CN111902535A - 能够稳定地表达靶蛋白的重组病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，且尤其涉及生成可以稳定地表达靶蛋白的重组病毒的方法。本发明的重组病毒可用于产生免疫原性组合物或疫苗。

Description

能够稳定地表达靶蛋白的重组病毒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，且尤其涉及可以稳定地表达靶蛋白的重组病毒及其用途。
背景技术
口蹄疫病毒(FMDV)是核糖核酸(RNA)病毒，属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒属(Aphthovirus)(Cooper等人，Intervirology，1978，10，165-180)。作为直径约25nm的裸二十面体病毒，FMDV含有由约8500个核苷酸组成、具有正极性的单链RNA分子。这种RNA分子包含单个开放读码框(ORF)，其编码尤其含有衣壳前体(也称为蛋白P1)的单个多蛋白。蛋白P1在其氨基末端处被肉豆蔻酰化。在成熟过程期间，蛋白P1被蛋白酶3C切割成称为VP0、VP1和VP3的三种蛋白质(Belsham G.J.，Progress inBiophysics and Molecular Biology，1993，60，241-261)。在病毒粒子中，蛋白VP0然后被切割成两种蛋白质，VP4和VP2。关于蛋白VP0转换成VP4和VP2以及形成成熟病毒粒子的机制是未知的。蛋白VP1、VP2和VP3具有约26,000Da的分子量，而蛋白VP4较小，为约8,000Da。
在FMD流行地区，疫苗接种是控制该疾病的有效且主要的手段。针对FMDV的当前商业疫苗主要是完整灭活的FMDV疫苗。此类疫苗的生产需要在高度封闭设施中繁殖大量的剧毒FMDV，所述高度封闭设施是维护昂贵的，并且具有释放活FMDV的潜在风险。另外，一些野外毒株难以适应悬浮BHK细胞并达到高滴度。完整灭活疫苗的另一个问题在于，它有时不能有效地刺激免疫应答，尤其是在猪中，并且因此它需要定期加强注射。
一种新型FMD疫苗是基于病毒样颗粒(VLP)的疫苗。衍生自前体蛋白P1-2A的VLP含有完整病毒上存在的免疫原性位点的整个储库，并且在动物中与病毒粒子一样是免疫原性的。VLP缺乏核酸且没有传染性，因此，基于VLP的疫苗在生产和动物中使用方面具有高安全性概况。FMDV VLP可以使用不同的表达系统和载体进行表达，并且可以作为亚单位疫苗递送(Luis L.Rodriguez和Marvin J.Grubman，Foot and mouth disease virus vaccines，Vaccine 27(2009)D90-D94)。尽管安全且易于制备，但基于VLP的亚单位疫苗有时不能成功地诱导针对疾病的持久性免疫。活疫苗可以在一个或两个剂量中赋予免疫，而基于VLP的亚单位疫苗可能需要在指定时间段内重复施用。
基于VLP的活载体疫苗预计作为控制FMDV的有希望的疫苗候选物。为了开发基于FMDV VLP的活载体疫苗，应该构建含有VLP编码基因的重组病毒。VLP编码基因应该由P1-2A前体基因和3C蛋白酶基因组成，使得VLP可以在重组病毒的复制过程中自动地表达且组装。不幸的是，发现P1-2A基因在重组病毒例如腺病毒的连续传代过程中不能稳定地维持，其因此负面影响VLP产率和疫苗功效。(L.Robinson，T.J.D.Knight-Jones，B.Charleston.Global Foot-and-Mouth Disease Research Update and Gap Analysis:3-Vaccines.Transboundary and Emerging Diseases(2016)P30-41)。
需要开发含有VLP编码基因的重组病毒，其可以允许VLP编码基因在其体外连续传代过程中稳定地维持在重组病毒中。
发明内容
上述技术问题的解决方案通过说明书以及权利要求中表征的实施方案来实现，并且本发明在其不同方面根据权利要求来实施。
一般地，本发明提供了用于增加靶基因的表达稳定性的重组病毒和相关方法。
在上述重组病毒中，靶基因设计为与重组病毒的必需基因功能性连接并且位于必需基因的上游，使得靶基因和必需基因可以共表达。例如，可以在同一ORF内将靶基因插入重组病毒的必需基因的上游，像这样只要重组病毒可以复制，靶基因就与必需基因稳定地共表达。具有靶基因表达丧失或靶基因中的任何移码突变的重组病毒不能复制。在一个实施方案中，重组病毒衍生自疱疹病毒科，尤其是马α疱疹病毒(Equid Alphaherpesvirus)1(EHV-1)。在一个实施方案中，靶基因包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。在本说明书的上下文中，术语“靶基因”和“第一多核苷酸”是可互换的，并且术语“必需基因”和“第二多核苷酸”是可互换的。
通过使用上述重组病毒，靶基因可以通过含有其的重组病毒稳定地表达。
本发明还提供了包含本发明的重组病毒的宿主细胞及其制备方法。
本发明还提供了包含本发明的重组病毒和/或由本发明的重组病毒表达的目的多肽的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗组合物，及其制备方法。本发明还提供了本发明的重组病毒在制备免疫原性/药物/疫苗组合物中的用途。
本发明还提供了通过向动物施用本发明的重组病毒或本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物，以用于治疗和/或预防动物中由病毒引起的临床体征的方法。
本发明进一步涉及用于免疫动物例如产食性动物包括猪的方法，其包括向此类动物施用本发明的重组病毒或本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物。
具体实施方式
本发明涉及重组病毒，其包含在重组病毒的基因组中的表达盒，其中所述表达盒包含编码至少一种目的多肽的第一多核苷酸、以及其为重组病毒的必需基因或其功能片段的第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸功能性连接，其中第一多核苷酸位于第二多核苷酸的上游，并且其中所述第二多核苷酸是在重组病毒中有活性的所述必需基因或其功能片段的唯一拷贝。
本发明还涉及用于制备重组病毒的方法，其包括在重组病毒的基因组中构建表达盒，其中所述表达盒包含编码至少一种目的多肽的第一多核苷酸、以及其为重组病毒的必需基因或其功能片段的第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸功能性连接，其中第一多核苷酸位于第二多核苷酸的上游，并且其中所述第二多核苷酸是在重组病毒中有活性的所述必需基因或其功能片段的唯一拷贝。
本发明进一步涉及用于增加重组病毒内的目的多肽的表达稳定性的方法，其包括在重组病毒的基因组中构建表达盒，其中所述表达盒包含编码至少一种目的多肽的第一多核苷酸、以及其为重组病毒的必需基因或其功能片段的第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸功能性连接，其中第一多核苷酸位于第二多核苷酸的上游，并且其中所述第二多核苷酸是在重组病毒中有活性的所述必需基因或其功能片段的唯一拷贝。
本发明的重组病毒基于将靶基因与重组病毒的必需基因共表达的新构思进行构建。预计靶基因和重组病毒的必需基因的共表达对靶蛋白的稳定表达有益。重组病毒的复制取决于靶基因的表达，其进而又使靶基因的表达稳定。如果重组病毒丧失靶基因的表达或具有靶基因中的任何移码突变，则下游的必需基因也无法功能性表达，并且结果，重组病毒不能复制。即，通过功能性组合在一起，靶基因在复制选择压力下稳定地表达。
通过允许靶基因与必需基因功能性连接，可以实现靶基因和重组病毒的必需基因的共表达。在一个示例性实施方案中，靶基因和必需基因可以设计为位于同一ORF内。因此，在一个实施方案中，本发明的重组病毒的第一多核苷酸和第二多核苷酸在同一ORF内。
存在两种示例性方式，以实现靶基因与必需基因的功能性连接。第一方式是缺失或沉默重组病毒的内源必需基因(即重组病毒的基因组中天然存在的必需基因)，并且将外源引入的相同必需基因插入靶基因的下游，使得靶基因与必需基因功能性连接。因此，在一个实施方案中，第二多核苷酸是外源的，并且重组病毒的内源必需基因已被沉默。第二方式是将靶基因插入病毒的内源必需基因的上游，使得靶基因与必需基因功能性连接。因此，在一个实施方案中，第二多核苷酸是重组病毒的内源必需基因。
在一个实施方案中，第二多核苷酸是重组病毒的内源必需基因。在另一个实施方案中，第二多核苷酸是外源的，并且重组病毒的内源必需基因已被沉默。
在一个实施方案中，第一多核苷酸编码抗原性多肽或治疗性多肽。抗原性多肽可以选自例如FMDV抗原、PRRSV抗原、DEV抗原和PRV抗原，优选FMDV抗原。在一个实施方案中，第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。在一个实施方案中，P1基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：1显示。在一个实施方案中，2A基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：2显示。在一个实施方案中，3C基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：3显示。在一个实施方案中，P1-2A-3C基因盒的核苷酸序列由SEQ ID NO：4显示。
在一个实施方案中，第二多核苷酸是重组病毒的必需基因或其功能片段。必需基因是被认为生物体中对于其复制至关重要的那些基因。关于病毒，必需基因包括但不限于编码衣壳蛋白、DNA解旋酶、DNA复制酶等的那些基因。在一个实施方案中，必需基因编码选自例如衣壳蛋白、DNA复制相关蛋白、DNA解旋酶、DNA复制酶、受体结合蛋白和外出相关蛋白(Egress-related protein)的蛋白质。在一个实施方案中，必需基因来自EHV-1的基因组。在一个实施方案中，必需基因是EHV-1ORF43基因或EHV-1ORF54基因。在一个实施方案中，ORF43基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：5显示。在一个实施方案中，ORF54基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：6显示。
在一个实施方案中，第一多核苷酸经由接头与第二多核苷酸连接。在一个实施方案中，接头可以是柔性接头，例如(GGGGS)n接头，或2A基因，优选2A基因。在一个实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸直接连接。在一个实施方案中，表达盒包含由“第一多核苷酸-接头-第二多核苷酸”的结构显示的构建体。
在一个实施方案中，重组病毒衍生自选自例如疱疹病毒科的病毒，例如马α疱疹病毒1(Equid Alphaherpesvirus 1)(EHV-1)、马α疱疹病毒4(Equid Alphaherpesvirus 4)(EHV-4)和牛α疱疹病毒(Bovine Alphaherpesvirus)1(牛疱疹病毒1、BHV-1)。在一个实施方案中，重组病毒衍生自选自疱疹病毒科，优选α疱疹病毒属(Alphaherpesvirinae)，更优选水痘病毒亚属(Varicellovirus)的成员的病毒，最优选地，所述重组病毒衍生自马α疱疹病毒1(EHV-1)。
在一个实施方案中，重组病毒衍生自EHV-1，并且第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。在一个实施方案中，P1基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：1显示。在一个实施方案中，2A基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：2显示。在一个实施方案中，3C基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：3显示。在一个实施方案中，P1-2A-3C基因盒的核苷酸序列由SEQ IDNO：4显示。在一个实施方案中，重组病毒衍生自EHV-1，并且必需基因是EHV-1ORF43基因或EHV-1ORF54基因。在一个实施方案中，ORF43基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：5显示。在一个实施方案中，ORF54基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：6显示。在一个实施方案中，重组病毒衍生自EHV-1，必需基因是EHV-1ORF43基因或EHV-1ORF54基因，并且第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。
在一个实施方案中，表达盒进一步包含例如调控元件，例如启动子、终止子等。在一个实施方案中，启动子是CMV启动子。在一个实施方案中，终止子是多聚A(多聚腺苷酸化)信号，优选BGH(牛生长激素)多聚A信号。在一个实施方案中，BGH多聚A信号的核苷酸序列由SEQ ID NO：7显示。
在一个实施方案中，表达盒包含由“启动子-第一多核苷酸-第二多核苷酸-终止子”的结构显示的构建体。在一个实施方案中，表达盒包含由“启动子-第一多核苷酸-接头-第二多核苷酸-终止子”的结构显示的构建体。在一个实施方案中，启动子是CMV启动子，优选CMV5启动子。在一个实施方案中，第一多核苷酸是靶基因，并且它包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因或由其组成。在一个实施方案中，第二多核苷酸是必需基因，并且它是EHV-1ORF43基因或EHV-1ORF54基因。在一个实施方案中，终止剂是BGH。在一个实施方案中，接头是2A基因。在一个实施方案中，表达盒包含CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH构建体或由其组成。在一个实施方案中，表达盒包含CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH构建体或由其组成。在一个实施方案中，CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH构建体的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8或由其显示。在一个实施方案中，CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH构建体的核苷酸序列包含SEQ IDNO：9或由其显示。
本发明进一步涉及包含本发明的重组病毒的宿主细胞。本发明的宿主细胞包含真核宿主细胞株，其特征在于它容许根据本发明的重组病毒的复制。在一个实施方案中，所述宿主细胞株是哺乳动物细胞株或昆虫细胞株，最优选地它是RK13细胞株、MDBK细胞株、ST细胞株、AI-ST细胞株、VERO细胞株、Sf9细胞株、Sf21、MDCK细胞株和/或其衍生物。在一个实施方案中，宿主细胞株是MDBK细胞株。
本发明进一步涉及制备宿主细胞的方法，其特征在于下述步骤：a)用本发明的重组病毒感染真核宿主细胞株；b)在合适的条件下培养受感染的细胞，和c)任选地收获所述宿主细胞。
如上文列出的哺乳动物宿主细胞株一般在塑料组织培养器皿中培养，所述器皿浸没在用于哺乳动物细胞培养的培养基中，例如补充有Earle盐和胎牛血清的最低必需培养基(MEM)。哺乳动物细胞株在培育箱中保持在37℃下补充有5％CO2及约80％湿度的常规氛围中。昆虫细胞株在浸没于昆虫细胞培养基中的塑料组织培养器皿中培养，并且在培育箱中保持在27℃下的常规氛围中。
本发明进一步涉及免疫原性组合物、药物组合物或疫苗组合物，其包含本发明的重组病毒和/或由本发明的重组病毒表达的目的多肽。在一个实施方案中，免疫原性/药物/疫苗组合物包含：a)本发明的重组病毒；和/或b)由本发明的重组病毒表达的目的多肽；和c)任选地，药学上或兽医学上可接受的载体或赋形剂，优选地，所述载体适合于经口、真皮内、肌内或鼻内施加。
本发明进一步涉及用于生产免疫原性/药物/疫苗组合物的方法，其包括下述步骤：a)用本发明的重组病毒感染本发明的宿主细胞株；b)在合适的条件下培养受感染的细胞；c)收获受感染的细胞；d)任选地纯化步骤c)的收获物；和e)将所述收获物与药学上可接受的载体混合。在一个实施方案中，收获物是由受感染细胞产生的重组病毒，或者收获物是由重组病毒表达的目的多肽。
本发明进一步涉及本发明的重组病毒在制备免疫原性/药物/疫苗组合物中的用途。在一个实施方案中，免疫原性/药物/疫苗组合物用于预防和/或治疗动物中由病原体感染引起的临床体征或疾病，或者用于治疗或预防动物中病原体感染的方法中，优选地所述动物是产食性动物例如猪。
本发明进一步涉及本发明的重组病毒或本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物，其用于降低或预防动物中由病原体感染引起的临床体征或疾病的方法中，或者用于治疗或预防动物中病原体感染的方法中，优选地所述动物是产食性动物例如猪。
本发明进一步涉及用于免疫动物例如产食性动物包括猪的方法，其包括向此类动物施用本发明的重组病毒或本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物。
