JPH0923880A - 高度に弱毒化された組換え日本脳炎ウイルスを産生する感染性日本脳炎ウイルスｃＤＮＡクローンおよびそのワクチン - Google Patents
高度に弱毒化された組換え日本脳炎ウイルスを産生する感染性日本脳炎ウイルスｃＤＮＡクローンおよびそのワクチンInfo
- Publication number
- JPH0923880A JPH0923880A JP8116062A JP11606296A JPH0923880A JP H0923880 A JPH0923880 A JP H0923880A JP 8116062 A JP8116062 A JP 8116062A JP 11606296 A JP11606296 A JP 11606296A JP H0923880 A JPH0923880 A JP H0923880A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- jev
- virus
- amino acid
- mutant
- encephalitis virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 142
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title abstract description 43
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 title abstract description 6
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 title abstract description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 14
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title description 12
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims abstract description 167
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 11
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims abstract 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 45
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 28
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 19
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 10
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 7
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 claims description 5
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 7
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 229960003239 encephalitis vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 78
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000037404 Central European encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101710083262 Ectin Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000283986 Lepus Species 0.000 description 1
- 241000343235 Maso Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008457 Neurologic Manifestations Diseases 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 241001529801 Tick-borne flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 208000025222 central nervous system infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004883 computer application Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000004836 empirical method Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 244000000042 obligate parasite Species 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229960001515 yellow fever vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物においてＪＥＶに対する免疫反応を刺激
するのに適切な弱毒化日本脳炎ウイルスを提供するこ
と。 【解決手段】 エンベロープタンパクの１３８位での酸
性アミノ酸の塩基性アミノ酸への置換によって、対応す
る野生型日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）と区別される単離
された突然変異日本脳炎ウイルスであって、該酸性アミ
ノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、該塩
基性アミノ酸がリシンまたはアルギニンである突然変異
日本脳炎ウイルス。
するのに適切な弱毒化日本脳炎ウイルスを提供するこ
と。 【解決手段】 エンベロープタンパクの１３８位での酸
性アミノ酸の塩基性アミノ酸への置換によって、対応す
る野生型日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）と区別される単離
された突然変異日本脳炎ウイルスであって、該酸性アミ
ノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、該塩
基性アミノ酸がリシンまたはアルギニンである突然変異
日本脳炎ウイルス。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンベロープタン
パクにおいて１個のアミノ酸突然変異を含有する組換え
弱毒化日本脳炎ウイルスに関する。特に、本発明は、か
かる突然変異日本脳炎ウイルスのゲノムをコードする単
離されたＤＮＡ分子に関する。本発明は、また、培養動
物細胞からの突然変異日本脳炎ウイルスの産生方法に関
する。さらにまた、本発明は、ビルレント日本脳炎ウイ
ルスからの保護を与えるための医薬組成物に関する。
パクにおいて１個のアミノ酸突然変異を含有する組換え
弱毒化日本脳炎ウイルスに関する。特に、本発明は、か
かる突然変異日本脳炎ウイルスのゲノムをコードする単
離されたＤＮＡ分子に関する。本発明は、また、培養動
物細胞からの突然変異日本脳炎ウイルスの産生方法に関
する。さらにまた、本発明は、ビルレント日本脳炎ウイ
ルスからの保護を与えるための医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）は、重篤な
脳炎性疾患および神経性疾患発現を誘発し、アジアで
は、毎年の急性の致命的な脳炎の多くのケースの原因で
ある、蚊媒介性（mosquito-borne）フラビウイルスであ
る。典型的には、ＪＥＶ感染の症候は、４〜２０日の潜
伏期間の後に出現する。患者は、高熱、麻痺および昏睡
を含む重篤な中枢神経系感染の証拠を持って病院に到着
することもある。有効な治療はない。ホウク（Ｈoke）
ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージ
ズ（Ｊ.Ｉnfect.Ｄis.）１６５：６３１（１９９２）。
入院患者の約３分の１は、１０日以内に死亡するであろ
うし、残りの３分の１は、重篤な永久神経精神病的欠損
（permanent neuropsychiatric deficit）を有したまま
回復するであろう。毎年１０,０００件以上のＪＥＶ誘
発性死亡が公式に報告されているが、実数は、それより
も非常に高いと推定される。例えば、バーク（Ｂurke）
らの「ジャパニーズ・エンセファライティス」（Ｊapan
ese encephalitis）［ジ・アルボバイラシズ：エピディ
ーミオロジー・アンド・エコロジー（THE ARBOVIRUSES:
EPIDEMIOLOGY AND ECOLOGY）、第３巻、（モナス・ティ
・ピー（Ｍonath ＴＰ）編、第６３〜９２頁（ＣＲＣプ
レス１９８８）］を参照。
脳炎性疾患および神経性疾患発現を誘発し、アジアで
は、毎年の急性の致命的な脳炎の多くのケースの原因で
ある、蚊媒介性（mosquito-borne）フラビウイルスであ
る。典型的には、ＪＥＶ感染の症候は、４〜２０日の潜
伏期間の後に出現する。患者は、高熱、麻痺および昏睡
を含む重篤な中枢神経系感染の証拠を持って病院に到着
することもある。有効な治療はない。ホウク（Ｈoke）
ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージ
ズ（Ｊ.Ｉnfect.Ｄis.）１６５：６３１（１９９２）。
入院患者の約３分の１は、１０日以内に死亡するであろ
うし、残りの３分の１は、重篤な永久神経精神病的欠損
（permanent neuropsychiatric deficit）を有したまま
回復するであろう。毎年１０,０００件以上のＪＥＶ誘
発性死亡が公式に報告されているが、実数は、それより
も非常に高いと推定される。例えば、バーク（Ｂurke）
らの「ジャパニーズ・エンセファライティス」（Ｊapan
ese encephalitis）［ジ・アルボバイラシズ：エピディ
ーミオロジー・アンド・エコロジー（THE ARBOVIRUSES:
EPIDEMIOLOGY AND ECOLOGY）、第３巻、（モナス・ティ
・ピー（Ｍonath ＴＰ）編、第６３〜９２頁（ＣＲＣプ
レス１９８８）］を参照。
【０００３】ＪＥＶゲノムは、３個の構造タンパク（キ
ャプシドタンパク、膜タンパクおよびエンベロープタン
パク）ならびに７個の非構造タンパク（ＮＳ１、ＮＳ２
Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ
５）を含む１０個のタンパクをコードする約１１ｋｂの
一本鎖ＲＮＡ分子である。スミヨシ（Ｓumiyoshi）ら、
バイロロジー（Ｖirology）、１６１：４７９（１９８
７)。ビルレントＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９８２、ナカ
ヤマ（Ｎakayama）、ベイジング（Ｂeijing）およびＳ
Ａ14、ならびに弱毒化菌株ＳＡ14−１４−２のゲノム
は、分子レベルで分析され、類似の構造機構が明らかに
された。マカダ（ＭcＡda）ら、バイロロジー（Ｖirolo
gy）１５８：３４８（１９８７)；ハシモト（Ｈashimot
o）ら、バイラス・ジーンズ（Ｖirus Ｇenes）１：３０
５（１９９０）；ニタヤファン（Ｎitayaphan）ら、バ
イロロジー（Ｖirology）１７７：５４１（１９９
０）。しかも、個々のＪＥＶタンパク間のビルレンスお
よび疾患との関係は、まだ、あまり理解されていない。
ャプシドタンパク、膜タンパクおよびエンベロープタン
パク）ならびに７個の非構造タンパク（ＮＳ１、ＮＳ２
Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ
５）を含む１０個のタンパクをコードする約１１ｋｂの
一本鎖ＲＮＡ分子である。スミヨシ（Ｓumiyoshi）ら、
バイロロジー（Ｖirology）、１６１：４７９（１９８
７)。ビルレントＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９８２、ナカ
ヤマ（Ｎakayama）、ベイジング（Ｂeijing）およびＳ
Ａ14、ならびに弱毒化菌株ＳＡ14−１４−２のゲノム
は、分子レベルで分析され、類似の構造機構が明らかに
された。マカダ（ＭcＡda）ら、バイロロジー（Ｖirolo
gy）１５８：３４８（１９８７)；ハシモト（Ｈashimot
o）ら、バイラス・ジーンズ（Ｖirus Ｇenes）１：３０
５（１９９０）；ニタヤファン（Ｎitayaphan）ら、バ
イロロジー（Ｖirology）１７７：５４１（１９９
０）。しかも、個々のＪＥＶタンパク間のビルレンスお
よび疾患との関係は、まだ、あまり理解されていない。
【０００４】現在、３つのタイプのＪＥＶワクチンがあ
る：（１）ウイルスがホルマリン処理によって非感染性
にされるマウス脳または組織培養物中で増殖したウイル
スから得られるワクチン、（２）動物における一連の継
代接種によって弱毒化されたウイルスからなるワクチ
ン、および（３）フラビウイルスタンパクを発現する組
換えワクシニアベクターなどのベクターからなるワクチ
ン。しかしながら、ＪＥＶの公衆衛生学的な重要さにも
かかわらず、現在入手可能なワクチンは、種々の理由の
ために無効にされている。
る：（１）ウイルスがホルマリン処理によって非感染性
にされるマウス脳または組織培養物中で増殖したウイル
スから得られるワクチン、（２）動物における一連の継
代接種によって弱毒化されたウイルスからなるワクチ
ン、および（３）フラビウイルスタンパクを発現する組
換えワクシニアベクターなどのベクターからなるワクチ
ン。しかしながら、ＪＥＶの公衆衛生学的な重要さにも
かかわらず、現在入手可能なワクチンは、種々の理由の
ために無効にされている。
【０００５】ホルマリン不活化されたマウス脳由来のＪ
ＥＶワクチンは、第２次世界大戦の間に発明され、該ワ
クチンは、日本では２０年以上もの間使用されていた。
該ワクチンの使用は、日本におけるＪＥＶによる罹病率
および死亡率の両方の減少に関連していた。ホウク（Ｈ
oke）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・
メディシン（Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed.）３１９：６０８（１
９８８）。しかしながら、生活水準の改善がＪＥＶ病の
発病率の若干の減少の原因となっているかもしれない。
ＥＶワクチンは、第２次世界大戦の間に発明され、該ワ
クチンは、日本では２０年以上もの間使用されていた。
該ワクチンの使用は、日本におけるＪＥＶによる罹病率
および死亡率の両方の減少に関連していた。ホウク（Ｈ
oke）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・
メディシン（Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed.）３１９：６０８（１
９８８）。しかしながら、生活水準の改善がＪＥＶ病の
発病率の若干の減少の原因となっているかもしれない。
【０００６】不活化ワクチンに関連する問題は、ウイル
スを生きているマウス中で産生し、面倒な手法でマウス
から収穫し、精製し、ホルマリン処理により殺さなけれ
ばないという事実から生じる。ホルマリン処理したウイ
ルスは、受容者中では複製しないので、免疫化を成功さ
せるためには、多量のウイルス抗原およびワクチンの反
復投与が必要である。さらに、死菌ワクチンによる免疫
の効果が生ワクチンによって与えられる免疫性と同じく
らい長く永続することはめったにない。最後に、ネズミ
の抗原を除去するのに必要なものおよび不活化プロセス
