PT666751E

PT666751E - Mutantes da estirpe hm-175 do virus da hepatite a para utilizacao como vacinas da hepatite a

Info

Publication number: PT666751E
Application number: PT93921524T
Authority: PT
Inventors: Robert H Purcell; Suzanne U Emerson; Ann W Funkhouser; Eric D Hondt
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog; Us Health
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 2002-01-30
Also published as: DK0666751T3; US6423318B1; ES2164074T3; SG73999A1; AU687012B2; WO1994006446A1; NZ256278A; DE69330758T2; EP0666751A4; US6113912A; US6180110B1; JPH08504094A; AU4858593A; EP0666751B1; CA2144317A1; US6680060B2; CA2144317C; DE69330758D1; EP0666751A1; JP3523646B2

Description

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ΕΡ 0 666 751 /PT DESCRICÃO "Mutantes da estirpe HM-175 do vírus da hepatite A para utilização como vacinas da hepatite A" A presente invenção foi realizada com apoio governamental ao abrigo de certos acordos Collaboratíve Research e Deve/opment Agreements concedidos pelo Department of Health and Human Services. O governo tem certos direitos na presente invenção.

Campo da invenção A presente invenção refere-se genericamente ao campo de composições de vacina úteis na profilaxia de hepatite A. Mais especificamente, a invenção proporciona um novo vírus vivo de hepatite A (HAV), e HAV recombinantes e quiméricos, cujos genomas são modificados a partir do genoma da sua estirpe progenitora HM-175 para os proporcionar com a capacidade de se propagarem em células MRC-5 e reterem a atenuação apropriada para utilização como vacinas vivas em humanos e outros primatas.

Antecedentes da Invenção

Nos Estados Unidos, o vírus da hepatite A é a causa de aproximadamente 25% de todos os casos clínicos de hepatite, montando a aproximadamente 1 50 000 destes casos. As populações com alto risco de contrair hepatite A nos países industrializados incluem as socialmente desfavorecidas, pessoal médico, pessoal militar, empregados e adultos em contacto com crianças em centros de dia, homossexuais masculinos, viciados em drogas, e viajantes a áreas endémicas.

Nos países em desenvolvimento, virtualmente toda a população é infectada com o vírus da hepatite A numa idade precoce. Muitas destas infecções resultam em infecção subclínica e não aparente, mas, à medida que os países melhoram as suas condições de higiene, a infecção com o vírus da hepatite A ocorre em idades progressivamente mais avançadas, resultando numa maior proporção da doença clínica. Assim, existe um aumento paradoxal da hepatite A clínica à medida que a taxa de infecção global diminui. Para uma imunização bem sucedida contra a hepatite A nos Estados Unidos e em outros países industrializados bem como em países em desenvolvimento, será

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ΕΡ 0 666 751 /PT 2 necessário vacinar toda a população pediátrica. Haverá uma necessidade crescente de vacinas contra a hepatite A vacinas nestes países no futuro próximo. A pesquisa relativa a vacinas de HAV focou-se em vírus inactivados, ou mortos. Contudo, na terapia de vacinas existem várias vantagens numa vacina viva, em vez de uma vacina inactivada. Com uma vacina viva, pode-se utilizar uma dosagem menor e menor número de doses, porque uma vacina viva replica nos vacinados para produzir mais antigénio e pode estimular o sistema imunitário do vacinado para gerar tanto IgA como IgM. As vacinas inactivadas, tais como a vacina polio Salk, que estimula a produção apenas de IgG em vacinados, não protege contra a infecção por vírus ingeridos, apenas contra a doença.

Um dos principais obstáculos ao desenvolvimento de uma vacina viva atenuada tem sido a dificuldade de adaptar o HAV a uma linha celular que suporte o rápido crescimento virai e esteja licenciada para a produção de vacinas. O vírus da hepatite A do tipo selvagem (HAV) cresce fracamente em cultura celular.

As patentes U.S. 4 532 215 e 4 636 469 descrevem, respectivamente, uma estirpe de HAV designada HM-175 inicialmente isolada de fezes humanas de um paciente em Melbourne, Austrália, e adaptada a passagem in vitro em culturas de células de rim de macaco verde africano (AGMK) e métodos para a obtenção das mesmas por passagens em série. A patente U.S. 4 620 978 descreve uma vacina que emprega o HAV HM-175, triplamente clonado em cultura de células AGMK e atenuado. A patente U.S. 4 894 228 descreve HM-175 de passagem 35, que difere do HM-175 do tipo selvagem por alterações nucleotídicas no genoma, é atenuado para chimpanzés, elicia anticorpos neutralizantes no soro, e é adequado para utilização como uma vacina de HAV atenuada. Revela a sequência nucleotídica completa do HAV, estirpe HM-175/7. Veja-se também B.C. Ross et a/, J. Gen. Viro!., 70:2805-2810 (1989); R.W. Jansen et al, Viro!., 163:299-307 (1988); e Tedeschi et al, J. Med. ViroL, (no prelo). As descrições destas patentes e artigos são aqui incorporadas como referência. 3 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT Ν. Fineschi et al, J. HepatoL, T3(4):S146-S151 (1991) descrevem um isolado de HAV, LSH/S, que é um candidato a uma vacina inactivada. Foi adaptado para crescer em células MRC-b diplóides humanas, uma célula licenciada preferida para o desenvolvimento de vacinas. Este documento compara apenas um pequena parte da sua sequência nucleotídica com a do HM-175 do tipo selvagem.

Provost et al, J. Med. Virol., 20:165-175 (1986) descrevem as variantes F e F' da estirpe CR326 do vírus da hepatite A. Embora tenha sido reportada como sendo imunogénica em voluntários vacinados, a variante F causou também níveis de ALT no soro anormais numa proporção substancial dos indivíduos.

Outra publicação recente deste grupo de investigadores descreveu um trabalho adicional com a variante F' [K. Midthun et al, J. Infect. Dis., 163:735-739 (1991)]. Observaram que a imunogenicidade do produto de vacina F’ depende da dose, i.e., uma TCID50 de 107,3 evocou uma resposta de anticorpos em 100% dos voluntários em 9 semanas após imunização enquanto doses inferiores foram imunogénicas numa menor percentagem de voluntários, e observou-se anti-HAV 4 a 6 meses após a imunização. Investigadores chineses descreveram recentemente estudos de uma potencial vacina viva atenuada contra a hepatite A preparada a partir da estirpe H2 de HAV [J.S. Mao et al, J. Infect. Dis., 1 59:621-624 (1989)]. Doze voluntários receberam a vacina por via subcutânea.

Uma vacina viva atenuada contra a hepatite A vacina teria um impacto significativo na erradicação da doença. Pode-se prever que uma vacina viva atenuada que requeira uma purificação mínima e não requeira adjuvantes seria menos onerosa do que as vacinas inactivadas contra a hepatite A correntemente disponíveis.

Existe uma necessidade na arte de métodos e composições para a vacinação eficaz de humanos e animais contra a hepatite A.

Sumário da Invenção

Num aspecto, a presente invenção proporciona um vírus vivo de hepatite A adaptado para crescer em células MRC-5. Este vírus é preferivelmente 4 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT caracterizado por atenuação. O vírus atenuado pode ser recombínante ou quimérico. Mais preferivelmente, o HAV é caracterizado por atenuação adequada para a administração eficaz da vacina a primatas, preferivelmente humanos, sem inactivação. O HAV pode ser caracterizado por conter pelo menos quatro de catorze nucleótidos específicos que diferem dos nucleótidos na mesma posição no genoma do HAV HM175, Passagem 35 [SEQ ID NO:1], em que pelo menos as posições de nucleótidos 591 e 687 estão alteradas para guanina, a 646 está alterada para adenina e a 669 está alterada para timina.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma vacina útil para proteger humanos ou outros primatas contra a hepatite A, vacina esta que contém pelo menos um dos HAV atrás descritos adaptado para crescer em células MRC-5. Preferivelmente, a vacina é eficaz para induzir uma resposta protectora de anticorpos sem adjuvantes.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para a protecção de humanos contra a infecção pelo vírus da hepatite A que compreende a administração ao paciente humano de uma quantidade eficaz de uma composição de vacina da presente invenção.

Num aspecto adicional, a invenção proporciona um método para a preparação de um HAV vivo adaptado para crescer em células MRC-5 incorporando numa área seleccionada do genoma de um HAV pelo menos quatro de catorze nucleótidos específicos, em que pelo menos as posições de nucleótidos 591 e 687 estão alteradas para guanina, a 646 está alterada para adenina e a 669 está alterada para timina. O genoma de HAV assim modificado é HAV HM-175, Passagem 35.

Noutra concretização, o HAV pode ser construído utilizando outro clone de ADNc de HAV e inserindo os nucleótidos apropriados no seu genoma. De acordo com este método, proporciona-se um HAV atenuado, adaptado para MRC-5 sem necessidade de mais passagens em MRC-5 ou outras linhas celulares de primata.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona sequências polinucleotídicas codificando os HAV recombinantes ou quiméricos atrás 5 87103 ΕΡ 0 666 751 /PT descritos. Preferivelmente estas sequências são ADNc úteis como sementes principais para a preparação de vacinas.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção estão descritos na seguinte descrição detalhada das suas concretizações preferidas.

Breve descricãn dos desenhos

A Fig. 1 é um gráfico que representa a produção de anticorpos anti-HAV vs. Tempo (semanas) vs. níveis de ALT e ICD para estudos com chimpanzés com o Vírus 4380 e subsequente desafio com HAV do tipo selvagem, como descrito no Exemplo 1. Estes resultados foram obtidos de um chimpanzé que foi infectado com o HAV atenuado no tempo 0 e desafiado com vírus virulento na semana 28. A Fig. 2 é um gráfico que representa a produção de anticorpos anti-HAV vs. tempo (semanas) vs. níveis de ALT e ICD para estudos com chimpanzés com Vírus 4380 e subsequente desafio com HAV do tipo selvagem, como descrito no Exemplo 1. As condições foram as mesmas que para a Fig. 1. A Fig. 3 é um gráfico que representa a produção de anticorpos anti-HAV vs. tempo (semanas) vs. níveis de ALT e ICD para estudos com chimpanzés com Vírus 4380 e subsequente desafio com HAV do tipo selvagem, como descrito no Exemplo 1. As condições foram as mesmas que para a Fig. 1. A Fig. 4 é um gráfico que representa a produção de anticorpos anti-HAV vs. tempo (semanas) vs. níveis de ALT e ICD para estudos com chimpanzés com Vírus 4380 e subsequente desafio com HAV do tipo selvagem, como descrito no Exemplo 1. Estes resultados foram obtidos a partir do chimpanzé que não foi infectado com o HAV atenuado, e portanto desenvolveu hepatite após o desafio com o vírus virulento. As condições foram as mesmas que para a Fig. 1. A Fig. 5 é um gráfico de barras das diluições no ponto final de vários dos vírus quiméricos, Vírus #2, 3, 4, 5, e 6, listados na Tabela VI. 6 87103 ΕΡ 0 666 751 /ΡΤ

Descrição detalhada da invenção A presente invenção proporciona vírus da hepatite A (HAV) adaptado para crescer na linha celular humana semelhante a fibroblastos, MRC-5, um substrato celular adequado para a produção comercial e licenciamento de vacinas contra a hepatite A vivas atenuadas e inactivadas. Em adição a estes HAV adaptados, a invenção proporciona um método para a adaptação de um HAV selencionado para crescer nessa linha celular humana e preparação de um HAV atenuado, adaptado para MRC-5, sem passagens em outras células de primata. 0 HAV da presente invenção e o método de preparação proporcionam também preferivelmente o HAV com suficiente atenuação para permitir a sua eficácia como uma vacina para humanos e animais.

Embora a arte anterior revele outras estirpes de vacina candidatas do vírus da hepatite A que foram adaptadas para crescer em fibroblastos diplóides humanos, as alterações genéticas no genoma do vírus necessárias e suficientes para esta adaptação não foram caracterizadas. Assim, estas estirpes não podem ser manipuladas in vitro para assegurar um produto de vacina reprodutível e completamente caracterizado. A presente invenção baseia-se no HAV do tipo selvagem, estirpe HM-175, que está descrito em detalhe na arte atrás citada e aqui incorporada [Cohen et al., J. Viro!., 61:50-59 (1987); SEQ ID N0:1 e 2]. Descrito resumidamente, o vírus HAV HM-175 ínfeccioso do tipo selvagem foi previamente adaptado para crescer em células de rim de macaco verde africano (AGMK) a 37°C. Após 26 passagens em AGMK, o vírus foi clonado três vezes em células AGMK por diluição em série, depois foi passado mais três vezes para proporcionar a passagem 32 (P-32). Verificou-se que P-32 estava atenuado como descrito em R.A. Karron et al, J. Infec. Dis., 157:338-345 (1988). 0 vírus P-32 descrito atrás foi passado mais três vezes em AGMK, e molecularmente clonado. 0 vírus que foi clonado foi denominado P-35 e o clone de comprimento completo foi referido como pHAV/7. O pHAV/7 é um clone de ADNc ínfeccioso do vírus que pode ser mantido num estado monoclonal e amplificado à vontade com risco diminuído de mutações èspontâneas. O vírus P-35 resultante cresceu bem em células de rim de macaco Rhesus fetal (FRhK) e minimamente em células de pulmão fibroblastóides humanas (MRC-5). 7 «7103

ΕΡ 0 666 751 /PT A patente U.S. 4 894 228 e Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:2497-2501 (1987) proporcionam as sequências nucleotídicas do HAV do tipo selvagem, estirpe HM-175 (veja-se, Fig. 1 da patente; SEQ ID NO:1 e 2) e as diferenças nucleotídicas entre o clone pHAV/7 de HAV HM-175, Passagem 35, e a sequência do tipo selvagem [SEQ ID NO:1]. Assim, estes documentos, aqui incorporados como referência, proporcionam a sequência de pHAV/7, P-35 [SEQ ID NO:1 e 2]. Os números de nucleótidos aqui utilizados aos quais correspondem as mutações da presente invenção (Tabelas I e VI adiante) são dos números de nucleótidos atribuídos às posições da sequência do tipo selvagem da Fig. 1 [SEQ ID NO:1 e 2] da patente U.S. 4 894 228 contendo as mutações para P-35. Note-se que aos nucleótidos delecionados em P-35 são atribuídas a posição de nucleótido da sequência do tipo selvagem [SEQIDNO:1]. Assim, por exemplo, a posição de nucleótido 131 representa um nucleótido que foi delecionado entre o tipo selvagem e P-35. O ADNc de P-35, i.e., HAV/HM-175/7, está depositado na American Type Culture Coiiection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland com o número de acesso 67495, depositado em 7 de Agosto, 1987. Um perito na arte pode prontamente construir as sequências nucleotídica e de aminoácidos de P-35 utilizando a arte anterior citada.

