JP3523646B2 - Ａ型肝炎ワクチン - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、米国保健厚生省（the Department of H
ealth and Human Services）により授与された所定
の共同研究開発協定に基づく政府助成金を受けた上で考
案された。政府は、本発明における所定の権利を有す
る。
ealth and Human Services）により授与された所定
の共同研究開発協定に基づく政府助成金を受けた上で考
案された。政府は、本発明における所定の権利を有す
る。
発明の分野
本発明は、一般的には、Ａ型肝炎の予防に役立つワク
チン組成物の分野に関する。より具体的には、本発明
は、新規のＡ型肝炎生ウイルス（HAV）、ならびに組換
えHAVおよびキメラHAVを提供するが、それらのゲノム
は、その親株であるHM−175のゲノムに、ヒトおよび他
の霊長類における生ワクチンとしての利用のためにMRC
−５細胞内で増殖し、しかも適切な弱毒効果を保持する
能力を提供するための修正を加えてできたものである。
チン組成物の分野に関する。より具体的には、本発明
は、新規のＡ型肝炎生ウイルス（HAV）、ならびに組換
えHAVおよびキメラHAVを提供するが、それらのゲノム
は、その親株であるHM−175のゲノムに、ヒトおよび他
の霊長類における生ワクチンとしての利用のためにMRC
−５細胞内で増殖し、しかも適切な弱毒効果を保持する
能力を提供するための修正を加えてできたものである。
発明の背景
米国においては、全臨床的肝炎症例の約25％がＡ型肝
炎ウイルスに起因するものであり、約150,000件の前記
症例がその内訳となっている。工業国内でのＡ型肝炎罹
患の高危険率集団には、社会的に恵まれない人々、医療
従事者、軍事従事者、保育園の職員および保育園におい
て子供に接触する成人、男性の同性愛者、薬物依存症患
者、ならびに伝染病が蔓延する地域への旅行者が含まれ
る。
炎ウイルスに起因するものであり、約150,000件の前記
症例がその内訳となっている。工業国内でのＡ型肝炎罹
患の高危険率集団には、社会的に恵まれない人々、医療
従事者、軍事従事者、保育園の職員および保育園におい
て子供に接触する成人、男性の同性愛者、薬物依存症患
者、ならびに伝染病が蔓延する地域への旅行者が含まれ
る。
発展途上国においては、実質的には全集団が初期の年
齢のうちにＡ型肝炎ウイルスに感染している。この感染
の大半が無症状で不顕性の感染をもたらすが、国が衛生
条件を改善すればＡ型肝炎ウイルスでの感染は除々によ
り高い年齢で生じるようになり、その結果、臨床的疾患
として取り上げられる割合がより高くなる。従って、感
染の総体的な比率が減少する際には臨床的に取り上げら
れるＡ型肝炎が増加するというパラドックスが存在す
る。米国内および他の工業国、ならびに発展途上国にお
いてＡ型肝炎に対する免疫化に成功を収めるためには、
全小児科集団にワクチン投与を施す必要があるだろう。
さほど遠くない将来、このような国々におけるＡ型肝炎
ワクチンについての需要は増加するであろう。
齢のうちにＡ型肝炎ウイルスに感染している。この感染
の大半が無症状で不顕性の感染をもたらすが、国が衛生
条件を改善すればＡ型肝炎ウイルスでの感染は除々によ
り高い年齢で生じるようになり、その結果、臨床的疾患
として取り上げられる割合がより高くなる。従って、感
染の総体的な比率が減少する際には臨床的に取り上げら
れるＡ型肝炎が増加するというパラドックスが存在す
る。米国内および他の工業国、ならびに発展途上国にお
いてＡ型肝炎に対する免疫化に成功を収めるためには、
全小児科集団にワクチン投与を施す必要があるだろう。
さほど遠くない将来、このような国々におけるＡ型肝炎
ワクチンについての需要は増加するであろう。
HAVワクチンにおける研究は、ウイルスを不活化させ
るかもしくは死滅させることに焦点を注いできた。しか
しながらワクチン療法においては、不活化ワクチンより
はむしろ生ワクチンの方に数々の利点が存在している。
生ワクチンを用いるとより低い用量およびより少ない回
数の投与を利用することができ、生ワクチンがワクチン
被接種者（ヒトおよび動物）内で複製してより多くの抗
原を産生し、そしてワクチン被接種者（ヒトおよび動
物）の免疫系を刺激してIgAとIgMとの両方を作成するこ
とができるということがその理由である。ソーク（Sal
k）のポリオワクチンのような不活化ワクチンはワクチ
ン被接種者（ヒトおよび動物）中においてIgG産生のみ
を刺激化するに過ぎず、このようなワクチンでは、摂取
されたウイルスによる感染に対する予防を行うことがで
きず、単に疾患対処に留まるのみである。
るかもしくは死滅させることに焦点を注いできた。しか
しながらワクチン療法においては、不活化ワクチンより
はむしろ生ワクチンの方に数々の利点が存在している。
生ワクチンを用いるとより低い用量およびより少ない回
数の投与を利用することができ、生ワクチンがワクチン
被接種者（ヒトおよび動物）内で複製してより多くの抗
原を産生し、そしてワクチン被接種者（ヒトおよび動
物）の免疫系を刺激してIgAとIgMとの両方を作成するこ
とができるということがその理由である。ソーク（Sal
k）のポリオワクチンのような不活化ワクチンはワクチ
ン被接種者（ヒトおよび動物）中においてIgG産生のみ
を刺激化するに過ぎず、このようなワクチンでは、摂取
されたウイルスによる感染に対する予防を行うことがで
きず、単に疾患対処に留まるのみである。
弱毒生ワクチン開発の主な障害は、迅速なウイルス増
殖を持続させ、しかもワクチン生産について認可されて
いる細胞株へHAVを適応させることの難しさであった。
野生型のＡ型肝炎ウイルス（HAV）は細胞培養物中では
その増殖が乏しい。
殖を持続させ、しかもワクチン生産について認可されて
いる細胞株へHAVを適応させることの難しさであった。
野生型のＡ型肝炎ウイルス（HAV）は細胞培養物中では
その増殖が乏しい。
米国特許第4,532,215号および第4,636,469号は、各々
オーストラリアのメルボルンにおけるある患者のヒト排
泄物を起源として単離され、そしてアフリカグリーンモ
ンキー（African green monkey）の腎臓（AGMK）培養
細胞中におけるインビトロでの継代に適応させたHM−17
5と表示されるHAVの株、ならびにその同一物を連続継代
により取得するための方法を記載している。米国特許第
4,620,978号は、AGMK細胞培養物中に三回連続してクロ
ーン化させ、しかも弱毒化させたHAV HM−175を利用す
るワクチンを記載している。米国特許第4,894,228号
は、ゲノムにおけるヌクレオチド変化により野生型HM−
175とは異なり、チンパンジー用に弱毒化させてあり、
血清中和抗体を誘導し、そして弱毒化HAVワクチンとし
ての利用に適するHM−175 Pass 35を記載している。
この特許は、HAV株HM−175/7の全ヌクレオチド配列を開
示している。B.C.Ross et al.、J.Gen.Virol.、70:28
05−2810（1989）;R.W.Jansen et al.、Virol.、163:
299−307（1988）；およびTedeschi et al.、J.Med.V
irol.、（印刷中）も参照せよ。これらの特許および投
稿論文の開示は引用することにより本明細書に取り込ま
れる。
オーストラリアのメルボルンにおけるある患者のヒト排
泄物を起源として単離され、そしてアフリカグリーンモ
ンキー（African green monkey）の腎臓（AGMK）培養
細胞中におけるインビトロでの継代に適応させたHM−17
5と表示されるHAVの株、ならびにその同一物を連続継代
により取得するための方法を記載している。米国特許第
4,620,978号は、AGMK細胞培養物中に三回連続してクロ
ーン化させ、しかも弱毒化させたHAV HM−175を利用す
るワクチンを記載している。米国特許第4,894,228号
は、ゲノムにおけるヌクレオチド変化により野生型HM−
175とは異なり、チンパンジー用に弱毒化させてあり、
血清中和抗体を誘導し、そして弱毒化HAVワクチンとし
ての利用に適するHM−175 Pass 35を記載している。
この特許は、HAV株HM−175/7の全ヌクレオチド配列を開
示している。B.C.Ross et al.、J.Gen.Virol.、70:28
05−2810（1989）;R.W.Jansen et al.、Virol.、163:
299−307（1988）；およびTedeschi et al.、J.Med.V
irol.、（印刷中）も参照せよ。これらの特許および投
稿論文の開示は引用することにより本明細書に取り込ま
れる。
N.Fineschi et al.、J.Hepatol.、13（４）:S146−
S151（1991）は、不活化ワクチンについての候補物であ
るHAV単離物LSH/Sを記載している。ワクチン開発のため
の好ましい認可済み細胞であるヒトの二倍体MRC−５細
胞中における増殖に、それを適応させてある。この文献
は、野生型HM−175のものに対してそのヌクレオチド配
列の小部分のみを比較しているに過ぎない。
S151（1991）は、不活化ワクチンについての候補物であ
るHAV単離物LSH/Sを記載している。ワクチン開発のため
の好ましい認可済み細胞であるヒトの二倍体MRC−５細
胞中における増殖に、それを適応させてある。この文献
は、野生型HM−175のものに対してそのヌクレオチド配
列の小部分のみを比較しているに過ぎない。
Provost et al.、J.Med.Virol.、20:165−175（198
6）は、CR326A型肝炎ウイルス株のＦおよびF'変異体を
記載している。Ｆ変異体はボランティアワクチン内にお
いては免疫原性を示すことが報告されているものの、そ
の変異体は実質的な比率の個体において異常血清ALTレ
ベルをも引き起こした。
6）は、CR326A型肝炎ウイルス株のＦおよびF'変異体を
記載している。Ｆ変異体はボランティアワクチン内にお
いては免疫原性を示すことが報告されているものの、そ
の変異体は実質的な比率の個体において異常血清ALTレ
ベルをも引き起こした。
このグループの研究者からの他の最近の刊行物は、F'
変異体を用いた更に詳細な研究を記載している［K.Midt
hun et al.、J.Infect.Dis.、163:735−739（199
1）］。彼らは、F'ワクチン産物の免疫原性は用量依存
的であることを観察しており（すなわち107.3のTCID50
が免疫化後９週間以では100％のボランティアーにおい
て抗体反応を誘導し、一方でより低い用量ではより低い
パーセンテージのボランティアにおいて免疫原性が示さ
れた）、しかも抗−HAVは免疫化後４−６カ月観察され
ていた。最近、中国人研究者達が、HAVのH2株から調製
した有望な弱毒生Ａ型肝炎ワクチンの研究を記載した
［J.S.Mao et al.、J.Infect.Dis.、159:621−624（1
989）］。12人のボランティアが皮下経路によるワクチ
ン接種を受けた。
変異体を用いた更に詳細な研究を記載している［K.Midt
hun et al.、J.Infect.Dis.、163:735−739（199
1）］。彼らは、F'ワクチン産物の免疫原性は用量依存
的であることを観察しており（すなわち107.3のTCID50
が免疫化後９週間以では100％のボランティアーにおい
て抗体反応を誘導し、一方でより低い用量ではより低い
パーセンテージのボランティアにおいて免疫原性が示さ
れた）、しかも抗−HAVは免疫化後４−６カ月観察され
ていた。最近、中国人研究者達が、HAVのH2株から調製
した有望な弱毒生Ａ型肝炎ワクチンの研究を記載した
［J.S.Mao et al.、J.Infect.Dis.、159:621−624（1
989）］。12人のボランティアが皮下経路によるワクチ
ン接種を受けた。
弱毒生Ａ型肝炎ワクチンは、疾患の撲滅に有意な衝撃
を与えることが可能であった。最低限の精製過程のみを
必要とし、しかもアジュバンドは必要としない弱毒生ワ
クチンは、近年利用可能となっている不活化Ａ型肝炎ワ
クチンと比較する費用が安価になるであろうということ
が予期される。
を与えることが可能であった。最低限の精製過程のみを
必要とし、しかもアジュバンドは必要としない弱毒生ワ
クチンは、近年利用可能となっている不活化Ａ型肝炎ワ
クチンと比較する費用が安価になるであろうということ
が予期される。
当該技術分野においては、Ａ型肝炎に対するヒトおよ
び動物の有効なワクチン注射のための方法および組成物
についての需要が存在する。
び動物の有効なワクチン注射のための方法および組成物
についての需要が存在する。
発明の要約
ある態様においては、本発明はMCR−５細胞中での増
殖に適応させた生きたＡ型肝炎ウイルスを提供する。こ
のウイルスは弱毒化を特徴とすることが好ましい。弱毒
ウイルスは組換え体もしくはキメラ体であることができ
る。このHAVは、不活化を伴わない、霊長類、好ましく
はヒトへの有効なワクチン投与のための適切な弱毒化を
特徴とすることがより好ましい。このHAVは、HAV HM−
175、Pass 35のゲノム［配列番号１］の同一位置に存
在するヌクレオチドとは異なる14の特異的ヌクレオチド
の内の一つもしくは複数を含むことを特徴とすることが
できる。
殖に適応させた生きたＡ型肝炎ウイルスを提供する。こ
のウイルスは弱毒化を特徴とすることが好ましい。弱毒
ウイルスは組換え体もしくはキメラ体であることができ
る。このHAVは、不活化を伴わない、霊長類、好ましく
はヒトへの有効なワクチン投与のための適切な弱毒化を
特徴とすることがより好ましい。このHAVは、HAV HM−
175、Pass 35のゲノム［配列番号１］の同一位置に存
在するヌクレオチドとは異なる14の特異的ヌクレオチド
の内の一つもしくは複数を含むことを特徴とすることが
できる。
他の態様においては、本発明は、Ａ型肝炎に対してヒ
トもしくは他の霊長類を保護するのに役立ち、そしてMR
C−５細胞中での増殖に適応させた上記のHAVの内の少な
くとも一つを含むワクチンを提供する。このワクチン
は、アジュバンドなしで予防用抗体反応を誘導するのに
有効である。
トもしくは他の霊長類を保護するのに役立ち、そしてMR
C−５細胞中での増殖に適応させた上記のHAVの内の少な
くとも一つを含むワクチンを提供する。このワクチン
は、アジュバンドなしで予防用抗体反応を誘導するのに
有効である。
更に別の態様においては、本発明は、ヒト患者に本発
明のワクチン組成物の有効量を投与することを含む、Ａ
