CN115516099A

CN115516099A - 甲型肝炎病毒制备方法和根据该方法制备的甲型肝炎病毒

Info

Publication number: CN115516099A
Application number: CN202080096843.XA
Authority: CN
Inventors: 李定恩; 金秀映; 曹舒映; 金勋; 李建世; 李受陈
Original assignee: Sk Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sk Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-12-23
Also published as: KR102277089B1; WO2021125891A1; EP4079859A1; KR20210079198A; EP4079859A4; JP2023511823A

Abstract

本发明涉及一种甲型肝炎病毒生产方法以及根据该方法生产的甲型肝炎病毒，更具体涉及：一种甲型肝炎病毒生产方法以及根据该方法生产的甲型肝炎病毒，所述方法包括以下步骤：用包含表达盒的用于甲型肝炎病毒制备的载体转化宿主细胞获得的病毒感染宿主细胞，所述表达盒包含甲型肝炎病毒基因，并将宿主细胞传代培养。

Description

甲型肝炎病毒制备方法和根据该方法制备的甲型肝炎病毒

技术领域

本申请要求2019年12月19日提交的韩国专利申请第10-2019-0171279号的优先权，其全部内容为本申请的参考。

本发明涉及一种甲型肝炎病毒的生产方法及根据该方法生产的甲型肝炎病毒，更具体涉及一种甲型肝炎病毒的制备方法及根据该方法制备的甲型肝炎病毒，所述方法包括用病毒感染宿主细胞并传代培养所述宿主细胞，所述病毒是通过用插入了包含甲型肝炎病毒基因的表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体转染宿主细胞而获得的。

背景技术

甲型肝炎是韩国70％以上急性病毒性肝炎的最重要原因。甲型肝炎病毒(HAV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，大小约为27nm，无包膜，核酸为单链RNA。在平均28天的潜伏期后，HAV会引起急性肝病，特征在于临床症状如发热、厌食、恶心和呕吐、腹痛、尿色深和黄疸(SM Lemon et al.J.Hepatol,68(1):167-184(2018)；Totsuka and Moritsugu,Intervirology,42:63-68(1999))。根据过去10年的一项调查，美国西部、中东和一些亚洲地区的甲型肝炎患者正在增加，令人担忧甲型肝炎疾病的全球传播。即使在韩国，感染甲型肝炎的人数也在10多岁和20多岁没有免疫力的年轻人中迅速增加(Nwachuku and Gerba,Rev.Environ.Contam.Toxicol.186:1-56(2006)；Kim and Lee,Intervirology,53(1):10-14(2010)；Korea Centers for Disease Control and Prevention(KCDC)InfectiousDiseases Portal Legal Infectious Disease Statistics by Disease-Hepatitis A)。特别是在学习年龄的青少年或考试对象的情况下，甲型肝炎病毒感染会因住院和治疗而造成人身和经济损失。在美国，众所周知，每名甲肝患者的直接和间接费用为成人$2500美元，18岁以下的人约$1500美元，每年因甲肝引起的医疗费用超过3亿美元(World HealthOrganization，1999)。

甲型肝炎的主要传播途径是粪口途径，甲型肝炎通过受污染的食物或饮用水传播。Advisory committee on immunization practices(ACIP)建议对前往甲型肝炎病毒流行地区的出境旅行者和相应地区的工人、男男性行为者(MSM)、乙型肝炎患者、慢性肝病患者和慢性肾功能衰竭患者以及生活在甲型肝炎高发地区的儿童群体进行疫苗接种(NelsonNP,Weng MK,Hofmeister MG,et al.Prevention of Hepatitis A Virus Infection inthe United States:Recommendations of the Advisory Committee on ImmunizationPractices,2020.MMWR Recomm Rep 2020；69(No.RR-5):1–38.DOI:http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.rr6905a1)。

为制备甲型肝炎疫苗，必然伴随着甲型肝炎病毒(HAV)的制备，但甲型肝炎病毒的复制速度非常慢(Cromeans et al.J.Gen.Virol.70:2051-2062(1989))。通常感染人的病毒，孵育短至2至3天或长至7天即可分离和复制，但甲型肝炎病毒短则培养约一个月才可获得病毒。相当于一个月的时间也仅限于病毒很好地适应培育细胞的情况。用于扩增甲型肝炎病毒的对甲型肝炎病毒高度敏感的细胞系(例如原代AGMK细胞、FRhK-4、BS-C-1)不适合作为生产疫苗的细胞。这些细胞系尚未针对适合用作人类疫苗生产细胞系的细胞系表征和稳定性进行验证。特别地，已建立示例的细胞作为能够在培养瓶等中进行体外培养的细胞系，但被归类为来自属于CITES限制的国际濒危物种猕猴科(Cercopithecidae)的猕猴(Macaca mulatta)和非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的材料，因此很难从分发和商业销售细胞系的ATCC(美国)进口到韩国。

为从人粪便样本中分离并在病毒生产细胞系中高产量生产，需要大约50个病毒感染传代培养物来使HAV适应所述病毒生产细胞系。例如，在商业疫苗Havrix的主种子病毒(HAV 4380或MRC5/9，主种子)的情况下，将人源wt HM-175(人粪便悬浮液)在原代AGMK(非洲绿猴)细胞中进行32代传代以确认适应细胞培养物的病毒。然后，将相应病毒(P-32AGMK细胞适应的)在MRC-5细胞系中传代培育37代并分离为病毒克隆(克隆25-4-21)，并将所述克隆在MRC-5中再次孵育(第38代)。此后，将在MRC-5细胞中通过病毒感染另外传代3次的第41代病毒用作主种子原种，将其称作HAV 4380(US6423318B1)。

甲型肝炎疫苗须接受政府指定的强制性疫苗接种，但在HAV流行期间经常供不应求。葛兰素史克(GSK)的Havrix、默克公司的Vaqta等全球最常用的甲型肝炎疫苗在2019年甲型肝炎流行的韩国被抢购一空，随后遭受供需困难重创，例如在2019年底停供。在2017年同样出现了这些疫苗的供需失衡问题，但供需不稳定甚至在2019年也没有解决，当时突然爆发甲型肝炎传播。目前，甲型肝炎疫苗已被保健福祉部(Ministry of Health andWelfare)列入2020年全国预防接种疫苗储备计划以稳定疫苗供需并正在努力解决这一问题。这种供需不稳定的原因是目前没有用甲型肝炎疫苗国内技术开发的商业化疫苗。

发明内容

技术问题

本发明人为了解决上述技术问题并开发出能够稳定快速生产甲型肝炎病毒的方法而反复潜心研究，结果发现了一种将约50次的传代培养步骤缩短至仅6次即可获得病毒的方法以及在病毒生产细胞系中以更高产量表达的最佳基因表达盒组合。然后，本发明人发现，用包含甲型肝炎病毒的遗传和功能位点的表达载体感染宿主细胞获得的病毒，通过反复传代培养以惊人的速度复制，以快速稳定地产生甲型肝炎病毒，然后完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种由SEQ ID NO:1定义的甲型肝炎病毒基因。

本发明的另一个目的是提供一种用于制备甲型肝炎病毒的表达盒，其包含SEQ IDNO:1的甲型肝炎病毒基因。

本发明的再一个目的是提供一种用于制备甲型肝炎病毒的包含所述表达盒的载体。

本发明的再一个目的是提供用所述载体制备的甲型肝炎病毒。

本发明的再一个目的是提供一种用于制备疫苗的甲型肝炎病毒的制备方法，包括以下步骤：(a)将宿主细胞用插入了表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体转染，所述表达盒包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因；(b)从宿主细胞获得病毒；(c)用获得的病毒感染宿主细胞并传代培养感染的宿主细胞；和(d)从宿主细胞获得病毒。

本发明的另一个目的是提供根据该方法制备的肝炎病毒。

本发明的另一个目的是提供一种包含肝炎病毒作为活性成分的甲型肝炎疫苗组合物。

本发明的另一个目的是提供一种由肝炎病毒组成的甲型肝炎疫苗组合物。

本发明的另一个目的是提供一种主要由肝炎病毒组成的甲型肝炎疫苗组合物。

本发明的另一个目的是提供一种包含所述疫苗组合物的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种填充有所述疫苗组合物的预填充注射器。

本发明的另一目的是提供所述肝炎病毒在制备甲型肝炎疫苗中的应用。

本发明的另一个目的是提供包含肝炎病毒作为活性成分的所述疫苗组合物在预防甲型肝炎中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种预防甲型肝炎的方法，包括将有效剂量的包含肝炎病毒作为活性成分的所述疫苗组合物施用于有需要的对象。

