CN116970624A - 抗SARS-CoV-2及变异株感染的腺病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗SARS‑CoV‑2及变异株感染的疫苗，特别包含一种广谱的抗SARS‑CoV‑2及变异株感染的腺病毒疫苗，属于医药领域。为解决针对SARS‑CoV‑2及其变异株感染尚缺乏有效预防和治疗药物的问题，本发明提供了以人5型复制缺陷腺病毒为载体的新型冠状病毒疫苗，特别包含一种广谱的抗SARS‑CoV‑2感染的疫苗，该疫苗以E1/E3缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，携带经过优化设计的SARS‑CoV‑2及其变异株S蛋白基因，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染，特别是对突变病毒有较好的防治效果。

Description

抗SARS-CoV-2及变异株感染的腺病毒疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抗SARS-CoV-2及变异株感染的腺病毒疫苗。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-Cov-2)是由世界卫生组织命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别，是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。目前，变异新冠病毒主要有五大种类：Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron，Omicron变异株又分为BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA4和BA5等几种亚系。截止目前为止，新型冠状病毒SARS-CoV-2已导致全球5.45亿人感染，其中死亡人数已超630万人。
SARS-CoV-2的主要结构蛋白包括刺突蛋白(Spike，S)、信使蛋白(Envelop，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，其中，S蛋白在病毒的感染和毒力中起着关键作用，常被用来作为疫苗的抗原。由于SARS-CoV-2变异株含有多个突变位点，病毒的S蛋白也含有多个突变位点，导致变异株一定程度上能够逃逸新冠原型株(即“新冠病毒野生株”)疫苗激发的抗体，导致新冠疫苗失效或保护力降低，为疫情防控工作带来巨大压力。因此，开发针对各变异的SARS-CoV-2病毒的疫苗，特别对各变异的SARS-CoV-2病毒的广谱疫苗，对于新型冠状病毒的防治非常重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供抗SARS-CoV-2及变异株感染的腺病毒载体。本发明的另一目的在于提供利用所述腺病毒载体制备的用于预防和/或治疗SARS-CoV-2或其变异株感染的疫苗。
本发明首先提供了编码SARS-CoV-2或变异株S蛋白基因的多核苷酸，所述的多核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；或者在SEQ ID No.3核苷酸序列经取代和/或缺失和/或插入至少一个核苷酸获得的，且与SEQ ID No.3具有相同或相似的生物学活性的核苷酸序列。
进一步地，所述多核苷酸序列包括S蛋白或其突变体自身的信号肽，所述自身信号肽核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述多核苷酸序列包括S蛋白或其突变体自身的信号肽和在自身信号肽前额外添加的人tPA信号肽。
其中，所述S蛋白或其突变体自身的信号肽可被其他信号肽替代。
进一步地，所述的多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2变异株S蛋白是将编码SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸中的第986位K替换为P，将987位V替换为P；所述编码SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一个优选实施方案中，所述的多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2变异株S蛋白还包括对Furin蛋白酶切位点RRAR突变成GSAS。
进一步地，所述多核苷酸序列选自新冠病毒野生型、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron毒株中的S蛋白核苷酸序列中的至少一种。
进一步地，所述多核苷酸序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQIDNo.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15或SEQ ID No.17中的至少一种。
进一步地，上述多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2及变异株S蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16或SEQ ID No.18中的至少一种。
优选地，所述氨基酸序列是在Beta变异株的S蛋白突变位点的基础上加上Delta变异株S蛋白RBD的突变位点。
更优选地，所述多核苷酸序列选自SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.15或SEQ ID No.17中的至少一种。
更优选地，所述多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2变异株S蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16或SEQ ID No.18中的至少一种。
本发明还提供能够表达上述多核苷酸的复制缺陷型重组腺病毒载体。
优选地，所述人复制缺陷型重组腺病毒载体选自人5型、35型、26型或/和黑猩猩AdC68型、AdC7型的复制缺陷型腺病毒，但不限于以上类型的腺病毒病毒载体。更优选地，选自E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。
本发明还提供预防和/或治疗SARS-CoV-2或其变异株感染的疫苗，其包括能够表达上述多核苷酸的人复制缺陷型重组腺病毒载体。
所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
进一步地，所述的佐剂为免疫佐剂。
优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、角鲨烯水包油乳剂、重组霍乱毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN。
进一步地，所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种。
进一步地，所述的钙盐为磷酸三钙。
进一步地，所述的植物皂苷为QS–21或ISCOM。
进一步地，所述的植物多糖为黄芪多糖。
进一步地，所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺。
进一步地，所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵。
进一步地，所述疫苗剂型为肌肉注射剂、注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
优选地，所述疫苗为滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
最后，本发明提供了制备上述腺病毒的方法，包括以下步骤：构建含有上述多核苷酸的穿梭质粒载体；然后将构建的穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞，培养宿主细胞；获得复制缺陷重组腺病毒，然后扩大培养、纯化，即可。
进一步地，所述穿梭质粒载体为pDC316-S、pDC315-S、pDC516-S或pDC515-S中至少一种。
进一步地，所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre、pBHGlox_E1,3FLP中至少一种。
进一步地，所述宿主细胞为HEK293。
本发明还提供了上述多核苷酸，上述疫苗在制备预防和/或治疗呼吸道病毒感染或致病药物中的用途。优选地，所述呼吸道病毒感染是SARS-CoV-2或其变异株感染引起的。
SEQ ID No.1S蛋白或其突变体自身的信号肽核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGC。
SEQ ID No.2S蛋白或其突变体自身的信号肽氨基酸序列
MFVFLVLLPLVS。
SEQ ID No.3野生型Ad-S疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAGTGTGTGAACCTGACAACAAGGACCCAGCTGCCTCCCGCCTACACCAACAGCTTCACAAGGGGCGTGTACTACCCTGACAAGGTGTTCAGGAGCAGCGTGCTGCACTCCACACAGGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCTCCAACGTGACATGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAACGGCACAAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCCTCCACAGAGAAGTC
CAACATCATCAGGGGCTGGATCTTCGGCACAACACTGGACAGCAAGACACAGAGCCTG
CTGATCGTGAACAACGCCACAAACGTGGTCATTAAGGTGTGTGAGTTCCAGTTCTGCAA
CGACCCCTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAG
TTCAGGGTGTACTCCAGCGCCAACAACTGTACATTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTG
ATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTCAAGA
ACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGAGAC
CTGCCTCAGGGCTTCTCCGCCCTGGAGCCTCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACAT
CACAAGATTCCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACCCCCGGCGATTCCA
GCAGCGGCTGGACCGCTGGCGCCGCTGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCCAGGACA
TTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACAATCACCGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGA
TCCTCTGAGCGAGACCAAGTGTACACTGAAGTCCTTCACAGTGGAGAAGGGCATCTACC
AGACCTCCAACTTCAGAGTGCAGCCCACAGAGAGCATCGTGAGATTCCCTAACATCACA
AACCTGTGCCCTTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTG
GAACAGAAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAACTCCGCC
TCCTTCTCCACATTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTC
ACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCC
CCGGACAGACCGGCAAGATCGCCGATTACAACTACAAGCTGCCCGATGACTTCACCGGC
TGTGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGATTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTA
CCTGTACAGACTGTTCAGAAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGATATCTCCACCG
AGATCTACCAGGCCGGCTCCACACCTTGTAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTC
CCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGAGT
GGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACAGTGTGTGGCCCAAAGAAG
TCCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGTGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCA
CAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCAGAGA
CATCGCCGATACCACAGACGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGATATCA
CCCCTTGCAGCTTCGGCGGCGTGTCCGTGATCACCCCTGGCACAAACACCAGCAACCA
GGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACAGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCC
GACCAGCTGACCCCCACATGGAGAGTGTACTCCACCGGCTCCAACGTGTTCCAGACAA
GGGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCATGTGAACAACAGCTACGAGTGTGACATCCCT
ATCGGCGCCGGCATCTGCGCCAGCTACCAGACCCAGACCAACAGCCCCAGGAGGGCCA
GATCCGTGGCCAGCCAGAGCATCATCGCCTACACCATGTCCCTGGGCGCCGAGAACAGC
GTGGCCTACTCCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACAATCTCCGTGACCAC
CGAGATCCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACATCCGTGGATTGTACCATGTACATCTGCGG
CGACAGCACAGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCTCCTTCTGTACCCAGCTGA
ACAGGGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTGTTCG
CCCAGGTGAAGCAGATCTACAAGACACCTCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAACTTC
TCCCAGATCCTGCCCGACCCTTCCAAGCCCTCCAAGAGATCCTTCATCGAGGACCTGCT
GTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTGG
GCGACATCGCCGCCAGAGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAACGGCCTCACCGTGCT
GCCCCCTCTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACCAGCGCCCTGCTGGCCGGAA
CAATCACCAGCGGCTGGACATTCGGCGCCGGCGCTGCTCTGCAGATCCCTTTCGCCATG
CAGATGGCCTACAGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAGAACC
AGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGATTCCCTGAGC
AGCACAGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAACCAGAACGCCCAGGCCC
TGAACACACTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCTCAA
CGACATCCTGAGCAGACTGGATAAGGTGGAGGCCGAGGTGCAGATCGATAGACTGATCA
CCGGCAGGCTGCAGTCCCTGCAGACATACGTGACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGA
GATCAGGGCCAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGTCCGAGTGTGTGCTGGGCCAG
AGCAAGAGGGTGGACTTCTGTGGCAAGGGCTACCACCTGATGTCCTTCCCTCAGTCCGC
CCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACATACGTGCCTGCCCAGGAGAAGAACTTCA
CAACAGCCCCTGCCATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCAGGGAGGGCGTGTT
CGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACCCAGAGGAACTTCTACGAGCCTCAGATCA
TCACAACCGATAACACATTCGTGAGCGGCAACTGTGATGTGGTCATTGGCATCGTGAAC
AATACCGTGTACGATCCCCTGCAGCCTGAGCTGGACTCCTTCAAGGAGGAGCTGGATAA
GTACTTCAAGAACCACACCTCCCCCGACGTGGATCTGGGCGACATTAGCGGCATCAACG
CCTCCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAACCT
GAACGAGTCCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGG
CCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACAATC
ATGCTGTGTTGCATGACATCCTGTTGTTCCTGTCTGAAGGGCTGTTGTAGCTGTGGCTCC
TGTTGCAAGTTCGACGAGGATGACTCCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACT
ACACCTGA
SEQ ID No.4野生型Ad-S疫苗S抗原的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16或SEQ ID No.18是将SEQ ID No.4的S蛋白的第986位赖氨酸(K)替换为脯氨酸(P)，将987位缬氨酸(V)替换为脯氨酸(P)。
SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.15或SEQ ID No.17是在野生型S蛋白基因的核苷酸序列基础上结合各变异株S蛋白突变位点的氨基酸得到各变异株S蛋白基因的核苷酸序列，并进行密码子优化而得。
SEQ ID No.5Ad-S-Beta疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGACCACAAGAACACAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGCGTGTATTATCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTGCTGCACAGCACCCAAGACCTGTTTCTGCCTTTT
TTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGA
GATTCGCCAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCACCGAGAAG
AGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGATAGCAAGACACAGAGCCT
GCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCA
ACGACCCCTTCCTGGGCGTGTATTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGA
GTTCAGAGTCTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCC
TGATGGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAATTTCAAGAACCTGAGAGAGTTCGTGTTCAA
GAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGAG
GCCTGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAAC
ATCACAAGATTTCAGACACTGCACCGGTCCTATCTCACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGG
GTGGACCGCTGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGC
TGAAGTACAACGAGAACGGCACCATTACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCCCT
GAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACA
AGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCAACCT
GTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGGAACC
GGAAAAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCTAGCTT
CAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACC
AACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATCGCCCCCG
GGCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTG
CGTGATCGCCTGGAACAGCAATAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTAC
CTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCACCG
AGATCTACCAAGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTGAAGGGCTTCAACTGCTACTTC
CCCCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCCACCTACGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGT
GGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCTGCCACCGTGTGTGGCCCCAAGAAG
AGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGGCTGACCGGGA
CCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTTCTGCCCTTTCAACAGTTCGGCAGAGA
CATCGCCGACACCACCGACGCCGTCCGGGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCA
CCCCCTGCTCCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCAACCA
AGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCC
GATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTTCAGACAA
GAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCC
CATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAACAGCCCTAGAAGAGCTA
GAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGTGGAGAACAG
CGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCA
CCGAAATCCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGC
GGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACACAGC
TGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGTGTT
CGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAACT
TCAGCCAAATTCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGAGAAGCTTCATCGAGGACCTG
CTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCT
GGGCGATATCGCTGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAACGGCCTGACCGTGC
TCCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACAAGCGCTCTGCTCGCCGGG
ACCATCACATCCGGGTGGACATTCGGGGCCGGCGCTGCCCTGCAGATCCCCTTCGCCAT
GCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGAGAATC
AGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGCCTGAG
CAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAATCAGAACGCCCAAGCC
CTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCTCCGTGCTGA
ACGACATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATTGACAGACTGAT
CACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGCCGCC
GAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGGC
AGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAG
CGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAAGAAC
TTCACCACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGT
GTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGCCTCAG
ATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATTGT
GAACAATACCGTGTACGACCCCCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTG
GACAAGTACTTCAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATTAGCGGCA
TCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATCGACAGACTGAACGAGGTGGCCAA
GAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATC
AAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTG
ACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGTTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTG
CGGGAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAA
GCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.6Ad-S-Beta疫苗S抗原的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID No.7Ad-S-Delta疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGGGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTGCTGCACAGCACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCTCCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACACAGAGC
CTGCTGATTGTGAACAACGCTACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTG
CAACGACCCCTTCCTGGGGGTGTACTACCACAAAAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGC
GGCGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCCTGAT
GGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAACTTCAAGAACCTCAGAGAGTTCGTGTTCAAGAA
CATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGAGACC
TGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATC
ACAAGATTTCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCCGGCGACAGCA
GCAGCGGGTGGACAGCCGGCGCTGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAAC
CTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATTACCGACGCCGTCGACTGCGCCCTGG
ACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTA
TCAGACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATC
ACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGC
CTGGAACAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGC
GCTAGCTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGGGTCAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTG
CTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATC
GCCCCCGGGCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCA
CCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGATAGCAAGGTGGGCGGCAACTA
CAACTATAGATACAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCA
GCACCGAGATCTACCAAGCCGGCAGCAAGCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTG
CTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTATCAGCCCT
ACAGAGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCTGCCACCGTGTGCGGCCC
CAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTG
ACCGGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTCCCTTTTCAGCAGTTCG
GCAGAGACATCGCCGACACCACCGATGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCT
GGACATCACCCCCTGCAGCTTTGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACA
AGCAACCAAGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCA
TCCACGCCGATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTT
CAGACAAGAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCG
ACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAACAGCAGACGG
AGAGCTAGAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGA
GAACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCG
TGACCACCGAGATCCTGCCCGTCTCCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTAC
ATCTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCAC
ACAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGA
GGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTCGGCGGCT
TCAACTTCAGCCAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGAGAAGCTTCATCGAG
GACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCG
ACTGCCTGGGCGACATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAATGGCCTG
ACCGTCCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACAAGCGCCCTGCT
GGCCGGCACAATTACAAGCGGCTGGACATTCGGCGCTGGCGCCGCCCTGCAAATCCCCT
TCGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTAC
GAGAATCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACA
GCCTGAGCAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGAACGTGGTGAATCAGAACGC
CCAAGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCTCC
GTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGACC
GGCTGATCACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAG
AGCCGCCGAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTG
CTGGGGCAGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCC
CTCAGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGA
GAAGAACTTCACCACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGA
GAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACG
AGCCTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATC
GGCATTGTGAACAATACAGTCTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGA
GGAGCTGGACAAGTACTTCAAGAATCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGGGACATC
AGCGGCATCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATCGACAGACTGAACGAGG
TGGCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCA
GTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGT
GATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGCT
GCTCCTGCGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGG
CGTGAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.8Ad-S-Delta疫苗S抗原的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID No.9Ad-S-Beta-Delta疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGACCACAAGAACACAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGCGTGTATTATCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTGCTGCACAGCACCCAAGACCTGTTTCTGCCCTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGATTCGCCAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGATAGCAAGACACAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTGTATTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGAGTCTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCT
TCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAATTTCAAGAACCTGAGAGAGTTCGTGTT
CAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGA
GAGGCCTGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATC
AACATCACAAGATTTCAGACCCTGCACCGGAGCTATCTGACCCCTGGCGACTCCTCCTC
CGGGTGGACCGCTGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCC
TGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATTACAGACGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCC
CCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAG
ACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCA
ACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGG
AACAGAAAAAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCTA
GCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTC
ACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATCGCCC
CCGGGCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTATAAGCTCCCCGACGACTTCACCGGC
TGCGTGATCGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACT
ACAGATATAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCAC
CGAGATCTACCAAGCCGGCAGCAAGCCCTGCAACGGCGTGAAGGGCTTCAACTGCTAC
TTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCCACCTACGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAG
AGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTCTGCGGCCCCAAG
AAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGGCTGACCG
GCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCAG
AGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGAC
ATCACACCCTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCA
ACCAAGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCA
CGCCGATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTCTATAGCACCGGCAGCAACGTGTTTCAGA
CAAGAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACAT
CCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAACAGCCCTAGAAGAG
CTAGAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGTGGAGAAC
AGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGAC
CACCGAGATCCTCCCTGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACATCT
GCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACACA
GCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGT
GTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCA
ACTTCAGCCAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGAGAAGCTTCATCGAGGAC
CTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTG
CCTGGGCGACATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAACGGCCTGACCG
TGCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAATACACAAGCGCCCTCCTGGCC
GGGACAATCACATCCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGGGCTGCCCTGCAGATCCCCTTCGC
CATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGAGA
ATCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGCCTG
AGCAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAATCAGAACGCCCAAG
CCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCT
GAACGACATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGATAGACTG
ATCACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGCCG
CCGAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGG
GCAGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAG
AGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAAGA
ACTTCACCACCGCTCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGC
GTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGCCTC
AGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATC
GTGAACAATACCGTCTACGACCCCCTGCAACCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGC
TGGACAAGTACTTCAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGG
CATCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAAATCGATCGGCTGAATGAGGTGGCCA
AGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACAT
CAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGT
GACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGTAGCT
GTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGA
AGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.10Ad-S-Beta-Delta疫苗S抗原的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID No.11Ad-S-Omicron-BA.1疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGACCACAAGAACACAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTCCTCCACAGCACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGTGATCAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCATCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACACAGAGCCTGCTGATCGTCAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGAGTGTATAGCAGCGCTAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAACTTCAAAAACCTGAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCATCGTGAGAGAGCCCGAGGACCTGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACAAGATTTCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGATCCTATCTGACCCCTGGGGACAGCAGCAG
CGGCTGGACCGCTGGCGCTGCCGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCC
TGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACAATCACCGATGCCGTCGACTGCGCCCTGGACCC
CCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAG
ACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCA
ACCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGG
AATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACCTGGCCC
CCTTCTTCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTC
ACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATCGCCC
CCGGGCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGG
CTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAAGCTCGACAGCAAGGTGAGCGGCAACTACAAC
TACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCA
CCGAGATCTACCAAGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCTTCAACTGCTA
CTTCCCCCTGAGAAGCTACAGCTTCAGACCCACCTACGGCGTGGGCCATCAGCCCTACA
GAGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAA
GAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGAAG
GGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTTCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCA
GAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGA
CATCACCCCCTGCTCCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCA
ACCAAGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCA
CGCCGATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTTCAG
ACAAGAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGTACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACA
TCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAAGAGCCACAGAAG
AGCTAGAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGA
ACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTG
ACCACCGAAATTCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACAT
CTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACA
CAGCTGAAGAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAG
GTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGTACTTCGGCGGCTT
CAACTTCAGCCAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGAGAAGCTTCATCGAGG
ACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGA
CTGCCTGGGCGATATTGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAAGGGCCTGA
CCGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTATACAAGCGCCCTCCTC
GCTGGGACCATCACAAGCGGCTGGACATTCGGGGCCGGCGCTGCCCTGCAGATCCCCTT
CGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACG
AGAATCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAG
CCTGAGCAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAACCACAACGCC
CAAGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCAGCAGCG
TGCTGAACGACATCTTCAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGACCG
GCTCATCACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGA
GCCGCCGAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGC
TGGGGCAGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCC
TCAGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAG
AAGAACTTCACCACCGCTCCCGCCATTTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGA
GGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAG
CCTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGTGACGTGGTGATCGG
CATCGTGAACAATACCGTGTACGACCCCCTGCAGCCCGAACTGGACAGCTTCAAGGAG
GAGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATTA
GCGGCATCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATTGACAGACTGAACGAGGT
GGCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCA
GTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGT
GATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAAGGCTGCT
GCAGCTGCGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGG
GCGTGAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.12Ad-S-Omicron-BA.1疫苗S抗原的氨基酸序列
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SEQ ID No.13Ad-S-Omicron-BA.2疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGATCACAAGAACACAGAGCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTCCTCCACAGCACCCAAGACCTGTTCCTGCCTTTCTTTAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACACAGAGCCTGCTGATCGTCAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGACGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGAGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAACTTCAAAAACCTGAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGGCAGAGACCTGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACAAGATTTCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGATCCTACCTCACACCTGGCGACAGCAGCTCCGGCTGGACCGCTGGCGCTGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACAATCACCGATGCCGTCGACTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCA
ACCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGG
AACAGAAAAAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACTTCGCCC
CCTTCTTCGCCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTC
ACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCAACGAGGTGAGCCAAATCGCCC
CCGGGCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGG
CTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAAGCTCGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAAC
TACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCA
CCGAGATCTACCAAGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCTTCAACTGCTA
CTTCCCCCTGAGAAGCTACGGCTTCAGACCCACCTACGGCGTGGGCCATCAGCCCTACA
GAGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAA
GAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACC
GGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTCCCCTTTCAGCAGTTCGGCA
GAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGA
CATCACCCCCTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGC
AACCAAGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCC
ACGCCGATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACTCCACCGGCAGCAACGTGTTTCAG
ACAAGAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGTACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACA
TCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAAGAGCCACAGAAG
AGCTAGAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGA
ACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTG
ACCACCGAGATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACAT
CTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACA
CAGCTGAAGAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAG
GTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGTACTTCGGCGGCTT
CAACTTCAGCCAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGG
ACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGA
CTGCCTCGGCGACATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAATGGCCTGA
CCGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTATACCTCCGCCCTGCTCG
CCGGGACCATCACAAGCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGCGCCGCCCTCCAAATCCCCTTC
GCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGA
GAATCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGC
CTGAGCAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAACCACAACGCCC
AAGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCAGCAGCGT
GCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGATAGAC
TGATCACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGC
CGCCGAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTG
GGGCAGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTC
AGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAA
GAACTTCACAACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAG
GGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGC
CTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGG
ATCGTGAACAACACCGTGTACGATCCCCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGG
AGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATTAG
CGGCATCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATCGACAGACTGAATGAGGTG
GCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGT
ACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGA
TGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGC
AGCTGCGGCTCCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCG
TGAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.14Ad-S-Omicron-BA.2疫苗S抗原的氨基酸序列
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SEQ ID No.15Ad-S-Omicron-BA.2.12.1疫苗S抗原的核苷酸序列
ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAATGCGTGAACCTGATCACAAGAACACAGAGCTACACCAACAGCTTCACAAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGAAGCAGCGTCCTCCACAGCACCCAAGACCTGTTCCTGCCTTTCTTTAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCTAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACACAGAGCCTGCTGATCGTCAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGACGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGAGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAAGGCAACTTCAAAAACCTGAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGGCAGAGACCTGCCCCAAGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACAAGATTTCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGATCCTACCTCACACCTGGCGACAGCAGCTCCGGCTGGACCGCTGGCGCTGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACAATCACCGATGCCGTCGACTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACTTCGCCCCCTTCTTCGCCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCAACGAGGTGAGCCAAATCGCCC
CCGGGCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGG
CTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAAGCTCGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAAC
TATCAGTACAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCA
CCGAGATCTACCAAGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCTTCAACTGCTA
CTTCCCCCTGAGAAGCTACGGCTTCAGACCCACCTACGGCGTGGGCCATCAGCCCTACA
GAGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAA
GAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACC
GGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTCCCCTTTCAGCAGTTCGGCA
GAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGA
CATCACCCCCTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGC
AACCAAGTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCC
ACGCCGATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACTCCACCGGCAGCAACGTGTTTCAG
ACAAGAGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGTACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACA
TCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAAGAGCCACAGAAG
AGCTAGAAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGA
ACCTGGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTG
ACCACCGAGATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACAT
CTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACA
CAGCTGAAGAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAG
GTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGTACTTCGGCGGCTT
CAACTTCAGCCAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGG
ACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGA
CTGCCTCGGCGACATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAATGGCCTGA
CCGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTATACCTCCGCCCTGCTCG
CCGGGACCATCACAAGCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGCGCCGCCCTCCAAATCCCCTTC
GCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGA
GAATCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGC
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AAGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCAGCAGCGT
GCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGATAGAC
TGATCACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGC
CGCCGAGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTG
GGGCAGAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTC
AGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAA
GAACTTCACAACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAG
GGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGC
CTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGG
ATCGTGAACAACACCGTGTACGATCCCCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGG
AGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATTAG
CGGCATCAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATCGACAGACTGAATGAGGTG
GCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGT
ACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGA
TGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGC
AGCTGCGGCTCCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCG
TGAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID No.16Ad-S-Omicron-BA.2.12.1疫苗S抗原的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLGRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYQYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENLVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID No.17Ad-S-Omicron-BA.4/5疫苗S抗原的核苷酸序列
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CCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGG
CGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCAGAGACATC
GCCGACACCACCGATGCTGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCC
TTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCAACCAAGTG
GCCGTGCTGTACCAAGGCGTCAACTGCACAGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGATCA
GCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACTCCACCGGCAGCAACGTGTTTCAGACAAGAGCC
GGCTGCCTGATCGGCGCCGAGTACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGG
CGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAAGAGCCACAGAAGAGCTAGAAGC
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CCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAG
ATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGA
CAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACACAGCTGAAG
AGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCC
AAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGTACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGC
CAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTT
CAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTCGGC
GACATCGCTGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAACGGCCTCACAGTGCTGCC
CCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACCTCCGCTCTGCTGGCCGGCACAA
TTACATCCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGCGCCGCCCTGCAAATCCCCTTCGCCATGCAG
ATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGAGAATCAGAA
GCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGCCTGAGCAGC
ACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAACCACAACGCCCAAGCCCTGA
ACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCTCCTCCGTCCTGAACGA
CATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATTGACAGACTGATTACCG
GCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGAT
CAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGGCAGAGC
AAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCCC
CCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAAGAACTTCAC
CACCGCTCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGTGTTCG
TGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGCCTCAGATCATC
ACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTCAACA
ACACCGTGTACGACCCCCTGCAACCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTGGACAA
GTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGGGACATCTCCGGCATCAAC
GCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAAATTGACAGACTGAATGAGGTGGCCAAGAACC
TGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTG
GCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCAT
CATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGCAGCTGTCTGAAGGGCTGCTGCTCCTGCGGCA
GCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGC
ACTACACCTGA
SEQ ID No.18Ad-S-Omicron-BA.4/5疫苗S抗原的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLGRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
有益效果：本发明将新冠病毒变异株的S蛋白突变体的986位赖氨酸(K)突变为脯氨酸(P)，987位缬氨酸(V)突变为脯氨酸(P)，以提高S蛋白稳定性以及表达水平。其中，Beta-Delta嵌合型S蛋白的基因序列是在Beta变异株的S蛋白突变位点的基础上加上Delta变异株S蛋白RBD的突变位点。再将S蛋白的氨基酸序列转换成核苷酸序列，并进行密码子优化，以获得编码SARS-CoV-2变异株S蛋白基因的多核苷酸。最后以E1/E3缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，制备抗SARS-CoV-2及变异株感染的疫苗，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染，特别是对突变病毒有较好的防治效果。
附图说明
图1为本发明实施例1新冠腺病毒疫苗S抗原结构示意图；
图2为试验1重组Ad5-Beta/Delta病毒全长基因构建示意图及重组腺病毒诱导刺突蛋白Spike的表达水平图；
图3为试验3重组腺病毒疫苗Ad5-WT、Ad5-Beta、Ad5-Delta、Ad5-Omicron BA.1、Ad5-Beta/Delta在血液中的抗RBD特异性结合抗体水平检测图；
图4分别为试验4重组腺病毒疫苗Ad5-WT、Ad5-Beta、Ad5-Delta、Ad5-OmicronBA.1、Ad5-Beta/Delta、Ad5-Omicron BA.4/5对假病毒的中和抗体检测结果图；
图5为试验5中重组腺病毒疫苗Ad5-Beta/Delta于肺泡灌洗液中抗RBD特异性IgG和IgA抗体的检测结果图；
图6为试验6腺病毒疫苗Ad5-Beta/Delta对组织驻留型T细胞的检测结果图；
图7为试验7中Ad5-Beta/Delta重组腺病毒疫苗对肺组织中抗原特异性T细胞的检测结果图；
图8为试验8中Ad5-Beta/Delta重组腺病毒疫苗生发中心反应的检测结果图。
具体实施方式
本发明首先提供了几种抗SARS-CoV-2及其变异株感染的疫苗，特别包含一种广谱的抗SARS-CoV-2感染的腺病毒疫苗。
所述的几种疫苗是含有经序列优化的SARS-CoV-2及Beta、Delta、Omicron变异株BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5和Beta-Delta变异株嵌合的S蛋白基因的重组E1/E3缺失的人5型、35型或26型或/和黑猩猩AdC68型和AdC7型的复制缺陷型腺病毒，SARS-CoV-2及其变异株S蛋白表达所用的信号肽是病毒自身的信号肽。
所述重组腺病毒疫苗被制备为肌肉注射剂、注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
在一个更为优选的实施方案中，所述重组腺病毒疫苗被制备为滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
在一个优选实施方案中，为提高S蛋白的表达量和稳定性，Ad-S-Beta/Delta疫苗的目的基因不仅包括自身的信号肽，还包括在自身信号肽前额外添加的人tPA信号肽，而且除了将编码SARS-Cov-2的S蛋白氨基酸中的第986位K替换为P，第987位V替换为P；还对Furin蛋白酶切位点(RRAR)突变成GSAS。
本发明提供了制备上述的表达SARS-CoV-2及其变异株刺突蛋白的重组E1、E3联合缺失的人5型、35型或26型或/和黑猩猩AdC68型和AdC7型的复制缺陷型腺病毒的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)构建包含编码SARS-CoV-2及Beta、Delta、Omicron BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5变异株和Beta-Delta变异株嵌合的S蛋白基因的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)获得的穿梭质粒载体与骨架质粒共转293A宿主细胞，包装重组E1/E3联合缺失的人5型、35型或26型或/和黑猩猩AdC68型和AdC7型的复制缺陷型腺病毒；
(3)步骤(2)构建成功并鉴定正确的毒种在293细胞中逐级扩增，293细胞工厂或结合片状载体、微载体在生物反应器中扩增，或以悬浮细胞状态在生物反应器中规模化扩增；
(4)收集的培养物利用化学去垢剂裂解释放病毒，经澄清和超滤浓缩后，利用氯化铯超速离心或离子交换层析的的方法纯化，获得目的腺病毒。
上述步骤(4)中，离子交换层析的填料为Q Sepharose XL、Source 30Q或Source15Q等。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1腺病毒疫苗的制备
1.S蛋白基因(野生型和各变异株)序列的优化和合成
选取病毒株(GenBank accession number:YP_009724390.1)为模板，获得野生型刺突(Spike,S)蛋白的基因序列，同时保留了S蛋白自身的信号肽。在此基础上，为保证蛋白提高表达水平的前提下，对密码子进行优化，随后优化后的序列进行基因合成。
在野生型病毒株(GenBank accession number:YP_009724390.1)刺突(Spike,S)蛋白序列的基础上，根据https://covariants.org/网站上提供的新冠病毒Beta、Delta、Omicron等各变异株的突变位点，获得各变异株S蛋白的核苷酸序列，同时保留了各S蛋白突变体自身的信号肽。Beta-Delta嵌合型S蛋白的基因序列是在Beta变异株的S蛋白突变位点的基础上加上Delta变异株S蛋白RBD的突变位点。在此基础上，为保证蛋白的稳定性及提高表达水平的前提下，对蛋白结构进行了突变。首先，将986位赖氨酸(L)替换为脯氨酸(P)，将987位缬氨酸(V)替换为脯氨酸(P)，以提高S蛋白稳定性以及表达水平。其次，对密码子进行优化。随后根据突变和优化的序列合成各变异株S蛋白基因。
按照以上方法合成的SARS-CoV-2及其变异株的S蛋白基因组有WT(野生型)、Beta、Delta、Beta/Delta嵌合型、Omicron BA.1、Omicron BA.4/5，其核苷酸序列分别如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID No.17所示。
2.重组腺病毒新冠疫苗的包装
在基因合成过程中，将合成后的产物利用重组的克隆策略将S基因克隆至pDC316载体中，所得穿梭质粒(pDC316-S)。将以上构建好的包含野生型S和变异株S基因的pDC316-S分别与AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：
1)将8×105个/孔HEK293A细胞接种于六孔板中，高糖DMEM+10％FBS培养基，置于37℃含5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
2)第二天用高糖DMEM+2％FBS换液，将骨架质粒(pBHGlox_E1,3Cre)和穿梭质粒利用lipofectamine3000共转染HEK293A细胞。具体步骤为：每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒2μg，用125μL Opti-MEM培养基进行稀释，然后加入12μL P3000试剂；另取一支1.5mlEP管，用125μL Opti-MEM培养基进行稀释7.5μL lipofectamine3000；将稀释的质粒和稀释的lipofectamine3000按1：1比例混合，室温孵育10-15分钟后加入细胞中，细胞继续培养，细胞长满后传代于25cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，直到细胞出现明显噬斑，待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。
3)收集出毒的细胞培养物，1200rpm离心3分钟，吸取含病毒的上清，细胞沉淀用1/10培养体积的含病毒上清重悬，置于-80℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次。3000rpm离心20分钟，收集含病毒的上清液并与前述的含病毒上清合并，此即为腺病毒疫苗的毒种。
4)取50μL疫苗候选株毒种液，加入2μL蛋白酶K，50℃消化30min释放病毒基因组，以此为模版PCR扩增S基因序列，PCR产物电泳胶回收后测序鉴定，PCR扩增的条件如下：
变性：95℃10min
变性：95℃10s
退火：64℃30s
延伸：72℃2min
延伸：72℃5min
循环数40次
PCR扩增的引物如下：
pDC516-F1：ACACGTCAATGGGAAGTGAAA(SEQ ID No.19)
pDC516-R1：GCTAGACGATCCAGACATGAT(SEQ ID No.20)
3.重组腺病毒新冠疫苗的扩增
经鉴定正确的重组腺病毒疫苗毒种在293细胞中逐级扩增。具体过程如下：按MOI＝10加入80％-90％长满的293细胞，待大部分细胞病毒变圆后，收集病毒培养物，按照上述反复冻融的方法，制备主病毒种子库和工作病毒种子库。利用细胞工厂或生物反应器规模化扩增重组腺病毒疫苗，细胞大部分病变后收集病毒培养物。生物反应器扩增细胞和病毒的过程如下：首先在生物反应器中加入3-5g/LCytodex1微载体后灭菌，然后生物反应器中加入细胞培养液，当运行条件稳定在37℃，pH 7.0，DO 50％，50rpm时，消化收集细胞工厂扩增的HEK293细胞，接种于生物反应器内，接种细胞密度1.0-5.0×105个细胞/ml，补充细胞培养液至5L，反应器细胞培养的条件为温度37℃、转速为30-50rpm、pH7.15～7.25之间、DO30～50％，每天取样检测葡萄糖浓度、细胞密度和微载体上细胞的形态；当生物反应器内的细胞密度达到1.0～5.0×106个细胞/ml时，生物反应器接种重组腺病毒疫苗毒种，MOI为5-30，接种后每天取样检测葡萄糖浓度、培养上清和细胞沉淀中的病毒滴度、和观察微载体上细胞的形态；当大部分细胞重微载体上脱落时，终止培养，向生物反应器中加入病毒裂解液，终浓度为0.05％-1％ Tween 20 37℃裂解2-4小时，后收集病毒液。
4.重组腺病毒新冠疫苗的纯化
收集的病毒利用氯化铯超速离心或离子交换层析的的方法纯化，具体过程如下：
(1)氯化铯超速离心纯化腺病毒疫苗
收集的病毒培养物1200g离心10分钟，吸取含病毒的培养上清，细胞沉淀用1/10培养体积的含病毒上清重悬，-80℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000rpm离心10-20分钟，吸取上清。含病毒的培养上清用100K-300K超滤膜包浓缩10倍；配制1.4g/ml氯化铯溶液(53g氯化铯+87ml 10mM Tris-HCl，PH 7.9)和1.2g/ml氯化铯溶液(氯化铯26.8+92ml10mMTris-HCl，PH 7.9)；在超速管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯溶液，然后轻缓地加入6ml1.2g/ml氯化铯溶液，最后在不连续梯度顶部加入20ml含病毒上清液，配平后100000×g，4℃离心90分钟；离心结束后注射器抽吸出蓝色的病毒带，透析去除氯化铯后保存在-80℃。
(2)离子交换层析纯化腺病毒
收集病毒培养物，用0.05％-1％ Tween 20 37℃裂解2-4小时，裂解的培养物经1.2μm和0.45μm囊式滤器过滤澄清，使用100-300kD分子量的切向流膜包将样品浓缩10倍，随后用10体积的滤洗缓冲液(50mM Tris–HCl，2mM MgCl2，0–500mM NaCl，pH 8.0)进行滤洗，收集滤洗样品；滤洗的样品中加加入核酸酶，终浓度为10-50U/ml，37℃消化1-3小时后，样品利用Q Sepharose XL、Source 30Q或Source 15Q等填料进行阴离子交换层析，具体过程如下：平衡缓冲液20ml/min流速平衡5个柱体积，平衡结束后10ml/min上样，上样结束后平衡缓冲液平衡至电导水平；线性梯度洗脱样品，洗脱的条件为100％低盐缓冲液到100％高盐缓冲液，10V洗脱柱体积，流速为10ml/min，收集各个洗脱峰；洗脱结束后用2M NaCl缓冲液对柱子进行再生5～10个柱体积，速度为20ml/min。收集病毒峰，随后洗脱的病毒样品经透析或切向流过滤进行缓冲液置换(缓冲液成10mM Tris、10mM Na-PO4、150mM NaCl、2mMMgCl2、2％蔗糖、0.15％甘油、0.02％吐温80，pH7.6)。纯化后的腺病毒直接灌装，-20℃避光保存。
以下通过试验例证明本发明的有益效果。
其中，通过实施例1制备的腺病毒疫苗分别定义为Ad5-WT、Ad5-Beta、Ad5-Delta、Ad5-Omicron BA.1、Ad5-Omicron BA.4/5和Ad5-Beta/Delta重组腺病毒疫苗。
试验1重组腺病毒疫苗鉴定
我们首先通过人复制缺陷Ad5腺病毒载体分别表达SARS-CoV-2原始株、Beta株、Delta株、Omicron BA.1、Omicron BA.4/5株的全长刺突糖蛋白，同时我们设计和构建了在Beta毒株的全长基础上，在RBD区域增加Delta株的两个突变L452R和T478K的腺病毒Ad5-Beta/Delta(图2),通过免疫印迹Western blot的方法检测重组Ad5-Beta/Delta病毒感染293T细胞48小时后刺突蛋白Spike的表达水平。如图2所示，腺病毒Ad5-Beta/Delta感染293T细胞后可以诱导产生高水平的Spike蛋白表达，而空载腺病毒对照Ad5-Empty则不能，证明我们的重组腺病毒蛋白疫苗制备成功。
试验2动物准备及小鼠免疫和样品收集
