염 백신을 제조하기 위해서는 A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus, HAV) 제조가 필수적으로 수반이 되어야 하지만, A형 간염 바이러스는 복제 속도가 매우 느리다(Cromeans et al. J. Gen. Virol. 70: 2051-2062 (1989)). 보통 사람에 감염되는 바이러스는 ?F게 2-3일, 길게 7일간 배양하면 바이러스가 복제되어 분리 가능하나, A형 간염 바이러스의 경우, 짧게 한달가량 배양해야 바이러스를 수득할 수 있다. 한달에 해당하는 기간도, 바이러스가 배양 세포에 작 적응된 경우로 제한된다. A형 간염 바이러스 증폭에 사용하는, A형 간염 바이러스에 대해 감수성이 높은 세포주 (예, Primary AGMK cell, FRhK-4, BS-C-1)는 백신을 생산하기 위한 세포로 적합하지 않다. 이들은 인체용 백신 생산용 세포주로 사용하기에 적합한 세포주 특성분석 및 안정성이 검증되지 않았다. 특히 예시의 세포는 플라스크 등에서의 체외 (in vitro) 배양이 가능한 세포주로 확립되었으나, CITES 협약의 제한을 받는 국제 멸종 위기종인 긴꼬리 원숭이과에 속한 히말라야 원숭이 (Macaca mulatta) 및 사바나 원숭이(Cercopithecus aethiops) 유래의 물질로 분류되어 상업적으로 세포주를 분양 판매하는 ATCC (US)등으로부터 국내로 수입이 어렵다.

사람의 분변검체에서 분리하여, 바이러스의 생산 세포주에서 고수율로 제조하려면 HAV를 생산 세포주에 적응시키기 위한 50회 내외의 바이러스 감염 계대배양이 필요하다. 일례로, 상업 백신 하브릭스의 마스터 시드 바이러스 (HAV 4380 or MRC5/9, Master seed)의 경우 사람 유래의 wt HM-175 (human stool suspension)를 primary AGMK (African green monkey) 세포에서 32 계대를 거쳐 세포 배양에 적응된 바이러스를 확인 후 해당 바이러스(P-32 AGMK cell-adapted)를 MRC-5 세포주에서 passage 37까지 배양 후 바이러스 클론(clone 25-4-21)으로 분리하고, 이 클론을 다시 MRC-5에서 1회 배양 후 (passage 38), 추가로 3 회 MRC-5 세포에서 바이러스 감염 계대 진행 한 passage 41의 바이러스를 master seed stock 으로 하고 이를 HAV 4380로 명시하고 있다 (US6423318B1).

A형 간염 백신은 국가에서 지정한 필수예방접종의 대상이나, HAV가 유행하는 시기에 빈번하게 공급 부족을 겪고 있는 실정이다. 전세계적으로 가장 높은 빈도로 사용되고 있는 A형 간염 백신인 글락소스미스클라인사의 하브릭스(Havrix, GSK) 및 머크사의 박타 (Vaqta, Merck & Co., Inc.) 등 2019년 A형 간염이 크게 유행한 대한민국에서 품절되어 2019년 말까지 공급이 중단되는 등 수급에 큰 어려움을 겪은바 있다. 이와 같은 백신 수급의 불균형 문제는 2017년에도 동일하게 발생한 일이나, A형 간염의 갑작스러운 유행이 발생한 2019년에도 수급불안정은 해소되지 못했다. 현재, 보건복지부의 백신수급의 안정화를 위한 2020년 국가예방접종 백신비축계획에 A형 간염 백신이 포함되어 이를 해소하기 위한 시도가 진행중이다. 이러한 수급불안정은 현재 A형 간염 백신은 국내 기술로 개발된 상업 백신이 없는데에도 이유가 있다.

본 발명자는 전술한 기술적 과제를 해결하고 A형 간염 바이러스를 안정적이고 빠르게 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 기존 바이러스 수득에 필요했던 50회 내외의 계대배양 단계를 단 6회로 단축시켜 바이러스를 수득하는 방법과 바이러스 생산 세포주에 더욱 고수율로 발현하는 최적의 유전자 발현 카세트 조합을 찾아냈고, A형 간염 바이러스의 유전자 및 기능적 영역을 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 감염시켜 얻어진 바이러스가 계대 배양을 거듭할수록 놀라울 정도로 빠른 속도로 복제하여 신속하고 안정적으로 A형 간염 바이러스를 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 A형 간염 바이러스 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression cassette)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 제조된 A형 간염 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression cassette)가 삽입된 벡터를 숙주세포에 형질전환(transfection)시키는 단계; (b) 상기 숙주세포로부터 바이러스를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계; 및 (d) 상기 숙주세포에서 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 간염 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 간염 바이러스를 유효성분으로 포함하는 A형 간염 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물이 충진된 프리필드 시린지(prefilled syringe)를 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 A형 간염 바이러스 유전자를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression cassette)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 벡터로 제조된 A형 간염 바이러스를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트 (Expression cassette)가 삽입된 벡터를 숙주세포에 형질전환 (transfection) 시키는 단계; (b) 상기 숙주세포로부터 바이러스를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계; 및 (d) 상기 숙주세포에서 세포변성효과(CPE)가 나타날 때 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 간염 바이러스를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 간염 바이러스를 유효성분으로 포함하는 A형 간염 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 백신 조성물이 충진된 프리필드 시린지(prefilled syringe)를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 A형 간염 바이러스 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression cassette)를 제공한다.

본 발명이 제공하는 상기 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자는 상업용 A형 바이러스주(ATCC VR-1402)의 유전자와 비교하여 A2876T 및 A3891T 점 돌연변이를 포함하며, 이로 인해 높은 수율과 빠른 계대배양에 적합한 것을 특징으로 한다.

특히, 3891번 위치는 아미노산이 MET에서 LEU로 변경되는 주요한 돌연변이다. 더욱 계대배양이 용이하고, 수율을 높일 수 있는 주요 부위에 돌연변이를 주어 본 발명의 재조합 염기서열을 완성하였다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 도 8 및 도 11과 같이 시중에 수득 가능한 야생형 A형 간염 바이러스와 비교할 때, 본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 유전자의 A형 간염 바이러스의 생산성이 더욱 우수한 것을 확인할 수 있었다.

종래기술에서는 A형 간염 바이러스를 수득하기 위해 최소 47회의 계대배양을 진행해야 했고(도 4), 번거롭고 시간이 오래걸리며, 비용이 많이 드는 단점이 있었다(T. Cromeans et al., J Medical Virology 22:45-56, 1987). 통상적으로 HAV의 1회 계대배양에 약 한달이 소요되는 바, 종래기술에 따라 백신제조용 A형 간염 바이러스를 사람의 분변으로부터 수득하려면 수십 개월이 소요되나, 본 발명에서는 상기 유전자 변이를 갖는 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자 및 이를 포함하는 발현 카세트를 이용하여 A형 간염 바이러스 생산 기간을 4~5개월로 단축시킨 것에 기술적 특징이 있다.

본 발명에서 '발현 카세트'란, 프로모터와 시그널 펩타이드를 코딩하는 염기 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 시그널 펩타이드의 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 분비 생산을 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다.

본 발명에서 '유전자'란 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열, 예컨대 개시 코돈 (메티오닌 코돈) 으로부터 시작하고 종결 시그널 (종료 코돈)으로 종결되는 열린 해독틀 (open reading frame) 이 포함된다. 유전자 및 폴리뉴클레오티드는 또한 전사 시작, 번역 및 전사 종료와 같이 이의 발현을 조절하는 영역을 포함할 수도 있다. 따라서 또한 프로모터 및 리보솜 결합 영역 (일반적으로는 코딩 서열 또는 유전자의 시작 코돈의 상향스트림 (upstream)에서 대략적으로 60 내지 250 뉴클레오티드에 놓인 이들 조절 요소, 전사 터미네이터 (일반적으로, 터미네이터는 코딩 서열 또는 유전자의 중지 코돈의 하향스트림에서 (downstream) 대략적으로 50 뉴클레오티드 내에 위치됨) 이 포함된다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA를 발현하거나, 특정 단백질을 인코딩하고, 조절성 서열을 포함하는 핵산 단편을 또한 언급한다.

본 발명에서 제공하는 발현 카세트는 상기 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자의 염기서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지면서 바이러스의 항원성이나 면역원성과 같은 생물학적 특성이 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열이 포함될 수 있음이 통상의 기술자에게 자명하게 이해될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 발현 카세트는 프로모터, hammerhead (HH) 리보자임 및 hepatitis delta virus (HDV) 리보자임을 포함하는 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 A형 간염 바이러스 유전자의 5'말단에 순서대로 CMV 프로모터, T7 프로모터, 다중클로닝영역 (MCS), HH 리보자임 영역을 포함하고, 상기 A형 간염 바이러스 유전자의 3'말단 방향에 순서대로 hepatitis delta virus 리보자임, MCS, polyA tail을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따르면, CMV/T7 프로모터는 서열번호 2, MCS 서열은 서열번호 3 또는 6, HH 리보자임은 서열번호 4, HDV 리보자임은 서열번호5, polyA tail은 서열번호 7로 표시될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 유전자 발현을 위하여 발현 카세트에 CMV 프로모터 부위 및 T7 RNA polymerase에 의한 in-vitro transcription이 가능한 T7 프로모터 영역을 삽입하였다(서열번호 2). 제한효소를 이용할 수 있도록 MCS를 유전자 5' 말단의 프로모터 뒤쪽에(서열번호 3), polyA tail 서열 앞쪽에 배치(서열번호 6)하였다. Self-cleavage 기능을 가진 catalytic RNA 절단 구조로서 HH 리보자임(서열번호 4), HDV 리보자임(서열번호 5) 영역이 HAV 서열 부위인 UTR-HAV polyprotein-UTR 영역의 양옆에 위치하여, 타겟으로 하는 HAV mRNA 구조만으로 분리(processing) 될 수 있도록 발현 카세트를 디자인하였다.

본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따르면, 상기 발현 카세트는 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 발현 카세트가 삽입된 A형 간염 바이러스 제조용 벡터를 제공한다.

본 발명에서 '벡터'란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 '작동가능하게 연결된(Operably linked)'는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 벡터와의 작동적 연결은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 벡터는 상기 서열번호 1의 A형 간염 유전자 이외에 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 리보자임 및 인핸서(enhancer) 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다.

개시 코돈 및 종결코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 숙주세포에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 프로모터는 human elongation factor-1 alpha(EF-1α), 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV), β-액틴 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터 등이 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.

상기 벡터가 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.