技术方案

为实现本发明的目的，本发明提供了由SEQ ID NO:1定义的甲型肝炎病毒基因。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于制备甲型肝炎病毒的表达盒，其包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于制备甲型肝炎病毒的表达载体，其包含所述表达盒。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了用所述载体制备的甲型肝炎病毒。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于制备疫苗的甲型肝炎病毒的制备方法，包括以下步骤：(a)将宿主细胞用插入了表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体转染，所述表达盒包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因；(b)从宿主细胞获得病毒；(c)用获得的病毒感染宿主细胞并传代培养被感染的宿主细胞；和(d)从宿主细胞获得病毒。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了根据所述方法制备的肝炎病毒。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种包含肝炎病毒作为活性成分的甲型肝炎疫苗组合物。

此外，本发明提供了一种由肝炎病毒组成的甲型肝炎疫苗组合物。

此外，本发明提供了一种主要由肝炎病毒组成的甲型肝炎疫苗组合物。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种包含所述疫苗组合物的试剂盒。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种填充有所述疫苗组合物的预填充注射器。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了所述肝炎病毒在制备甲型肝炎疫苗中的应用。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了包含肝炎病毒作为活性成分的疫苗组合物预防甲型肝炎的应用。

为实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种预防甲型肝炎的方法，包括将有效剂量的包含肝炎病毒作为活性成分的疫苗组合物施用于有需要的对象。

在下文详细描述本发明。

本发明提供了由SEQ ID NO:1定义的甲型肝炎病毒基因。

此外，本发明提供了一种用于制备甲型肝炎病毒的表达盒，其包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因。

本发明提供的SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因与商业甲型病毒株(ATCC VR-1402)的基因相比，包括A2876T和A3891T点突变，具有适合高产和快速传代培养的特点。

特别地，位置3891是其中氨基酸从MET变为LEU的主要突变。本发明的重组核苷酸序列是通过对能够促进传代培养和提高产量的主要位点进行突变而完成的。

根据本发明的一个方面，证实了如图8和11所示与可商购的野生型甲型肝炎病毒相比，根据本发明的由SEQ ID NO:1定义的甲型肝炎病毒基因的生产力更优异。

在相关技术中，为获得甲型肝炎病毒，至少需要进行47次传代培养(图4)，并且存在繁琐、耗时、成本高的缺点(T.Cromeans et al.,J Medical Virology 22:45-56,1987)。通常，一次HAV的传代培养需要约一个月，而根据相关技术从人粪便中获得用于制备疫苗的甲型肝炎病毒需要几十个月。在本发明中，技术特征是使用具有遗传突变的SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因和包含该基因的表达盒将甲型肝炎病毒的生产周期减少至4至5个月。

在本发明中，“表达盒”是指通过包括启动子、编码信号肽的核苷酸序列和编码靶蛋白的基因而能够表达与待分泌和产生的信号肽的下游可操作地连接的靶蛋白的单元盒。能帮助有效产生靶蛋白的各种因子均可以包括在这种表达盒的内部或外部。

在本发明中，“基因”泛指与生物学功能相关的多核苷酸的任何节段。因此，基因或多核苷酸如在基因组序列中一样包括内含子和外显子，或如在cDNA中仅包括编码序列，例如从起始密码子(甲硫氨酸密码子)开始并到终止信号(终止密码子)结束的开放读框。基因或多核苷酸还可以包括调节其表达的位点，例如转录起始位点、翻译位点和转录终止位点。因此，基因或多核苷酸包括启动子和核糖体结合位点(通常，这些调节元件通常位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸处)和转录终止子(通常，终止子位于编码序列或基因终止密码子下游约50个核苷酸内)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA、或编码特定蛋白质并包含调节序列的核酸片段。

对本领域技术人员来说明显的是，本发明提供的表达盒可以包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与病毒的抗原性或免疫原性基本相同的生物学性质，同时与SEQ IDNO:1的甲型肝炎病毒基因的核苷酸序列具有至少80％或更多、优选90％或更多、更优选95％或更多的序列同源性。

根据本发明的一个方面，所述表达盒可包括启动子、锤头(HH)核酶和丁型肝炎病毒(HDV)核酶。

优选地，所述表达盒在甲型肝炎病毒基因的5’端依次包含CMV启动子、T7启动子、多克隆位点(MCS)和HH核酶位点，以及在甲型肝炎病毒基因的3’端方向依次可以包含丁型肝炎病毒核酶、MCS和polyA尾。

根据本发明的一个优选实施方案，CMV/T7启动子可以由SEQ ID NO:2定义，MCS序列可以由SEQ ID NO:3或6定义，HH核酶可以由SEQ ID NO:4定义，HDV核酶可以由SEQ IDNO:5定义，以及polyA尾可以由SEQ ID NO:7定义。在本发明的一个实施方案中，能够被T7RNA聚合酶体外转录的CMV启动子位点和T7启动子位点被插入基因表达的表达盒(SEQ IDNO:2)。MCS排列在所述基因5’端的启动子(SEQ ID NO:3)之后和polyA尾序列(SEQ ID NO:6)之前，以便使用限制酶。所述表达盒被设计成作为具有自切割功能的催化性RNA切割结构，HH核酶(SEQ ID NO:4)和HDV核酶(SEQ ID NO:5)位点位于UTR-HAV多聚蛋白-UTR位点的两侧，其是HAV序列位点，并且可以仅从待靶向的HAV mRNA结构中分离(加工)。

根据本发明的一个优选实施方案，所述表达盒可以包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

此外，本发明提供了包含所述表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体。

在本发明中，“载体”是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的载体，且是指包括必要的调节元件的基因构建体，所述调节元件可操作地连接以表达插入基因。在本发明中，“可操作地连接”是指编码靶蛋白的核酸序列与核酸表达调节序列功能性连接以发挥一般功能。与载体的可操作连接可以使用本发明所属领域熟知的遗传重组技术制备，并且可以使用本发明所属领域熟知的酶容易地进行位点特异性DNA切割和连接。

可用于本发明的合适载体不仅可以包括表达调节元件，例如启动子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、核酶和增强子，还可以包括除了SEQ ID NO:1的甲型肝炎基因之外用于膜靶向或分泌的信号序列。

起始密码子和终止密码子通常被认为是编码免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分，并且在施用所述基因构建体时需要在宿主细胞中发挥作用，并且需要与编码序列符合读框。一般启动子可以是组成型的或诱导型的。所述启动子包括人延伸因子-1α(EF-1α)、猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、巨细胞病毒(CMV)、β-肌动蛋白启动子、T7启动子和T3启动子，但不限于此。

当载体是可复制表达载体时，载体可以包括复制起点，复制起点是从此开始复制的特定核酸序列。作为重组表达载体，可以使用质粒、病毒、粘粒等各种类型的载体。重组载体的类型只要是能发挥在真核细胞的各种宿主细胞中表达希望的基因和产生希望蛋白质的功能，就没有特别限定，但优选能够大量产生具有强活性的启动子和以与天然状态相似但保持强表达能力的形式的外源蛋白的载体。

本领域已知其中可以插入包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎基因的表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的真核表达载体。其非限制性实例包括pUC57载体、pcDNA3.1载体、pVAX1载体(Life Technology,Cergy-Pontoise,France)和pBudCE4.1(Life Technology)，以及可以使用本文公开或提及的或本领域技术人员已知的载体制备本发明的表达载体。优选地，可以使用pUC57载体。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述载体可以示出图2所示的HAV病毒基因的切割图及参与基因表达以产生病毒的因子。

本发明提供一种用于制备疫苗的甲型肝炎病毒的制备方法，包括以下步骤：(a)将宿主细胞用插入有表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体转染，所述表达盒包括SEQ IDNO:1的甲型肝炎病毒基因；(b)从宿主细胞获得病毒；(c)用获得的病毒感染宿主细胞并传代培养被感染的宿主细胞；和(d)从宿主细胞获得病毒。

(a)将宿主细胞用插入有表达盒的载体转染，所述表达盒包括用于制备甲型肝炎病毒的SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因；

“表达盒”和“载体”可以以与上述相同的方式应用。

在本发明中，“宿主细胞”是指已经遗传改变或可以通过施用外源多核苷酸如重组质粒或载体而遗传改变的真核细胞。当提到遗传改变的细胞时，该术语包括最初改变的细胞及其后代。可以将包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因序列的多核苷酸或表达盒插入克隆载体和表达载体中，然后将所述载体注入合适的宿主细胞中进行复制和扩增。

在本发明的步骤(a)中注入载体的宿主细胞的类型没有特别限制，但可以是来源于HAV的天然宿主(例如黑猩猩、猴、人等)的细胞或用于疫苗生产的细胞。“用于疫苗生产的细胞”也可以表述为细胞底物，可以定义为在来源于人或动物的细胞系中具有生产作为制备生物药物或细胞培养药物的原料的药物的能力。

特别地，在本发明中，宿主细胞优选用于生产本领域的生物药物，因为已证明作为用于人疫苗生产的细胞的安全性。关于已证明作为人用疫苗生产细胞的安全性的细胞的详细描述可参考Jordan and Sandig,Viruses,6:1672-1700(2014)；WHO Technical ReportSeries,No.978,Annex 3，这些文件的全部内容可以是本发明的参考内容。