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠购买自维通利华公司，小鼠饲养在四川大学生物治疗国家重点实验室的无特殊病原体的环境中。首先将小鼠分为7组：(1)PBS组、(2)Ad5-Empty、(3)Ad5-WT、(4)Ad5-Beta、(5)Ad5-Delta、(6)Ad5-Omicron和(7)Ad5-Beta/Delta组，通过滴鼻免疫分别向BALB/c小鼠在第0，4，8周免疫以5×109病毒颗粒VP/只的剂量免疫小鼠。在第3、7周通过眼眶静脉采集血液样本，第11周处死小鼠并收集血液、肺泡灌洗液、肺和纵隔淋巴结组织，并将组织制成单细胞悬液进行流式检测。血液在4℃下以6000转/分离心10分钟。血清样品在使用前保存于-20℃，以便后续检测血清中的结合抗体和中和抗体。试验3抗RBD特异性抗体检测
用ELISA法检测血清中RBD特异性抗体。首先，我们用重组RBD蛋白(0.1μg/孔)包被96孔NUNC-MaxiSorp平板(Thermo Fisher Scientific,USA)，4℃，12小时。用1×PBST(1×PBS+0.1％ Tween-20)洗三次，用1％牛血清白蛋白(BSA)在37℃阻隔1小时。培养皿与2倍稀释梯度的血清样品在室温下孵育1小时，然后通过1×PBST洗涤三次。在培养皿中加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗小鼠IgG抗体，室温下孵育1小时，洗5次。在培养皿中加入3,3'，5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，暗处孵育10分钟。用1M H2SO4(100μl/孔)停止反应，在450nm处测定吸光度。
如图3所示，在接种后3、7、11周，重组腺病毒疫苗Ad5-WT、Ad5-Beta、Ad5-Delta、Ad5-Omicron.BA.1、Ad5-Beta/Delta都可以诱导产生高水平的血液中抗RBD特异性结合抗体，因此需要进一步检测血清中的中和抗体水平来评价各种重组腺病毒疫苗诱导的广谱中和免疫反应。
试验4假病毒中和试验
除了BA.3和BA.4/5假病毒从诺唯赞生物科技有限公司购买外，我们从吉满生物科技上海有限公司购买了SARS-CoV-2假病毒(GFP-Luciferase)的其他新冠病毒变异株假病毒。将在第11周处死小鼠后收集到的血清样本在60℃灭活30分钟后，用含有血清和抗生素的DMEM双有培养基三倍梯度稀释血清。稀释后的血清与荧光素酶假病毒(野生型WT，B.1.1.7,B.1.351,P.1,B.1.617,C.37,BA.1,BA.2,BA.2.12.1,BA.3,BA.4/5)在37℃孵育1小时。将1.2×104 293T/ACE2细胞添加到每个孔中表达报告基因。48小时后，去除感染细胞上清后，每孔加入100μl含荧光素酶底物的l裂解试剂。最后，用多模式微板阅读器(PerkinElmer,USA)检测。
如图4所示，Ad5-WT，Ad5-Beta,Ad5-Delta诱导出对自身病毒高水平的中和抗体，但由于Omicron毒株的强的免疫逃逸能力，这三种疫苗诱导针对Omicron亚变的中和抗体水平较低。Ad5-Omicron-BA.1/BA.5疫苗可以诱导出针对Omicron亚变体的高水平中和抗体，但是其无法诱导出针对WT、Alpha、Beta、Delta等高水平的中和抗体。与其他腺病毒疫苗相比，Ad5-Beta/Delta可以诱导出针对包括WT、Alpha、Beta、Delta、Omicron BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3及BA.4/5的高水平广谱性中和抗体。
试验5肺泡灌洗液中抗RBD特异性IgG和IgA抗体的检测
用ELISA法检测肺泡灌洗液中的RBD特异性抗体IgG和IgA。首先，我们用重组RBD蛋白(0.1μg/孔)包被96孔NUNC-MaxiSorp平板(Thermo Fisher Scientific,USA)，4℃，12小时。用1×PBST(1×PBS+0.1％ Tween-20)洗三次，用1％牛血清白蛋白(BSA)在37℃阻隔1小时。培养皿与2倍稀释梯度的肺泡灌洗液样品在室温下孵育1小时，然后通过1×PBST洗涤三次。在培养皿中加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗小鼠IgG或IgA(1：5000稀释)抗体，室温下孵育1小时，洗5次。在培养皿中加入3,3'，5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，暗处孵育10分钟。用1M H2SO4(100μl/孔)停止反应，在450nm处测定吸光度。
如图5所示，在接种后11周，重组腺病毒疫苗Ad5-Beta/Delta诱导产生高水平的肺泡灌洗液中抗RBD特异性结合抗体IgG和IgA，这说明我们的重组腺病毒疫苗可以在呼吸道黏膜部分产生强烈的抗体保护。
试验6肺泡灌洗液中组织驻留型T细胞的检测
使用流式细胞术检测肺泡灌洗液中组织驻留型T细胞(Tissue resident Tcells，TRM)的数量。将收集好的1ml肺泡灌洗液离心(400×g，5分钟)，弃上清后获得细胞沉淀，使用100μlPBS缓冲液重悬细胞后，加入PerCP/Cyanine5.5-conjugated anti-mouseCD3(BioLegend,100718),Brilliant Violet 421-conjugated anti-mouse CD4(BioLegend,100412),Brilliant Violet510-conjugated anti-mouse CD8,PE-conjugated anti-mouse CD44,FITC-conjugated anti-mouse CD69,and APC-conjugatedanti-mouse CD103抗体后，在4℃孵育30分钟。用PBS洗涤一次后，重选细胞，并通过流式细胞术检测。
如图6所示，滴鼻免疫Ad5-Beta/Delta后，相比较于PBS处理的小鼠，腺病毒疫苗可以在肺组织募集大量的组织驻留型CD4+和CD8+T细胞，产生细胞免疫保护。
试验7肺组织中抗原特异性T细胞的检测
使用流式细胞术检测肺组织中抗原特异性T细胞的检测。将收集的肺组织剪碎至1mm3大小后，加入配置好的胶原酶消化液，并在37℃孵育1小时，将组织消化液过70uM筛网得到单细胞悬液。肺组织单细胞在含有刺突蛋白Spike肽库的双有1640培养基中刺激并培养12h，进行细胞内细胞因子染色(ICS)。在1640培养基中加入10％胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、1mM丙酮酸(均来自美国Gibco公司)、50μMβ-巯基乙醇和20U/ml IL-2(均来自Sigma-Aldrich公司)。为了阻止细胞内细胞因子的分泌，brefeldin A(BFA,BDBiosciences)在染色前孵育6小时。细胞在1×PBS冷液中洗涤，在4℃下用PerCP/Cyanine5.5-conjugated anti-mouse CD3(BioLegend,100718),APC-conjugated anti-mouse CD4(BioLegend,100412),FITC-conjugated anti-mouse CD8,PE-conjugatedanti-mouse CD44抗体染色30分钟。然后将细胞固定并打孔，以促进细胞内用PE-Cy7-conjugated anti-mouse IFN-γ,Brilliant Violet510-conjugated anti-mouse TNF-α(所有流式抗体来自BioLegend)在室温下放置2小时染色。用1×PBS洗细胞，再用流式细胞术检测。
T细胞反应是临床结果的主要决定因素，对预防SARS-CoV-2具有重要作用。如图7所示，滴鼻免疫Ad5-Beta/Delta疫苗后诱导产生强大的抗原特异性细胞免疫，包括分泌IFN-γ和TNF-α的T细胞。
试验8生发中心反应的检测
纵隔淋巴细胞单细胞悬液制备完成后，我们用PerCP/Cyanine5.5-conjugatedanti-mouse CD3,PE-Cy7-conjugated anti-mouse CD45R/B220,Brilliant Violet 421-conjugated anti-mouse GL-7,APC-conjugated anti-mouse CD95,Brilliant Violet421-conjugated anti-mouse CD19,APC-conjugated anti-mouse CD4,PE-conjugatedanti-mouse CXCR5,and Brilliant Violet510-conjugated PD-1抗体对Tfh细胞、GC B细胞进行染色(流式抗体均来自BioLegend)。细胞在黑暗中4℃染色。30分钟后，用1×PBS冲洗细胞，用流式细胞仪检测。
持久的记忆反应在再次感染时提供快速有效的保护性免疫。Tfh和GCB细胞的升高代表疫苗可以对机体提供长效的保护性免疫。如图8所示，滴鼻免疫Ad5-Beta/Delta疫苗后可以诱导纵隔淋巴结内Tfh和GCB细胞明显升高，证明我们的重组腺病毒疫苗可以提高长效的免疫保护。
以上仅是本发明的优选实施方案，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.编码SARS-CoV-2或变异株S蛋白基因的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；或者在SEQ ID No.3核苷酸序列上经取代和/或缺失和/或插入至少一个核苷酸，且与SEQ ID No.3具有相同或相似的生物学活性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸序列包括S蛋白或其突变体自身的信号肽，所述自身的信号肽核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；优选地，所述多核苷酸序列包括S蛋白或其突变体自身的信号肽和在自身信号肽前额外添加的人tPA信号肽。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2变异株S蛋白是将编码SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸中的第986位K替换为P，第987位V替换为P；所述编码SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；优选地，所述的多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2变异株S蛋白还包括将Furin蛋白酶切位点RRAR突变成GSAS。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸序列选自新冠病毒野生型、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron毒株中的S蛋白核苷酸序列中的至少一种。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15或SEQ ID No.17中的至少一种；优选地，所述多核苷酸序列选自SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15或SEQ ID No.17中的至少一种。
6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸序列编码的SARS-Cov-2及变异株S蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16或SEQ ID No.18中的至少一种；优选地，所述的多核苷酸序列编码的SARS-Cov-2变异株S蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.10、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16或SEQ ID No.18中的至少一种。
7.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸序列编码的SARS-CoV-2变异株S蛋白的氨基酸序列是在Beta变异株的S蛋白突变位点的基础上加上Delta变异株S蛋白RBD的突变位点。
8.能够表达权利要求1-7任一项所述多核苷酸的复制缺陷型重组腺病毒载体。
9.如权利要求8所述的重组腺病毒载体，其特征在于：所述复制缺陷型重组腺病毒载体选自人5型、35型或26型或/和黑猩猩AdC68型或AdC7型的复制缺陷型腺病毒；优选地，选自E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。
10.预防和/或治疗SARS-CoV-2或其变异株感染的疫苗，其特征在于：其含有能够表达权利要求1-7任一项所述的多核苷酸；或含有权利要求8或9所述的复制缺陷型重组腺病毒载体。
11.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
12.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗剂型为肌肉注射剂、注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂；优选地，所述疫苗为滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
13.制备权利要求8或9中的腺病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：构建含有权利要求1-7任一项所述多核苷酸的穿梭质粒载体；然后将构建的穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞，培养宿主细胞；获得复制缺陷重组腺病毒，然后扩大培养、纯化，即可。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：满足以下至少一项：
所述穿梭质粒载体为pDC316-S、pDC315-S、pDC516-S或pDC515-S中至少一种；
所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre、pBHGlox_E1,3FLP中至少一种；
所述宿主细胞为HEK293。
15.权利要求1-7任一项所述的多核苷酸，权利要求10-12任一项所述的疫苗在制备预防和/或治疗呼吸道病毒感染或致病药物中的用途；优选地，所述呼吸道病毒感染是SARS-CoV-2或其变异株感染引起的。
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