MX2010010034A - Vacunas de flavivirus defectuosas en replicacion y vectores de vacunas. - Google Patents

Vacunas de flavivirus defectuosas en replicacion y vectores de vacunas.

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Harold Kleanthous
Konstantin V Pugachev
Alexander A Rumyantsev
Maryann Giel-Moloney
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Sanofi Pasteur Biologics Co
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Abstract

La invención proporciona vacunas de flavivirus defectuosas de replicación y vectores de vacunas, y composiciones y métodos correspondientes.

Description

VACUNAS DE FLAVIVIRUS DEFECTUOSAS EN REPLICACION Y VECTORES DE VACUNAS Campo de la Invención Esta invención se refiere a vacunas de flavivirus defectuosas en replicación y vectores de vacunas, y composiciones y métodos correspondientes.
Antecedentes de la Invención Los flavivirus están distribuidos mundialmente y representan un problema de salud pública global . Los flavivirus también tienen un impacto significativo como patógenos veterinarios. Los patógenos de flavivirus incluyen virus de la fiebre amarilla (YF) , del dengue tipos 1-4 (DEN1-4) , de encefalitis japonesa (JE) , del Nilo Occidental ( ) , de encefalitis transmitida por garrapata (TBE) , y otros del serocomplejo TBE, tales como virus de enfermedad de Kyasanur Forest (KFD) y fiebre hemorrágica de Omsk (OHF) . Vacunas contra YF [cepa 17D de vacuna atenuada viva (LAV) ] , JE [vacunas desactivadas (INV) y LAV] , y TBE (INV) están disponibles. Ninguna vacuna humana licenciada está actualmente disponible contra DEN y WN. Vacunas veterinarias han estado en uso incluyendo, por ejemplo, vacunas contra WN en caballos (INV, vacunas quiméricas recombinantes y vivas) , JE (INV y LAV) para prevenir encefalitis en caballos y parto de fetos muertos en cerdos en Asia, flavivirus de encefalomielitis ovina (I V) para prevenir enfermedad neurológica en ovejas en el Reino Unido, y TBE (INV) usado en animales de granja en la República Checa (INV) (Monath y Heinz, Flaviviruses , en Fields et al., eds . , Fields Virology, 3ra. edición, Filadelfia, Nueva York, Lippincott-Raven Publishers, 1996, pp. 961-1034) .
Encefalitis transmitida por garrapata (TBE) es la enfermedad viral transmitida por garrapatas mas importante en los humanos. Es endémica en partes de Europa y el Norte de Asia, ocasionando mas de 10,000 hospitalizaciones anualmente, con una tasa de fatalidad de casos de 0.5-1.5% en Europa y 6-40% en Siberia y el Lejano Oriente. Una proporción significativa de pacientes sufren de secuelas neuro-psiquiátricas de larga duración. Vacunas desactivadas producidas en cultivos celulares de embriones de pollos han probado efectivas para prevenir la enfermedad. Por ejemplo, una cobertura de vacunación de 86% de la población austríaca (la mas alta entre los países europeos) ha resultado en aproximadamente 90% de reducción de casos hospitalizados (Heinz y Kunz, Arch. Virol . Suppl . 18:201-205, 2004). Las vacunas desactivadas son costosas y requieren tres inoculaciones para inmunización primaria. Potenciadores periódicos (cada 2-5 años) se requieren para mantener inmunidad. Por lo tanto, una vacuna de TBE menos costosa, la cual es efectiva después de una-dos dosis y proporciona inmunidad duradera, tal como de por vida, (similar a aquella lograda por inmunización de YF 17D) se necesita, y de hecho ha sido identificada por la OMS como una prioridad principal. El desarrollo de candidatos de LAV de TBE en las varias décadas pasadas por medio de atenuación empírica o racional de virus padre de TBE per se o quimerización de virus TBE o Langat (LGT, un flavivirus atenuado naturalmente que está relacionado de manera cercana ( serológicamente) a TBE) con virus del dengue 4 ha encontrado dificultadas debido a problemas con virulencia residual de candidatos y/o baja inmunogenicidad/sobre-atenuación (Wright et al., Vaccine 26:882-890, 2008; Maximova et al. J. Virol. 82:5255-5268, 2008; Rumyantsev et al., Vaccine 24:133-143, 2006; Kofler et al., Arch. Virol. Suppl . 18:191-200, 2004; y referencias en las mismas) .