根据本发明的一个方面，用于疫苗生产的细胞可以选自Vero、MA104、WI-38、CHO、MDCK、Hi5、CEF、S9、人胚胎肺成纤维细胞(例如MRC-5等)、PER.C6、BHK-21、CHO-K1及其无血清适应性细胞。优选地，用于疫苗生产的细胞可以选自MA104、Vero或其无血清适应性细胞。更优选地，所述细胞可以是SF-Vero细胞。

根据本发明的一个方面，宿主细胞的培养可以如下进行：MA104和Vero细胞系使用含有2％FBS的EMEM(2％FBS-EMEM)培养基，SF-Vero细胞系更换为2mL无血清EMEM培养基(SF-EMEM)，可在30至40℃(优选在35℃)在3至7％(优选5％)的CO₂温育器中温育2至4周(优选3周)。

当相应的温度范围、二氧化碳浓度范围和温育天数不足或超过时，可能无法生成合适数目的细胞系，也可能无法形成合适的HAV基因构建体转染条件。

本领域技术人员可以通过在血清量减少的培养基中逐步传代培养细胞直至细胞可以在无血清培养基中成功存活和增殖，由此可以容易地实现在无血清培养基中温育的细胞适应性，以便本领域技术人员可以容易地获得每种细胞系的无血清适应细胞系。

在本发明中，可以通过本领域已知的任何方法将载体注入宿主细胞中。插入有包括SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因的表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体可以通过多种合适的方式注入宿主细胞中，包括内吞作用，转染，电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它组分的转染；微粒喷射；脂染；和病毒载体注射(例如逆转录病毒载体)。

(b)从宿主细胞获得病毒；

在步骤(a)后，将用载体转染的宿主细胞在营养培养基中温育以获得甲型肝炎病毒以用作种子，并且根据宿主细胞此时可以适当地选择和使用耐受的培养基和温育条件。在温育期间，可以适当调整温度、培养基的pH、温育时间等条件以适合细胞生长和病毒产生。由此，宿主细胞中产生或分泌的病毒可以从培养基的上清或细胞裂解物中回收，并且可以通过常规的蛋白质和病毒分离技术进行分离和纯化。

然后将在步骤(b)中获得的病毒感染宿主细胞并作为种子用于扩增，在本发明的一个实施方案中，将该病毒命名为0代(P0)病毒。

(c)用获得的病毒感染宿主细胞并传代培养感染的宿主细胞；

在本发明的步骤(c)中，用在步骤(b)中获得的P0病毒感染宿主细胞并重复传代培养以产生可适应宿主细胞并进行高速扩增的病毒。

根据本发明的一个实施方案，当进行感染传代时，宿主细胞MA104和Vero可以以1×10⁵至1×10⁷个细胞/5mL制备，SF-Vero细胞以5×10⁵至5×10⁷个细胞/5m制备。当宿主细胞以低于相应浓度的较低浓度制备时，可能难以获得满意的滴度，而宿主细胞以高于相应浓度的较高浓度制备时，可能不会发生均匀的宿主细胞感染，因此其可能不经济。

根据本发明的一个实施方案，可以将宿主细胞在30至40℃(优选35℃)在3至7％(优选5％)CO₂温育器中温育2至4周(优选3周)。当相应的温度范围、二氧化碳浓度范围和培养天数不足或超过时，可能无法产生合适数目的细胞系，也可能无法形成合适的传代培养条件。

根据本发明的一个实施方案，在P1感染传代期间，M104和VERO细胞以5×105至5×10⁷个细胞/30mL制备，SF-Vero细胞以8×10⁵至8×10⁷个细胞/30mL制备，可在即将感染前从制备的细胞中除去培养基，用30mL DPBS洗涤1至3次。当相应条件不足或超过时，可能无法以最佳产量获得病毒。

根据本发明的一个实施方案，可以将1至10mL感染培养基用于P1至P4感染传代，并且可以将20至50mL感染培养基用于P5至P6感染传代。当相应条件不足或超过时，可能无法以最佳产量获得病毒。

在本发明中，传代是指即使病毒在宿主细胞中感染后，在培养物中病毒增殖的实验确认即细胞病变效应或病毒检测未得到确认，也持续保持病毒感染宿主细胞的传代。

步骤(c)中用病毒感染的宿主细胞优选使用与步骤(a)中用于制备P0病毒的宿主细胞相同的宿主细胞。

根据本发明的一个实施方案，传代培养具体可以按照以下方法进行。将宿主细胞用P0病毒处理和感染，然后温育。培养后，将宿主细胞粉碎并离心以去除细胞碎片，仅获得上清液。使用获得的上清传代1(P1)进行宿主细胞感染。

将感染宿主细胞感染—培养宿主细胞—粉碎宿主细胞—获得上清液的过程在一个循环中重复以进行传代。

在本发明的一个循环的传代过程中，宿主细胞的培养优选进行5天至30天，更优选10天至25天，甚至更优选17天至21天，最优选19天至21天。

在每个传代培养过程中，病毒的增殖是在其中通常温育宿主细胞的培养基组合物中进行的。将宿主细胞在标准商业培养基如补充有血清(例如10％胎牛血清)的培养基或无血清培养基中，在适合维持中性缓冲pH(例如pH在7.0至7.2之间)的CO₂浓度和控制湿度的条件下温育。任选地，培养基可以含有额外的营养物质，例如L-谷氨酰胺、维生素、糖、氨基酸、肽、微量元素、丙酮酸钠、蛋白胨、维生素、糖(例如葡萄糖)和非必需氨基酸，以及额外的促进预期生长性质的补充剂(例如胰蛋白酶、β-巯基乙醇、胰岛素、生长因子、氨基酸复合物等)。

在一些情况中，例如为了制备病毒，优选在无血清条件下生长宿主细胞。所述细胞可以小规模贴壁温育，例如在小于25mL的培养基、培养管或培养瓶中，或在大培养瓶(例如Cell Factory System)中温育，并可在搅拌的大培养瓶、旋转瓶和反应器培养溶液中的微载体(例如Cytodex、GE Healthcare)中温育。微载体珠是小球体(直径范围为50至100μm)，每单位体积细胞培养物可为贴壁细胞生长提供大表面积。例如，在商业病毒生产如疫苗生产的情况下，通常优选在生物反应器或发酵罐中培养细胞。可以使用的生物反应器的体积从1L或更小至超过100L，例如也可以使用NBS生物反应器(New Brunswick Scientific,Edison,N.J.)；Sartorius Stedim Biotech,Gottingen,Germany)或规模-X生物反应器(规模-X一次性生物反应器系统；Univercells Technologies，Belgium)至商业规模的生物反应器。

在本发明中，无论培养体积如何，重要的是将培养溶液的温度保持在35℃或以下以确保甲型肝炎病毒的有效制备。一般而言，优选使用控制器，例如恒温器，或其它装置来感应和维持细胞培养系统的温度，以使病毒复制期间的温度不超过35℃。

在培养中维持细胞的方法已被广泛报道并且在本领域中是已知的。一般方案在本领域中是已知的，并且可以通过常规实验容易地确定细胞培养过程中条件的变化。

另一方面，在本发明中，可以将上述1个循环一代的传代培养重复2至30次，优选2至20次，更优选4至20次，甚至更优选4至15次，最优选4至10次。

(d)从宿主细胞获得病毒

本发明的步骤(d)是重复步骤(c)以获得宿主细胞及其培养基而回收用于疫苗生产的病毒的步骤。

优选地，在步骤(d)中，当在宿主细胞中出现细胞病变效应时可以获得病毒。

在本发明中，细胞病变效应是指在细胞中由甲型肝炎病毒感染引起的所有效应。细胞病变效应包括斑块形成、细胞颗粒化和破碎以及细胞从支持物(例如细胞-病毒培养瓶)上脱离、细胞收缩、细胞聚集、细胞裂解、细胞变圆变性、细胞脱落、凋亡诱导等，但不限于此。细胞病变效应通常也可以通过显微镜或肉眼观察来确认。

同时，在本发明的步骤(d)中，在宿主细胞中出现细胞病变效应后从细胞培养液和细胞获得病毒后，进行额外的传代培养以获得每次传代预期量的病毒，并且也可以通过再次重复传代进行步骤(d)。

在本发明中，病毒量是指通过病毒滴度(具体为甲型肝炎抗原的含量)、斑块的大小或形状、颗粒密度或其它本领域已知方式测量的病毒量。

根据本发明的一个实施方案，在根据上述方法重复传代的宿主细胞中传代3代后开始观察到及在第4代或第5代后观察到细胞病变效应(CPE)，确认释放到培养基中的病毒量和细胞中的病毒量显著增加。此外，确认了即使继续传代，释放到培养基中的病毒量或细胞中的病毒量也没有减少而是保持不变。作为代表性实例，通过透射电子显微镜(TEM)在SF-Vero细胞系中的感染传代第3代中确认了病毒颗粒，以及在图5A至5C中示出了制备的病毒颗粒的电子显微照片。