の注意深いモニターリングに必要なものは、ワクチンの
生産コストを増加させる。したがって、不活化ワクチン
は、生産に費用がかかり、ＪＥＶが重要な問題であるほ
とんどの発展途上国には適していない。
スを生きているマウス中で産生し、面倒な手法でマウス
から収穫し、精製し、ホルマリン処理により殺さなけれ
ばないという事実から生じる。ホルマリン処理したウイ
ルスは、受容者中では複製しないので、免疫化を成功さ
せるためには、多量のウイルス抗原およびワクチンの反
復投与が必要である。さらに、死菌ワクチンによる免疫
の効果が生ワクチンによって与えられる免疫性と同じく
らい長く永続することはめったにない。最後に、ネズミ
の抗原を除去するのに必要なものおよび不活化プロセス
の注意深いモニターリングに必要なものは、ワクチンの
生産コストを増加させる。したがって、不活化ワクチン
は、生産に費用がかかり、ＪＥＶが重要な問題であるほ
とんどの発展途上国には適していない。
【０００７】弱毒化生ワクチンを開発するための実質的
な試みが行われてきた。そのうえ、これらの試みは、マ
ウスにおけるＪＥＶの一連の継代接種がヒトにおいて弱
毒化されたウイルスを生じるという期待によって動機づ
けられた。以下に説明するほとんどの将来有望なワクチ
ンは、ウイルスが多くの突然変異体を含むことが判明し
ており、これらの変化の影響が知られていないので、理
想的な候補ではない。
な試みが行われてきた。そのうえ、これらの試みは、マ
ウスにおけるＪＥＶの一連の継代接種がヒトにおいて弱
毒化されたウイルスを生じるという期待によって動機づ
けられた。以下に説明するほとんどの将来有望なワクチ
ンは、ウイルスが多くの突然変異体を含むことが判明し
ており、これらの変化の影響が知られていないので、理
想的な候補ではない。
【０００８】生の弱毒化ＪＥＶ菌株ＳＡ14−１４−２
は、細胞培養物および実験動物における一連の継代接種
によって経験的に産生された。弱毒化ウイルスＳＡ14−
１４−２およびその親ウイルス（ＳＡ14）のヌクレオチ
ド配列の比較により、弱毒化ウイルスが５７個のヌクレ
オチド置換を有しており、２４個のアミノ酸置換を生じ
ることが判明した。アイハラ（Ａihara）ら、バイラス
・ジーンズ（Ｖirus Ｇenes）５：９５（１９９１）。
しかしながら、親ウイルス自体のゲノムは、他の野生型
ＪＥＶのゲノムから非常に異なる。この観察により、親
から誘導されたいずれの菌株も種々のＪＥＶ菌株に暴露
された人を保護するのに適しているかについて疑問が生
じる。
は、細胞培養物および実験動物における一連の継代接種
によって経験的に産生された。弱毒化ウイルスＳＡ14−
１４−２およびその親ウイルス（ＳＡ14）のヌクレオチ
ド配列の比較により、弱毒化ウイルスが５７個のヌクレ
オチド置換を有しており、２４個のアミノ酸置換を生じ
ることが判明した。アイハラ（Ａihara）ら、バイラス
・ジーンズ（Ｖirus Ｇenes）５：９５（１９９１）。
しかしながら、親ウイルス自体のゲノムは、他の野生型
ＪＥＶのゲノムから非常に異なる。この観察により、親
から誘導されたいずれの菌株も種々のＪＥＶ菌株に暴露
された人を保護するのに適しているかについて疑問が生
じる。
【０００９】中国ではヒトにおける実地試験でＳＡ14−
１４−２ワクチンウイルスが使用された。ヒトにおける
血清変換（中和抗体）率は、６０％から９０％まで変わ
る。アオ（Ａo）ら、Ｃhinese Ｊ. Ｍicrobiol. and Ｉ
mmunol. ３：２４５（１９８１）。しかしながら、多重
ワクチン投与は、血清変換を誘発することを必要とし、
各投与は、高力価（約１０6ＰＦＵ）でなければならな
い。この方法では、ＳＡ14−１４−２ワクチンは、前記
の不活化ワクチンと同様である。さらにまた、２回の高
力価ワクチン投与による免疫化にもかかわらずワクチン
接種を受けた人における日本脳炎の発生が報告された。
１４−２ワクチンウイルスが使用された。ヒトにおける
血清変換（中和抗体）率は、６０％から９０％まで変わ
る。アオ（Ａo）ら、Ｃhinese Ｊ. Ｍicrobiol. and Ｉ
mmunol. ３：２４５（１９８１）。しかしながら、多重
ワクチン投与は、血清変換を誘発することを必要とし、
各投与は、高力価（約１０6ＰＦＵ）でなければならな
い。この方法では、ＳＡ14−１４−２ワクチンは、前記
の不活化ワクチンと同様である。さらにまた、２回の高
力価ワクチン投与による免疫化にもかかわらずワクチン
接種を受けた人における日本脳炎の発生が報告された。
【００１０】さらに、ＳＡ14−１４−２は、一次イヌ腎
臓細胞（ＰＣＫ）において継代接種された。エッケルズ
（Ｅckels）ら、ヴァクシーン（Ｖaccine）６：５１３
（１９８８）。得られたウイルス、ＳＡ−１４−１４−
２−ＰＣＫは、配列決定され、そのビルレンスマーカー
は、細胞培養物および実験動物において特徴付けられ
た。ニタヤファン（Ｎitayaphan）ら、バイロロジー
（Ｖirology）１７７：５４１（１９９０）；ハセ（Ｈa
se）ら、アーカイブス・オブ・バイロロジー（Ａrch.Ｖ
irol.）１３０：１３１（１９９３）。実験マウスにお
いて、種々の投与量および投与方針を用いたＳＡ１４−
１４−２−ＰＣＫによる免疫化は、血清中和抗体の存在
によって測定すると、低率の血清交換を誘発した。さら
にまた、ほとんど全ての免疫化された実験マウスは、免
疫用ワクチン投与量に関係なく、親ウイルスの大脳内攻
撃後に死亡した。
臓細胞（ＰＣＫ）において継代接種された。エッケルズ
（Ｅckels）ら、ヴァクシーン（Ｖaccine）６：５１３
（１９８８）。得られたウイルス、ＳＡ−１４−１４−
２−ＰＣＫは、配列決定され、そのビルレンスマーカー
は、細胞培養物および実験動物において特徴付けられ
た。ニタヤファン（Ｎitayaphan）ら、バイロロジー
（Ｖirology）１７７：５４１（１９９０）；ハセ（Ｈa
se）ら、アーカイブス・オブ・バイロロジー（Ａrch.Ｖ
irol.）１３０：１３１（１９９３）。実験マウスにお
いて、種々の投与量および投与方針を用いたＳＡ１４−
１４−２−ＰＣＫによる免疫化は、血清中和抗体の存在
によって測定すると、低率の血清交換を誘発した。さら
にまた、ほとんど全ての免疫化された実験マウスは、免
疫用ワクチン投与量に関係なく、親ウイルスの大脳内攻
撃後に死亡した。
【００１１】１９８０年代の中国では、ワクチン実験の
ためにＳＡ１４−１４−２−ＰＣＫウイルスも使用され
た。しかしながら、この実験は、ワクチン接種を受けた
人がＪＥＶ抗体を生じなかったので、失敗に終わった。
ＪＥＶ ＳＡ14−１４−２およびＰＣＫ誘導体による累
積結果は、弱毒化ウイルスが生ワクチンよりも不活化ワ
クチンのようにふるまうことを示した。
ためにＳＡ１４−１４−２−ＰＣＫウイルスも使用され
た。しかしながら、この実験は、ワクチン接種を受けた
人がＪＥＶ抗体を生じなかったので、失敗に終わった。
ＪＥＶ ＳＡ14−１４−２およびＰＣＫ誘導体による累
積結果は、弱毒化ウイルスが生ワクチンよりも不活化ワ
クチンのようにふるまうことを示した。
【００１２】ＪＥＶタンパクがキャリヤーによってまた
は組換えベクターによって宿主に投与されるいくつかの
候補ＪＥＶワクチンが生産された。今日まで、ほとんど
の将来有望なワクチンは、ＮＹＶＡＣと称されるワクシ
ニアウイルスから誘導された組換えウイルスを使用す
る。中和抗体は、ＪＥＶエンベロープタンパクをコード
するワクシニア−ＪＥＶ組換えウイルスを接種した実験
マウスにおいて検出された。接種マウスは、ビルレント
ウイルスによる腹腔内攻撃に対して保護されたが、中和
抗体力価および血清交換率は、死菌ワクチンによる免疫
化の後に観察されたものよりも低かった。さらにまた、
ＪＥＶに対する保護は、一部のみであった。ヤスダ（Ｙ
asuda）ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ.Ｖir
ology）６４：２７８８（１９９０）；メイソン（Ｍaso
n）ら、バイロロジー（Ｖirology）１８０：２９４（１
９９１）；ジャン（Ｊan）ら、アメリカン・ジャーナル
・オブ・トロピカル・メディシン・アンド・ハイジーン
（Ａm.Ｊ. of Ｔrop.Ｍed.＆ Ｈyg.）４８：４１２（１
９９３）。したがって、組換えベクターによる多重免疫
化は、致命的な攻撃から実験マウスを保護することを必
要とする。さらにまた、ＪＥＶエンベロープタンパクの
みを発現するベクターによる免疫化は、ＪＥＶ感染細胞
において活性的に発現されるＪＥＶタンパクの全てに応
答するために体液および細胞免疫系を刺激することはで
きない。
は組換えベクターによって宿主に投与されるいくつかの
候補ＪＥＶワクチンが生産された。今日まで、ほとんど
の将来有望なワクチンは、ＮＹＶＡＣと称されるワクシ
ニアウイルスから誘導された組換えウイルスを使用す
る。中和抗体は、ＪＥＶエンベロープタンパクをコード
するワクシニア−ＪＥＶ組換えウイルスを接種した実験
マウスにおいて検出された。接種マウスは、ビルレント
ウイルスによる腹腔内攻撃に対して保護されたが、中和
抗体力価および血清交換率は、死菌ワクチンによる免疫
化の後に観察されたものよりも低かった。さらにまた、
ＪＥＶに対する保護は、一部のみであった。ヤスダ（Ｙ
asuda）ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ.Ｖir
ology）６４：２７８８（１９９０）；メイソン（Ｍaso
n）ら、バイロロジー（Ｖirology）１８０：２９４（１
９９１）；ジャン（Ｊan）ら、アメリカン・ジャーナル
・オブ・トロピカル・メディシン・アンド・ハイジーン
（Ａm.Ｊ. of Ｔrop.Ｍed.＆ Ｈyg.）４８：４１２（１
９９３）。したがって、組換えベクターによる多重免疫
化は、致命的な攻撃から実験マウスを保護することを必
要とする。さらにまた、ＪＥＶエンベロープタンパクの
みを発現するベクターによる免疫化は、ＪＥＶ感染細胞
において活性的に発現されるＪＥＶタンパクの全てに応
答するために体液および細胞免疫系を刺激することはで
きない。
【００１３】要約すれば、弱毒化生ワクチンは、しばし
ば、弱毒化ワクチンが、（１）体液および細胞の両方の
応答に基づいて長い持続性免疫性を誘発し、（２）生産
にあまり費用がかからず、（３）通常、単回免疫化投与
のみを必要とするので、他の形態のワクチンよりも好ま
しい。他方、ビルレンスへのワクチン逆転の危険性は、
経験的に誘導される弱毒化生ワクチンによる不変的な問
題である。
ば、弱毒化ワクチンが、（１）体液および細胞の両方の
応答に基づいて長い持続性免疫性を誘発し、（２）生産
にあまり費用がかからず、（３）通常、単回免疫化投与
のみを必要とするので、他の形態のワクチンよりも好ま
しい。他方、ビルレンスへのワクチン逆転の危険性は、
経験的に誘導される弱毒化生ワクチンによる不変的な問
題である。
【００１４】したがって、神経系では複製せず、種々の
ＪＥＶタンパクに対する免疫応答を誘発する弱毒化ＪＥ
Ｖワクチンが必要とされている。さらにまた、弱毒化Ｊ
ＥＶのゲノムは、弱毒化表現型の分子決定子の存在を同
定することができ、最終ワクチン調製物において証明す
ることができるように完全に特徴付けられるべきであ
る。
ＪＥＶタンパクに対する免疫応答を誘発する弱毒化ＪＥ
Ｖワクチンが必要とされている。さらにまた、弱毒化Ｊ
ＥＶのゲノムは、弱毒化表現型の分子決定子の存在を同
定することができ、最終ワクチン調製物において証明す
ることができるように完全に特徴付けられるべきであ
る。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、動物
においてＪＥＶに対する免疫反応を刺激するのに適切な
弱毒化日本脳炎ウイルスを提供することである。また、
本発明の目的は、かかる突然変異ウイルスをコードする
既知のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を提供する
ことである。
においてＪＥＶに対する免疫反応を刺激するのに適切な
弱毒化日本脳炎ウイルスを提供することである。また、
本発明の目的は、かかる突然変異ウイルスをコードする
既知のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を提供する
ことである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、エンベロープ
タンパクの１３８位での酸性アミノ酸の、塩基性アミノ
酸への置換によって、対応する野生型日本脳炎ウイルス
（ＪＥＶ）と区別される単離された突然変異日本脳炎ウ
イルスであって、該酸性アミノ酸がグルタミン酸または
アスパラギン酸であり、該塩基性アミノ酸がリシンまた
はアルギニンである突然変異日本脳炎ウイルスを提供す
るものである。
タンパクの１３８位での酸性アミノ酸の、塩基性アミノ
酸への置換によって、対応する野生型日本脳炎ウイルス
（ＪＥＶ）と区別される単離された突然変異日本脳炎ウ
イルスであって、該酸性アミノ酸がグルタミン酸または
アスパラギン酸であり、該塩基性アミノ酸がリシンまた
はアルギニンである突然変異日本脳炎ウイルスを提供す
るものである。
【００１７】好ましい具体例では、野生型ＪＥＶは、Ｊ
ＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９８２であり、突然変異ＪＥＶの
塩基性アミノ酸は、リシンである。さらに好ましい具体
例では、野生型ＪＥＶは、ＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９８
２であり、突然変異ＪＥＶの塩基性アミノ酸は、アルギ
ニンである。
ＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９８２であり、突然変異ＪＥＶの
塩基性アミノ酸は、リシンである。さらに好ましい具体
例では、野生型ＪＥＶは、ＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９８
２であり、突然変異ＪＥＶの塩基性アミノ酸は、アルギ
ニンである。
【００１８】本発明は、突然変異ＪＥＶのゲノムをコー
ドする単離されたＤＮＡ分子であって、突然変異ＪＥＶ
が、エンベロープタンパクをコードする遺伝子における
１または２個のヌクレオチド置換からなる突然変異によ
って、対応する野生型ＪＥＶと区別される単離されたＤ
ＮＡ分子を提供するものでもある。特に、本発明は、突
然変異により、野生型ＪＥＶのエンベロープタンパクの
１３８位の酸性アミノ酸の、突然変異ＪＥＶのエンベロ
ープタンパクにおける１３８位の塩基性アミノ酸への置
換を生じ、該酸性アミノ酸がグルタミン酸またはアスパ
ラギン酸であり、塩基性アミノ酸がリシンまたはアルギ
ニンであるかかるＤＮＡ分子を提供するものである。
ドする単離されたＤＮＡ分子であって、突然変異ＪＥＶ
が、エンベロープタンパクをコードする遺伝子における
１または２個のヌクレオチド置換からなる突然変異によ
って、対応する野生型ＪＥＶと区別される単離されたＤ
ＮＡ分子を提供するものでもある。特に、本発明は、突
然変異により、野生型ＪＥＶのエンベロープタンパクの
１３８位の酸性アミノ酸の、突然変異ＪＥＶのエンベロ
ープタンパクにおける１３８位の塩基性アミノ酸への置
換を生じ、該酸性アミノ酸がグルタミン酸またはアスパ
ラギン酸であり、塩基性アミノ酸がリシンまたはアルギ
ニンであるかかるＤＮＡ分子を提供するものである。
【００１９】本発明は、さらに、 （ａ）鋳型として突然変異ＪＥＶをコードするＤＮＡ分
子を用いてイン・ビトロで全長ウイルスゲノムＲＮＡを
合成し； （ｂ）培養動物細胞にウイルスゲノムＲＮＡをトランス
フェクトさせて、ウイルスを産生させ；次いで、 （ｃ）培養動物細胞からウイルスを単離すること からなることを特徴とする、培養動物細胞からの突然変
異ＪＥＶの産生方法を提供するものである。
子を用いてイン・ビトロで全長ウイルスゲノムＲＮＡを
合成し； （ｂ）培養動物細胞にウイルスゲノムＲＮＡをトランス
フェクトさせて、ウイルスを産生させ；次いで、 （ｃ）培養動物細胞からウイルスを単離すること からなることを特徴とする、培養動物細胞からの突然変
異ＪＥＶの産生方法を提供するものである。
【００２０】本発明は、また、（ａ）突然変異ＪＥＶ、
および（ｂ）医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組
成物の治療有効量を投与することからなり、該突然変異