Los flavivirus son virus de AR de cadena positiva, envueltos, pequeños, transmitidos principalmente por vectores de artrópodos (mosquitos o garrapatas) a hospederos naturales, los cuales son principalmente animales vertebrados, tales como varios mamíferos, incluyendo humanos, y aves. La molécula de ARN genómico de flavivirus es de alrededor de 11,000 nucleótidos (nt) de longitud y abarca un cuadro de lectura abierto (ORF) grande flanqueado por regiones terminales no traducidas (UTRs) 5' y 3' de alrededor de 120 y 500 nucleótidos de longitud, respectivamente. El ORF codifica un precursor de poli-proteína que es separado co- y post-traduccionalmente para generar proteínas virales individuales. Las proteínas son codificadas en el orden: C-pr /M-E-NS1-NS2A/2B-NS3 -NS4A/4B-NS5 , donde C (núcleo/cápsida) , prM/M (pre-membrana/membrana) , y E (envoltura) son las proteínas estructurales ( es decir, los componentes de partículas virales, y las proteínas NS son proteínas no estructurales, las cuales están involucradas en replicación intracelular de virus. Replicación de flavivirus ocurre en el citoplasma. Ante infección de células y traducción de ARN genómico, procesamiento de la poli-proteína comienza con translocación de la porción prM de la poli-proteína hacia el lumen de retículo endoplásmico (ER) de células infectadas, seguido por translocación de porciones E y NS1, según se dirige por las señales hidrófobas para las proteínas prM, E, y NS1. Terminales amino de proteínas prM, E, y NS1 son generadas por separación con señalasa celular, la cual se localiza en el lado luminal de la membrana ER, y las proteínas individuales resultantes permanecen ancladas a la terminal carboxi en la membrana. La mayoría de las separaciones restantes, en la región no estructural, se llevan a cabo por la serina proteasa NS2B/NS3 viral. La proteasa viral también es responsable por generar la terminal C de la proteína C madura encontrada en viriones de progenie. Moléculas de ARN genómico recién sintetizadas y la proteína C forman una nucleocápsida esférica densa, la cual se vuelve rodeada por la membrana celular en la cual se incrustan las proteínas E y prM. La proteína M madura se produce por separación de prM poco antes de liberación de virus por furina celular o una proteasa similar. E, la proteína principal de la envoltura, es el objetivo principal para neutralizar anticuerpos, la correlación principal de inmunidad contra infección de flavivirus. Respuesta de linfocitos T (CTL) citotóxicos específicos de virus es el otro atributo clave de inmunidad. Epítopes CTL CD8+ y CD4+ múltiples han sido caracterizados en varias proteínas estructurales y no estructurales de flavivirus. Además, respuestas inmunológicas innatas contribuyen a tanto limpieza de virus y a regular el desarrollo de respuestas inmunológicas adaptativas y memoria inmunológica .
Además de las vacunas desactivadas (INV) y atenuadas vivas (LAV) contra flavivirus discutidas anteriormente, otras plataformas de vacuna han sido desarrolladas. Un ejemplo se basa en flavivirus quiméricos que incluyen cápsida de virus de la fiebre amarilla y secuencias no estructurales y proteínas prM-E de otros flavivirus, a los cuales se busca inmunidad. Esta tecnología ha sido usada para desarrollar candidatos de vacuna contra virus del dengue (DEN) , encefalitis japonesa (JE) , del Nilo Occidental (WN) , y encefalitis de San Luis (SLE) (ver, v.gr., las patentes US 6,962,708 y 6,696,281). Flavivirus quiméricos a base de virus de la fiebre amarilla han producido resultados altamente prometedores en pruebas clínicas.
Otra plataforma de vacuna de flavivirus se basa en el uso de tecnología de virus pseudo-infecciosos (PIV) (Masón et al., Virology 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol . 21:11737-11748, 2007; idman et al., Adv . Virus. Res. 72:77-126, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine 26:2772- 2781, 2008; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008). PIVs son virus defectuosos de replicación atenuados por una supresión. A diferencia de vacunas vivas de flavivirus, sufren una sola ronda de replicación in vivo (u opcionalmente rondas limitadas, para construcciones de dos componentes; ver mas adelante), lo cual proporciona beneficios con respecto a seguridad. PIVs también no inducen viremia e infección sistémica. Además, a diferencia de vacunas desactivadas, PIVs imitan infección de virus completa, lo cual puede resultar en eficacia incrementada debida a la inducción de respuestas robustas de células B y T, mayor durabilidad de inmunidad, y requerimientos de dosis disminuidos. Similar a virus enteros, vacunas de PIV apuntan a células que presentan antígeno, tales como células dendríticas, estimulan receptores similares a Toll (TLRs) , e inducen inmunidad Thl/Th2 balanceada. Además, construcciones de PIV han sido mostradas creciendo en altos títulos en células de sustrato, con poco o sin efecto citopático (CPE) , permitiendo para manufactura de alto rendimiento, opcionalmente empleando múltiples cosechas y/o expansión de células de sustrato infectadas.