Posteriormente, o vírus P-32 adaptado a células AGMK e atenuado foi adicionalmente manipulado para permitir que este se adaptasse a crescer em células MRC-5, de modo a ficar disponível para a produção de vacinas em larga escala. A Passagem 32 foi duplamente clonada em placas fágicas em MRC-5 para formar a Passagem 37. A Passagem 37 foi passada uma vez em MRC-5 de um clone seleccionado, 25-4-21. A Passagem 38 resultante foi passada três vezes em células MRC-5, resultando a Passagem 41, a semente principal, designada 87J19. Esta reserva de vírus semente principal foi também denominada o vírus 4380, e é referida em toda a descrição por este último nome. O vírus vivo atenuado HAV 4380, foi depositado em 4 de Abril, 1990 na Coiiection Nationale de Cu/tures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724, Paris CEDEX 15 com o N°. de acesso I-936. Este depósito foi realizado nos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos e não foi publicamente divulgado. 0 HAV 4380 é uma estirpe adaptada a cultura de 8 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT células e atenuada do vírus da hepatite A, estirpe HM-175, adaptada para crescer numa linha celular de fibroblastos humanos (MRC-5) adequada para o desenvolvimento de vacinas por incubação a uma temperatura reduzida de 32-35°C. O crescimento do vírus é determinado por detecção de antigénio virai num ensaio serológico. O vírus adaptado é purificado por purificação de placas fágicas utilizando um método aceite (ensaio de radioimunofocagem).

Após um total de nove passagens em células MRC-5 a temperatura reduzida, o vírus resultante foi caracterizado pelas suas características biológicas em cultura celular e em duas espécies de primatas que são consideradas como sendo sub-rogadas em relação ao homem, i.e., saguins e chimpanzés. Veja-se, e.g., o Exemplo 1 adiante. Verificou-se que o vírus HAV 4380 é sensível à temperatura {i.e., apenas cresceu a temperaturas reduzidas) em células MRC-5 mas foi ainda capaz de crescer a 37°C em células primárias de rim de macaco verde africano. O vírus estava adicionalmente atenuado em virulência, em comparação com o vírus progenitor, HM-175, P-32, quando testado em chimpanzés e macacos saguim, espécies em que o vírus replicou fracamente ou não replicou mesmo. Esta reduzida capacidade de replicação em primatas foi adicionalmente confirmada em voluntários humanos, como descrito no Exemplo 2.

Preparou-se uma vacina inactivada candidata contra a hepatite A a partir do HAV 4380 e demonstrou-se que era segura (i.e., não produzia hepatite ou outros efeitos adversos graves) e imunogénica em humanos. Verificou-se também que induzia produção de anticorpos sem adjuvantes. O HAV 4380, como existe correntemente, cresce bem num substrato celular adequado para a produção comercial de vacinas. Também não infecta seres humanos quando administrada por via oral ou intravenosa em doses até 107 doses infecciosas para cultura de tecidos, mesmo quando não inactivado. O HAV 4380 é adequado para utilização como uma vacina viva de HAV em humanos. Contudo, tal como indicado no Exemplo 2, crê-se que a vacina de 4380 é algo sobre-atenuada, porque não ó infeccioGo, característica que reduz a sua eficiência quando utilizada como uma vacina atenuada.

Para produzir outros candidatos a vacina que são maximizados para níveis desejados de atenuação e bom crescimento em células MRC-5, os inventores identificaram alterações genéticas que ocorriam no genoma do vírus HAV 4380

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ΕΡ 0 666 751 /PT 9 adaptado para MRC-5 que alteravam as suas características de crescimento e o tornavam mais adequado para a produção de vacinas do que o vírus HM-175, Passagem 35, relacionado, adaptado para AGMK. A identificação das seguintes mutações nas sequências nucleotídicas em 4380, em comparação com HM-175, Passagem 35 [Cohen et ai, atrás citado; e patente U.S. 4 894 228, Fig. 1; SEQ ID NO:1 e 2], permite a manipulação do genoma de HAV por técnicas de engenharia genética.

Assim, o conhecimento das diferenças genómicas entre as passagens de HM-175 adaptado para AGMK e o 4380 mais atenuado, permite a construção de vírus quimérico possuindo as características de crescimento melhoradas, i.e., crescimento rápido e eficiente em cultura de células MRC-5, mas com um nível de atenuação de virulência para espécies de primatas, incluindo o homem, que permitirá que o vírus replique eficientemente sem produzir hepatite ou outros efeitos inconvenientes. A presente invenção permite o desenho de um HAV quimérico que pode alcançar as características óptimas para um candidato a vacina viva atenuada contra a hepatite A. Um tal vírus permitirá também o desenho de candidatos preferidos a vacinas inactivadas, se desejado. A presente invenção identifica as mutações que se crê terem ocorrido durante a adaptação ao crescimento do HAV, Passagem 32, estirpe HM-175, em células MRC-5. Uma combinação destas mutações é responsável pela adaptação às células MRC-5 e à sobre-atenuação no HAV 4380. A sequência nucleotídica do vírus HAV 4380 adaptado para células MRC-5 foi comparada com a do vírus HM-175, passagem 35, clone 7, adaptado para AGMK. Determinaram-se as sequências nucleotídicas de consenso directamente de produtos de reacção em cadeia com polimerase.

Os inventores verificaram que existem pelo menos catorze diferenças de um único nucleótido entre a passagem 35 do vírus HM-175/7 [SEQ ID NO:1] e o vírus 4380 adaptado para MRC-5, mutações das quais pelo menos doze ocorreram aparentemente durante o período de adaptação da Passagem 32 do vírus da hepatite A (HAV), estirpe HM-175 [SEQ ID NO: 1 ], ao crescimento em células MRC-5. A Tabela I apresenta estas doze mutações por diferenças de nucleótidos e as resultantes diferenças de aminoácidos (AA) diferenças, se algumas, adquiridas pelo vírus HAV 4380 adaptado para MRC-5. As outras duas mutações parecem ser mutações inversas para a sequência do tipo selvagem, ou mais provavelmente, representam mutações que ocorreram entre as passagens 32 e 35 em células AGMK, e que portanto representam diferenças entre o vírus P-32 biologicamente caracterizado e o vírus P-35

87103 ΕΡ 0 666 751 /ΡΤ 10 molecularmente clonado. Note-se que a sequência parcial de LSH/S de HAV de Flneschi et a/, acima citado, se sobrepõe apenas na mutação observada na posição 5145.

Na Tabela, A representa adenina, G representa guanina, C representa citosina, e U representa uridina ou timina; Leu representa leucina, Phe representa fenilalanina, Ele representa isoleucina, Vai representa valina e Ser representa serina.

Tabela I

Alterações de nucleótidos que ocorrem durante a adaptação de HM-175 em células MRC-5: Comparação com a sequência de HM-175/7 (P-35)

Alteração de Nucleótido Região do Genoma Alteração de AA 591 A para G 5' nc NA 646 G para A 5' nc NA 669 C para U 5' nc NA 687 U para G 5' nc NA 2864 U para A VP1 Sem alteração 3934 A para G 2B Sem alteração 4418 A para U 2C Leu para Phe 4643 A para U 2C Sem alteração 5145 A para G 3A lie para Vai 5745 A para U 3C Thr para Ser 6216 U para C 3D Sem alteração 6908 U para C 3D Sem alteração

Desenham-se novos candidatos a vacina de HAV introduzindo pelo menos quatro destes nucleótidos num HAV numa posição de nucleótido homóloga à posição de nucleótido na sequência genómica do vírus HM-175, Passagem 35 [SEQIDNO:1] adaptado para AGMK, em que pelo menos as posições de nucleótido 591 e 687 estão alteradas para guanina, a 646 está alterada para adenina e a 669 está alterada para timina. Estes nucleótidos identificados na Tabela I podem ser introduzidos em posições de nucleótido análogas e/ou homólogas às de P-35 nas sequências genómicas de outras estirpes e variantes de HAV para produzir um HAV recombinante ou quimérico da presente 11 87103 ΕΡ 0 666 751 /PT invenção. Com a frase "posição de nucleótido análoga ou homóloga" pretende-se designar um nucleótido num HAV que não o HAV HM-175, Passagem 35 [SEQ ID N0:1] que está presente na mesma região virai, e.g., 2C, 3D e semelhantes, numa posição na região similar à do nucleótido da Tabela I. Por outras palavras, a posição de nucleótido pode diferir no número de posição devido a deteções em outras regiões do vírus; mas um perito na arte pode prontamente determinar a sua semelhança funcional à posição de nucleótido em HM-175, Passagem 35 [SEQ ID NO:1].

Embora estas posições de nucleótidos possam não ter os números de posição de nucleótido idênticos correspondentes ao HM-175 do tipo selvagem [SEQIDNO:1], prevê-se que estas posições análogas e/ou homólogas podem ser prontamente identificadas para permitir que HAV que não derivados da estirpe HM-175 sejam modificados para criar novos HAV de acordo com a presente invenção.

De modo semelhante, os inventores são capazes de manipular o genoma de um progenitor ou intermediário de HAV 4380 recorrendo a este conhecimento e podem assim 'inverter' certas mutações em 4380 para criar novos vírus HAV quiméricos. Um ou mais destes nucleótidos, ou várias suas combinações, podem ser incorporados, por formação de quimeras ou mutagénese dirigida por oligonucleótidos, numa estirpe de HAV, mais prontamente o clone de ADNc de HAV/HM-175/7, para produzir novos vírus viáveis que adquiriram a capacidade de crescer em células MRC-5. Outros derivados de HAV HM-175 estão disponíveis de American Type Culture Collection com os números de acesso na ATCC, VR 2089, VR 2090, VR 2091, VR 2092, VR 2093, VR 2097, VR 2098, e VR 2099. Estes e outros HAV podem ser empregues para obter derivados desejados de HAV da presente invenção. Uma vez que há indicações de que o vírus 4380 adaptado para MRC-5 pode ser sobre-atenuado para humanos, é importante ser capaz de remover ou introduzir mutações seleccionadas em HM-175. A construção de nove vírus quiméricos exemplificativos contendo urna ou mais desLas mutações está descrita em detalhe no Exemplo 3 adiante.

As técnicas mutagénicas e de engenharia genética empregues para construir os HAV quiméricos ou recombinantes que incorporam uma ou mais destas mutações são os convencionais e conhecidos dos peritos na arte 12 87103 ΕΡ 0 666 751 /PT [veja-se, por exemplo, Sambrook et aL, Molecular Clowning. A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)). Outras técnicas convencionais, incluindo as reacções em cadeia com polimerase e técnicas de síntese química, podem também ser utilizadas para desenhar HAV de acordo com a presente invenção. De modo semelhante, prevê-se que possam ser realizadas mutações homólogas utilizando outras passagens com HM-175.

Os vírus quiméricos e recombinantes da presente invenção podem ser desenhados por aplicação de técnicas semelhantes e selecção de uma ou mais diferentes combinações dos nucleótidos (mutações) que aparecem nas Tabelas I e VI. Por exemplo, os dados das análises de crescimento dos vírus quiméricos do Exemplo 3 demonstram que as quatro mutações específicas de MRC-5 na região não codificante a 5' (mutações nas posições de nucleótido 591, 646, 669, e 687 de HM-175/7) e uma ou ambas as mutações específicas de MRC-5 na região 2C (mutações nas posições de nucleótido 4418 e 4643 de HM-175/7) são desejáveis para o crescimento óptimo do vírus em células MRC-5. Podem também estar envolvidas outras mutações. Os HAV quiméricos específicos exemplificativos da presente invenção são caracterizados pelas mutações no genoma de HAV HM-175/7 que aparecem em vírus designados #2 a #10 na Tabela VI do Exemplo 3 adiante.

Os HAV da presente invenção podem ser caracterizados pela presença de pelo menos quatro destes nucleótidos das Tabelas I ou VI em posições genómicas análogas dos derivados de HAV HM 175, caracterizados por pelo menos as posições de nucleótido 591 e 687 estarem alteradas para guanina, a 646 estar alterada para adenina e a 669 estar alterada para timina.

Prevê-se ainda que possam aparecer mutações adicionais em algumas regiões do HAV que têm ainda que ser sequenciadas. As mutações que aparecem na Tabela I podem ser incorporadas em qualquer combinação, e/ou com outras mutações ainda a identificar, para construir vários HAV quiméricos ou recombinantes com características desejadas para utilização como vacinas vivas de HAV.

Quimeras e vírus recombinantes adicionais construídos por mutagénese dirigida por oligonucleótidos podem ser desenhados e avaliados quanto à 07103

ΕΡ 0 666 751 /PT 13 determinação dos efeitos individuais das mutações e suas combinações sobre o crescimento virai em células MRC-5 e na adaptação ao crescimento em culturas celulares seleccionadas. O fenótipo de atenuação destes vírus quiméricos pode ser avaliado em saguins ou chimpanzés por técnicas tais como as descritas adiante no Exemplo 1 para HAV 4380.

São também proporcionadas pela presente invenção as sequências polinucleotídicas que codificam os HAV da presente invenção. Estas sequências polinucleotídicas são preferivelmente sequências de ADNc, que podem formar uma semente principal para a vacina de HAV. Uma sequência de ADNc da presente invenção compreende uma sequência de ADN que codifica um genoma de um HAV seleccionado caracterizada pela presença de um ou mais dos nucleótidos identificados como as doze mutações na Tabela I em qualquer combinação desejada que infira as características desejadas ao novo HAV. Estes ADNc podem ser obtidos por técnicas convencionais conhecidas dos peritos na arte. Veja-se, e.g., Sambrook et al, atrás citado, e a patente U.S. 4 894 228.

Assim, a presente invenção proporciona uma composição de vacina viva útil na protecção contra infecção por HAV e um método profiláctico que acarreta a administração a um primata, preferivelmente um humano, de uma quantidade eficaz de uma tal composição. Esta composição de vacina pode conter um ou mais dos HAV da invenção, incluindo o HAV 4380, bem como os HAV quiméricos e recombinantes aqui descritos. A composição de vacina pode também conter misturas de dois ou mais dos HAV, se desejado.