ＪＥＶがエンベロープタンパクの１３８位で酸性アミノ
酸の塩基性アミノ酸への置換によって対応する野生型Ｊ
ＥＶと区別されることを特徴とする動物におけるＪＥＶ
に対する中和抗体の産生方法を提供するものである。
および（ｂ）医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組
成物の治療有効量を投与することからなり、該突然変異
ＪＥＶがエンベロープタンパクの１３８位で酸性アミノ
酸の塩基性アミノ酸への置換によって対応する野生型Ｊ
ＥＶと区別されることを特徴とする動物におけるＪＥＶ
に対する中和抗体の産生方法を提供するものである。
【００２１】本発明は、また、かかる突然変異ＪＥＶお
よび医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組成物を提
供するものでもある。かかる医薬組成物は、粘膜に投与
されるか、または、皮下注射、皮内注射および筋肉内注
射からなる群から選択される注射の形態によって投与さ
れてもよい。
よび医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組成物を提
供するものでもある。かかる医薬組成物は、粘膜に投与
されるか、または、皮下注射、皮内注射および筋肉内注
射からなる群から選択される注射の形態によって投与さ
れてもよい。
【００２２】本発明は、さらに、 （ａ）ｐＭ３４３（ＡＴＣＣ Ｎo. ７５４９０）のｃＤ
ＮＡ挿入からなるＤＮＡ鋳型を用いてイン・ビトロで全
長ウイルスゲノムＲＮＡを合成し； （ｂ）動物細胞の単層培養物に該ウイルスゲノムＲＮＡ
をトランスフェクトさせ（ここで、トランスフェクショ
ンにより、単層培養物内で種々の大きさのウイルス含有
プラークが形成される）；次いで、 （ｃ）単層培養物内の小さなプラークからウイルスを単
離すること からなることを特徴とする突然変異ＪＥＶの産生方法を
提供するものである。
ＮＡ挿入からなるＤＮＡ鋳型を用いてイン・ビトロで全
長ウイルスゲノムＲＮＡを合成し； （ｂ）動物細胞の単層培養物に該ウイルスゲノムＲＮＡ
をトランスフェクトさせ（ここで、トランスフェクショ
ンにより、単層培養物内で種々の大きさのウイルス含有
プラークが形成される）；次いで、 （ｃ）単層培養物内の小さなプラークからウイルスを単
離すること からなることを特徴とする突然変異ＪＥＶの産生方法を
提供するものである。
【００２３】本発明は、また、野生型フラビウイルスの
エンベロープタンパクにおける酸性アミノ酸の、突然変
異フラビウイルスのエンベロープタンパクにおける塩基
性アミノ酸への置換によって、対応する野生型フラビウ
イルスと区別される単離された突然変異フラビウイルス
であって、該フラビウイルスが、マリーバレー脳炎ウイ
ルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイ
ルスおよび中央ヨーロッパダニ媒介性脳炎ウイルスから
なる群から選択され、酸性アミノ酸がグルタミン酸また
はアスパラギン酸であり、塩基性アミノ酸がリシンまた
はアルギニンである単離された突然変異フラビウイルス
を提供するものでもある。
エンベロープタンパクにおける酸性アミノ酸の、突然変
異フラビウイルスのエンベロープタンパクにおける塩基
性アミノ酸への置換によって、対応する野生型フラビウ
イルスと区別される単離された突然変異フラビウイルス
であって、該フラビウイルスが、マリーバレー脳炎ウイ
ルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイ
ルスおよび中央ヨーロッパダニ媒介性脳炎ウイルスから
なる群から選択され、酸性アミノ酸がグルタミン酸また
はアスパラギン酸であり、塩基性アミノ酸がリシンまた
はアルギニンである単離された突然変異フラビウイルス
を提供するものでもある。
【００２４】以下に、図面について説明する。
【００２５】図１は、ＪＥＶゲノムの線図および組換え
ＪＥＶウイルスの構造を示す図である。図２は、ｃＤＮ
Ａから組換え野生型ＪＥＶの回収ストラテジーを示す図
である。５'−ハーフＪＥＶ ｃＤＮＡ（ｐＭ３４３）お
よび３'−ハーフｃＤＮＡ（ｐＨ７５６）は、それらの
各々のｃＤＮＡクローンから精製され、イン・ビトロで
連結して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する全長ＤＮ
Ａ鋳型を産生する。ＪＥＶ ＲＮＡをｃＤＮＡ鋳型から
転写し、ＲＮＡを単層ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェ
クトした。２−５日間のインキュベーションの後、ＪＥ
Ｖプラークは、ニュートラルレッドまたはクリスタルバ
イオレットで染色することによって視覚化された。
ＪＥＶウイルスの構造を示す図である。図２は、ｃＤＮ
Ａから組換え野生型ＪＥＶの回収ストラテジーを示す図
である。５'−ハーフＪＥＶ ｃＤＮＡ（ｐＭ３４３）お
よび３'−ハーフｃＤＮＡ（ｐＨ７５６）は、それらの
各々のｃＤＮＡクローンから精製され、イン・ビトロで
連結して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する全長ＤＮ
Ａ鋳型を産生する。ＪＥＶ ＲＮＡをｃＤＮＡ鋳型から
転写し、ＲＮＡを単層ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェ
クトした。２−５日間のインキュベーションの後、ＪＥ
Ｖプラークは、ニュートラルレッドまたはクリスタルバ
イオレットで染色することによって視覚化された。
【００２６】図３は、ＢＨＫ細胞における親ＪＥＶ、組
換え野生型（ＩＣ３７）および組換え突然変異ＪＥＶ
（ＩＣ４７）の増殖率を示すグラフである。図４は、Ｎ
１８細胞における組換え野生型（ＩＣ３７）および組換
え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の増殖率を示すグラフで
ある。図５は、培養培地における親ＪＥＶまたは突然変
異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の安定性を示すグラフである。
換え野生型（ＩＣ３７）および組換え突然変異ＪＥＶ
（ＩＣ４７）の増殖率を示すグラフである。図４は、Ｎ
１８細胞における組換え野生型（ＩＣ３７）および組換
え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の増殖率を示すグラフで
ある。図５は、培養培地における親ＪＥＶまたは突然変
異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の安定性を示すグラフである。
【００２７】図６は、親ＪＥＶ、組換え野生型ＪＥＶ
（ＩＣ３７）または組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）
で攻撃されたＳwiss ＩＣＲ異系交配マウスの生存率を
示すグラフである。Ａ：腹腔内（ｉｐ）経路によって接
種した２週齢のマウス。Ｂ：ｉｐ経路によって接種した
３週齢のマウス。Ｃ：大脳内（ｉｃ）経路によって接種
した３週齢のマウス。Ｄ：親およびＩＣ４７ウイルスを
ｉｃ経路によって接種した５週齢マウス。
（ＩＣ３７）または組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）
で攻撃されたＳwiss ＩＣＲ異系交配マウスの生存率を
示すグラフである。Ａ：腹腔内（ｉｐ）経路によって接
種した２週齢のマウス。Ｂ：ｉｐ経路によって接種した
３週齢のマウス。Ｃ：大脳内（ｉｃ）経路によって接種
した３週齢のマウス。Ｄ：親およびＩＣ４７ウイルスを
ｉｃ経路によって接種した５週齢マウス。
【００２８】図７は、親ＪＥＶまたは組換え突然変異Ｊ
ＥＶ（ＩＣ４７）のいずれかを接種した３週齢マウスに
おけるウイルス血症および中和抗体産生の存在を示すグ
ラフである。図８は、ＩＣＲマウスの脳における親ＪＥ
Ｖまたは組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の力価を示
すグラフである。Ａ：ｉｐ経路による親ウイルスを接種
したマウスのウイルス力価は、瀕死のマウス（黒塗りの
三角形、ｉｐ−１）および健康なマウス（白抜きの三角
形、ｉｐ−２）から測定した。Ｂ：組換え突然変異ウイ
ルスを接種した。
ＥＶ（ＩＣ４７）のいずれかを接種した３週齢マウスに
おけるウイルス血症および中和抗体産生の存在を示すグ
ラフである。図８は、ＩＣＲマウスの脳における親ＪＥ
Ｖまたは組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の力価を示
すグラフである。Ａ：ｉｐ経路による親ウイルスを接種
したマウスのウイルス力価は、瀕死のマウス（黒塗りの
三角形、ｉｐ−１）および健康なマウス（白抜きの三角
形、ｉｐ−２）から測定した。Ｂ：組換え突然変異ウイ
ルスを接種した。
【００２９】図９は、ｉｃ経路によって親ウイルスで攻
撃されたＩＣ４７免疫化マウスの脳におけるウイルス力
価を示すグラフである。図１０は、３週齢のマウスにお
ける組換え野生型ＩＣ３７ウイルス、ＩＣ４７ウイルス
または138Ａrgウイルスによるニューロビルレンス（neu
rovirulence）の誘発を示すグラフである。図１１は、
５週齢のマウスにおける組換え野生型ＩＣ３７ウイル
ス、ＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイルスによるニ
ューロビルレンスの誘発を示すグラフである。
撃されたＩＣ４７免疫化マウスの脳におけるウイルス力
価を示すグラフである。図１０は、３週齢のマウスにお
ける組換え野生型ＩＣ３７ウイルス、ＩＣ４７ウイルス
または138Ａrgウイルスによるニューロビルレンス（neu
rovirulence）の誘発を示すグラフである。図１１は、
５週齢のマウスにおける組換え野生型ＩＣ３７ウイル
ス、ＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイルスによるニ
ューロビルレンスの誘発を示すグラフである。
【００３０】前記のとおり、ヒト用の安全かつ有効で経
済的なＪＥＶ生ワクチンが必要とされている。弱毒化生
ワクチンを研究する従来の試みは、ネズミ宿主における
野生型ウイルスの一連の継代接種の経験的方法を利用し
た。このアプローチでは、多くの突然変異がランダムに
導入され、かかる突然変異が弱毒化表現型を引き起こす
ことを期待することができるだけである。
済的なＪＥＶ生ワクチンが必要とされている。弱毒化生
ワクチンを研究する従来の試みは、ネズミ宿主における
野生型ウイルスの一連の継代接種の経験的方法を利用し
た。このアプローチでは、多くの突然変異がランダムに
導入され、かかる突然変異が弱毒化表現型を引き起こす
ことを期待することができるだけである。
【００３１】これらの制限を克服するために、本発明者
らは、感染性ｃＤＮＡクローンからＪＥＶを産生するた
めのシステムを開発した。予想外に、この方法は、高度
に弱毒化されたウイルスを産生した。これらの突然変異
ウイルスの構造および機能を特徴付け、イン・ビトロで
突然変異誘発を用いて、さらなる弱毒化ウイルスを産生
した。これらの研究結果により、エンベロープタンパク
におけるアミノ酸位置１３８でＪＥＶについてのニュー
ロビルレンス位置を発見した。
らは、感染性ｃＤＮＡクローンからＪＥＶを産生するた
めのシステムを開発した。予想外に、この方法は、高度
に弱毒化されたウイルスを産生した。これらの突然変異
ウイルスの構造および機能を特徴付け、イン・ビトロで
突然変異誘発を用いて、さらなる弱毒化ウイルスを産生
した。これらの研究結果により、エンベロープタンパク
におけるアミノ酸位置１３８でＪＥＶについてのニュー
ロビルレンス位置を発見した。
【００３２】本明細書に記載する方法は、ＪＥＶについ
ての非常に改良された弱毒化生ワクチンの産生を可能に
する。さらに、ニューロビルレンス位置の解明は、他の
ニューロビルレントフラビウイルスに対するワクチンを
生じさせるために用いられる。
ての非常に改良された弱毒化生ワクチンの産生を可能に
する。さらに、ニューロビルレンス位置の解明は、他の
ニューロビルレントフラビウイルスに対するワクチンを
生じさせるために用いられる。
【００３３】感染性ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンの構築 感染性ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンの構築方法は、スミヨ
シ（Ｓumiyoshi）ら［ジャーナル・オブ・バイロロジー
（Ｊ.Ｖirol.）６６：５４２５（１９９２)］によって
開示されている。すなわち、ＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９
８２（「親ＪＥＶ」）のゲノムの３'および５'末端を表
すオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。親ＪＥＶ
のヌクレオチド配列は、スミヨシ（Ｓumiyoshi）ら［バ
イロロジー（Ｖirology）１６１：４９７（１９８７)］
に開示されている。３'末端プライマー、および逆転写
酵素鋳型としての親ＪＥＶゲノムＲＮＡを用いて、第一
鎖合成を行った。５'末端プライマー、および鋳型とし
てのｃＤＮＡの第一鎖を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを合成
した。次いで、ｃＤＮＡ分子をＢamＨＩおよびＳalＩで
消化し、該フラグメントをｐＢＲ３２２中に挿入した。
コンピテントなイー・コリ（Ｅ.coli）ＨＢ１０１細胞
を組換えｐＢＲ３２２で形質転換させることによってｃ
ＤＮＡライブラリーを構築した。
シ（Ｓumiyoshi）ら［ジャーナル・オブ・バイロロジー
（Ｊ.Ｖirol.）６６：５４２５（１９９２)］によって
開示されている。すなわち、ＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ９
８２（「親ＪＥＶ」）のゲノムの３'および５'末端を表
すオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。親ＪＥＶ
のヌクレオチド配列は、スミヨシ（Ｓumiyoshi）ら［バ
イロロジー（Ｖirology）１６１：４９７（１９８７)］
に開示されている。３'末端プライマー、および逆転写
酵素鋳型としての親ＪＥＶゲノムＲＮＡを用いて、第一
鎖合成を行った。５'末端プライマー、および鋳型とし
てのｃＤＮＡの第一鎖を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを合成
した。次いで、ｃＤＮＡ分子をＢamＨＩおよびＳalＩで
消化し、該フラグメントをｐＢＲ３２２中に挿入した。
コンピテントなイー・コリ（Ｅ.coli）ＨＢ１０１細胞
を組換えｐＢＲ３２２で形質転換させることによってｃ
ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００３４】各々ウイルスゲノムのほぼ半分をコードし
ている２つのｃＤＮＡ分子のイン・ビトロ連結によっ
て、ＪＥＶゲノムの全長ＤＮＡコピーを構築した。説明
するように、ヌクレオチド１からヌクレオチド５５７６
までのＪＥＶ配列を含有する５'−ハーフｃＤＮＡクロ
ーンｐＭ３４３を用いて、「ＩＣ３７」と称される全長
ＪＥＶ ｃＤＮＡを産生した。図２を参照。ｃＤＮＡク
ローンｐＨ７５６から５,４００塩基対フラグメントを
単離することによって、ＪＥＶゲノムの３'−ハーフを
含有するｃＤＮＡ分子を得た；このフラグメントは、ヌ
クレオチド５５７７から３'−末端までのＪＥＶゲノム
の一部を含有する。最後に、３'−末端クローンおよび
５'−末端クローンを連結して、全長ＪＥＶ ｃＤＮＡク
ローンＩＣ３７を産生した。
ている２つのｃＤＮＡ分子のイン・ビトロ連結によっ
て、ＪＥＶゲノムの全長ＤＮＡコピーを構築した。説明
するように、ヌクレオチド１からヌクレオチド５５７６
までのＪＥＶ配列を含有する５'−ハーフｃＤＮＡクロ
ーンｐＭ３４３を用いて、「ＩＣ３７」と称される全長
ＪＥＶ ｃＤＮＡを産生した。図２を参照。ｃＤＮＡク
ローンｐＨ７５６から５,４００塩基対フラグメントを
単離することによって、ＪＥＶゲノムの３'−ハーフを
含有するｃＤＮＡ分子を得た；このフラグメントは、ヌ
クレオチド５５７７から３'−末端までのＪＥＶゲノム