Los principios de la tecnología de PIV se ilustran en las figuras 1 y 2. Hay dos variaciones de la tecnología. En la primera variación, un virus pseudo- infeccioso de un solo componente (s-PIV) se construye con una gran supresión en la proteína de cápsida (C) , haciendo al virus mutante incapaz de formar partículas virales infecciosas en células normales (figura 1) . La supresión no remueve los primeros -20 codones de la proteína C, los cuales contienen una secuencia de ciclización de ARN, y un número similar de codones en el extremo de C, los cuales codifican un sitio de separación de proteasa viral y el péptido de señal para prM. El s-PIV puede propagarse, v.gr., durante la manufactura, en cultivos celulares de sustrato (ayudantes) en los cuales la proteína C es provista en trans, v.gr., en células transíectadas de manera estable produciendo la proteína C (o un cartucho ayudante mas grande incluyendo proteína C) , o en células conteniendo un replicón de alfavirus [v.gr., un replicón de virus de encefalitis equina venezolana (VEE) ] expresando la proteína C u otro vector de expresión intracelular expresando la proteína C. Después de inoculación in vivo, v.gr., después de inmunización, el PIV sufre una sola ronda de replica-ción en células infectadas en ausencia de trans-complementariedad de la supresión, sin esparcimiento a células circundantes. Las células infectadas producen partículas similares a virus (VLPs) vacias, las cuales son producto de los genes prM-E en el PIV, resultando en la inducción de respuesta neutralizante de anticuerpo. Una respuesta de células T también deberá inducirse mediante presentación de MHC1 de epítopes virales. Este enfoque ha sido aplicado al virus YF 17D y virus N y virus quiméricos WN/JE y WN/DEN2 (Masón et al., Virology 351 :432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol . 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, .
En la segunda variación, un PIV de dos componentes (d-PIV) se construye (figura 2) . Células de sustrato son transfecta-das con dos ARNs virales defectuosos, uno con una supresión en el gen C y otro careciendo los genes de proteina de envoltura prM-E.
Los dos genomas defectuosos se complementan entre sí, resultando en acumulación de dos tipos de PIVs en el medio de cultivo celular (Shustov et al., J. Virol . 21:11737-11748, 2007; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008). Opcionalmente , los dos PIVs pueden manufacturarse por separado en líneas celulares ayudantes apropiadas y después mezclarse en una formulación de dos componentes. Esto último puede ofrecer una ventaja para ajusfar concentraciones relativas de los dos componentes, incrementando inmunogenicidad y eficacia. Este tipo de vacuna de PIV deberá ser capaz de sufrir un esparcimiento limitado in vivo debido a la co- infección de algunas células en el sitio de inoculación con ambos componentes. Se espera que el esparcimiento sea auto- limitante pues hay mas células en tejidos que partículas virales producidas por células inicialmente co- infectadas . Además, un MOI relativamente alto es necesario para co- infección eficiente, y no se espera que células por fuera del sitio de inoculación sean co-infectadas eficientemente (v.gr., al drenar nodos linfáticos) . Células infectadas con el PIV AC solo producen los VLPs altamente inmunógenos . Células co-infectadas producen los dos tipos de partículas virales defectuosas empacadas, las ? cuales también estimulan anticuerpos neutralizantes. Se espera que la infección limitada resulte en una respuesta mas fuerte de anticuerpos neutralizantes y la respuesta de células T comparados con s-PIVs. Para disminuir las probabilidades de recombinación durante la manufactura in vivo, incluyendo con flavivirus circulantes, secuencias virales pueden modificarse en tanto s-PIVs y d-PIVs usando, v.gr., reemplazos de codones sinónimos, para reducir homologías de secuencia de nucleótidos, y mutar los elementos 5' y 3' de ciclización complementaria.
Compendio de la Invención La invención proporciona flavivirus pseudo- infecciosos deficientes de replicacion o defectuosos que incluyen un genoma de flavivirus que incluye (i) una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótido que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (pr ) , envoltura (E) , proteína I no estructural (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5), y (ii) secuencias que codifican uno o mas inmunógenos heterólogos relacionados con patógeno, cáncer, o alergia. Por ejemplo, la supresión/mutación puede ser con secuencias de cápsida (C) ; secuencias de pre-membrana (prM) y/o envoltura (E) ; secuencias de cápsida (C) , pre-membrana (prM) , y envoltura (E) ; o secuencias de proteína no estructural 1 (NS1) .