상기 서열번호 1의 A형 간염 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트가 삽입될 수 있는 eukaryotic 발현 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 이의 비제한적인 예는, pUC57 벡터, pcDNA3.1 벡터, pVAX1 벡터 (라이프 테크놀로지 (Life Technology), 프랑스 세르지 퐁투아즈), pBudCE4.1 (라이프 테크놀로지 (Life Technology))를 포함하며, 본원에 개시 또는 언급되거나 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 벡터들은 본원발명의 상기 발현벡터 제작에 이용될 수 있다. 바람직하게는 pUC57 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시양태에 따르면, 상기 벡터는 도 2에 개시된 HAV 바이러스 유전자 및 바이러스 생성을 위한 유전자 발현에 관여하는 인자들의 개열지도를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명은 (a) 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트 (Expression cassette)가 삽입된 벡터를 숙주세포에 형질전환 (transfection)시키는 단계; (B) 상기 숙주세포로부터 바이러스를 수득하는 단계; (C) 상기 수득한 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계; 및 (D) 상기 숙주세포에서 세포변성효과(CPE)가 나타날 때 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법을 제공한다.

(a) 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트 (Expression cassette)가 삽입된 벡터를 숙주세포에 형질전환(transfection)시키는 단계;

상기 '발현 카세트' 및 '벡터'에 대해서는 전술한 바가 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명에서 상기 '숙주세포'는 유전적으로 변경되었거나, 외인성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 투여에 의해 유전적으로 변경될 수 있는 진핵 세포를 의미한다. 유전적으로 변경된 세포를 언급하는 경우, 그 용어는 최초에 변경된 세포 또는 그의 자손을 모두 포함한다. 상기 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 또는 발현카세트를 클로닝 벡터 및 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서 벡터가 주입되는 숙주세포는 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니나, HAV의 자연 숙주 (예, 침팬치, 원숭이, 사람 등) 유래의 세포이거나 백신 생산용 세포일 수 있다. 상기 '백신 생산용 세포'는 세포기질(cell substrate)로도 표현될 수 있으며 바이오 의약품이나 세포배양의약품의 제조 원료로서 사람 또는 동물 유래의 세포주 중 의약품을 생산하는 능력을 가진 것으로 정의될 수 있다.

특히, 본 발명에서 상기 숙주세포는 사람 백신 생산용 세포로서 안전성이 입증되어 당업계에서 생물학적 의약품 생산에 이용되고 있는 것이 바람직하다. 사람 백신 생산용 세포로서의 안전성이 입증된 세포에 대한 구체적인 설명은 Jordan and Sandig, Viruses, 6: 1672-1700 (2014); WHO Technical Report Series, No. 978, Annex 3를 참고할 수 있으며, 이들 문헌의 모든 내용은 본 발명의 내용에 참고가 될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 상기 백신 생산용 세포는 Vero, MA104, WI-38, CHO, MDCK, Hi5, CEF, S9, Human Embryonic Lung Fibroblast (예시, MRC-5 등), PER.C6, BHK-21, CHO-K1 및 이들의 무혈청 적응 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 백신 생산용 세포는 MA104, Vero 또는 이의 무혈청 적응 세포가 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, SF-Vero 세포일 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 숙주세포의 배양은 아래와 같이 이뤄질 수 있다: MA104, Vero 세포주는 2% FBS를 포함하는 EMEM (2% FBS-EMEM)배지를 사용하고, SF-Vero 세포주는 무혈청의 EMEM 배지 (SF-EMEM) 2 mL로 교환하여, 30 내지 40℃(바람직하게는 35 ℃), 3 내지 7% (바람직하게 5%) CO₂ 배양기에서 2 내지 4주(바람직하게는 3주) 동안 배양하는 것일 수 있다.

해당 온도범위, 이산화탄소 농도 범위 및 배양 일수를 미달하거나 초과할 경우, 적정한 수의 세포주가 생성되지 않을 수 있으며, HAV 유전자 컨스트럭트를 transfection 시키기에 적절한 조건이 형성되지 않을 수 있다.

혈청-무함유 배지에서 배양에 대한 세포 적응은 세포가 혈청-무함유 배지 내에서 성공적으로 생존하고 증식할 수 있을 때까지 혈청의 양이 감소하는 배지에서 세포를 점진적으로 계대 배양함으로써 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 달성될 수 있어, 상기 각 세포주의 무혈청 적응 세포주는 통상의 기술자에 의해 쉽게 얻어질 수 있다.

본 발명에서 상기 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주세포 내로 주입될 수 있다. 상기 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트 (Expression cassette)가 삽입된 벡터는 세포 내 이입, 트랜스펙션, 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 성분을 사용하는 트랜스펙션; 미세입자 투사법; 리포펙션; 및 viral vector 주입 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터)을 비롯한 다수의 적합한 수단에 의해 숙주세포 내로 주입될 수 있다.

(b) 상기 숙주세포로부터 바이러스를 수득하는 단계;

상기 (a) 단계 이후 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 영양배지에서 배양함으로써 시드로 사용할 A형 간염 바이러스를 수득할 수 있으며, 이 때 사용되는 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 바이러스 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기와 같이 숙주세포 내에서 생성되거나 분비되는 바이러스는 배양배지의 상등액 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있으며, 통상적인 단백질 및 바이러스 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다 (Michael C. Flickinger, Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. Chapter: Chromatographic Purification of Virus Particles, P. Gagnon, 2009).

상기 (b) 단계에서 수득된 바이러스는 이후 숙주세포에 감염되어 증폭되기 위한 시드로서 활용이 되며, 본 발명의 일실시예에서는 이를 passage 0 (P0) 바이러스로 명명하였다.

(c) 상기 수득한 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계;

본 발명의 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 수득한 P0 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 반복적으로 계대 배양함으로써, 숙주세포에 적응하여 빠른 속도로 증폭할 수 있는 바이러스를 생성하는 단계이다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 감염계대 진행 시 숙주 세포 MA104 및 Vero는 1×10⁵ 내지 1×10⁷ cells/5 mL로, SF-Vero 세포는 5×10⁵ 내지 5×10⁷ cells/5 mL로 준비하는 것일 수 있다. 해당 농도보다 적게 숙주세포를 준비할 경우, 만족할만한 역가를 얻기 힘들 수 있으며, 해당 농도보다 많게 숙주세포를 준비할 경우, 숙주세포의 감염이 골고루 이뤄지지 않아 경제적이지 않을 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 숙주세포 배양은 30 내지 40℃(바람직하게는 35 ℃), 3 내지 7% (바람직하게 5%) CO₂ 배양기에서 2 내지 4주(바람직하게는 3주) 동안 배양하는 것일 수 있다. 해당 온도범위, 이산화탄소 농도 범위 및 배양 일수를 미달하거나 초과할 경우, 적정한 수의 세포주가 생성되지 않을 수 있으며, 계대 배양에 적절한 조건이 형성되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, P1 감염 계대 진행 시, M104 및 VERO 세포는 5×10⁵ 내지 5×10⁷ cells/30 mL로, SF-Vero 세포는 8×10⁵ 내지 8×10⁷ cells/30 mL로 준비하였으며, 감염 직전 준비한 세포에서 동일하게 배지를 제거하고 30 mL DPBS로 1 내지 3회 세척할 수 있다. 해당 조건을 미달하거나 초과할 경우, 최적의 수율로 바이러스가 수득되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, P1 내지 P4 감염 계대 진행 시에는 감염 배지 1 - 10 mL, P5 내지 P6의 감염 계대는 감염 배지 20 내지 50 mL을 사용할 수 있다. 해당 조건을 미달하거나 초과할 경우, 최적의 수율로 바이러스가 수득되지 않을 수 있다.

본 발명에서 상기 계대는 숙주세포에 바이러스를 감염시킨 후 배양상 바이러스 증식에 대한 실험적 확인, 즉 세포병변효과나 바이러스의 검출이 확인되지 않아도, 바이러스에 감염된 숙주세포의 계대를 지속적으로 유지하는 것을 의미한다.

상기 (c) 단계에서 바이러스로 감염시키는 숙주세포는 상기 (a) 단계에서 P0 바이러스를 제조하기 위해 사용한 숙주세포와 동일한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 계대 배양은 구체적으로 다음과 같은 방법에 따라 진행될 수 있다. 상기 P0 바이러스를 숙주세포에 처리하여 감염시킨 후 이를 배양한다. 배양 후 숙주세포를 파쇄하고 원심분리하여 세포 잔해물들은 제거한 뒤 상등액만을 수득한다. 상기 수득한 상등액 passage 1 (P1)을 이용하여 다시 숙주세포 감염을 진행한다.

전술한 숙주세포 감염 - 숙주세포 배양 - 숙주세포 파쇄 - 상등액 수득 과정을 1 사이클(cycle)로 하여 반복해서 계대를 진행한다.

본 발명의 상기 1 사이클의 계대 과정에서 숙주세포의 배양은 바람직하게는 5일 내지 30일간 진행할 수 있으며, 더 바람직하게는 10일 내지 25일, 보다 더 바람직하게는 17일 내지 21일, 가장 바람직하게는 19일 내지 21일 일간 진행할 수 있다.

상기 각 계대 배양 과정에서 바이러스의 증식은 숙주세포가 일반적으로 배양되는 배지 조성물에서 이루어진다. 숙주세포는 중성의 완충된 pH(예, 7.0과 7.2 사이의 pH)를 유지하는 데 적합한 CO₂ 농도와 조절된 습도 하에서, 혈청(예, 10% 태아 소 혈청)이 보충된 배지 또는 무혈청 배지와 같은 표준 시판 배양 배지에서 배양된다. 선택적으로, 배지는 예를 들어 L-글루타민, 비타민, 당, 아미노산, 펩타이드, 미량원소, 소듐 피루베이트, 펩톤, 비타민, 당 (예, 글루코즈) 비필수 아미노산과 같은 부가 영양제, 바람직한 성장 특성을 촉진하는 부가의 보충제(예, 트립신,

-머캅토에탄올, 인슐린, 성장인자, 아미노산 복합제 등) 등을 함유할 수 있다.

일부 경우에, 예를 들어 바이러스의 제조를 위해서는, 숙주세포를 무혈청 조건하에서 성장시키는 것이 바람직하다. 세포는 작은 규모, 예를 들어 25 mL 미만 배지, 배양 튜브 또는 플라스크에서, 또는 큰 플라스크 (예, Cell Factory System)에서 부착 배양 가능하며, 교반되는 큰 플라스크, 로테이터 병, 반응기 배양액내의 미세 운반체 (예, Cytodex, GE Healthcare) 상에서 배양될 수 있다. 미세담체 비드는 세포 배양물의 부피당 부착성 세포 성장을 위한 큰 표면적을 제공하는 작은 구이다(직경 50-100 ㎛ 범위). 예를 들어 백신 생산과 같은 상업적인 바이러스 생산의 경우, 생물반응기 또는 발효기에서 세포를 배양하는 것이 종종 바람직하다. 생물반응기는 1 L 이하에서부터 100 L 초과 부피까지 이용가능하며, 예를 들어 NBS 생물반응기 (New Brunswick Scientific, Edison, N. J.); Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Germany) 또는 scale-X 생물반응기 (scale-X single-use bioreactor system; Univercells Technologies, Belgium) 으로부터의 실험실 용량 및 상업적 규모의 생물반응기를 이용할 수도 있다.