Uma composição de vacina pode ser formulada para conter um transportador ou diluente e um ou mais dos HAV da invenção. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados facilitam a administração dos vírus mas são fisiologicamente inertes e/ou não prejudiciais. Os transportadores podem ser seleccionados por um perito na arte. Os Transportadores exemplificativos incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrina, ágar, pectina, óleo de amendoim, azeite, óleo de sésamo e água. Adicionalmente, o transportador ou diluente pode incluir um material retardador no tempo, tal como monoestearato de glicerol ou diestearato de glicerol, sozinhos ou com uma cera. Em adição, podem-se utilizar formulações de polímeros de libertação lenta. 14 87103

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Opcionalmente, a composição de vacina pode ainda conter conservantes, estabilizantes químicos, outras proteínas antígénicas, e ingredientes farmacêuticos convencionais. Os ingredientes adequados que podem ser utilizados numa composição de vacina em conjunto com o vírus incluem, por exemplo, casaminoácidos, sacarose, gelatina, vermelho de fenol, N-Z amina, difosfato monopotássico, lactose, hidrolisado de lactalbumina, e leite seco. Tipicamente, os estabilizantes, adjuvantes, e conservantes, são optimizados para determinar a melhor formulação quanto a eficácia no alvo humano ou animal. Os conservantes adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, gaiato de propilo, os parabenos, etilvanilina, glicerina, fenol, para-clorofenol. A composição de vacina da presente invenção é mais preferivelmente produzida sem um adjuvante. Contudo, quando necessário, um ou mais dos componentes de vacina atrás descritos podem ser misturados ou adsorvidos com um adjuvante convencional. O adjuvante é utilizado como um irritante não específico para atrair os leucócitos ou melhorar uma resposta imunitária. Estes adjuvantes incluem, entre outros, óleo mineral e água, hidróxido de alumínio, Amphigen, Avridine, L121/esqualeno, D-lactido-polilactido/glicósido, pliois plurónicos, dipéptido de muramilo, Bordetella morta, saponinas, e Quil A.

Alternativamente, ou em adição ao HAV da invenção, espera-se que outros agentes úteis no tratamento de infecção por HAV, e.g., agentes imunoestimulantes, sejam úteis na redução e na eliminação de sintomas da doenças. O desenvolvimento de composições de vacina ou terapêuticas contendo estes agentes está dentro das atribuições de um perito na arte tendo em conta os ensinamentos da presente invenção.

De acordo com o método da invenção, um humano ou um animal podem ser vacinados contra infecção por HAV através da administração de uma quantidade eficaz de uma composição de vacina atrás descrita. Uma quantidade eficaz é definida como a quantidade de vacina de HAV capaz de induzir protecção no vacinado contra a infecção por HAV e/ou contra hepatite. A vacina pode ser administrada através de qualquer via adequada. Uma tal composição pode ser administrada parentericamente, preferivelmente intramuscularmente ou subcutaneamente. Contudo, pode também ser formulada para ser administrada por qualquer via adequada, incluindo oralmente.

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As quantidades eficazes adequadas dos HAV da presente invenção podem ser determinadas por um perito na arte com base no nível de resposta imunitária desejado. Uma tal composição pode ser administrada uma vez, e/ou pode também ser administrado um reforço. Contudo, podem ser feitos ajustamentos à dosagem adequada pelo médico ou veterinário assistente dependendo da idade, sexo, peso e saúde geral do paciente humano ou animal.

De modo semelhante, doses adequadas da composição de vacina da invenção podem ser prontamente determinadas por um perito na arte. A dosagem pode ser ajustada dependendo do paciente humano ou da espécie animal a tratar, i.e. do seu peso, idade e saúde geral.

Os exemplos que se seguem ilustram os métodos preferidos para obter os HAV da invenção e a sua utilização como composições de vacina. Estes exemplos não se pretendem limitantes do âmbito da invenção.

Exemplo 1: Teste de Vacina de HAV 4380 adaptada para MRC-5 em Saguins e Chimpanzés A atenuação de vírus da hepatite A (HAV), estirpe HM-175, por passagem em série em cultura de células foi previamente demonstrada. Após 32 passagens em células AGMK primárias, o vírus foi completamente atenuado para chimpanzés e quase completamente atenuado para saguins. Subsequentemente, de acordo com a presente invenção, o vírus foi adaptado para crescer em células MRC-5 e novamente clonado por purificação de placas fágicas. O HAV 4380 foi preparado a partir do lote 87JI9 de voluntários, passagem de nível 41 da estirpe HM-175 de HAV que foi derivada dos níveis de passagem previamente caracterizados do vírus que foram também preparados na forma de bancos de voluntários. Mostrou-se que dois destes bancos de passagens anteriores eram atenuados para chimpanzés e saguins. Contudo, nenhum deles foi administrado a voluntários porque se reconheceu que células primárias de rim de macaco verde africano, o substrato para esses bancos de voluntários, não estariam disponíveis em quantidades suficientes para produzir uma vacina economicamente viável. Portanto, o vírus foi adaptado para células MRC-5 e adicionalmente submetido a passagem para preparar o lote 87J19 de voluntários ou HAV 4380.

A finalidade desta experiência é testar o nível de atenuação deste vírus para saguins e chimpanzés, antes dos ensaios de fase I em voluntários. O lote87J19 foi testado quanto a segurança e imunogenicidade em quatro chimpanzés e quatro saguins Saguinus mystax. Dois saguins adicionais serviram como controlos não inoculados. Os chimpanzés utilizados neste estudo foram criados e crescidos em cativeiro; os saguins eram animais selvagens capturados. Administrou-se um inoculo de 104 TCID50 do vacina candidata do lote 87J19, intravenosamente, a cada animal. 0 inoculo residual foi congelado e subsequentemente reconfirmou-se o título em dois laboratórios diferentes.

De acordo com o protocolo experimental, os saguins identificados pelos números ID arbitrários 570, 572, 566 e 575 e os chimpanzés identificados pelos números ID arbitrários 1300, 1333, 1309 e 1313 receberam um inóculo de HAV 4380 do Clone 25-4-21, Lote 87 J 19575, 17/11/87 numa dose e via de administração de diluição de 10'3/1ml/I.V. Os saguins n°s. 541 e 578 receberam um diiuente numa dose e via de 1ml/I.V. A. Infecção: Três de quatro chimpanzés e um de quatro saguins, foram infectados, como determinado pelo desenvolvimento de anti-HAV detectável por um radioimunoensaio comercial (HAVAB, Abbott Laboratories, Chicago, IL). Os chimpanzés seroconverteram dez a onze semanas após a inoculação; a única seroconversão em saguim ocorreu oito semanas após a inoculação. Este saguim morreu subsequentemente na semana onze do estudo e outro saguim, não infectado, morreu subsequentemente na semana catorze, mas nehuma morte foi atribuível ao inóculo.

Os três chimpanzés que seroconverteram desenvolveram também IgM anti-HAV. Dois destes, os Chimp 1309 e Chimp 1313, desenvolveram IgM anti-HAV nas semanas dez e onze, respectivamente, quando testados por HAVAB-M Standard (Abbott Laboratories, Chicago, IL) a uma diluição final do soro de 1:4 000. Quando os soros foram testados a uma diluição de 1:40, o Chimp 1313 e o Chimp 1333 seroconverteram nas semanas nove e cinco, respectivamente. 0 teste HAVAB-M é um ensaio de captura que utiliza IgM anti-humana e não foi normalizado para utilização com soros de primatas menos estreitamente relacionados com o homem do que o chimpanzé. Por esta razão, os saguins não foram testados quanto a IgM anti-HAV. 17 87103 ΕΡ 0 666 751 /ΡΤ Β. Bioquímica: A evidência bioquímica de hepatite foi monitorizada através de determinações semanais da alanina-aminotransferase (ALT) e de desidrogenase isocítrica (ICD) séricas. A primeira constitui o meio indirecto mais fiável para o diagnóstico da hepatite no chimpanzé e a última é comparavelmente sensível para a avaliação em saguins. Nenhum dos chimpanzés ou dos saguins teve uma elevação das enzimas do fígado atribuível ao inoculo. Todos os valores para os chimpanzés estavam dentro dos limites normais. O único saguim infectado, o número 582, teve as enzimas hepáticas normais até ao momento da sua morte. Os saguins 566, 570, e 578 tinham, cada um, um ou mais valores de enzimas hepáticas anormais, mas os primeiros dois destes animais não foram infectados pelo inoculo, conforme avaliado pela falha na seroconversão, e o terceiro era um controlo negativo não inoculado.

Os saguins têm frequentemente valores menos estáveis das enzimas hepáticas do que os chimpanzés, em parte porque são, por natureza, animais relativamente frágeis e porque são capturados na selva e portanto normalmente estão infectados com vários endo- e ecto-parasitas, incluindo microfilária. C. Histologia: Secções histológicas preparadas a partir de biópsias semanais do fígado em série obtidas dos chimpanzés e dos saguins foram avaliadas segundo o código para alterações histopatológicas. Embora alguns animais tivessem uma linha de base elevada de alterações histopatológicas, nenhum dos animais tinha evidência de alterações histopatológicas mais graves do que aquelas que se observaram em biópsias antes da inoculação. De modo igualmente importante, não existiam alterações alterações histológicas que fossem temporariamente relacionadas com a seroconversão em animais infectados. Os dois saguins que morreram foram submetidos a avaliação mais extensiva. Ambos os animais tinham evidência de doença sistémica que estava provavelmente etiologicamente relacionada com as suas mortes, mas as alterações histológicas no fígado foram diagnosticadas como doença crónica, e não aguda, e portanto não relacionada com o inoculo.

Realizou-se uma comparação de alterações histopatológicas observadas em chimpanzés e saguins com estes vários bancos de voluntários e vírus do tipo selvagem. Vejam-se as Tabelas II e III adiante.

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Inóculo* Tabela II HISTOPATOLOGIA: CHIMPANZÉS Histooatoloaia do fíaado Gama de # Inoc. # Infectados # Gravidade** T.S. 4 4 4 + - 3 + P-21 6 6 1 0 - 3 + P-32 6 6 0 0 MRC-5 4 3 0 0 * Dose: 103 - 105ID50IV ** Escala de 0-3 +

Inóculo* # Inoc. Tabela III HISTOPATHOLOGIA: SAGUINS # Infectados # Histooatoloaia do fíaado Gama de Gravidade** T.S. 4 4 4 1 + - 2 + P-21 8 8 8 1 + - 3 + P-32 5 5 3 O - 2 + MRC-5 * r-. .. ιλ3 4 ί λ5 i r\ 1 0 0 * Dose: 103 - 105 ID50 IV ** Escala de 0-3 + O lote 87J19 parece estar mais atenuado do que outros bancos de voluntários ou vírus do tipo selvagem, com base na infectividade e na gravidade das alterações histopatológicas. D. Imunofluorescência: Avaliaram-se biópsias de fígado congeladas de modo instantâneo, em série, obtidas de animais infectados, quanto à expressão de antigénio virai, por imunofluorescência. Apenas um animal, o Chimp 1313, foi sem dúvida, mas fracamente, positivo para o antigénio virai intra-hepático. Este animal foi positivo durante apenas uma semana. Estes resultados foram 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT 19 comparados com os que foram obtidos no estudo anterior de outros bancos de voluntários e vírus do tipo selvagem. Tal como observado nas Tabelas IV e V, a replicaçáo intra-hepática diminuiu adicionalmente tanto nos chimpanzés como nos saguins quando comparada com o vírus crescido em AGMK e o vírus do tipo selvagem.

Inoculo* Tabela IV REPLICAÇÃO VIRAL NO FÍGADO: SAGUINS (IMUNOFLUORESCÊNCIA) Pico # Inoc. # Infectados Médio Duração Média (sem.) T.S. 4 4 2,5 + 12,2 P-21 8 8 1 + 3,5 P-32 5 5 <1 + 2,4 MRC-5 4 1 0 0 *Dose: 103 - 105 id50 I.V.

Inoculo* Tabela V REPLICAÇÃO VIRAL NO FÍGADO: CHIMPANZÉS (IMUNOFLUORESCÊNCIA) Pico Duração # Inoc. # Infectados Médio Média (sem.) T.S. 4 4 1 + 1,8 P-21 6 6 <1 + 0,5 P-32 6 6 < 1 + 0,6 MRC-5 4 3 < 1 + 0,3 *Dose: 103 - 105 ID50 I.V.

E. Protecção: Embora o único saguim infectado no estudo tivesse morrido, todos os quatro chimpanzés estavam disponíveis para desafio com HAV do tipo selvagem progenitor para determinar se os níveis de anti-HAV presentes nos animais infectados eram protectores. Consequentemente, os três animais infectados e um animal não infectado foram desafiados com aproximadamente 1 O3 doses infecciosas para chimpanzé da estirpe HM-175 de 20 87103 ΕΡ Ο 666 751 /ΡΤ HAV do tipo selvagem (suspensão de fezes humanas), administradas intravenosamente (Fig. 1 a 4).

Todos os três chimpanzés previamente infectados estavam protegidos contra a hepatite do tipo A, conforme medido pelos valores persistentemente normais de enzimas séricas (Fig. 1 a 3). Todos os três animais protegidos liveram uma resposta dc anticorpos anamnésticos ao vírus de desafio, sugerindo que havia replicação limitada. Em contraste, o chimpanzé não infectado previamente desenvolveu elevados valores de enzimas, diagnóstico de hepatite após o desafio com vírus do tipo selvagem (Fig. 4). Assim, o banco de voluntários 87J19 produziu uma infecção não aparente em chimpanzés que estimulou protecção contra o subsequente desafio com vírus virulento do tipo selvagem.

Os resultados destas porções da experiência demonstram que o banco de voluntários 87J19 de HAV 4380, estirpe HM-175 (adaptada para células MRC-5) estava significativamente mais atenuado para chimpanzés e saguins do que a sua estirpe progenitora, HAV, estirpe HM-175 (AGMK, Passagem-32). É evidente destes estudos que o HAV 4380, estirpe HM-175 do banco de voluntários 87J19, é altamente atenuado para chimpanzés e saguins que são sub-rogados aceites para o homem no estudo de vírus da hepatite A.

Exemplo 2: Estudo clínico de voluntários.

Neste ensaio clínico, voluntários receberam títulos crescentes da vacina viva atenuada de hepatite A, 4380, banco de voluntários 87J19, que foi previamente testada em chimpanzés e saguins como descrito no Exemplo 1. Estes estudos pré-clínicos demonstraram que a vacina era segura, imunogénica e eficaz em modelos animais experimentais.

Admitiram-se voluntários numa enfermaria isolada do United States Army Medicai Research Institute of Infectíous Diseases, Fort Detrick, Maryland. Oito voluntários receberam a vacina viva atenuada de hepatite A (1 ml) pela via oral e da seguinte maneira: dois receberam uma dose de 104 TCID50, dois uma dose de 105 TCID50, dois uma dose de 106 TCID50, e dois uma dose de 107 TCID50. Seis voluntários receberam a vacina pela via intramuscular na área deltoide e da 21 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT seguinte maneira: 2 receberam uma dose de 105 TCID50, 2 uma dose de 106 TCID50e 2 uma dose de 107 TCID50.

Cada voluntário permaneceu na enfermaria durante três dias após a imunização. Monitorizaram-se efeitos locais ou sistémicos durante o período de admissão e durante 12 semanas após a imunização. Pediu-se aos voluntários para voltarem aos 6 e aos 1 2 meses para seguimento serológico.