El inmunógeno heterólogo puede ser, por ejemplo, a partir de un patógeno seleccionado a partir del grupo que consiste de un virus de la rabia (v.gr., un epítope de proteína G de virus de la rabia), Borrelia burgdorferi (v.gr., inmunógeno OspA o un fragmento inmunógeno del mismo) , una garrapata (v.gr., una proteína de saliva de garrapata seleccionada a partir del grupo que consiste en 64 TP , Isac, y Salp20, o un fragmento inmunógeno del mismo), un virus de la influenza (v.gr., un virus de la influenza M2, hemaglutinina (HA) , o epítope de neuraminida-sa (NA) , o un fragmento inmunógeno del mismo) , un virus de inmunodeficiencia humana (v.gr., una proteína gag, tat/nef, o gpl20 de VIH optimizada por codón, o un fragmento inmunógeno de la misma) , un virus de inmunodeficiencia simia, un virus del papiloma humano (v.gr., una proteína Ll o L2 de cápsida HPV16 o HPV18, o un fragmento inmunógeno de las mismas), un virus sincitial respiratorio (v.gr., una glico-proteína de virus sincitial respiratorio F o G) , parásito de malaria, y Mycobacte-rium tuberculosis (también ver mas adelante) .
Los flavivirus pseudo- infecciosos deficientes de replicación pueden incluir secuencias que codifican una proteína de pre-membrana (prM) y/o envoltura (E) . Además, los genomas de flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicación pueden seleccionarse a partir de aquellos del virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, virus de encefalitis transmitida por garrapata, virus Langat, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, y virus de encefalitis de San Luis, cepas atenuadas de los mismos, y quimeras de los mismos (también ver mas adelante) . En varios ejemplos, las quimeras incluyen secuencias de pre-membrana (pr ) y envoltura (E) de un primer flavivirus (v.gr., un virus de encefalitis transmitida por garrapatas o un virus Langat) , y cápsida (C) y secuencias no estructurales de un segundo flavivirus, diferente (v.gr., un virus de la fiebre amarilla, del Nilo Occidental, o Langat) .
Los genomas de flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicación pueden empacarse en partículas incluyendo secuencias de pre-membrana (prM) y envoltura (E) a partir de un flavivirus que es el mismo o diferente de aquel de los genomas.
Además, las secuencias que codifican los inmunógenos heterólogos pueden insertarse en lugar de, o en combinación con, las supresiones o mutaciones de las una o mas proteínas.
Las secuencias que codifican a los inmunógenos heterólogos pueden insertarse en los genomas de flavivirus dentro de secuencias que codifican la proteína de envoltura (E) , dentro de secuencias que codifican la proteína no estructural 1 (NS1) , dentro de secuencias que codifican la proteína de pre-membrana (prM) , intergenicalmente entre secuencias que codifican la proteína de envoltura (E) y la proteína no estructural 1 (NS1) , intergenicalmente entre la proteína no estructural 2B (NS2B) y la proteína no estructural 3 (NS3) , y/o como una inserción bicistró-nica en la región no traducida 3' del genoma de flavivirus.
La invención también incluye composiciones que incluyen un primer flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación, como se describe anteriormente, y un segundo (o adicional) flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación, diferente, que incluye un genoma que incluye una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótido que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) . En estas composiciones, las una o mas proteína codificadas por las secuencias en las cuales ocurren las supresiones o mutaciones en el segundo flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación, diferente, son diferentes de las una o mas proteínas codificadas por las secuencias en las cuales las supresiones ocurren en el primer flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación.
La invención además incluye métodos para inducir respuestas inmunológicas a un inmunógeno en un sujeto, lo cual involucra administrar al sujeto uno o mas flavivirus y/o composiciones pseudo- infecciosos deficientes de replicación como se describe en la presente al sujeto. En varios ejemplos, el sujeto está en riesgo pero no tiene una infección por el patógeno o una enfermedad o condición asociada con el inmunógeno relacionado con cáncer o alergia. En otros ejemplos, el sujeto tiene una infección por el patógeno o una enfermedad o condición asociada con el inmunógeno relacionado con cáncer o alergia. La invención por ende incluye métodos profilácticos y terapéuticos. En estos métodos, el inmunógeno puede ser de, por ejemplo, un patógeno seleccionado a partir del grupo que consiste en un virus de la rabia, Borrelia burgdorferi, una garrapata, un virus de la influenza, un virus de inmunodeficiencia humana, un virus de inmunodeficiencia simia, un virus del papiloma humano, un virus sincitial respiratorio, parásito de malaria, y M cobacfcerium tuberculosis (también ver mas adelante) . Además, los métodos pueden ser para inducir una respuesta inmunológica contra una proteína codificada por el genoma de flavivirus, además de la fuente del inmunógeno. En varios ejemplos, el sujeto está en riesgo pero no tiene una infección por el flavivirus correspondiente al genoma del flavivirus pseudo-infeccioso, el cual incluye secuencias que codifican una proteína de pre-membrana y/o envoltura de flavivirus. En otros ejemplos, el sujeto tiene una infección por el flavivirus que corresponde al genoma del flavivirus pseudo-infeccioso, el cual incluye secuencias que codifican una proteína de pre-membrana y/o envoltura de flavivirus .