본 발명에서, 배양 부피에 상관없이, A형 간염 바이러스의 효과적인 제조를 보장하기 위하여 배양물을 35℃ 이하의 온도에서 유지하는 것이 중요하다. 일반적으로, 조절기, 예를 들어 항온기, 또는 세포 배양 시스템의 온도를 감지하고 유지하기 위한 기타 장치를 이용하여 바이러스 복제 기간 동안 온도가 35℃를 초과하지 않도록 하는 것이 바람직하다.

배양중인 세포를 유지하는 과정은 광범위하게 보고되었으며, 당업계에 공지되어 있다. 일반적인 프로토콜은 예를 들어 R. Ian Freshney (2010) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique and Specialized Applications (sixth edition, Wiley-Blackwell) 등에서 제공되며, 세포 배양 과정 중의 조건 변화는 일상적인 실험을 통하여 쉽게 결정될 수 있다.

한편, 본 발명에서 상기 계대 배양은 전술한 1 사이클의 1 계대를 2회 내지 30회 반복할 수 있으며, 바람직하게는 2회 내지 20회, 더 바람직하게는 4회 내지 20회, 보다 더 바람직하게는 4회 내지 15회, 가장 바람직하게는 4회 내지 10회 반복할 수 있다.

(d) 상기 숙주세포에서 바이러스를 수득하는 단계;

본 발명의 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 반복하여 상기 숙주세포와 이의 배양액을 수득하여 백신 생산용 바이러스를 회수하는 단계이다.

바람직하게는, 상기 (d) 단계는 숙주세포에서 세포변성효과(Cytopathic Effect)가 나타날 때 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명에서 상기 세포변성효과란 A형 간염 바이러스 감염에 의해 야기되는 세포에서의 모든 효과를 의미한다. 이는 플라크 형성, 세포 과립화에 이은 단편화 (cell granulation and fragmentation) 및 지지체(예를 들면, 세포-바이러스 배양 플라스크)로부터의 세포 박리, 세포 위축 (cell shrinkage), 세포 응집 (cell aggregation), 세포 용해 (cell lysis), 세포 라운딩 (cell rounding) 변성, 부육 형성 (soughing), 세포자멸사 유도 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포변성효과는 일반적으로 현미경으로 관찰하거나 육안으로 관찰하여 확인할 수도 있다.

한편, 본 발명의 상기 (d) 단계에서는 숙주세포에서 세포변성효과가 나타난 이후에 세포 배양액 및 세포로부터 바이러스를 수득한 후 추가적인 계대 배양을 실시하여 매 계대마다 목적하는 양의 바이러스를 수득하고, 다시 계대를 반복하는 방식으로 상기 (d) 단계가 진행될 수도 있다.

본 발명에서 상기 바이러스의 양이란 바이러스 역가(상세하게는, A형 간염 항원의 함량), 플라크의 크기 또는 형태, 입자 밀도 또는 당업계에 공지된 기타 수단에 의해 측정되어지는 바이러스 양을 의미한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 전술한 방법에 따라 반복하여 계대를 진행한 숙주세포는 3 계대 이후부터 세포병변효과 (CPE)가 관찰되기 시작하였으며, 4 계대 또는 5 계대 이후부터 배양액으로 방출된 바이러스 및 세포 내 바이러스의 양이 현저히 증가하는 것으로 확인이 되었다. 또한, 배양액으로 방출된 바이러스 및 세포 내 바이러스의 양은 계대가 지속되어도 감소하지 않고 유지가 되는 것으로 확인되었다. 대표 예로 SF-Vero 세포주에서 감염 3 계대에서 바이러스를 입자를 전자현미경(TEM)으로 확인하였으며 도 5에 제조한 바이러스 입자의 전자 현미경 사진을 나타내었다.

따라서, 본 발명에서 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서의 계대 배양을 적어도 2회 이상, 바람직하게는 3회 이상, 더 바람직하게는 4회 이상 수행한 이후에 진행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 숙주세포에서 세포변성효과가 관찰된 이후라도 바이러스 양을 더 증폭하고자 하는 경우에는 반복해서 계대 배양을 수행함으로써 목적하는 수준의 바이러스 양이 얻어지는 시점에 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 (d) 단계 이후에 수득한 바이러스를 백신으로 활용하기 위하여 바이러스의 정제 단계 및 바이러스의 불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 정제는 주요 정제 방법 또는 주요 정제 단계, 예를 들면, 크로마토그래피, 또는 밀도 구배 초원심분리 정제 방법을 통해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 레진 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 멤브레인 크로마토그래피 등일 수 있다. 또한 이온 교환 크로마토그래피 와 사이즈 배제 크로마토그래피가 동시에 수행될 수 있으며 이온 교환 크로마트그래피와 Multimodal 크로마토그래피가 동시에 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 불활성화 단계는 바이러스 감염성의 완벽한 제거를 위해 수행하며 일반적으로, 이것은 화학적 또는 물리적 수단으로 수행될 수 있다. 화학적 불활성화는 예를들어 포름알데하이드 (formaldehyde) 또는 베타프로피오락톤 (beta-propiolactone)이 적정 농도로 포함된 불활화 시액으로 바이러스를 불활화 처리할 수 있다. 필요한 경우 잔여의 불활화 물질은 나중에 중화될 수 있다. 포름알데히드로 불활성화된 물질은 예를 들어 Sodium sulfite 또는 Sodium bisulfite 가 포함되는 중화제 (formaldehyde neutralizer)로 중화될 수 있으며, 정용여과 (diafiltration)를 통해서 인산염 버퍼, 생리식염수 혹은 바이러스 안전성을 유지해주지는 버퍼로 교환될 수 있다.

본 발명에서 상기 정제 및 불활성화 단계는 그 순서가 특별히 제한되지 않으며, 정제 후 불활성화 단계를 거치거나 또는 불활성화 후 정제 단계를 거칠 수 있다. 바람직하게는 불활성화 후 정제 단계를 거칠 수 있다.

본 발명은 또한 상기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된 A형 간염 바이러스를 제공한다.

본 발명의 상기 방법에 따라 제조된 A형 간염 바이러스는 백신 생산 세포주로서의 안전성이 확보되거나 입증되어 산업적으로 사용되고 있거나, WHO를 포함한 각국 보건당국에 생물학적 의약품 생산 세포 기질로서 허가되거나 인증된 세포주에서 증폭 속도가 매우 빠르다. 또한, 숙주세포 내에서 장기간의 계대 배양을 반복하더라도 안정적으로 바이러스 증폭이 가능하여 A형 간염 백신 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신 또는 사백신일 수 있다.

생기 '생백신'은 살아있는 바이러스 활성 성분을 포함하는 백신을 의미한다. 상기 '약독화 (attenuation)' 란 살아있는 바이러스의 병원성(pathogenicity)을 인공적 또는 자연적 요인에 의해 약하게 한 것으로, 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 바이러스 입자 열처리 (heat), 바이러스로의 자외선(UV light) 조사, 시험관 내 고차 연속 계대 배양 또는 배양 플라스크 등의 체외 배양 용기 내 배양 세포에서의 바이러스 연속 계대 배양을 수차례 실시함으로서 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다. 상기 '사백신'은 불활화 백신이라고도 하며, 감염성이 제거된 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신 (whole virus vaccine)과 분할 백신 (split virus vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조 가능하다.

본 발명의 백신 조성물은, 전술한 바이러스 이외에 1, 2 또는 3개 이상의 면역보조제 (adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. '면역보조제'란 용어는 항원에 대한 면역반응을 증대시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 면역보조제는 주로 전달 시스템으로서 작용하거나, 주로 면역 조절제로서 작용하거나, 또는 상기 둘 모두의 강한 특징을 가질 수 있다. 적합한 면역보조제는 인간을 포함한 포유동물에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물의 유효성을 증가시키기에 적당한 면역보조제 (adjuvant)는 하기의 것들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다:

(1) 알루미늄 염(명반) (예: 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 등);

(2) 수중유형 에멀젼 제형(무라밀 펩티드또는 세균 세포벽 성분과 같은 다른 특정한 면역 자극제를 함유하거나 함유하지 않음),

(3) 퀼 에이(Quil A) 또는 스티뮬론(STIMULON)™ QS-21[Antigenics, Framingham, MA](미국특허 제5,057,540 호)과 같은 사포닌 애주번트가 사용되거나 이로부터 생성된 입자;

(4) 합성 폴리뉴클레오타이드;

(5) 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨, 인터페론, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 등;

특정 구현예에서, 알루미늄계 면역보조제가 사용될 수 있다. 알루미늄 염 면역보조제는 알루미늄-침전 백신 (alum precipitated vaccine)이거나 알루미늄-흡착 백신 (alum-adsorbed vaccine)일 수 있다. 알루미늄 염에는 알루미나 수화물, 산화 알루미늄, 알루미늄 3수화물, 인산알루미늄겔, Superfos, 암포젤, 수산화알루미늄(²), 알루미늄 히드록시포스페이트 설페이트 (aluminum phosphate adjuvant, APA), 무정형 알루미나 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 알루미늄 염은 2-3 주간 서서히 항원을 방출하는 항원 저장소를 형성하여 비특이적으로 대식세포, 보체, 선천성 면역 메커니즘을 활성화시킨다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 발명에 개시된 백신 조성물은 면역보조제로서 CpG 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. CpG 올리고뉴클레오타이드는 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN)를 지칭하며, 따라서 상기 용어는 달리 지시되지 않는 한 호환적으로 사용된다.

상기 면역보조제는 조성물 중 접합체 양과 가수에 따라 적절히 선택하되, 알루미늄계 면역보조제를 사용할 경우, 알루미늄 원소를 기준으로 조성물 내에 알루미늄 원소가 0.01 mg/mL 내지 1.0 mg/mL로 포함되도록 첨가되는 것일 수 있다. 바람직하게 조성물 내에 알루미늄 원소가 0.1 mg/mL 내지 0.6 mg/mL, 또는 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL로 포함되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조성물 내에 알루미늄 원소가 0.15 mg/mL 내지 0.35 mg/mL로 포함될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 그 목적 효과를 달성하는 한, 상기 조성물을 제공하는 제형이 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물을 액체 형태(즉 용액 또는 현탁액)로 또는 동결건조된 형태로 제형화할 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 액체 형태, 바람직하게는 수성 액체 형태이다. 액체 제형으로서 제공되는 경우, 본 발명의 백신 조성물은 상기 액체 제형이 용기(바람직하게, 주사기)에 패키징(Packaging)된 형태로 제공되어 재분산 등 별도의 백신 조성물 재현 과정 없이 곧바로 투여할 수 있으며, 따라서 상기 액체 제형은 수성 매질 중에서의 재현탁이 필요한 동결건조된 제형의 조성물과는 달리 주사 및 일정한 효과를 재현하는데 이상적일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 제형화는 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, A형 간염 바이러스를 생리학적으로 허용 가능한 담체(vehicle)로 제형화하여 상기 조성물을 제조할 수 있다. 상기와 같은 비히클의 예는 비제한적으로 물, 완충된 염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 폴리소르베이트 20 및 덱스트로스 용액을 포함한다.