Os soros foram obtidos antes da imunização e uma vez por semana durante as 12 semanas seguintes. Em voluntários que completaram o tempo de seguimento apropriado, obtiveram-se também soros aos 6 e aos 1 2 meses após a administração inicial da vacina. Testaram-se os espécimes séricos quanto a alanina-aminotransferase (ALT) e anticorpos para a hepatite A. A ALT foi testada com um analisador Kodak ΕΚΤΑ Chem 700XR (Rochester, NY); os valores normais eram de 0 a 50 Ul/ml. Os anticorpos para a hepatite A foram testados por quatro métodos diferentes, incluindo um radioimunoensaio comercial (HAVAB, Abbott Laboratories, N. Chicago, IL). Em segundo lugar, um imunoensaio com ligação de enzimas desenvolvido por SmithKline Beecham (SKB-ELISA), que foi mais sensível do que o HAVAB Standard, em que um nível >20 miliunidades internacionais (mUI) era considerado positivo. Os soros seleccionados foram testados por RIFIT (radioimunofocagem) quanto a anticorpos neutralizantes para a hepatite A. Com este teste, um título sérico > 1:10 era considerado positivo [S.M. Lemon et al, J. Infect. Dis., 148:1033-1039 (1983)]. Finalmente, os soros foram testados quanto a IgM anti-HAV por um radioimunoensaio comercial (HAVAB-M, Abbott Laboratories, N. Chicago, IL).

Recolheram-se fezes dos voluntários duas a três vezes por semana durante as primeiras 12 semanas que foram testadas quanto à presença de vírus da hepatite A por radioimunoensaio [R.H. Purcélula et al, J. Imunof., 11 6:349-356 (1976)] e técnicas de biologia molecular [J. Ticehurst et al, J. Clin. MicrobioL, 25:1822-1829 (1987)].

Todos os voluntários permaneceram saudáveis durante o período de seguimento (14 semanas a um ano). Não houveram queixas sistémicas imediatamente após a imunização ou durante o seguimento a longo prazo. Os 87103

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22 <3F níveis de séricos de alanina-aminotransferase permaneceram normais em todos os 14 indivíduos durante o período de observação. Não foi observado anticorpo para a hepatite A em nenhum dos oito voluntários que receberam a vacina por via oral ou nos dois voluntários que receberam a dose de 105 TCID50 pela via intramuscular. Os quatro voluntários que receberam maiores doses de vacina {106 TCIDao ou 107 TCID50) tinham todos anticorpo detectável pelo ELISA da SKB logo 3 semanas após a imunização. Os níveis detectáveis persistiram durante as 12 semanas de observação. Soros seleccionados testados quanto a anticorpo neutralizante tinham títulos que variavam de 1:10 a 1:40 num voluntário que tinha recebido uma dose de 106 e 1:40 a 1:2560 num voluntário que tinha recebido uma dose de 107 TCID50. O ensaio HAVAB comercial detectou anti-HAV apenas num dos voluntários, que tinha recebido a dose de 107. A IgM anti-HAV não foi detectada em nenhum dos voluntários que tinham recebido a vacina oralmente. Os soros de voluntários que tinham recebido 107 TCID50 I.M. tinham IgM anti-HAV detectável.

As fezes de todos os voluntários que receberam a vacina oral foram negativas para o vírus da hepatite A, enquanto que as de voluntários que tinham recebido a vacina por via intramuscular estão a ser testadas.

Embora apenas um pequeno número de voluntários tenha recebido a vacina oralmente, pareceu que a vacina não é imunogénica por esta via. Isto deve-se provavelmente a sobre-atenuação do vírus, embora devam ser consideradas outras causas, tais como inactivação no tracto gastrointestinal ou um inoculo demasiado pequeno. A vacina foi segura e imunogénica pela via intramuscular em doses de 106 e 107 TCID50. A resposta de anticorpos foi pronta: observou-se anti-HAV em 3 semanas após a imunização, persistiu durante o período de observação, e não diminuiu em título. Uma tal resposta a uma única inoculação de uma preparação a que faltava um adjuvante, é notável. Se realmente, o anti-HAV persistir durante muito tempo após uma dose, as logísticas de administração deste produto seriam muito mais simples e mais bem sucedidas do que com as vacinas actuais contra a hepatite A. A presença de IgM anti-HAV em voluntários que receberam 107 TCID50 sem evidência de hepatite é sugestiva de replicação assintomática do vírus.

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Exemplo 3: Construção de Vírus Quiméricos

Geraram-se vários vírus quiméricos exemplificativos para avaliar o efeito de várias das mutações da Tabela I num gama de hospedeiros e/ou atenuação em primatas. A sequência do vírus 4380 adaptado para MRC-5 foi obtida utilizando reacção em cadeia com polimerase: transcriptase inversa (RT:PCR) para amplificar regiões do vírus como ADNc antes da sequenciação (por isso T em vez de U na Tabela VI adiante). Os números 2-10 na Tabela VI designam vírus quimérico preparados por inserção de mutações encontradas no vírus 4380 adaptado para MRC-5 no clone pHAV/7 de ADNc que codifica o vírus HM-175, Passagem 35, atenuado, de Cohen et a/., J. Virol., 61:3035-3039 (1987) [SEQ ID NO:1 e 2]. Mutações introduzidas por "quimera" significa que uma porção do genoma do vírus 4380 foi amplificada por RT:PCR, digerida com enzimas de restrição específicas e que o fragmento foi utilizado para substituir o fragmento homólogo no clone pHAV/7 de ADNc. As mutações introduzidas por mutagénese foram inseridas por mutagénese dirigida por oligonucleótidos do clone pHAV/7 de ADNc utilizando o protocolo de mutagénese da Amersham.

Os ADNc quiméricos foram transcritos em ARN in vitro e os ácidos nucleicos (tanto ARN como ADN) foram transfectados em células FRhK-4 para gerar vírus quiméricos. A quantificação do crescimento do vírus quimérico para as quimeras exemplificativas foi realizada por ensaio "slot-blot". A Tabela VI apresenta os resultados da construção e teste dos nove vírus quiméricos. Tal como se utiliza na Tabela VI, definem-se os seguintes termos: Cultura celular refere-se a vírus contendo as mutações indicadas seleccionado por crescimento em células MRC-5. Mutagénese refere-se a mutagénese dirigida por oligonucleótidos dos clones de ADNc de P-35 ou ΗΜΊ75. Um genoma virai quimérico refere-se à construção de um genoma virai quimérico utilizando porções do clone de ADNc de P-35 e fragmentos gerados por PCR do vírus 4380 adaptado para células MRC-5. ND significa que este estudo não foi ainda realizado. O símbolo + refere-se a vírus que apresenta algum crescimento nesse tipo de célula. O símbolo - refere-se a vírus que apresenta pouco, ou não apresenta, crescimento nesse tipo de célula. Os dois tipos de células empregues para testar o crescimento dos vírus quiméricos são a linha de células semelhantes a fibroblastos de pulmão humano, MRC-5, e a linha de células semelhantes a epiteliais de rim de macaco Rhesus fetal, FRhK-4. Note-se que Vírus #1 na Tabela refere-se a HAV 4380 adaptado para MRC-5. Os vírus #2 a 10 são vírus quiméricos da presente invenção.

Diferenças de nucleótidos de P-35 HM-175 Método de mutação introduzida

Cultura celular +

Quimera

Quimera + + 87103

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Tabela VI

Diferenças na sequência de Nucleótidos de vírus da hepatite A adaptado para MRC-5: Comparação com Vírus P-35 HM-175

Crescimento de vírus mutado em culturas celulares FRhK-4 MRC-5 Vírus #1 (adaptado para MRC-5)

591 A para G 646 G para A 669 C para T 687 T para G 2864 T para A 3196 G para A 3934 A para G 4418 A para T 4643 A para T 5145 A para G 5745 A para T 6216 T para C 6908 T para C 7032 C para T

Vírus #2 591 A para G 646 G para A 669 C para T 687 T para G

Vírus #3 124 C para T 1 31 d para T

132 d para T

133 d para T

134 d para G 152 G para A 203-207 d para T 591 A para G 646 G para A 669 C para T 687 T para G________ d = Base nesta posição delecionada em P-35 em comparação com O tipo selvagem

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TABELA VI (cont) Diferenças na sequência de IMucleótidos de vírus da hepatite A adaptado para MRC-5: Comparação com Vírus P-35 HM-175 Diferenças de Método Crescimento de nucleótidos de mutação vírus mutado de P-35 HM-175_introduzida_em culturas celulares FRhK-4 MRC-5

Vírus #4 591 A para G 646 G para A 669 C para T 687 T para G 4418 A para T 4643 A para T

Quimera + +

Vírus #5 1 24 C para T 131 d para T 132 d para T 133 d para T 1 34 d para T 1 52 G para A 203-207 d para T 591 A para G 646 G para A 669 C para T 687 T para G 4418 A para T 4643 A para T

Quimera d = Base nesta posição delecionada em P-35 em comparação com o tipo selvagem A introdução de quatro mutações encontradas na região não codificante a 5', nas posições de nucleótido 591, 646, 669, e 687 do genoma de P-35, parece ser importante para a gama de hospedeiros de HAV em cultura celular. Estas permitem algum crescimento do vírus transfectado em células MRC-5, mas não são inteiramente responsáveis pela adaptação em cultura de células

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MRC-5. A introdução de duas mutações, nos nucleótidos 4418 e 4643 na região 2C do vírus adaptado para MRC-5, com as mutações a 5' permite o completo crescimento em células MRC-5. Assim as quatro mutações na região não codificante a 5' e as duas mutações na região 2C do genoma do vírus adaptado para células MRC-5 parecem actuar sinergicamente na adaptação deste vírus ao eficiente crescimento em células MRC-5.

Exemplo 4: Comparação da diluição no ponto final dos vírus quiméricos em células FRhK-4 versus células MRC-5 Vírus quiméricos com a composição descrita na Tabela VI foram diluídos em série em incrementos de dez vezes, e plaqueou-se uma alíquota igual de cada diluição em células FRhK-4 e MRC-5. Após 21 dias de incubação a 34,5°C para permitir o crescimento do vírus, lisaram-se as células por adição de uma solução tampão contendo dodecilsulfato de sódio. Extraiu-se o ARN virai com fenol e quantificou-se por hibridação "slot blot" utilizando uma ribossonda marcada com [32p] específica para o vírus da hepatite A. Uma autorradiografia do "slot blot" obtido de células FRhK-4 e de células MRC-5 ilustra que a diluição no ponto final do vírus adaptado para MRC-5 foi o mesmo em ambas as linhas de células, indicando que este vírus pode crescer em qualquer das linhas de células. Em contraste, o vírus P35 HM-175 tinha uma diluição no ponto final de 10'5 em células FRhK-4 e <10'1 em células MRC-5, demonstrando que este vírus é incapaz de crescer com sucesso em células MRC-5. Como ilustra a Fig. 5, o vírus #4 foi mais provavelmente o vírus adaptado para MRC-5 e os vírus #2, 3 e 5 eram intermediários. Estes resultados mostram que certas mutações do vírus adaptado para MRC-5 podem ser introduzidas no clone pHAV/7 de ADNc para gerar novos vírus que também adquiriram a capacidade de crescer em células MRC-5.

Numerosas modificações e variações da presente invenção estão incluídas no fascículo acima identificado e espera-se que sejam óbvias para um perito na arte. Estas modificações e alterações às composições e processos da presente invenção crêem-se abrangidos no âmbito das reivindicações anexas.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: SmithKline Beecham, Biologicals, s.a.

Government of USA, Dept. Health & Human Services Funkhouser, Ann W.

Emerson, Suzanne U.

Purcell, Robert H. D'Hondt, Eric

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Vacinas de vírus da hepatite A (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Howson and Howson (B) RUA: PO Box 457 Spring House Corporate Cntr (C) CIDADE: Spring House (D) ESTADO: Pennsylvania

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 19477 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO:Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US93/08610 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 17-Set-1993 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 07/947,338 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-Set-1992 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Bak, Mary E. 28 87103 ΕΡ 0 666 751 /ΡΤ (Β) NÚMERO DE REGISTO: 31 215 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/CERTIFICADO: SBCP50110 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 215-540-9206 ; (B) TELEFAX: 215-540-5818 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7493 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 735...7415 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: 29 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT TTCAAGAGGG GTCTCCGGGA ATTTCCGGAG TCCCTCTTGG AAGTCCATGG 50 TGAGGGGACT TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT AGGCTAAATT 100 TTCCCTTTCC ÇTTTfCCCTT TÇCTATTCCC TTTGTTTTGC TTGTAAATAT 150 TAATTCCTGC AGGTTCAGGG TTCTTAAATC TGTTTCTCTA TAAGAACACT 200 CATTTTTCAC GCTTTCTGTC TTCTTTCTTC CAGGGCTCTC CCCTTGCCCT 250 AGCCTCTGGC CGTTGCGCCC GGCGGGGTCA ACTCCATGAT TAGCATGGAG 300 CTGTAGGAGT CTAAATTGGG GACACAGATG-TTTGGAACGT CACCTTGCAG 350 TGTTAACTTG GCTTTCATGA ATCTCTTTGA TCTTCCACAA GGGGTAGGCT 400 ACGGGTGAAA CCTCTTAGGC TAATACTTCT ATGAAGAGAT GCCTTGGATA 450 GGGTAACAGC GGCGGATATT GGTGAGTTGT TAAGACAAAA ACCATTCAAC 500 GCCGGAGGAC TGACTCTCAT CCAGTGGATG CATTGAGTGG ATTGACTGTC 550 AGGGCTGTCT TTAGGCTTAA TTCCAGACCT CTCTGTGCTT AGGGCAAACA 600 TCATTTGGCC TTAAATGGGA TTCTGTGAGA GGGGATCCCT CCATTGACAG 650 CTGGACTGTT CTTTGGGGCC TTATGTGGTG TTTGCCTCTG AGGTACTCAG 700 GGGCATTTAG GTTTTTCCTC ATTCTTAAAT AATA ATG AAC ATG TCT AGA 749