型肝炎に対してヒトを保護するための方法を提供する。
明のワクチン組成物の有効量を投与することを含む、Ａ
型肝炎に対してヒトを保護するための方法を提供する。
更に別の態様においては、本発明は、あるHAVのゲノ
ムの選択された領域内へ14の特異的ヌクレオチドの内の
一つもしくは複数を取り込ませることによって、MRC−
５細胞内での増殖に適応させた生きたHAVを調製するた
めの方法を提供する。このような修正を加えたHAVゲノ
ムは、HAM HM−175、Pass 35もしくは細胞培養に適応
させた関連変異体であることが好ましい。
ムの選択された領域内へ14の特異的ヌクレオチドの内の
一つもしくは複数を取り込ませることによって、MRC−
５細胞内での増殖に適応させた生きたHAVを調製するた
めの方法を提供する。このような修正を加えたHAVゲノ
ムは、HAM HM−175、Pass 35もしくは細胞培養に適応
させた関連変異体であることが好ましい。
他の態様においては、HAVを、他のHAV cDNAクローン
を使用し、そして適切なヌクレオチドをそのゲノム中に
挿入させて作製することができる。この方法に従うと、
MRC−５適応化弱毒HAVが、MRC−５もしくは他の霊長類
細胞株内での更に進んだ継代を必要とすることなく提供
される。
を使用し、そして適切なヌクレオチドをそのゲノム中に
挿入させて作製することができる。この方法に従うと、
MRC−５適応化弱毒HAVが、MRC−５もしくは他の霊長類
細胞株内での更に進んだ継代を必要とすることなく提供
される。
更に別の態様においては、本発明は、先に記載の組換
えHAVもしくはキメラMAVをコード化するポリヌクレオチ
ド配列を提供する。これらの配列は、ワクチン調製用の
ワクチン種として有用なcNDAであることが好ましい。
えHAVもしくはキメラMAVをコード化するポリヌクレオチ
ド配列を提供する。これらの配列は、ワクチン調製用の
ワクチン種として有用なcNDAであることが好ましい。
本発明の他の態様および利点は、本発明の好ましい態
様の以下に示す詳細な記述において更に詳しく記載され
る。
様の以下に示す詳細な記述において更に詳しく記載され
る。
図面の簡単な記述
図１は、実施例１において記載されるように、ウイル
ス4380を用い、そして次に野生型HAVで刺激するチンパ
ンジー実験について、抗−HAV抗体産生 対 時間（週
数）対ALTおよびICDレベルをプロットしたグラフであ
る。これらの結果は、時間０に弱毒HAVで感染させ、そ
して第28週目に有毒ウイスルで刺激したチンパンジーか
ら得られた。
ス4380を用い、そして次に野生型HAVで刺激するチンパ
ンジー実験について、抗−HAV抗体産生 対 時間（週
数）対ALTおよびICDレベルをプロットしたグラフであ
る。これらの結果は、時間０に弱毒HAVで感染させ、そ
して第28週目に有毒ウイスルで刺激したチンパンジーか
ら得られた。
図２は、実施例１において記載されるように、ウイル
ス4380を用い、次に野生型HAVで刺激するチンパンジー
実験について、抗−HAV抗体産生 対 時間（週数）対A
LTおよびICDレベルをプロットしたグラフである。条件
は図１についてのものと同一であった。
ス4380を用い、次に野生型HAVで刺激するチンパンジー
実験について、抗−HAV抗体産生 対 時間（週数）対A
LTおよびICDレベルをプロットしたグラフである。条件
は図１についてのものと同一であった。
図３は、実施例１に記載されるように、ウイルス4380
を用い、次に野生型HAVで刺激するチンパンジー実験に
ついて、抗−HAV抗体産生 対 時間（週数）対ALTおよ
びICDレベルをプロットしたグラフである。条件は図１
についてのものと同一であった。
を用い、次に野生型HAVで刺激するチンパンジー実験に
ついて、抗−HAV抗体産生 対 時間（週数）対ALTおよ
びICDレベルをプロットしたグラフである。条件は図１
についてのものと同一であった。
図４は、実施例１に記載されるように、ウイルス4380
を用い、次に野生型HAVで刺激するチンパンジー実験に
ついて、抗−HAV抗体産生 対 時間（週数）対ALTおよ
びICDレベルをプロットしたグラフである。これらの結
果は、弱毒HAVで感染させてはいない、従って有毒ウイ
ルスでの刺激後に肝炎を発症したチンパンジーから得ら
れた。条件は図１についてのものと同一であった。
を用い、次に野生型HAVで刺激するチンパンジー実験に
ついて、抗−HAV抗体産生 対 時間（週数）対ALTおよ
びICDレベルをプロットしたグラフである。これらの結
果は、弱毒HAVで感染させてはいない、従って有毒ウイ
ルスでの刺激後に肝炎を発症したチンパンジーから得ら
れた。条件は図１についてのものと同一であった。
図５は、表VIに列挙される数々のキメラウイルス、ウ
イルス＃２、３、４、５、および６の終点希釈率の棒グ
ラフである。
イルス＃２、３、４、５、および６の終点希釈率の棒グ
ラフである。
発明の詳細な記述
本発明は、商業的産生に適しており、しかも不活化お
よび弱毒生Ａ型肝炎ワクチン用に認可されている細胞基
質であるヒトの繊維芽細胞株（MRC−５）での増殖に適
応させたＡ型肝炎ウイルス（HAV）を提供する。このよ
うな適応化HAVに加え、本発明は、そのヒト細胞株内で
の増殖へ選択されたHAVを適応させ、そしてMRC−５適応
化弱毒HAVを他の霊長類細胞内での継代を伴うことなし
に調製するための方法を提供する。本発明のHAVおよび
調製法は、ヒトおよび動物のためのワクチンとしてのそ
の有効性を実現可能とするよう十分に弱毒化されている
HAVも提供することが好ましい。
よび弱毒生Ａ型肝炎ワクチン用に認可されている細胞基
質であるヒトの繊維芽細胞株（MRC−５）での増殖に適
応させたＡ型肝炎ウイルス（HAV）を提供する。このよ
うな適応化HAVに加え、本発明は、そのヒト細胞株内で
の増殖へ選択されたHAVを適応させ、そしてMRC−５適応
化弱毒HAVを他の霊長類細胞内での継代を伴うことなし
に調製するための方法を提供する。本発明のHAVおよび
調製法は、ヒトおよび動物のためのワクチンとしてのそ
の有効性を実現可能とするよう十分に弱毒化されている
HAVも提供することが好ましい。
従来の技術によりヒトの二倍体繊維芽細胞内での増殖
に適応させてあるＡ型肝炎ウイルスのワクチン株の他の
候補物が開示されているものの、このような適応化に必
須かつ十分であるウイルスゲノム内での遺伝子変化は未
だにその特徴が解明されていない。従って、これらの株
が複製可能でしかも十分な特徴決定が行われたワクチン
産物であることを立証するために、これらの株をインビ
トロにおいて操作することはできない。
に適応させてあるＡ型肝炎ウイルスのワクチン株の他の
候補物が開示されているものの、このような適応化に必
須かつ十分であるウイルスゲノム内での遺伝子変化は未
だにその特徴が解明されていない。従って、これらの株
が複製可能でしかも十分な特徴決定が行われたワクチン
産物であることを立証するために、これらの株をインビ
トロにおいて操作することはできない。
本発明は、先に引用されておりしかも本明細書に取り
込まれる技術［Cohen et al.、J.Virol.、61:50−59
（1987）；配列番号１および２］において詳細が記載さ
れている野生型HAVの株HM−175に基づくものである。簡
潔に記述すると、野生型の感染性HAV HM−175ウイルス
を、予め37℃においてアフリカグリーンモンキーの腎臓
の（AGMK）の初代細胞内での増殖に適応させた。AGMK中
での26継代の後、ウイルスを連続希釈によりAGMK細胞中
に三回クローン化させ、その後更に三回継代を行って継
代物32（Ｐ−32）を取得した。Ｐ−32は、R.A.Karron
et al.、J.Infec.Dis.、157、338−345（1988）におい
て記載されるように弱毒化されていることを見いだし
た。
込まれる技術［Cohen et al.、J.Virol.、61:50−59
（1987）；配列番号１および２］において詳細が記載さ
れている野生型HAVの株HM−175に基づくものである。簡
潔に記述すると、野生型の感染性HAV HM−175ウイルス
を、予め37℃においてアフリカグリーンモンキーの腎臓
の（AGMK）の初代細胞内での増殖に適応させた。AGMK中
での26継代の後、ウイルスを連続希釈によりAGMK細胞中
に三回クローン化させ、その後更に三回継代を行って継
代物32（Ｐ−32）を取得した。Ｐ−32は、R.A.Karron
et al.、J.Infec.Dis.、157、338−345（1988）におい
て記載されるように弱毒化されていることを見いだし
た。
先に記載されるＰ−32ウイルスをAGMK中で更に３回継
代させ、そして分子的にクローン化した。クローン化し
たウイルスはＰ−35と称し、そして全長クローンをpHAV
/7として引用した。pHAV/7は、モノクローナル状態で保
持し、そして自発的突然変異の危険性を減らした状態で
随意に増幅させることが可能なウイルスの感染性cDNAク
ローンである。得られるＰ−35ウイルスはアカゲザル胎
児の腎臓（FRhK）細胞中では良く増殖し、そしてヒトの
繊維芽細胞様の肺細胞（MRC−５）においては最小限の
増殖を示した。
代させ、そして分子的にクローン化した。クローン化し
たウイルスはＰ−35と称し、そして全長クローンをpHAV
/7として引用した。pHAV/7は、モノクローナル状態で保
持し、そして自発的突然変異の危険性を減らした状態で
随意に増幅させることが可能なウイルスの感染性cDNAク
ローンである。得られるＰ−35ウイルスはアカゲザル胎
児の腎臓（FRhK）細胞中では良く増殖し、そしてヒトの
繊維芽細胞様の肺細胞（MRC−５）においては最小限の
増殖を示した。
米国特許第4,894,228号およびCohen et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.、USA、84:2497−2501（1987）は、野生
型HAV株HM−175（その発明の図１を参照せよ；配列番号
１および２）のHAVヌクレオチド配列、ならびにHAV HM
−175、Pass 35、クローンpHAV/7と野生型配列［配列
番号１］との間のヌクレオチドの差異を提供する。従っ
て、引用することにより本明細書に取り込まれるこれら
の文献はpHAV/7、Ｐ−35の配列［配列番号１および２］
を提供する。本明細書中で用いられるヌクレオチド番号
（以下に示す表ＩおよびVI）には本発明の突然変異を対
応させてあるが、この番号は米国特許第4,894,228号か
らの図１の野生型配列［配列番号１および２］の位置に
割り振られたヌクレオチド番号であり、Ｐ−35について
の突然変異もこの米国特許内に含まれている。Ｐ−35に
おいて失われているヌクレオチドには野生型配列［配列
番号１］のヌクレオチドの位置が割り振られていること
を銘記せよ。従って、例えば、ヌクレオチドの位置131
は、野生型とＰ−35との間で失われているヌクレオチド
を表す。Ｐ−35のcDNA、すなわちHAV/HM−175/7は、198
7年８月７日に、受託番号第67495号としてthe America
n Type Culture Colleciton、12301 Parklawn Dri
ve、Rockville、Maryland、に寄託されている。当業者
は、先に引用した技術の利用によりＰ−35のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を容易に作製することができる。
Natl.Acad.Sci.、USA、84:2497−2501（1987）は、野生
型HAV株HM−175（その発明の図１を参照せよ；配列番号
１および２）のHAVヌクレオチド配列、ならびにHAV HM
−175、Pass 35、クローンpHAV/7と野生型配列［配列
番号１］との間のヌクレオチドの差異を提供する。従っ
て、引用することにより本明細書に取り込まれるこれら
の文献はpHAV/7、Ｐ−35の配列［配列番号１および２］
を提供する。本明細書中で用いられるヌクレオチド番号
（以下に示す表ＩおよびVI）には本発明の突然変異を対
応させてあるが、この番号は米国特許第4,894,228号か
らの図１の野生型配列［配列番号１および２］の位置に
割り振られたヌクレオチド番号であり、Ｐ−35について
の突然変異もこの米国特許内に含まれている。Ｐ−35に
おいて失われているヌクレオチドには野生型配列［配列
番号１］のヌクレオチドの位置が割り振られていること
を銘記せよ。従って、例えば、ヌクレオチドの位置131
は、野生型とＰ−35との間で失われているヌクレオチド
を表す。Ｐ−35のcDNA、すなわちHAV/HM−175/7は、198
7年８月７日に、受託番号第67495号としてthe America
n Type Culture Colleciton、12301 Parklawn Dri
ve、Rockville、Maryland、に寄託されている。当業者
は、先に引用した技術の利用によりＰ−35のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を容易に作製することができる。
その後Ｐ−32のAGMK細胞適応化弱毒ウイルスを更に操
作して、そのウイルスをMRC−５細胞内での増殖に適応
可能にさせるが、そのことにより大量のワクチン産生が
利用可能となる。二回のプラーク形成を利用することに
より継代物32をMRC−５中にクローン化させていって継
代物37を作製する。継代物37をMRC−５の選択されたク
ローン25−４−21中で一度継代した。得られる継代物38
をMRC−５細胞中で三回継代し、得られる継代物41がワ
クチン種となるが、これを87J19と表示した。このワク
チン種ウイスル保存物はウイルス4380とも称され、そし
てこれは本開示全体にわたり後述の名称により引用され
る。
作して、そのウイルスをMRC−５細胞内での増殖に適応
可能にさせるが、そのことにより大量のワクチン産生が
利用可能となる。二回のプラーク形成を利用することに
より継代物32をMRC−５中にクローン化させていって継
代物37を作製する。継代物37をMRC−５の選択されたク
ローン25−４−21中で一度継代した。得られる継代物38
をMRC−５細胞中で三回継代し、得られる継代物41がワ
クチン種となるが、これを87J19と表示した。このワク
チン種ウイスル保存物はウイルス4380とも称され、そし
てこれは本開示全体にわたり後述の名称により引用され
る。
弱毒生ウイルスHAV 4380は、1990年４月４日に、受