본 명세는 본 발명에 개시된 A형 간염 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 부형제(Excipient), 담체, 등장화제 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 이들 부형제, 담체 또는 희석제의 종류는 후술하는, 약학적 조성물의 투여 경로에 따라 사용되는 종류가 당해 기술분야에 공지되어 있다.

일례로, 액상 제제에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체에는 수성 또는 비수성 용매, 현탁액, 에멀젼, 오일이 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸 올레이트가 있다. 수성 용매는 물, 수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 생리식염수, 버퍼 용액을 포함한다. 약제학적 조성물은 등장성(isotonic), 저장성(hypotonic) 또는 고장성(hypertonic)일 수 있다. 하지만 주사로 투여되는 약제학적 조성물은 기본적으로 등장성이 바람직하다. 따라서 등장성이나 고장성이 조성물의 저장에 유리할 수 있다. 약제학적 조성물이 고장성일 경우, 투여 전에 등장성이 되도록 희석할 수 있다. 등장화제는 이온성 등장화제이거나 비이온성 등장화제일 수 있다. 이온성 등장화제에는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 염화마그네슘 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 비이온성 등장화제에는 솔비톨, 글리세롤 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 최소한 한 가지의, 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함한다. 예를 들면, 약제학적 조성물이 주사제일 경우 pH 5.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0 내지 pH 8.0, pH 6.8 내지 pH 7.5에서 완충능을 가지는 완충액으로 구성되는 것이 바람직하다. 완충액은 인산칼륨, 인산일수소나트륨, 글루타메이트, 카보네이트, 보레이트, 락테이트, 시트레이트, 히스티딘, 글리신, 트리에탄올아민등으로 구성된 완충액을 선택할 수 있다.

본 명세의 백신 조성물은 완충제 (buffering agent), 염(salt), 2가 양이온 (divalent cation), 계면활성제 (surfactant, 특히 비-이온성 세제 (non-ionic detergent)), 저온보호물질 (cryoprotectant, 예를 들어 당(sugar)), 산화방지제(anti-oxidant, 예를 들어 킬레이트제, 보존제(preservative) 및 항균제 (anti-fungal agent)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 완충제는 당업계에 약학적 조성물 특히, 백신 조성물에 사용되는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트 (phosphate), 석시네이트 (succinate), 또는 Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acid)로 사용할 수 있다. 이들은 임의의 화합물 형태로 사용될 수 있으며, 예를들어 포스페이트는 인산 나트륨 (sodium phosphate), 인산 칼륨 (potassium phosphate)의 형태로 사용될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 염(Salt)을 포함한다. 상기 염 종류는 당업계에 약학적 조성물 특히, 백신 조성물에 사용되는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 염화 마그네슘, 염화 칼륨, 염화 나트륨, 염화 보레이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 계면활성제를 포함한다. 바람직한 하나의 실시양태에서 비-이온성 세제 (non-ionic detergent)를 사용한다. 하나의 실시양태에서, 상기 계면활성제는 폴리솔베이트 20(트윈(상표) 20), 폴리솔베이트 40(트윈(상표) 40), 폴리솔베이트 60(트윈(상표) 60), 폴리솔베이트 65(트윈(상표) 65), 폴리솔베이트 80(트윈(상표) 80), 폴리솔베이트 85(트윈(상표) 85), 트리톤(Triton)(상표) N-101, 트리톤(상표) X-100, 옥톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트라이에탄올아민, 트라이에탄올아민 폴리펩타이드 올리에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, 솔루톨(Solutol) H 15), OTG(octylthioglucoside), OG(octylglucoside), NM(nonylmaltoside), LDAO(lauryldimethylamine oxide), DDM(dodecyl beta-D-maltoside) 및 폴록사머(poloxamer)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에서 용어 '단일 용량(each dose)'은 단위 용량(unit dose)' 또는 '1회 투여 용량'과 동일한 의미로 사용되며, 본 명세서에서 상호 호환적으로 용어가 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 단위 용량은, 동물, 바람직하게 포유동물, 특히 인간에게 단일 투여량 (unitary dosage)으로서 적합한 단위를 지칭할 수 있으며, 각각의 단위는 당업자가 목적하는 질병의 예방효과 또는 면역화 효과를 생성하도록(특히, 동시에 심각한 부작용의 위험이 없도록) 계산된 항원성 물질을 함유한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 발명에서 제공하는 백신 조성물은 단위 용량 (unit dose) 형태로 제공될 수 있다.

상기 용량은 이의 투여 수단 또는 투여 경로 등 약학적 제제 분야의 기술상식에 따라 당업자가 적합한 양을 설정하여 사용할 수 있으며, 일례로 주사용 1회 투여 용량은 0.5 mL, 0.6 mL, 0.7 mL, 0.8 mL, 0.9 mL, 또는 1.0 mL 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

전술한 본원 발명의 백신 조성물을 사용자에 직접 제공하기 위한 보다 편리한 수단으로서, 본원 발명은 전술한 백신 조성물 중 어느 하나로 충전된 용기를 제공한다.

상기 용기는 당업계에 약학적 조성물 또는 백신 조성물을 제공하는데 사용되는 것으로 알려진 것이라면, 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 하나의 실시양태에서, 상기 용기는 프리필드시린지 (prefilled syringe), 바이알 (vial), 주사기(syringe), 멸균 주사침(single use needle), 마이크로니들 패치 (microneedle patch), 앰플(ample) 및 투약 카트리지(cartridge)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 백신 조성물의 전형적인 1회 주사용 용량은 0.5 mL 또는 1.0 mL, 더욱 바람직하게는 투여 그룹에 따라 0.5 mL 또는 1.0 mL의 부피로 제공되는 것일 수 있다.

따라서, 상기 정의된 바와 같은 용기 또는 주사기는 본 발명의 백신 조성물이 상기 1회 주사용량의 부피로 충전되어 제공되는 것일 수 있다. 하나의 실시 양태에서 상기 용기 또는 주사기는 일례로 0.5 mL 또는 1.0 mL 부피의 본 발명에 정의된 백신 조성물 중 어느 하나로 충전되어 제공되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은, 전술한 본 발명의 백신 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트의 구체적인 구성품은, 조성물의 제공 형태에 따라 당업계에 그 제공 형태가 알려진 것을 참고로 할 수 있다. 전술한 백신 조성물로 충전된 임의의 용기 (container)가 본 키트 내에 포함됨은 명백하다.

일례로 상기 키트는 본 발명의 백신 조성물(액체 제형이건 동결건조 제형이건)이 담겨 있거나 담겨있지 않은 1개 이상의 바이알, 본 발명의 백신 조성물이 담겨 있거나 담겨있지 않은 1개 이상의 주사기, 또는 각각을 하나 이상 모두 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 백신 조성물이 액상의 제형으로 제공되는 경우에는, 백신 물질이 프리필드시린지 (prefilled syringe)에 포함되며, 이 때의 물질은 환자투여를 위한 물질이된다. 프리필드시린지의 입구에 멸균주사침을 장착하여 환자에 투여할 수 있다.

또한 상기 키트에는 사용자에 제공될 사용설명서(package inserts)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 키트는, 상기 백신 조성물을 단회 접종 스케쥴을 위한 용량으로 제공할 수 있으며, 또한 다회 (분할)접종 스케쥴을 위한 용량으로 제공될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 백신 조성물은 약제(약학적 조성물)로서 사용하기 위한 것이다. 본 발명에 개시된 백신 조성물을 대상에서 세균 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 다양한 치료학적 또는 예방학적 방법으로, 약학적 조성물로서 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 개시된 백신 조성물을 대상에서 A형 간염 바이러스에 의한 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용할 수 있다.

또한 본 발명은, 전술한 본원 발명의 백신 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, A형 간염을 예방하기 위한 백신화 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, A형 간염 바이러스 사멸 또는 A형 간염 바이러스와 관련된 감염, 질병 또는 상태의 개선, 치료, 예방 효과를 나타내는 양을 말한다.

하나의 실시양태에서, 상기 유효량은 면역학적 유효량이다. 면역학적 유효량이란, 당업자에게 공지되어 있는 표준 분석법으로 측정시, 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응 중 어느 하나의 면역 반응을 유발하기에 충분한 항원 또는 백신의 양을 말한다. 면역원으로서의 항원의, 예컨대 바이러스 항원 또는 그의 백신에 의해 유도된 항원특이적 항혈청 (antiserum) 또는 항원중화 혈청 (neutralizaing antibody)의 수준을 측정함으로써, 또는 바이러스 항원에 의해 자극된 t 세포가 분비하는 사이토카인 (cytokine) 검출을 통해 측정할 수 있다. 또한, 면역 반응의 보호 수준은, 면역화된 개체에서의 항원 유래 바이러스 감염 감소 또는 감염으로 인해 발병하는 질병의 예방을 확인함으로서 측정할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 상기 유효량은 예방적 유효량이다. 본 발명에서 용어 '예방'은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 '예방적 유효량'은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

구체적인 실시양태에서 본 발명에 개시된 백신 조성물을 대상에서 A형 간염을 예방하기 위해 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은, 전술한 본원 발명의 백신 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, A형 간염을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 '개체'는 '대상(subject)'과 상호 호환적으로 용어가 사용될 수 있으며, 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하여 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 개 등의 포유동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역 저하된 개체는 임의의 인간 남성 또는 인간 여성이다.

본 발명의 백신 조성물은, 체내에서 그 목적하는 효과를 달성하는 한 그 투여 경로가 특별히 제한되지 않으나, 근육내, 복강내, 피내, 피하, 직장내, 전신 또는 점막 경로를 통해 상기 백신 조성물을 투여함으로써 A형 간염 바이러스 감염에 민감한 인간을 보호하거나 치료하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 1회 용량 또는 다회 용량으로 제공될 수 있다. 일부의 경우에, 본 발명에 따른 백신 조성물의 1회 용량만큼 적게 필요하지만, 일부 상황, 예를 들어 보다 큰 면역결핍의 상태 하에서는 제2, 제3 또는 제4 용량이 제공될 수도 있다. 초기 백신화에 이어서, 대상은 1회 또는 수회(다수회)의 추가 면역화를 적합한 간격으로 수행할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물이 충진된 프리필드 시린지(prefilled syringe)를 제공한다.