の一部を含有する。最後に、３'−末端クローンおよび
５'−末端クローンを連結して、全長ＪＥＶ ｃＤＮＡク
ローンＩＣ３７を産生した。
【００３５】実施例１に記載するとおり、および、スミ
ヨシ（Ｓumiyoshi）ら（１９９２）によって開示されて
いるとおり、ＲＮＡ転写用鋳型としてＩＣ３７を用い
て、感染性ＪＥＶを得た。転写産物を、培養哺乳動物細
胞中にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞から
感染性日本脳炎ウイルスを回収した。下記のとおり、Ｉ
Ｃ３７から産生されたウイルスは、親ＪＥＶと機能的に
同一であると思われる。したがって、ＩＣ３７ ｃＤＮ
Ａから得られた感染性ウイルスは、「組換え野生型ＪＥ
Ｖ」と称される。
ヨシ（Ｓumiyoshi）ら（１９９２）によって開示されて
いるとおり、ＲＮＡ転写用鋳型としてＩＣ３７を用い
て、感染性ＪＥＶを得た。転写産物を、培養哺乳動物細
胞中にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞から
感染性日本脳炎ウイルスを回収した。下記のとおり、Ｉ
Ｃ３７から産生されたウイルスは、親ＪＥＶと機能的に
同一であると思われる。したがって、ＩＣ３７ ｃＤＮ
Ａから得られた感染性ウイルスは、「組換え野生型ＪＥ
Ｖ」と称される。
【００３６】突然変異ＪＥＶをコードするｃＤＮＡ分子
の構築 前記アプローチを用いて、突然変異ゲノムを有する日本
脳炎ウイルスを得ることができる。イン・ビトロ突然変
異誘発の最終目的は、有効な弱毒化ワクチンを産生する
ことである。テストケースのように、１つの特に有用な
突然変異を、ＪＥＶゲノムの３'−末端をコードするｐ
Ｈ７５６と称されるｃＤＮＡ分子中に導入した。
の構築 前記アプローチを用いて、突然変異ゲノムを有する日本
脳炎ウイルスを得ることができる。イン・ビトロ突然変
異誘発の最終目的は、有効な弱毒化ワクチンを産生する
ことである。テストケースのように、１つの特に有用な
突然変異を、ＪＥＶゲノムの３'−末端をコードするｐ
Ｈ７５６と称されるｃＤＮＡ分子中に導入した。
【００３７】実施例２に記載するように、部位特異的突
然変異誘発を用いて、ＸｂａＩ制限部位を除去したサイ
レント（silent）突然変異を導入した。突然変異ｃＤＮ
Ａ「ｐＨ７５６Ｘ」およびｐＭ３４３を一緒に連結し、
連結されたＤＮＡをＴ７ポリメラーゼ反応に付して、Ｒ
ＮＡ転写体を産生した。培養細胞をＲＮＡとトランスフ
ェクトさせ、トランスフェクト細胞から感染性ＪＥＶを
回収した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、ウイ
ルスゲノムＤＮＡ分子を調製した。続く配列決定分析に
より、回収されたウイルスのゲノム中に特異的なサイレ
ント突然変異が存在することが明らかになった。これら
の結果により、本明細書に記載する方法を用いて、特定
の突然変異をＪＥＶゲノム中に導入することができたこ
と、および、該突然変異が安定であることが判明した。
然変異誘発を用いて、ＸｂａＩ制限部位を除去したサイ
レント（silent）突然変異を導入した。突然変異ｃＤＮ
Ａ「ｐＨ７５６Ｘ」およびｐＭ３４３を一緒に連結し、
連結されたＤＮＡをＴ７ポリメラーゼ反応に付して、Ｒ
ＮＡ転写体を産生した。培養細胞をＲＮＡとトランスフ
ェクトさせ、トランスフェクト細胞から感染性ＪＥＶを
回収した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、ウイ
ルスゲノムＤＮＡ分子を調製した。続く配列決定分析に
より、回収されたウイルスのゲノム中に特異的なサイレ
ント突然変異が存在することが明らかになった。これら
の結果により、本明細書に記載する方法を用いて、特定
の突然変異をＪＥＶゲノム中に導入することができたこ
と、および、該突然変異が安定であることが判明した。
【００３８】組換え弱毒化ＪＥＶの調製 「図１」に示すように、５'および３' ｃＤＮＡクロー
ンの混合物を連結することによって、種々の感染性ＪＥ
Ｖ ｃＤＮＡクローンを構築した。詳細には、ｐＭ３４
３およびｐＭ４３３からの５'フラグメントをｐＨ７５
６、ｐＨ３１３、ｐＨ１７３およびｐＨ７５６Ｘからの
３'フラグメントと連結させた。ｃＤＮＡクローンｐＭ
３４３、ｐＭ４３３およびｐＨ７５６は、１９９３年６
月１７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ；ミズーリ州ロックヴィル）に寄託され
ており、該プラスミドは、各々、ＡＴＣＣ Ｎo. ７５４
９０、７５４９１および７５４９２と割り当てられた。
日本脳炎ウイルスＪａｏＡｒＳ９８２菌株ＩＣ４７は、
１９９３年６月１７日にＡＴＣＣに寄託されており、Ａ
ＴＣＣ Ｎo. ＶＲ ２４１２と割り当てられた。
ンの混合物を連結することによって、種々の感染性ＪＥ
Ｖ ｃＤＮＡクローンを構築した。詳細には、ｐＭ３４
３およびｐＭ４３３からの５'フラグメントをｐＨ７５
６、ｐＨ３１３、ｐＨ１７３およびｐＨ７５６Ｘからの
３'フラグメントと連結させた。ｃＤＮＡクローンｐＭ
３４３、ｐＭ４３３およびｐＨ７５６は、１９９３年６
月１７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ；ミズーリ州ロックヴィル）に寄託され
ており、該プラスミドは、各々、ＡＴＣＣ Ｎo. ７５４
９０、７５４９１および７５４９２と割り当てられた。
日本脳炎ウイルスＪａｏＡｒＳ９８２菌株ＩＣ４７は、
１９９３年６月１７日にＡＴＣＣに寄託されており、Ａ
ＴＣＣ Ｎo. ＶＲ ２４１２と割り当てられた。
【００３９】ハムスター腎臓細胞において培養させた
後、全ての組換えウイルスは、同様の速度で増殖すると
思われる。しかしながら、５'ｃＤＮＡ、ｐＭ４３３を
含有するウイルスは、ビルレント親ＪＥＶによって産生
されるプラークよりも明確に小さなプラークを産生し
た。かかる小さなプラークは、ウイルスが弱毒化されて
いることを示す。本明細書に記載するとおり、本発明者
らは、ｐＭ４３３から誘導された全長ＪＥＶ ｃＤＮＡ
クローンが無毒性（avirulent）であり、一方、ｐＭ３
４３から誘導されたＪＥＶ ｃＤＮＡクローンがビルレ
ントであることを見いだした。実施例１、２および４を
参照。
後、全ての組換えウイルスは、同様の速度で増殖すると
思われる。しかしながら、５'ｃＤＮＡ、ｐＭ４３３を
含有するウイルスは、ビルレント親ＪＥＶによって産生
されるプラークよりも明確に小さなプラークを産生し
た。かかる小さなプラークは、ウイルスが弱毒化されて
いることを示す。本明細書に記載するとおり、本発明者
らは、ｐＭ４３３から誘導された全長ＪＥＶ ｃＤＮＡ
クローンが無毒性（avirulent）であり、一方、ｐＭ３
４３から誘導されたＪＥＶ ｃＤＮＡクローンがビルレ
ントであることを見いだした。実施例１、２および４を
参照。
【００４０】ヌクレオチド配列分析は、ｐＭ３４３と比
較して、ｐＭ４３３が１つのヌクレオチド置換を含むこ
とを明らかにした。ｐＭ３４３のエンベロープタンパク
において、１３８番目のアミノ酸は、ＧＡＡによってコ
ードされるグルタミン酸であるが、ｐＭ４３３のエンベ
ロープタンパクにおける１３８位は、ＡＡＡによってコ
ードされるリシンである。これらの結果は、向神経性フ
ラビウイルスのゲノムにおけるニューロビルレンスにつ
いての位置の最初で唯一の疑わしくない定義を示す。
較して、ｐＭ４３３が１つのヌクレオチド置換を含むこ
とを明らかにした。ｐＭ３４３のエンベロープタンパク
において、１３８番目のアミノ酸は、ＧＡＡによってコ
ードされるグルタミン酸であるが、ｐＭ４３３のエンベ
ロープタンパクにおける１３８位は、ＡＡＡによってコ
ードされるリシンである。これらの結果は、向神経性フ
ラビウイルスのゲノムにおけるニューロビルレンスにつ
いての位置の最初で唯一の疑わしくない定義を示す。
【００４１】これらの研究は、野生型コドンＧＡＡを、
リシンをコードするＡＡＧに突然変異させることによっ
て産生することができることも示す。突然変異は、オリ
ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニ
ング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる突然
変異誘発などの良く知られている技術を用いてＪＥＶゲ
ノムの５'−末端をコードするｃＤＮＡ分子中に導入す
ることができる。実施例１、およびオーズベル（Ａusub
el）ら編のカレント・プロトコールズ・イン・モレキュ
ラー・バイオロジー（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY）、第８.０.３−８.５.９頁［ジョーン・ウィ
リー・アンド・サンズ（Ｊohn Ｗiley＆ Ｓons）１９９
０］を参照。また、一般的には、マクファーソン（Ｍc
Ｐherson）編、ディレクテッド・ミュータジェネシス：
ア・プラクティカル・アプローチ（DIRECTED MUTAGENES
IS : A PRACTICAL APPROACH）（ＩＲＬプレス１９９
１）も参照。
リシンをコードするＡＡＧに突然変異させることによっ
て産生することができることも示す。突然変異は、オリ
ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニ
ング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる突然
変異誘発などの良く知られている技術を用いてＪＥＶゲ
ノムの５'−末端をコードするｃＤＮＡ分子中に導入す
ることができる。実施例１、およびオーズベル（Ａusub
el）ら編のカレント・プロトコールズ・イン・モレキュ
ラー・バイオロジー（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY）、第８.０.３−８.５.９頁［ジョーン・ウィ
リー・アンド・サンズ（Ｊohn Ｗiley＆ Ｓons）１９９
０］を参照。また、一般的には、マクファーソン（Ｍc
Ｐherson）編、ディレクテッド・ミュータジェネシス：
ア・プラクティカル・アプローチ（DIRECTED MUTAGENES
IS : A PRACTICAL APPROACH）（ＩＲＬプレス１９９
１）も参照。
【００４２】さらに一般的には、ニューロビルレンス位
置の発見は、エンベロープタンパクの１３８位の酸性ア
ミノ酸がビルレンスに関連しており、一方、この位置の
塩基性アミノ酸が弱毒化表現型を引き起こすことを示
す。したがって、138Ｇluを138Ａspに突然変異させるこ
とによってビルレント表現型を維持することが可能であ
る。対照的に、エンベロープタンパクの１３８位の酸性
アミノ酸を塩基性アミノ酸アルギニンに突然変異させる
ことによって弱毒化ＪＥＶを産生することができる。か
かる弱毒化突然変異体は、野生型コドンＧＡＡをＣＧ
Ｔ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡまたはＡＧＧに変
えることによって得ることができる。
置の発見は、エンベロープタンパクの１３８位の酸性ア
ミノ酸がビルレンスに関連しており、一方、この位置の
塩基性アミノ酸が弱毒化表現型を引き起こすことを示
す。したがって、138Ｇluを138Ａspに突然変異させるこ
とによってビルレント表現型を維持することが可能であ
る。対照的に、エンベロープタンパクの１３８位の酸性
アミノ酸を塩基性アミノ酸アルギニンに突然変異させる
ことによって弱毒化ＪＥＶを産生することができる。か
かる弱毒化突然変異体は、野生型コドンＧＡＡをＣＧ
Ｔ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡまたはＡＧＧに変
えることによって得ることができる。
【００４３】実施例７に示す研究は、この仮説を確認す
る。すなわち、本発明者らは、エンベロープタンパクに
おいて138Ａspを含有する組換えＪＥＶがマウスにおい
て致命的であるが、一方、１３８位にＡＧＡ（Ａrg）コ
ドンを有する組換えＪＥＶが弱毒化表現型を表すことを
見いだした。
る。すなわち、本発明者らは、エンベロープタンパクに
おいて138Ａspを含有する組換えＪＥＶがマウスにおい
て致命的であるが、一方、１３８位にＡＧＡ（Ａrg）コ
ドンを有する組換えＪＥＶが弱毒化表現型を表すことを
見いだした。
【００４４】エンベロープタンパクの１３８位のニュー
ロビルレンス位置の発見は、マリー・バレー脳炎ウイル
ス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイル
スおよび中央ヨーロッパ脳炎ウイルスなどの他のニュー
ロビルレントフラビウイルスについての弱毒化ワクチン
を産生するために適用される。該ウイルスは、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションなどの公共の受
託所から入手することができる［マリー・バレー脳炎ウ
イルス：ＡＴＴＣ Ｎo. ＶＲ−７７；セントルイス脳炎
ウイルス：ＡＴＣＣ ＶＲ−８０およびＶＲ−１２６
５］。
ロビルレンス位置の発見は、マリー・バレー脳炎ウイル
ス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイル
スおよび中央ヨーロッパ脳炎ウイルスなどの他のニュー
ロビルレントフラビウイルスについての弱毒化ワクチン
を産生するために適用される。該ウイルスは、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションなどの公共の受
託所から入手することができる［マリー・バレー脳炎ウ
イルス：ＡＴＴＣ Ｎo. ＶＲ−７７；セントルイス脳炎
ウイルス：ＡＴＣＣ ＶＲ−８０およびＶＲ−１２６
５］。
【００４５】別法として、公表されているヌクレオチド
配列を用いて化学合成法によって、フラビウイルスゲノ
ムをコードするＤＮＡ分子を得ることができる。かかる
ＤＮＡ分子は、例えば、相互にプライミングする長いオ
リゴヌクオレチドを用いて遺伝子を合成することによっ
て得られる。例えば、オーズベル（Ａusubel）ら、第
８.２.８−８.２.１３頁を参照。また、ウォスニック
（Ｗosnick）ら、ジーン（Ｇene）６０：１１５（１９
８７）も参照。さらにまた、これらの技術を、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を用いることによって増強させて、長さ
１.８キロベースほどの大きな遺伝子を合成することが
できる。アダン（Ａdang）ら、Ｐlant Ｍolec.Ｂiol.２
１：１１３１（１９９３）；バンボット（Ｂambot）
ら、ＰＣＲ Ｍethods and Ａpplications ２：２６６
（１９９３）。マンドル（Ｍandl）ら、バイロロジー
（Ｖirology）１９４：１７３（１９９３）には、ダニ
媒介性フラビウイルス・ポワサン（Ｐowassan）のヌク
レオチド配列が開示されており、ウエスタンサブタイプ
ダニ媒介性脳炎ウイルスのヌクレオチド配列は、マンド
ル（Ｍandl）ら、バイロロジー（Ｖirology）１６６：
１９７（１９８８）およびマンドル（Ｍandl）ら、バイ
ロロジー（Ｖirology）１７３：２９１（１９８９）に
開示されている。
配列を用いて化学合成法によって、フラビウイルスゲノ
ムをコードするＤＮＡ分子を得ることができる。かかる
ＤＮＡ分子は、例えば、相互にプライミングする長いオ
リゴヌクオレチドを用いて遺伝子を合成することによっ
て得られる。例えば、オーズベル（Ａusubel）ら、第
８.２.８−８.２.１３頁を参照。また、ウォスニック
（Ｗosnick）ら、ジーン（Ｇene）６０：１１５（１９
８７）も参照。さらにまた、これらの技術を、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を用いることによって増強させて、長さ
１.８キロベースほどの大きな遺伝子を合成することが
できる。アダン（Ａdang）ら、Ｐlant Ｍolec.Ｂiol.２
１：１１３１（１９９３）；バンボット（Ｂambot）
ら、ＰＣＲ Ｍethods and Ａpplications ２：２６６
（１９９３）。マンドル（Ｍandl）ら、バイロロジー
（Ｖirology）１９４：１７３（１９９３）には、ダニ
媒介性フラビウイルス・ポワサン（Ｐowassan）のヌク
レオチド配列が開示されており、ウエスタンサブタイプ