託番号第Ｉ−936号としてthe Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes、Institut Pas
teur、25、rue du Docteur Roux、75724、Paris CE
DEX 15、に寄託されている。この寄託は、微生物の寄
託の国際的承認（the International Recognition o
f the Deposit of Microorganisms）に関するブダ
ペスト条約に基づいて行われ、そして未だに公には広め
られていない。HAV 4380はＡ型肝炎ウイルス株HM−175
の細胞培養適応化弱毒株であり、32−35℃の低温下での
インキュベーションによるワクチン開発に適するヒトの
繊維芽細胞株（MRC−５）内での増殖に適応させてあ
る。このウイルスの増殖は、血清学的アッセイにおける
ウイルス抗原の検出により決定される。適応化ウイルス
を、許容される方法（放射線免疫フォーカスアッセイ）
を用いてプラーク精製法により精製する。
託番号第Ｉ−936号としてthe Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes、Institut Pas
teur、25、rue du Docteur Roux、75724、Paris CE
DEX 15、に寄託されている。この寄託は、微生物の寄
託の国際的承認（the International Recognition o
f the Deposit of Microorganisms）に関するブダ
ペスト条約に基づいて行われ、そして未だに公には広め
られていない。HAV 4380はＡ型肝炎ウイルス株HM−175
の細胞培養適応化弱毒株であり、32−35℃の低温下での
インキュベーションによるワクチン開発に適するヒトの
繊維芽細胞株（MRC−５）内での増殖に適応させてあ
る。このウイルスの増殖は、血清学的アッセイにおける
ウイルス抗原の検出により決定される。適応化ウイルス
を、許容される方法（放射線免疫フォーカスアッセイ）
を用いてプラーク精製法により精製する。
低温下でのMRC−５細胞内での総計９継代の後、得ら
れるウイルスについて、細胞培養物内、ならびにヒトの
代用物と考えられる２つの霊長類種、すなわちマーモセ
ットおよびチンパンジー内におけるその生物学的特徴に
ついての特徴決定を行った。例えば、以下に示す実施例
１を参照せよ。HAV 4380ウイルスはMRC−５細胞内では
温度感受性（すなわち、低温下で増殖する）であること
を見いだしたが、アフリカグリーンモンキーの初代腎臓
細胞中では37℃においても依然として増殖可能であっ
た。このウイルスの病原性を更に弱毒化させて親ウイル
スであるHM−175、Ｐ−32と比較したところ、チンパン
ジーおよびマーモセットザルにおける検査をした場合、
これらの種においてはウイルスはほとんどもしくは全く
複製しなかった。霊長類において示される複製能の低下
を、実施例２において記載されるようにヒトのボランテ
ィアにおいて更に検証した。
れるウイルスについて、細胞培養物内、ならびにヒトの
代用物と考えられる２つの霊長類種、すなわちマーモセ
ットおよびチンパンジー内におけるその生物学的特徴に
ついての特徴決定を行った。例えば、以下に示す実施例
１を参照せよ。HAV 4380ウイルスはMRC−５細胞内では
温度感受性（すなわち、低温下で増殖する）であること
を見いだしたが、アフリカグリーンモンキーの初代腎臓
細胞中では37℃においても依然として増殖可能であっ
た。このウイルスの病原性を更に弱毒化させて親ウイル
スであるHM−175、Ｐ−32と比較したところ、チンパン
ジーおよびマーモセットザルにおける検査をした場合、
これらの種においてはウイルスはほとんどもしくは全く
複製しなかった。霊長類において示される複製能の低下
を、実施例２において記載されるようにヒトのボランテ
ィアにおいて更に検証した。
弱毒Ａ型肝炎ワクチンの候補物をHAV 4380から調製
し、そして安全であり（すなわち、これは肝炎もしくは
他の重篤な不利な影響を生じない）、しかもヒトにおい
て免疫原性を示すことを証明した。これはアジュバンド
なしでも抗体産生を誘導することも見いだした。現在で
もそうであるが、HAV 4380は商業的ワクチン産生に適
する細胞基質中で良く増殖する。またこれは、不活化さ
れなくとも、最高107組織培養物までの用量での経口も
しくは静脈内経路により投与する際にはヒトを感作する
ことがない。HAV 4380は、ヒトにおけるHAV生ワクチン
としての利用に適する。しかしながら実施例２において
示されるように、ワクチン 4380は幾分弱毒化過剰であ
ると考えられており、このワクチンが感染力を失ってい
ることがこの理由となっており、この特性があることに
より弱毒ワクチンとして使用する際の効能が低下するこ
とになる。
し、そして安全であり（すなわち、これは肝炎もしくは
他の重篤な不利な影響を生じない）、しかもヒトにおい
て免疫原性を示すことを証明した。これはアジュバンド
なしでも抗体産生を誘導することも見いだした。現在で
もそうであるが、HAV 4380は商業的ワクチン産生に適
する細胞基質中で良く増殖する。またこれは、不活化さ
れなくとも、最高107組織培養物までの用量での経口も
しくは静脈内経路により投与する際にはヒトを感作する
ことがない。HAV 4380は、ヒトにおけるHAV生ワクチン
としての利用に適する。しかしながら実施例２において
示されるように、ワクチン 4380は幾分弱毒化過剰であ
ると考えられており、このワクチンが感染力を失ってい
ることがこの理由となっており、この特性があることに
より弱毒ワクチンとして使用する際の効能が低下するこ
とになる。
所望のレベルの弱毒化およびMRC−５細胞内での良好
な増殖について最大限の条件を満たす他のワクチン候補
物を作製する目的で、本発明者らは、ワクチンの増殖特
性を変化させ、そして関連するAGMK適応化ウイルスHM−
175の継代物35と比較してそのワクチンをワクチン産生
により適する状態にさせる、MRC−５適応化HAV 4380ウ
イルスのゲノム内に生じる遺伝子変化を発見した。本発
明者らはHM−175のPass 35［先に引用したCohen et
al.、および米国特許第4,894,228号、図1;配列番号１お
よび２］と比較した際に4380におけるヌクレオチド配列
内の以下に示す突然変化を発見したが、この発見により
遺伝子工学技術によるHAVゲノムの操作が可能となる。
な増殖について最大限の条件を満たす他のワクチン候補
物を作製する目的で、本発明者らは、ワクチンの増殖特
性を変化させ、そして関連するAGMK適応化ウイルスHM−
175の継代物35と比較してそのワクチンをワクチン産生
により適する状態にさせる、MRC−５適応化HAV 4380ウ
イルスのゲノム内に生じる遺伝子変化を発見した。本発
明者らはHM−175のPass 35［先に引用したCohen et
al.、および米国特許第4,894,228号、図1;配列番号１お
よび２］と比較した際に4380におけるヌクレオチド配列
内の以下に示す突然変化を発見したが、この発見により
遺伝子工学技術によるHAVゲノムの操作が可能となる。
従って、HM−175のAGMK適応化継代物と、より強く弱
毒化されている4380との間のゲノムの差異を知ることに
より、増殖特性を改善してありながら（すなわちMRC−
５細胞培養物中で迅速かつ効果的に増殖する）ヒトを初
めとする霊長類種についてのあるレベルの病原体弱毒化
が施されているキメラウイルスの作製が可能となり、こ
のことにより肝炎もしくは他のたちの悪い効果を生じる
ことなくウイルスを効果的に複製させることが可能とな
るであろう。本発明により、弱毒生Ａ型肝炎ワクチン候
補物についての至適特性を達成することができるキメラ
HAVの設計が可能となる。所望であらば、このようなウ
イルスにより好ましい不活化ワクチン候補物の設計をも
可能となるであろう。本発明は、HM−175 HAV、継代物
32という株をMRC−５細胞中での増殖へ適応化させてい
る間に起こるものと考えられる突然変異を同定する。こ
れらの突然変異の内の一つもしくは複数の組み合わせ
が、MRC−５細胞への適応化およびHAV 4380における過
剰弱毒化の原因となっている。MRC−５細胞適応化ウイ
ルスHAV 4380のヌクレオチド配列を、AGMK適応化HM 1
75ウイルス、継代物35、クローン７のものと比較した。
ヌクレオチド共通配列をポリメラーゼ連鎖反応産物から
直接決定した。
毒化されている4380との間のゲノムの差異を知ることに
より、増殖特性を改善してありながら（すなわちMRC−
５細胞培養物中で迅速かつ効果的に増殖する）ヒトを初
めとする霊長類種についてのあるレベルの病原体弱毒化
が施されているキメラウイルスの作製が可能となり、こ
のことにより肝炎もしくは他のたちの悪い効果を生じる
ことなくウイルスを効果的に複製させることが可能とな
るであろう。本発明により、弱毒生Ａ型肝炎ワクチン候
補物についての至適特性を達成することができるキメラ
HAVの設計が可能となる。所望であらば、このようなウ
イルスにより好ましい不活化ワクチン候補物の設計をも
可能となるであろう。本発明は、HM−175 HAV、継代物
32という株をMRC−５細胞中での増殖へ適応化させてい
る間に起こるものと考えられる突然変異を同定する。こ
れらの突然変異の内の一つもしくは複数の組み合わせ
が、MRC−５細胞への適応化およびHAV 4380における過
剰弱毒化の原因となっている。MRC−５細胞適応化ウイ
ルスHAV 4380のヌクレオチド配列を、AGMK適応化HM 1
75ウイルス、継代物35、クローン７のものと比較した。
ヌクレオチド共通配列をポリメラーゼ連鎖反応産物から
直接決定した。
本発明者らは、pass−35 HM−175/7ウイルス［配列
番号１］とMRC−５適用化ウイルス 4380との間には少
なくとも14の独特なヌクレオチドの差異が存在し、その
内の少なくとも12のものは明らかにMRC−５細胞内への
増殖にHM−175の株であるPass 32A型肝炎ウイルス（HA
V）［配列番号１］を適応化させている期間中に生じて
いることを発見した。表Ｉは、ヌクレオチドの差異およ
び得られるアミノ酸（AA）の差異によるこれら12の突然
変異を列挙してあり、いずれにせよ、これらの突然変異
はMRC−５適応化ウイルスHAV 4380が獲得してきたもの
である。他の２つの突然変異は野生型配列への復帰突然
変異であると思われているか、あるいはより最もらしく
は、AGMK細胞中の継代物32と35との間に起こり、そして
そのため生物学的特徴決定が行われているＰ−32ウイル
スと分子的にクローン化されたＰ−35ウイルスとの間の
差異を表す突然変異を表すものと思われている。先に引
用されるFineschi et al.のLSH/S HAVの部分配列
は、位置5145において観察される突然変異のみと重複す
るに過ぎないことを銘記せよ。
番号１］とMRC−５適用化ウイルス 4380との間には少
なくとも14の独特なヌクレオチドの差異が存在し、その
内の少なくとも12のものは明らかにMRC−５細胞内への
増殖にHM−175の株であるPass 32A型肝炎ウイルス（HA
V）［配列番号１］を適応化させている期間中に生じて
いることを発見した。表Ｉは、ヌクレオチドの差異およ
び得られるアミノ酸（AA）の差異によるこれら12の突然
変異を列挙してあり、いずれにせよ、これらの突然変異
はMRC−５適応化ウイルスHAV 4380が獲得してきたもの
である。他の２つの突然変異は野生型配列への復帰突然
変異であると思われているか、あるいはより最もらしく
は、AGMK細胞中の継代物32と35との間に起こり、そして
そのため生物学的特徴決定が行われているＰ−32ウイル
スと分子的にクローン化されたＰ−35ウイルスとの間の
差異を表す突然変異を表すものと思われている。先に引
用されるFineschi et al.のLSH/S HAVの部分配列
は、位置5145において観察される突然変異のみと重複す
るに過ぎないことを銘記せよ。
この表においては、Ａはアデニンを表し、Ｇはグアニ
ンを表し、Ｃはシトシンを表し、そしてＵはウリジンも
しくはチミジンを表し、さらにLeuはロイシンを表し、P
heはフェニルアラニンを表し、Ileはイソロイシンを表
し、Valはバリンを表し、そしてSerはセリンを表す。
ンを表し、Ｃはシトシンを表し、そしてＵはウリジンも
しくはチミジンを表し、さらにLeuはロイシンを表し、P
heはフェニルアラニンを表し、Ileはイソロイシンを表
し、Valはバリンを表し、そしてSerはセリンを表す。
これらのヌクレオチドの内の一つもしくは複数をHAV
内の、AGMK適応化ウイルスHM−175のPass 35のゲノム
配列［配列番号１］中のヌクレオチドの位置に相同なヌ
クレオチドの位置に導入することにより、新規のHAVワ
クチン候補物を設計する。表Ｉにおいて示されるこれら
のヌクレオチドを、他のHAV株および変異体のゲノム配
列中のＰ−35のものに類似するおよび／または相同なヌ
クレオチドの位置に導入して、本発明の組換えHAVもし
くはキメラHAVを産生することができる。成句「類似す
るもしくは相同なヌクレオチドの位置」，は、例えば2C
および3Dなどの同一なウイルス領域内に存在するHAV H
M−175のPass 35［配列番号１］以外のHAV内に含ま
れ、表Ｉのヌクレオチドのものに類似するその領域内の
位置に存在するヌクレオチドを意味する。他の言葉で
は、ヌクレオチドの位置は、ウイルスの他の領域内にお
ける欠損が原因で位置番号が異なることがあるが、当業
者はHM−175のPass 35［配列番号１］内のヌクレオチ
ドの位置への機能的類似性を容易に決定することができ
る。
内の、AGMK適応化ウイルスHM−175のPass 35のゲノム
配列［配列番号１］中のヌクレオチドの位置に相同なヌ
クレオチドの位置に導入することにより、新規のHAVワ
クチン候補物を設計する。表Ｉにおいて示されるこれら
のヌクレオチドを、他のHAV株および変異体のゲノム配
列中のＰ−35のものに類似するおよび／または相同なヌ
クレオチドの位置に導入して、本発明の組換えHAVもし
くはキメラHAVを産生することができる。成句「類似す
るもしくは相同なヌクレオチドの位置」，は、例えば2C
および3Dなどの同一なウイルス領域内に存在するHAV H
M−175のPass 35［配列番号１］以外のHAV内に含ま
れ、表Ｉのヌクレオチドのものに類似するその領域内の
位置に存在するヌクレオチドを意味する。他の言葉で
は、ヌクレオチドの位置は、ウイルスの他の領域内にお
ける欠損が原因で位置番号が異なることがあるが、当業