La invención también incluye flavivirus quiméricos atenuados, vivos, que incluyen un virus de la fiebre amarilla en el cual secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura son reemplazadas con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura de un virus de encefalitis transmitida por garrapatas o un virus Langat, y la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y pre-membrana del flavivirus quimérico incluye un híbrido de virus de la fiebre amarilla y encefalitis transmitida por garrapatas o secuencias de señal de cápsida/pre-membrana de virus Langat, o una variante de los mismos. En varios ejemplos, la secuencia de señal de cápsida/pre-membrana del flavivirus quimérico incluye secuencias de virus de la fiebre amarilla en la región terminal amino y secuencias de virus de encefalitis transmitida por garrapatas o Langat en la región terminal carboxi (ver mas adelante) .
Además, la invención incluye flavivirus quiméricos atenuados, vivos, que incluyen un virus del Nilo Occidental en el cual secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura se reemplazan con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura de un virus de encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, y la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y pre-membrana del flavivirus quimérico incluye una secuencia de señal de cápsida/pre-membrana de virus de encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o un variante de la misma.
La invención también incluye composiciones farmacéuticas que incluyen uno o mas flavivirus pseudo- infecciosos , composición, o flavivirus atenuados, vivos, como se describe en la presente, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Además, las composiciones pueden incluir un adyuvante.
También incluidos en la invención son flavivirus pseudo- infecciosos deficientes de replicación que incluyen un genoma de flavivirus que incluye una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , o proteína no estructural 5 (NS5) .
Además, la invención incluye moléculas de ácido nucleico que corresponden al genoma de un flavivirus pseudo-infeccioso, o el genoma del flavivirus atenuado, vivo, como se describe en la presente, y complementos de los mismos.
La invención también proporciona métodos para hacer flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicacion como se describen en la presente, involucrando introducir una o mas moléculas de ácido nucleico, como se describe anteriormente, en una célula que expresa las proteínas que corresponden a cualquier secuencia suprimida a partir del genoma de flavivirus de los flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicacion. En estos métodos, la proteína puede expresarse en la célula del genoma de un segundo (o adicional) flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicacion, diferente. En otros ejemplos, la proteína se expresa a partir de un replicón (v.gr., un replicón de alfavirus, tal como un replicón de virus de la encefalitis equina venezolana; ver mas adelante) .
La invención también incluye composiciones conteniendo dos o mas flavivirus pseudo- infecciosos deficientes de replicacion, en los cuales dos de los flavivirus pseudo- infecciosos deficientes de replicacion se seleccionan a partir de los grupos que consisten en: (a) un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que incluye un genoma conteniendo secuencias de virus de la encefalitis japonesa, y un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que incluye un genoma conteniendo secuencias de virus del dengue; (b) un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que incluye un genoma que contiene secuencias de virus de la fiebre amarilla, y un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que incluye un genoma conteniendo secuencias del virus del dengue; y (c) un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación incluyendo un genoma que contiene secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat y una secuencia insertada que codifica un inmunógeno de Borrelia burgdorferi, y un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que incluye un genoma que contiene secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat y una secuencia insertada que codifica un inmunógeno de proteína de saliva de garrapata, o un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que incluye un genoma que contiene secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat y secuencias insertadas que codifican un inmunógeno de Borrelia burgdorferi y un inmunógeno de proteína de saliva de garrapata.
Composiciones farmacéuticas incluyendo los flavivirus quiméricos atenuados, vivos, descritos en la presente también se incluyen en la invención. Además, la invención incluye métodos para inducir una respuesta inmunológica a virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o virus Langat en un sujeto, involucrando administrar al sujeto tal una composición farmacéutica. En varios ejemplos, el sujeto no tiene pero está en riesgo de desarrollar infección por virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o virus Langat. En otros ejemplos, el sujeto está infectado con virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o virus Langat .
La invención además incluye flavivirus pseudo- infecciosos deficientes de replicación que incluyen un genoma de flavivirus que incluye una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótido que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (pr ) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) , donde el genoma de flavivirus incluye secuencias de virus de la fiebre amarilla en las cuales secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura se reemplazan con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura de un virus de la encefalitis transmitida por garrapata o un virus Langat, y secuencias que codifican la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y de pre-membrana del genoma de flavivirus incluyen un híbrido de secuencias que codifican secuencias de señal de cápsida/pre-membrana virus de la fiebre amarilla o virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o una variante de las mismas. En varios ejemplos, las secuencias que codifican la secuencia de señal de cápsida/pre-membrana del genoma de flavivirus incluyen secuencias de virus de la fiebre amarilla en la región 5' y secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat en la región 3 ' .