因此，在本发明中，可以在进行步骤(c)中的传代培养至少两次、优选三次或更多次、更优选四次或更多次之后，进行步骤(d)，但本发明不限于此。即使在宿主细胞中观察到细胞病变效应后，当希望进一步扩增病毒量时，也可以通过重复进行传代培养在获得所需水平的病毒时获得病毒。

本发明的方法可以进一步包括病毒纯化步骤和病毒灭活步骤，以便将步骤(d)之后获得的病毒用作疫苗。

在本发明中，纯化可以通过主要纯化方法或主要纯化步骤进行，例如色谱法或密度梯度超速离心纯化方法。色谱法可包括树脂离子交换色谱、疏水相互作用色谱、混合色谱、膜色谱法等。另外，离子交换色谱法和大小排阻色谱法可以同时进行，离子交换色谱法和多元色谱法可以同时进行。

在本发明中，进行灭活步骤是为了完全去除病毒感染性，通常灭活步骤可以通过化学或物理方式进行。对于化学灭活，可以用含有例如适当浓度的甲醛或β-丙内酯的灭活溶液灭活病毒。如果需要，可以稍后中和残留的灭活材料。用甲醛灭活的材料可以用含有例如亚硫酸钠或亚硫酸氢钠的甲醛中和剂中和，并且可以更换为磷酸盐缓冲液、生理盐水或缓冲液以通过渗滤保持病毒安全性。

在本发明中，纯化和灭活步骤的顺序没有特别限制，可以在纯化后进行灭活步骤，也可以灭活后进行纯化步骤。优选地，可以在灭活后进行纯化步骤。

本发明提供了根据包括步骤(a)至(d)的方法制备的甲型肝炎病毒。

根据本发明的方法制备的甲型肝炎病毒在已经工业化使用的细胞系中的扩增速度非常快，所述细胞系作为疫苗生产细胞系的安全性已经得到包括WHO在内的国家卫生部门的保证或证实或者被批准或授予资格作为生物药物生产细胞底物。此外，即使在宿主细胞中重复进行长期的传代培养后，所述病毒也能稳定扩增，因此所述病毒可以非常有用地用于生产甲型肝炎疫苗。

本发明还提供了包含所述病毒作为活性成分的疫苗组合物。

在本发明中，所述疫苗可以是活疫苗、减毒疫苗或灭活疫苗。

“活疫苗”是指含有活病毒活性成分的疫苗。“减毒”是指通过人为或天然因素削弱活病毒的致病性，通过仅刺激免疫系统来诱导免疫而不引起体内疾病。病毒的减毒可以通过进行病毒颗粒热处理、对病毒紫外光照射、体外高阶连续传代培养、或在如培养瓶等体外培养容器中温育的细胞中进行多次连续病毒传代来实现。还可以通过进行不同的遗传改变来实现减毒，例如，通过特异性缺失已知提供毒性的病毒序列或将在病毒基因组插入序列而进行。“灭活疫苗”也称为灭活的疫苗，是一种含有已去除感染性的病毒的疫苗。其实例包括可通过已知方法容易地制备的全病毒疫苗和裂解病毒疫苗。

除了上述病毒之外，本发明的疫苗组合物还可以进一步包括一种、两种或三种或更多种佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以主要用作递送系统，主要用作免疫调节剂，或兼具两者的强力特性。合适的佐剂包括适用于哺乳动物包括人的那些佐剂。

适合提高本发明疫苗组合物效力的佐剂包括但不限于以下材料：

(1)铝盐(Alum)(如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等)；

(2)水包油乳剂制剂(含或不含其它特异性免疫刺激剂，如胞壁酰肽或细菌细胞壁成分)；

(3)与皂苷佐剂如Quil A或STIMULON^TM QS-21[Antigenics,Framingham,MA](美国专利号5,057,540)一起使用或由其产生的颗粒；

(4)合成多核苷酸；和

(5)细胞因子如白细胞介素、干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等。

在一个具体实施方案中，可以使用基于铝的佐剂。铝盐佐剂可以是铝沉淀疫苗或铝吸附疫苗。铝盐包括水化氧化铝、氧化铝、三水化铝、磷酸铝凝胶、Superfos、amphogel、氢氧化铝(III)、磷酸铝佐剂(APA)、无定形氧化铝等，但不限于此。铝盐形成抗原储库，在2至3周内缓慢释放抗原，以非特异性激活巨噬细胞、补体和先天免疫机制。

在另一个具体实施方案中，本发明公开的疫苗组合物可以包括CpG寡核苷酸作为佐剂。CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，因此除非另有说明，否则这些术语可互换使用。

根据组合物中缀合物的量和化合价适当选择佐剂，但当使用基于铝的佐剂时，可加入铝元素，其包括在所述组合物中的量基于铝元素为0.01mg/mL至1.0mg/mL。优选地，所述组合物中铝元素的含量可为0.1mg/mL至0.6mg/mL，或0.1mg/mL至0.4mg/mL，更优选所述组合物中的铝元素的含量可为0.15mg/mL至0.35mg/mL。

只要本发明的疫苗组合物达到其效果，提供该组合物的制剂没有特别限制。

本发明的疫苗组合物可以配制成液体形式(即溶液或悬浮液)或冻干形式。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物为液体形式，优选为水性液体形式。当作为液体制剂提供时，本发明的疫苗组合物以其中液体制剂被包装在容器(优选注射器)中的形式提供，以直接施用而无需单独的疫苗组合物再现过程如再分散。因此，与需要在水性介质中再悬浮的冻干制剂的组合物不同，液体制剂对于注射和再现某种效果可以是理想的。

本发明的疫苗组合物的配制可以使用本领域已知的各种方法进行。例如，可以通过将甲型肝炎病毒在生理上可接受的运载体中配制来制备组合物。所述运载体的实例包括水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、聚山梨醇酯20和葡萄糖溶液，但不限于此。

本发明提供一种疫苗组合物，其包含本发明公开的甲型肝炎病毒和药学上可接受的赋形剂、载体、等渗剂或稀释剂。所述赋形剂、载体或稀释剂的类型是本领域已知的，可根据下文描述的药物组合物的施用途径使用。

在一个实例中，用于液体制剂的药学上可接受的载体包括水性或非水性溶剂、悬浮液、乳液和油。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇和油酸乙酯。水性溶剂包括水、水溶液、乳液或悬浮液、生理盐水和缓冲溶液。所述药物组合物可以是等渗的、低渗的或高渗的。然而，通过注射施用的药物组合物优选基本上是等渗的。因此，等渗性或高渗性对于组合物的储存可以是有利的。当药物组合物为高渗时，可在施用前将药物组合物稀释至等渗。等渗剂可以是离子等渗剂或非离子等渗剂。离子等渗剂包括氯化钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁等，但不限于此。非离子等渗剂包括山梨糖醇、甘油等，但不限于此。优选地，包括至少一种药学上可接受的缓冲剂。例如，当药物组合物为注射剂时，药物组合物优选包含在pH 5.0至pH 9.0例如pH 6.0至pH 8.0及pH 6.8至pH 7.5具有缓冲能力的缓冲剂。所述缓冲剂可以选自磷酸钾、磷酸一氢钠、谷氨酸盐、碳酸盐、硼酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、甘氨酸、三乙醇胺等组成的缓冲剂。

本发明的疫苗组合物可以另外包括选自缓冲剂、盐、二价阳离子、表面活性剂(特别是非离子去污剂)、冷冻保护剂(例如糖)、抗氧化剂(例如螯合剂)、防腐剂和抗真菌剂中的至少一种。

缓冲剂的类型没有特别限制，只要该缓冲剂在本领域中已知用于药物组合物、特别是疫苗组合物即可，但可以使用组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐或4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸(Hepes)。这些缓冲剂可以以任何化合物的形式使用，例如磷酸盐可以以磷酸钠和磷酸钾的形式使用。

在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含盐。所述盐类型没有特别限制，只要该盐在本领域中已知用于药物组合物、特别是疫苗组合物即可，但可以选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、硼酸盐氯化物及其组合。

在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含表面活性剂。在一个优选的实施方案中，使用非离子去污剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯20(Tween^TM 20)、聚山梨醇酯40(Tween^TM 40)、聚山梨醇酯60(Tween^TM 60)、聚山梨醇酯65(Twin^TM 65)、聚山梨醇酯80(Twin^TM 80)、聚山梨醇酯85(Twin^TM 85)、Triton^TM N-101、Triton^TM X-100、辛苯聚醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15，Solutol H 15)、辛基硫代葡萄糖苷(OTG)、辛基葡萄糖苷(OG)、壬基麦芽糖苷(NM)、月桂基二甲胺氧化物(LDAO)、十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)和泊洛沙姆(poloxamer)。

在本发明中，“每剂量”与“单位剂量”或“一剂”含义相同，在本文可以互换使用。优选地，单位剂量可以指适合作为动物、优选哺乳动物特别是人的单位剂量的单位，并且每个单位含有经本领域技术人员计算对预期疾病产生预防或免疫作用(特别是同时没有严重副作用的风险)的抗原材料。在一个优选的实施方案中，本发明提供的疫苗组合物可以以单位剂量的形式提供。