Met Asn Met Ser Arg 1 CAA GGT ATT TTC CAG ACT GTT GGG AGT GGT CTT GAC CAC ATC Gin Gly 11« Phe Gin Tiir Vai Gly Ser Gly Leu Asp His Ile 791 30 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT CTG TCT TTG GCA GAC ATT GAG GAA GAG CAA ATG ATT CAA TCA 833 Leu Ser 20 Leu Ala Asp Ile Glu 25 Glu Glu Gin Met Ile 30 Gin Ser GTT GAT AGG ACT GCA GTG ACT GGT GCT TCT TAT TTT ACT TCT 875 Vai Asp 35 Arg Thr Ala Vai Thr 40 Gly Ala Ser Tyr Phe 45 Thr Ser GTG GAT CAA TCT TCA GTT CAT ACA GCT GAG GTT GGA TCA CAC 917 Vai Asp Gin 50 Ser Ser Vai His Thr 55 Ala Glu Val Gly Ser 60 His CAG GTT GAA CCT TTG AGA ACC TCT GTT GAT AAA CCC GGT TCA 959 Gin. Vai Glu Pro β5 Leu Arg Thr Ser Val 70 Asp Lys Pro Gly Ser 75 AAG AAG ACT CAG GGA GAG AAA TTT TTC TTG ATT CAT TCT GCA 1001 Lys Lys Thr Gin Gly 80 GlU Lys Phe Phe Leu 85 Ile His Ser Ala GAT TGG CTT ACT ACA CAT GCT CTT TTC CAT GAA GTT GCA AAA 1043 Asp Trp 90 Leu Thr Thr His Ala 95 Leu Phe His Glu Val 100 Ala Lys TTG GAT GTG GTG AAA TTA TTA TAC AAT GAG CAG TTT GCT GTT 1085 Leu Asp 105 Vai vai Lys Leu Leu 110 Tyr Asn Glu Gin Phe 115 Ala Val CAA GGG TTG TTG AGA TAC CAT ACA TAT GCA AGA TTT GGC ATT 1127 Glit Gly Leu 120 Leu Arg Tyr His Thr 125 Tyr Ala Arg Phe Gly 130 Ile GAA ATT CAA GTT CAG ATA AAC CCT ACA CCT TTC CAA CAG GGG 1169 Glu Ile Gin Vai 135 Gin Ile Asn Pro Thr 140 Pro Phe Gin Gin Gly 145 GGA TTG ATC TGT GCT ATG GTT CCT GGT GAC CAG AGC TAT GGT 1211 Gly Leu Ile Cys Ala 150 Met Vai Pro Gly Asp 155 Gin Ser Tyr Gly TCT ATA GCA TCA TTG ACT GTT TAT CCT CAT GGT TTG TTA AAT 1253 Ser Ile 160 Ala Ser Leu Thr val 165 Tyr Pro His Gly Leu 170 Leu Asn TGC AAT ATT AAC AAT GTG GTT AGA ATA AAG GTT CCA TTT ATT 1295 Cys Asn 175 ile Asn Asn val Val 180 Arg Ile Lys Val Pro 185 Phe Ile TAC ACA ACA CCT COT TAC CAC TTT AAA GAT CCA CAA TAC CCA 1337 Tyr Thr Arg 190 Gly Ala Tyr His Phe 195 Lys Asp Pro Gin Tyr Pro 200

87103

ΕΡ 0 666 751 /PT 31 GTT TGG GAA TTG ACA ATT AGA GTT TGG TCA GAA TTA AAT ATT 1379 Vai Trp Glu Leu 205 Thr Ile Arg Vai Trp 210 Ser Glu Leu Asn Ile 215 GGG ACA GGA ACT TCA GCT TAT ACT TCA CTC AAT GTT TTA GCT 1421 Gly Thr Gly Thr Ser 220 Ala Tyr Thr Ser Leu 225 Asn Vai Leu Ala AGA TTT ACA 6AT TTG GAG TTG CAT GGA TTA ACT CCT CTT TCT 1463 Arg 230 Phe Thr Asp Leu Glu 235 Leu His Gly Leu Thr 240 Pro Leu Ser ACA CAA ATG ATG AGA AAT GAA TTT AGG GTC AGT ACT ACT GAG • 1505 Thr Gin 245 Met Met Arg Asn Glu 250 Phe Arg Vai Ser Thr 255 Thr Glu AAT GTG GTG AAT CTG TCA AAT TAT GAA GAT GCA AGA GCA AAG 1547 Asn Vai Vai 260 Asn Leu Ser Asn Tyr 265 Glu Asp Ala Arg Ala 270 Lys ATG TCT TTT GCT TTG GAT CAG GAA GAT TGG AAA TCT GAT CCG 1589 Met Ser Phe Ala 275 Leu Asp Gin Glu Asp 2S0 Trp Lys Ser Asp Pro 285 TCC CAG GGT GGT GGG ATC AAA ATT ACT CAT TTT ACT ACT TGG 1631 Ser Gin Gly Gly Gly 290 Ile Lys Ile Thr His 295 Phe Thr Thr Trp ACA. TCT ATT CCA ACT TTG. GCT GCT CAG TTT CCA TTT AAT GCT 1573 Tht 30σ Ser Xle Pró Thr Leu 300 Ala Ala éln Phe Pro 310 ,Pha Asn Ala TCA GAC TCA GTT GGT CAA CAA ATT AAA GTT ATT CCA GTT GAC 1715 Ser Asp 315 Ser Vai Gly Gin Gin 320 Ile Lys Vai Ile Pro 325 Vai Asp CCA TAT TTT TTC CAA ATG ACA AAT ACG AAT CCT GAC CAA AAA 1757 Pro Tyr Phe 330 Phe Gin Met Thr Asn 335 Thr Asn Pro Asp Gin 340 Lys TGT ATA ACT GCT TTG GCT TCT ATT TGT CAG ATG TTT TGT TTT 1799 Cys Ile Thr Ala 345 Leu Ala Ser lie Cys 350 Gin Mat Pha Cys Phe 355 TGG AGA GGA GAT CTT GTC TTT GAT TTT CAA GTT TTT ccc ACC 1841 Trp Arg Gly Asp Leu 360 Vai Phe Aep Phe Gin 365 Vai Phe Pro Thr AAA TAT CAT TCA GGT AGA TTA CTG TTT TGT TTT GTT CCT GGC 1883 Lys 370 Tyr His Ser Gly Arg 375 Leu Leu Phe Cys Phe 380 Vai Pro Gly

87103 ΕΡ 0666 751/PT

ΑΑΤ GAG CTA ATA GAT GTT TCT GGA ATC ACA TTA AAG CAA GCA 1925 Asn Glu 385 Leu Ile Asp Val Ser 390 Gly Ile Thr Leu Lys 395 Gin Ala ACT ACT GCT CCT TGT GCA GTA ATG GAT ATT ACA GGA GTG CAG 1967 Thr Thr Ala 400 Pro cys Ala val Met 405 Asp Ile Thr Gly Val 410 Gin TCA ACT TTG AGA TTT CGT GTT CCC TGG ATT TCT GAC ACT CCT 2009 Ser Thr Leu Arg 415 Phe Arg Val Pro Trp 420 Ile Ser Asp Thr Pro 425 TAC AGA GTG AAC AGG TAT ACA AAG TCA GCA CAT CAG AAA GGT 2051 Tyr Arg Vai Asn Arg 430 Tyr Thr Lys Ser Ala 435 His Gin Lys Gly GA G TAC ACT GCC ATT GGG AAG CTT ATT GTG TAT TGT TAT AAC 2093 Glu 440 Tyr Thr Ala Ile Gly 445 Lys Leu Ile val Tyr 450 cys Tyr Asn AGA TTG ACC TCT CCT TCT AAC GTT GCT TCC CAT GTC AGA GTG 2135 Arg Leu 4S5 Thr Ser Pro Ser Asn 460 Val Ala Ser Kis Val 4 65 Arg Val AAT GTT TAT CTT TCA GCA ATT AAC TTG GAA TGT TTT GCT CCT 2177 Asn Vai Tyr 470 Leu Ser Ala ile Asn 475 Leu Glu Cys Phe Ala 480 Pro CTT TAT CAT GCT ATG GAT GTT ACT ACA CAA GTT GGA GAT GAT 2219 Leii Tyr His Ala 485 Met Asp Val Thr Thr 490 Gin Val Gly Asp Asp 495 TCT GGA GGT TTT TCA ACA ACA GTT TCT ACA GAA CAG AAT GTT 2261 Ser Gly Gly Phe ser 500 Thr Thr val ser Thr 505 Glu Gin Asn Val CCA GAT ccc CAA GTT GGT ATA ACA ACC ATG AAA GAT TTG AAA 2303 Pro 5Í0 Aep Pro Gin Val Gly 515 Ile Thr Thr Met Lys 520 Asp Leu Lys GGA AAA GCT AAC AGA GGG AAA ATG GAT GTT TCA GGA GTA CAA 2345 Gly Lys 525 Ala Asn Arg Gly Lys 530 Met Asp Val Ser Gly 535 val Gin GCA CCT GTG GGA GCT ATC ACA ACA ATT GAG GAT CCA GTT TTA 2387 Ala VXQ val 540 Gly Ala Ile Thr Thr 545 Ile Glu Aep Pro Val 550 Leu GCA AAG AAA GTA CCT GAG ACA TTT CCT GAA TTG AAA CCT GGA 2429 Ala Lys Lys Val 555 Pro GlU Thr Phe Pro 560 Glu Leu Lys Pro Gly 565

87103 ΕΡ 0 666 751 /PT 33

GAA TCC AGA CAT ACA TCA GAT CAT ATG TCC ATC TAC AAG TTT 2471 Glu Ser Arg Bis Thr 570 Ser Asp His Met Ser 575 Ile Tyr Lys Phe ATG GGA AGG TCT CAT TTC TTG TGC ACT TTT ACA TTC AAT TCA 2513 Met 580 Gly Arg Ser His Phe 585 Leu Cys Thr Phe Thr 590 Phé Asn Ser AAT AAT AAA GAG TAC ACA TTT CCT ATA ACC TTG TCT TCA ACC 2555 Asn Asn 595 Lys Glu Tyr Thr Phe 600 Pro Ile Thr Leu Ser 605 Ser Thr TCT AAT CCT CCT CAT GGT TTG CCA TCA ACA CTG AGG TGG TTT 2597 Ser Asn Pro 6X0 Pro His Gly Leu Pro 615 Ser Thr Leu Arg Trp 620 Phe TTC AAC TTG TTT CAG TTG TAT AGA GGG CCT TTA GAT CTG ACA 2639 Phe Asn Leu Phe 625 Gin Leu Tyr Arg Gly 630 Pro Leu Asp Leu Thr 635 ATT ATT ATT ACA GGA GGA ACT GAT GTA GAT GGC ATG GCC TGG 2681 Ile Xle Xle Thr Gly 640 Ala Thr Asp Val Asp 645 Gly Met Ala Trp TTC ACT CCA GTA GGT CTT GCC GTT GAT ACT CCT TGG GTA GAG 2723 Phe 650 Thr Pro. Vai Gly Leu 655 Ala val Asp Thr Pro 660 Trp Val Glu MG GAG TCA GCT TTG TCT ATT GAC TAC AAA ACT GCT CTT GGA 2765 íiys. Glu 665 Ser Ala Leu Ser Xle 670 Asp Tyr Lys Thr Ala 675 Leu Gly GCT GTC AGA TTT AAC ACA AGG AGA ACA GGG AAC ATT CAG ATT 2807 Ala Vai Arg 680 Phe Asn Thr Arg Arg 685 Thr Gly Asn Ile Gin 690 Ile AGA TTA CCA TGG TAT TCT TAT TTA TAT GCT GTG TCT GGA GCA 2849 Arg Leu Pro Trp 695 Tyr Ser Tyr Leu Tyr 700 Ala Val Ser Gly Ala 705 CTG GAT GGT TTG GGT GAC AAG ACA GAT TCT ACA TTT GGA TTC 2891 Leu Asp Gly Leu Gly 710 Asp Lys Thr Asp Ser 715 Thr Phe Gly Leu GTT TCT ATT CAG ATT GCA AAT TAC AAT CAT TCT GAT GAA TAC 2933 Vai 720 Ser Ile Gin Ile Ala 725 Asn Tyr Asn His Ser 730 Asp Glu Tyr TTG TCT TTT AGT TGT TAT TTG TCT GTC ACA GAA CAA TCA GAG 2975 Leu Ser 735 Phe Ser Cys Tyr Leu 740 Ser Val Thr GlU Gin 745 Ser Glu

87103

ΕΡ 0666 751/PT 34 τττ TAT TTT CCC AGA GCT CCA TTG AAC TCA AAT GCC ATG TTA 3017 Phe Tyr Phe 750 Pro Arg Ala Pro Leu 755 Asn Ser Asn Ala Met 760 Leu TCC ACT GAA TCA ATG ATG AGC AGA ATT GCA GCT GGA GAC TTG 3059 Ser Thr Glu Ser 765 Met Met Ser Arg Ile 770 Ala Ala Gly Asp Leu 775 GAG TCA TCA GTG GAT GAT CCT AGA TCA GAG GAA GAT AAA AGA 3101 GlU Ser Ser Vai Asp 7B0 Asp Pro Arg Ser Glu 785 Glu Asp Lys Arg TTT GAG AGT CAT ATA GAA TGC AGG AAG CCA TAT AAA GAA CTG 3143 Phe 790 Glu Ser His Ile Glu 795 Cys Arg Lys Pro Tyr 800 Lys Glu Leu AGA TTA GAA GTT GGG AAA CAA AGA CTC AAG TAT GCT CAG GAA 3185 Arg Leu 805 Glu Vai Gly Lys Gin 810 Arg Leu Lys Tyr Ala 815 Gin Glu GAA TTG TCA AAT GAA GTA CTT CCA CCC CCT AGG AAA ATG AAG 3227 Glu Leu Sar 820 Asn Glu Vai Leu Pro 825 Pro Pro Arg Lys Met 830 Lys GGA CTG TTT TCA CAA GCC AAA ATT TCT CTT TTT TAT ACT GAG 3269 Gly Leu Phe Sèr 835 Gin Ala Lys Ile Ser 840 Leu Phe Tyr Thr Glu 845 JGAG CAT GAA ATA ATG AAG TTT TCC TGG AGA GGT GTG ACT GCT 3311 Glu His Glu Ile Met 850 Lysr Phe Ser Trp Arg 855 Gly vai Thr Ala GAT ACT AGA GCT TTA AGG AGG TTT GGA TTC TCT TTG GCC GCA 3353 Asp 860 Thr Arg Ala Leu Arg 865 Arg Phe Gly Phe Ser 870 Leu Ala Ala GGC AGA AGT GTG TGG ACT CTT GAA ATG GAT GCT GGG GTT CTT 3395 Gly Arg 875 Ser Vai Trp Thr Leu 880 GlU Met Asp Ala Gly 885 Vai Leu ACT GGG AGA CTG ATT AGA TTG AAT GAT GAG AAA TGG ACA GAA 3437 Thr Gly Arg 890 Leu Ile Arg Leu Asn 895 Asp Glu Lys Trp Thr 900 Glu ATG AAG GAT GAC AAG ATT GTT TCA TTG ATT GAA AAG TTT ACA 3479 Met Lys Asp Asp 905 Lys Ile Vai Ser Leu 910 ile Glu Lys Phe Thr 915 AGT AAC AAA TAT TGG TCC AAA GTG AAT TTC CCA CAT GGG ATG 3521 Ser Asn Lys Tyr Trp 920 Ser Lys Vai Asn Phe 925 Pro His Gly Met 35 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT TTG GAT CTT GAA GAA ATT GCT GCC AAT TCT AAG GAT TTT CCT 3563 Leu 930 Asp Leu Glu Glu Ile 935 Ala Ala Asn Ser Lys 940 Asp Phe Pro AAC ATG TCT GAA ACC GAT TTG TGT TTC TTG CTG CAT TGG TTA 3605 Asn Met 945 Ser Glu Thr A$p Leu 950 Cys Phe Leu Leu His 955 Trp Leu AAT CCA AAG AAA ATT AAT TTA GCA GAT AGA ATG CTT GGA TTG 3647 Asn Pro Lys 960 Lys Ile Asn Leu Ala 965 Asp Arg Met Leu Gly 970 Leu TCT GGA GTT CAG GAA ATT AAA GAA CAA GGT GTT GGA TTA ATA 3689 Ser Gly Vai Gin 975 Glu Ile Lys Glu Gin 980 Gly Val Gly Leu Ile 985 GCA GAG TGT AGA ACT TTC TTA GAT TCT ATT GCT GGA ACT TTA 3731 Ala Glu Cys Arg Thr 990 Phe Leu Asp ser Ile 995 Ala Gly Thr Leu AAA TCT ATG ATG TTT GGA TTT CAT CAT TCT GTG ACT GTT GAA 3773 Lys ser 1000 Met Met Phe Gly Phe 1005 His Bis Ser Val Thr 1010 Val Glu ATT ATA AAC ACT GTG CTC TGT TTT GTT AAG AGT GGA ATT TTG 3815 Ile Xle Asn 1015 Thr Val Leu Cys Phe 1020 Val Lys Ser Gly Ile 1025 Leu CTT TAT GTA ATA CAA CAA TTG AAT GAG GAT GAA CAT TCT CAC 3857 iei£ Tyr Vai Ile 1030 Gin Glh Leu Asn Gin 1035 Asp Glu His Ser His 1040 ATA ATT GGT TTG TTG AGA GTC ATG AAT TAT GCA GAT ATT GGT 3899 Ile Ile Gly Leu Leu 1045 Arg Val Met Asn Tyr 1050 Ala Asp Ile Gly 1055 TGT TCA GTT ATT TCA TGT GGC AAA GTT TTT TCC AAA ATG CTG 3941 Cys Ser val ile Ser cys 1060 Gly Lys Val Phe Ser 1065 Lys Met Leu GAA ACA GTC TTT AAT TGG CAA ATG GAC TCC AGA ATG ATG GAG 3983 Glu Thr 1070 Val Phe Asn Trp Gin 1075 Met Asp Ser Arg Met 1080 Met Glu TTA AGG ACT CAG AGT TTT TCC AAC TGG TTA AGA GAT ATT TGT . 4025 Leu Arg Thr 1085 Gin Ser Phe Ser Asn 1090 Trp Leu Arg Asp Ile 1095 cys TCT GGG ATC ACC ATT TTT AAA AAC TTC AAG GAT GCA ATT TAT 4067 Ser Gly Ile Thr 1100 Ile Phe Lys Asn Phe 1105 Lys Asp Ala Ile Tyr 1110 36 36