本发明进一步涉及针对动物中由病原体引起的临床疾病，来免疫所述动物例如产食性动物包括猪的方法，所述方法包括向动物施用本发明的重组病毒或本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物的步骤，由此所述重组病毒或所述免疫原性/药物/疫苗不能引起感染的临床体征，但能够诱导使动物针对所述病原体的致病形式免疫的免疫应答。
在一个实施方案中，免疫导致畜群中的特定病毒感染发生率的减轻、或者由特定病毒感染引起或与之有关的临床体征严重性的降低。
进一步地，用如随同提供的免疫原性组合物免疫有需要的产食性动物，导致预防通过病毒感染的产食性动物感染。甚至更优选地，免疫导致针对所述病毒感染的有效的持久性免疫应答。应理解，所述时间段持续多于2个月，优选多于3个月，更优选多于4个月，更优选多于5个月，更优选多于6个月。应理解，免疫可能并非在所有被免疫的动物/对象中都是有效的。然而，该术语要求畜群的显著部分的动物/对象被有效免疫。
本发明进一步涉及用于治疗或预防动物中由病毒引起的临床体征的方法，所述动物例如有需要的产食性动物，所述方法包括向动物施用治疗有效量的本发明的重组病毒或本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物。
优选地，与未治疗或预防(未免疫)但随后被病毒感染的动物相比，临床体征降低至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，还更优选至少95％，最优选100％。
在一个实施方案中，如上文提到的临床体征或疾病由口蹄疫病毒属和α疱疹病毒属的病毒引起，优选由FMDV引起。
本发明进一步涉及试剂盒，其用于给动物接种疫苗以针对动物中与病原体有关的疾病和/或降低与病原体有关或由病原体引起的一种或多种临床体征的发生率或严重性，所述动物优选产食性动物例如猪或牛。本发明的试剂盒包括：a)能够向所述动物施用疫苗的分配器；b)本发明的免疫原性/药物/疫苗组合物，和c)任选地说明册。
一般定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有在提交时与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。术语的含义和范围应该是明确的；然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应该包括复数，且复数术语应该包括单数。在本文中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用并非限制性的。本文提及的所有专利和出版物都引入本文作为参考。
除非另有说明，否则本发明的实践采用病毒学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中充分解释。参见例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第I、II和III卷，第二版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986)；Perbal，B.，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；Protein purification methods–a practical approach(E.L.V.Harris和S.Angal编辑，IRL Press at Oxford University Press)；以及Handbookof Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell Scientific Publications)。
还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不预期是限制性的。必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物，提及“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物，等等。
分子生物学定义
如本文使用的，术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“RNA序列”或“DNA序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段和部分，以及基因组或合成起源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表有义链或反义链。序列可以是非编码序列、编码序列或两者的混合物。本发明的核酸序列可以使用本领域技术人员众所周知的标准技术来制备。
术语“核酸”和“多核苷酸”还可以包括由除五种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外的碱基组成的核酸。
术语“多肽”是通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的生物学上存在的短链。在本发明的上下文中，除非指出，否则术语“多肽”和“蛋白质”是可互换的。
术语“目的多肽”指由任何长度的多核苷酸序列编码的多肽，其编码目的产物。在一个具体方面，编码目的多肽的多核苷酸序列是外源的。根据定义，重组病毒中包含的每一个多核苷酸序列或每一个基因以及由其编码的分别蛋白质或RNA被称为“外源的”、“外源序列”、“外源基因”、“外源编码序列”或“转基因”，尤其当它来自不同(病毒)物种时。在一个具体方面，目的多肽是抗原性多肽或治疗性多肽。在一个具体方面，目的多肽是FMDV抗原。在本发明的上下文中，除非指出，否则术语“目的多肽”和“靶蛋白”是可互换的。
如本领域已知的，术语“载体”指用于将遗传材料传递至宿主细胞的多核苷酸构建体，通常是质粒或细菌人工染色体。载体可以是例如细菌、病毒、噬菌体、细菌人工染色体、粘粒或质粒。如本文使用的，载体可以由DNA或RNA组成或者包含DNA或RNA。在一些实施方案中，载体由DNA组成。在一些实施方案中，载体是感染性病毒。此类病毒载体含有病毒基因组，其以它携带外来基因的方式被操纵，所述外来基因在细胞培养和宿主动物两者中均不在病毒载体的复制中起作用。在一个具体方面，载体可以用于各种目的，例如仅传递遗传材料、用于宿主细胞或生物的转染、用于靶基因的表达、用作疫苗例如DNA疫苗或用于基因表达的目的。基因表达是描述如通过被称为基因的特异性多核苷酸序列指导的细胞中的蛋白质生物合成的术语。在一个具体方面，载体可以是“表达载体”，当它存在于适当的环境中时，所述表达载体是能够指导由通过该载体携带的一个或多个基因编码的蛋白质表达的载体。
用于表达的载体以及用于制备和/或使用载体(或重组体)的方法可以是或类似于以下中公开的方法：美国专利号4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425，PCT公开WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti，"Applications of poxvirus vectors to vaccination:An update，"PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss，"Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety,"PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利号4,745,051(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编辑)，Methods in Molecular Biology39，"Baculovirus Expression Protocols"(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector"，Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，"Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector，"Molecular and Cellular Biology 1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；于1986年10月16日提交的美国申请号920,197；EP专利公开号265785；美国专利号4,769,331(重组疱疹病毒)；Roizman，"The function of herpes simplex virus genes:A primerfor genetic engineering of novel vectors,"PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，"The application of genetically engineered herpes simplexviruses to the treatment of experimental brain tumors,"PNAS USA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，"Epstein-Barr virus vectors for gene deliveryto B lymphocytes"，PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，"Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,"PNAS USA 93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利号5,591,439，5,552,143；WO 98/00166；批准的美国申请序列号08/675,556和08/675,566，两者均于1996年7月3日提交(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，"Adenovirus as cloning vectors,"Seminars in Virology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70，42434；PCT WO91/11525；Felgner等人(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259:1745-49，1993；以及McClements等人，"Immunization with DNA vaccines encodingglycoprotein D or glycoprotein B，alone or in combination，induces protectiveimmunity in animal models of herpes simplex virus-2disease"，PNAS USA 93:11414-11420，1996年10月；以及美国专利号5,591,639、5,589,466和5,580,859，以及WO90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature，以及Furth等人，Analytical Biochemistry，尤其与DNA表达载体相关。还参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia，41:736-739，1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利号4,945,050；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars inImmunology第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利号4,394,448(将DNA插入活细胞内的方法)；McCormick等人，美国专利号5,677,178(致细胞病变病毒的用途)；以及美国专利号5,928,913(用于基因递送的载体)；以及本文引用的其它文件。
术语“病毒载体”描述了遗传修饰的病毒，其通过重组DNA技术以某种方式操纵，使得它进入宿主细胞内能够导致特异性生物活性，例如由载体携带的外来靶基因的表达。病毒载体在靶细胞、组织或生物中可能具有复制能力或可能不没有复制能力。病毒载体可以掺入来自任何已知生物的基因组的序列。序列可以以其天然形式掺入，或可以以任何方式修饰，以获得所需活性。例如，序列可以包含插入、缺失或取代。病毒载体还可以掺入关于外源多核苷酸序列的插入位点。在一个具体方面，病毒载体是疱疹病毒科，例如EHV-1。
病毒载体的生成可以使用本领域众所周知的任何合适的遗传工程技术来完成，所述遗传工程技术包括但不限于限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、DNA测序、细胞培养中转染的标准技术，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.(1989))，或者K.Maramorosch和H.Koprowski(Methods in Virology第VIII卷，Academic Press Inc.London，UK(2014))中所述。
术语“重组病毒”用于描述通过病毒基因组的人工操纵，即重组DNA技术，在其基因组中包含外源序列的病毒。在一个具体方面，包含外源序列例如外源抗原编码序列的病毒是重组病毒。在一个具体方面，重组病毒可以被视为含有编码目的多肽的外源多核苷酸序列的病毒。在一个具体方面，重组病毒衍生自疱疹病毒科，例如EHV-1，并且包含靶基因。
用于制备重组病毒的重组DNA技术是本领域技术人员众所周知的，并且通常采用病毒基因组的全长互补DNA拷贝(感染性克隆)的构建，所述拷贝然后可以通过DNA重组和操纵方法进行修饰。
术语“功能性连接”或“可操作地连接”用于描述调控元件与基因或其编码区之间的连接。通常，基因表达置于一种或多种调控元件的控制下，所述调控元件例如但不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子。基因或编码区被说成与调控元件“可操作地连接(operably linked to)”或“可操作地连接(operatively linked to)”或“可操作地结合”或“功能性连接”，意指基因或编码区受调控元件控制或影响。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。
此外，在本说明书的上下文中，术语“功能性连接(functional linking)”、“功能性连接(functionally linked)”、“可操作地连接(operably linked)”或“可操作地连接(operably linked)”，意指两个或更多个核酸序列以允许它们各自以正确的形式表达且以所需的方式起作用的方式放置。例如，如果必需基因序列的转录或翻译取决于多核苷酸的正确表达，则多核苷酸与必需基因序列功能性连接。
“开放读码框”或“ORF”指DNA或RNA的核酸序列的长度，其包含翻译起始信号或起始密码子，例如ATG或AUG，以及终止密码子，并且可以潜在地翻译成多肽序列。
“两个多核苷酸在同一ORF内”意指两个多核苷酸在同一转录分子内，并且共享相同的翻译起始信号或起始密码子和相同的终止密码子。在一个具体方面，靶基因和必需基因在同一转录分子内，并且共享相同的翻译起始信号或起始密码子和相同的终止密码子。
如本文使用的，术语“表达”指核酸序列的转录和/或翻译。根据本发明的具体方面，术语“表达”指外源核酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达盒”或“转录单元”定义了在重组病毒的基因组内的区域，其含有待转录的一个或多个基因。在一个具体方面，表达盒中包含的基因可以是靶基因和重组病毒的内源必需基因。在一个具体方面，表达盒中包含的基因可以是靶基因和外源必需基因。表达盒内包含的编码转录基因的核苷酸序列以及含有调控元件的多核苷酸序列彼此可操作地连接。它们从启动子转录，并且转录通过至少一个多聚腺苷酸化信号终止。在一个具体方面，它们从一个单一启动子转录。结果，不同的基因是至少转录上连接的。多于一种蛋白质或产物可以从每个转录单元(多顺反子转录单元)转录且表达。每个转录单元包含对于该单元内包含的任何所选序列的转录和翻译所必需的调控元件。并且每个转录单元可以含有相同或不同的调控元件。例如，每个转录单元可以含有相同的终止子，IRES元件或内含子可以用于转录单元内的基因的功能性连接。
术语“必需基因”意指对于生物复制必不可少的那些基因，并且因此被视为生命的基础。术语必需基因的“功能片段”或“功能衍生物”意指该片段或衍生物仍影响必需基因的活性。对于病毒，如果基因的缺失导致在单步或多步生长曲线中的病毒滴度大于10倍的减少，则该基因也被视为必需的(即在细胞培养中具有作用)。大多数必需基因编码蛋白质，以维持中心代谢、复制DNA、将基因翻译成蛋白质、维持基本的细胞结构、以及介导进入和离开细胞的转运过程。关于病毒，涉及包裹病毒粒子生产、肌动蛋白尾形成和细胞外病毒粒子释放的所有基因也被视为必需的。两种主要策略已用于在全基因组基础上鉴定必需基因：基因的直接缺失和使用转座子的随机诱变。在第一种情况下，各个基因(或ORF)以系统的方式从基因组中完全缺失。在转座子介导的诱变中，转座子随机插入基因组中尽可能多的位置中，目的是使靶向基因失活。仍能够存活或生长的插入突变体并不在必需基因中。(Zhang，R.，2009&Gerdes，S.，2006)。