所述剂量可以使用本领域技术人员根据药物制备领域的技术公知设定的合适量，例如根据其施用方式或施用途径等设定，例如一次注射剂量可以为0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL或1.0mL，但不限于此。

作为直接为使用者提供上述本发明疫苗组合物的更方便的方式，本发明提供了一种填充有上述任何疫苗组合物的容器。

容器的类型没有特别限制，只要该容器在本领域中已知用于提供药物组合物或疫苗组合物即可。在一个实施方案中，所述容器选自预填充注射器、小瓶、注射器、无菌一次性针头、微针贴片、安瓿和计量筒。

取决于施用组，本发明的疫苗组合物的典型单次注射剂可以以0.5mL或1.0mL、更优选0.5mL或1.0mL的体积提供。

因此，可以提供如上定义的容器或注射器，其中本发明的疫苗组合物以单次注射剂的体积填充在其中。在一个实施方案中，所述容器或注射器可以提供为填充有例如0.5mL或1.0mL体积的本发明中定义的任一种疫苗组合物。

本发明还提供了包含上述本发明疫苗组合物的试剂盒。所述试剂盒的具体成分可根据所述组合物的提供形式参考本领域已知形式提供。显然，任何装有上述疫苗组合物的容器都包括在试剂盒中。

在一个实例中，试剂盒可以提供含有或不含有本发明疫苗组合物(液体制剂或冻干制剂)的一个或多个小瓶、含有或不含有本发明疫苗组合物的一个或多个注射器，或包括所有所述小瓶或注射器的试剂盒。

此外，当本发明疫苗组合物以液体制剂提供时，疫苗材料包含在预填充注射器中，此时所述材料成为用于患者施用的材料。可以通过将无菌注射针头连接到预填充注射器的入口将所述疫苗组合物施用于患者。

所述试剂盒还可以包括提供给用户的包装插页。

在本发明中，所述试剂盒可以以单一接种计划的剂量提供所述疫苗组合物，或者可以以多次(拆分)接种计划的剂量提供。

在一个实施方案中，本文公开的疫苗组合物用作药物(药物组合物)。本发明中公开的疫苗组合物可以在各种治疗或预防方法中用作药物组合物，用于预防、治疗或改善受试者的细菌感染、疾病或病症。特别地，本发明公开的疫苗组合物可用于预防、治疗或改善受试者中由甲型肝炎病毒引起的感染、疾病或病症。

此外，本发明提供了一种预防甲型肝炎的疫苗接种方法，其特征在于将有效量的上述本发明疫苗组合物施用于需要其的个体。

在本发明中，“有效量”是指当施用于个体时表现出甲型肝炎病毒死亡或改善、治疗或预防与甲型肝炎病毒相关的感染、疾病或病症的效果的量。

在一个实施方案中，有效量是免疫有效量。免疫有效量是指当通过本领域技术人员已知的标准测定法测量时足以引起细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)免疫应答的抗原或疫苗的量。作为免疫原的抗原例如病毒抗原或抗原特异性抗血清或由其疫苗诱导的中和抗体的水平通过检测由病毒抗原刺激的t细胞分泌的细胞因子测量或可以测量。此外，免疫反应的保护水平可以通过鉴定免疫的个体中抗原衍生病毒感染的减少或由预防感染引起的疾病来测量。

在一个实施方案中，有效量是预防有效量。在本发明中，术语“预防”是指在从未被诊断患有病症或疾病但倾向于患该病症或疾病的个体中抑制所述病症或疾病的发生。因此，如本文所用，术语“预防有效量”是指足以实现所述药理作用的量。

在一个具体实施方案中，本文公开的疫苗组合物可用于预防受试者的甲型肝炎。因此，本发明提供了一种预防甲型肝炎的方法，其特征在于将有效量的上述本发明的疫苗组合物施用于有需要的个体。

在本发明中，术语“个体”可以与“受试者”互换使用，并且可以是动物，优选哺乳动物，特别包括人，例如猫、羊、猪、马、牛或狗等，并且也可以是动物来源的细胞、组织、器官等。所述个体可以是需要所述效果的患者。

在本发明的一个实施方案中，本文公开的免疫抑制的个体是任何人类男性或人类女性。

在本发明的疫苗组合物中，施用途径没有特别限制，只要在体内实现期望的效果即可，但是所述疫苗组合物通过肌肉、腹膜内、皮内、皮下、直肠、全身或粘膜途径施用，以用于保护或治疗易感染甲型肝炎病毒的人。

本发明的疫苗组合物可以单剂或多剂提供。在一些情况下，本发明的疫苗组合物只需要一剂，但在一些情况下，例如在更大的免疫缺陷条件下，也可以提供第二剂、第三剂或第四剂。在最初的疫苗接种之后，可以以适当的时间间隔对受试者进行一次或数次(多次)额外的免疫接种。

本发明还提供了包含所述疫苗组合物的试剂盒。

本发明还提供了一种填充有所述疫苗组合物的预填充注射器。

所述试剂盒和预填充注射器可以包括HAV疫苗组合物和药学上可接受的载体。此外，所述试剂盒和预填充注射器可另外包括以预防HAV感染而应遵守的基本事项(施用期间的注意事项、给药周期、储存温度、有效期等)的说明。

本发明提供了所述病毒用于制备甲型肝炎疫苗的应用。

本发明提供了包含肝炎病毒作为活性成分的疫苗组合物在预防甲型肝炎中的应用。

本发明提供了一种预防甲型肝炎的方法，包括将有效剂量的包含肝炎病毒作为活性成分的所述疫苗组合物施用于有需要的个体。

本文使用的术语“包括”与“包括”或“特征在于”具有相同的含义，并且不排除在根据本发明的组合物或方法中未具体提及的其它成分或方法步骤。除非另有说明，否则术语“由…组成”是指排除另外的元件、步骤或成分等。术语“基本上由…组成”是指在所述组合物或方法的范围内，除了所描述的材料或步骤之外，还包括基本上不影响其基本性质的材料或步骤。

有益效果

根据本发明提供的制备甲型肝炎病毒的方法，可以制备在短时间内稳定扩增的甲型肝炎病毒，作为甲型肝炎疫苗病毒的原料非常有用。

附图说明

图1是示例说明根据本发明的方法生产用于疫苗制备的甲型肝炎病毒(HAV)的方法的图示。通过从用含有HAV基因的载体转染的宿主细胞获得种子病毒、将所述种子病毒感染相同宿主细胞并对其进行传代培养，可以快速稳定地扩增HAV。

图2是示例说明在本发明中用于制备种子病毒的宿主细胞转染的载体的切割图谱的图示。

图3A和3B是示例说明根据本发明方法逐步从MA104细胞和Vero细胞制备HAV的方法(图3A)以及从无血清适应性Vero细胞(SF-Vero)制备HAV的方法(图3B)的示意图。

图4是相关技术中逐步制备HAV的方法的示意图。

图5A至5C是通过透射电子显微镜(TEM)观察根据本发明方法制备的种子病毒感染MA104(图5A)、Vero(图5B)和SF-Vero(图5C)后在第3代(P3)分离的病毒的图。

图6是在第1代(P1)中确认在第5代(P5)中鉴定的病毒含量(滴度)的结果，这是在本发明的图3A和3B的方法期间在P0之后用于病毒拯救的盲传代步骤。在P1至P5的每个传代的细胞裂解物和培养上清液中的病毒滴度被测量为吸光度值。

图7A和7B示例说明了在本发明图3A和3B的方法中分离自p6的细胞裂解物样品中鉴定的病毒含量(滴度)的定量分析结果(图7A)，以及在P6传代培养中制备的种子病毒感染MA104、Vero和SF-Vero细胞后，用免疫荧光测定法(IFA)检测细胞中感染的病毒的结果(图7B)。

图8是在用商购的HAV感染宿主细胞MA104、Vero和SF-Vero(图8A

)或用根据图3A和3B的方法制备的种子病毒感染相同宿主细胞(图8B

)后，连续进行病毒感染传代1至6代后测量病毒含量的图。此外，图8示例说明了通过ELISA测量的在6次传代的每次传代时收获的感染的宿主细胞裂解物和培养上清液中的病毒滴度的吸光度，相对比较宿主细胞A和B中病毒增殖的结果。

图9A和9B是用根据图3B的方法制备的种子病毒感染SF-Vero细胞系和MRC-5细胞系10次后确认上清液和细胞中病毒滴度的结果。

图10示例说明了根据病毒在T培养瓶(175cm²)中温育天数确认病毒滴度(抗原含量)。为了确认在用本发明的种子病毒感染后的病毒生长模式，每3至4天收获感染样品，并从上清液和细胞裂解液中测量和说明病毒滴度。

图11示例说明了通过用商购的HAV感染细胞工厂10(CF10)培养容器中的宿主细胞(图11A)或用根据本发明方法制备的种子病毒感染宿主细胞MA104、Vero或SF-Vero(图11B)来确认第P11代细胞裂解物中病毒滴度的结果。