者はHM−175のPass 35［配列番号１］内のヌクレオチ
ドの位置への機能的類似性を容易に決定することができ
る。
このようなヌクレオチドの位置は野生型HM−175［配
列番号１］に相当する同一のヌクレオチドの位置番号に
なっていないことがあるものの、これらの類似するおよ
び／または相同の位置を同定するのは容易であり、その
ことにより株HM−175誘導体以外のHAVを改変させて本発
明に従う新規のHAVを作製することが可能であることが
予期される。
列番号１］に相当する同一のヌクレオチドの位置番号に
なっていないことがあるものの、これらの類似するおよ
び／または相同の位置を同定するのは容易であり、その
ことにより株HM−175誘導体以外のHAVを改変させて本発
明に従う新規のHAVを作製することが可能であることが
予期される。
同様に、本発明者らは、この知識を頼りにHAV 4380
の祖先もしくは中間体のゲノムを操作することができ、
そしてそのことにより4380における所定の突然変異を
「逆戻り」させて新規のキメラHAVウイルスを作製する
ことができる。これらのヌクレオチドの内の一つもしく
は複数、あるいはこれらの異なる組み合わせ物を、キメ
ラ形成もしくはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発
により、HAV株、最も簡便にはcDNAクローンHAV/HM−175
/7内に挿入して、MRC−５細胞内で増殖する能力を獲得
した、生存能のある新規のウイルスを産生することがで
きる。他のHM−175 HAV誘導体は、ATCC表示番号VR 20
89、VR 2090、VR 2091、VR 2092、VR 2093、VR 20
97、VR 2098、およびVR 2099の下でthe American T
ype Culture Collectionから入手することができる。
これらのHAVおよび他のHAVを利用して本発明の所望のHA
Vを誘導することができる。MRC−５適応化ウイルス 43
80はヒトについて弱毒化過剰である可能性があるという
徴候があるため、選択された突然変異をHM−175内から
除去するもしくはその中に導入することが可能であると
いうことは重要である。一つもしくは複数の前記突然変
異を含む実例として示した９つのキメラウイルスの作製
法は、以下の実施例３にその詳細を記述してある。
の祖先もしくは中間体のゲノムを操作することができ、
そしてそのことにより4380における所定の突然変異を
「逆戻り」させて新規のキメラHAVウイルスを作製する
ことができる。これらのヌクレオチドの内の一つもしく
は複数、あるいはこれらの異なる組み合わせ物を、キメ
ラ形成もしくはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発
により、HAV株、最も簡便にはcDNAクローンHAV/HM−175
/7内に挿入して、MRC−５細胞内で増殖する能力を獲得
した、生存能のある新規のウイルスを産生することがで
きる。他のHM−175 HAV誘導体は、ATCC表示番号VR 20
89、VR 2090、VR 2091、VR 2092、VR 2093、VR 20
97、VR 2098、およびVR 2099の下でthe American T
ype Culture Collectionから入手することができる。
これらのHAVおよび他のHAVを利用して本発明の所望のHA
Vを誘導することができる。MRC−５適応化ウイルス 43
80はヒトについて弱毒化過剰である可能性があるという
徴候があるため、選択された突然変異をHM−175内から
除去するもしくはその中に導入することが可能であると
いうことは重要である。一つもしくは複数の前記突然変
異を含む実例として示した９つのキメラウイルスの作製
法は、以下の実施例３にその詳細を記述してある。
一つもしくは複数のこれらの突然変異を取り込むキメ
ラHAVもしくは組換えHAVを作製するのに利用した突然変
異誘発技術および遺伝子工学技術は常法であり、そして
当業者に知られている［例えば、Sambrook et al.、M
olecular Cloning.A Laboratory Manual、2d editi
on、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring
Harbor、New York、（1989）、を参照せよ。］ポリ
メラーゼ連鎖反応および化学合成技術を初めとする他の
通常の技術を使用して本発明のHAVを設計することもで
きる。同様に、他のHM−175継代物を使用して相同な突
然変異を作製することができることが予期される。これ
らのヌクレオチドを相同領域内に導入することによりHM
−175以外のHAV株に類似する変化を適用させることも可
能である。
ラHAVもしくは組換えHAVを作製するのに利用した突然変
異誘発技術および遺伝子工学技術は常法であり、そして
当業者に知られている［例えば、Sambrook et al.、M
olecular Cloning.A Laboratory Manual、2d editi
on、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring
Harbor、New York、（1989）、を参照せよ。］ポリ
メラーゼ連鎖反応および化学合成技術を初めとする他の
通常の技術を使用して本発明のHAVを設計することもで
きる。同様に、他のHM−175継代物を使用して相同な突
然変異を作製することができることが予期される。これ
らのヌクレオチドを相同領域内に導入することによりHM
−175以外のHAV株に類似する変化を適用させることも可
能である。
本発明のキメラウイルスおよび組換えウイルスを、類
似する技術の適用、ならびに表ＩおよびVIに表わすヌク
レオチド（突然変異）の内の一つもしくは複数の異なる
組み合わせの選択により設計することができる。例え
ば、実施例３のキメラウイルスの増殖分析からのデータ
により、5'非コーディング領域内の４つのMRC−５特異
的突然変異の内の一つもしくは複数（HM−175/7のヌク
レオチドの位置591、646、669、および687における突然
変異）、ならびに2C領域内のMRC−５特異的突然変異の
内の一つもしくは両方共（HM−175/7のヌクレオチドの
位置4418および4643における突然変異）が、MRC−５細
胞中でのウイルスの至適増殖について所望される可能性
があることが示される。他の突然変異も必要である可能
性がある。具体的実例として示される本発明のキメラHA
Vは、以下の実施例３の表VIにおいて＃２から＃10まで
で表示されるウイルス内に出現するHAV HM−175/7のゲ
ノム中の突然変異を特徴とする。
似する技術の適用、ならびに表ＩおよびVIに表わすヌク
レオチド（突然変異）の内の一つもしくは複数の異なる
組み合わせの選択により設計することができる。例え
ば、実施例３のキメラウイルスの増殖分析からのデータ
により、5'非コーディング領域内の４つのMRC−５特異
的突然変異の内の一つもしくは複数（HM−175/7のヌク
レオチドの位置591、646、669、および687における突然
変異）、ならびに2C領域内のMRC−５特異的突然変異の
内の一つもしくは両方共（HM−175/7のヌクレオチドの
位置4418および4643における突然変異）が、MRC−５細
胞中でのウイルスの至適増殖について所望される可能性
があることが示される。他の突然変異も必要である可能
性がある。具体的実例として示される本発明のキメラHA
Vは、以下の実施例３の表VIにおいて＃２から＃10まで
で表示されるウイルス内に出現するHAV HM−175/7のゲ
ノム中の突然変異を特徴とする。
本発明のHAVは、HAV HM−175誘導体もしくは他のHAV
株の類似するゲノムの位置に、表ＩもしくはIVのこれら
のヌクレオチドの内の一つもしくは複数のものが存在す
ることを特徴とする。本発明のHAVは、二つもしくはそ
れを上回る前記ヌクレオチドを特徴とし、この場合HAV
親株内の一つのヌクレオチドは、pHAV/7の位置5145もし
くは他のHAV株の類似する位置のグアニン（Ｇ）であ
る。
株の類似するゲノムの位置に、表ＩもしくはIVのこれら
のヌクレオチドの内の一つもしくは複数のものが存在す
ることを特徴とする。本発明のHAVは、二つもしくはそ
れを上回る前記ヌクレオチドを特徴とし、この場合HAV
親株内の一つのヌクレオチドは、pHAV/7の位置5145もし
くは他のHAV株の類似する位置のグアニン（Ｇ）であ
る。
追加的な突然変異が、依然として配列決定を行う必要
があるHAVの幾つかの領域内に出現することがあること
も予期される。表Ｉに表わす突然変異を、いずれかの組
み合わせで、および／または依然として同定する必要の
ある他の突然変異と一緒に取り込んで、HAV生ワクチン
としての利用についての所望される特徴を有する数々の
キメラHAVもしくは組換えHAVを作製することができる。
があるHAVの幾つかの領域内に出現することがあること
も予期される。表Ｉに表わす突然変異を、いずれかの組
み合わせで、および／または依然として同定する必要の
ある他の突然変異と一緒に取り込んで、HAV生ワクチン
としての利用についての所望される特徴を有する数々の
キメラHAVもしくは組換えHAVを作製することができる。
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により作製さ
れる追加的キメラウイルスおよび組換えウイルスを設計
し、そしてMRC−５細胞内でのウイルス増殖および選択
された細胞培養物中での増殖への適応について、それら
の突然変異および組み合わせの個々の効果の評価の評定
を行うことができる。これらのキメラウイルスの弱毒化
表現型（attenuation phenotype）を、HAV 4380につ
いて以下の実施例１に記載されるような技術によりマー
モセットもしくはチンパンジーにおいて評価することが
できる。
れる追加的キメラウイルスおよび組換えウイルスを設計
し、そしてMRC−５細胞内でのウイルス増殖および選択
された細胞培養物中での増殖への適応について、それら
の突然変異および組み合わせの個々の効果の評価の評定
を行うことができる。これらのキメラウイルスの弱毒化
表現型（attenuation phenotype）を、HAV 4380につ
いて以下の実施例１に記載されるような技術によりマー
モセットもしくはチンパンジーにおいて評価することが
できる。
本発明のHAVをコード化するポリヌクレオチド配列
も、本発明により提供される。このようなポリヌクレオ
チド配列は、HAVワクチンのためのワクチン種を形成す
ることができるcDNA配列であることが好ましい。本発明
のcDNA配列は、新規のHAVに所望の特徴を付与するいず
れかの所望の組み合わせでの、表Ｉの12の突然変異とし
て示されるヌクレオチドの内の一つもしくは複数の存在
を特徴とする選択されたHAVゲノムをコード化するDNA配
列を含む。このようなcDNAは当業者に知られる通常の技
術により取得することができる。例えば、先に引用され
るSambrook et al.、および米国特許第4,894,228号を
参照せよ。
も、本発明により提供される。このようなポリヌクレオ
チド配列は、HAVワクチンのためのワクチン種を形成す
ることができるcDNA配列であることが好ましい。本発明
のcDNA配列は、新規のHAVに所望の特徴を付与するいず
れかの所望の組み合わせでの、表Ｉの12の突然変異とし
て示されるヌクレオチドの内の一つもしくは複数の存在
を特徴とする選択されたHAVゲノムをコード化するDNA配
列を含む。このようなcDNAは当業者に知られる通常の技
術により取得することができる。例えば、先に引用され
るSambrook et al.、および米国特許第4,894,228号を
参照せよ。
従って、本発明は、HAV感染に対する保護に役立つ生
ワクチン組成物、ならびにそのような組成物の有効量を
霊長類、好ましくはヒトに投与することを伴う予防法を
提供する。このワクチン組成物は、本発明書に記載され
るHAV 4380ならびにキメラHAVおよび組換えHAVを初め
とする一つもしくは複数の本発明のHAVを含むことがで
きる。ワクチン組成物はまた、所望であれば二つもしく
はそれを上回るHAVの混合物をも含むことができる。
ワクチン組成物、ならびにそのような組成物の有効量を
霊長類、好ましくはヒトに投与することを伴う予防法を
提供する。このワクチン組成物は、本発明書に記載され
るHAV 4380ならびにキメラHAVおよび組換えHAVを初め
とする一つもしくは複数の本発明のHAVを含むことがで
きる。ワクチン組成物はまた、所望であれば二つもしく
はそれを上回るHAVの混合物をも含むことができる。
ワクチン組成物は、担体もしくは賦形剤、ならびに一
つもしくは複数の本発明のHAVを含むように製剤するこ
とができる。適切な薬剤学的に許容される担体はウイル
スの投与を容易にするが、これらの担体は生理学的不活
性および／または無害である。当業者は担体を選択する
ことができる。実例として示される担体には、減菌食塩
水、ラクトース、スクロース、硫酸カルシウム、ゼラチ
ン、デキストリン、アガロース、ペクチン、ピーナッツ
油、オリーブ油、ゴマ油、および水がある。そのうえ、
担体もしくは賦形剤は、モノステアリン酸グリセロール
もしくはジステアリン酸グリセロールのような徐放性材
料を単独で、あるいはワックスと共に含むことができ
る。その上、緩放出性ポリマー製剤を使用することがで
きる。
つもしくは複数の本発明のHAVを含むように製剤するこ
とができる。適切な薬剤学的に許容される担体はウイル
スの投与を容易にするが、これらの担体は生理学的不活
性および／または無害である。当業者は担体を選択する
ことができる。実例として示される担体には、減菌食塩
水、ラクトース、スクロース、硫酸カルシウム、ゼラチ
ン、デキストリン、アガロース、ペクチン、ピーナッツ
油、オリーブ油、ゴマ油、および水がある。そのうえ、
担体もしくは賦形剤は、モノステアリン酸グリセロール
もしくはジステアリン酸グリセロールのような徐放性材
料を単独で、あるいはワックスと共に含むことができ
る。その上、緩放出性ポリマー製剤を使用することがで
きる。
場合によっては、ワクチン組成物は更に、保存料、化
学安定化剤、他の抗原性蛋白質、および通常の薬剤学的
処方成分を含むことができる。ウイルスと組み合わせた
ワクチン組成物において用いることができる適切な処方
成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチ
ン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二硫酸一カリウ
ム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および
粉乳がある。典型的には、安定化剤、アジュバンド、お
よび保存料を最大限に活用して、標的となるヒトもしく
は動物における効力について最良の製剤を決定する。適
切な保存料には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウ
ム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラ
ベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パ
ラクロロフェノールがある。
学安定化剤、他の抗原性蛋白質、および通常の薬剤学的
処方成分を含むことができる。ウイルスと組み合わせた
ワクチン組成物において用いることができる適切な処方
成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチ
ン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二硫酸一カリウ
ム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および
粉乳がある。典型的には、安定化剤、アジュバンド、お
よび保存料を最大限に活用して、標的となるヒトもしく
は動物における効力について最良の製剤を決定する。適
切な保存料には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウ
ム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラ
ベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パ
ラクロロフェノールがある。
本発明のワクチン組成物を、アジュバンドを使用せず
に産生することが最も好ましい。しかしながら必要であ
らば、先に記載のワクチン構成成分の内の一つもしくは
複数を通常のアジュバンドと混合させるか、あるいはそ
れに吸着させるかすることができる。アジュバンドは、
白血球を誘引させるかもしくは免疫反応を亢進させるた
めの非特異的刺激剤として用いる。このようなアジュバ
ンドには、中でも鉱油および水、水酸化アルミニウム、
アンフィゲン（Amphigen）、アビリジン（Aviridin
e）、L121/スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／
グリコシド、プルロニックプリオワ（Pluronic plyoi
s）、ムラミルジペプチド、死滅化ボルデテルラ（Borde
tella）、サポニン、およびクゥィルＡ（Quil Ａ）が
ある。
に産生することが最も好ましい。しかしながら必要であ
らば、先に記載のワクチン構成成分の内の一つもしくは
複数を通常のアジュバンドと混合させるか、あるいはそ
れに吸着させるかすることができる。アジュバンドは、
白血球を誘引させるかもしくは免疫反応を亢進させるた
めの非特異的刺激剤として用いる。このようなアジュバ
ンドには、中でも鉱油および水、水酸化アルミニウム、
アンフィゲン（Amphigen）、アビリジン（Aviridin
e）、L121/スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／
グリコシド、プルロニックプリオワ（Pluronic plyoi
s）、ムラミルジペプチド、死滅化ボルデテルラ（Borde
tella）、サポニン、およびクゥィルＡ（Quil Ａ）が
ある。
別法では、すなわち本発明のHAVに加えて、例えば免
疫刺激剤のような、HAV感染を治療するのに有用な他の
作用物質が、疾患症状を減少させそして除去するのに役
立つことが期待される。これらの作用物質を含むワクチ
ンもしくは治療用組成物の開発は、本発明の教示を考慮
すれば当業者の技術範囲内に含まれる程度のものであ
る。
疫刺激剤のような、HAV感染を治療するのに有用な他の
作用物質が、疾患症状を減少させそして除去するのに役
立つことが期待される。これらの作用物質を含むワクチ
ンもしくは治療用組成物の開発は、本発明の教示を考慮
すれば当業者の技術範囲内に含まれる程度のものであ
る。
本発明の方法に従うと、先に記載のワクチン組成物の
有効量を投与することにより、ヒトもしくは動物にHAV
感染に対するワクチン接種を施すことができる。有効量
は、HAV感染および／または肝炎に対するワクチン被接
種者（ヒトおよび動物）において保護作用を誘導するこ
とが可能なHAVワクチンの量として特定される。ワクチ
ンはいずれかの適切な経路により投与することができ
る。このような組成物は、非経口的、好ましくは筋肉内
的もしくは皮下的に投与することができる。しかしなが
ら、これを、経口的投与を初めとする他のいずれかの適
切な経路により投与するように製剤することもできる。
有効量を投与することにより、ヒトもしくは動物にHAV
感染に対するワクチン接種を施すことができる。有効量
は、HAV感染および／または肝炎に対するワクチン被接
種者（ヒトおよび動物）において保護作用を誘導するこ
とが可能なHAVワクチンの量として特定される。ワクチ
ンはいずれかの適切な経路により投与することができ
る。このような組成物は、非経口的、好ましくは筋肉内
的もしくは皮下的に投与することができる。しかしなが
ら、これを、経口的投与を初めとする他のいずれかの適
切な経路により投与するように製剤することもできる。
当業者は、本発明のHAVの適切な有効量を所望される
免疫反応のレベルに基づいて決定することができる。こ
のような組成物は一度投与すればよく、そして／または
ブースター投与もすることができる。しかしながら主治
医もしくは獣医は、ヒトもしくは動物患者の年齢、性
別、体重、および、一般的健康状況に依存して適切な用
量調節を行うことができる。
免疫反応のレベルに基づいて決定することができる。こ
のような組成物は一度投与すればよく、そして／または
ブースター投与もすることができる。しかしながら主治
医もしくは獣医は、ヒトもしくは動物患者の年齢、性
別、体重、および、一般的健康状況に依存して適切な用
量調節を行うことができる。
同様に、当業者は本発明のワクチン組成物の適切な用
量を簡便に決定することができる。用量は、ヒト患者も
しくは治療すべき動物種に依存して、すなわち体重、年
齢、および一般的健康状況によって調節することができ
る。
量を簡便に決定することができる。用量は、ヒト患者も
しくは治療すべき動物種に依存して、すなわち体重、年
齢、および一般的健康状況によって調節することができ
る。
以下に示す実施例は本発明のHAVを取得し、そしてワ
クチン組成物としてそれらを使用するための好ましい方
法を詳細に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を
制限することを意図するものではない。
クチン組成物としてそれらを使用するための好ましい方
法を詳細に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を
制限することを意図するものではない。
実施例1:マーモセットおよびチンパンジーにおけるMRC
−５適応化HAV 4380の検査 細胞培養物中での連続継代によるＡ型肝炎ウイルス
（HAV）の株HM−175の弱毒化は既に記載されている。AG
MKの初代細胞における32継代の後、ウイルスをチンパン
ジー用に完全に弱毒化させ、そしてマーモセット用には
ほぼ完全に弱毒化させた。その後、本発明に従い、ウイ
ルスをMRC−５細胞中での増殖に適応させ、そしてプラ
ーク精製により再クローン化させた。
−５適応化HAV 4380の検査 細胞培養物中での連続継代によるＡ型肝炎ウイルス
（HAV）の株HM−175の弱毒化は既に記載されている。AG
MKの初代細胞における32継代の後、ウイルスをチンパン
ジー用に完全に弱毒化させ、そしてマーモセット用には
ほぼ完全に弱毒化させた。その後、本発明に従い、ウイ
ルスをMRC−５細胞中での増殖に適応させ、そしてプラ
ーク精製により再クローン化させた。
HAV 4380は、ボランティアプールとして予め調製し
てあったウイルスの、やはり予め特徴を決定してあった
継代レベルから取得したボランティアロット87J19すな
わち継代レベル41の株HM−175 HAVから調製した。この
ような２つの初期継代物プールはチンパンジーおよびマ
ーモセットについて弱毒化されていることが判明した。
しかしながら、いずれのものもボランティアには投与せ
ずにおいたが、それは、これらのボランティアプールに
ついての基質であるアフリカグリーンモンキーの初代腎
臓細胞は、価格的に実現可能なワクチンを産生するほど
の十分量を入手することができないであろうといことが
認識されたためである。従って、このウイルスをMRC−
５細胞に適応させ、そしてボランティアロット87J19す
なわちHAV 4380を調製するために更に継代を行った。
てあったウイルスの、やはり予め特徴を決定してあった
継代レベルから取得したボランティアロット87J19すな
わち継代レベル41の株HM−175 HAVから調製した。この
ような２つの初期継代物プールはチンパンジーおよびマ
ーモセットについて弱毒化されていることが判明した。
しかしながら、いずれのものもボランティアには投与せ
ずにおいたが、それは、これらのボランティアプールに
ついての基質であるアフリカグリーンモンキーの初代腎
臓細胞は、価格的に実現可能なワクチンを産生するほど
の十分量を入手することができないであろうといことが
認識されたためである。従って、このウイルスをMRC−
５細胞に適応させ、そしてボランティアロット87J19す
なわちHAV 4380を調製するために更に継代を行った。
この実験の目的は、ボランティアにおける第Ｉ段階試
験の前に、マーモセットおよびチンパンジーについての
このウイルスの弱毒化のレベルを検査することである。
ロット87J19を、４匹のチンパンジーと４匹のサクイヌ
ス ミスタックス（Saquinus mystax）マーモセットに
おける安全性および免疫原性について検査した。２匹の
追加的マーモセットを非接種対照として用いた。この研
究に用いたチンパンジーは餌付けをしてありしかも監禁
してあったが、一方でマーモセットは野生状態のものを
捕獲した動物であった。候補物ワクチンであるロット87
J19の104のTCID50の接種物を各動物に静脈内投与した。
残った接種物は凍結し、そしてその後に２つの異なる研
究室において力価を証明してもらった。
験の前に、マーモセットおよびチンパンジーについての
このウイルスの弱毒化のレベルを検査することである。
ロット87J19を、４匹のチンパンジーと４匹のサクイヌ
ス ミスタックス（Saquinus mystax）マーモセットに
おける安全性および免疫原性について検査した。２匹の
追加的マーモセットを非接種対照として用いた。この研
究に用いたチンパンジーは餌付けをしてありしかも監禁
してあったが、一方でマーモセットは野生状態のものを
捕獲した動物であった。候補物ワクチンであるロット87
J19の104のTCID50の接種物を各動物に静脈内投与した。
残った接種物は凍結し、そしてその後に２つの異なる研
究室において力価を証明してもらった。
実験計画案に従って、任意のID番号570、572、566、
および575により示されるマーモセット、ならびに任意
のID番号300、1333、1309、および1313により示される
チンパンジーに、10-3希釈/1ml/I.V.の用量および投与
経路において、クローン25−４−21、ロット87J19575、
17/11/87からのHAV 4380の接種物を投与した。マーモ
セットNo.541および548には、1ml/I.V.の用量および投
与で希釈液を投与した。
および575により示されるマーモセット、ならびに任意
のID番号300、1333、1309、および1313により示される
チンパンジーに、10-3希釈/1ml/I.V.の用量および投与
経路において、クローン25−４−21、ロット87J19575、
17/11/87からのHAV 4380の接種物を投与した。マーモ
セットNo.541および548には、1ml/I.V.の用量および投
与で希釈液を投与した。
A.感作：市販の放射線免疫アッセイ（HAVAB、Abbott L
aboratories社、Chicago、IL）により検出される抗−HA
Vの開発により測定したところ、４匹の内の３匹のチン
パンジーおよび４匹の内の１匹のマーモセットが感作さ
れていた。チンパンジーは接種後10から11週間目までセ
ロコンバージョンを生じ、唯一のマーモセットのセロコ
ンバージョンは接種後８週間目に生じた。このマーモセ
ットはその後研究11週間目に死亡し、そして感作されな
かった他のマーモセットはその後14週間目に死亡した
が、いずれの死も接種物が原因ではなかった。
aboratories社、Chicago、IL）により検出される抗−HA
Vの開発により測定したところ、４匹の内の３匹のチン
パンジーおよび４匹の内の１匹のマーモセットが感作さ
れていた。チンパンジーは接種後10から11週間目までセ
ロコンバージョンを生じ、唯一のマーモセットのセロコ
ンバージョンは接種後８週間目に生じた。このマーモセ
ットはその後研究11週間目に死亡し、そして感作されな
かった他のマーモセットはその後14週間目に死亡した
が、いずれの死も接種物が原因ではなかった。
セロコンバージョンを生じた３匹のチンパンジー全て
はIgM抗−HAVをも生じていた。1:4,000の最終血清希釈
液において標準的HAVAB−Ｍ（Abbott Laboratories
社、Chicago、IL）により検査したところ、これらの内
の２匹、すなわちChimp 1309およびChimp 1313は各々
10週目および13週目にIgM抗−HAVを産生していた。これ
らの血清を、1:40の希釈液において検査したところ、Ch
imp 1313およびChimp 1333は各々９週間目および５週
間目にセロコンバージョンを生じた。HAVAB−Ｍ検査は
抗−ヒトIgMを利用する捕捉アッセイであり、そしてチ
ンパンジーと比較するとヒトとそれ程密接に関連しては
いない霊長類からの血清での利用については未だに標準
化が行われていない。この理由のため、マーモセットは
IgM抗−HAVについては検査を行わなかった。