如本文使用的，术语“内源的”指物种中天然存在的多核苷酸或蛋白质。必需基因被说成“病毒的内源必需基因”，意指必需基因天然存在于病毒的基因组中。在一个具体方面，靶基因被插入重组病毒的内源必需基因的上游，并且与之功能性连接。
如本文使用的，术语“外源的”指多核苷酸或蛋白质源于或产生自外来物种，或者如果来自相同物种，则由其原始形式改造。在一个具体方面，重组病毒的内源必需基因被沉默，并且相同的外源必需基因被插入靶基因的下游并且与之功能性连接。
如本文使用的，术语“构建体”指重组核酸，例如已人工生成的质粒。
术语“调控元件”、“调控核酸”、“表达控制元件”可互换使用，并且指可以影响特定宿主生物中可操作连接的编码序列表达的核酸分子。这些术语被广泛地使用，并且覆盖促进或调节转录的所有元件，包括启动子、启动子序列、RNA聚合酶与转录因子的基本相互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和应答元件。原核生物中的示例性调控元件包括启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞中使用的调控元件可以包括但不限于转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入位点(IRES)、微小核糖核酸病毒2A序列等等，其在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码多肽的产生。
如本文使用的，术语“启动子”或“启动子序列”意指允许RNA聚合酶的结合并指导基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区中，邻近基因的转录起始位点。启动子内在转录起始中起作用的序列元件经常以共有核苷酸序列为特征。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和动物如哺乳动物(包括马、猪、牛和人)、鸟类或昆虫的启动子。启动子可以是诱导型、阻遏型和/或组成型的。诱导型启动子响应培养条件中的一些变化(例如温度变化)，起始来自在其控制下的DNA的转录水平增加(Ptashne，2014)。本领域技术人员众所周知的启动子的实例是例如CMV-5、SV40大T、HCMV和MCMV立即早期基因1、人延伸因子α启动子。
术语“增强子”指示这样的多核苷酸序列，其在顺式位置上作用于启动子的活性，并且因此刺激与这个启动子功能性连接的基因或编码序列的转录。与启动子不同，增强子的效应不依赖于位置和取向，并且因此它们可以位于转录单元的前面或后面、在内含子内或甚至在编码区内。增强子可以位于转录单元的紧邻以及与启动子相当远的距离处。与启动子具有物理和功能重叠也是可能的。技术人员知道来自各种来源的许多增强子(并且保藏在数据库例如GenBank中，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤增强子、腺病毒增强子)，其可作为独立元件或在多核苷酸序列内克隆的元件获得(例如保藏在ATCC处或来自商业和个人来源)。许多启动子序列也含有增强子序列，例如常用的CMV启动子。人CMV增强子是迄今为止鉴定的最强增强子之一。诱导型增强子的一个实例是金属硫蛋白增强子，其可以被糖皮质激素或重金属刺激。
“转录调控元件”通常包含待表达的基因序列上游的启动子、转录起始和终止位点以及多聚腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”指构建体中的核酸，其对应于掺入初级转录物内的第一核酸，即mRNA前体。转录起始位点可以与启动子序列重叠。
“终止信号”或“终止子”或“多聚腺苷酸化信号”或“多聚A”或转录终止位点”或“转录终止元件”是信号序列，其导致在真核mRNA的3'端处的特异性位点处的切割、以及在切割的3'端处约100-200个腺嘌呤核苷酸(多聚A尾)的序列的转录后掺入，并且因此促使RNA聚合酶终止转录，多聚腺苷酸化信号包含切割位点上游的约10-30个核苷酸的序列AATAAA和位于下游的序列，已知各种多聚腺苷酸化元件，例如tk多聚A、SV40晚期和早期多聚A、BGH多聚A(例如在美国专利号5,122,458中描述)或仓鼠生长激素多聚A(WO2010010107)。
“翻译调控元件”包含对于待表达的每个个别多肽的翻译起始位点(AUG)、终止密码子和多聚A信号。内部核糖体进入位点(IRES)可能包括在一些构建体中。为了优化表达，可以建议去除、添加或改变待表达的核酸序列的5'-和/或3'-非翻译区，以消除任何潜在地额外的不适当的替代翻译起始密码子或其它序列，其可能在转录或翻译水平上干扰表达或降低表达。可以将共有的核糖体结合位点(Kozak序列)插入起始密码子的上游，以增强翻译和因此的表达。在这个核糖体结合位点周围增加的A/U含量进一步使核糖体结合更有效。
术语“移码突变”，也称为成框错误或读码框移位，指由DNA序列中不能被三整除的核苷酸数目的插入-缺失(插入或缺失)引起的遗传突变。ORF内的移码突变导致ORF内的基因的异常表达。
术语“基因沉默”是“关闭”基因，从而防止其以蛋白质生产的形式或其它表达形式表达的过程。基因沉默是重要的实验室技术，因为禁用基因是确定该基因的目的的高度有效方法。可以通过各种不同方式并通过多种不同机制之一使基因沉默。基因沉默经常被认为与基因敲除相同。即，当基因被敲除时，它们从生物的基因组中完全消失，并且因此不具有表达。在本发明的上下文中，基因沉默还包括将基因的表达降低至这样的水平，使得基因的其余活性不足以实现其功能。例如，在一个具体方面，病毒的内源必需基因已被沉默到此类水平，使得必需基因的其余活性不能影响靶基因对必需基因的控制，所述必需基因是外源引入的并且与靶基因功能性连接。
“宿主细胞”指重组病毒可以在其中复制的细胞。在一个具体方面，宿主细胞可以是真核宿主细胞株，优选哺乳动物细胞株或昆虫细胞株。宿主细胞包含但不限于RK13细胞株、MDBK细胞株、ST细胞株、AI-ST细胞株、VERO细胞株、Sf9细胞株、Sf21、MDCK细胞株和/或其衍生物。
如本文使用的，术语“稳定表达”或“表达稳定性”意指重组病毒能够在其传代过程中正确表达外源多核苷酸，而无外源多核苷酸的丧失或外源多核苷酸中的任何移码突变。在本发明的上下文中，外源多核苷酸的稳定表达通过允许外源多核苷酸与重组病毒的必需基因功能性连接，并且位于必需基因的上游来实现。具有外源多核苷酸的丧失或外源多核苷酸中的任何移码突变的重组病毒并不复制，并且因此从重组病毒培养液中消除。因此，存在于培养液中的占优势重组病毒是能够正确共表达外源多核苷酸和必需基因的那些病毒。
外源多核苷酸的表达可以通过各种方法进行确定，如通过ELISA、蛋白质印迹、放射免疫测定、免疫沉淀、测定蛋白质的生物活性、或蛋白质的免疫染色随后为FACS分析。在一个具体方面，通过蛋白质印迹确定外源多核苷酸的表达。
EHV-1定义
“疱疹病毒”或“疱疹病毒载体”指疱疹病毒目(Herpesvirales)中的疱疹病毒科中的物种。
术语“马疱疹病毒载体”或“马疱疹病毒”或“EHV”意指影响马的疱疹病毒科的成员。迄今为止，已鉴定了马疱疹病毒的八个不同物种，其中五个属于α疱疹病毒亚科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9)，并且三个属于γ疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015Release EC47，London，UK，2015年7月；电子邮件批准2016年(MSL#30)。
术语“马科动物(equid)”或“马科动物(equine)”或“马科动物(equin)”意指马科(Equidae)或属于马科，其包括马、驴和斑马，优选马。另外，“马科动物(equid)”或“马科动物(equine)”或“马科动物(equin)”还涵盖马科成员的杂种(例如骡、驴骡等)。
术语“EHV-1”意指马α疱疹病毒1，疱疹病毒科中的α疱疹病毒属中的水痘病毒亚属的成员。关于EHV-1的非限制性参考序列是例如野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)或RacH(Hübert 1996)。在一个具体方面，重组病毒衍生自疱疹病毒科，例如EHV-1或EHV-4，优选EHV-1。
EHV-1ORF43基因编码称为VP23的衣壳蛋白，其是衣壳体间三链体(intercapsomeric triplex)的组分(Elizabeth A.R.Telford等人，Journal of GeneralVirology，1998，79，1197-1203)。在一个实施方案中，EHV-1ORF43基因的核苷酸序列由SEQID NO：5显示。
EHV-1ORF54基因编码蛋白质，其是DNA解旋酶-引发酶复合物的组分(ElizabethA.R.Telford等人，Journal of General Virology，1998，79，1197-1203)。在一个实施方案中，EHV-1 ORF54基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：6显示。
FMDV定义
“口蹄疫病毒”或“FMDV”指微小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒属中的物种。
术语“P1蛋白”或“蛋白P1”意指含有4种衣壳蛋白VP4、VP2、VP3和VP1的前体蛋白。在成熟过程期间，蛋白P1被蛋白酶3C切割成称为VP0、VP1和VP3的三种蛋白质。在病毒粒子中，蛋白VP0然后被切割成两种蛋白质，VP4和VP2。在一个实施方案中，P1基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：1显示。
术语“2A肽”或“肽2A”是自切割的肽，并且用于几个病毒科中(微小核糖核酸病毒科中最广为人知的FMDV)，用于产生多重多肽。在FMDV中，2A肽位于P1-2A前体的C末端处。在一个实施方案中，2A基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：2显示。
术语“蛋白酶3C”或“3C蛋白酶”意指在微小核糖核酸病毒中发现的蛋白酶和内肽酶，其切割非末端序列的肽键。3C蛋白酶位于P3前体中，并且可以将P1前体蛋白加工成VP0(VP4和VP2的前体)、VP3和VP1。在一个实施方案中，3C基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：3显示。
P1-2A-3C盒意指含有通过含有2A肽基因的序列连接的P1基因和3C基因的单个ORF。在一个实施方案中，P1-2A-3C基因盒的核苷酸序列由SEQ ID NO：4显示。
疫苗定义
“免疫原性或免疫学组合物”指包含至少一种抗原或其免疫原性部分的物质组合物，其在宿主中引发对该组合物的细胞或抗体介导的免疫应答。
如本文使用的，术语“抗原”是本领域众所周知的，并且包括其为免疫原性的物质，即免疫原，以及诱导免疫学无应答性或无反应性(即通过人体对外来物质的防御机制的反应缺乏)的物质。如本文使用的，术语“抗原”预期意指含有或包含表位的全长蛋白质以及其肽片段。
术语“产食性动物”意指用于人消耗的动物，例如猪、牛、家禽等等，优选地，产食性动物意指猪和牛，最优选猪。在本发明的一个具体方面，“产食性动物”是偶蹄类动物，包括牛、绵羊、山羊和猪，优选猪。
如本文使用的，“免疫原性组合物”可以指多肽或蛋白质，例如引发如本文所述的免疫应答的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”指蛋白质或多肽的片段或者截短和/或取代形式，其包括一个或多个表位，并且因此引发本文所述的免疫应答。一般而言，此类截短和/或取代形式或片段包含来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。可以使用本领域众所周知的许多表位作图技术来鉴定此类片段。参见例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris，编辑，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，线性表位可以通过以下进行确定：在固体支持物上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且在肽仍附着至载体的同时，使肽与抗体反应。此类技术是本领域已知的且描述的，参见例如，美国专利号4,708,871；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；以及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，例如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振，通过确定氨基酸的空间构象，容易地鉴定构象表位。参见Epitope Mapping Protocols，同上。合成抗原也包括在该定义内，例如多表位、侧翼表位和其它重组或合成衍生的抗原。参见例如，Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996)，J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier，A.(1997)，Immunol.and Cell Biol.75:402-408；以及Gardner等人，(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，瑞士，1998年6月28日至7月3日。(其教导和内容全部引入本文作为参考)。
如本文使用的，术语“疫苗”指药物组合物，其包含在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫活性组分，并且包含可能但非必需地增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗可以另外包含对于药物组合物典型的进一步组分。通过区别的方式，疫苗的免疫活性组分可以包含完整的病毒颗粒，其以其原始形式，或者作为所谓的改良式活毒疫苗(MLV)中的减毒颗粒、或所谓的杀死疫苗(KV)中通过适当方法灭活的颗粒。在另一种形式中，疫苗的免疫活性组分可以包含生物的适当元件(亚单位疫苗)，由此通过以下生成这些组分：破坏整个颗粒或含有此类颗粒的生长培养物，以及产生所需结构的任选地后续纯化步骤，或者包括通过使用基于例如细菌、昆虫、哺乳动物或其它物种的合适系统的适当操纵的合成过程，加上任选地后续分离和纯化程序，或者通过使用合适的药物组合物(多核苷酸疫苗接种)直接掺入遗传材料，在需要疫苗的动物中诱导合成过程。疫苗可以包含一种或同时地多于一种上述元件。如在本发明的具体方面中使用的，“疫苗”指活疫苗或活病毒，也称为重组疫苗。在本发明的另一个具体方面，“疫苗”指灭活或杀死的病毒，包括病毒样颗粒(VLP)。因此，疫苗可以是亚单位疫苗或杀死的(KV)或灭活的疫苗。
“药物组合物”基本上由一种或多种成分组成，所述成分能够修饰它施用于其的生物、或者生活在该生物内或之上的生物的生理功能，例如免疫功能。该术语包括但不限于抗生素或抗寄生虫药，以及通常用于实现某些其它目的的其它组成成分，所述其它目的例如但不限于加工性状，无菌性，稳定性，经由肠内或肠胃外途径例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、真皮内或其它合适的途径施用组合物的可行性，施用后的耐受性或控制释放特性。仅为了示范目的而给出，此类药物组合物的一个非限制性实例可以如下制备：将受感染的细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(BSA)混合，然后通过其他方法使混合物冻干或脱水。在疫苗接种之前，然后将混合物在水溶液(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或非水溶液(例如油乳剂、基于铝的佐剂)中再水化。
如本文使用的，“药学上或兽医学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定试剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等等。在一些优选实施方案中，且尤其是包括冻干的免疫原性组合物的那些实施方案，用于在本发明中使用的稳定试剂包括用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文使用的，“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)，油包水型乳剂，水包油型乳剂，水包油包水型乳剂。乳剂可以特别地基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；起因于烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚反应的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用，以形成乳剂。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其是任选地乙氧基化的，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.)，JohnWiley and Sons，NY，第51-94页(1995)，以及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。示例性的佐剂是在由M.Powell和M.Newman编辑的"VaccineDesign，The Subunit and Adjuvant Approach"，Plenum Press，1995的第147页上描述的SPT乳剂，以及在同一本书的第183页上描述的乳剂MF59。