87103 ΕΡ 0 666 751 IPΤ TGG CTT TAT ACA AAA TTA AAG GAC TTT TAT GAA GTG AAT TAT 4109 Trp Leu Tyr Thr Lys 1115 Leu Lys Asp Phe Tyr 1120 Glu val Asn Tyr 1125 GGC AAG AAG AAG GAC ATT TTA AAT ATT CTT AAA GAT AAC CAA 4151 Gly Lys Lys Lys Asp Ile 1130 Leu Asn Ile Leu Lys 1135 Asp Asn Gin CAA AAA ATA GAG AAA GCC ATT GAG GAA GCC GAT GAA TTT TGC 4193 Gin Lys 1140 Ile Glu Lys^ t Ala Ile 1145 Glu Glu Ala Asp Glu 1150 Phe cys ATT TTG CAA ATC CAA GAT GTG GAA AAA TTT GAA CAG TAT CAG 4235 Ile Leu Gin 1155 Ile Gin Asp Vai Glu 1160 Lys Phe Glu Gin Tyr 1165 Gin AAA GGG GTT GAC TTG ATA CAA AAA TTG AGA ACT GTT CAT TCA 4277 Lys Gly Vai Asp Leu 1170 ile Gin Lys Leu Arg 1175 Thr Val His Ser 1180 ATG GCT CAG GTT GAT CCA AAT TTA ATG GTT CAT TTG TCA CCT 4319 «et Ala Gin Vai Asp 1185 Pro Asn Leu Met Val 1190 ais Leu ser Pro 1195 TTG AGA GAT TGT ATA GCA AGA GTT CAT CAG AAA CTT AAA AAC 4361 Leu Arg ASp Cys ile Ala 1200 Arg val Hls Gin Lys 1205 Leu Lys Asn CTT GGA TCT ATA AAT CAG GCA ATG GTA ACG AGA TGT GAG CCA 4403 Leg Gly 121Ό Ser Ile Asn Gin Ala 1215 Met Val Thr Arg Cys 1220 Glu Pro GTT GTT TGT TAT TTA TAT GGC AAA AGA GGG GGA GGA AAG AGC 4445 Vai Vai Cys Tyr Leu 1225 Tyr Gly Lys 1230 Arg Gly Gly Gly Lys 1235 Ser TTA ACA TCA ATT GCA TTG GCA ACC AAA ATT TGT AAA CAT TAT 4487 Leu Thr Ser Ile Ala 1240 Leu Ala Thr Lys Ile 1245 cys Lys His Tyr 1250 GGT GTT GAG CCT GAA AAG AAT ATC TAT ACT AAA CCT GTG GCT 4529 Gly Vai Glu Pro Glu 1255 Lys Asn Ile Tyr Thr 1260 Lys Pro Val Ala 1265 TCA GAT TAC TGG GAT GGA TAT AGT GGA CAA TTA GTT TGC ATC . 4571 Ser Asp Tyr Trp Asp Gly 1270 Tyr Ser Gly Gin Leu 1275 Val Cys Ile ATT GAT GAT ATT GGC CAA AAC ACA ACA GAT GAG GAT TGG TCA 4613 Ile Asp 1280 Asp Ile Gly Gin Asn 1285 Thr Thr Asp GlU Asp 1290 Trp Ser 37 87103

ΕΡ 0666 751/PT GAT TTT TGT CAG TTA GTG TCA GGA TGT CCA ATG AGA TTA AAC 4655 Asp Phe Cys Gin 1295 Leu Val Ser Gly Cys 1300 Pro Met Arg Leu Asn 1305’ ATG GCC TCT CTT GAG GAG AAG GGT AGG CAT TTT TCT TCT CCT 4697 Met Ala Ser Leu 1310 Glu Glu Lys Gly Arg 1315 His Phe Ser Ser Pro 1320 TTT ATA ATA GCA ACT TCA AAT TGG TCA AAT CCA AGT CCA AAA 4739 Phe Ile Ile Ala Thr 1325 Ser Asn Trp Ser Asn 1330 Pro Ser Pro Lys 1335 ACA GTT TAT GTT AAG GAA GCA ATT GAC CGC AGA CTC CAT TTC 4781 Thr Val Tyr Val Lys Glu 1340 Ala Ile Asp Arg Arg 1345 Leu His Phe AAG GTT GAA GTT AAA CCT GCT TCA TTT TTC AAA 1 o 3 £ o 4823 Lys val Glu 1350 Val Lys Pro Ala ser Phe 1355 Phe Lys Asn Pro His 1360 AAT GAT ATG TTG AAT GTT AAT TTA GCT AAA ACA AAT GAT GCA 4865 Ac π Asp Met 1365 Leu Asn Val Asn Leu Ala 1370 Lys Thr Asn Asp Ala 1375 ATC AAA GAT ATG TCT TGT GTT GAT TTG ATA ATG GAT GGA CAT 4907 Ile Lys Asp Met 1380 Ser Cys Val Asp Leu 1385 Ile Met Asp Gly His 1390 AAT GTT TCA TTG ATG GAT TTG CTC AGT TCT TTA GTC ATG ACA 4949 Asn val ser Leu Met 1395 Asp Leu Leu Ser Ser 1400 Leu Val Met r js GTT GAA ATT AGA AAA CAA AAC ATG ACT GAA TTC ATG GAG TTG 4991 Val Glu Ile Arg Lys Gin 1410 Asn Met Thr Glu Phe 1415 Met Glu Leu TGG TCT CAG GGA ATT TCA GAT GAT GAT AAT GAT AGT GCA GTA 5033 Trp Ser Gin 1420 Gly Ile Ser Asp Asp Asp 1425 Asn Asp Ser Ala Val 1430 GCT GAG TTT TTC CAG TCT TTT CCA TCT GGT GAA CCA TCG AAC 5075 Ala Glu Phe 143 5 Phe Gin Ser Phe Pro Ser 1440 Gly Glu Pro ser Asn 1445 TCT AAA TTA TCT GGC TTT TTC CAA TCT GTT ACT AAT CAC AAG 5117 Ser Lys Leu Ser 1450 Gly Phe Phe Gin Ser 1455 Val Thr Asn His Lys 1460 TGG GTT GCT GTG GGA GCT GCA GTT GGC ATT CTT GGA GTG CTC 5159 Trp val Ala val Gly 1465 Ala Ala Val Gly Ile 1470 Leu Gly Val Leu 1475 38 38

87103

ΕΡ 0666 751/PT

GTT GGA GGA TGG TTT GTG TAT AAG CAT TTC TCC CGC AAA GAG 5201 val Gly Gly Trp Phe Val 1480 Tyr Lys His Phe Ser 1485 Arg Lys GlU G&G GAA CCA ATC CCA GCT GAA GGG GTA TAT CAT GGT GTA ACT 5243 Glu Glu 1490 Pro Ile Pro Ala Glu Gly Val 1495 Tyr His Gly 1500 Val Thr AAG CCC AAG CAA GTG ATT AAA TTA GAT GCA GAT CCA GTA GAA 5285 Lys Pro Lys 1505 Gin Val Ile Lys Leu Asp 1510 Ala Asp Pro Val 1515 Glu TCT CAG TCA ACT TTG GAA ATA GCA GGA CTG GTT AGG AAG AAC 5327 Ser Gin Ser Thr 1520 Leu GlU Ile Ala Gly 1525 Leu val Arg Lys Asn 1530 TTG GTT CAG TTT GGA GTT GGA GAG AAG AAT GGA TGT GTG AGA 5369 Leu val Gin Phe Gly 1535 val Gly Glu Lys Asn 1540 Gly cys Val Arg 1545 TGG GTT ATG AAT GCC TTG GGA GTG AAA GAT GAT TGG CTG CTT 5411 Trp val Met Asn Ala Leu 1550 Gly val Lys Asp Asp 1555 Trp Leu Leu GTG CCT TCC CAT GCT TAT AAA TTT GAG AAA GAT TAT GAA ATG 5453 val Pro 1560 Ser Hls Ala Tyr Lys Phe Glu 1565 Lys Asp Tyr 1570 GlU Met ATC GAG TTT TAT TTT AAT AGA GGT GGA ACT TAC TAT TCA ATT 5495 «et Glu Phe ' 1575 Tyr Phe Asn Arg Gly Gly 1580 Thr Tyr Tyr Ser 1585 Ile TCA GCT GGT AAT GTT GTT ATT CAA TCT TTG GAT GTG GGA TTC 5537 Ser Ala Gly Asn 1590 Val Val Ile Gin Ser 1595 Leu Asp Val Gly Phe 1600 CAG GAT GTT GTT CTG ATG AAG GTT CCT ACA ATT CCT AAG TTT 5579 Gin Asp Val Val Leu 1605 Met Lys Val Pro Thr 1610 ile Pro Lys Phe 1615 AGA GAT ATT ACT CAG CAT TTT ATT AAG AAA GGG GAT GTG CCT 5621 Arg Asp Ile Thr Gin Mis 1620 Phe Ile Lys Lys Gly 1625 Asp val Pro AGA GCT TTG AAT CGC CTG GCA ACA TTA GTG ACA ACT GTA AAT • 5663 Arg Ala 1630 Leu Asn Arg Leu Ala Thr Leu 1635 Val Thr Thr 1640 val Asn GGA ACC CCT ATG TTA ATT TCT GAG GGC CCA CTA AAG ATG GAA 5705 Gly Thr Pro 1645 Met Leu Ile Ser Glu Gly 1650 Pro Leu Lys Met 1655 GlU 39 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT GAG AAA GCT ACT TAT GTT CAT AAG AAA AAT GAT GGT ACA ACA 5747 GlU Lys Ale Thr 1660 Tyr val HÍS Lys Lys Asn 1665 Asp Gly Thr Thr 1670 GTT GAT TTA ACT GTG GAT CAG GCA TGG AGA GGA AAA GGC GAA 5789 Vai Asp Leu Thr Val 1675 Asp Gin Ala Trp Arg 1680 Gly Lys Gly GlU 1685 GGT CTT CCT GGA ATG TGT GGT GGG GCC TTG GTT TCA TCG AAT 5831 Gly Leu Pro Gly Met Cys 1690 Gly Gly Ala Leu Val 1695 ser Ser Asn CAA TCT ATA CAG AAT GCA ATC TTG GGC ATC CAT GTT GCT GGA 5873 Gin ser 1700 Ile Gin Asn Ala Ile 1705 Leu Gly Ile His Val 1710 Ala Gly GGA AAT TCA ATT CTT GTT GCA AAA TTG GTT ACT CAA GAA ATG 5915 Gly Asn Ser 1715 ile Leu Val Ala Lys 1720 Leu Val Thr Gin Glu 1725 Met TTC CAA AAT ATT GAT AAG AAA ATT GAA AGT CAG AGA ATT ATG 5957 Phe Gin Asn Ile 1730 Asp Lys Lys Ile Glu Ser 1735 Gin Arg ile Met 1740 AAA GTG GAG TTT ACT CAG TGT TCA ATG AAT GTG GTC TCC AAA 5999 Lys Vai GlU Phe Thr 1745 Gin Cys Ser Met Asn 1750 Val Val ser Lys 1755 ACG CTT TTT AGA AAG AGT CCC ATT TAT CAT CAC ATT GAT AAA 6041 íhc Leu Phe Arg Lys ser 1760 pro lie Tyr His Hls 1765 Ile Asp Lys ACC ATG ATT AAT TTT CCT GCA GCT ATG CCC TTT TCT AAA GCT 6083 Thr Met 1770 Ile Asn Phe Pro Ala 1775 Ala Met Pro Phe Ser 1780 Lys Ala GAA ATT GAT CCA ATG GCT GTG ATG TTA TCT AAG TAT TCA TTA 6125 GlU Ile Asp 1785 Pro Met Ala Val Met 1790 Leu ser Lys Tyr Ser 1795 Leu CCT ATT GTA GAA GAA CCA GAG GAT TAT AAA GAG GCT TCA ATT 6167 Pro Ile Vai GlU 1800 Glu Pro Glu Asp Tyr Lys 1805 GlU Ala Ser Ile 1810 TTT TAT CAA AAT AAA ATA GTG GGT AAG ACT CAG TTA GTT GAT 6209 Phe Tyr Gin Asn Lys 1815 Ile val Gly Lys Thr 1820 Gin Leu val Asp 1825 GAT TTT TTA GAT CTT GAT ATG GCC ATT ACA GGG GCC CCA GGA 6251 Asp Phe Leu Asp Leu Asp 1830 Met Ala Ile Thr Gly 1835 Ala Pro Gly 40 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT ATT GAT GCT ATC AAC ATG GAT TCA TCT CCT GGA TTT CCT TAT- 6293 Ile Asp Ala 1840 . Ile Asn Met Asp 1845 Ser. Ser Pro Gly Phe 1850 Pro Tyr GTC CAG GAG AAG TTG ACC AAA AGA GAT TTA ATT TGG TTG GAT 6335 Vai Gin Glu 1855 Lys Leu Thr Lys Arg 1860 Asp Leu Ile Trp Leu 1865 Asp GAA AAT GGT TTA TTG CTG GGA GTT CAT CCA AGA TTG GCT CAG 6377 Glu Asn Gly Leu 1870 Leu Leu Gly Vai His 1875 Pro Arg Leu Ala Gin 1880 AGA ATC TTA TTC AAT ACT GTC ATG ATG GAA AAT TGT TCT GAT 6419 Arg tle Leu Phe Asn 1885 Thr Vai Met Met Glu 1890 Asn Cys Ser Asp 1895 TTG GAT GTT GTT TTT ACA ACC TGT CCA AAA GAT GAA TTG AGA 6461 Leu Asp Vai Vai Phe Thr 1900 Thr cys Pro Lys Asp 1905 Glu Leu Arg CCA TTA GAG AAA GTG TTG GAA TCA AAA ACA AGA GCT ATT GAT 6503 Pro Leu 1910 Glu Lye Vai Leu Glu 1915 Ser Lys Thr Arg Ala 1920 Ile Asp GCT TGT CCT CTG GAT TAC TCA ATT TTG TGC CGA ATG TAT TGG 6545 Ala cys Pro 1925 Leu Asp Tyr Ser Ile 1930 Leu cys Arg Met Tyr 1935 Trp GGT CCA GCT ATT AGT TAT TTT CAT TTG AAT CCA GGT TTC CAT 6587 Glyl Pro Ala Ile 1940 Ser Tyr Phe His Leu 1945 Asn Pro Gly Phe His 1950 ACA GGT GTT GCT ATT GGC ATA GAT CCT GAT AGA CAG TGG GAT 6629 Thr Gly Vai Ala ile 1955 Gly Ile Asp Pro Asp 1960 Arg Gin Trp Asp 1965 GAA TTA TTT AAA ACA ATG ATA AGA TTC CCA GAT GTT GGT CTT 6671 GlU Leu Phe Lys Thr Met 1970 lie Arg Phe Gly Asp 1975 Vai Gly Leu GAT TTA GAT TTC TCT GCT TTT GAT GCT AGT CTT AGT CCA TTT 6713 Asp Leu 1980 Asp Phe Ser Ala Phe 1985 Asp Ala Ser Leu Ser 1990 Pro Phe ATG ATT AGA GAA GCA GGT AGA ATC ATG AGT GAA CTA .TCT GGA 6755 Met Ile Arg 1995 Glu Ala Gly Arg Ile 2000 Met Ser Glu Leu Ser 2005 Gly ACT CCA TCC CAT TTT GGC ACA GCT CTT ATC AAT ACT ATC ATT 6797 Thr Pro Ser Hls 2010 Phe Gly Thr Ala Leu 2015 Ile Asn Thr Ile Ile 2020 41 67103