图12示例说明了用根据本发明的方法制备的HAV的灭活抗原或商业HAV疫苗(Havrix，GSK)接种实验动物之前(第-5天)、以2周的间隔接种两次后(第28天)及接种3次后(第42天)，在动物血液中分析的抗HAV血清滴度的图。SK144和SK72是分别以144EL.U(3.0IU)和72EL.U(1.5IU)施用纯化和灭活后的本发明病毒的组，HVR144和HVR72是以144EL.U和72EL.U施用商品Havrix的组。作为实验的阴性对照，正常组施用生理盐水代替病毒抗原，而铝组仅施用不包括抗原的铝佐剂。

图13是示例说明在根据图12进行实验的过程中，通过观察各动物组的平均体重来观察因接种抗原是否发生不良反应的图。

具体实施方式

在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于示例说明本发明，本发明的内容不限于以下实施例。

实验方法

在图1中总结了本发明中进行的实验方法。

1.基因合成和载体制备

在本发明中，用于基因合成的HAV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。HAV基因包含一个核苷酸序列，其功能顺序是5’非翻译区(UTR)、多聚蛋白基因和3’UTR。CMV启动子-T7启动子(SEQ ID NO:2)、多克隆位点(MCS，SEQ ID NO:3)和锤头(HH)核酶(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列包括在HAV基因的5’-端方向，以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶(SEQ ID NO:5)、MCS(SEQ ID NO:6)和bGH polyA终止子(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列位于3’-端方向。包括所有其它功能区如HAV基因、启动子等由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的核苷酸序列由SEQ ID NO:8定义。

使用KpnI(GGTACC)和SalI(GTCGAC)限制酶将合成的SEQ ID NO:8的甲型肝炎病毒基因克隆到pUC57载体中。完整质粒构建图如图2所示，称为HAV表达载体。

2.使用HAV表达载体转染

MA104(ECACC，85102918)和Vero(WHO)(ECACC，88020401)细胞系在6孔培养板中在分别含有10％和5％FBS的EMEM(Lonza)培养基中在2×10⁵个细胞/孔/2mL条件下制备，无血清Vero细胞(来自Vero(WHO)的无血清适应性细胞，SF-Vero)在无血清EMEM培养基中在4×10⁵个细胞/孔/2mL的条件下制备，并在37℃在5％CO₂温育器中温育。用于细胞制备的培养基成为每个细胞的培养基。

在18至24小时后，从培养板中去除培养基，用2mL DPBS洗涤两次，每孔加入2mL培养基。将1.0μg的HAV表达载体(质粒)、35μL的Lipofectamine LTX-Plus(ThermoFisher)和960μL的Opti-MEM(ThermoFisher)在锥形管中混合并在室温下放置15分钟。将该混合物以200μL加入每个板孔中并在5％CO₂、37℃温育器中温育。24小时后，去除所有细胞的上清液，将MA104和Vero细胞系的培养基更换为含有2％FBS的EMEM(2％FBS-EMEM)，SF-Vero细胞系的培养基更换为2mL无血清EMEM培养基(SF-EMEM)，将所述细胞系在35℃、5％CO₂温育器中温育3周。将温育的MA104、Vero和SF-Vero细胞收获在500μL的EMEM培养基中，悬浮并冷冻/解冻3次。为了去除剩余的破碎细胞碎片，在10,000g离心1分钟后，仅再次收获上清液并设为病毒P0(种子病毒)。

3.盲传代用于病毒拯救

当使用P0病毒进行作为第一次盲传代P1的感染传代时，在感染24小时前，在T25培养瓶中制备1×10⁶个细胞/5mL的MA104和Vero及5×10⁶个细胞/5mL的SF-Vero。在P1至P4感染传代时，在T25培养瓶中，将浓度为7×10⁵个细胞/5mL的MA104和Vero细胞以及1×10⁶个细胞/5mL的SF-Vero细胞在培养基中在37℃和5％CO₂温育。24小时后，从制备的细胞中去除培养基，在即将感染前加入5mL DPBS并洗涤两次。在P5和P6感染传代中，在从P4感染传代前1天，在T175培养瓶中制备5×10⁶个细胞/30mL的MA104和Vero细胞和8×10⁶个细胞/30mL的SF-Vero细胞，并且以相同方式在即将感染前从制备的细胞中除去培养基并用30mL DPBS洗涤两次。

含有2％FBS的EMEM培养基是MA104和Vero细胞系的病毒感染培养基，不含FBS的EMEM培养基用作SF-Vero细胞系的感染培养基。将5mL每种细胞感染培养基用于P1至P4感染传代，将35mL感染培养基用于P5和P6感染传代。在P6传代中，使用五个T175培养瓶进行感染传代。将制备的P0样品加入制备的细胞中，在35℃和5％CO₂放置1小时，然后加入5mL(35mL)感染培养基。

在用P0样品感染后，每7天更换一次培养基至21天，并维持感染的细胞。感染后第21天，收获细胞裂解物并如在P0收获一样进行3次冻融(-70℃/37℃)，然后去除细胞碎片并离心，仅收获上清液并用作病毒培养基，设为第1代(P1)。在从P0到P1的传代期间，每周更换一次培养基，但在从P1到P6的传代期间，仅在感染后第7天更换培养基。以20至21天为1个传代周期，连续进行6次传代。上述细胞感染和传代的过程示于图3A和3B。

在完成一次传代后，从病毒感染的培养瓶中分别收获培养上清液和细胞裂解物。当收获细胞裂解物时，将2mL胰蛋白酶-Versene(Lonza)溶液加入已去除上清液的培养瓶中，洗涤并去除，然后再次加入2mL胰蛋白酶-Versene溶液，在37℃温育器中放置5分钟，并分离细胞。将其中悬浮有细胞的2mL胰蛋白酶-Versene悬浮液转移到锥形管中，并离心以收获细胞沉淀。

将细胞裂解液(沉淀)加入到EMEM 1mL(T25，P1-P4)或5mL(T175，P5)中，冻融3次后离心，然后制备从中去除了细胞碎片的上清液(细胞裂解液样品)。将收获的每次感染传代的培养上清液离心后，将200μL细胞裂解液样品转移到微量离心管中进行病毒滴度分析并冷冻直至分析。除分析外，所有剩余的细胞裂解液样品均用于下一次感染。

通过ELISA定性分析测量P1至P5的滴度，在第6代(P6)时，去除培养上清，收获所有感染的细胞，悬浮于5mL无血清EMEM中，在冻融5次后离心以去除细胞碎片，然后仅收获上清液并作为种子病毒储存。通过ELISA定性分析测量P6病毒的滴度。

4.确认盲传代过程的细胞病变效应

通过显微镜检查根据病毒感染进行宿主细胞的细胞病变效应(CPE)。在MA104和Vero细胞系中，直到P4代才显示出病毒引起的细胞病变效应，但从P5代开始证实由病毒引起的如细胞裂解和细胞脱离等CPE，SF-Vero细胞系在P3代后表现出轻度CPE。

5.HAV抗原分析ELISA

通过定性和定量分析对病毒盲传代期间收获的样品中的HAV抗原进行测定。对于定性分析，进行HAV特异性ELISA以通过吸光度(光密度，450nm)确认抗原，对于定量分析，通过应用标准品(灭活的HAVBRP，1350IU/mL，Y0001192，EDQM)绘制标准曲线并测量样品中的HAV病毒滴度(抗原含量)。使用检测试剂盒HAV-Antigen ELISA试剂盒(Mediagnost，E12)，根据标准品将病毒滴度单位表示为IU/mL。使用的商业甲型肝炎病毒株(ATCCVR-1402)也通过相同方法进行量化。

6.透射电子显微镜(TEM)

如图3A和3B所示，使用在P6传代培养后收获的一部分细胞裂解物观察透射电子显微镜图像。通过使用碳支持膜(formvar-carbon)涂层的EM网格，用2％乙酸双氧铀进行15秒的负染色，并用透射电子显微镜(JEM-1011，JEOL)观察，以及用Camera-Megaview III成像设备鉴定病毒颗粒。

7.免疫荧光测定(IFA)