Además, la invención incluye flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicacion que incluyen un genoma de flavivirus que incluye una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótido que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) , donde el genoma de flavivirus incluye secuencias de virus del Nilo Occidental en las cuales secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura son reemplazadas con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y envoltura de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, y las secuencias que codifican la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y pre-membrana del genoma de flavivirus incluyen secuencias que codifican una secuencia de señal de cápsida/pre-membrana de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o una variante de las mismas.
Además, la invención incluye flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicacion que incluyen un genoma de flavivirus que incluye una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) , donde cualquier proteína de cápsida (C) y no estructural (NS) en el genoma de flavivirus es a partir de virus Langat y cualquier proteína de pre-membrana (prM) y envoltura (E) es a partir de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas .
Por "flavivirus pseudo- infecciosos deficiente de replicación" o "PIV" se entiende un flavivirus que es deficiente de replicación debido a una supresión o mutación en el genoma de flavivirus. La supresión o mutación puede ser, por ejemplo, una supresión de una secuencia grande, tal como la mayoría de la proteína de cápsida, como se describe en la presente (con la secuencia de ciclización restante; ver mas adelante) . En otros ejemplos, secuencias codificando diferentes proteínas (v.gr., prM, E, NS1, NS3, y/o NS5; ver mas adelante) o combinaciones de proteínas (v.gr., prM-E o C-prM-E) se suprimen. Este tipo de supresión puede ser ventajoso si el PIV se va a usar como un vector para entregar un inmunógeno heterólogo, pues la supresión puede permitir inserción de secuencias que pueden ser, por ejemplo, por lo menos hasta del tamaño de la secuencia suprimida. En otros ejemplos, la mutación puede ser, por ejemplo, una mutación puntual, provisto que resulte en deficiencia de replicación, como se discute anteriormente. Debido a la supresión o mutación, el genoma no codifica todas las proteínas necesarias para producir una partícula de flavivirus completa. Las secuencias faltantes pueden ser provistas en trans por una línea celular complementaria que está diseñada para expresar la secuencia faltante (v.gr., por el uso de un replicón; s-PIV; ver mas adelante) , o por co-expresión de dos genomas deficientes de replicación en la misma célula, donde los dos genomas deficientes de replicación, cuando se consideran juntos, codifican todas las proteínas necesarias para producción (sistema d-PlV; ver mas adelante) .
Ante introducción en las células que no expresan proteínas complementarias, los genomas se replican y, en algunas instancias, generan "partículas similares a virus", que son liberadas a partir de las células y son capaces de dejar a las células y ser inmunógenas, pero no pueden infectar otras células y llevar a la generación de partículas adicionales. Por ejemplo, en el caso de un PIV incluyendo una supresión en las secuencias que codifican proteína de cápsida, después de infección de células que no expresan cápsida, VLPs que incluyen proteínas prM-E se liberan de las células . Debido a la falta de proteína de cápsida, las VLPs carecen cápsida y un genoma de ácido nucleico. En el caso del enfoque de d-PIV, producción de PIVs adicionales es posible en células que están infectadas con dos PIVs que se complementan entre sí con respecto a la producción de todas las proteínas requeridas (ver mas adelante) .
La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, los vectores de PIV y los PIVs de la invención son altamente atenuados y altamente eficaces después de una a dos dosis, proporcionando inmunidad duradera. Además, a diferencia de vacunas desactivadas, PIVs imitan infección de virus entero, lo cual puede resultar en eficacia incrementada debida a la inducción de respuestas robustas de células B y T, mayor durabilidad de inmunidad, y requerimientos de dosis disminuidos. Además, similar a virus enteros, vacunas de PIV apuntan a células que presentan antígeno, tales como células dendríticas, estimulan receptores similares a Toll (TLRs) , e inducen inmunidad Thl/Th2 balanceada. Construcciones de PIV también han sido mostrados creciendo en altos títulos en células de sustrato, con poco o sin CPE, permitiendo para manufactura de alto rendimiento, opcional -mente empleando múltiples cosechas y/o expansión de células de sustrato infectadas. Además, los vectores de PIV de la invención proporcionan una opción para desarrollar vacunas contra patógenos no de flavivirus para los cuales no hay vacunas actualmente disponibles .
Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una ilustración esquemática de tecnología de PIV de un solo componente (s-PIV) .
La figura 2 es una ilustración esquemática de tecnología de PIV de dos componentes (d-PIV) .