佐剂的进一步实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物通过术语卡波姆已知(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与多羟基化化合物交联的此类丙烯酸聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个羟基，优选不多于8个羟基，其中至少三个羟基的氢原子被替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂族原子团。优选的原子团是含有2至4个碳原子的那些原子团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和原子团本身可以含有其它取代基，例如甲基。以名称
Figure BDA0002686186960000191
(BF Goodrich，Ohio，USA)产品是特别合适的。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。在这些中，可以提及Carbopol 974P、934P和971P。最优选的是
Figure BDA0002686186960000192
971P的使用。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中有共聚物EMA(Monsanto)，其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解导致酸溶液，其优选被中和至生理pH，以便得到免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身将掺入其内的佐剂溶液。
进一步合适的佐剂尤其包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)，SAF-M(Chiron，Emeryville CA)，单磷酰脂质A，阿夫立定脂质胺佐剂，来自大肠杆菌(E.coli)的不耐热肠毒素(重组或其它形式)，霍乱毒素，IMS 1314或胞壁酰二肽，或者天然存在的或重组的细胞因子或其类似物或内源性细胞因子释放的刺激物。
佐剂可以以约100μg至约10mg/剂量的量添加，优选以约100μg至约10mg/剂量的量，更优选以约500μg至约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量的量，且最优选以约1mg/剂量的量。可替代地，佐剂可以为按最终产物的体积计约0.01至50％的浓度，优选约2％至30％的浓度，更优选约5％至25％的浓度，还更优选约7％至22％的浓度，且最优选10％至20％的浓度。
“稀释剂”可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可以尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“分离的”意指“通过人为”从其天然状态改变的，即，如果它存在于自然界中，则它已被改变或从其原始环境中取出，或两者。例如，天然存在于活生物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，而与其天然状态的共存材料分开的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，如该术语在本文中采用的。
制剂
组合物施用于其的对象优选是动物，包括但不限于牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、犬、仓鼠、小鼠和大鼠，最优选地哺乳动物是猪。
本发明的制剂包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物和生理上可接受的媒介物。疫苗包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物和生理上可接受的媒介物。制剂应该适合施用模式。
需要时，免疫原性组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。经口制剂可以包括标准载体，例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
治疗方法
优选的施用途径包括但不限于鼻内、经口、真皮内和肌内。在饮用水中，最优选以单一剂量的施用是期望的。技术人员将认识到，本发明的组合物也可以以一个、两个或更多个剂量，以及通过其它施用途径来施用。例如，此类其它途径包括皮下、皮内、腹膜内、皮内，并且根据所需的治疗持续时间和有效性，根据本发明的组合物可以例如在每天的基础上施用一次或几次以及间歇地施用，共数天、数周或数月，并且以不同的剂量例如约103至108TCID50(参见上文的病毒滴度)。
需要时，组合物可以存在于包装或分配器装置中，所述装置可以包含含有活性成分的一种或多种单元剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以伴随关于施用优选关于施用于哺乳动物，尤其是猪的说明书。与此类器皿相关的可以是以由管理药物或生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的通知，所述通知反映了由制造、使用或销售机构批准用于人施用。
序列概述
下述序列在本发明中详细描述并由此公开：
SEQ ID NO：1 P1基因的核苷酸序列，
SEQ ID NO：2 2A基因的核苷酸序列，
SEQ ID NO：3 3C基因的核苷酸序列，
SEQ ID NO：4 P1-2A-3C基因表达盒的核苷酸序列，
SEQ ID NO：5 EHV-1ORF43基因的核苷酸序列，
SEQ ID NO：6 EHV-1ORF54基因的核苷酸序列，
SEQ ID NO：7 BGH多聚A信号的核苷酸序列，
SEQ ID NO：8 CMV5-P12A3C2AORF43-BGH盒的核苷酸序列，
SEQ ID NO：9 CMV5-P12A3C2AORF54-BGH盒的核苷酸序列，
SEQ ID NO：10 引物序列，和
SEQ ID NO：11 引物序列。
附图说明
下述附图构成本说明书的部分，并且被包括以进一步示范本发明的某些方面。通过参考与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合的这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本发明。
图1.必需基因易位概念的图示。A：必需基因被缺失并与靶基因易位；以及B：靶基因也可以在其原始位置处的必需基因的上游插入。
图2.FMDV P12A3C盒的设计。
图3.示出了转移质粒的构建程序。靶基因P12A3C被合成并且克隆到载体pUC19-CMV5-ORF1/3-接头内，导致pUC19-CMV5-P12A3C。EHV-1必需基因ORF43或ORF54也被合成并且克隆到pUC19-CMV5-P12A3C内，导致最终的转移质粒，其用于生成重组EHV-1。
图4.CMV5-P12A3C2AORF43-BGH的凝胶电泳结果。用限制性酶I-CeuI消化转移质粒。在消化后，约7kb的靶片段被释放并用于重组。
图5.从EHV-1载体中缺失了基因ORF43或ORF54，并且该缺失突变病毒无法在体外复制。作为对照，在转染后2天，EHV-1野生型可以容易地拯救并良好繁殖。由于所拯救的病毒含有EGFP基因，因此噬菌斑显示了绿色荧光。
图6.具有ORF43基因易位的重组EHV-1的基因结构。ORF43基因从其原始位置缺失，并且易位到FMDV P12A3C基因的下游。
图7.通过IFA确认FMDV蛋白表达和EHV-1ORF71恢复。具有EHV-1ORF43或ORF54易位的重组病毒可以在转染后得到拯救。FMDV靶蛋白的表达通过IFA进行确认。将EHV-1gp2染色以显示EHV-1噬菌斑的存在。
图8.一系列重组EHV-1用常规设计进行构建，但不能稳定地表达靶蛋白。(A)通过双重IFA发现阴性的EHV-1噬菌斑；(B)阴性噬菌斑的测序显示了随机遗传变化，包括单核苷酸缺失，导致下游基因的移码突变。
图9.代表性双重IFA结果的图示，显示了可以表达靶FMDV蛋白和EHV-1蛋白两者的噬菌斑。
图10.来自重组病毒的不同传代水平的FMDV VLP检测。
图11.A：靶基因表达盒和引物位置的图示；B：来自重组病毒的不同传代水平的PCR结果。
图12.与亲代EHV-1相比，重组EHV-1的体外单步生长动力学。
实施例
包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下述实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好起作用的技术，并且因此可以被视为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当了解，可以在所公开的具体实施方案中制备许多改变，并且仍获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
在研究中，除非另有说明，否则所有材料都是商购可得的，并且购自QIAGEN、Promega、Thermo Fisher和BIO-RAD。
实施例1：可以稳定地表达FMDV抗原的本发明的重组EHV-1的构建
1.1FMDV P1-2A-3C基因表达盒的构建
为了表达FMDV VLP，设计了衍生自FMDV血清型O毒株(GenBank ID：JN998085)的基因表达盒P1-2A-3C。在这项研究中，基于P1基因(SEQ ID NO：1)、2A基因(SEQ ID NO：2)和3C基因(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列，通过Genscript化学合成了FMDV P1-2A-3C基因表达盒。该研究中使用的合成P1-2A-3C基因表达盒的核苷酸序列由SEQ ID NO：4显示。P1-2A-3C基因盒的设计在图2中示出。
1.2转移质粒的构建
在该研究中使用了转移载体pUC19-CMV5-ORF1/3-接头(Genscript)，其含有用于两步Red介导的重组的同源侧翼区、卡那霉素抗性基因以及启动子和BGH多聚A信号。
为了生成转移质粒，将P1-2A-3C基因(SEQ ID NO：4)插入转移载体内的ORF1/3位点处。然后，ORF43基因(SEQ ID NO：5)和ORF54基因(SEQ ID NO：6)被化学合成并且克隆到P1-2A-3C基因(SEQ ID NO：4)的下游，分别导致转移质粒pUC19-CMV5-P12A3C2AORF43和pUC19-CMV5-P12A3C2AORF54。转移质粒pUC19-CMV5-P12A3C2AORF43的构建程序在图3中示出。
通过限制性酶I-CeuI(NEB)消化转移质粒，分别释放含有CMV5-P12A3C2AORF43-BGH(SEQ ID NO.8)和CMV5-P12A3C2AORF54-BGH(SEQ ID NO.9)的约7kb的两个片段，其然后进行凝胶纯化(Invitrogen)，并且经由凝胶电泳进行确认。释放的片段用于进一步重组。CMV5-P12A3C2AORF43-BGH的凝胶电泳结果在图4中示出。
1.3EHV-1病毒载体的构建
在这项研究中，使用EHV-1疫苗株RacH(Patel，JR和Heldens，J，2005)作为病毒载体，以表达血清型O FMDV基因P12A3C。RacH毒株在天然宿主(即，马)中已丧失其毒力，并且此后已在欧洲和美国用作改良式活毒疫苗(MLV)(Patel，JR和Heldens，J，2005)。通过用mini-F复制子序列替换大部分ORF71基因(编码gp2)，将RacH病毒基因组构建为细菌人工染色体(BAC)，并且将Bacmid命名为pRacH(Rudolph和Osterrieder，2002，Virology 293，2002，356-367；US7482441B2)。
在这项研究中，分别从pRacH中缺失必需基因ORF43基因和ORF54基因，并且通过限制性片段长度多态性(RFLP)分析鉴定具有缺失的ORF43基因的pRacH(在图5中显示为EHV-1-delORF43 P1)和具有缺失的ORF54基因的pRacH(在图5中显示为EHV-1-delORF54 P1)。
通过将EHV-1-delORF43 P1和EHV-1-delORF54 P1转染到MDBK细胞内，确认了缺失突变体无法在细胞培养物中复制。结果显示于下图5中。
1.4本发明的重组EHV-1的构建
本发明的重组EHV-1经由两步Red介导的重组策略进行构建(Tischer BK等人，BioTechniques 2006(40)，191-197)。特别地，消化在步骤1.2中获得的转移质粒，以分别释放CMV5-P12A3C2AORF43-BGH(SEQ ID NO.8)和CMV5-P12A3C2AORF54-BGH(SEQ ID NO.9)的片段。将两个释放的片段电穿孔到分别含有EHV-1-delORF43 P1和EHV-1-delORF54 P1的大肠杆菌感受态细胞内。重组病毒的基因结构在图6中示出。然后在氯霉素和卡那霉素双重抗性LB琼脂平板上选择重组克隆。提取重组Bacmid DNA，并且通过PCR和RFLP方法两者进行分析。在Red重组的第2步中，使用1％阿拉伯糖诱导归巢核酸内切酶I-SceI的表达，导致卡那霉素基因上游的I-SceI限制性位点的切割，以及最终地卡那霉素盒的切除。
1.5病毒拯救与纯化
为了拯救重组EHV-1，重组Bacmid DNA被提取，并且使用lipofectamine 3000(Thermo Fisher)转染到6孔板中的MDBK细胞(Sigma)内。在转染后，每天观察细胞，以检查GFP阳性和阴性噬菌斑的形成。转染的细胞连同培养上清液一起冷冻并解冻两次，通过离心清除，并且将定义为第1代的重组病毒贮存于-80℃下，用于以后分析。进行有限稀释或噬菌斑纯化，以分开GFP阴性重组病毒，其中去除了含有EGFP基因的mini-F，并且经由分子内同源重组机制恢复了缺失的ORF71。每一轮有限稀释被认为是一次传代。
实施例2：FMDV蛋白的表达和检测
2.1IFA、蔗糖梯度离心和蛋白质印迹
为了确认FMDV蛋白的表达，使用针对FMDV VP1的单克隆抗体(Jeno-Biotech，目录#9172)进行间接荧光测定(IFA)。MDBK细胞被感染，并且用1.5％甲基纤维素上覆。感染三天后，将细胞用1xPBS洗涤，用4％甲醛固定，通过0.1％Trition X-100渗透化处理，并且用相应的抗体染色。FMDV蛋白的表达通过IFA进行确认(图7)。
对于蛋白质印迹分析，将受感染的细胞团块裂解，并且与4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)和Nupage 10x还原剂(Invitrogen)混合。在85℃下加热5分钟后，蛋白质在NuPAGE凝胶(Invitrogen)上分离，并且转移到PVDF膜(Lifetech)。在膜封闭后，使膜与抗FMDV VP1 mAb(第1抗体，Jeno-Biotech)一起温育1小时，然后在洗涤后，与抗小鼠IgG-HRP(第2抗体，Santa-Cruz)一起温育1小时。在将Supersignal West Femto MaximumSensitivity底物(Thermo Scientific)施加于膜后，使图像显色。
为了确认FMDV VLP的形成，受感染的细胞培养物通过离心进行预清除，并且通过使用Amicon Ultra-15mL离心过滤器(Merk，Ultracel-100KDa)的超滤进行浓缩，然后在10℃下施加于以53,720g的10％-60％蔗糖梯度超离心共22小时。蔗糖梯度从上到下分离为14个级分。如上所述，通过使用抗FMDV VP1 mAb的蛋白质印迹分析每个级分中的蛋白质。
实施例3：FMDV蛋白表达的稳定性研究
3.1FMDV P1-2A-3C基因不能用常规设计稳定地表达
用将FMDV P1-2A-3C基因直接引入EHV-1病毒载体内的常规设计，构建了不同的重组EHV-1作为对照(具有不同的启动子和插入位点)。下表中概括了不同重组EHV-1的遗传稳定性测试结果。
表1.不同重组EHV-1的遗传稳定性测试的概括
P1-2A-3C盒 启动子 插入位点 细胞株 遗传稳定性
SEQ ID NO:4 CMV ORF1/3 MDBK 在P3后不稳定
SEQ ID NO:4 EHV-4gG ORF1/3 MDBK 在P4后不稳定
SEQ ID NO:4 CMV ORF70(gG) MDBK 在P5后不稳定
可以看出，通过使用常规设计，FMDV P1-2A-3C基因不能稳定地维持，并且趋于在连续传代过程中丧失靶蛋白表达，如通过双重IFA所示的(图8A)。测序分析还显示了插入物中的随机缺失(图8B)。
3.2解决基因稳定性问题的必需基因易位