ΕΡ 0666 751 /PT TAT TCC AAG CAT TTG CTG TAT AAC TGT TGT TAC CAT GTC TGT 6839 Tyr Ser Lys His Leu 2025 Leu Tyr Asn Cys cys 2030 Tyr His val cys 2035 GGT TCA ATG ccc TCT GGG TCT CCT TGT ACA GCT TTG CTA AAT 6881 Gly Ser Met Pro Ser Gly 2040 Ser Pro Cys Thr Ala 2045 Leu Leu Asn TCA ATT ATT AAT AAT GTC AAT TTG TAT TAT GTG TTT TCC AAG 6923 Ser Ile 2050 Ile Asn Asn Val Asn 2055 Leu Tyr Tyr Val Phe 2060 Ser Lys ATA TTT GGA AAG TCT CCA GTT TTC TTT TGT CAG GCT TTG AAG 6965 Ile Phe Gly 2065 Lys Ser Pro Val Phe 2070 Phe cys Gin Ala Leu 2073 Lys ATT CTC TGT TAT GGA GAT GAT GTT TTA ATA GTT TTC TCT CGA 7007 Ile Leu Cys Tyr 2080 Gly ASp Asp Val Leu 2085 Ile val Phe Ser Arg 2090 GAT GTT CAG ATT GAT AAT CTT GAT TTG ATT GGA CAA AAA ATT 7049 Asp Vai «ln Ile Asp 2095 Asn Leu Asp Leu Ile 2100 Gly Gin Lys Ile 2105. GTA GAT GAG TTT AAG AAA CTT GGC ATG ACA GCT ACT TCT GCT 7091 Vai Asp Glu Phe Lys Lys 2110 Leu Gly Met Thr Ala 2115 Thr Ser Ala „GAC AAG AAT GTA CCT CAÇ CTG AAA CCA GTT TCG GAA TTG ACT 7133 Asp Lys 212*0 Asn vai pro Gin Leu 2125 Lys pro Val Ser Glu 2130 Leu Thr TTT CTC AAA AGA TCT TTC AAT TTG GTA GAG GAT AGA ATT AGA 7175 Phe Leu Lys Arg 2135 Ser Phe Asn Leu 2140 Val GlU ASp Arg Ile 2145 Arg CCT CCA ATT TCC GAA AAA ACA ATT TGG TCT TTA ATA GCA TGG 7217 Pro Ala Ile Ser 2150 GlU Lys Thr Ile Trp 2155 Ser Leu Ile Ala Trp 2160 CAG AGA AGT AAC GCT GAG TTT GAG CAG AAT TTA GAA AAT GCT 7259 Gin Arg Ser Asn Ala 2165 Glu Phe Glu Gin Asn 2170 Leu Glu Asn Ala 2175 CAG TGG TTT GCT TTT ATG CAT GGC TAT GAG TTT TAT CAG AAA 7301 Gin Trp Phe Ala Phe Met 2180 His Gly Tyr Glu Phe 2185 Tyr Gin Lys TTT TAT TAT TTT GTT CAG TCC TGT TTG GAG AAA GAG ATG ATA 7343 Phe Tyr 2190 Tyr Phe val Gin Ser 2195 cys Leu Glu Lys Glu 2200 Met Ile

87103ΕΡ 0666 751/PT42 GAA TAC AGA CTT AAA Glu Tyr Arg Leu Lys 2205 TCT TAT GAT TGG TGG AGA ATG AGA TTT Ser Tyr Asp Trp Trp Arg «et Arg Phe 2210 2215 TAT GAC CAG TGT TTC ATT TGT GAC CTT TCA TGATTTGTTT Tyr Asp Gin Cys Phe Ile Cys Asp Leu Ser 2220 2225

7385 7425 AAACAAATTT TCTTAAAATT TCTGAGGTTT GTTTATTTCT TTTATCAGTA 7475 AATAAAAAAA AAAAAAAA 7493 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2227 aminoácidos (B) TIPO: aminoáddo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met 1 Asn Met Ser Arg 5 Gin Gly Ile Phe Gin 10 Thr Vai Gly Ser Gly 15 Leu Asp. His Ile Leu 20 Ser Leu Ala Asp He '25 Glu Glu Glu Gin Met 30 Ile Gin Ser Vai Asp 35 Arg Thr Ala Vai Thr 40 Gly Ala Ser Tyr Phe 45 Thr Ser Vai Asp Gin 50 Ser Ser Vai His Thr 55 Ala Glu Vai Gly Ser 60 HÍS Gin Vai Glu Pro 65 Leu Arg Thr Ser Vai 70 Asp Lys Pro Gly Ser 75 Lys Lys Thr Gin Gly 80 Glu Lys Phe Phe Leu 85 Ile His Ser Ala Asp 90 Trp Leu Thr Thr His 95 Ala Leu Phe His Glu 100 Vai Ala Lys Leu Asp 105 Vai Vai Lys Leu Leu 110 Tyr Asn Glu Gin Phe 115 Ala Vai Gin Gly Leu 120 Leu Arg Tyr His Thr Tyr 125 Ala Arg Phe Gly 130 Ile Glu Ile Gin vai 135 Gin Ile Asn Pro Thr 140 Pro Phe Gin Gin

87103

ΕΡ 0 666 751 /PT 43

Giy 145 Gly Leu Ile Cys Ala 150 Met val Pro Gly Asp 155 Gin ser Tyr Gly Ser 160 Ιΐβ Ala ser Leu Thr 165 val Tyr Pro His Gly 170 Leu Leu Asn cys Asn 175 Ile Asn Asn Vai val 180 Arg Ile Lys Val Pro Phe 185 Ile Tyr Thr Arg 190 Gly Ala Tyr His Phe 195 Lys Asp Pro Gin Tyr 200 Pro Val Trp Glu Leu 205 thr lie Arg Vai Trp 210 Ser Glu Leu Asn Ile 215 Gly Thr Gly Thr Ser 220 Ala Tyr Thr Ser Leu 225 Asn Vai Leu Ala Arg 230 Phe Thr Asp Leu Glu 235 Leu His Gly Leu Thr 240 Pro Leu Ser Thr Gin 245 Met Met Arg Asn Glu 250 Phe Arg Val Ser Thr 255 Thr Glu Asn Vai val 260 Asn Leu Ser Asn Tyr Glu 265 Asp Ala Arg Ala 270 Lys Met ser Phe Ala 275 Leu Asp Gin Glu Asp 280 Trp Lys Ser Asp Pro 285 Ser Gin Gly Gly Gly 290 Ile Lys Ile Thr His 295 Phe Thr Thr Trp Thr 300 Ser Ile pro Thr Leu 305 Ala Ala Gin Phe Pro 310 Phe Asn Ala Ser Asp 315 Ser val Gly Gin Gin 320 Zle Lys Vai Ile Pro 325 Val Asp Pro Tyr Phe 330 Phe Gin Met Thr Asn 335 Thr Asn Pro Asp Gin 340 Lys Cys Ile Thr Ala Leu 345 Ala Ser Ile Cys 350 Gin Met Phe Cys Phe 355 Trp Arg Gly Asp Leu 360 Val Phe Asp Phe Gin 365 Val Phe Pro Thr Lys 370 Tyr His Ser Gly Arg 375 Leu Leu Phe cys Phe 380 Val Pro Gly Asn Glu 385 Leu Ile Asp Val Ser 390 Gly Ile Thr Leu Lys 395 Gin Ala Thr Thr Ala 400 Pro Cys Ala Val Met 4 05 Asp Ile Thr Gly Val 410 Gin Ser Thr Leu Arg 415 Phe

87103

ΕΡ 0 666 751/PT 44

Arg Vai Pro Trp 420 Ile Ser Asp Thr Pro 425 Tyr Arg Val Asn Arg 430 Tyr Thr Lys Ser Ala 435 His Gin Lys Gly Glu 440 Tyr Thr Ala Ile Gly 445 Lys Leu Ile vai Tyr 450 cys Tyr Asn Arg Leu 455 Thr Ser Pro ser Asn 460 Val Ala Ser His Vai Arg 465 Vai Asn Vai Tyr 470 Leu Ser Ala Ile Asn 475 Leu Glu Cys Phe Ala 480 Pro Leu Tyr His Ala 485 Met Asp Val Thr Thr 490 Glu Val Gly Asp Asp 495 Ser Gly Gly Phe Ser 500 Thr Thr Val Ser Thr 505 Glu Gin Asn Val Pro 510 Asp Pro Gin Vai Gly 515 Ile Thr Thr Met Lys 520 Asp Leu Lys Gly Lys 525 Ala Asn Arg Gly Lys 530 Met Asp Vai Ser Gly 535 Val Gin Ala Pro Val 540 Gly Ala Ile Thr Thr Ile 545 Glu Asp Pro Val 550 Leu Ala Lys Lys Val 555 Pro Glu Thr Phe Pro 560 Glu Leu Lys Pro Gly 565 Glu Ser Arg His Thr 570 Ser Asp His Met Ser 575 Ile Tyr Lys Phe Met 580 Gly Arg ser His Phe 585 Leu cys Thr Phe Thr 590 Phe Asn Ser Asn Asn 595 Lys GlU Tyr Thr Phe 600 Pro Ile Thr Leu ser 605 Ser Thr Ser Asn Pro 610 Pro His Gly Leu Pro 615 Ser Thr Leu Arg Trp 620 Phe Phe Asn Leu Phe Gin 625 Leu Tyr Arg Gly 630 Pro Leu Asp Leu Thr 635 Ile Ile Ile Thr Gly 640 Ala Thr Asp Vai Asp 645 Gly Met Ala Trp Phe 650 Thr Pro Val Gly Leu 655 Ala Vai Asp Thr Pro 660 Trp Val GlU Lys Glu 665 Ser Ala Leu Ser Ile 670 Asp Tyr

Lys Thr Ala Leu Gly Ala Vai Arg phe Asn Thr Arg Arg Thr Gly Asn 675 680 685

07103 ΕΡ 0 666 761 /PT 45

Ile Gin 690 Ile Arg Leu Pro Trp 695 Tyr Ser Tyr Leu Tyr 700 Ala Vai Ser Gly Ala 705 Leu Asp Gly Leu Gly 710 Asp Lys Thr Asp Ser 715 Thr Phe Gly Leu Val 720 Ser Ile Gin Ile Ala 725 Asn Tyr Asn HÍS Ser 730 Asp GlU Tyr Leu Ser 735 Phe Ser Cys Tyr Leu 740 Ser Vai Thr Glu Gin 745 Ser Glu Phe Tyr Phe 750 Pro Arg Ala Pro Leu 755 Asn Ser Asn Ala Met 760 Leu Ser Thr Glu Ser 765 Met Met Ser Arg Ile 770 Ala Ala Gly Asp Leu 775 Glu Ser Ser Vai Asp 780 Asp Pro Arg Ser GlU 785 Glu Asp Lys Arg Phe 790 Glu Ser Eis Ile Glu 795 cys Arg Lys Pro Tyr 800 Lys Glu Leu Arg Leu 805 Glu Vai Gly Lys Gin 810 Arg Leu Lys Tyr Ala 815 Gin Glu Glu Leu Ser 820 Asn Glu Vai Leu pro 825 Pro Pro Arg Lys Met 830 Lys Gly Leu Phe Ser 835 Gin Ala Lys Ile Ser 840 Leu Phe Tyr Thr Glu 845 Glu Eis GlU Ile Hei: 850 Lys Phe ser Trp Arg 855 Gly Vai Thr Ala Asp 860 Thr Arg Ala Leu Arg 885 Arg Phe Gly Phe Ser 870 Leu Ala Ala Gly Arg 875 ser Vai Trp Thr Leu 880 Glu Hat Asp Ala Gly 885 Vai Leu Thr Gly Arg 890 Leu Ile Arg Leu Asn 895 Asp Glu Lys Trp Thr 900 Glu Met Lys Asp Asp 905 Lys Ile Vai Ser Leu 910 Ile GlU Lys Phe Thr 915 Ser Asn Lys Tyr Trp 920 Ser Lys Vai Asn Phe 925 Pro HÍS Gly Met Leu 930 Asp Leu Glu Glu Ile 935 Ala Ala Asn Ser Lys 940 Asp Phe Pro Asn Met 945 Ser Glu Thr Asp Leu 950 Cys Phe Leu Leu HÍS 955 Trp Leu Asn Pro Lys 960