将5×10³个细胞/孔/0.5mL条件下的MA104和Vero细胞以及8×10³个细胞/孔/0.5mL浓度的SF-Vero细胞在24孔培养板中的每种培养基中悬浮并制备，并在37℃和5％CO₂条件下温育24小时。从温育的细胞中除去培养基并通过加入300μL/孔的DPBS进行洗涤。将如图3所示制备的种子病毒用每个细胞的感染培养基稀释，在细胞中以0.1IU/孔的浓度处理，并在每孔中加入0.5mL感染培养基，在35℃和5％CO₂温育器中温育。从感染之日起第7天，将细胞上清完全去除并用0.5mL DPB洗涤两次。去除细胞中残留的所有DPBS，加入0.2mL3.7％的甲醛溶液，然后在室温下放置30分钟。以与上述相同的方式去除甲醛溶液并用DPBS洗涤3次。以250μL/孔加入0.2％Triton X-100缓冲溶液，在室温放置5分钟，然后用0.5mLDPBS洗涤3次。将一抗(抗-HAV表面Ag，Raybiotech)在PBS中稀释至1/500，以250μL/孔加入，在室温反应1小时。此后，将二抗(山羊抗小鼠IgG Alexa488，ThermoFisher)稀释至1/4000，并以与一抗处理剂量相同的剂量加入细胞中，在室温放置1小时，然后用DPBS洗涤5次并除去。将DPBS以250μL/孔加入细胞中，并用荧光显微镜(放大倍率100×，Eclipse Ts2-FL，Nikon)对细胞进行拍照。

8.种子病毒感染确认(感染测试)

将如图3A和3B所示制备的种子病毒与商业甲型肝炎病毒株(ATCC VR-1402)的感染模式进行相互比较。为此，将商业病毒株的病毒滴度(含量)通过本专利中描述的ELISA进行量化。在病毒感染24小时之前，将MA104和Vero细胞系在T75培养瓶中在12mL培养基中以2×10⁶个细胞制备，SF-Vero细胞系在12mL培养基中以3.5×10⁶个细胞制备。将种子病毒和商业病毒株以2.0IU悬浮在1mL感染培养基中，用10mL的DPBS洗涤并加入T75培养瓶中制备的每种细胞中。在35℃、5％CO₂温育器中反应1小时后，加入11mL感染培养基并温育。将细胞培养21天，在感染后第7天用新鲜的感染培养基更换培养基。将21天温育的1个病毒感染传代共进行10次，样品收获和进行病毒含量分析的连续感染传代与盲传代相同，当收获细胞裂解液样品时，将细胞最后悬浮在5mL无血清EMEM中，用作下一次感染传代的样本。

此外，将MRC-5(ECACC，05011802)细胞系在T75培养瓶中制备，总数为8×10⁶个细胞/12mL，SF-Vero制备为细胞浓度为3.5×10⁶个细胞/12mL，并将如图3B所示制备的种子病毒在与上述T75培养瓶感染相同的条件下共进行了6次连续感染传代。测量并比较在每个病毒感染传代收获的一些上清液和一些细胞裂解物样品中的病毒滴度(含量)。使用MRC-5细胞系的培养基含有在EMEM培养基中的10％FBS和2％浓度的感染培养基。病毒感染后上清和细胞的收获方法与重复冻融的方法相同，具体方法与进行盲传代的方法中所述相同。

9.种子病毒的生长确认测试

在感染前一天，将SF-Vero细胞以2×10⁷个细胞/35mL接种在T175培养瓶中并在37℃和5％CO₂条件下温育。制备共9个相同细胞密度的T175培养瓶，其中8个培养瓶感染病毒，其余作为正常细胞对照。在感染当天从所有培养瓶中除去培养基后，在每个培养瓶中，用30mL的DPBS洗涤细胞。制备在35mL培养基中含有15IU的SF-Vero衍生的种子病毒的病毒感染溶液并将其加入洗涤过的T175培养瓶中。在共8个培养瓶中相等感染15IU的SF-Vero衍生种子病毒。当将感染的细胞在35℃和5％CO₂温育器中温育时，在感染后第3、7、10、14、17、21、24和28天(dpi)分别收获上清液和细胞裂解物，测量病毒滴度(含量)。

10.种子病毒细胞工厂的温育

在T175培养瓶中以相同方式进行每种细胞衍生的种子病毒的附加感染传代，然后进行到第11代(MA104，Vero)和第12代(SF-Vero)以增加病毒的细胞适应性和收获相应过程中感染的细胞。在附加感染传代的方法中，将从P6收获的第一种子病毒在T175培养瓶中感染并温育两次以获得P8代的病毒，当感染P9时，将从P8获得的病毒样品以浓度15IU/T175定量感染。类似地，将病毒通过重复感染-收获传代至P11和P12。对种子病毒的P11(MA104，Vero)和P12(SF-Vero)传代病毒进行量化并将对应于500IU的病毒分配到单独的冷冻管中。使用图6所示在6次传代后获得的商品病毒样品，以与附加感染传代相同的方式将商业病毒感染传代至P11(MA104，Vero)和P12(SF-Vero)以获得病毒。在附加感染传代中，不收集上清液，仅收获感染的细胞，用Sonifier将细胞粉碎40秒，离心，然后仅收集上清液并使用。种子病毒和商业病毒分别以等量500IU用于CF10(6320cm2，ThermoFisher)的宿主细胞感染。CF10中的感染方法如下。将MA104、Vero、SF-Vero细胞在2.0×10⁸个细胞/1.5L的培养基中制备。16至18小时后，去除培养基，将细胞用500mL的DPBS洗涤一次并去除。通过在200mL的EMEM培养基中加入500IU制备的病毒制备病毒感染溶液，并将其加入到洗涤的CF10中。将所述病毒感染溶液在35℃和5％CO₂温育60分钟，每15分钟倾斜培养瓶以使病毒稀释液均匀吸附到细胞上。病毒吸附后，每种细胞加入1.5L感染培养基(MA104，Vero：2％FBS-EMEM；SF-Vero：SF-EMEM)，在35℃和5％CO₂条件下温育21天。在病毒温育的第7天，用新鲜的感染培养基更换培养基。

感染后，在CF10中病毒感染的培养物的收获过程如下。感染后，从CF10容器中除去上清液。将CF10用500mL的DPBS洗涤并除去，加入200mL的TrypLE Express(ThermoFisher)并在37℃温育器中反应3至5分钟。加入200mL无血清EMEM，将约400mL感染细胞悬浮液收获在2L方瓶中。将收获的悬浮液以5000g离心10分钟，去除上清液，仅回收细胞沉淀。将100mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)加入细胞沉淀中，悬浮，然后用Sonifier(SFX550，Branson)超声处理(波幅40％，2分钟)以进行细胞裂解。将约100mL细胞裂解物离心(5000g，AllegraX-15R，SX4750A)，将上清液转移至新的无菌1L方瓶中。离心后，将100mL上清液的约100μL储存，用于ELSIA分析。加入400mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)并用于纯化过程。将衍生自MA104和Vero的细胞裂解物单独贮存，并将在SF-Vero中温育的病毒感染细胞的裂解物用于抗原纯化以进行动物实验施用。

11.病毒纯化和灭活

使用囊式过滤器(Sartopure PP3，5μm，Sartorius Stedim)和深层过滤器(Supra50，050PDH4，PALL)依次纯化回收的细胞裂解物。使用100kDa超滤/渗滤(UF/DF)过滤器(

2Mini，P2B100A01，Merck，Millipore)将纯化的收获物用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)进行缓冲液交换，过滤并浓缩10倍，然后用benzonase(1单位)处理。用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)平衡的DEAE

Fast Flow(GEHealthcare)柱以10mL/min的速率进行离子交换色谱(IEC)。收集约200mL级分，使用10kDa UF/DF过滤器(

2Mini，P2B010A01，Merck Millipore)用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)进行缓冲液交换，并浓缩5倍。使用HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR(GEHealthcare)以1mL/min的速率对浓缩物进行大小排阻色谱(SEC)。

进行SEC后，收集约40mL抗原级分并使用10kDa过滤器(

2Mini，P2B010A01，Merck Millipore)浓缩80倍以获得纯化的HAV抗原。将甲醛以270至370μg/mL的浓度加入获得的抗原中用于病毒灭活并在37℃反应5天。此后，将抗原用10kDa过滤器渗滤并用0.22μm过滤器(

Gold)灭菌过滤。在动物实验中每次施用之前24小时，将氢氧化铝悬浮于吸附缓冲液(pH 7.1-8.0)中，与抗原混合，在4℃搅拌16小时或更久。

12.动物实验

将铝吸附的抗原施用于小鼠(BALB/c，4周龄，每组10名受试者)。作为动物实验的对照，使用商业HAV疫苗(Havrix，GSK)，施用于小鼠的抗原(3.0IU和1.5IU)和对照剂量(144EL.U和72EL.U，ELISA单位)设置为商业疫苗人体(成人和婴儿)剂量的1/10。在通过解离与对照(商业疫苗)结合的铝盐仅分离抗原后，通过测量和比较本发明的抗原及其量，将施用的抗原的剂量设定调整到相同水平。在动物实验中，通过肌肉注射(IM)以2周的间隔施用抗原3次。施用后，从小鼠全血中分离血清以测定抗总HAV抗体滴度。将97/646(NIBSC，International Standard for Anti-Hepatitis A,Immunoglobulin)设定为标准对照材料，在测量期间使用抗HAV ELISA(E10，Mediagnost)或抗甲型肝炎病毒IgG ELISA(4660，ALPHA Diagnostic International)。