为了评估FMDV蛋白是否可以由本发明的重组EHV-1稳定地表达，本发明的重组EHV-1用MOI 0.01在MDBK细胞上连续传代。在每次传代后，新鲜的MDBK细胞单层用适当稀释度的重组病毒进行感染，并且用1.5％甲基纤维素上覆。感染后三天，使用抗FMDV VP1 mAb和山羊抗EHV-1pAb(VMRD)的混合物进行双重IFA。在荧光显微镜检查下检查各个噬菌斑。用FMDV VP1和EHV-1抗体两者染色的噬菌斑被识别为阳性的，而仅显示EHV-1染色的噬菌斑为阴性的。计算阳性噬菌斑率并且在不同传代水平之间进行比较。代表性的双重IFA结果显示于图9中。
在每5代(P5、P10、P15和P20)时，从受感染的细胞中提取病毒DNA，并且使用高保真Accuprime pfx DNA聚合酶(Invitrogen)，PCR扩增完整的插入物(正向引物：taacaccatggcaggcctgttg(SEQ ID NO：10)，反向引物：gagcgattcgcacctcatctcc(SEQ IDNO：11))。然后对PCR产物进行测序。另外，每5代使用蔗糖梯度离心和蛋白质印迹检测VLP的表达(Rational Engineering of Recombinant Picornavirus Capsids to ProduceSafe，Protective Vaccine Antigen.PLOS Pathogens.2013Mar；9(3):e1003255.)。来自重组EHV-1的不同传代水平的FMDV VLP结果显示于图10中。
计算总EHV-1噬菌斑中的FMV蛋白阳性噬菌斑百分比，并且显示于表2中。结果明确地显示，FMDV蛋白可以在传代过程中稳定地表达至少直到P20。
表2.在每次传代时的总EHV-1噬菌斑中的FMDV蛋白阳性噬菌斑百分比
传代 阳性率
P5 355/355(100％)
P6 274/274(100％)
P7 155/155(100％)
P8 234/234(100％)
P9 85/85(100％)
P10 173/173(100％)
P11 108/108(100％)
P12 78/78(100％)
P13 175/175(100％)
P14 44/44(100％)
P15 109/109(100％)
P16 202/202(100％)
P17 120/120(100％)
P18 172/172(100％)
P19 295/295(100％)
P20 173/173(100％)
从重组EHV-1中提取来自每五次传代的病毒DNA，并且使用PCR扩增整个插入物。结果显示可以扩增整个插入物，而无片段长度的明显差异(图11)，指示在连续病毒传代过程中没有发生遗传变化。PCR产物也被测序并且并未揭示遗传变化。
实施例4：重组病毒的体外生长动力学
为了评估重组病毒的体外生长特性，通过用MOI为5的亲本病毒和重组病毒感染24孔板中的MDBK细胞。在37℃下的2小时附着后，用柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗涤细胞。在不同的时间点，收获培养上清液并进行滴定。
确定了具有ORF43或ORF54易位的两种重组病毒的单步生长动力学，并且与亲本病毒进行比较。如图12中可以看出的，重组病毒具有与亲本病毒相似的生长动力学，并且可以在感染后36小时达到峰值滴度，然而，该峰值比亲本病毒低约1logTCID50/mL，这是预计的，因为外来蛋白的表达影响病毒生长。
从上文实验数据可以确定：(1)用常规设计，FMDV靶蛋白不能稳定地表达；(2)EHV-1ORF43或ORF54是关于EHV-1复制的必需基因；并且(3)本发明的rEHV-1/FMD构建体可以表达具有显著改善的稳定性的靶蛋白，同时维持与亲本EHV-1可比较的生长能力。
根据本公开内容，无需过度实验，可以制备且实行本文公开且请求保护的所有组合物和方法。尽管已根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序施加变化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学上相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂，同时获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改都被认为在由如下附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110> 勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司
<120> 能够稳定地表达靶蛋白的重组病毒
<130> P20192930
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2205
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<400> 1
atgggagccg gacaatccag tccggctact gggtcacaga accaatcagg caacaccggg 60
agtatcatca acaattacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccaacttggt 120
gacaatgcta tcagcggagg ctccaacgag ggatccacag acacaacctc cacccacaca 180
accaacactc agaacaatga ctggttttca aagttggcca gctctgcctt cagcggtctt 240
ttcggcgccc tcctcgccga taagaaaacc gaggagacca ctcttctcga ggaccgcatc 300
ctcaccaccc gaaacggaca caccacctcg acaacccagt cgagtgttgg cataacgcac 360
gggtacgcaa cagctgagga ttttgtgaac gggccaaaca cctctggtct tgagaccaga 420
gttgtccagg cggaacggtt ctttaaaacc cacctgttcg actgggtcac cagtgatccg 480
ttcggacggt gctacttgtt ggagctcccg actgaccaca aaggtgtcta cggcagcctg 540
accgactcat acgcctacat gagaaacggt tgggatgttg aggtcaccgc tgtggggaat 600
cagttcaacg gaggctgcct actggtggcc atggtgcctg aactttgttc catcgagcgg 660
agagagctgt tccagcttac gctcttcccc caccagttca tcaacccccg gacgaacatg 720
acagcccaca tcaaggtgcc ctttgttggc gtcaaccgtt acgatcagta caaggtacac 780
aagccgtgga cccttgtggt tatggtcgta gccccactga ctgtcaacac cgaaggcgct 840
ccgcagatca aggtgtatgc caacatcgca cccaccaacg tgcacgtcgc gggtgagttc 900
ccttccaaag aggggatttt ccctgtggcc tgtagcgacg gttatggcgg cttggtgaca 960
actgacccaa agacggctga ccccgtttac ggcaaagtgt tcaacccccc ccgcaacatg 1020
ttgccggggc ggttcaccaa cctcctggac gtggctgagg cttgccccac gtttctgcac 1080
ttcgatggtg acgtaccgta tgtgaccact aagacggatt cggacagggt gctcgcacaa 1140
tttgacttgt ctttggcagc aaaacacatg tcaaacacct tccttgcagg tcttgcccag 1200
tactacacgc agtacagcgg caccgtcaac ctgcacttca tgttcacagg tcccactgac 1260
gcgaaagcgc gttacatgat tgcgtatgcc cctccgggca tggagccgcc caaaacacct 1320
gaggctgctg ctcactgcat tcacgcagag tgggacacgg gtctgaactc aaagtttacc 1380
ttttccatcc cctacctctc ggcggctgat tacgcgtaca ccgcgtctga cgctgctgag 1440
accacaaatg ttcagggatg ggtctgctta tttcaaataa cacacgggaa agctgagggt 1500
gacgctcttg tcgtgctggc cagtgctggc aaagactttg agctgcgcct gcctgtggac 1560
gctcggcaac agaccacttc gacgggcgag tcggctgacc ccgtgactgc caccgttgag 1620
aattacggtg gcgagacaca ggtccagagg cgccaccaca cagacgtctc attcatattg 1680
gacagatttg tgaaagtcac accaaaagac tcaataaatg tattggacct gatgcagacc 1740
ccctcccaca ccctagtagg ggcgctcctc cgcactgcca cttactattt cgctgatcta 1800
gaggtggcag tgaaacacga gggggacctt acctgggtgc caaatggagc acctgaagca 1860
gccttggaca acaccaccaa cccaacggcg taccataagg cgccgcttac tcggcttgca 1920
ttgccctaca cggcaccaca ccgtgttttg gccaccgttt acaacgggaa ctgcaaatac 1980
gccgggggct cactgcccaa cgtgagaggc gatctccaag tgctggctca gaaggcagcg 2040
aggccgctgc ctacttcttt caactacggt gccatcaaag ccactcgggt gacagaactg 2100
ctgtaccgca tgaagagggc cgagacgtac tgtcctcggc ccctcttggc tgttcacccg 2160
agtgcggcca gacacaaaca gaaaatagtg gcgcctgtaa agcag 2205
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<400> 2
tccttgaact ttgatctgct caagttggca ggggacgtgg agtccaaccc tggg 54
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<400> 3
agtggtgccc ccccgaccga cttgcaaaag atggtcatgg gtaacaccaa gcccgttgag 60
ctcatactcg acgggaagac agtagccatc tgctgtgcta ctggagtatt tggcactgcc 120
tacctcgtgc ctcgtcatct tttcgctgag aagtacgaca agatcatgtt ggacggtaga 180
accatgacag acagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtaaa aggacaggac 240
atgctctcag acgctgcgct catggtgctg caccgtggga accgcgtgag agacatcacg 300
aaacactttc gtgacacagc aagaatgaag aaaggcaccc ccgtcgttgg tgtgatcaac 360
aacgctgacg tcgggagact gattttctca ggtgaggccc tcacctacaa ggacattgta 420
gtgtgcatgg atggagacac catgccgggc ctatttgcct acaaagccgc caccaaagct 480
ggctactgcg ggggagccgt ccttgctaag gatggagccg acacattcat cgttggcact 540
cactctgcag gtggcaatgg agttgggtac tgctcatgcg tatccagatc catgctccaa 600
aaaatgaagg cacacatcga ccctgaacca caccacgagt aa 642
<210> 4
<211> 2985
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-2A-3C基因表达盒
<400> 4
atgggagccg gacaatccag tccggctact gggtcacaga accaatcagg caacaccggg 60
agtatcatca acaattacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccaacttggt 120
gacaatgcta tcagcggagg ctccaacgag ggatccacag acacaacctc cacccacaca 180
accaacactc agaacaatga ctggttttca aagttggcca gctctgcctt cagcggtctt 240
ttcggcgccc tcctcgccga taagaaaacc gaggagacca ctcttctcga ggaccgcatc 300
ctcaccaccc gaaacggaca caccacctcg acaacccagt cgagtgttgg cataacgcac 360
gggtacgcaa cagctgagga ttttgtgaac gggccaaaca cctctggtct tgagaccaga 420
gttgtccagg cggaacggtt ctttaaaacc cacctgttcg actgggtcac cagtgatccg 480
ttcggacggt gctacttgtt ggagctcccg actgaccaca aaggtgtcta cggcagcctg 540
accgactcat acgcctacat gagaaacggt tgggatgttg aggtcaccgc tgtggggaat 600
cagttcaacg gaggctgcct actggtggcc atggtgcctg aactttgttc catcgagcgg 660
agagagctgt tccagcttac gctcttcccc caccagttca tcaacccccg gacgaacatg 720
acagcccaca tcaaggtgcc ctttgttggc gtcaaccgtt acgatcagta caaggtacac 780
aagccgtgga cccttgtggt tatggtcgta gccccactga ctgtcaacac cgaaggcgct 840
ccgcagatca aggtgtatgc caacatcgca cccaccaacg tgcacgtcgc gggtgagttc 900
ccttccaaag aggggatttt ccctgtggcc tgtagcgacg gttatggcgg cttggtgaca 960
actgacccaa agacggctga ccccgtttac ggcaaagtgt tcaacccccc ccgcaacatg 1020
ttgccggggc ggttcaccaa cctcctggac gtggctgagg cttgccccac gtttctgcac 1080
ttcgatggtg acgtaccgta tgtgaccact aagacggatt cggacagggt gctcgcacaa 1140
tttgacttgt ctttggcagc aaaacacatg tcaaacacct tccttgcagg tcttgcccag 1200
tactacacgc agtacagcgg caccgtcaac ctgcacttca tgttcacagg tcccactgac 1260
gcgaaagcgc gttacatgat tgcgtatgcc cctccgggca tggagccgcc caaaacacct 1320
gaggctgctg ctcactgcat tcacgcagag tgggacacgg gtctgaactc aaagtttacc 1380
ttttccatcc cctacctctc ggcggctgat tacgcgtaca ccgcgtctga cgctgctgag 1440
accacaaatg ttcagggatg ggtctgctta tttcaaataa cacacgggaa agctgagggt 1500
gacgctcttg tcgtgctggc cagtgctggc aaagactttg agctgcgcct gcctgtggac 1560
gctcggcaac agaccacttc gacgggcgag tcggctgacc ccgtgactgc caccgttgag 1620