はIgM抗−HAVをも生じていた。1:4,000の最終血清希釈
液において標準的HAVAB−Ｍ（Abbott Laboratories
社、Chicago、IL）により検査したところ、これらの内
の２匹、すなわちChimp 1309およびChimp 1313は各々
10週目および13週目にIgM抗−HAVを産生していた。これ
らの血清を、1:40の希釈液において検査したところ、Ch
imp 1313およびChimp 1333は各々９週間目および５週
間目にセロコンバージョンを生じた。HAVAB−Ｍ検査は
抗−ヒトIgMを利用する捕捉アッセイであり、そしてチ
ンパンジーと比較するとヒトとそれ程密接に関連しては
いない霊長類からの血清での利用については未だに標準
化が行われていない。この理由のため、マーモセットは
IgM抗−HAVについては検査を行わなかった。
B.生化学的症状：肝炎の生化学的証拠を血清のアラニン
アミノトランスフェラーゼ（ALT）およびイソクエン酸
デヒドロゲナーゼ（ICD）を毎週決定することによりモ
ニターした。前者はチンパンジーにおける肝炎を診断す
る最も信頼制の高い間接的方法であり、そして後者はマ
ーモセットの評定については比較的感度が高い。チンパ
ンジーもしくはマーモセットの内のいずれのものも、接
種物が原因となる肝酵素の上昇は示さなかった。チンパ
ンジーについての全ての値は正常範囲以内に収まってい
た。唯一の感作マーモセット、番号582は、死に至るま
での期間正常な肝酵素を示した。マーモセット566、57
0、および578の各々は一つもしくは複数の異常肝酵素値
を示したが、セロコンバージョンを生じていなかったこ
とより判断すると、これらの動物の内の最初の２匹は接
種物により感作されておらず、そして第三のものは接種
を行わなかった陰性対照であった。
アミノトランスフェラーゼ（ALT）およびイソクエン酸
デヒドロゲナーゼ（ICD）を毎週決定することによりモ
ニターした。前者はチンパンジーにおける肝炎を診断す
る最も信頼制の高い間接的方法であり、そして後者はマ
ーモセットの評定については比較的感度が高い。チンパ
ンジーもしくはマーモセットの内のいずれのものも、接
種物が原因となる肝酵素の上昇は示さなかった。チンパ
ンジーについての全ての値は正常範囲以内に収まってい
た。唯一の感作マーモセット、番号582は、死に至るま
での期間正常な肝酵素を示した。マーモセット566、57
0、および578の各々は一つもしくは複数の異常肝酵素値
を示したが、セロコンバージョンを生じていなかったこ
とより判断すると、これらの動物の内の最初の２匹は接
種物により感作されておらず、そして第三のものは接種
を行わなかった陰性対照であった。
マーモセットはチンパンジーと比較すると肝酵素値が
さほど安定でないことが良くあり、これは一部にはマー
モセットは生まれつき比較的虚弱な動物であるためとい
う理由により、なおかつそれらのマーモセットはジャン
グルで捕獲してきた動物であり、そしてそのため通常ミ
クロフィラリアを初めとする種々多様な内寄生性生物お
よび外寄生性生物に感染しているという理由による。
さほど安定でないことが良くあり、これは一部にはマー
モセットは生まれつき比較的虚弱な動物であるためとい
う理由により、なおかつそれらのマーモセットはジャン
グルで捕獲してきた動物であり、そしてそのため通常ミ
クロフィラリアを初めとする種々多様な内寄生性生物お
よび外寄生性生物に感染しているという理由による。
C.組織学的症状：チンパンジーおよびマーモセットから
取得した毎週毎の一連の肝生検材料から調製した組織学
的検査用切片を、組織病理学的変化についての慣例に基
づき評価した。幾匹かの動物は高いベースラインの組織
病理学的変化を示したものの、いずれの動物も接種前の
生検材料において見られるものと比較してより重篤な組
織病理学的変化の形跡を示してはいなかった。同様に重
要なことであるが、感作動物におけるセロコンバージョ
ンに一時的に関連する病理学的変化は存在しなかった。
死亡した２匹のマーモセットをより広範囲にわたる評価
に供した。両動物ともそれぞれの死に恐らく病因学的に
関連すると思われる全身性疾患の形跡を示していたが、
肝臓における組織学的変化は急性疾患のものではなく慢
性疾患のものであると診断され、そしてそのため接種物
に関連するものではなかった。
取得した毎週毎の一連の肝生検材料から調製した組織学
的検査用切片を、組織病理学的変化についての慣例に基
づき評価した。幾匹かの動物は高いベースラインの組織
病理学的変化を示したものの、いずれの動物も接種前の
生検材料において見られるものと比較してより重篤な組
織病理学的変化の形跡を示してはいなかった。同様に重
要なことであるが、感作動物におけるセロコンバージョ
ンに一時的に関連する病理学的変化は存在しなかった。
死亡した２匹のマーモセットをより広範囲にわたる評価
に供した。両動物ともそれぞれの死に恐らく病因学的に
関連すると思われる全身性疾患の形跡を示していたが、
肝臓における組織学的変化は急性疾患のものではなく慢
性疾患のものであると診断され、そしてそのため接種物
に関連するものではなかった。
これらのさまざまなボランティアプールおよび野生型
ウイルスを用いる際にチンパンジーおよびマーモセット
において観察される組織病理学的変化の比較を実施し
た。以下の表IIおよびIIIを参照せよ。
ウイルスを用いる際にチンパンジーおよびマーモセット
において観察される組織病理学的変化の比較を実施し
た。以下の表IIおよびIIIを参照せよ。
感染性および組織病理学的変化の重篤度に基づくと、
ロット87J19は他のボランティアプールもしくは野生型
ウイルスと比較してより強く弱毒化されているように思
われる。
ロット87J19は他のボランティアプールもしくは野生型
ウイルスと比較してより強く弱毒化されているように思
われる。
D.免疫蛍光法：感作動物から取得した一連の瞬間凍結肝
生検材料を、免疫蛍光法によりウイルス抗原の発現につ
いて評価した。ただ一匹の動物、Chimp 1313が、弱い
ながらも確かに肝臓内ウイルス抗原について陽性を示し
た。この動物はわずか一週間の間のみ陽性を示した。こ
の結果を他のボランティアプールおよび野生型ウイルス
のこれまでの研究において得られたものと比較した。表
IVおよびＶにおいて示されるように、AGMK増殖ウイルス
と野生型ウイルスとを比較する際、肝臓内複製はチンパ
ンジーおよびマーモセットのいずれにおいても一層減少
化が進んでいた。
生検材料を、免疫蛍光法によりウイルス抗原の発現につ
いて評価した。ただ一匹の動物、Chimp 1313が、弱い
ながらも確かに肝臓内ウイルス抗原について陽性を示し
た。この動物はわずか一週間の間のみ陽性を示した。こ
の結果を他のボランティアプールおよび野生型ウイルス
のこれまでの研究において得られたものと比較した。表
IVおよびＶにおいて示されるように、AGMK増殖ウイルス
と野生型ウイルスとを比較する際、肝臓内複製はチンパ
ンジーおよびマーモセットのいずれにおいても一層減少
化が進んでいた。
E.保護作用：研究の結果一匹の感作マーモセットが死亡
したものの、４匹全てのチンパンジーは野生型の親HAV
での刺激に利用することができ、感作動物中に存在する
抗−HAVのレベルが保護作用を行う程のものか否かを決
定することができた。従って、３匹の感作動物および一
匹の非感作動物に、野生型のHM−175株HAV（ヒト排泄物
懸濁液）の約103のチンパンジー感染性用量での刺激を
静脈内投与により実施した（図１から図４まで）。
したものの、４匹全てのチンパンジーは野生型の親HAV
での刺激に利用することができ、感作動物中に存在する
抗−HAVのレベルが保護作用を行う程のものか否かを決
定することができた。従って、３匹の感作動物および一
匹の非感作動物に、野生型のHM−175株HAV（ヒト排泄物
懸濁液）の約103のチンパンジー感染性用量での刺激を
静脈内投与により実施した（図１から図４まで）。
予め感作させてあった３匹のチンパンジー全ては、持
続的な正常血清酵素値が測定されたためＡ型肝炎に対す
る保護作用を生じていた（図１から図３まで）。３匹の
被保護化動物全ては刺激ウイルスへの既住症抗体反応を
示し、このことにより制限を受けた上での複製の存在が
示唆された。それとは対比的に、予め感作されていなか
ったチンパンジーは、野生型ウイルスでの刺激後に肝炎
と診断される高い酵素値を呈した（図４）。従って、ボ
ランティアプール87J19はチンパンジー内での不顕性感
染を生じ、その不顕性感染により有毒の野生型ウイルス
での後続刺激に対する保護作用が刺激化された。
続的な正常血清酵素値が測定されたためＡ型肝炎に対す
る保護作用を生じていた（図１から図３まで）。３匹の
被保護化動物全ては刺激ウイルスへの既住症抗体反応を
示し、このことにより制限を受けた上での複製の存在が
示唆された。それとは対比的に、予め感作されていなか
ったチンパンジーは、野生型ウイルスでの刺激後に肝炎
と診断される高い酵素値を呈した（図４）。従って、ボ
ランティアプール87J19はチンパンジー内での不顕性感
染を生じ、その不顕性感染により有毒の野生型ウイルス
での後続刺激に対する保護作用が刺激化された。
この実験のこれらの部分の結果により、HAV4380株HM
−175（MRC−５細胞に適応させてあるもの）であるボラ
ンティアプール87J19は、その親であるHAV株HM−175（A
GMK、Pass−32）と比較して、チンパンジーおよびマー
モセットについて有意に強く弱毒化されているというこ
とが示される。これらの研究により、HAV 4380株HM−1
75であるボランティアプール87J19は、Ａ型肝炎ウイル
スの研究における容認されるヒト代用物であるチンパン
ジーおよびマーモセットについては弱毒化の度合いが高
いことが明白である。
−175（MRC−５細胞に適応させてあるもの）であるボラ
ンティアプール87J19は、その親であるHAV株HM−175（A
GMK、Pass−32）と比較して、チンパンジーおよびマー
モセットについて有意に強く弱毒化されているというこ
とが示される。これらの研究により、HAV 4380株HM−1
75であるボランティアプール87J19は、Ａ型肝炎ウイル
スの研究における容認されるヒト代用物であるチンパン
ジーおよびマーモセットについては弱毒化の度合いが高
いことが明白である。
実施例2:ボランティアの臨床研究
この臨床試験においては、ボランティアに、実施例１
において記載されるように、チンパンジーおよびマーモ
セットにおいて既に検査された弱毒生Ａ型肝炎ワクチン
4380、すなわちボランティアプール87J19の増加力価
を投与した。これらの臨床的予備研究により、このワク
チンは安全で、免疫原性を示し、そして実例として示し
た実験的動物モデルにおいて効果を有することが示され
ている。
において記載されるように、チンパンジーおよびマーモ
セットにおいて既に検査された弱毒生Ａ型肝炎ワクチン
4380、すなわちボランティアプール87J19の増加力価
を投与した。これらの臨床的予備研究により、このワク
チンは安全で、免疫原性を示し、そして実例として示し
た実験的動物モデルにおいて効果を有することが示され
ている。
ボランティアは、米国陸軍感染性疾患医療研究所（th
e United States Army Medical Research Instit
ute of Infectios Diseases、Fort Detrick、Maryl
and）の隔離臨床病棟に入院した。８人のボランティア
に、以下に示す様式における経口経路により弱毒生Ａ型
肝炎ワクチン（1ml）を投与したが、その様式の内訳と
は、二人に104のTCID50用量を、二人に105のTCID50用量
を、二人に106のTCID50用量を、そして二人に107のTCID
50用量を投与するということであった。６人のボランテ
ィアには、以下に示す様式における三角筋領域の筋肉内
経路によりワクチを投与したが、その様式の内訳とは、
二人に105のTCID50用量を、二人に106のTCID50用量を、
そして二人に107のTCID50用量を投与するということで
あった。
e United States Army Medical Research Instit
ute of Infectios Diseases、Fort Detrick、Maryl
and）の隔離臨床病棟に入院した。８人のボランティア
に、以下に示す様式における経口経路により弱毒生Ａ型
肝炎ワクチン（1ml）を投与したが、その様式の内訳と
は、二人に104のTCID50用量を、二人に105のTCID50用量
を、二人に106のTCID50用量を、そして二人に107のTCID
50用量を投与するということであった。６人のボランテ
ィアには、以下に示す様式における三角筋領域の筋肉内
経路によりワクチを投与したが、その様式の内訳とは、
二人に105のTCID50用量を、二人に106のTCID50用量を、
そして二人に107のTCID50用量を投与するということで
あった。
各ボランティアは免疫化後３週間その病棟に滞留し
た。局所性もしくは全身性副作用を、投与期間および免
疫化後12週間の間モニターした。ボランティアには、血
清学的追跡調査のため６および12カ月目に来院するよう
に請求した。
た。局所性もしくは全身性副作用を、投与期間および免
疫化後12週間の間モニターした。ボランティアには、血
清学的追跡調査のため６および12カ月目に来院するよう
に請求した。
免疫化前、および次からの12週間の間には一週間に一
度、血清を採取した。適切な追跡期間を満了したボラン
ティアにおいては、最初のワクチン投与後６カ月および
12カ月目にも血清を採取した。血清標本を、アラニンア
ミノトランスフェラーゼ（ALT）およびＡ型肝炎への抗
体について検査した。ALTは、Kodak社のEKTA Chem 70
0XR分析機（Rochester、NY）で検査し、この場合正常値
は０から50IU/mlであった。Ａ型肝炎に対する抗体は、
市販の放射性免疫アッセイ（HAVAB、Abbott Laborator
ies社、N.Chicago、IL）を初めとする４つの異なる方法
により検査した。第二の抗体検査法は、SmithKline Be
echam社により開発された酵素結合免疫アッセイ（SKB−
ELISA）であり、これは標準的なHAVABと比較してより感
度が高く、このアッセイにおいては≧20ミリ国際単位
（mIU）のレベルが陽性と判定される。選択された血清
を、Ａ型肝炎に対する抗体の中和についてのRIFIT（放
射性免疫フォーカス）アッセイにより検査した。この検
査によっては≧1:10の血清力価が陽性と判定される［S.