实验结果

在本发明中，设计基因表达盒以表达HAV基因，并合成相应的盒以获得盒表达载体。将基于合成的HAV表达载体转染MA104、Vero、SF-Vero三种细胞系，裂解基因转染细胞(转染体)以感染相同细胞，进行盲传代或病毒感染传代直至确认病毒颗粒以分离病毒。由此，确认预定量的病毒制备作为可用于未来疫苗生产和研究的种子病毒。所述种子病毒通过仅6次传代培养而制备，并确认了在制备后通过进行支原体和无菌试验确认种子病毒是以无菌状态制备的。

在现有商业疫苗的情况下，为制备用于疫苗生产的病毒(主种子批)，通过在MRC-5中传代培养对病毒进行了多次细胞培养适应过程以确立病毒，这需要原代AGMK培养物和血清。通过所述方法制备的种子病毒中，由无血清疫苗生产细胞系(SF-Vero)制备的种子病毒(926IU/mL)是来源于疫苗用细胞系的病毒，具有商业疫苗开发的高适用性。在对相应的种子病毒进行扩增、纯化、灭活以去除感染性，吸附于佐剂及随后施用于小鼠之后，证实本专利施用的抗原的抗血清滴度与商业疫苗相似。

使用上述载体和用于病毒生产的HAV表达盒的生产病毒的方法分别在图1和2中示意性地说明和描述。在图1中，列出了在MA104和Vero细胞系中以及在SF-Vero细胞系中进行的两种温育过程，转染和盲传代的过程连同所需的时间在图3A和3B中示例说明。在从P1到P5的感染传代之后，如图6所示，确认了在每个传代收获和测量的上清液和细胞裂解物中的病毒滴度(含量)。即使在转染后多次传代后，通过ELISA检测也确认了病毒，证实病毒在上清液和细胞裂解液样品中稳定扩增。确认在细胞裂解液中病毒的相对检测量高于在上清液中，这可能反映了非裂解HAV特性。在下一次的P6传代培养之后，立即通过电子显微镜从细胞裂解物确认病毒颗粒(图5A至5C)，病毒含量被量化并确认为2371IU/mL(MA104)、586IU/mL(Vero)和926IU/mL(SF-Vero)(图7A)。参考MA104细胞系用于对在胃肠道中增殖的肠道病毒如甲型肝炎病毒的感染研究的事实(JH Lee et al.,2013)，将用于研究的种子病毒从细胞系中扩增并用于保全(securing)。Vero和SF-Vero细胞系具有相同起源，但其病毒培养条件随着血清存在或不存在的条件而变化。特别地，SF-Vero细胞被一起选择以证实本发明的病毒即使在无血清条件下也可以顺利扩增。作为种子病毒的含量，确认了在无血清培养条件下温育和分离的SF-Vero来源的种子病毒与Vero细胞来源的种子病毒相比含量相对较高。将制备的种子病毒以0.1IU/孔的含量在24孔板中感染，在第7天通过免疫荧光确认病毒的感染性(图7B)。

将图7A所示三种类型的制备的种子病毒和商业病毒(ATCC原种，227IU/mL)如实验方法8中确认种子病毒感染的方法所述用2.0IU感染，并比较当本发明的种子病毒和商业病毒感染相同细胞系时的扩增程度。从共进行6次连续感染传代的感染培养物的上清液和细胞裂解物中检测病毒，并且与商业病毒株(图8A)相比，证实了本发明的种子病毒(图8B)具有稳定的且相对高的病毒滴度(图8)。

此外，将已用作现有甲型肝炎疫苗的生产细胞并在温育过程中需要血清的MRC-5细胞系和本发明中用于病毒生产和感染的无血清培养的疫苗生产细胞SF-Vero细胞系设为感染细胞，并通过感染2.0IU的在图3B的SF-Vero中制备的种子病毒进行比较。在共10次传代期间，通过ELISA分析上清液和细胞裂解物，并用吸光度值相对比较病毒滴度(含量)。结果，SF-Vero细胞中的病毒生产具有从感染后的第一代开始检测到病毒的模式，并且从第二代开始，在ELISA反应中始终检测到在细胞裂解物中测量的病毒滴度(图9A)。在MRC-5传代中，有一个传代中在收获的细胞裂解物样品测量的病毒检测水平相似，但未显示病毒滴度的恒定增加模式。特别地，所述上清液中检测的病毒较低，与在SF-Vero中用于疫苗生产的感染传代结果相反(图9B)。由此证实，通过本发明方法制备的种子病毒在SF-Vero细胞中顺利扩增，并且根据在感染传代后的培养物，病毒的细胞适应性在SF-Vero细胞系中高于在MRC-5细胞中。测量的吸光度结果值与图表一起报告(图9A和9B)。

在进行CF10培养以获得用于动物实验的病毒之前，将在本发明中制备的SF-Vero来源的种子病毒在T175培养瓶中进行感染，并以3至4天的间隔确认病毒滴度(含量)随着天数的改变(图10)。优先进行这个操作，以确认本发明的病毒的培养时间，同时设定感染的细胞的每培养单位面积的病毒含量。作为病毒感染后的测定结果，从感染后第10天开始，细胞内的病毒量增加，如图(图6、7A和7B、8和9)所示，确认了在细胞中扩增的病毒与上清液相比具有高滴度。特别是在感染后第20至21天左右确认了最大病毒含量。确认病毒扩增(3537IU，21dpi)比初始感染量(15IU)高大约230倍(图10)。

参考图11，作为通过在CF10中温育具有相同条件的相同感染传代数的种子病毒和商品病毒获得的病毒滴度的测量结果，根据本发明的方法制备并传代的病毒滴度B显著高于通过以相同方式温育根据需要长时间的一般方法A获得的商业病毒而获得的病毒滴度A。显著水平是指在相同病毒培养面积和相同培养方法的前提下，根据本发明方法的滴度B的含量与滴度A相比增加了150％(MA104，1.53倍)、470％(Vero，4.70倍)和251％(SF-Vero，2.51倍)。当在相同条件下进行传代培养时，本发明方法的病毒滴度高于常规方法的事实意味着通过本发明的方法可以更快且更稳定地制备HAV病毒。推测细胞系间病毒滴度的差异是由于细胞对甲型肝炎病毒感染的易感性不同，但应通过本发明的种子病毒的特征性研究稍后予以证实。重要的是，在本发明中，有意义的是开发新的病毒株并将其应用于疫苗生产株，并且从现有的基于MRC-5的甲型肝炎疫苗的商业生产中证实了其培养潜力。

同时，图12示出在将本发明制备的种子病毒温育、纯化和灭活，然后间隔2周将种子病毒施用于小鼠实验动物3次之后，施用分离自收集的小鼠全血的血清产生的针对灭活抗原的抗体。图13是示出动物实验期间各组动物体重平均值的图。SK144和SK72是在纯化和灭活后分别以3IU(144EL.U)和1.5IU(72EL.U)施用本发明病毒的组，而HVR144和HVR72是以144EL.U和72EL.U施用商业产品Havrix的组。

参考图12，第-5天是指第一次施用前5天的小鼠血清，第28天是指第二次施用后第14天的血清，第42天是指第三次施用后第14天的血清。每个注射组的条形图表示每天收获的小鼠血清中存在的抗HAV抗体(总IgG抗HAV血清)的浓度。血清浓度通过在实验方法中12.动物实验中描述的抗体滴定分析方法测量。

各施用组施用前的第-5天血清中，各组均未观察到抗HAV血清滴度升高。在第28天的血清分析中，确认SK144组(平均抗体5.742mIU/mL)和HVR144组(平均抗体5.783mIU/mL)之间的抗体滴度(p>0.9999)与SK72组(4.377mIU/mL)和HVR72组(4.875mIU/mL)抗体滴度(p＝0.3895)相似。在第42天的血清分析中，确认SK144组(平均抗体6.002mIU/mL)和HVR144组(平均抗体6.223mIU/mL)之间的抗体滴度(p＝0.8825)与SK72组(5.432mIU/mL)和HVR72组(5.446mIU/mL)的抗体滴度(p>0.9999)相似。

图12示出根据本发明的方法制备的HAV抗原与商业化甲型肝炎疫苗(Havrix)相比在免疫学功效上没有有效差异。作为参考，由于不能给小鼠施用人用剂量，因此使用1/10人用剂量并根据商业化甲型肝炎疫苗的成人剂量1440EL.U/注射剂量和儿童剂量720EL.U/注射剂量计算所述剂量。

参考图13，从动物实验的开始日期到结束日期，未观察到原因不明的不良反应、小鼠应激以及可能影响免疫原性测定的施用抗原后的即刻不良反应和体重减轻。此外，即使在目视观察中，也未确认有通过施用本发明的纯化的灭活抗原和对照材料的不良反应。

工业实用性

根据本发明提供的制备甲型肝炎病毒的方法，可以在短时间内制备稳定扩增的甲型肝炎病毒，对制备甲型肝炎疫苗非常有用。此外，所述方法可作为甲肝疫苗技术开发的源头技术，这是在韩国国内尚未开发的技术。