상기 키트 및 프리필드 시린지에는 상기 HAV 백신 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다. 또한 상기 키트 및 프리필드 시린지는, HAV 감염을 예방하기 위하여 준수해야 할 기본적인 사항들(투약시 주의사항, 투약주기, 보관온도, 유효기간 등)의 지침을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명이 제공하는 A형 간염 바이러스 제조방법에 따르면 짧은 기간 내에 안정적으로 증폭하는 A형 간염 바이러스를 제조할 수 있어, A형 간염 백신 바이러스 원료 물질로 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스(HAV)를 생산하는 방법을 나타낸 도면이다. HAV 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 시드 바이러스 (seed virus)를 수득하고, 상기 시드 바이러스를 동일 숙주세포에 감염시켜 계대 배양함으로써 HAV를 빠르고 안정적으로 증폭할 수 있다.
도 2는 본 발명에서 시드 바이러스를 제조하기 위해 숙주세포 형질전환에 사용한 벡터의 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 MA104 세포 및 Vero 세포에서 HAV를 제조하는 방법(a) 및 무혈청 적응 Vero 세포 (SF-Vero)에서 HAV를 제조하는 방법(b)을 단계별로 나타낸 도면이다.
도 4는 종래 기술에서 HAV를 제조하는 방법을 단계별로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 제조된 시드 바이러스를 MA104(a), Vero (b), SF-Vero (c)에 감염시킨 후, 3 계대(P3)에 분리한 바이러스를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 도면이다.
도 6은 본 발명의 도 3의 과정 중 P0 이후 바이러스 rescue를 위한 blind passage 단계인 passage 1 (P1)에서 passage 5 (P5)에서 확인된 바이러스 함량(역가)을 확인한 결과이다. P1-P5 각 계대 세포 용해물 및 배양 상층액에서 바이러스 역가를 흡광도 값으로 측정하였다.
도 7은 본 발명의 도 3의 과정의 p6에서 분리된 cell lysate 시료로부터 확인된 바이러스 함량(역가)을 정량 분석하여 나타낸 결과이며(도 7a), P6 계대 배양에서 만들어진 시드 바이러스를 MA104, Vero, SF-Vero 세포에 감염 시킨 후 세포내 감염된 바이러스를 면역형광법(immunofluorescence assay, IFA)로 검출한 결과를 함께 나타내었다(도 7b).
도 8은 통상적인 방법에 따라 상업적으로 구매 가능한 HAV를 숙주세포 (MA104, Vero, SF-Vero)에 감염 시키거나 (도 8의

A), 도 3의 방법에 따라 제조된 시드 바이러스를 동일의 숙주세포에 감염시킨 후 (도 8

B), 연속적으로 바이러스 감염 계대 1에서 6 계대까지 수행 후 바이러스 함량을 측정한 것이다. ELISA를 통해 6 회의 각 계대에서 수거된 감염된 숙주세포 용해물(cell lysate) 및 배양 상등액(supernatant)으로부터 바이러스의 역가를 흡광도로 측정하여, A 와 B의 숙주세포에서의 바이러스 증식을 상대적으로 비교한 결과이다.
도 9는 도 3b의 방법에 따라 제조된 시드 바이러스를 SF-Vero 세포주와 MRC-5 세포주에 감염 후 바이러스 역가를 상등액과 세포에서 10회에 걸쳐 확인한 결과이다.
도 10은 T 플라스크 (175 cm²)에서 바이러스 배양 일 수 (days)에 따른 바이러스 역가(항원함량)을 확인한 것이다. 발명의 시드 바이러스 감염 후 virus growth 양상을 확인하기 위하여 3-4 일 간격으로 감염 시료를 수거하여 상등액과 cell lysate으로부터 바이러스를 역가를 측정하여 나타내었다.
도 11은 통상적인 방법에 따라 상업적으로 구매 가능한 HAV를 cell factory 10 (CF10) 배양용기의 숙주세포에숙주세포에 감염시키거나(A), 또는 본 발명의 방법에 따라 제조된 시드 바이러스를 숙주세포 (MA104, Vero 또는 SF-Vero)에 감염시키고(B), P11 계대의 세포 용해물에서 바이러스의 역가를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 방법에 따라 제조된 HAV의 불활성화 항원 또는 상업 HAV 백신(하브릭스, GSK) 각각을 실험동물에 접종하기 전(Day -5), 2주 간격으로 2회차 접종한 후(Day 28), 및 3회차 접종한 후(Day 42), 동물의 혈액에서 분석된 항-HAV 혈청의 역가를 나타낸 도면이다. SK144 및 SK72는 발명의 바이러스를 정제 후 불활화 하여 각각 144 EL.U (3.0 IU), 72 EL.U (1.5 IU)를 투여한 것이며, HVR144, HVR72는 상용제품 Havrix를 144 EL.U, 72 EL.U로 투여한 그룹이다. 시험의 음성 대조군으로서 Normal 그룹은 바이러스 항원 대신 생리식염수를 투여하였으며, Alum 그룹은 항원을 제외한 alum adjuvant 만 투여되었다.
도 13은는 상기 도 12에 따른 실험을 진행하는 과정 중 각 동물 그룹의 평균 체중을 관찰하여 항원 접종에 따른 이상반응 여부를 관찰한 도면이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

본 발명에서 수행한 실험방법을 도 1에 요약하여 나타내었다.

1. 유전자 합성 및 벡터 제작

본 발명에서 유전자 합성에 사용한 HAV 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 나타내었다. HAV 유전자는 기능적으로 5말단 UTR (untrans lated region), Polyprotein 유전자, 3’말단 UTR의 순서대로 염기서열이 구성된다. HAV 유전자의 5’말단 방향으로 CMV 프로모터-T7 프로모터(서열번호 2), Multiple cloning site (MCS, 서열번호 3), HH(hammerhead) ribozyme(서열번호 4) 염기서열을 포함하며, 3말단 방향으로는 HDV (hepatitis delta virus) ribozyme(서열번호 5), MCS(서열번호 6), bGH polyA terminator(서열번호 7)의 염기서열이 위치한다. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 HAV 유전자 및 프로모터 등의 기타 기능적 영역을 모두 포함한 염기서열은 서열번호 8로 나타내었다.

상기 합성된 서열번호 8의 A형 간염 바이러스 유전자를 KpnI(GGTACC) 및 SalI(GTCGAC) 제한효소를 이용하여 pUC57 벡터에 클로닝하였다. 완성된 플라스미드 construction map을 도 2에 나타내었으며, HAV 발현 벡터로 명하였다.

2. HAV 발현 벡터를 이용한 형질전환 (Transfection)

6well culture plate에 각각 MA104 (ECACC, 85102918), Vero (WHO) (ECACC, 88020401) 세포주를 2×10⁵ cells/well/2 mL의 조건으로 10% 및 5% FBS를 포함하는 EMEM(Lonza) 배지에 각각 준비하였고, Serum Free Vero 세포(Vero(WHO) 유래의 무혈청 적응세포, SF-Vero)는 4×10⁵ cells/well/2 mL 조건으로 무혈청의 EMEM 배지에 준비하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포 준비에 사용한 배지는 각 세포의 배양 배지(culture medium)가 된다.

18-24시간 후 culture plate에서 배양 배지를 제거하고 2 mL의 DPBS로 2회 세척하고, 배양 배지를 well에 2 mL씩 첨가하였다. HAV 발현 벡터(플라스미드) 1.0 μg, Lipofectamine LTX-Plus (ThermoFisher) 35 μL, Opti-MEM (ThermoFisher) 960 μL를 conical tube에서 혼합하여 실온에 15 분 방치하였다. 혼합액을 200 μL씩 plate well에 첨가하고 5% CO₂, 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 모든 세포의 상층액을 제거하고, MA104, Vero 세포주는 2% FBS를 포함하는 EMEM (2% FBS-EMEM), SF-Vero 세포주는 무혈청의 EMEM 배지 (SF-EMEM) 2 mL로 교환하고, 35℃, 5% CO₂ 배양기에서 3주 동안 배양하였다. 배양된 MA104, Vero 및 SF-Vero 세포를 500 μL의 EMEM 배지에 수거하여 부유시키고, 3회 freezing/thawing을 수행하였다. 파쇄되고 남은 cell debris를 제거하기 위하여 10,000g에서 1분간 원심 분리하여 상층액만을 다시 모아 바이러스 P0 (시드 바이러스)로 정하였다.

3. Virus 분리 (Virus rescue)를 위한 맹목 계대 (Blind passage)

P0 바이러스를 이용하여 최초 blind passage인 P1으로 감염 계대 진행 시에는 T25 flask에 MA104 및 Vero 1×10⁶ cells/5 mL, SF-Vero 5×10⁶ cells/5 mL로 감염하기 24시간 전 준비하였다. P1-P4 감염 계대시에는 T25 flask에 MA104, Vero 세포는 7×10⁵ cells/5 mL의 농도로, SF-Vero 세포는 1×10⁶ cells/5 mL로 배양 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 24시간 후, 준비한 세포에서 배양 배지를 제거하고 DPBS를 5 mL씩 첨가하여 감염 직전 2회 세척하였다. P5 및 P6 감염 계대에서는 P4로 부터의 감염 계대 진행하기 하루 전에 T175 Flask에 MA104 및 Vero 세포를 5×10⁶ cells/30 mL로, SF-Vero 세포는 8×10⁶ cells/30 mL로 준비하였으며, 감염 직전 준비한 세포에서 동일하게 배지를 제거하고 30 mL DPBS로 2회 세척하였다.

2% FBS가 포함된 EMEM 배지는 MA104, Vero 세포주로 바이러스 감염 배지(infection medium) 이며, FBS 가 포함되지 않은 EMEM은 SF-Vero 세포주의 감염 배지로 사용하였다. P1-P4 감염 계대는 각 세포의 감염 배지 5 mL, P5-P6의 감염 계대는 감염 배지 35 mL을 사용하였다. P6 계대에서는 5개의 T175 Flask를 이용하여 감염 계대를 진행하였다. 준비된 P0의 시료를 준비된 세포에 첨가하고 1시간 동안 35℃, 5% CO₂에서 방치 후, 감염배지 5 mL (35mL)을 첨가하였다.

P0 시료 감염 후 21일 동안 7일 간격으로 배양배지를 교환하며, 감염세포를 유지하였다. 감염 후 21일째 세포성분(cell lysate)을 수거하여 P0 수거시와 마찬가지로 3 회 freezing/thawing (-70℃/37℃)을 수행 후 cell debris를 제거하고 원심분리한 후, 상층액만을 모아 이를 바이러스 배양액으로 하고 passage 1(P1)으로 정하였다. P0에서 P1으로 진행하는 동안은 매주 배지 교환을 수행하였으나, P1에서 P6 계대시에는 감염 후 7일째에만 배지 교환하였다. 20-21일을 1회의 계대 기간으로 하여 총 6회의 계대를 연속적으로 진행하였다. 상술한 세포감염 및 계대 진행의 과정을 도 3에 나타내었다.