M.Lemon et al.、J.Infect.Dis.、148:1033−1039（1
983）］。最後には、血清を市販の放射性免疫アッセイ
（HAVAB−Ｍ、Abbott Laboratories社、N.Chicago、I
L）によりIgM抗−HAVについて検査した。
度、血清を採取した。適切な追跡期間を満了したボラン
ティアにおいては、最初のワクチン投与後６カ月および
12カ月目にも血清を採取した。血清標本を、アラニンア
ミノトランスフェラーゼ（ALT）およびＡ型肝炎への抗
体について検査した。ALTは、Kodak社のEKTA Chem 70
0XR分析機（Rochester、NY）で検査し、この場合正常値
は０から50IU/mlであった。Ａ型肝炎に対する抗体は、
市販の放射性免疫アッセイ（HAVAB、Abbott Laborator
ies社、N.Chicago、IL）を初めとする４つの異なる方法
により検査した。第二の抗体検査法は、SmithKline Be
echam社により開発された酵素結合免疫アッセイ（SKB−
ELISA）であり、これは標準的なHAVABと比較してより感
度が高く、このアッセイにおいては≧20ミリ国際単位
（mIU）のレベルが陽性と判定される。選択された血清
を、Ａ型肝炎に対する抗体の中和についてのRIFIT（放
射性免疫フォーカス）アッセイにより検査した。この検
査によっては≧1:10の血清力価が陽性と判定される［S.
M.Lemon et al.、J.Infect.Dis.、148:1033−1039（1
983）］。最後には、血清を市販の放射性免疫アッセイ
（HAVAB−Ｍ、Abbott Laboratories社、N.Chicago、I
L）によりIgM抗−HAVについて検査した。
最初の12週間については一週間当たり２−３回ボラン
ティアから排泄物を回収し、そして放射性免疫アッセイ
［R.H.Purcell et al.、J.Immunol.、116:349−356
（1976）］および分子生物学的技術［J.Ticehurst et
al.、J.Clin.Microbiol.、25:1822−1829（1987）］
によりＡ型肝炎ウイルスの存在について検査した。
ティアから排泄物を回収し、そして放射性免疫アッセイ
［R.H.Purcell et al.、J.Immunol.、116:349−356
（1976）］および分子生物学的技術［J.Ticehurst et
al.、J.Clin.Microbiol.、25:1822−1829（1987）］
によりＡ型肝炎ウイルスの存在について検査した。
全てのボランティアは追跡期間中健康状態のままであ
った（14週間から１年まで）。全身性の病状はいずれ
も、免疫化直後あるいは長期の追跡調査期間中には全く
存在しなかった。血清アラニンアミノトランスフェラー
ゼレベルは、観察期間中14人全ての個体において正常値
に留まっていた。
った（14週間から１年まで）。全身性の病状はいずれ
も、免疫化直後あるいは長期の追跡調査期間中には全く
存在しなかった。血清アラニンアミノトランスフェラー
ゼレベルは、観察期間中14人全ての個体において正常値
に留まっていた。
経口経路によりワクチンを投与された８人のボランテ
ィアもしくは筋肉内経路により105のTCID50用量を投与
した二人のボランティアの内のいずれのものにおいて
も、Ａ型肝炎に対する抗体は観察されなかった。より高
い用量のワクチン（106のTCID50もしくは107のTCID50）
を投与した４人のボランティアにおは全て、免疫化後３
週間目という早い時期にSKB ELISAにより検出可能な抗
体が存在していた。検出可能レベルは12週間の観察期間
にわたり持続した。中和抗体について検査した選択され
た血清には、106用量を投与したボランティアにおいて
は1:10から1:40までの範囲に、そして107のTCID50用量
を投与したボランティアにおいては1:40から1:2560まで
の範囲にわたる力価が存在した。市販のHAVABアッセイ
により、107用量を投与したボランティアの内のただ一
人において抗−HAVが検出された。IgM抗−HAVは、ワク
チンを経口投与したボランティアの内のいずれにおいて
も検出されなかった。107のTICD50I.M.投与を施したボ
ランティアからの血清には、検出可能なIgM抗−HAVが存
在していた。
ィアもしくは筋肉内経路により105のTCID50用量を投与
した二人のボランティアの内のいずれのものにおいて
も、Ａ型肝炎に対する抗体は観察されなかった。より高
い用量のワクチン（106のTCID50もしくは107のTCID50）
を投与した４人のボランティアにおは全て、免疫化後３
週間目という早い時期にSKB ELISAにより検出可能な抗
体が存在していた。検出可能レベルは12週間の観察期間
にわたり持続した。中和抗体について検査した選択され
た血清には、106用量を投与したボランティアにおいて
は1:10から1:40までの範囲に、そして107のTCID50用量
を投与したボランティアにおいては1:40から1:2560まで
の範囲にわたる力価が存在した。市販のHAVABアッセイ
により、107用量を投与したボランティアの内のただ一
人において抗−HAVが検出された。IgM抗−HAVは、ワク
チンを経口投与したボランティアの内のいずれにおいて
も検出されなかった。107のTICD50I.M.投与を施したボ
ランティアからの血清には、検出可能なIgM抗−HAVが存
在していた。
経口ワクチン投与を施した全ての患者からの排泄物は
Ａ型肝炎ウイルスについて陰性であった一方で、筋肉内
経路によりワクチンを投与したボランティアからのもの
は、現在検査中である。
Ａ型肝炎ウイルスについて陰性であった一方で、筋肉内
経路によりワクチンを投与したボランティアからのもの
は、現在検査中である。
少数のボランティアのみが経口的ワクチン投与を受け
たに過ぎないのであるが、この経路によってはワクチン
は免疫原性を示さないことは明白である。これは恐らく
ウイルスの弱毒化過剰が原因であると思われるが、胃腸
管における不活性化もしくは接種量が少なすぎることの
ような他の原因も考慮するべきである。このワクチン
は、106および107のTCID50という用量における筋肉内経
路によっては安全でありそして免疫原性を示した。抗体
反応は迅速であり、抗−HAVが免疫化の３週間以内に観
察され、観察期間中持続し、そして力価は減少しなかっ
た。アジュバンドを添加していない調剤の単一接種に対
するこのような反応は顕著である。本当に抗−HAVが単
回投与後長期間持続するのであらばこの産物の投与の後
方業務はより単純なものになるであろうし、そして現行
のＡ型肝炎ワクチを用いる場合と比較するとより成功す
る確立が高くなるであろう。107のTCID50投与を施した
ボランティア中に肝炎の形跡を伴うことなくIgM抗−HAV
が存在することにより、このウイルスが不顕性複製を行
うことが示唆される。
たに過ぎないのであるが、この経路によってはワクチン
は免疫原性を示さないことは明白である。これは恐らく
ウイルスの弱毒化過剰が原因であると思われるが、胃腸
管における不活性化もしくは接種量が少なすぎることの
ような他の原因も考慮するべきである。このワクチン
は、106および107のTCID50という用量における筋肉内経
路によっては安全でありそして免疫原性を示した。抗体
反応は迅速であり、抗−HAVが免疫化の３週間以内に観
察され、観察期間中持続し、そして力価は減少しなかっ
た。アジュバンドを添加していない調剤の単一接種に対
するこのような反応は顕著である。本当に抗−HAVが単
回投与後長期間持続するのであらばこの産物の投与の後
方業務はより単純なものになるであろうし、そして現行
のＡ型肝炎ワクチを用いる場合と比較するとより成功す
る確立が高くなるであろう。107のTCID50投与を施した
ボランティア中に肝炎の形跡を伴うことなくIgM抗−HAV
が存在することにより、このウイルスが不顕性複製を行
うことが示唆される。
実施例3:キメラウイルスの作製法
実例として示される幾つかのキメラウイルスを作製し
て、霊長類における宿主域および／または弱毒化につい
て、表Ｉの突然変異の内の幾つかのものの効果を評定し
た。MRC−５適応化ウイルス4380の配列を逆転写酵素：
ポリメラーゼ連鎖反応（RT:PCR）を使用して取得し、配
列決定をする前にcDNAとしてのウイルスの領域を増幅さ
せた（そのため、以下の表VIにおけるＵの代わりにＴが
存在する）。表VIにおける番号２−10は、MRC−５適応
化ウイルス4380において見いだされる突然変異を、Cohe
n et el.、J.Viol.、61:3035−3039（1987）［配列番
号１および２］の弱毒化させたHM−171ウイルスのPass
35をコード化するpHAV/7のcDNAクローン内に挿入する
ことにより作製したキメラウイルスを表示する。「キメ
ラ」により導入される突然変異とは、RT:PCRにより増幅
され、特異的制限酵素で消化させる4380ウイルスゲノム
の一部分を意味し、そしてその断片を用いてcDNAクロー
ンpHAV/7内の相同断片を置換する。突然変異誘発により
導入された突然変異は、Amersham社の突然変異誘発実験
計画案を用いるcDNAクローンpHAV/7のオリゴヌクレオチ
ド特異的突然変異誘発により挿入した。
て、霊長類における宿主域および／または弱毒化につい
て、表Ｉの突然変異の内の幾つかのものの効果を評定し
た。MRC−５適応化ウイルス4380の配列を逆転写酵素：
ポリメラーゼ連鎖反応（RT:PCR）を使用して取得し、配
列決定をする前にcDNAとしてのウイルスの領域を増幅さ
せた（そのため、以下の表VIにおけるＵの代わりにＴが
存在する）。表VIにおける番号２−10は、MRC−５適応
化ウイルス4380において見いだされる突然変異を、Cohe
n et el.、J.Viol.、61:3035−3039（1987）［配列番
号１および２］の弱毒化させたHM−171ウイルスのPass
35をコード化するpHAV/7のcDNAクローン内に挿入する
ことにより作製したキメラウイルスを表示する。「キメ
ラ」により導入される突然変異とは、RT:PCRにより増幅
され、特異的制限酵素で消化させる4380ウイルスゲノム
の一部分を意味し、そしてその断片を用いてcDNAクロー
ンpHAV/7内の相同断片を置換する。突然変異誘発により
導入された突然変異は、Amersham社の突然変異誘発実験
計画案を用いるcDNAクローンpHAV/7のオリゴヌクレオチ
ド特異的突然変異誘発により挿入した。
キメラcDNAをインビトロでRNA内に転写させ、そして
核酸（RNAとDNAの両方）をFRhK−４細胞内にトランスフ
ェクトさせてキメラウイルスを作製した。実例として示
したキメラ体についてのキメラウイルス増殖の定量化
は、スロット−ブロットアッセイ（slot−blot assa
y）により実施した。
核酸（RNAとDNAの両方）をFRhK−４細胞内にトランスフ
ェクトさせてキメラウイルスを作製した。実例として示
したキメラ体についてのキメラウイルス増殖の定量化
は、スロット−ブロットアッセイ（slot−blot assa
y）により実施した。
表VIは、９つのキメラウイルスの作製および検査の結
果を示している。表VIにおいて用いられる以下の用語を
特定する。細胞培養物は、MEC−５細胞中の増殖により
選択される表示の突然変異を含むウイルスを意味する。
突然変異誘発は、Ｐ−35もしくはHM−175cDNAクローン
のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を意味する。
キメラウイルスゲノムは、Ｐ−35 cDNAクローンの一部
分、ならびにMRC−５細胞適応化ウイルス4380のRCRで作
製した断片を使用するキメラウイルスゲノム構築物を意
味する。NDは、この研究は未だに実施されていないこと
を意味する。＋記号は、その種類の細胞内において幾分
かの増殖を示すウイルスを意味する。−記号は、その種
類の細胞内においてほとんど増殖しない、あるいは全く
増殖しないウイルスを意味する。キメラウイルスの増殖
を検査するのに利用した２つの種類の細胞は、ヒト肺の
繊維芽細胞様細胞株MRC−５およびアカゲザル胎児腎臓
の上皮様細胞株FRhK−４である。表中のウイルス＃１は
MRC−５適応化HAV4380を意味することを銘記せよ。ウイ
ルス＃２から10までは本発明のキメラウイルスである。
果を示している。表VIにおいて用いられる以下の用語を
特定する。細胞培養物は、MEC−５細胞中の増殖により
選択される表示の突然変異を含むウイルスを意味する。
突然変異誘発は、Ｐ−35もしくはHM−175cDNAクローン
のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を意味する。
キメラウイルスゲノムは、Ｐ−35 cDNAクローンの一部
分、ならびにMRC−５細胞適応化ウイルス4380のRCRで作
製した断片を使用するキメラウイルスゲノム構築物を意
味する。NDは、この研究は未だに実施されていないこと
を意味する。＋記号は、その種類の細胞内において幾分
かの増殖を示すウイルスを意味する。−記号は、その種
類の細胞内においてほとんど増殖しない、あるいは全く
増殖しないウイルスを意味する。キメラウイルスの増殖
を検査するのに利用した２つの種類の細胞は、ヒト肺の
繊維芽細胞様細胞株MRC−５およびアカゲザル胎児腎臓
の上皮様細胞株FRhK−４である。表中のウイルス＃１は
MRC−５適応化HAV4380を意味することを銘記せよ。ウイ
ルス＃２から10までは本発明のキメラウイルスである。
Ｐ−35ゲノムのヌクレオチドの位置591、646、669、
および687において5'非コーディング領域中に見いださ
れる４つの突然変異を導入スルコトは、細胞培養物中の
HAV宿主域にとって重要なものであるように思われる。
これらの突然変異によりMRC−５細胞中でのトランスフ
ェクト済みウイルスの幾分かの増殖が可能になるが、こ
れによりMRC−５細胞培養適用が全て説明される訳では
ない。5'突然変異と共にMRC−５適応化ウイルスの2C領
域内のヌクレオチド4418および4643において２つの突然
変異を導入することにより、MRC−５細胞中の完全増殖
が可能となる。従って、5'非コーディング領域内の４つ
の突然変異、およびMRC−５適応化ウイルスのゲノムの2
C領域内の２つの突然変異、このウイルスの適応化の際
に協同的に作用してMRC−５細胞内での増殖を効率の良
いものにしているように思われる。2C領域内の２つの突
然変異のみをＰ−35 AGMKゲノム内に導入しても、トラ
ンスフェクト済みウイルスはMRC−２細胞内において認
識できる程に増殖するようにはならない。
および687において5'非コーディング領域中に見いださ
れる４つの突然変異を導入スルコトは、細胞培養物中の
HAV宿主域にとって重要なものであるように思われる。
これらの突然変異によりMRC−５細胞中でのトランスフ
ェクト済みウイルスの幾分かの増殖が可能になるが、こ
れによりMRC−５細胞培養適用が全て説明される訳では
ない。5'突然変異と共にMRC−５適応化ウイルスの2C領
域内のヌクレオチド4418および4643において２つの突然
変異を導入することにより、MRC−５細胞中の完全増殖
が可能となる。従って、5'非コーディング領域内の４つ
の突然変異、およびMRC−５適応化ウイルスのゲノムの2
C領域内の２つの突然変異、このウイルスの適応化の際
に協同的に作用してMRC−５細胞内での増殖を効率の良
いものにしているように思われる。2C領域内の２つの突
然変異のみをＰ−35 AGMKゲノム内に導入しても、トラ
ンスフェクト済みウイルスはMRC−２細胞内において認
識できる程に増殖するようにはならない。