ダニ媒介性脳炎ウイルスのヌクレオチド配列は、マンド
ル（Ｍandl）ら、バイロロジー（Ｖirology）１６６：
１９７（１９８８）およびマンドル（Ｍandl）ら、バイ
ロロジー（Ｖirology）１７３：２９１（１９８９）に
開示されている。
【００４６】概要的には、エンベロープタンパクの１３
８位の酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に突然変
異させることによって弱毒化ＪＥＶを構築することが可
能である。実施例７は、１つのヌクレオチド置換を有す
る無毒性ＪＥＶが、ネズミ宿主を介する１０回の継代接
種の後、弱毒化表現型を保持したことを示す。それにも
かかわらず、好ましい弱毒化日本脳炎ウイルスは、２つ
のヌクレオチド置換を含んでおり、確実に、野生型への
逆転を非常に見込みのないものにする。したがって、２
つのヌクレオチド置換は、アルギニンをコードするコド
ンを、グルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれかを
コードするコドンに転換することを必要とするので、好
ましい弱毒化ＪＥＶは、エンベロープタンパクの１３８
位にアルギニン残基を含有する。
８位の酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に突然変
異させることによって弱毒化ＪＥＶを構築することが可
能である。実施例７は、１つのヌクレオチド置換を有す
る無毒性ＪＥＶが、ネズミ宿主を介する１０回の継代接
種の後、弱毒化表現型を保持したことを示す。それにも
かかわらず、好ましい弱毒化日本脳炎ウイルスは、２つ
のヌクレオチド置換を含んでおり、確実に、野生型への
逆転を非常に見込みのないものにする。したがって、２
つのヌクレオチド置換は、アルギニンをコードするコド
ンを、グルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれかを
コードするコドンに転換することを必要とするので、好
ましい弱毒化ＪＥＶは、エンベロープタンパクの１３８
位にアルギニン残基を含有する。
【００４７】ワクチンにおける組換え弱毒化ＪＥＶの使
用 前記のとおり、突然変異ＪＥＶ菌株ＳＡ14−１４−２
は、マウスなどの実験動物における弱毒化表現型を示
し、該菌株をヒトに接種すると、中和抗体産生を刺激す
る。エッケルズ（Ｅckels）ら、バクシーン（Ｖaccin
e）６：５１３（１９８８）を参照。他方、ＳＡ１４−
１４−２−ＰＣＫウイルスは、マウスにおいて低率の血
清交換を誘発し、該ウイルスは、ヒトにおいては中和抗
体を刺激しない。したがって、弱毒化ＪＥＶを用いる研
究は、弱毒化ＪＥＶ菌株の、ワクチン接種を受けたマウ
スおよびヒトにおける血清交換誘発能間の相互関係を示
す。したがって、本明細書に記載されたイン・ビボ研究
の結果は、本発明の突然変異日本脳炎ウイルスがワクチ
ン接種を受けたヒトにおいて免疫応答を刺激する際に特
に有効であることを示す。
用 前記のとおり、突然変異ＪＥＶ菌株ＳＡ14−１４−２
は、マウスなどの実験動物における弱毒化表現型を示
し、該菌株をヒトに接種すると、中和抗体産生を刺激す
る。エッケルズ（Ｅckels）ら、バクシーン（Ｖaccin
e）６：５１３（１９８８）を参照。他方、ＳＡ１４−
１４−２−ＰＣＫウイルスは、マウスにおいて低率の血
清交換を誘発し、該ウイルスは、ヒトにおいては中和抗
体を刺激しない。したがって、弱毒化ＪＥＶを用いる研
究は、弱毒化ＪＥＶ菌株の、ワクチン接種を受けたマウ
スおよびヒトにおける血清交換誘発能間の相互関係を示
す。したがって、本明細書に記載されたイン・ビボ研究
の結果は、本発明の突然変異日本脳炎ウイルスがワクチ
ン接種を受けたヒトにおいて免疫応答を刺激する際に特
に有効であることを示す。
【００４８】ウイルスは、無生物培地で増殖することが
できない細胞内偏性寄生生物であるので、弱毒化ＪＥＶ
は、培養哺乳動物細胞およびヒナ胚子細胞（chick embr
yo cell）培養物などの生物培地（animate media）培地
において増殖させなければならない。弱毒化ウイルスの
宿主細胞からの精製方法は、当業者によく知られいる。
例えば、感染組織培養細胞からＳＡ14−１４−２ワクチ
ンを調製する方法を開示しているウォン（Ｗang）ら、
Ｃhin.Ｊ.Ｖirol.６：３８（１９９０）を参照。また、
一般的に、レミントンズ・ファーマシューティカル・サ
イエンシズ（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE
S）、第１８版［マック・パブリッシング・カンパニー
（Ｍack Ｐublishing Ｃo.）１９９０］。
できない細胞内偏性寄生生物であるので、弱毒化ＪＥＶ
は、培養哺乳動物細胞およびヒナ胚子細胞（chick embr
yo cell）培養物などの生物培地（animate media）培地
において増殖させなければならない。弱毒化ウイルスの
宿主細胞からの精製方法は、当業者によく知られいる。
例えば、感染組織培養細胞からＳＡ14−１４−２ワクチ
ンを調製する方法を開示しているウォン（Ｗang）ら、
Ｃhin.Ｊ.Ｖirol.６：３８（１９９０）を参照。また、
一般的に、レミントンズ・ファーマシューティカル・サ
イエンシズ（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE
S）、第１８版［マック・パブリッシング・カンパニー
（Ｍack Ｐublishing Ｃo.）１９９０］。
【００４９】弱毒化ウイルスワクチンの投与モードおよ
びかかるワクチンの好適な投与量は、当業者によく知ら
れている。例えば、レミントンズ・ファーマシューティ
カル・サイエンシズ、第１８版［マック・パブリッシン
グ・カンパニー、１９９０］を参照。例えば、弱毒化Ｊ
ＥＶワクチンは、筋肉内注射、皮下注射、または、皮内
注射によってヒト受容体に投与することができる。一般
に、ワクチンの投与は、受容者の年齢、体重、身長、性
別、一般的な健康状態および過去の病歴などの因子に依
存して変わるであろう。一般に、１０2−１０6ＰＦＵ／
mＬを含有する製剤として、ワクチン０.５〜１mＬを投
与する。ＪＥＶ弱毒化ワクチン、ＳＡ14−１４−２によ
る実験は、本明細書に記載した組換え弱毒化ＪＥＶの適
切な投与量についての一般的なガイドラインを提供す
る。例えば、ユ（Ｙu）ら、Ｃhin.Ｊ.Ｍicrobiol.Ｉmmu
nol.１：７７（１９８１）、アオ（Ａo）ら、Ｃhin.Ｊ.
Ｍicrobiol.Ｉmmunol.３：２４５（１９８３）、ユら、
Ａm.Ｊ.Ｔrop.Ｍed.Ｈyg.３９：２１４（１９８８）、
およびツァイ（Ｔsai）ら、バクシーンズ（VACCINE
S）、第２版、プロトキン（Ｐlotkin）ら編、第６７１
−７１３頁における「ジャパニーズ・エンセファリティ
ス・バクシーンズ」（Ｊapanese Ｅncephalitis Ｖacci
nes）［ダブリュ・ビー・ソーンダーズ・カンパニー
（Ｗ.Ｂ.Ｓaunders Ｃo.）１９９４］を参照。
びかかるワクチンの好適な投与量は、当業者によく知ら
れている。例えば、レミントンズ・ファーマシューティ
カル・サイエンシズ、第１８版［マック・パブリッシン
グ・カンパニー、１９９０］を参照。例えば、弱毒化Ｊ
ＥＶワクチンは、筋肉内注射、皮下注射、または、皮内
注射によってヒト受容体に投与することができる。一般
に、ワクチンの投与は、受容者の年齢、体重、身長、性
別、一般的な健康状態および過去の病歴などの因子に依
存して変わるであろう。一般に、１０2−１０6ＰＦＵ／
mＬを含有する製剤として、ワクチン０.５〜１mＬを投
与する。ＪＥＶ弱毒化ワクチン、ＳＡ14−１４−２によ
る実験は、本明細書に記載した組換え弱毒化ＪＥＶの適
切な投与量についての一般的なガイドラインを提供す
る。例えば、ユ（Ｙu）ら、Ｃhin.Ｊ.Ｍicrobiol.Ｉmmu
nol.１：７７（１９８１）、アオ（Ａo）ら、Ｃhin.Ｊ.
Ｍicrobiol.Ｉmmunol.３：２４５（１９８３）、ユら、
Ａm.Ｊ.Ｔrop.Ｍed.Ｈyg.３９：２１４（１９８８）、
およびツァイ（Ｔsai）ら、バクシーンズ（VACCINE
S）、第２版、プロトキン（Ｐlotkin）ら編、第６７１
−７１３頁における「ジャパニーズ・エンセファリティ
ス・バクシーンズ」（Ｊapanese Ｅncephalitis Ｖacci
nes）［ダブリュ・ビー・ソーンダーズ・カンパニー
（Ｗ.Ｂ.Ｓaunders Ｃo.）１９９４］を参照。
【００５０】本発明のワクチンは、公知の、医薬的な有
用な組成物の調製方法に従って製剤化することができ、
これにより、弱毒化ウイルスを医薬的に許容される賦形
剤と混合して混合物にする。組成物は、その投与が受容
者によって許容され得る場合、「医薬的に許容される賦
形剤」であると言われる。無菌リン酸緩衝生理食塩水
は、医薬的に許容される賦形剤の一例である。他の適切
な賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、レミ
ントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、第
１８版［マック・パブリッシング・カンパニー、１９９
０］を参照。
用な組成物の調製方法に従って製剤化することができ、
これにより、弱毒化ウイルスを医薬的に許容される賦形
剤と混合して混合物にする。組成物は、その投与が受容
者によって許容され得る場合、「医薬的に許容される賦
形剤」であると言われる。無菌リン酸緩衝生理食塩水
は、医薬的に許容される賦形剤の一例である。他の適切
な賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、レミ
ントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、第
１８版［マック・パブリッシング・カンパニー、１９９
０］を参照。
【００５１】治療目的のために、弱毒化ＪＥＶおよび医
薬的に許容される賦形剤は、治療有効量でヒト受容者に
投与される。ウイルスと医薬的に許容される賦形剤との
混合物は、投与量が生理学的に有意である場合、「治療
有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在が
受容者の生理機能において検出可能な変化を生じる場
合、生理学的に有意である。これに関連して、薬剤は、
その存在が日本脳炎ウイルスに対する中和抗体の産生を
刺激する場合、生理学的に有意である。
薬的に許容される賦形剤は、治療有効量でヒト受容者に
投与される。ウイルスと医薬的に許容される賦形剤との
混合物は、投与量が生理学的に有意である場合、「治療
有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在が
受容者の生理機能において検出可能な変化を生じる場
合、生理学的に有意である。これに関連して、薬剤は、
その存在が日本脳炎ウイルスに対する中和抗体の産生を
刺激する場合、生理学的に有意である。
【００５２】前記に一般的に記載した本発明は、以下の
実施例を参照して容易に理解されるであろう。該実施例
は、本発明を単に説明するだけであり、本発明の範囲を
限定するものではない。
実施例を参照して容易に理解されるであろう。該実施例
は、本発明を単に説明するだけであり、本発明の範囲を
限定するものではない。
【００５３】
実施例１ 野生型ＪＥＶまたは突然変異ＪＥＶをコードする感染性
ｃＤＮＡクローンの増殖 Ａ．ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンの構築 スミヨシ（Ｓumiyoshi）ら［ジャーナル・オブ・バイロ
ロジー（Ｊ.Ｖirol.）６６：５４２５（１９９２）］の
開示に従って、菌株ＪａＯＡｒＳ９８２をコードする感
染性野生型ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンを構築した。すな
わち、ＪＥＶゲノムの５'−ハーフをコードする２つの
ｃＤＮＡクローン（ｐＭ３４３またはｐＭ４３３）およ
び該ゲノムの３'−ハーフに相当するｃＤＮＡ（ｐＨ７
５６）をイン・ビトロで連結して、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼに対する２つの全長鋳型を作製した。「図２」を
参照。ＲＮＡ合成反応混合物５０μＬは、１μgのｃＤ
ＮＡ鋳型、４０mＭ トリス−ＨＣl（ｐＨ８.０）、２５
mＭ ＮaＣl、８mＭ ＭgＣl2、２mＭスペルミジン、５m
Ｍジチオトレイトール、各１mＭ ＣＴＰ、ＵＴＰおよび
ＧＴＰ、０.１mＭ ＡＴＰ、１mＭ ｍ7Ｇ(５')ｐｐｐ
(５')Ａ、５ＵのＲＮase阻害剤、および０.２μＬのＴ
７ ＲＮＡポリメララーゼを含有した。
ｃＤＮＡクローンの増殖 Ａ．ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンの構築 スミヨシ（Ｓumiyoshi）ら［ジャーナル・オブ・バイロ
ロジー（Ｊ.Ｖirol.）６６：５４２５（１９９２）］の
開示に従って、菌株ＪａＯＡｒＳ９８２をコードする感
染性野生型ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンを構築した。すな
わち、ＪＥＶゲノムの５'−ハーフをコードする２つの
ｃＤＮＡクローン（ｐＭ３４３またはｐＭ４３３）およ
び該ゲノムの３'−ハーフに相当するｃＤＮＡ（ｐＨ７
５６）をイン・ビトロで連結して、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼに対する２つの全長鋳型を作製した。「図２」を
参照。ＲＮＡ合成反応混合物５０μＬは、１μgのｃＤ
ＮＡ鋳型、４０mＭ トリス−ＨＣl（ｐＨ８.０）、２５
mＭ ＮaＣl、８mＭ ＭgＣl2、２mＭスペルミジン、５m
Ｍジチオトレイトール、各１mＭ ＣＴＰ、ＵＴＰおよび
ＧＴＰ、０.１mＭ ＡＴＰ、１mＭ ｍ7Ｇ(５')ｐｐｐ
(５')Ａ、５ＵのＲＮase阻害剤、および０.２μＬのＴ
７ ＲＮＡポリメララーゼを含有した。
【００５４】ｃＤＮＡ鋳型により転写されたＲＮＡ分子
をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトさせ、後代ウイ
ルスを回収した。チョウ（Ｃhou）ら、Ａdv.Ｅnzym.Ｒe
lat.Ａreas Ｍol.Ｂiol.４７：４５（１９７８）。これ
らの研究では、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２mＭ
Ｌ−グルタミン、０.１mＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０.
３％重炭酸ナトリウム、１０Ｕ／mＬのペニシリン、お
よび１０μgのストレプトマイシンを補足した最小必須
培地（ＭＥＭ）中でＢＨＫ−２１細胞を増殖させた。３
５mmの皿中のＢＨＫ−２１細胞の単層をリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、該細胞を、室温で１０分
間、ＲＮＡ転写物および１０％リポフェクチン（Ｌipof
ectinR）［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ,イン
コーポレイテッド（Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratorie
s,Ｉnc.）；ミズーリ州ゲイザースバーグ］を含有する
ＰＢＳ ４００μＬと一緒にインキュベートした。次い
で、該細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＥＭ中２％ＦＣＳを含
有する１％アガロースで覆った。２〜３日のインキュベ
ーションの後、細胞をニュートラルレッドで染色して、
ウイルスプラークを視覚化した。
をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトさせ、後代ウイ
ルスを回収した。チョウ（Ｃhou）ら、Ａdv.Ｅnzym.Ｒe
lat.Ａreas Ｍol.Ｂiol.４７：４５（１９７８）。これ
らの研究では、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２mＭ
Ｌ−グルタミン、０.１mＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０.