1회의 계대가 종료된 후 바이러스가 감염된 플라스크에서 배양 상층액과 cell lysate를 각각 수거하였다. cell lysate 수거 시, 상층액이 제거된 플라스크에 Trypsin-Versene (Lonza) 용액을 2 mL 첨가하여 세척 후 제거하고, 다시 Trypsin-Versene 용액을 2 mL 첨가하여 37℃ incubator에서 5분간 방치 후 cell을 떼어냈다. Cell이 부유된 2 mL Trypsin-Versene 부유액을 conical tube에 옮겨 담고, 원심분리하여 cell pellet 상태로 모았다.

Cell lysate (pellet)에 EMEM 1 mL (T25, P1-P4) 또는 5 mL (T175, P5)을 첨가하여 3회 freezing/thawing 한 후 원심분리하였고, 이후 cell debris가 제거된 상층액(cell lysate 시료)으로 준비하였다. 수거한 각 감염 계대의 배양 상층액과 원심분리 후 cell lysate 시료에서 200 μL씩 바이러스 역가 분석용으로 microcentrifuge tube에 옮겨 분석 시까지 냉동보관하였다. 분석용을 제외한 나머지 cell lysate 시료를 모두 다음 회차의 감염에 사용하였다.

P1-P5는 ELISA 정성분석으로 역가를 측정하였으며 passage 6(P6)에서는 배양 상등액을 제거하고 감염 세포를 모두 모아 무혈청의 EMEM 5 mL에 부유시킨 후, 5회 freezing-thawing 한 후 원심분리로 cell debris를 제거한 후 상층액만을 수거하여 시드 바이러스로 보관하였다. ELISA 정성분석으로 P6 바이러스 역가를 측정하였다.

4. Blind Passage 과정의 세포변성 효과 확인

바이러스 감염에 따른 숙주세포의 세포변성(CPE)는 현미경 검경으로 수행하였다. MA104, Vero 세포주에서는 P4 계대까지 바이러스에 의한 세포 변성 효과가 보이지 않았으나, P5 계대부터 cell lysis 및 detachment 등 바이러스에 의한 CPE가 확인되었으며, SF-Vero 세포주에서는 P3 계대 진행 후 mild CPE를 보였다.

5. HAV 항원분석 ELISA

바이러스 blind passage 동안 수거된 시료 내 HAV 항원 측정은 정성(qualitative) 및 정량(quantitative) 분석을 통해 측정되었다. 정성분석은 HAV 특이 ELISA 수행하여 흡광도 (optical density, 450 nm)로 항원을 확인하였고, 정량 분석은 표준품 (Inactivated HAV BRP, 1350 IU/mL, Y0001192, EDQM)을 적용하여 standard curve를 작성, 검체 내 HAV 바이러스 역가(항원 함량)을 측정하였다. 분석용 키트 HAV-Antigen ELISA Kit (Mediagnost, E12)를 이용하였으며 바이러스 역가 단위는 표준품에 따라 IU/mL로 표기하였다. 사용한 상업용 A형 간염 바이러스주(ATCC VR-1402)도 동일의 방법으로 정량하였다.

6. Transmission Electron Microscopy (TEM)

도 3의 P6 계대 배양 후 수거된 cell lysate의 일부를 이용, 투과전자현미경상을 관찰하였다. formvar-carbon coated EM grid를 이용하여 2% uranyl acetate로 15초간 negative staining 하여, 투과전자현미경(JEM-1011, JEOL)으로 관찰하고 Camera-Megaview III Imaging 장비로 바이러스 입자를 확인하였다.

7. Immunofluorescence Assay (IFA)

24-well culture plate에 5×10³ cells/well/0.5 mL 조건으로 MA104, Vero 세포를, 8×10³ cells/well/0.5 mL의 농도로 SF-Vero 세포를 각 배양 배지에 부유시켜 준비하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양된 세포에서 배지를 제거하고 300 μL/well로 DPBS를 첨가하여 세척하였다. 도3에서 제조된 시드 바이러스를 각 세포의 감염 배지로 희석하여 0.1 IU/well 농도로 세포에 처리하고 감염 배지 0.5 mL씩 각 well에 첨가하여 35℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 감염일로부터 7 일차에 세포의 상층액을 모두 제거하고 0.5 mL DPBS로 2회 세척하였다. 세포에 남은 DPBS를 모두 제거하고, 3.7% formaldehyde 용액을 0.2 mL 첨가한 후 실온에서 30분간 방치하였다. Formaldehyde 용액을 제거하고 상기와 동일하게 DPBS로 3회 세척하였다. 0.2% Triton X-100 버퍼용액을 250 μL/well로 첨가하고, 실온에서 5분 방치 후 0.5 mL DPBS로 3회 세척하였다. 1차 항체를 (Anti-HAV Surface Ag, Raybiotech) 1/500로 PBS에 희석하여 250 μL/well로 첨가하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 2차 항체 (Goat anti-Mouse IgG Alexa488, ThermoFisher)를 1/4000로 희석하여 1차 항체 처리 용량과 동일하게 세포에 첨가 후 1시간 실온에서 방치후 DPBS로 5 회 세척하고 제거하였다. 세포에 250 μL/well로 DPBS를 첨가하고, 형광현미경 (Magnification 100×, Eclipse Ts2-FL, Nikon)으로 촬영하였다.

8. 시드 바이러스 감염 확인 (Infection test)

도 3에서 제조된 시드 바이러스와 상업용 A형 간염 바이러스주(ATCC VR-1402)와의 감염 패턴을 비교하였다. 이를 위하여 본 특허에 기술한 ELISA로 상업용 바이러스주의 바이러스 역가(함량)를 정량하였다. 바이러스 감염 24 시간 전 T75 플라스크에 MA104, Vero 세포주는 2×10⁶ cells로 SF-Vero 세포주는 3.5×10⁶ cells로 12 mL 배양 배지에 준비하였다. 시드 바이러스 및 상업용 바이러스주를 2.0 IU씩 1 mL 감염배지에 부유시켜, DPBS 10 mL로 세척하여 준비한 T75 플라스크의 각 세포에 첨가하였다. 35℃, 5% CO-₂ incubator에서 1시간 반응 후, 감염 배지 11 mL을 첨가하여 배양하였다. 21일 배양하였으며, 감염 후 7일째에는 배지를 fresh한 감염 배지로 교환해 주었다. 21일 배양의 1 회 바이러스 감염 계대를 총 10회 진행하였으며, 바이러스 함량 분석을 위한 시료 수거 및 연속 감염 계대는 blind passage에서와 동일하며, cell lysate 시료 수거 시 5 mL의 혈청 미포함 EMEM에 최종 부유시켜 다음 감염 계대를 위한 시료로 사용하였다.

또한 T75 플라스크에 total cell 수 8×10⁶ cells/12 mL로 MRC-5 (ECACC, 05011802) 세포주를 준비하고, SF-Vero는 3.5×10⁶ cells/12 mL 세포 농도로 준비하여, 도 3b에서 제조된 시드 바이러스를 위의 T75 플라스크 감염에서와 동일 조건으로 총 6 회의 연속 감염 계대를 진행하였다. 각 바이러스 감염 계대에서 수거한 일부 상층액 및 일부 cell lysate 시료내 바이러스 역가(함량)을 측정 및 비교하였다. MRC-5 세포주의 배양 배지는 EMEM 배지 내 FBS 10%, 감염 배지는 2% 농도로 포함된 상태로 사용하였다. 바이러스 감염 후 상등액 및 세포 수거의 방법은 freezing/thwaing을 반복하는 것으로 동일하며, 자세한 방법은 blind passage 수행의 방법에서 서술한 것과 같다.

9. 시드 바이러스의 Growth 확인 시험

감염 하루 전 T175 flask에 SF-Vero 세포를 2×10⁷ cells/35 mL로 seed 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 동일한 cell density의 T175 flask를 모두 9 개 준비하여, 8 개 flask는 바이러스 감염, 나머지는 normal cell 대조군으로 하였다. 감염 당일 모든 flask의 배양 배지 제거 후, 각 flask를 DPBS 30 mL을 이용해 세포를 세척하였다. 배양배지 35 mL에 SF-Vero 유래 시드 바이러스 15 IU 가 포함된 바이러스 감염액을 제조하여 세척한 T175 플라스크에 첨가하였다. 총 8 개의 플라스크에 동일하게 15 IU가 감염되도록 하였다. 감염시킨 세포를 35℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하면서 감염 후 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28 일째(days post-infection, dpi)에 각각 상등액과 cell lysate를 수거하여 바이러스 역가(함량)를 측정하였다.

10. 시드 바이러스 Cell Factory 배양

각 세포 유래의 시드바이러스를 동일 방법으로 T175 flask에서 추가 감염 계대를 진행하여, 11계대(MA104, Vero) 및 12계대(SF-Vero)까지 진행하여 바이러스의 세포 적응도를 높이고 해당과정의 감염세포를 수거하였다. 추가 감염 계대의 방법은, P6에서 수확한 최초의 시드 바이러스를 2회 T175 플라스크에서 감염 배양하여 P8 계대의 바이러스를 얻었고, P9로의 감염 시에는 P8에서 얻은 바이러스 시료를 정량하여 15 IU/T175 농도로 감염하였다. 동일하게 P11 및 P12까지 감염-수거를 반복하여 계대하였다. 시드 바이러스의 P11 (MA104, Vero) 및 P12(SF-Vero) 계대 바이러스는 정량하여 500 IU에 해당하는 바이러스를 별도의 cryovial에 분주하였다. 상업용 바이러스는 도 6의 6회의 계대후 수득한 상업용 바이러스 시료를 이용하여, 위의 추가 감염 계대와 동일하게 P11(MA104, Vero), P12(SF-Vero)로 감염 계대하여 바이러스를 얻었다. 추가 감염 계대에서 상층액은 수거하지 않았으며, 감염 세포만을 수거하여 Sonifier로 40 초간 세포파쇄하여 원심분리 후 상등액만을 수거하여 사용하였다. 시드 바이러스 및 상업용 바이러스를 각각 500 IU 동량으로 CF10(6320 cm², ThermoFisher)의 숙주세포 감염에 사용하였다. CF10에서의 감염 방법은 다음과 같다. MA104, Vero, SF-Vero 세포를 배양배지 2.0×10⁸ cells/1.5 L로 준비하였다. 16-18시간 이후 배양 배지를 제거하고, 세포를 DPBS 500 mL로 1회 세척하고 제거하였다. EMEM 배지 200 mL에 준비한 500 IU의 바이러스를 첨가하여 바이러스 감염액을 제조하고, 세척된 CF10에 첨가하였다. 35℃, 5% CO₂ 조건에서 60분간 배양하며, 15분마다 플라스크를 기울여 바이러스 희석액이 세포에 고루 흡착할 수 있도록 하였다. 바이러스 흡착 후 각 세포의 감염배지를 (MA104, Vero: 2%FBS-EMEM, SF-Vero: SF-EMEM) 1.5 L 첨가하여, 35℃, 5% CO₂ 조건에서 21일 배양하였다. 바이러스 배양 7일차에 fresh한 감염 배지로 배지교환하였다.