La figura 3 es una ilustración esquemática de un diseño experimental general para probar inmunogenicidad y eficacia de PIVs en ratones.
La figura 4 es una gráfica que compara la respuesta inmunológica humoral inducida por PIV-WN (RV-WN) con aquella de LAV de YF/WN (CV-WN) en ratones.
La figura 5 es una serie de gráficas que muestran los resultados de retar a hámsteres inmunizados con PIV-YF (RV-YF) , YF17D, PIV-WN (RV-WN) , y LAV de YF/WN (CV-WN) con Asibi adaptado a hámsteres (vacunados de PIV-YF y YF17D) y WN-NY99 de tipo silvestre (vacunados de PIV-WN y LAV de YF/WN) .
La figura 6 es una tabla que muestra títulos de virus YF/TBE y YF/LGT y morfología de placa obtenida con los flavivirus quiméricos indicados .
La figura 7 es una tabla que muestra títulos de PIV WN/TBE y ejemplos de inmuno-fluorescencia de células conteniendo los PIVs indicados.
La figura 8 es un conjunto de gráficas que muestran la cinética de replicación de LAV de YF/TBE y PIV-WN/TBE en líneas celulares Vero y BHK (CV-Hypr = LAV de YF/Hypr; CV-LGT = LAV de YF/LGT; TV-WN/TBEV = PIV-WN/TBEV) .
La figura 9 es una serie de gráficas que muestran supervivencia de ratones inoculados IC con construcciones de PIV- TBE y LAV de YF/TBE en una prueba de neuro-virulencia (ratones ICR de 3.5 semanas de edad; RV-WN/Hypr = PIV-WN/TBE (Hypr) ; CV-Hypr = LAV de YF/TBE (Hypr) ; CV-LGT = LAV de YF/LGT) .
La figura 10 es una gráfica que muestra la supervivencia de ratones inoculados IP con construcciones de PIV-WN/TBE (Hypr) (RV-WN/Hypr), LAV de YF/TBE (Hypr) , y LAV DE YF/LGT (CV-LGT) y YF17D en una prueba de neuro-invasividad (ratones ICR de 3.5 semanas de edad) .
La figura 11 es una serie de gráficas que ilustran la morbidez en ratones medida por dinámica de pérdida de peso corporal después de reto de virus TBE, para grupos inmunizados con candidatos de s-PIV-TBE (panel izquierdo superior) , virus quiméricos YF/TBE y YF/LGT (panel derecho superior) , y controles (YF 17D, vacuna TBE muerta humana, y simulación; panel inferior) .
La figura 12 es una representación esquemática de construcciones PIV expresando proteína G de virus de la rabia, así como ilustración de empaque de las construcciones para hacer virus pseudo- infeccioso e inmunización.
La figura 13 es una representación esquemática de diseños de inserción resultantes en construcciones viables/que expresan (ejemplificadas por rabia G) .
La figura 14 es una serie de imágenes mostrando análisis de inmuno- fluorescencia y gráficas mostrando curvas de crecimiento de células transfectadas con las construcciones de PIV-WN indicadas (AC-rabia G, AprM-E-rabia G, y AC-PrM-E-rabia G) .
La figura 15 es una serie de imágenes mostrando análisis de inmuno- fluorescencia de RabG expresada en las membranas de plasma de células Vero transíectadas con las construcciones de PIV indicadas (AC-rabia G, AprM-E-rabia G, y AC-PrM-E-rabia G) .
La figura 16 es una ilustración esquemática de una construcción de PIV-WN-rabia G y una serie de imágenes mostrando que esta construcción se esparce en células ayudantes, pero no en células ingenuas.
La figura 17 es una serie de gráficas que muestran estabilidad del gen de proteína de rabia G en vectores de PIV-WN.
La figura 18 es un conjunto de imágenes que muestran una comparación de esparcimiento de variantes de PIV-WN-rabia G de un solo componente contra de dos componentes en células Vero.
La figura 19 es un conjunto de imágenes de inmuno-fluorescencia mostrando expresión de proteína F de RSV de longitud completa (cepa A2) por el componente AprM-E de d-PIV-WN en células ayudantes después de transíección.
Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona vectores de virus pseudo-infecciosos (PIV) defectuosos o deficientes de replicación que incluyen secuencias de flavivirus, las cuales pueden usarse en métodos para inducir inmunidad contra inmunógenos heterólogos relacionados con patógeno, cáncer, y alergia insertados en los vectores así como, opcionalmente, los propios vectores. La invención también incluye composiciones que incluyen combinaciones de PIVs y/o vectores de PIV, como se describe en la presente, y métodos para usar tales composiciones para inducir respuestas inmunológicas contra secuencias de inmunógeno insertadas y/o secuencias de los propios PIVs. Además, la invención incluye PIVs particulares y flavivirus quiméricos atenuados, vivos, que incluyen secuencias del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, y vectores, composiciones, y métodos de uso relacionados. Los vectores de PIV, PIVs, flavivirus quiméricos atenuados vivos, composiciones, y métodos de la invención se describen adicionalmente a continuación.