３％重炭酸ナトリウム、１０Ｕ／mＬのペニシリン、お
よび１０μgのストレプトマイシンを補足した最小必須
培地（ＭＥＭ）中でＢＨＫ−２１細胞を増殖させた。３
５mmの皿中のＢＨＫ−２１細胞の単層をリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、該細胞を、室温で１０分
間、ＲＮＡ転写物および１０％リポフェクチン（Ｌipof
ectinR）［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ,イン
コーポレイテッド（Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratorie
s,Ｉnc.）；ミズーリ州ゲイザースバーグ］を含有する
ＰＢＳ ４００μＬと一緒にインキュベートした。次い
で、該細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＥＭ中２％ＦＣＳを含
有する１％アガロースで覆った。２〜３日のインキュベ
ーションの後、細胞をニュートラルレッドで染色して、
ウイルスプラークを視覚化した。
【００５５】５'−ハーフｐＭ３４３および３'−ハーフ
ｐＨ７５６から誘導された全長ｃＤＮＡから回収された
ウイルスをＩＣ３７と称した。この組換えウイルスは、
親ＪＥＶの特性とは区別することができる特性を示し
た。ｐＭ４３３およびｐＨ７５６から調製されたｃＤＮ
Ａ鋳型から回収されたウイルスをＩＣ４７と称した。驚
くべきことに、ＩＣ４７の特徴は、親ウイルスおよびＩ
Ｃ３７の特徴とは異なる。
ｐＨ７５６から誘導された全長ｃＤＮＡから回収された
ウイルスをＩＣ３７と称した。この組換えウイルスは、
親ＪＥＶの特性とは区別することができる特性を示し
た。ｐＭ４３３およびｐＨ７５６から調製されたｃＤＮ
Ａ鋳型から回収されたウイルスをＩＣ４７と称した。驚
くべきことに、ＩＣ４７の特徴は、親ウイルスおよびＩ
Ｃ３７の特徴とは異なる。
【００５６】Ｂ．野生型ＪＥＶクローンの部位特異的突
然変異誘発 ｃＤＮＡクローンｐＨ７５６は、ヌクレオチドの９１３
１位で固有のＸｂａＩ制限部位を含有する。部位特異的
イン・ビトロ突然変異誘発を用いて、アミノ酸配列を変
えずに、ＸｂａＩ部位を除去するヌクレオチド置換を導
入した（すなわち、サイレント突然変異）。スタッジャ
ー（Ｓtudier）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１８９：１１３（１
９８６）。突然変異ｃＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ反応のための鋳型として用い、前記の方法を用いて、
ウイルスを回収した。
然変異誘発 ｃＤＮＡクローンｐＨ７５６は、ヌクレオチドの９１３
１位で固有のＸｂａＩ制限部位を含有する。部位特異的
イン・ビトロ突然変異誘発を用いて、アミノ酸配列を変
えずに、ＸｂａＩ部位を除去するヌクレオチド置換を導
入した（すなわち、サイレント突然変異）。スタッジャ
ー（Ｓtudier）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１８９：１１３（１
９８６）。突然変異ｃＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ反応のための鋳型として用い、前記の方法を用いて、
ウイルスを回収した。
【００５７】回収したウイルス粒子からゲノムＲＮＡを
精製し、該ＲＮＡをｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）増幅法のための鋳型として用いた。得
られたｃＤＮＡの制限分析により、該クローンがヌクレ
オチドの９１３１位でＸｂａＩ部位を欠いていることが
判明した。この結果は、（１）回収したウイルスが変性
ｃＤＮＡから誘導され、汚染菌ではなかったこと、およ
び（２）部位特異的突然変異誘発がこれらの技術によっ
て日本脳炎ウイルス中に導入され得ることを示した。
精製し、該ＲＮＡをｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）増幅法のための鋳型として用いた。得
られたｃＤＮＡの制限分析により、該クローンがヌクレ
オチドの９１３１位でＸｂａＩ部位を欠いていることが
判明した。この結果は、（１）回収したウイルスが変性
ｃＤＮＡから誘導され、汚染菌ではなかったこと、およ
び（２）部位特異的突然変異誘発がこれらの技術によっ
て日本脳炎ウイルス中に導入され得ることを示した。
【００５８】Ｃ．ＪＥＶ ｃＤＮＡクローンの構造分析
およびイン・ビトロ機能性分析 細胞当たり１０ＰＦＵの多重度で感染したＢＨＫ−２１
細胞中で、親、ＩＣ３７およびＩＣ４７ウイルスの増殖
率を比較した。「図３」を参照。該ウイルスは、増殖率
に基づいて識別することができなかったが、ＩＣ４７の
プラークサイズは、親およびＩＣ３７のプラークサイズ
よりも非常に小さかった。
およびイン・ビトロ機能性分析 細胞当たり１０ＰＦＵの多重度で感染したＢＨＫ−２１
細胞中で、親、ＩＣ３７およびＩＣ４７ウイルスの増殖
率を比較した。「図３」を参照。該ウイルスは、増殖率
に基づいて識別することができなかったが、ＩＣ４７の
プラークサイズは、親およびＩＣ３７のプラークサイズ
よりも非常に小さかった。
【００５９】まず、腎臓組織からＢＨＫ−２１細胞を単
離した。神経組織から誘導された細胞中でのＩＣ３７お
よびＩＣ４７の増殖を試験するために、Ｎ１８細胞を、
細胞当たり１０ＰＦＵの多重度でいずれのウイルスとも
一緒にインキュベートした。「図４」に示すように、Ｉ
Ｃ３７は、ＩＣ４７と比較して大きな割合で増殖した。
この観察結果は、以下に説明するとおり、ネズミ脳組織
における低いＩＣ４７増殖率およびＩＣ４７の弱毒化表
現型に関連している。
離した。神経組織から誘導された細胞中でのＩＣ３７お
よびＩＣ４７の増殖を試験するために、Ｎ１８細胞を、
細胞当たり１０ＰＦＵの多重度でいずれのウイルスとも
一緒にインキュベートした。「図４」に示すように、Ｉ
Ｃ３７は、ＩＣ４７と比較して大きな割合で増殖した。
この観察結果は、以下に説明するとおり、ネズミ脳組織
における低いＩＣ４７増殖率およびＩＣ４７の弱毒化表
現型に関連している。
【００６０】親およびＩＣ４７ウイルスの安定性を比較
するために、１０％ＦＣＳおよび１０００ＰＦＵ／mＬ
の親またはＩＣ４７を含有する培養培地の溶液をＣＯ2
インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。ウ
イルスを、プラークアッセイにより各時点で力価測定し
た。「図５」において示されるように、ウイルス安定性
において明白な差異はなかった。
するために、１０％ＦＣＳおよび１０００ＰＦＵ／mＬ
の親またはＩＣ４７を含有する培養培地の溶液をＣＯ2
インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。ウ
イルスを、プラークアッセイにより各時点で力価測定し
た。「図５」において示されるように、ウイルス安定性
において明白な差異はなかった。
【００６１】ｃＤＮＡのヌクレオチド配列分析により、
ｐＭ３４３（すなわち、ＩＣ３７の５'−ハーフ）およ
びｐＭ４３３（すなわち、ＩＣ４７の５'−ハーフ）が
エンベロープタンパクにおける１３８位の単一のコドン
によって異なることが判明した。ｐＭ３４３のエンベロ
ープタンパクにおいて、１３８番目のアミノ酸は、ＧＡ
Ａによってコードされるグルタミン酸であるが、ｐＭ４
３３のエンベロープタンパクにおける１３８位は、ＡＡ
Ａによってコードされるリシンである。ＩＣ３７および
ＩＣ４７の３'−ハーフが同一のｃＤＮＡクローンから
誘導されたので、これらの結果は、１３８位でのエンベ
ロープタンパクの単一のアミノ酸変化により変わったプ
ラークサイズを生じることを示す。該突然変異は、以下
に説明するとおり、ニューロビルレンスの大きな変化も
生じる。
ｐＭ３４３（すなわち、ＩＣ３７の５'−ハーフ）およ
びｐＭ４３３（すなわち、ＩＣ４７の５'−ハーフ）が
エンベロープタンパクにおける１３８位の単一のコドン
によって異なることが判明した。ｐＭ３４３のエンベロ
ープタンパクにおいて、１３８番目のアミノ酸は、ＧＡ
Ａによってコードされるグルタミン酸であるが、ｐＭ４
３３のエンベロープタンパクにおける１３８位は、ＡＡ
Ａによってコードされるリシンである。ＩＣ３７および
ＩＣ４７の３'−ハーフが同一のｃＤＮＡクローンから
誘導されたので、これらの結果は、１３８位でのエンベ
ロープタンパクの単一のアミノ酸変化により変わったプ
ラークサイズを生じることを示す。該突然変異は、以下
に説明するとおり、ニューロビルレンスの大きな変化も
生じる。
【００６２】実施例２ マウスにおける野生型ＪＥＶ、ＩＣ３７およびＩＣ４７
ウイルスのニューロビルレンス Ｓwiss ＩＣＲマウスを用いて、組換えウイルスＩＣ３
７およびＩＣ４７ならびに親ＪＥＶをニューロビルレン
スについて比較した。予備実験において、大脳内（ｉ
ｃ）または腹腔内（ｉｐ）のいずれかの投与を用いて、
３週齢のマウスに１０〜１０6ＰＦＵを接種した。親ウ
イルスまたはＩＣ３７をｉｃ接種したマウスは全てが死
亡したが、ウイルスをｉｐ接種したマウスの死亡率は、
約５０％であった。対照的に、ＩＣ４７をｉｃ経路また
はｉｐ経路のいずれかによって接種したマウスは、全て
が当該処置にもかかわらず生き残った。これらの研究に
より、ＩＣ３７および親ウイルスは、それらのマウスを
殺す能力において区別がつかなかったが、ＩＣ４７は、
有毒ではなかったことが判明した。
ウイルスのニューロビルレンス Ｓwiss ＩＣＲマウスを用いて、組換えウイルスＩＣ３
７およびＩＣ４７ならびに親ＪＥＶをニューロビルレン
スについて比較した。予備実験において、大脳内（ｉ
ｃ）または腹腔内（ｉｐ）のいずれかの投与を用いて、
３週齢のマウスに１０〜１０6ＰＦＵを接種した。親ウ
イルスまたはＩＣ３７をｉｃ接種したマウスは全てが死
亡したが、ウイルスをｉｐ接種したマウスの死亡率は、
約５０％であった。対照的に、ＩＣ４７をｉｃ経路また
はｉｐ経路のいずれかによって接種したマウスは、全て
が当該処置にもかかわらず生き残った。これらの研究に
より、ＩＣ３７および親ウイルスは、それらのマウスを
殺す能力において区別がつかなかったが、ＩＣ４７は、
有毒ではなかったことが判明した。
【００６３】第２の研究において、８匹のＳwiss ＩＣ
Ｒ異系交配マウスのグループを親ウイルス、ＩＣ３７ま
たはＩＣ４７で攻撃した。１００ ＰＦＵのｉｃ接種の
ために３週齢および５週齢のマウスを用い、一方、１０
０ ＰＦＵのｉｐ接種のために２週齢および３週齢のマ
ウスを用いた。親ウイルスまたはＩＣ３７のいずれかを
ｉｐ接種した後、死亡率は、２週齢マウスについては１
００％であり、３週齢マウスについては５０％であっ
た。「図６」のＡおよびＢを参照。親ウイルスまたはＩ
Ｃ３７による大脳内接種の結果、３週齢および５週齢マ
ウスについては１００％の死亡率を生じた。「図６」の
ＣおよびＤを参照。全てのマウスは、ＩＣ４７の接種に
もかかわらず疾患の徴候を伴わずに生き残った。
Ｒ異系交配マウスのグループを親ウイルス、ＩＣ３７ま
たはＩＣ４７で攻撃した。１００ ＰＦＵのｉｃ接種の
ために３週齢および５週齢のマウスを用い、一方、１０
０ ＰＦＵのｉｐ接種のために２週齢および３週齢のマ
ウスを用いた。親ウイルスまたはＩＣ３７のいずれかを
ｉｐ接種した後、死亡率は、２週齢マウスについては１
００％であり、３週齢マウスについては５０％であっ
た。「図６」のＡおよびＢを参照。親ウイルスまたはＩ
Ｃ３７による大脳内接種の結果、３週齢および５週齢マ
ウスについては１００％の死亡率を生じた。「図６」の
ＣおよびＤを参照。全てのマウスは、ＩＣ４７の接種に
もかかわらず疾患の徴候を伴わずに生き残った。
【００６４】実施例３ 親またはＩＣ４７ウイルスに感染したマウスにおける中
和抗体産生およびウイルス血症 これらの研究のために、３週齢Ｓwiss ＩＣＲマウスに
１００ＰＦＵの親ウイルスまたはＩＣ４７ウイルスをｉ
ｐ接種した。種々の時点で血清試料を採取し、以下のと
おり、中和抗体およびウイルス血症を測定した。中和抗
体力価を測定するために、血清試料の１０〜１６０倍希
釈物を調製し、５０ＰＦＵの親ウイルスと一緒に４℃で
一晩インキュベートした。３５mmまたは６０mmの皿中の
ＢＨＫ−２１細胞の単層にウイルスを接種し、ＰＢＳで
洗浄し、ＭＥＭ中２％ウシ胎児血清を含有する１％アガ
ロースで覆ったプラークアッセイによって、該反応のウ
イルス力価を測定した。２〜３日後、細胞をニュートラ
ルレッドまたはクリスタルバイオレットで染色して、プ
ラークを視覚化した。プラークの７０％減少は、中和抗
体力価の存在を示した。
和抗体産生およびウイルス血症 これらの研究のために、３週齢Ｓwiss ＩＣＲマウスに
１００ＰＦＵの親ウイルスまたはＩＣ４７ウイルスをｉ
ｐ接種した。種々の時点で血清試料を採取し、以下のと
おり、中和抗体およびウイルス血症を測定した。中和抗
体力価を測定するために、血清試料の１０〜１６０倍希
釈物を調製し、５０ＰＦＵの親ウイルスと一緒に４℃で
一晩インキュベートした。３５mmまたは６０mmの皿中の
ＢＨＫ−２１細胞の単層にウイルスを接種し、ＰＢＳで
洗浄し、ＭＥＭ中２％ウシ胎児血清を含有する１％アガ
ロースで覆ったプラークアッセイによって、該反応のウ
イルス力価を測定した。２〜３日後、細胞をニュートラ
ルレッドまたはクリスタルバイオレットで染色して、プ
ラークを視覚化した。プラークの７０％減少は、中和抗
体力価の存在を示した。
【００６５】両方の処置グループにおいて接種の３〜４
日後に中和抗体を検出した。「図７」を参照。中和抗体
産生における差異は、比較的小さかった。
日後に中和抗体を検出した。「図７」を参照。中和抗体
産生における差異は、比較的小さかった。
【００６６】ウイルス血症の存在を測定するために、Ｂ
ＨＫ−２１単層に血清試料を添加し、プラークアッセイ
によって、ウイルス力価を測定した。３日目に最大力価
約１０3ＰＦＵ／mlを有する親ウイルスを接種したマウ
スにおいてウイルス血症を検出した。「図７」を参照。
抗体力価が上昇し始めると、検出可能なウイルス血症が
減少し初めた；４日目には、ウイルスは、全く検出され
なかった。ウイルス血症は、ＩＣ４７を接種したマウス
からの血清中には検出されなかったが、該マウスは、親
ウイルスに対する抗体反応と類似した抗体反応を増した
ので、ウイルスは、おそらくこれらのマウスにおいて複
製されたのであろう。
ＨＫ−２１単層に血清試料を添加し、プラークアッセイ
によって、ウイルス力価を測定した。３日目に最大力価
約１０3ＰＦＵ／mlを有する親ウイルスを接種したマウ
スにおいてウイルス血症を検出した。「図７」を参照。
抗体力価が上昇し始めると、検出可能なウイルス血症が
減少し初めた；４日目には、ウイルスは、全く検出され
なかった。ウイルス血症は、ＩＣ４７を接種したマウス
からの血清中には検出されなかったが、該マウスは、親
ウイルスに対する抗体反応と類似した抗体反応を増した
ので、ウイルスは、おそらくこれらのマウスにおいて複
製されたのであろう。
【００６７】実施例４ 脳におけるウイルス増殖 脳組織におけるウイルスの増殖を試験するために、ｉｃ
またはｉｐ投与を用いて、マウスを１００ ＰＦＵの親
ＪＥＶ、組換え野生型ＪＥＶ ＩＣ３７またはＩＣ４７
に感染させた。接種後の種々の時点で脳を採取し、ＭＥ
Ｍ（４：１；ｗ／ｖ）中５０％ＦＣＳにおいて、組織試
料をホモジナイズした。前記のとおり、プラークアッセ
イによって、脳ホモジナートのウイルス力価を測定し
た。
またはｉｐ投与を用いて、マウスを１００ ＰＦＵの親
ＪＥＶ、組換え野生型ＪＥＶ ＩＣ３７またはＩＣ４７
に感染させた。接種後の種々の時点で脳を採取し、ＭＥ
Ｍ（４：１；ｗ／ｖ）中５０％ＦＣＳにおいて、組織試
料をホモジナイズした。前記のとおり、プラークアッセ
イによって、脳ホモジナートのウイルス力価を測定し
た。
【００６８】親ウイルスをｉｃ経路によって接種する
と、脳内のウイルス力価は、すぐに増加し、５日目に１
０7ＰＦＵ／gmを超えるレベルに達した。「図８」のＡ
を参照。７日目までに、全てのマウスは、該感染により
死亡した。親ウイルスをｉｐ接種した後、５日目にウイ
ルスが脳内に出現した。１０7ＰＦＵ／gmを超える脳ウ
イルス力価を有するマウスは、麻痺し、死亡したが
（「図８」のＡ、黒塗りの三角形）、１０6ＰＦＵ／g未
満の脳ウイルス力価を有するグループのマウスは、健康
なままであった（白抜きの三角形）。１４日目までに