감염 후 CF10에 바이러스 감염 배양의 Harvest의 과정은 다음과 같다. 감염이 끝난 CF10 용기에서 상층 배양액을 제거하였다. CF10을 DPBS 500 mL로 세척 후 제거하고, TrypLE Express (ThermoFisher) 200 mL을 첨가하여 3-5분간 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 혈청이 포함되지 않은 EMEM 200 mL을 첨가하여 약 400 mL 용량의 감염세포 부유액으로 2 L Square Bottle에 수거하였다. 수거한 부유액을 5000g에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버리고 cell pellet만 회수하였다. Cell pellet에 phosphate Buffer (50 mM, pH 7.0) 100 mL을 첨가하고 부유시킨 뒤, Sonifier (SFX550, Branson)로 음파처리하여 (amplitude 40%, 2분) 세포 파쇄하였다. 세포 파쇄액 약 100 mL을 원심분리 (5000g, Allegra X-15R, SX4750A)하여 상등액을 멸균된 새로운 1 L Square Bottle에 옮겼다. 원심분리 후 상등액 100 mL 중 일부 100 μL를 보관하여, ELSIA 분석에 사용하였다. 400 mL의 phosphate Buffer (50 mM, pH 7.0)를 추가하여 정제 프로세스에 사용하였다. MA104, Vero 유래 세포 파쇄액은 별도 보관하였으며, 동물시험 투여를 위한 항원 정제는 SF-Vero에서 배양된 바이러스 감염 세포의 파쇄액을 이용하였다.

11. 바이러스 정제 및 불활성화

회수된 세포 파쇄액을 capsule filter (Sartopure PP3, 5 ㎛, Sartorius Stedim) 및 depth filter (Supra 50, 050PDH4, PALL)를 이용하여 순차적으로 정화하였다. 정화된 수확물은 100 kDa ultrafiltration/diafiltration (UF/DF) 필터 (Pellicon® 2 Mini, P2B100A01, Merck Millipore)를 이용하여 phosphate Buffer (50 mM, pH 7.0)으로 완충교환하며 여과 및 10배 농축 후 benzonase (1 unit) 처리하였다. phosphate buffer (50mM, pH7.0)으로 평형화시킨 DEAE Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare) column으로 10 mL/분의 속도로 ion exchange chromatography (IEC)를 수행하였다. 약 200 mL의 분획을 수집하여 10 kDa UF/DF 필터 (Pellicon® 2 Mini, P2B010A01, Merck Millipore)를 이용하여 phosphate buffer (50 mM, pH 7.0)으로 완충교환하며 5배 농축하였다. 농축액은 HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare)을 이용하여 1 mL/분의 속도로 size exclusion chromatography (SEC)를 하였다.

SEC 수행 후 약 40 mL의 항원 분획을 수집하였고 10 kDa (Pellicon® 2 Mini, P2B010A01, Merck Millipore) 필터를 이용하여 80배 농축하여 정제된 HAV 항원을 수득하였다. 바이러스 불활화를 위해 수득한 항원에 270-370 ㎍/mL의 농도로 포름알데히드(formaldehyde)를 첨가하여 37℃에서 5일 반응시켰다. 이후 10 kDa 필터로 diafiltration하고, 0.22 ㎛ 필터(Millipak® Gold)로 제균 여과하였다. 동물시험의 각 투여 회차의 투여 24시간 전, 흡착 버퍼 (adsorption buffer, pH 7.1 ~ 8.0)에 alum hydroxide를 부유시켜 항원과 혼합한 후 4℃에서 16시간 이상 교반하였다.

12. 동물실험

마우스 (BALB/c, 4주령, 그룹당 10개체)에 상기 Alum 흡착된 항원을 투여하였다. 동물 시험의 대조군으로 상용 HAV 백신(하브릭스, GSK)을 이용하였고, 마우스에 투여한 항원 (3.0 IU 및 1.5 IU)및 대조군의 용량 (144 EL.U 및 72 EL.U, ELISA Unit)은 상용 백신에 제시된 사람(성인 및 소아) 투여 용량의 1/10 로 설정하였다. 투여 항원 용량 설정은, 대조군(상업백신)에 결합되어 있는 alum 염을 탈착(dissociation)시켜, 항원으로만 분리한 후 특허의 항원과 그 양을 함께 측정 및 비교하여 용량을 동일 수준으로 맞추었다. 동물 시험 시 항원은 근육(IM, intramuscular injection)으로 2주 간격, 3회 투여하였다. 투여 후 마우스 전혈로부터 혈청을 분리하여 Anti-Total HAV 항체가를 측정하였다. 표준대조물질로 97/646 (NIBSC, International Standard for Anti-Hepatitis A, Immunoglobulin)를 설정하였으며, 측정 시 Anti-HAV ELISA (E10, Mediagnost), 또는 Anti-Hepatitis A Virus IgG ELISA (4660, ALPHA Diagnostic International)을 사용하였다.

실험결과

본 발명에서는 HAV 유전자를 발현할 수 있도록 유전자 발현 카세트를 디자인하고, 해당 카세트를 합성하여 카세트 발현 벡터를 확보하였다. 합성 기반의 HAV 발현 벡터를 3 종류의 세포주 (MA104, Vero, SF-Vero)에 Transfection하고, 유전자가 transfection 된 세포 (transfectant)를 파쇄하여 동일의 세포에 감염 시키고, 바이러스 입자가 확인될 때까지 계대 (Blind passage or virus infection passage)를 수행하여 바이러스를 분리하였다. 이로 부터 일정의 바이러스양을 확인하여 추후 백신 제조 및 연구에 활용가능한 시드 바이러스로 제조하였다. 시드 바이러는 계대 배양 6회만에 제조되었으며, 제조 후 마이코플라스마 및 sterility 시험을 수행하여 무균의 상태로 제조됨을 확인하였다.

기존 상업백신의 경우 백신 생산에 사용할 바이러스 (mastser seed lot)를 제조하기 위하여, primary AGMK 배양 및 혈청을 필수로 요하는 MRC-5에서 계대 배양하여 바이러스를 수립하는 수회차의 바이러스의 세포 적응 (cell culture adaptation)과정을 수행하나, 본 발명에서는 이와 달리 유전자 발현 벡터를 이용하여 바이러스를 분리하는 방법을 고안, 적용하였다. 고안된 방법으로 제조된 시드 바이러스 중, 무혈청 배양의 백신 생산세포주 (SF-Vero)에서 제조된 시드 바이러스 (926 IU/mL)는 백신용 세포주 유래의 바이러스로, 상업적으로 백신 개발 시 적용 가능성이 높다 할 수 있겠다. 해당 시드 바이러스를 증폭시켜, 정제하고 감염성을 제거하는 불활화 과정을 거친 후 adjuvant 흡착 후 마우스에 투여하여, 상용백신 대비 특허의 투여항원에 대한 항혈청가가 유사함을 확인하였다.

전술한 벡터를 이용한 바이러스 제조의 방법 및 바이러스 제작에 사용한 HAV 발현 카세트를 도식화하여 각각 도 1과 도 2에 기술하였다. 도 1의 과정을 MA104 및 Vero 세포주, SF-Vero 세포주에서 수행한 2 가지 배양 과정을 나열하고, transfection, blind passage의 과정을 소요 기간과 함께 도 3에 나타내었다. P1에서 P5 까지의 감염 계대를 진행한 후 각 계대에서 수거하여 측정한 상등액과 cell lysate 내의 바이러스 역가(함량)는 도 6과 같이 확인되었다. Transfection 이후 수회의 계대가 지나지 않았음에도 ELISA 검출 상 바이러스가 확인되었으며, 상등액 및 cell lysate 시료에서 안정적으로 바이러스가 증폭되었음을 확인하였다. 상대적인 바이러스 검출량은 상등액에 비해 Cell Lysate에서 높게 확인되었으며, 이는 non-lytic한 HAV 특징을 반영하는 것이라 할 수 있다. 다음 회차인 P6 계대 배양이 종료 직후, cell lysate으로부터 바이러스 입자를 전자현미경으로 확인하였으며 (도 5), 바이러스 함량을 정량하여 2371 IU/mL (MA104), 586 IU/mL (Vero), 926 IU/mL (SF-Vero)으로 확인하였다 (도 7a). MA104 세포주는, A형 간염 바이러스와 같이 위장관에서 증식하는 바이러스(enteric viruses)의 감염 연구에 활용된 점을 참조하여 (JH Lee et al., 2013), 해당 세포주로부터 연구용 시드 바이러스를 증폭시켜 확보하기 위하여 사용되었다. Vero 및 SF-Vero 세포주는 그 기원이 같으나, 혈청 유무의 조건으로 그의 바이러스 배양조건을 달리한다. 특히 SF-Vero 세포는 무혈청 조건에서도 발명의 바이러스가 원활하게 증폭될 수 있음을 확인하기 위하여 같이 선정되었다. 시드 바이러스의 함량은 무혈청 배양 조건에서 배양 및 분리된 SF-Vero 유래의 시드 바이러스가 Vero 세포 유래 시드 바이러스 대비 상대적으로 높은 함량으로 확인되었다. 제조된 시드 바이러스를 24-well plate에서 0.1 IU/well 함량으로 감염하여 7일차에 면역형광반응으로 바이러스의 감염성 확인하였다 (도 7b).

도 7a의 제조한 시드 바이러스 3 종류와 상업용 바이러스 (ATCC stock, 227 IU/mL)를 실험방법 8. 시드 바이러스 감염 확인 방법에 서술한 것과 같이 2.0 IU 감염하여 발명의 시드 바이러스와 상업용 바이러스가 동일 세포주에 감염 시 증폭되는 정도를 비교하였다. 총 6 회의 연속 감염 계대를 진행한 감염 배양의 상층액과 cell lysate로부터 바이러스를 검출하였으며, 상업용 바이러스주 (도 8a)에 비해, 발명의 시드 바이러스 (도 8b)가 바이러스 역가가 안정적이면서 상대적으로 높게 측정됨을 확인하였다 (도 8).