aattacggtg gcgagacaca ggtccagagg cgccaccaca cagacgtctc attcatattg 1680
gacagatttg tgaaagtcac accaaaagac tcaataaatg tattggacct gatgcagacc 1740
ccctcccaca ccctagtagg ggcgctcctc cgcactgcca cttactattt cgctgatcta 1800
gaggtggcag tgaaacacga gggggacctt acctgggtgc caaatggagc acctgaagca 1860
gccttggaca acaccaccaa cccaacggcg taccataagg cgccgcttac tcggcttgca 1920
ttgccctaca cggcaccaca ccgtgttttg gccaccgttt acaacgggaa ctgcaaatac 1980
gccgggggct cactgcccaa cgtgagaggc gatctccaag tgctggctca gaaggcagcg 2040
aggccgctgc ctacttcttt caactacggt gccatcaaag ccactcgggt gacagaactg 2100
ctgtaccgca tgaagagggc cgagacgtac tgtcctcggc ccctcttggc tgttcacccg 2160
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ctgctcaagt tggcagggga cgtggagtcc aaccctgggc ccggatctgg aggaccttac 2280
gagggaccgg tgaagaagcc tgtcgctttg aaagtgaaag ctaagaactt gatcgtcact 2340
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gagctcatac tcgacgggaa gacagtagcc atctgctgtg ctactggagt atttggcact 2460
gcctacctcg tgcctcgtca tcttttcgct gagaagtacg acaagatcat gttggacggt 2520
agaaccatga cagacagtga ctacagagtg tttgagtttg agattaaagt aaaaggacag 2580
gacatgctct cagacgctgc gctcatggtg ctgcaccgtg ggaaccgcgt gagagacatc 2640
acgaaacact ttcgtgacac agcaagaatg aagaaaggca cccccgtcgt tggtgtgatc 2700
aacaacgctg acgtcgggag actgattttc tcaggtgagg ccctcaccta caaggacatt 2760
gtagtgtgca tggatggaga caccatgccg ggcctatttg cctacaaagc cgccaccaaa 2820
gctggctact gcgggggagc cgtccttgct aaggatggag ccgacacatt catcgttggc 2880
actcactctg caggtggcaa tggagttggg tactgctcat gcgtatccag atccatgctc 2940
caaaaaatga aggcacacat cgaccctgaa ccacaccacg agtaa 2985
<210> 5
<211> 945
<212> DNA
<213> 马疱疹病毒1
<400> 5
atggcgagtg ccgcctttga gattgacatc ctactgccca gtgacctatc tcccgctgac 60
ctgtcagctc ttcaaaaatg cgagggtaag cttgtgtttt tgaccgctct gcgtcgtcgc 120
gtgatgctct ccagcgtcac cctctcgtca tactatgtca acggcgcacc cccggacacg 180
ctatccctga tggcggcgtt tcgtaggcgt tttcccgcta taatacagcg cgtgctgccc 240
aacaaaatga tagccgccgc cctgggagtc gcaccgcttc ctcccggggc gttcatacag 300
aacacaggcc cgtttgacct gtgcaacggg gactctgtgt gcgcgctgcc tcccattttg 360
gacgtggagg acaagctgcg cctaggatct gtgggcgagg aaatactatt tccgctgacc 420
gttccactcg cgcaagcgcg cgaactcatc gcgcggctgg tagcgcgcgc ggtgcaggct 480
ctcaccccaa acgcccaggc ccagcgcgga gcggaggtga tgttttacaa cggacgaaag 540
tacaacgtga ccccggatct cagacaccga gacgccgtta acggcgtggc gcggtctctg 600
gtgctaaaca tgatttttgc catgaacgag ggatcgcttg tgctgctctc gctgatacca 660
aacctgctca ccctgggaac ccaggacgga tttgtgaacg ccataatcca gatgggaagc 720
gccacccgtg aggttggcca gctcgtccac cagcagcccg tgccccaacc gcaggacggc 780
gctcgccgct tttgtgtgta cgacgctctg atgtcatgga tcagcgttgc ctcgcgtctt 840
ggtgacgtgg tcggtgggaa acccttggtg cggatctgta cgttcgaggg ccaggctacg 900
atttcccgcg gcgagaaggc ccctgtcatt caaacgcttt tgtaa 945
<210> 6
<211> 2256
<212> DNA
<213> 马疱疹病毒1
<400> 6
atggagggca gcgtcgaatg gtttaacgga catgtttgtg ctaccagtat ttactctcta 60
tggacagatc cgcaccaccc agggcatctt caggcgctcg tctacatgct gtgtcggcgc 120
ggtagcgact acaccgcaga gttttgtcac gttcccgtct cgggcgaact cttgaaacgc 180
ggagctcgcg acgcatctct ggtaacaccg gcgcgcgttg ccagcgccgc gcagaccgcg 240
gctgtgcctg ggtgctggcc cctggctccc ctgggaaacg ccatgttgtg gaaatccgtc 300
tacggtggca taacggcggc gcttaagcgc gccgtgggaa gctttgcttt ctatcaaccc 360
ctggtgttag gaattaacac gcaaactgga cttttagtta ccctccgacc cgccgcgtct 420
gcgggtgaag gcggtggcga ccacgtctct ccgcgggcgg cgatcgtaaa tgtgtcggtg 480
gaggtagact tggacccagc gggcattgaa gcgagcgcgg ctagctccac aggatcgtct 540
ctcgccaggg ccagactctg cacgcttcga gatggatatt ttctctcaaa gcgggacatt 600
gccctagaag ttgagatcgc tacaaaggag gtttcatttt acagaaagta tgactctgtg 660
caacagcctg ccaacaagcg tcgcggcgac atggcagatt tgttcgtcgt gcacgaacga 720
acccttttgc tagggggatg taaacgaatg ggagttaagg ttctattgcc gcgaacgttt 780
gactgtttag ttgccagctc ccagtcagtg tcgggtttag ctgccatggc gctgtacaaa 840
cagtggcacg ctactctatt ctctgtagag ctaccagata ctgttgtgca aatttttgct 900
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tttcccggac tcccgaccct caaggctagt tcgagcacca cggaggctgt gcgcgatgca 1020
atggccgcct atagactgtc cgacgggctg tggccggctc taggtatgag cgcgtttcac 1080
tttttggctc catgggaccc ggaagacagg tggcccggtg aatcggaggc aaaacgggta 1140
gagggggcgg tacacaggct tcagcttgga accgaggatg attggggggc tgggcgggta 1200
tcatgcattt tagagtcgga cgctgtaatg caggggccgt ggttcgcaaa gtttgacttt 1260
tcggcgtttt tccccacgct gtacctgttg ctgtttcccg ccaatgagcg cttggctgag 1320
gtggttagat tgagggcacg tggccaacac cccaccctta agctcgcctt ggtatccttt 1380
tttggggggc tgcagcacat caaccccgta gcctataggt ccatcatagc cctatccaac 1440
ggaatcagta agcggctgga gcacgaagtc aatcagaggg gttttgccat ctgtacatat 1500
gtcaaagatg gcttttgggg ggcagccgga aatctgccat cagactctgt atcctacgcc 1560
gacgcgctgg tttacgcaga ggagctaaga agcgccgctc agaaggcggc cctcggacac 1620
gtgtccgaga tggggttttc gctgccggag ggtgtccact tgaatttgcg gctggagggt 1680
ttgtttacag acgccatctc gtggtccacc cactgttact ggttgtacaa ccgcttcacc 1740
aagatggaag actttgtagg cttccccgcc aagagcgggg ccggcagagc cgcgaaggcg 1800
agcttgtctg ccttgctacc gctggtagcc gcggtatgcg actctagcga tatgagcacc 1860
ctccatcagt ctgtgcgggg ggcctgcgaa cagctggtag ccggcgcttt tgccgagcgc 1920
aacaacccgc agttttggag taccaggacg gggatcgagt cgtctacgct actccccccg 1980
gcagtttaca ggaacggcag cttgctcgac agagactgtg ggcagaggga aattgtgttg 2040
actcgcaaac acgactgtga atccccatcg cccgtaccct ggacgctctt cccaccaccc 2100
ttggttttgg ggcgcattga ctgtatggtc tatcttacgt ccattttcaa aacttatcta 2160
agcatgttaa acagagcaat atctgcctcg tgcgacgcgg atgaatctat gaatgtggac 2220
tttccaatct ctgattatgc atttttattt acctaa 2256
<210> 7
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGH多聚A信号
<400> 7
gtcacctaaa tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 60
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 120
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 180
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agaca 225
<210> 8
<211> 4947
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV5-P12A3C2AORF43-BGH盒
<400> 8
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tagcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc cgcgtggccg gccggatccg ccaccatggg agccggacaa 660
tccagtccgg ctactgggtc acagaaccaa tcaggcaaca ccgggagtat catcaacaat 720
tactacatgc agcagtacca gaactccatg gacacccaac ttggtgacaa tgctatcagc 780
ggaggctcca acgagggatc cacagacaca acctccaccc acacaaccaa cactcagaac 840
aatgactggt tttcaaagtt ggccagctct gccttcagcg gtcttttcgg cgccctcctc 900
gccgataaga aaaccgagga gaccactctt ctcgaggacc gcatcctcac cacccgaaac 960
ggacacacca cctcgacaac ccagtcgagt gttggcataa cgcacgggta cgcaacagct 1020
gaggattttg tgaacgggcc aaacacctct ggtcttgaga ccagagttgt ccaggcggaa 1080
cggttcttta aaacccacct gttcgactgg gtcaccagtg atccgttcgg acggtgctac 1140
ttgttggagc tcccgactga ccacaaaggt gtctacggca gcctgaccga ctcatacgcc 1200
tacatgagaa acggttggga tgttgaggtc accgctgtgg ggaatcagtt caacggaggc 1260
tgcctactgg tggccatggt gcctgaactt tgttccatcg agcggagaga gctgttccag 1320
cttacgctct tcccccacca gttcatcaac ccccggacga acatgacagc ccacatcaag 1380
gtgccctttg ttggcgtcaa ccgttacgat cagtacaagg tacacaagcc gtggaccctt 1440
gtggttatgg tcgtagcccc actgactgtc aacaccgaag gcgctccgca gatcaaggtg 1500
tatgccaaca tcgcacccac caacgtgcac gtcgcgggtg agttcccttc caaagagggg 1560
attttccctg tggcctgtag cgacggttat ggcggcttgg tgacaactga cccaaagacg 1620
gctgaccccg tttacggcaa agtgttcaac cccccccgca acatgttgcc ggggcggttc 1680
accaacctcc tggacgtggc tgaggcttgc cccacgtttc tgcacttcga tggtgacgta 1740
ccgtatgtga ccactaagac ggattcggac agggtgctcg cacaatttga cttgtctttg 1800
gcagcaaaac acatgtcaaa caccttcctt gcaggtcttg cccagtacta cacgcagtac 1860
agcggcaccg tcaacctgca cttcatgttc acaggtccca ctgacgcgaa agcgcgttac 1920
atgattgcgt atgcccctcc gggcatggag ccgcccaaaa cacctgaggc tgctgctcac 1980
tgcattcacg cagagtggga cacgggtctg aactcaaagt ttaccttttc catcccctac 2040