は、生存マウスの脳からウイルスが浄化された。
と、脳内のウイルス力価は、すぐに増加し、５日目に１
０7ＰＦＵ／gmを超えるレベルに達した。「図８」のＡ
を参照。７日目までに、全てのマウスは、該感染により
死亡した。親ウイルスをｉｐ接種した後、５日目にウイ
ルスが脳内に出現した。１０7ＰＦＵ／gmを超える脳ウ
イルス力価を有するマウスは、麻痺し、死亡したが
（「図８」のＡ、黒塗りの三角形）、１０6ＰＦＵ／g未
満の脳ウイルス力価を有するグループのマウスは、健康
なままであった（白抜きの三角形）。１４日目までに
は、生存マウスの脳からウイルスが浄化された。
【００６９】ＩＣ４７をｉｃ接種したマウスにおいて、
ウイルスは、脳組織中ですぐに増殖し始めるが、ＩＣ４
７は、親ウイルスと比較してより遅く脳中に蓄積され、
ＩＣ４７は、親ウイルスについて観察された力価よりも
低い力価を達成した。「図８」のＢを参照。最大脳力価
は、５日目で約１０4.7ＰＦＵ／gmであった。ＩＣ４７
は、８日目までに脳から浄化される。ｉｐ投与によって
ＩＣ４７を接種したマウスの脳組織においてウイルス
は、全く検出されなかった。
ウイルスは、脳組織中ですぐに増殖し始めるが、ＩＣ４
７は、親ウイルスと比較してより遅く脳中に蓄積され、
ＩＣ４７は、親ウイルスについて観察された力価よりも
低い力価を達成した。「図８」のＢを参照。最大脳力価
は、５日目で約１０4.7ＰＦＵ／gmであった。ＩＣ４７
は、８日目までに脳から浄化される。ｉｐ投与によって
ＩＣ４７を接種したマウスの脳組織においてウイルス
は、全く検出されなかった。
【００７０】実施例５ 免疫化−攻撃研究 ＩＣ４７を用いて親ウイルスに対する保護免疫性を与え
ることができるかを測定するために、８匹のマウスの３
つのグループに１００ ＰＦＵのＩＣ４７を接種した。
２週齢マウスにはｉｐ接種し、一方、３週齢マウスには
ｉｐ経路またはｉｃ経路のいずれかによって接種した。
ＩＣ４７接種から２週間後、マウスを１００ ＰＦＵの
親ウイルスでｉｃ経路によって攻撃した。
ることができるかを測定するために、８匹のマウスの３
つのグループに１００ ＰＦＵのＩＣ４７を接種した。
２週齢マウスにはｉｐ接種し、一方、３週齢マウスには
ｉｐ経路またはｉｃ経路のいずれかによって接種した。
ＩＣ４７接種から２週間後、マウスを１００ ＰＦＵの
親ウイルスでｉｃ経路によって攻撃した。
【００７１】全ての非免疫化マウスは、７日目までに死
亡したが、ＩＣ４７で処置した全てのマウスは、該攻撃
にもかかわらず疾患の徴候を伴わずに生き残った。攻撃
されたマウスの最大ウイルス力価は、脳組織gm当たり１
０7ＰＦＵ以下であり、これは、非免疫化マウスの脳に
おいて観察された力価よりも１０倍低かった。「図９」
を参照。親ウイルスは、１４日目までに脳組織から浄化
された。
亡したが、ＩＣ４７で処置した全てのマウスは、該攻撃
にもかかわらず疾患の徴候を伴わずに生き残った。攻撃
されたマウスの最大ウイルス力価は、脳組織gm当たり１
０7ＰＦＵ以下であり、これは、非免疫化マウスの脳に
おいて観察された力価よりも１０倍低かった。「図９」
を参照。親ウイルスは、１４日目までに脳組織から浄化
された。
【００７２】実施例６ エンベロープタンパク構造のコンピューターシミュレー
ション アミノ酸配列データに基づくタンパク構造の予想のため
に数種類のシミュレーションプログラムが利用可能であ
る。これらのプログラムを用いて、組換え野生型ＩＣ３
７および138Ｌys突然変異を有する組換え弱毒化ＩＣ４
７の予想されたエンベロープタンパク構造を比較した。
チョウ−ファスマン（Ｃhou-Ｆasman）・プログラムお
よびガーニャー−オスグトープ−ロビンソン（Ｇarnier
−Ｏsguthorpe−Ｒobinson）・プログラムを用いて、α
螺旋、βシートおよび回転を含む二次元構造を予想し
た。チョウ（Ｃhou）ら、Ａdv.Ｅnz.Ｒelat.Ａreas Ｍo
l.Ｂiol.４７：４５（１９７８）；ガーニャー（Ｇarni
er）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１２０：９７（１９７８）。他
のプログラムを用いて、親水性、表面確率、フレキシビ
リティ、および抗原性などのさらなるパラメーターを予
想した。ホップ（Ｈopp）ら、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）７
８：３８２４（１９８１）；エミニ（Ｅmini）ら、Ｊ.
Ｖirology ５５：８３６（１９８５）；ジェイムソン・
ビー・エイ（Ｊameson ＢＡ）ら、コンピューター・ア
プリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（Ｃ
omputer Ａpplications in theＢiosciences）４：１８
１（１９８８）。
ション アミノ酸配列データに基づくタンパク構造の予想のため
に数種類のシミュレーションプログラムが利用可能であ
る。これらのプログラムを用いて、組換え野生型ＩＣ３
７および138Ｌys突然変異を有する組換え弱毒化ＩＣ４
７の予想されたエンベロープタンパク構造を比較した。
チョウ−ファスマン（Ｃhou-Ｆasman）・プログラムお
よびガーニャー−オスグトープ−ロビンソン（Ｇarnier
−Ｏsguthorpe−Ｒobinson）・プログラムを用いて、α
螺旋、βシートおよび回転を含む二次元構造を予想し
た。チョウ（Ｃhou）ら、Ａdv.Ｅnz.Ｒelat.Ａreas Ｍo
l.Ｂiol.４７：４５（１９７８）；ガーニャー（Ｇarni
er）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１２０：９７（１９７８）。他
のプログラムを用いて、親水性、表面確率、フレキシビ
リティ、および抗原性などのさらなるパラメーターを予
想した。ホップ（Ｈopp）ら、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）７
８：３８２４（１９８１）；エミニ（Ｅmini）ら、Ｊ.
Ｖirology ５５：８３６（１９８５）；ジェイムソン・
ビー・エイ（Ｊameson ＢＡ）ら、コンピューター・ア
プリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（Ｃ
omputer Ａpplications in theＢiosciences）４：１８
１（１９８８）。
【００７３】親水性、表面確率、フレキシビリティおよ
び抗原性についてのシミュレーションの結果には有意な
差異はなかった。しかしながら、チョウ−ファスマンお
よびガーニャー−オスグトープ−ロビンソンの両方のプ
ログラムは、２種類のウイルスの二次元構造における差
異を予想した。チョウ−ファスマン・プログラムによる
と、回転、α螺旋およびβシートにおいて差異はある。
ガーニャー−オスグトープ−ロビンソン・プログラム
は、２種類のウイルスのエンベロープタンパク間の回転
の差異を予想した。したがって、138Ｌys突然変異が、
ＩＣ４７の弱毒化表現型に誘導するようにエンベロープ
タンパクのコンホーメーションを変化させることが可能
である。
び抗原性についてのシミュレーションの結果には有意な
差異はなかった。しかしながら、チョウ−ファスマンお
よびガーニャー−オスグトープ−ロビンソンの両方のプ
ログラムは、２種類のウイルスの二次元構造における差
異を予想した。チョウ−ファスマン・プログラムによる
と、回転、α螺旋およびβシートにおいて差異はある。
ガーニャー−オスグトープ−ロビンソン・プログラム
は、２種類のウイルスのエンベロープタンパク間の回転
の差異を予想した。したがって、138Ｌys突然変異が、
ＩＣ４７の弱毒化表現型に誘導するようにエンベロープ
タンパクのコンホーメーションを変化させることが可能
である。
【００７４】実施例７ エンベロープタンパクにおける138Ａspおよび138Ａrg突
然変異を有する組換えウイルスの特徴付け 部位特異性突然変異誘発を用いて、エンベロープタンパ
クの１３８位に以下の突然変異：Ａrg（ＡＧＡ）［「
138Ａrg」］、Ａrg（ＡＧＧ）およびＡsp（ＧＡＣ）
［「138Ａsp」］を有する組換えウイルスを産生した。
ＤＮＡ配列分析を用いて、ヌクレオチド置換を証明し
た。
然変異を有する組換えウイルスの特徴付け 部位特異性突然変異誘発を用いて、エンベロープタンパ
クの１３８位に以下の突然変異：Ａrg（ＡＧＡ）［「
138Ａrg」］、Ａrg（ＡＧＧ）およびＡsp（ＧＡＣ）
［「138Ａsp」］を有する組換えウイルスを産生した。
ＤＮＡ配列分析を用いて、ヌクレオチド置換を証明し
た。
【００７５】３週齢のマウスにｉｃ経路により１００Ｐ
ＦＵの組換え野生型ＩＣ３７、ＩＣ４７、138Ａrgまた
は138Ａspを接種することによって、組換え突然変異ウ
イルスのニューロビルレンス誘発能を試験した。ＩＣ３
７または138Ａspを接種したマウスの全ては、死亡し
た。対照的に、ＩＣ４７または138Ａrgを接種した全て
のマウスは、いずれの病気の徴候もなく生存した。「図
１０」を参照のこと。
ＦＵの組換え野生型ＩＣ３７、ＩＣ４７、138Ａrgまた
は138Ａspを接種することによって、組換え突然変異ウ
イルスのニューロビルレンス誘発能を試験した。ＩＣ３
７または138Ａspを接種したマウスの全ては、死亡し
た。対照的に、ＩＣ４７または138Ａrgを接種した全て
のマウスは、いずれの病気の徴候もなく生存した。「図
１０」を参照のこと。
【００７６】ニューロビルレンス分析は、また、８匹の
５日齢マウスのグループを用いて行った。これらの研究
では、ＩＣ３７の接種後６日目までに全てのマウスが死
亡した。「図１１」を参照のこと。ＩＣ４７および138
Ａrgは、また、これらの新生マウスにおいてニューロビ
ルレントであった。
５日齢マウスのグループを用いて行った。これらの研究
では、ＩＣ３７の接種後６日目までに全てのマウスが死
亡した。「図１１」を参照のこと。ＩＣ４７および138
Ａrgは、また、これらの新生マウスにおいてニューロビ
ルレントであった。
【００７７】これらの研究により、ＩＣ４７および138
Ａrgが５日齢マウスにおいてニューロビルレンスを誘発
したが、３週齢マウスにおいては誘発しなかったことが
判明した。この罹病性パターンは、ヒトを黄熱病ウイル
スから保護するために用いた確立された弱毒化ワクチン
である黄熱病１７Ｄについて見られたものと同様であ
る。
Ａrgが５日齢マウスにおいてニューロビルレンスを誘発
したが、３週齢マウスにおいては誘発しなかったことが
判明した。この罹病性パターンは、ヒトを黄熱病ウイル
スから保護するために用いた確立された弱毒化ワクチン
である黄熱病１７Ｄについて見られたものと同様であ
る。
【００７８】138Ａrgが中和抗体産生を誘発することが
できるかを判定するために、３週齢のＩＣＲマウスに１
００ＰＦＵのウイルスを接種した。接種後７日目および
１４日目に採取した血液試料中で中和抗体力価を測定し
た。両方の血清試料において、１：８０の力価が見られ
た。これらの結果は、138ＡrgがＩＣ４７と同様に免疫
原性であることを示す。
できるかを判定するために、３週齢のＩＣＲマウスに１
００ＰＦＵのウイルスを接種した。接種後７日目および
１４日目に採取した血液試料中で中和抗体力価を測定し
た。両方の血清試料において、１：８０の力価が見られ
た。これらの結果は、138ＡrgがＩＣ４７と同様に免疫
原性であることを示す。
【００７９】攻撃研究において、３週齢のマウスに１０
０ＰＦＵの138Ａrgを接種した。２週間後、該マウスに
１００ＰＦＵのＩＣ３７をｉｃ注射した。７日目までに
全ての非免疫化マウスが死亡したが、138Ａrgで免疫化
した全てのマウスは、いずれの病気の徴候もなく致命的
な攻撃にもかかわらず生き残った。したがって、138Ａr
gおよびＩＣ４７は、同程度に防御免疫を提供すること
が明らかである。
０ＰＦＵの138Ａrgを接種した。２週間後、該マウスに
１００ＰＦＵのＩＣ３７をｉｃ注射した。７日目までに
全ての非免疫化マウスが死亡したが、138Ａrgで免疫化
した全てのマウスは、いずれの病気の徴候もなく致命的
な攻撃にもかかわらず生き残った。したがって、138Ａr
gおよびＩＣ４７は、同程度に防御免疫を提供すること
が明らかである。
【００８０】ＩＣ４７および138Ａrgをマウスの脳中に
継代接種して、弱毒化表現型を提供する突然変異の遺伝
的安定性を測定した。これらの研究において、３週齢の
マウスに両方のウイルスをｉｃ投与し、該マウスを注射
後４日目に殺した。脳ホモジネートを前記に従って調製
し、Ｐ１と命名した。Ｐ１ホモジネートの一部を用い
て、マウスの第２グループに接種し、これらのマウスか
らの脳ホモジネートをＰ２と命名した。このサイクルを
１０代のブラインド継代接種のために継続した。
継代接種して、弱毒化表現型を提供する突然変異の遺伝
的安定性を測定した。これらの研究において、３週齢の
マウスに両方のウイルスをｉｃ投与し、該マウスを注射
後４日目に殺した。脳ホモジネートを前記に従って調製
し、Ｐ１と命名した。Ｐ１ホモジネートの一部を用い
て、マウスの第２グループに接種し、これらのマウスか
らの脳ホモジネートをＰ２と命名した。このサイクルを
１０代のブラインド継代接種のために継続した。
【００８１】Ｐ１０ホモジネートから単離した１００Ｐ
ＦＵのＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイルスを３週
齢のマウスにｉｃ投与して、ニューロビルレンスを測定
した。これらの研究の結果から、弱毒化表現型が１０代
継代接種後に安定であったことが判明した。Ｐ１０ホモ
ジネートからのウイルスのＤＮＡ配列分析により、ＩＣ
４７および138Ａrg突然変異の安定性が証明された。１
０代継代接種後、復帰突然変異体は、観察されなかっ
た。
ＦＵのＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイルスを３週
齢のマウスにｉｃ投与して、ニューロビルレンスを測定
した。これらの研究の結果から、弱毒化表現型が１０代
継代接種後に安定であったことが判明した。Ｐ１０ホモ
ジネートからのウイルスのＤＮＡ配列分析により、ＩＣ
４７および138Ａrg突然変異の安定性が証明された。１
０代継代接種後、復帰突然変異体は、観察されなかっ
た。
【００８２】要約すれば、138Ａrgウイルスは、高度に
弱毒化され、非常に免疫原性であり、防御免疫を誘発
し、遺伝的に安定であり、エンベロープタンパクのアミ
ノ酸１３８をコードするコドンにおいて二重突然変異を
含有する。138Ａrgウイルスのニューロビルレンス特徴
は、黄熱病ワクチン１７Ｄのものと同様である。ＩＣ４
７ウイルスおよび138Ａrgウイルスの両方の弱毒化表現
型は、マウスの脳を介する１０代のブラインド継代接種
後、安定である。138Ａrgウイルスは、二重突然変異を
有し、ＩＣ４７は、単一の突然変異を有するので、138
Ａrgウイルスは、長期間にわたって、ＩＣ４７よりも遺
伝的に安定であることを証明した。
弱毒化され、非常に免疫原性であり、防御免疫を誘発
し、遺伝的に安定であり、エンベロープタンパクのアミ
ノ酸１３８をコードするコドンにおいて二重突然変異を
含有する。138Ａrgウイルスのニューロビルレンス特徴
は、黄熱病ワクチン１７Ｄのものと同様である。ＩＣ４
７ウイルスおよび138Ａrgウイルスの両方の弱毒化表現
型は、マウスの脳を介する１０代のブラインド継代接種
後、安定である。138Ａrgウイルスは、二重突然変異を
有し、ＩＣ４７は、単一の突然変異を有するので、138
Ａrgウイルスは、長期間にわたって、ＩＣ４７よりも遺
伝的に安定であることを証明した。
【００８３】本発明は、以上に挙げた好ましい具体例に
限定されるものではない。前記具体例に種々の変更を行
うことができ、この変更が特許請求の範囲で定義した本
発明の範囲内であることは、当業者には明らかなことで
ある。本明細書に記載した全ての刊行物および特許出願
は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すも
のである。全ての刊行物および特許出願は、出典明示に
より本明細書の一部とする。
限定されるものではない。前記具体例に種々の変更を行
うことができ、この変更が特許請求の範囲で定義した本
発明の範囲内であることは、当業者には明らかなことで
ある。本明細書に記載した全ての刊行物および特許出願
は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すも
のである。全ての刊行物および特許出願は、出典明示に