実施例4:FRhK−４ 対 MRC−５細胞でのキメラウイル
スの終点希釈の比較 表VIに記載される組成のキメラウイルスを10倍増加量
で連続的に希釈し、そして各希釈物の同量分注をFRhK−
４およびMRC−５細胞のプレート上にかけた。ウイルス
増殖を可能にさせるための34.5℃における21日間のイン
キュベーションの後、ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩
衝溶液の添加により細胞を溶菌させた。ウイルスRNAを
フェノールで抽出し、そしてＡ型肝炎ウイルスに特異的
な［32P］−ラベル化リボプローブ（riboprobe）を使用
するスロットブロットハイブリッド形成（slot blot
hybridization）による定量を行った。FRhK−４細胞お
よびMRC−５細胞から取得したスロットブロットのラジ
オオートグラフにより、MRC−５適応化ウイルスの終点
希釈率は両細胞株において同一であったことが証明さ
れ、このことによりこのウイルスはいずれの細胞株内で
も増殖可能であることが示された。それとは対照的に、
P35 HM−175ウイルスは、FRhK−４細胞については10-5
の、そしてMRC−５細胞については＜10-1の終点希釈率
を示し、このことによりこのウイルスはMRC−５細胞上
ではうまく増殖することができないことが示された。図
５に示されるように、ウイルス＃６はpass 35ウイルス
に最も類似している一方で、ウイルス＃４はMRC−５に
適応させたウイルスに最も類似しており、そしてウイル
ス＃２、３、および５はそれらの中間であった。これら
の結果により、MRC−５適応化ウイルスからの所定の突
然変異をpHAV/7 cDNAクローン内に導入させて、やはり
MRC−５細胞内で増殖する能力を獲得している新規のウ
イルスを作製することができるということが示される。
スの終点希釈の比較 表VIに記載される組成のキメラウイルスを10倍増加量
で連続的に希釈し、そして各希釈物の同量分注をFRhK−
４およびMRC−５細胞のプレート上にかけた。ウイルス
増殖を可能にさせるための34.5℃における21日間のイン
キュベーションの後、ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩
衝溶液の添加により細胞を溶菌させた。ウイルスRNAを
フェノールで抽出し、そしてＡ型肝炎ウイルスに特異的
な［32P］−ラベル化リボプローブ（riboprobe）を使用
するスロットブロットハイブリッド形成（slot blot
hybridization）による定量を行った。FRhK−４細胞お
よびMRC−５細胞から取得したスロットブロットのラジ
オオートグラフにより、MRC−５適応化ウイルスの終点
希釈率は両細胞株において同一であったことが証明さ
れ、このことによりこのウイルスはいずれの細胞株内で
も増殖可能であることが示された。それとは対照的に、
P35 HM−175ウイルスは、FRhK−４細胞については10-5
の、そしてMRC−５細胞については＜10-1の終点希釈率
を示し、このことによりこのウイルスはMRC−５細胞上
ではうまく増殖することができないことが示された。図
５に示されるように、ウイルス＃６はpass 35ウイルス
に最も類似している一方で、ウイルス＃４はMRC−５に
適応させたウイルスに最も類似しており、そしてウイル
ス＃２、３、および５はそれらの中間であった。これら
の結果により、MRC−５適応化ウイルスからの所定の突
然変異をpHAV/7 cDNAクローン内に導入させて、やはり
MRC−５細胞内で増殖する能力を獲得している新規のウ
イルスを作製することができるということが示される。
本発明の数々の修正物および改変物は先に示される明
細書内に含まれ、そしてこれらは当業者には明白である
ことが予期される。本発明の組成物および方法に対する
このような修正物および改変物は、今後添付される請求
の範囲内に含まれるものとみなされる。
細書内に含まれ、そしてこれらは当業者には明白である
ことが予期される。本発明の組成物および方法に対する
このような修正物および改変物は、今後添付される請求
の範囲内に含まれるものとみなされる。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願者:SmithKline Beecham、Biologicals、
s.a. Government of USA、Dept.Health
＆ Human Services Funkhouser、Ann W. Emerson、Suzanne U. Purcell、Robert H. D'Hondt、Eric （ii）発明の名称:A型肝炎ウイルスワクチン （iii）配列数:2 （iv）連絡先： （Ａ）住所:Howson and Howson （Ｂ）街路名:PO Box 457 Spring House Corp
orate Cntr （Ｃ）市:Spring House （Ｄ）州:Pennsylvania （Ｅ）国:USA （Ｆ）ZIP:19477 （ｖ）コンピューター解読可能形態： （Ａ）メディウムの種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエアー:PatentIn Release ＃1.
0、Version ＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号:PCT/US93/08610 （Ｂ）提出日:1993年９月17日 （Ｃ）分類： （vii）これまでの出願データ （Ａ）出願番号:US 07/947,338 （Ｂ）提出日:1992年９月18日 （viii）弁理士／代理店の情報： （Ａ）氏名:Bak、Mary E. （Ｂ）登録番号:31,215 （Ｃ）参照／審査番号:SBCP50110 （ix）電気通信情報： （Ａ）電話:215−540−9206 （Ｂ）テレファックス:215−540−5818 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:7493 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未決定 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:735..7415 （xi）配列 （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:2227 （Ｂ）配列の種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列
s.a. Government of USA、Dept.Health
＆ Human Services Funkhouser、Ann W. Emerson、Suzanne U. Purcell、Robert H. D'Hondt、Eric （ii）発明の名称:A型肝炎ウイルスワクチン （iii）配列数:2 （iv）連絡先： （Ａ）住所:Howson and Howson （Ｂ）街路名:PO Box 457 Spring House Corp
orate Cntr （Ｃ）市:Spring House （Ｄ）州:Pennsylvania （Ｅ）国:USA （Ｆ）ZIP:19477 （ｖ）コンピューター解読可能形態： （Ａ）メディウムの種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエアー:PatentIn Release ＃1.
0、Version ＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号:PCT/US93/08610 （Ｂ）提出日:1993年９月17日 （Ｃ）分類： （vii）これまでの出願データ （Ａ）出願番号:US 07/947,338 （Ｂ）提出日:1992年９月18日 （viii）弁理士／代理店の情報： （Ａ）氏名:Bak、Mary E. （Ｂ）登録番号:31,215 （Ｃ）参照／審査番号:SBCP50110 （ix）電気通信情報： （Ａ）電話:215−540−9206 （Ｂ）テレファックス:215−540−5818 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:7493 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未決定 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:735..7415 （xi）配列 （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:2227 （Ｂ）配列の種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
// Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｒ 1:91
(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 フアンクハウザー，アン・ダブリユー
アメリカ合衆国メリーランド州21043エ
リコツトシテイ・メアリージヨーズウエ
イ722
(72)発明者 エマーソン，スザンヌ・ユー
アメリカ合衆国メリーランド州20853ロ
ツクビル・ウツドクレストドライブ
14201
(72)発明者 パーセル，ロバート・エイチ
アメリカ合衆国メリーランド州20841ボ
イズ・ホワイトグラウンズロード17517
(72)発明者 ドント，エリク
ベルギー・ビー―3052オツテンブルク・
スコールストラート25
(56)参考文献 特表 平６−500238（ＪＰ，Ａ)
米国特許4894228（ＵＳ，Ａ)
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，1987年，Ｖｏｌ．84，Ｎ
ｏ．８，ｐ．2497−2501
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 7/08
C12N 15/09
C12P 21/02
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】配列番号１のDNAを有するＡ型肝炎ウイル
スHM−175株の突然変異体であって、該配列における少
なくとも位置、591および687のヌクレオチドがグアニン
に変化しており、646のヌクレオチドがアデニンに変化
しており、そして669のヌクレオチドがチミンに変化し
ていることを特徴とする突然変異体。 - 【請求項２】さらなる位置4418および4643のヌクレオチ
ドがチミンに変化している請求項１に記載の突然変異
体。 - 【請求項３】少なくとも位置、3934および5145のヌクレ
オチドがグアニンに変化しており、5745のヌクレオチド
がチミンに変化しており、そして6908のヌクレオチドが
シトシンに変化している請求項１または２に記載の突然
変異体。 - 【請求項４】CNCMに寄託番号Ｉ−936で寄託されているH
AV 4380株と同一とみなせる特徴を有する請求項１〜３
のいずれかに記載の突然変異体。 - 【請求項５】32℃〜35℃でインキュベートすることによ
りヒト繊維芽細胞株MRC−５において増殖するように適
応されており、そして37℃で初代アフリカグリーンモン
キーの腎臓細胞（AGMK細胞）において増殖できる、請求
項４に記載のHAV 4380株。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の突然変異
体を含んでなるＡ型肝炎ウイルスワクチン。 - 【請求項７】配列番号１のDNAを有するＡ型肝炎ウイル
スHM−175株の突然変異体の作製方法であって、該配列
における少なくとも位置、591および687のヌクレオチド
がグアニンに変化し、646のヌクレオチドがアデニンに
変化し、そして669のヌクレオチドがチミンに変化する
ように該HM−175株を改変することを特徴とする方法。 - 【請求項８】さらなる位置4418および4643のヌクレオチ
ドがチミンに変化する請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】少なくとも位置、3934および5145のヌクレ
オチドがグアニンに変化し、5745のヌクレオチドがチミ
ンに変化し、そして6908のヌクレオチドがシトシンに変
化する請求項７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】Ａ型肝炎に対するヒトまたは霊長類の免
疫感作用ワクチンを調製するための、請求項１〜５のい
ずれかに記載の突然変異体の使用方法。 - 【請求項１１】請求項１〜５のいずれかに記載の突然変
異体をコードする核酸分子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94733892A | 1992-09-18 | 1992-09-18 | |
| US07/947,338 | 1992-09-18 | ||
| PCT/US1993/008610 WO1994006446A1 (en) | 1992-09-18 | 1993-09-17 | Hepatitis a virus vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08504094A JPH08504094A (ja) | 1996-05-07 |
| JP3523646B2 true JP3523646B2 (ja) | 2004-04-26 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50822594A Expired - Fee Related JP3523646B2 (ja) | 1992-09-18 | 1993-09-17 | Ａ型肝炎ワクチン |
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| EP (1) | EP0666751B1 (ja) |
| JP (1) | JP3523646B2 (ja) |
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| AU (1) | AU687012B2 (ja) |
| CA (1) | CA2144317C (ja) |
| DE (1) | DE69330758T2 (ja) |
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| ES (1) | ES2164074T3 (ja) |
| HK (1) | HK1013667A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ256278A (ja) |
| PT (1) | PT666751E (ja) |
| SG (1) | SG73999A1 (ja) |
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| WO1992019268A1 (en) | 1991-05-08 | 1992-11-12 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | New hepatitis a virus strain, method for the isolation of new hepatitis a virus strains and hepatitis a vaccines |
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