ctctcggcgg ctgattacgc gtacaccgcg tctgacgctg ctgagaccac aaatgttcag 2100
ggatgggtct gcttatttca aataacacac gggaaagctg agggtgacgc tcttgtcgtg 2160
ctggccagtg ctggcaaaga ctttgagctg cgcctgcctg tggacgctcg gcaacagacc 2220
acttcgacgg gcgagtcggc tgaccccgtg actgccaccg ttgagaatta cggtggcgag 2280
acacaggtcc agaggcgcca ccacacagac gtctcattca tattggacag atttgtgaaa 2340
gtcacaccaa aagactcaat aaatgtattg gacctgatgc agaccccctc ccacacccta 2400
gtaggggcgc tcctccgcac tgccacttac tatttcgctg atctagaggt ggcagtgaaa 2460
cacgaggggg accttacctg ggtgccaaat ggagcacctg aagcagcctt ggacaacacc 2520
accaacccaa cggcgtacca taaggcgccg cttactcggc ttgcattgcc ctacacggca 2580
ccacaccgtg ttttggccac cgtttacaac gggaactgca aatacgccgg gggctcactg 2640
cccaacgtga gaggcgatct ccaagtgctg gctcagaagg cagcgaggcc gctgcctact 2700
tctttcaact acggtgccat caaagccact cgggtgacag aactgctgta ccgcatgaag 2760
agggccgaga cgtactgtcc tcggcccctc ttggctgttc acccgagtgc ggccagacac 2820
aaacagaaaa tagtggcgcc tgtaaagcag tccttgaact ttgatctgct caagttggca 2880
ggggacgtgg agtccaaccc tgggcccgga tctggaggac cttacgaggg accggtgaag 2940
aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgatcg tcactgagag tggtgccccc 3000
ccgaccgact tgcaaaagat ggtcatgggt aacaccaagc ccgttgagct catactcgac 3060
gggaagacag tagccatctg ctgtgctact ggagtatttg gcactgccta cctcgtgcct 3120
cgtcatcttt tcgctgagaa gtacgacaag atcatgttgg acggtagaac catgacagac 3180
agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac 3240
gctgcgctca tggtgctgca ccgtgggaac cgcgtgagag acatcacgaa acactttcgt 3300
gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc gtcgttggtg tgatcaacaa cgctgacgtc 3360
gggagactga ttttctcagg tgaggccctc acctacaagg acattgtagt gtgcatggat 3420
ggagacacca tgccgggcct atttgcctac aaagccgcca ccaaagctgg ctactgcggg 3480
ggagccgtcc ttgctaagga tggagccgac acattcatcg ttggcactca ctctgcaggt 3540
ggcaatggag ttgggtactg ctcatgcgta tccagatcca tgctccaaaa aatgaaggca 3600
cacatcgacc ctgaaccaca ccacgagggg ttgatcgttg acaccagaga tgtggaagag 3660
cgcgtgcacg tcatgcgcaa gaccaagggt acctccttga actttgatct cctcaagttg 3720
gcaggggacg tagagtccaa cccagggcct atggcgagtg ccgcctttga gattgacatc 3780
ctactgccca gtgacctatc tcccgctgac ctgtcagctc ttcaaaaatg cgagggtaag 3840
cttgtgtttt tgaccgctct gcgtcgtcgc gtgatgctct ccagcgtcac cctctcgtca 3900
tactatgtca acggcgcacc cccggacacg ctatccctga tggcggcgtt tcgtaggcgt 3960
tttcccgcta taatacagcg cgtgctgccc aacaaaatga tagccgccgc cctgggagtc 4020
gcaccgcttc ctcccggggc gttcatacag aacacaggcc cgtttgacct gtgcaacggg 4080
gactctgtgt gcgcgctgcc tcccattttg gacgtggagg acaagctgcg cctaggatct 4140
gtgggcgagg aaatactatt tccgctgacc gttccactcg cgcaagcgcg cgaactcatc 4200
gcgcggctgg tagcgcgcgc ggtgcaggct ctcaccccaa acgcccaggc ccagcgcgga 4260
gcggaggtga tgttttacaa cggacgaaag tacaacgtga ccccggatct cagacaccga 4320
gacgccgtta acggcgtggc gcggtctctg gtgctaaaca tgatttttgc catgaacgag 4380
ggatcgcttg tgctgctctc gctgatacca aacctgctca ccctgggaac ccaggacgga 4440
tttgtgaacg ccataatcca gatgggaagc gccacccgtg aggttggcca gctcgtccac 4500
cagcagcccg tgccccaacc gcaggacggc gctcgccgct tttgtgtgta cgacgctctg 4560
atgtcatgga tcagcgttgc ctcgcgtctt ggtgacgtgg tcggtgggaa acccttggtg 4620
cggatctgta cgttcgaggg ccaggctacg atttcccgcg gcgagaaggc ccctgtcatt 4680
caaacgcttt tgtaatctag atagagggcc ctattctata gtgtcaccta aatgctagag 4740
ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 4800
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 4860
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 4920
acagcaaggg ggaggattgg gaagaca 4947
<210> 9
<211> 6258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV5-P12A3C2AORF54-BGH盒
<400> 9
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tagcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc cgcgtggccg gccggatccg ccaccatggg agccggacaa 660
tccagtccgg ctactgggtc acagaaccaa tcaggcaaca ccgggagtat catcaacaat 720
tactacatgc agcagtacca gaactccatg gacacccaac ttggtgacaa tgctatcagc 780
ggaggctcca acgagggatc cacagacaca acctccaccc acacaaccaa cactcagaac 840
aatgactggt tttcaaagtt ggccagctct gccttcagcg gtcttttcgg cgccctcctc 900
gccgataaga aaaccgagga gaccactctt ctcgaggacc gcatcctcac cacccgaaac 960
ggacacacca cctcgacaac ccagtcgagt gttggcataa cgcacgggta cgcaacagct 1020
gaggattttg tgaacgggcc aaacacctct ggtcttgaga ccagagttgt ccaggcggaa 1080
cggttcttta aaacccacct gttcgactgg gtcaccagtg atccgttcgg acggtgctac 1140
ttgttggagc tcccgactga ccacaaaggt gtctacggca gcctgaccga ctcatacgcc 1200
tacatgagaa acggttggga tgttgaggtc accgctgtgg ggaatcagtt caacggaggc 1260
tgcctactgg tggccatggt gcctgaactt tgttccatcg agcggagaga gctgttccag 1320
cttacgctct tcccccacca gttcatcaac ccccggacga acatgacagc ccacatcaag 1380
gtgccctttg ttggcgtcaa ccgttacgat cagtacaagg tacacaagcc gtggaccctt 1440
gtggttatgg tcgtagcccc actgactgtc aacaccgaag gcgctccgca gatcaaggtg 1500
tatgccaaca tcgcacccac caacgtgcac gtcgcgggtg agttcccttc caaagagggg 1560
attttccctg tggcctgtag cgacggttat ggcggcttgg tgacaactga cccaaagacg 1620
gctgaccccg tttacggcaa agtgttcaac cccccccgca acatgttgcc ggggcggttc 1680
accaacctcc tggacgtggc tgaggcttgc cccacgtttc tgcacttcga tggtgacgta 1740
ccgtatgtga ccactaagac ggattcggac agggtgctcg cacaatttga cttgtctttg 1800
gcagcaaaac acatgtcaaa caccttcctt gcaggtcttg cccagtacta cacgcagtac 1860
agcggcaccg tcaacctgca cttcatgttc acaggtccca ctgacgcgaa agcgcgttac 1920
atgattgcgt atgcccctcc gggcatggag ccgcccaaaa cacctgaggc tgctgctcac 1980
tgcattcacg cagagtggga cacgggtctg aactcaaagt ttaccttttc catcccctac 2040
ctctcggcgg ctgattacgc gtacaccgcg tctgacgctg ctgagaccac aaatgttcag 2100
ggatgggtct gcttatttca aataacacac gggaaagctg agggtgacgc tcttgtcgtg 2160
ctggccagtg ctggcaaaga ctttgagctg cgcctgcctg tggacgctcg gcaacagacc 2220
acttcgacgg gcgagtcggc tgaccccgtg actgccaccg ttgagaatta cggtggcgag 2280
acacaggtcc agaggcgcca ccacacagac gtctcattca tattggacag atttgtgaaa 2340
gtcacaccaa aagactcaat aaatgtattg gacctgatgc agaccccctc ccacacccta 2400
gtaggggcgc tcctccgcac tgccacttac tatttcgctg atctagaggt ggcagtgaaa 2460
cacgaggggg accttacctg ggtgccaaat ggagcacctg aagcagcctt ggacaacacc 2520
accaacccaa cggcgtacca taaggcgccg cttactcggc ttgcattgcc ctacacggca 2580
ccacaccgtg ttttggccac cgtttacaac gggaactgca aatacgccgg gggctcactg 2640
cccaacgtga gaggcgatct ccaagtgctg gctcagaagg cagcgaggcc gctgcctact 2700
tctttcaact acggtgccat caaagccact cgggtgacag aactgctgta ccgcatgaag 2760
agggccgaga cgtactgtcc tcggcccctc ttggctgttc acccgagtgc ggccagacac 2820
aaacagaaaa tagtggcgcc tgtaaagcag tccttgaact ttgatctgct caagttggca 2880
ggggacgtgg agtccaaccc tgggcccgga tctggaggac cttacgaggg accggtgaag 2940
aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgatcg tcactgagag tggtgccccc 3000
ccgaccgact tgcaaaagat ggtcatgggt aacaccaagc ccgttgagct catactcgac 3060
gggaagacag tagccatctg ctgtgctact ggagtatttg gcactgccta cctcgtgcct 3120
cgtcatcttt tcgctgagaa gtacgacaag atcatgttgg acggtagaac catgacagac 3180
agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac 3240
gctgcgctca tggtgctgca ccgtgggaac cgcgtgagag acatcacgaa acactttcgt 3300
gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc gtcgttggtg tgatcaacaa cgctgacgtc 3360
gggagactga ttttctcagg tgaggccctc acctacaagg acattgtagt gtgcatggat 3420
ggagacacca tgccgggcct atttgcctac aaagccgcca ccaaagctgg ctactgcggg 3480
ggagccgtcc ttgctaagga tggagccgac acattcatcg ttggcactca ctctgcaggt 3540
ggcaatggag ttgggtactg ctcatgcgta tccagatcca tgctccaaaa aatgaaggca 3600
cacatcgacc ctgaaccaca ccacgagggg ttgatcgttg acaccagaga tgtggaagag 3660
cgcgtgcacg tcatgcgcaa gaccaagggt acctccttga actttgatct cctcaagttg 3720
gcaggggacg tagagtccaa cccagggcct atggagggca gcgtcgaatg gtttaacgga 3780
catgtttgtg ctaccagtat ttactctcta tggacagatc cgcaccaccc agggcatctt 3840
caggcgctcg tctacatgct gtgtcggcgc ggtagcgact acaccgcaga gttttgtcac 3900
gttcccgtct cgggcgaact cttgaaacgc ggagctcgcg acgcatctct ggtaacaccg 3960
gcgcgcgttg ccagcgccgc gcagaccgcg gctgtgcctg ggtgctggcc cctggctccc 4020