より本明細書の一部とする。
【図１】 ＪＥＶゲノムの線図および組換えＪＥＶウイ
ルスの構造を示す図。
ルスの構造を示す図。
【図２】 ｃＤＮＡから組換え野生型ＪＥＶの回収スト
ラテジーを示す図。
ラテジーを示す図。
【図３】 ＢＨＫ細胞における親ＪＥＶ、組換え野生型
（ＩＣ３７）および組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）
の増殖率を示すグラフ。
（ＩＣ３７）および組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）
の増殖率を示すグラフ。
【図４】 Ｎ１８細胞における組換え野生型（ＩＣ３
７）および組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の増殖率
を示すグラフ。
７）および組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の増殖率
を示すグラフ。
【図５】 培養培地における親ＪＥＶまたは突然変異Ｊ
ＥＶ（ＩＣ４７）の安定性を示すグラフ。
ＥＶ（ＩＣ４７）の安定性を示すグラフ。
【図６】 親ＪＥＶ、組換え野生型ＪＥＶ（ＩＣ３７）
または組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）で攻撃された
Ｓwiss ＩＣＲ異系交配マウスの生存率を示すグラフ。
または組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）で攻撃された
Ｓwiss ＩＣＲ異系交配マウスの生存率を示すグラフ。
【図７】 親ＪＥＶまたは組換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ
４７）のいずれかを接種した３週齢マウスにおけるウイ
ルス血症の存在および中和抗体産生を示すグラフ。
４７）のいずれかを接種した３週齢マウスにおけるウイ
ルス血症の存在および中和抗体産生を示すグラフ。
【図８】 ＩＣＲマウスの脳における親ＪＥＶまたは組
換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の力価を示すグラフ。
換え突然変異ＪＥＶ（ＩＣ４７）の力価を示すグラフ。
【図９】 ｉｃ経路によって親ウイルスで攻撃されたＩ
Ｃ４７免疫化マウスの脳におけるウイルス力価を示すグ
ラフ。
Ｃ４７免疫化マウスの脳におけるウイルス力価を示すグ
ラフ。
【図１０】 ３週齢のマウスにおける組換え野生型ＩＣ
３７ウイルス、ＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイル
スによるニューロビルレンス（neurovirulence）の誘発
を示すグラフ。
３７ウイルス、ＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイル
スによるニューロビルレンス（neurovirulence）の誘発
を示すグラフ。
【図１１】５週齢のマウスにおける組換え野生型ＩＣ３
７ウイルス、ＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイルス
によるニューロビルレンスの誘発を示すグラフ。
７ウイルス、ＩＣ４７ウイルスまたは138Ａrgウイルス
によるニューロビルレンスの誘発を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/01 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/09 33/531 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｌ 33/531 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｅ 33/569 9162−4Ｂ Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/01 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 スミヨシ ヒデオ アメリカ合衆国06405コネチカット州ブラ ンフォード、オールド・ヒックリー・レイ ン35番 (72)発明者 チャールズ・エイチ・ホウク・ジュニア アメリカ合衆国21044メリーランド州コロ ンビア、カーディナル・レイン6405番
Claims (22)
- 【請求項１】 エンベロープタンパクの１３８位での酸
性アミノ酸の、塩基性アミノ酸への置換によって、対応
する野生型日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）と区別される単
離された突然変異日本脳炎ウイルスであって、該酸性ア
ミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、該
塩基性アミノ酸がリシンまたはアルギニンである突然変
異日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）。 - 【請求項２】 野生型ＪＥＶがＪＥＶ菌株ＪａＯＡｒＳ
９８２であり、酸性アミノ酸がグルタミン酸である請求
項１記載の突然変異ＪＥＶ。 - 【請求項３】 塩基性アミノ酸がリシンである請求項２
記載の突然変異ＪＥＶ。 - 【請求項４】 突然変異ＪＥＶがＩＣ４７（ＡＴＣＣ
Ｎo. ＶＲ ２４１２）である請求項３記載の突然変異Ｊ
ＥＶ。 - 【請求項５】 塩基性アミノ酸がアルギニンである請求
項２記載の突然変異ＪＥＶ。 - 【請求項６】 突然変異日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）の
ゲノムをコードする単離されたＤＮＡ分子であって、突
然変異ＪＥＶが、エンベロープタンパクをコードする遺
伝子における１または２個のヌクレオチド置換からなる
突然変異によって、対応する野生型ＪＥＶと区別される
単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項７】 突然変異により、野生型ＪＥＶのエンベ
ロープタンパクの１３８位の酸性アミノ酸の、突然変異
ＪＥＶのエンベロープタンパクにおける１３８位の塩基
性アミノ酸への置換が生じ、該酸性アミノ酸がグルタミ
ン酸またはアスパラギン酸であり、塩基性アミノ酸がリ
シンまたはアルギニンである請求項６記載の単離された
ＤＮＡ分子。 - 【請求項８】 塩基性アミノ酸がリシンである請求項７
記載の単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項９】 ｐＭ４３３（ＡＴＣＣ Ｎo. ７５４９
１）のｃＤＮＡ挿入からなる請求項８記載の単離された
ＤＮＡ分子。 - 【請求項１０】 ｐＭ４３３のｃＤＮＡ挿入およびｐＨ
７５６（ＡＴＣＣＮｏ. ７５４９２）のｃＤＮＡ挿入か
らなる請求項９記載の単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１１】 （ａ）鋳型として請求項６記載のＤＮ
Ａ分子を用いてイン・ビトロで全長ウイルスゲノムＲＮ
Ａを合成し； （ｂ）培養動物細胞にウイルスゲノムＲＮＡをトランス
フェクトさせて、ウイルスを産生させ；次いで、 （ｃ）培養動物細胞からウイルスを単離することからな
ることを特徴とする、培養動物細胞からの突然変異ＪＥ
Ｖの産生方法。 - 【請求項１２】 （ａ）請求項１記載の突然変異ＪＥＶ
および（ｂ）医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組
成物の治療有効量を投与することを特徴とする動物にお
けるＪＥＶに対する中和抗体の産生方法。 - 【請求項１３】 突然変異ＪＥＶがＩＣ４７（ＡＴＣＣ
Ｎo. ＶＲ ２４１２）である請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 塩基性アミノ酸がアルギニンである請
求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 医薬組成物が粘膜に投与される請求項
１２記載の方法。 - 【請求項１６】 医薬組成物が、皮下注射、皮内注射お
よび筋肉内注射からなる群から選択される注射の形態に
よって投与される請求項１２記載の方法。 - 【請求項１７】 （ａ）請求項１記載の突然変異ＪＥＶ
および（ｂ）医薬的に許容される賦形剤からなることを
特徴とするビルレント日本脳炎ウイルスからの保護を与
えるための医薬組成物。 - 【請求項１８】 塩基性アミノ酸がリシンである請求項
１７記載の医薬組成物。 - 【請求項１９】 突然変異ＪＥＶがＩＣ４７（ＡＴＣＣ
Ｎo. ＶＲ ２４１２）である請求項１８記載の医薬組
成物。 - 【請求項２０】 塩基性アミノ酸がアルギニンである請
求項１７記載の医薬組成物。 - 【請求項２１】 （ａ）ｐＭ３４３（ＡＴＣＣ Ｎo. ７
５４９０）のｃＤＮＡ挿入からなるＤＮＡ鋳型を用いて
イン・ビトロで全長ウイルスゲノムＲＮＡを合成し； （ｂ）動物細胞の単層培養物に該ウイルスゲノムＲＮＡ
をトランスフェクトさせ（ここで、トランスフェクショ
ンにより、単層培養物内で種々の大きさのウイルス含有
プラークを形成する）；次いで、 （ｃ）単層培養物内の小さなプラークからウイルスを単
離することからなることを特徴とする、突然変異ＪＥＶ
の産生方法。 - 【請求項２２】 野生型フラビウイルスのエンベロープ
タンパクにおける酸性アミノ酸の、突然変異フラビウイ
ルスのエンベロープタンパクにおける塩基性アミノ酸へ
の置換によって、対応する野生型フラビウイルスと区別
される単離された突然変異フラビウイルスであって、該
フラビウイルスが、マリーバレー脳炎ウイルス、セント
ルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよび中
央ヨーロッパダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群から選
択され、酸性アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギ
ン酸であり、塩基性アミノ酸がリシンまたはアルギニン
である突然変異フラビウイルス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/438702 | 1995-05-11 | ||
| US08/438,702 US5736148A (en) | 1993-06-15 | 1995-05-11 | Infectious Japanese encephalitis virus cDNA clones that produce highly attenuated recombinant Japanese encephalitis virus, and vaccines thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0923880A true JPH0923880A (ja) | 1997-01-28 |
Family
ID=23741685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8116062A Withdrawn JPH0923880A (ja) | 1995-05-11 | 1996-05-10 | 高度に弱毒化された組換え日本脳炎ウイルスを産生する感染性日本脳炎ウイルスｃＤＮＡクローンおよびそのワクチン |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0923880A (ja) |
| KR (1) | KR100430960B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007533985A (ja) * | 2004-04-20 | 2007-11-22 | スフィンゴテック・ゲーエムベーハー | 医療診断におけるタキキニンの前駆体および／またはその断片の使用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100710519B1 (ko) * | 2002-10-09 | 2007-04-24 | (주)씨아이디 | 일본뇌염 바이러스의 신규한 전체-길이의 게놈 ＲＮＡ 및상기 ＪＥＶ 게놈 ＲＮＡ에 대한 감염성이 있는 ＪＥＶｃＤＮＡ 및 이것의 용도 |
-
1995
- 1995-11-03 KR KR1019950039564A patent/KR100430960B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-05-10 JP JP8116062A patent/JPH0923880A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007533985A (ja) * | 2004-04-20 | 2007-11-22 | スフィンゴテック・ゲーエムベーハー | 医療診断におけるタキキニンの前駆体および／またはその断片の使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR960040374A (ko) | 1996-12-17 |
| KR100430960B1 (ko) | 2004-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10548964B2 (en) | Antigens and vaccines directed against human enteroviruses | |
| US11753627B2 (en) | Dengue tetravalent vaccine containing a common 30 nucleotide deletion in the 3′-UTR of dengue types 1,2,3, and 4, or antigenic chimeric dengue viruses 1,2,3, and 4 | |
| US8088391B2 (en) | West nile virus vaccine | |
| KR100850620B1 (ko) | 약독된 생백신 | |
| US20150056244A1 (en) | Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses | |
| CN109152828A (zh) | 减毒活zika病毒疫苗 | |
| JPH08504094A (ja) | Ａ型肝炎ワクチン | |
| CN113186171B (zh) | 一种黄病毒属病毒的减毒病毒及其用途 | |
| US5736148A (en) | Infectious Japanese encephalitis virus cDNA clones that produce highly attenuated recombinant Japanese encephalitis virus, and vaccines thereof | |
| JPH0923880A (ja) | 高度に弱毒化された組換え日本脳炎ウイルスを産生する感染性日本脳炎ウイルスｃＤＮＡクローンおよびそのワクチン | |
| Shahana et al. | Japanese Encephalitis: An overview of vaccine development |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060627 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060926 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070109 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070502 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20070613 |
|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20070803 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20091106 |