또한 기존 A형 간염 백신의 생산세포로 사용되어왔으며 배양 시 혈청을 요구하는 MRC-5 세포주와 본 특허에서 바이러스 제조 및 감염에 사용한 무혈청 배양의 백신 생산세포인 SF-Vero 세포주를 감염 세포로 하여, 도 3b의 SF-Vero에서 제조한 시드 바이러스를 2.0 IU 감염하여 비교하였다. 총 10회의 계대를 진행하는 동안 상층액과 cell lysate를 ELISA 분석하여 바이러스 역가(함량)를 흡광도 값으로 상대비교한 결과, SF-Vero 세포에서의 바이러스 생산은 감염 후 1회 계대부터 바이러스가 검출되기 시작하였고, 계대 2회차 부터는 cell lysate에서 측정되는 바이러스역가가 ELISA 반응에서 일정하게 검출되는 패턴을 보였다 (도 9a). MRC-5에서의 계대에서는 수거한 cell lysate 시료에서 바이러스 검출이 비슷한 수준으로 측정된 계대 회차가 있으나, 일정한 바이러스 역가의 증가 패턴을 나타내지 않았다. 특히 백신 생산용의 SF-Vero에서의 감염 계대 결과와 대조적으로 상등액에서 바이러스 검출이 낮았다 (도 9b). 이를 통해 발명의 방법으로 제조한 시드 바이러스가 SF-Vero 세포에서 바이러스 증폭이 원활하며, 감염 계대 후 배양에 따른 바이러스의 세포 적응도가 MRC-5 세포 대비 SF-Vero 세포주에서 높음을 확인할 수 있었다. 그래프와 함께 측정된 흡광도 결과값을 보고하였다 (도 9).

동물실험에 사용할 바이러스를 얻기 위한 CF10 배양을 수행하기 전, T175 flask에 발명에서 제조한 SF-Vero 유래의 시드 바이러스를 감염하고, 배양일수 (days)에 따른 바이러스 역가(함량) 변화를 3-4일 간격으로 확인하였다 (도 10). 이는 바이러스 감염될 세포의 배양 단위 면적당 바이러스의 함량을 설정함과 동시에 발명의 바이러스의 배양 기간을 확인하기 위하여 우선적으로 수행하였다. 바이러스 감염 후 측정 결과 감염 후 10일을 기점으로 세포 내 바이러스의 양이 증가하였으며, 앞의 도면 (도 6, 도 7, 도 8, 도 9)에서와 마찬가지로 cell 내에서 증폭된 바이러스가 상등액 대비 높은 역가로 확인되었다. 특히 감염 후 20-21일 경에 바이러스 함량이 최대로 확인되었다. 최초 감염 바이러스량(15 IU) 대비 약 230 배의 바이러스 증폭 (3537 IU, 21 dpi)을 확인하였다 (도 10).

도 11을 참고하면, 동일 조건의 감염 계대횟수를 가지는 시드 바이러스와 상업용 바이러스를 CF10에서 동일하게 배양하여 얻은 바이러스 역가 측정 결과, 본 발명의 방법에 따라 제조하여 계대를 진행한 바이러스 역가(B)의 경우, 장기간 소요된 통상적인 방법(A)에 따라 얻어진 상업용 바이러스를 동일하게 배양하여 얻은 바이러스 역가(A)와 비교해 현저히 높게 측정되는 것으로 확인하였다. 현저한 수준이라 함은, 동일 바이러스 배양 면적, 동일 배양방법을 전제로 발명의 방법에 따른 역가 (B)가 (A)에 비해 그 함량이 150% (MA104, 1.53배), 470%(Vero, 4.70배), 251%(SF-Vero, 2.51배) 증가한 것을 말한다. 동일 조건에서 계대 배양을 진행했을 때 본 발명의 방법이 통상적인 방법과 비교해 바이러스의 역가가 더 높게 확인이 되었다는 것은 본 발명의 방법이 HAV 바이러스를 더 빠르고 안정적으로 제조할 수 있다는 것을 의미한다. 각 세포주간의 바이러스 역가의 차이는 A형 간염 바이러스 감염에 대한 감수성 (cell susceptibility)의 차이에 의한 것으로 추측되나, 추후 본 발명의 시드 바이러스의 특성 연구를 통해 확인되어야 할 것으로 사료된다. 무엇보다 본 발명에서는 기존의 MRC-5를 기반으로하는 A형 간염 백신의 상업생산에서 벗어나, 새로운 바이러스주를 개발하고 이를 백신생산주에 적용하고 그의 배양 가능성을 확인했다는 데에 의의가 있다 할 수 있다.

한편, 도 12는 본 발명에서 제작한 시드 바이러스를 배양, 정제하여 불활성화 한 후 마우스 실험동물에 2주간격으로 3회 투여 후, 채집한 마우스 전혈에서 분리한 혈청으로 투여한 불활성화 항원에 대한 항체 생성 여부를 확인한 것이다. 도 13은 동물실험 진행 중의 각 그룹별 동물 체중의 평균값을 나타낸 도면이다. SK144 및 SK72는 발명의 바이러스를 정제 후 불활화 하여 각각 3 IU (144 EL.U), 1.5 IU (72 EL.U)를 투여한 그룹이며, HVR144 및 HVR72는 상용제품 하브릭스를 144 EL.U, 72 EL.U로 투여한 그룹이다.

도 12를 참고하면, Day-5는 최초 투여 5일 전의 마우스 혈청, Day 28은 2회차 투여 후 14일째의 혈청, Day 42는 3회차 투여 후 14일째의 혈청을 의미한다. 각 투여 그룹 (injection group)의 막대 그래프는 각 날짜에 수거된 마우스 혈청 내 존재하는 anti-HAV Antibody (total IgG 항 HAV 혈청)의 농도를 의미한다. 혈청의 농도는 상기 실험방법 12. 동물실험 항에 서술한 항체가 분석방법으로 측정되었다.

각 투여 그룹의 투여 전 Day-5 혈청에서는 모든 그룹에서 항 HAV 혈청가의 증가는 확인되지 않았다. Day 28일 째의 혈청 분석에서는 SK144 그룹 (평균 항체가 5.742 mIU/mL)과 HVR144 그룹 (평균항체가 5.783 mIU/mL)간의 항체가와 (p>0.9999), SK72 그룹 (4.377 mIU/mL)과 HVR72 그룹 (4.875 mIU/mL)의 항체가 또한 유사한 수준 (p=0.3895)으로 확인되었다. Day 42일 째의 혈청 분석에서는 SK144 그룹 (평균 항체가 6.002 mIU/mL)과 HVR144 그룹 (평균항체가 6.223 mIU/mL)간의 항체가와 (p=0.8825), SK72 그룹 (5.432 mIU/mL)과 HVR72 그룹 (5.446 mIU/mL)의 항체가 또한 유사한 수준 (p>0.9999)으로 확인되었다.

도 12는 제품화된 A형 간염 백신(하브릭스)과 비교 시, 본 발명의 방법에 따라 제조된 HAV 항원의 면역학적 효능에 있어 유효한 차이가 없음을 보여준다. 참고로, 마우스에는 사람 용량으로 투여 할 수 없으므로 1/10 Human Dose를 사용한 것으로, 상용화 A형 간염 백신의 성인 투여 용량인 1440 EL.U/Injection dose와 소아 투여 용량 720 EL.U/Injection dose을 기준으로 산정하였다.

도 13을 참고하면, 동물시험 시작일부터 종료일까지 육안 관찰상 원인 불명의 이상반응, 마우스 스트레스 및 면역원성 측정에 영향을 줄 수 있는 항원투여 후 즉각적인 이상반응, 체중감소는 발견되지 않았다. 또한 육안적 관찰에서도, 투여된 발명의 정제된 불활화 항원 및 대조물질에 의한 이상반응 또한 확인되지 않았다.

본 발명이 제공하는 A형 간염 바이러스 제조방법에 따르면 짧은 기간 내에 안정적으로 증폭하는 A형 간염 바이러스를 제조할 수 있어, A형 간염 백신 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다. 또한 한국에 국내 기술로 개발되어 있지 않은 A형 간염 백신 기술 개발의 원천기술로 활용될 수 있다.

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Claims (21)

1. 서열번호 1로 표시되는 A형 간염 바이러스 유전자.
   
2. 제1항의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression Cassette).
   
3. 제2항에 있어서, 상기 발현 카세트는 프로모터, HH (Hammerhead) 리보자임 및 HDV (Hepatitis Delta Virus) 리보자임을 포함하는, 발현 카세트.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 발현 카세트.
   
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 벡터.
   
6. 제5항의 벡터로 제조된 A형 간염 바이러스.
   
7. (a) 서열번호 1의 A형 간염 바이러스 유전자를 포함하는 A형 간염 바이러스 제조용 발현 카세트(Expression cassette)를 포함하는 벡터를 분리된 숙주세포에 형질전환(transfection)시키는 단계;
   (b) 상기 숙주세포로부터 바이러스를 수득하는 단계;
   (c) 상기 수득한 바이러스를 분리된 숙주세포에 감염시켜 계대 배양하는 단계; 및
   (d) 상기 (c) 단계의 숙주세포에서 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 A형 간염 바이러스 유전자의 5'말단 방향에 순서대로 CMV 프로모터, T7 프로모터, 다중클로닝영역 (MCS), HH (Hammerhead) 리보자임 영역을 포함하고, 상기 A형 간염 바이러스 유전자의 3'말단 방향에 순서대로 HDV (Hepatitis Delta Virus) 리보자임, MCS 및 Poly-A Tail을 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 Vero, MA104, WI-38, BHK-21, CHO, MDCK, Hi5, CEF 및 Sf9 로 이루어진 군에서 선택되는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
    
11. 제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 무혈청(Serum Free) 배지에서 적응된 세포인 것인, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
    
12. 제7항에 있어서, 상기 계대 배양은 2 내지 30회 수행하는 것인, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
    
13. 제7항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 숙주세포는 3회 이상의 계대 배양에서 세포변성효과(Cytopathic Effect)가 나타나는 것인, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
    
14. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계 및 상기 (c) 단계의 숙주세포는 동일한 세포인, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
    
15. 제7항에 있어서, 상기 (d) 단계 이후에 바이러스의 정제 단계, 불활성화 단계, 또는 정제 및 불활성화 단계를 추가로 포함하는, 백신 제조를 위한 A형 간염 바이러스 제조방법.
    
16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 A형 간염 바이러스.
    
17. 제16항의 바이러스를 유효성분으로 포함하는 A형 간염 백신 조성물.
    
18. 제17항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신 또는 사백신(Inactivated Vaccine)인 것인, A형 간염 백신 조성물.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 면역보조제(Adjuvant)를 추가로 포함하는 것인, A형 간염 백신 조성물.
    
20. 제17항에 따른 백신 조성물을 포함하는 키트.
    
21. 제17항에 따른 백신 조성물이 충진된 프리필드시린지(Prefilled syringe).

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