ctgggaaacg ccatgttgtg gaaatccgtc tacggtggca taacggcggc gcttaagcgc 4080
gccgtgggaa gctttgcttt ctatcaaccc ctggtgttag gaattaacac gcaaactgga 4140
cttttagtta ccctccgacc cgccgcgtct gcgggtgaag gcggtggcga ccacgtctct 4200
ccgcgggcgg cgatcgtaaa tgtgtcggtg gaggtagact tggacccagc gggcattgaa 4260
gcgagcgcgg ctagctccac aggatcgtct ctcgccaggg ccagactctg cacgcttcga 4320
gatggatatt ttctctcaaa gcgggacatt gccctagaag ttgagatcgc tacaaaggag 4380
gtttcatttt acagaaagta tgactctgtg caacagcctg ccaacaagcg tcgcggcgac 4440
atggcagatt tgttcgtcgt gcacgaacga acccttttgc tagggggatg taaacgaatg 4500
ggagttaagg ttctattgcc gcgaacgttt gactgtttag ttgccagctc ccagtcagtg 4560
tcgggtttag ctgccatggc gctgtacaaa cagtggcacg ctactctatt ctctgtagag 4620
ctaccagata ctgttgtgca aatttttgct tacctagggc cagaattaaa cccgtgtgga 4680
gaggaagtcg actattgttg ctttgttgga tttcccggac tcccgaccct caaggctagt 4740
tcgagcacca cggaggctgt gcgcgatgca atggccgcct atagactgtc cgacgggctg 4800
tggccggctc taggtatgag cgcgtttcac tttttggctc catgggaccc ggaagacagg 4860
tggcccggtg aatcggaggc aaaacgggta gagggggcgg tacacaggct tcagcttgga 4920
accgaggatg attggggggc tgggcgggta tcatgcattt tagagtcgga cgctgtaatg 4980
caggggccgt ggttcgcaaa gtttgacttt tcggcgtttt tccccacgct gtacctgttg 5040
ctgtttcccg ccaatgagcg cttggctgag gtggttagat tgagggcacg tggccaacac 5100
cccaccctta agctcgcctt ggtatccttt tttggggggc tgcagcacat caaccccgta 5160
gcctataggt ccatcatagc cctatccaac ggaatcagta agcggctgga gcacgaagtc 5220
aatcagaggg gttttgccat ctgtacatat gtcaaagatg gcttttgggg ggcagccgga 5280
aatctgccat cagactctgt atcctacgcc gacgcgctgg tttacgcaga ggagctaaga 5340
agcgccgctc agaaggcggc cctcggacac gtgtccgaga tggggttttc gctgccggag 5400
ggtgtccact tgaatttgcg gctggagggt ttgtttacag acgccatctc gtggtccacc 5460
cactgttact ggttgtacaa ccgcttcacc aagatggaag actttgtagg cttccccgcc 5520
aagagcgggg ccggcagagc cgcgaaggcg agcttgtctg ccttgctacc gctggtagcc 5580
gcggtatgcg actctagcga tatgagcacc ctccatcagt ctgtgcgggg ggcctgcgaa 5640
cagctggtag ccggcgcttt tgccgagcgc aacaacccgc agttttggag taccaggacg 5700
gggatcgagt cgtctacgct actccccccg gcagtttaca ggaacggcag cttgctcgac 5760
agagactgtg ggcagaggga aattgtgttg actcgcaaac acgactgtga atccccatcg 5820
cccgtaccct ggacgctctt cccaccaccc ttggttttgg ggcgcattga ctgtatggtc 5880
tatcttacgt ccattttcaa aacttatcta agcatgttaa acagagcaat atctgcctcg 5940
tgcgacgcgg atgaatctat gaatgtggac tttccaatct ctgattatgc atttttattt 6000
acctaatcta gatagagggc cctattctat agtgtcacct aaatgctaga gctcgctgat 6060
cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 6120
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 6180
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 6240
gggaggattg ggaagaca 6258
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
taacaccatg gcaggcctgt tg 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
gagcgattcg cacctcatct cc 22

Claims (44)

1.一种重组病毒，其包含在所述重组病毒的基因组中的表达盒，其中所述表达盒包含编码至少一种目的多肽的第一多核苷酸、以及为重组病毒的必需基因或其功能片段的第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸功能性连接，其中所述第一多核苷酸位于第二多核苷酸的上游，并且其中所述第二多核苷酸是所述必需基因或其功能片段在重组病毒中有活性的唯一拷贝。
2.权利要求1的重组病毒，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在同一ORF内。
3.权利要求1或2的重组病毒，其中所述第二多核苷酸是所述重组病毒的内源必需基因。
4.权利要求1或2的重组病毒，其中所述第二多核苷酸是外源的，并且所述重组病毒的内源必需基因已被沉默。
5.权利要求1-4中任一项的重组病毒，其中所述第一多核苷酸编码抗原性多肽或治疗性多肽。
6.权利要求5的重组病毒，其中所述抗原性多肽选自FMDV抗原、PRRSV抗原、DEV抗原和PRV抗原，优选FMDV抗原。
7.权利要求1-4中任一项的重组病毒，其中所述第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。
8.权利要求1-7中任一项的重组病毒，其中所述重组病毒衍生自选自以下的病毒：疱疹病毒科(herpesviridae)，例如马α疱疹病毒1(EHV-1)、马α疱疹病毒4(EHV-4)和其它水痘病毒(Varicelloviruses)，如伪狂犬病病毒(Pseudorabies)(PrV)和牛疱疹病毒1(BHV-1)，腺病毒科(Adenoviridae)(AdV)，例如犬腺病毒(Canine Adenovirus)(CAdV)，腺相关病毒科，慢病毒科(Lentiviridae)例如逆转录病毒(Retroviruses)和痘病毒科(Poxviridae)。
9.权利要求8的重组病毒，其中所述病毒是疱疹病毒科，优选α疱疹病毒属(Alphaherpesvirinae)，更优选水痘病毒亚属(Varicellovirus)，最优选马α疱疹病毒1(EHV-1)的成员。
10.权利要求1的重组病毒，其中所述重组病毒衍生自EHV-1，并且所述第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。
11.权利要求1-10中任一项的重组病毒，其中所述必需基因编码选自衣壳蛋白、DNA复制相关蛋白、DNA解旋酶、DNA复制酶、受体结合蛋白和外出相关蛋白的蛋白质。
12.权利要求11的重组病毒，其中所述重组病毒衍生自EHV-1，所述第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因，并且所述必需基因是EHV-1ORF43基因或EHV-1ORF54基因。
13.权利要求1-12中任一项的重组病毒，其中所述第一多核苷酸经由接头与所述第二多核苷酸连接。
14.权利要求13的重组病毒，其中所述接头可以是柔性接头或2A基因，优选2A基因。
15.权利要求1-13中任一项的重组病毒，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸直接连接。
16.权利要求1-15中任一项的重组病毒，其中所述表达盒进一步包含调控元件，例如启动子，优选CMV5启动子。
17.权利要求1-16中任一项的重组病毒，其中所述表达盒包含P1-2A-3C-2A-ORF43构建体或P1-2A-3C-2A-ORF54构建体，优选CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH构建体或CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH构建体，更优选如SEQ ID NO：8中所示的CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH构建体、或如SEQ ID NO：9中所示的CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH构建体。
18.一种用于制备权利要求1-17中任一项的重组病毒的方法，其包括在所述重组病毒的基因组中构建表达盒，其中所述表达盒包含编码至少一种目的多肽的第一多核苷酸、以及为重组病毒的必需基因或其功能片段的第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸功能性连接，其中第一多核苷酸位于第二多核苷酸的上游，并且其中所述第二多核苷酸是所述必需基因或其功能片段在重组病毒中有活性的唯一拷贝。
19.一种用于增加重组病毒内的目的多肽的表达稳定性的方法，其包括在所述重组病毒的基因组中构建表达盒，其中所述表达盒包含编码至少一种目的多肽的第一多核苷酸、以及为重组病毒的必需基因或其功能片段的第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸功能性连接，其中第一多核苷酸位于第二多核苷酸的上游，并且其中所述第二多核苷酸是所述必需基因或其功能片段在重组病毒中有活性的唯一拷贝。
20.权利要求19的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在同一ORF内。
21.权利要求19或20的方法，其中所述第二多核苷酸是所述重组病毒的基因组中天然存在的必需基因。
22.权利要求19或20的方法，其中所述第二多核苷酸是外源的，并且所述重组病毒的基因组中天然存在的必需基因已被沉默。
23.权利要求19-22中任一项的方法，其中所述第一多核苷酸编码抗原性多肽或治疗性多肽。
24.权利要求23的方法，其中所述抗原性多肽选自FMDV抗原、PRRSV抗原、DEV抗原和PRV抗原，优选FMDV抗原。
25.权利要求19-22中任一项的方法，其中所述第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。
26.权利要求19-22中任一项的方法，其中所述重组病毒衍生自选自以下的病毒：疱疹病毒科，例如马α疱疹病毒1(EHV-1)、马α疱疹病毒4(EHV-4)和其它水痘病毒，如伪狂犬病病毒(PrV)和牛疱疹病毒1(BHV-1)，腺病毒科(AdV)，例如犬腺病毒(CAdV)，腺相关病毒科，慢病毒科例如逆转录病毒和痘病毒科。
27.权利要求26的方法，其中所述病毒是疱疹病毒科，优选α疱疹病毒属，更优选水痘病毒亚属，最优选马α疱疹病毒1(EHV-1)的成员。
28.权利要求19的方法，其中所述重组病毒衍生自EHV-1，并且所述第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因。
29.权利要求19-28中任一项的方法，其中所述必需基因编码选自衣壳蛋白、DNA复制相关蛋白、DNA解旋酶、DNA复制酶、受体结合蛋白和外出相关蛋白的蛋白质。
30.权利要求29的方法，其中所述重组病毒衍生自EHV-1，所述第一多核苷酸包含FMDV的P1基因、2A基因和3C基因，并且所述必需基因是EHV-1ORF43基因或EHV-1ORF54基因。
31.权利要求19-30中任一项的方法，其中所述第一多核苷酸经由接头与所述第二多核苷酸连接。
32.权利要求31的方法，其中所述接头可以是柔性接头或2A基因，优选2A基因。
33.权利要求19-30中任一项的方法，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸直接连接。
34.权利要求19-30中任一项的方法，其中所述表达盒进一步包含其它调控元件，例如启动子、多聚A等，优选启动子，更优选CMV5启动子。
35.权利要求19-31中任一项的方法，其中所述表达盒包含P1-2A-3C-2A-ORF43构建体或P1-2A-3C-2A-ORF54构建体，优选CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH构建体或CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH构建体，优选如SEQ ID NO：8中所示的CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH构建体、或如SEQ ID NO：9中所示的CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH构建体。
36.一种宿主细胞，其包含权利要求1-17中任一项的重组病毒，优选地所述宿主细胞是真核宿主细胞株；更优选地，所述宿主细胞株是哺乳动物细胞株或昆虫细胞株；最优选地，所述宿主细胞株是RK13细胞株、MDBK细胞株、ST细胞株、AI-ST细胞株、VERO细胞株、Sf9细胞株、Sf21、MDCK细胞株和/或其衍生物。
37.一种制备权利要求36的宿主细胞的方法，其特征在于下述步骤：
a.用权利要求1-17中任一项的重组病毒感染所述宿主细胞株，
b.在合适的条件下培养受感染的细胞，以及
c.任选地收获所述宿主细胞。
38.一种免疫原性、药物或疫苗组合物，其包含：
a.权利要求1-17中任一项的重组病毒，和/或
b.由权利要求1-17中任一项的重组病毒表达的目的多肽，和
b.任选地，药学上或兽医学上可接受的载体或赋形剂，优选地，所述载体适合于经口、真皮内、肌内或鼻内施加。
39.一种用于制备免疫原性、药物或疫苗组合物的方法，其包括下述步骤：
a.用权利要求1-17中任一项的重组病毒感染权利要求36的宿主细胞，
b.在合适的条件下培养受感染的细胞，
c.收获受感染的细胞，
d.任选地纯化步骤c)的收获物，和
e.任选地将所述收获物与药学上可接受的载体混合。
40.权利要求39的方法，其中所述收获物是由受感染细胞产生的重组病毒，或者所述收获物是由重组病毒表达的目的多肽。
41.权利要求1-17中任一项的重组病毒在制备免疫原性、药物或疫苗组合物中的用途，所述组合物用于预防和/或治疗动物中由病原体感染引起的临床体征或疾病，或者用于治疗或预防动物中病原体感染的方法中，优选地所述动物是产食性动物例如猪。
42.权利要求1-17中任一项的重组病毒或者权利要求38的免疫原性、药物或疫苗组合物，其用于降低或预防动物中由病原体感染引起的临床体征或疾病的方法中，或者用于治疗或预防动物中病原体感染的方法中，优选地所述动物是产食性动物例如猪。
43.一种针对动物中由病原体引起的疾病，来免疫、治疗或预防所述动物例如产食性动物例如猪或牛的方法，所述方法包括向所述动物施用权利要求1-17中任一项的重组病毒或者权利要求38的免疫原性、药物或疫苗组合物的步骤。
44.一种试剂盒，其用于给动物接种疫苗以针对所述动物中与病原体有关的疾病和/或降低与病原体有关或由病原体引起的一种或多种临床体征的发生率或严重性，所述动物优选产食性动物例如猪或牛，所述试剂盒包括：
a.能够向所述动物施用权利要求1-17中任一项的重组病毒或者权利要求38的免疫原性、药物或疫苗组合物的分配器；
b.权利要求1-17中任一项的重组病毒或者权利要求38的免疫原性、药物或疫苗组合物；和
c.任选的说明册。
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