87103 ΕΡ 0 666 751/PT 46 Lys Ile Asn Leu Ala Asp Arg Met Leu Gly Leu. Ser Gly Val Gin Glu 965 970 975 Ile Lys GlU Gin Gly Vai Gly Leu Ile Ala G1U cys Arg Thr Phe Leu 980 985 990 Asp Ser Ile Ala Gly Thr Leu Lys Ser Met Met Phe Gly Phe His His 995 1000 1005 Ser Val Thr vai Glu Ile Ile Asn Thr Vai Leu Cys Phe Val Lys ser loio 1015 1020 Gly Ile Leu Leu Tyr Vai Ile Gin Gin Leu Asn Gin Asp Glu His Ser 1025 1030 1035 1040 Ris Ile Ile Gly Leu Leu Arg Vai Met Asn Tyr Ala Asp Ile Gly Cys 1045 1050 1055 Ser Vai Ile Ser Cys Gly Lys Val Phe Ser Lys Met Leu Glu Thr Val 1060 1065 1070 Phe Asn Trp Gin Met Asp Ser Arg Met Met Glu Leu Arg Thr Gin Ser 1075 1080 1085 Phe Ser Asn Trp Leu Arg Asp Ile Cys ser Gly Ile Thr Ile Phe Lys 1090 1095 1100 Asn Phe Lys Asp Ala ile Tyr Trp Leu Tyr Thr Lys Leu Lys Asp Phe 1105 1110 1115 1120 Tyr Glu vai Asn Tyr Gly Lys Lys Lys Asp xie Leu Asn Ile Leu Lys 1125 1130 1135 Asp Asn Gin Gin Lys Ile Glu Lys Ala Ile Glu Glu Ala Asp Glu Phe 1140 1145 1150 Cys Ile Leu Gin Ile Gin Asp Val Glu Lys Phe Glu Gin Tyr Gin Lys 1155 1160 1165 Gly Vai Asp Leu Ile Gin Lys Leu Arg Thr Val His Ser Met Ala Gin 1170 1175 1180 Vai Asp Pro Asn Leu Het Val His Leu Ser Pro Leu Arg Asp Cys Ile 1185 1190 1195 1200 Ala Arg Vai His Gin Lys Leu Lys Aen Leu Gly Ser Ile Asn Gin Ala 1205 1210 1215 Met Vai Thr Arg Cys Glu Pro Val Val Cys Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg 1220 1225 1230

47 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT

Gly Gly Gly Lys Ser Leu Thr Ser Ile Ala Leu Ala Thr Lys Ile Cys 1235 1240 1245 Lys His Tyr Gly Vai Glu Pro Glu Lys Asn Ile Tyr Thr Lys Pro Val 1250 1255 1260 Ala Ser Asp Tyr Trp Asp Gly Tyr Ser Gly Gin Leu Val Cys lie Ile 1265 1270 1275 1280 Asp Asp Ile Gly Gin Asn Thr Thr Asp Glu Asp Trp Ser Asp Phe Cys 1285 1290 1295 Gin Leu Vai Ser Gly Cys Pro Met Arg Leu Asn Met Ala ser Leu Glu 1300 1305 1310 Glu Lys Gly Arg HÍS Phe Ser Ser Pro Phe Ile Ile Ala Thr Ser Asn 1315 1320 1325 Trp Ser Asn Pro Ser Pro Lys Thr Val Tyr Val Lys Glu Ala Ile Asp 1330 1335 1340 Arg Arg Leu His Phe Lys Val Glu Val Lys Pro Ala Ser Phe Phe Lys 1345 1350 1355 1360 Asn Pro His Asn Asp Met Leu Asn Val Asn Leu Ala Lys Thr Asn Asp 1365 1370 1375 Ala Ile Lys Asp Met Ser Cys val Asp Leu Ile Met Asp Gly His Asn 1380 1385 1390 Vai' Ser Lau Met Asp Leu Leu Ser Ser Leu Val Met Thr Val Glu Ile 1395 1400 1405 Arg Lvs Gin Asn Met Thr Glu Phe Met Glu Leu Trp Ser Gin Gly Ile 1410 1415 1420 Ser Asp Asp Asp Asn Asp Ser Ala Val Ala Glu Phe Phe Gin Ser Phe 1425 1430 1435 1440 Pro Ser Gly Glu Pro Ser Asn Ser Lys Leu Ser Gly Phe Phe Gin ser 1445 1450 1455 Vai Thr Asn His Lys Trp Val Ala Val Gly Ala Ala Val Gly Ile Leu 1460 1465 1470 Gly Vai Leu Vai Gly Gly Trp Phe Val Tyr Lys His Phe Ser Arg Lys 1475 1480 1485

Glu Glu Glu Pro Ile Pro Ala Glu Gly Vai Tyr Hís Gly Val Thr Lys 1490 1495 1500 48 Θ7103 ΕΡ Ο 666 751 IPΤ

Pro Lys Gin Vai Ile Lys Leu Asp Ala Asp Pro Vai Glu Ser Gin Ser 1505 1510 1515 1520

Thr Leu Glu Ile Ala Giy Leu vai Arg Lys Asn Leu vai Oln phe Gly 1525 1530 1535

Vai Gly Glu Lys Asn Gly Cys Vai Arg Trp vai Met Asn Ala Leu Gly 1540 1545 1550 val Lys Asp Asp Trp Leu Leu Vai Pro ser His Ala Tyr Lys Phe Glu 1555 1560 1565

Lys Asp Tyr Glu Met Met Glu Phe Tyr Phe Asn Arg Gly Gly Thr Tyr 1570 1575 1580

Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Asn Val Val Ile Gin Ser Leu Asp Val Gly 1585 1590 1595 1600

Phe Gin Asp Val Val Leu Met Lys Val Pro Thr Ile Pro Lys Phe Arg 1605 1610 1615

Asp Ile Thr Gin His Phe Ile Lys Lys Gly Asp Val Pro Arg Ala Leu 1620 1625 1630

Asn Arg Leu Ala Thr Leu Val Thr Thr Val Asn Gly Thr Pro Met Leu 1635 1640 1645

Ile Ser Glu Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys Ala Thr Tyr Val His 1650 1655 1660

Lys' Lys Asn Asp Gly Thr Thr Val Asp Leu Thr Val Asp Gin Ala Trp 1665 1670 1675 1680

Arg Gly Lys Gly Glu Gly Leu Pro Gly Met Cys Gly Gly Ala Leu Val 1685 1690 1695

Ser Ser Asn Gin Ser Ile Gin Asn Ala Ile Leu Gly Ile His Val Ala 1700 1705 1710

Gly Gly Asn Ser Ile Leu Val Ala Lys Leu Val Thr Gin Glu Met Phe 1715 1720 1725

Gin Asn Ile Asp Lys Lys Ile Glu Ser Gin Arg Ile Met Lys Val Glu 1730 1735 1740

Phe Thr Gin Cys Ser Met Asn Val Val Ser Lys Thr Leu Phe Arg Lys 1745 1750 1755 1760

Ser Pro Ile Tyr His His Ile Asp Lys Thr Met Ile Asn Phe Pro Ala 1765 1770 1775 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT

49

Ala Met Pro Phe 1780 Ser Lys Ala Glu Ile 1785 Asp Pro Met Ala Val 1790 Met Leu Ser Lys Tyr Ser 1795 Leu Pro Ile Val Glu 1800 Glu Pro Glu Asp Tyr 1805 Lys Glu Ala Ser Ile 1810 Phe Tyr Gin Asn Lys 1815 Ile Val Gly Lys Thr 1820 Gin Leu Val Asp Asp 1623 Phe Leu Asp Leu Asp 1830 Met Ala Ile Thr Gly 1835 Ala Pro Gly Ile 1840 Asp Ala Ile Asn Met Asp 1845 ser ser Pro Gly Phe 1850 Pro Tyr Val Gin Glu 1855 Lys Leu Thr Lys Arg 1860 Asp Leu Ile Trp Leu 1865 Asp Glu Asn Gly Leu Leu 1870 Leu Gly Val His 1875 Pro Arg Leu Ala Gin 1880 Arg Ile Leu Phe Asn 1885 Thr Val Met Met Glu 1890 Asn cys Ser Asp Leu 1895 Asp Val Val Phe Thr 1900 Thr Cys Pro Lys Asp 1905 Glu Leu Arg Pro Leu 1910 Glu Lys Val Leu Glu 1915 Ser Lys Thr Arg 1920 Ala Ile Asp Ala Cys Pro 1925 Leu Asp Tyr Ser Ile 1930 Leu Cys Arg Met Tyr 1935 Trp' Gly Pro Ala Ile 1940 Ser Tyr Phe His Leu 1945 Asn Pro Gly Phe Bis Thr 1950 Gly Vai Ala Ile 1955 Gly Ile Asp Pro Asp 1960 Arg Gin Trp Asp Glu 1965 Leu Phe Lys Thr Met 1970 Ile Arg Phe Gly Asp 1975 Val Gly Leu Asp Leu 1980 Asp Phe Ser Ala Phe Asp 1985 Ala Ser Leu Ser 1990 Pro Phe Met Ile Arg 1995 Glu Ala Gly Arg 2000 Ile Met Ser Glu Leu Ser Gly 2005 Thr Pro Ser His 2010 Phe Gly Thr Ala Leu 2015 Ile Asn Thr lie Ile 2020 Tyr Sar Lys His Leu 2025 Leu Tyr Asn Cys cys Tyr 2030 His Vai Cys Gly Ser Met Pro 2035 Ser Gly Ser Pro cys 2040 Thr Ala 2045 Leu Leu 50 87103

ΕΡ 0 666 751 /PT

Asn Ser Ile Ile Asn Asn vai Asn Leu Tyr Tyr Vai Phe 2050 2055 2060 Phe Gly Lys ser Pro Vai Phe Phe cys Gin Ala Leu Lys 2065 2070 2075 Tyr Gly Asp Asp Vai Leu Ile Vai Phe Ser Arg Asp vai 2085 2090 Asn Leu Asp Leu Ile Gly Gin Lys Ile Vai Asp Glu Phe 2100 2105 Gly Met Thr Ala Thr Ser Ala Asp Lys Asn Vai Pro Gin

Ser Lys He

Ile Leu cys 2080

Gin Ile Asp 2095

Lys Lys Leu 2110

Leu Lys Pro 2115 2120 2125

Vai Ser Glu Leu Thr Phe Leu Lys Arg ser Phe Asn Leu Vai Glu Asp 2130 2135 2140

Arg lie Arg Pro Ala Ile ser Glu Lys Thr Zle Trp ser Leu ile Ala 2145 2150 2155 2160

Trp Gin Arg Ser Asn Ala Glu Phe Glu Gin Asn Leu Glu Asn Ala. Gin 2165 2170 2175

Trp Phe Ala Phe Met His Gly Tyr Glu Phe Tyr Gin Lys Phe Tyr Tyr 2180 2185 2190

Lisboa,

Por SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A. e GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA,representado pelo THE SECR. OF THE DEPT. OF HEALTH AND HUMAN SERVICES AND HIS SUCCESSORS - O AGENTE OFICIAL -

ÓNIO JOÃO ΝΗΔ FERREIRA

Of, Pr. Ind.

Rua das Flores, 74-4,° SSOO-195 LlSROA

Claims

8/103 ΕΡ 0 666 751 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Mutante da estirpe HM-175 do vírus da hepatite A, possuindo o ADN de SEQIDNO:1, em que pelo menos as posições de nucleótido 591 e 687 estão alteradas para guanina, a 646 está alterada para adenina e a 669 está alterada para timina.
2. Mutante de acordo com a reivindicação 1 em que adicionalmente os nucleótidos nas posições 4418 e 4643 estão alteradas para timina.
3. Mutante de acordo com a reivindicação 1 e 2, em que pelo menos as posições de nucleótido 3934 e 5145 estão alteradas para guanina, a 5745 está alterada para timina e a 6908 está alterada para citosina.
4. Mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 possuindo as características de identificação da estirpe HAV 4380, depositada no CNCM com o número de acesso 1-936.
5. Estirpe HAV 4380 de acordo com a reivindicação 4 adaptada para crescer na linha celular de fibroblastos humanos, MRC-5, por incubação de 32°C a 35°C, e capaz de crescer a 37°C em células primárias de rim de macaco verde africano (células AGMK).
6. Vacina de vírus da hepatite A compreendendo um mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Método de preparação de um mutante da estirpe HM-175 do vírus da hepatite A possuindo o ADN de SEQIDN0:1, compreendendo o passo de modificação da referida estirpe do vírus da hepatite A, em que pelo menos as posições de nucleótido 591 e 687 no ADN de SEQ ID NO:1 estão alteradas para guanina, a 646 está alterada para adenina e a 669 está alterada para timina.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que adicionalmente os nucleótidos nas posições 4418 e 4643 estão alteradas para timina. 87103 ΕΡ Ο 666 751 /ργ 2/2
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que pelo menos as posições de nucleótido 3934 e 5145 estão alteradas para guanina, a 5745 está alterada para timina e a 6908 está alterada para citosina.
10. Utilização de um mutante do vírus HAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de uma vacina para a imunização de um humano ou primata contra a hepatite A.
11. Molécula de ácido nucleico que codifica o mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5. Lisboa, Por SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A. e GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA,representado pelo THE SECR. OF THE DEPT. OF HEALTH AND HUMAN SERVICES AND HIS SUCCESSORS - O AGENTE OFICIAL -

-7. '"'"visioJOÃO 04 ÇUNHA FERRE1RA %- O/. Pr. Ind. Rua Flores, 74.4,“ l300-195 LISBOA