Vectores de PIV y PIVs Los vectores de PIV y PIVs de la invención pueden basarse en los PIVs de un solo o dos componentes descritos anteriormente (también ver O 2007/098267 y O 2008/137163) . Por ende, por e emplo, en el caso de PIVs de un solo componente, los vectores de PIV y PIVs pueden incluir un genoma que incluye una gran supresión en secuencias que codifican proteína de cápsida y ser producidas en una línea celular complementaria que produce proteína de cápsida en trans (un solo componente; figura 1 y figura 12) . De acuerdo con este enfoque, la mayoría de la región que codifica cápsida se suprime, lo cual previene al genoma de PIV de producir progenie infecciosa en líneas celulares normales (es decir, líneas celulares que no expresan secuencias de cápsida) y sujetos vacunados. La supresión de cápsida típicamente no interrumpe secuencias de ARN requeridas para ciclización de genoma (es decir, la secuencia que codifica aminoácidos en la región de las posiciones 1-26) , y/o la secuencia de prM requerida para maduración de prM a M. En ejemplos específicos, las secuencias suprimidas corresponden a aquellas que codifican aminoácidos 26-100, 26-93, 31-100, o 31-93 de la proteína C.
Vectores de PIV de un solo componente y PIVs pueden propagarse en líneas celulares que expresan ya sea C o un cartucho C-prM-E, donde se replican a altos niveles. Líneas celulares ejemplares que pueden usarse para expresión de vectores de PIV de un solo componente y PIVs incluyen BHK-21 (v.gr. , ATCC CCL-10) , Vero (v.gr., ATCC CCL-81) , C71/10, y otras células de origen de vertebrados o mosquitos. La C o el cartucho C-prM-E pueden expresarse en tales células por el uso de un replicón derivado de vector viral, tal como un replicón de alfavirus (v.gr., un replicón basado en virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) , virus Sindbis, virus Semliki Forest (SFV) , virus de la encefalitis equina oriental (EEEV) , virus de la encefalitis equina occidental (WEEV) , o virus Ross River) . Para disminuir la posibilidad de recombinación productiva entre los vectores de PIV/PIVs y secuencias complementarias, las secuencias en los replicones (codificando C( prM, y/o E) pueden incluir mutaciones de nucleótido. Por ejemplo, secuencias que codifican una proteína C complementaria pueden incluir una secuencia de ciclización no natural. Las mutaciones pueden resultar de optimización de codones, lo cual puede proporcionar un beneficio adicional con respecto a rendimiento de PIV. Además, en el caso de células complementarias expresando secuencias de proteína C (y no un cartucho C-prM-E) , puede ser benéfico incluir una secuencia de anclado en la terminal carboxi de la proteína C incluyendo, por ejemplo, alrededor de 20 aminoácidos de pr (ver, v.gr., O 2007/098267) .
Los vectores PIV y PIVs de la invención también pueden basarse en la tecnología de genoma de dos componentes descrita anteriormente. Esta tecnología emplea dos construcciones de genoma parciales, cada una de las cuales es deficiente en la expresión de por lo menos una proteína requerida para replicación productiva (cápsida o prM/E) pero, cuando está presente en la misma célula, resulta en la producción de todos los componentes necesarios para hacer un PIV. Por ende, en un ejemplo de la tecnología de genoma de dos componentes, el primer componente incluye una supresión grande de C, como se describe anteriormente en referencia a PIVs de un solo componente, y el segundo componente incluye una supresión de prM y E (figura 2 y figura 12) . En otro ejemplo, el primer componente incluye una supresión de C, prM, y E, y el segundo componente incluye una supresión de NS1 (figura 12) . Ambos componentes pueden incluir elementos promotores de acción cis requeridos para replicación de ARN y un conjunto completo de proteínas no estructurales, las cuales forman al complejo de enzimas replicante. Por ende, ambos genomas defectuosos pueden incluir una región no traducida 5 ' y por lo menos alrededor de 60 nucleótidos (elemento 1) de la secuencia de codificación de proteína natural, siguiente, la cual comprende un fragmento terminal amino de la proteína de cápsida. Esta secuencia puede seguirse por una secuencia de separación de proteasa tal como, por ejemplo, una ubiquitina o secuencia de proteasa específica de virus de enfermedad de pies y boca (FAMDV) 2A, la cual puede fusionarse con secuencias que codifican ya sea cápsida o envoltura (prM-E) . Además, secuencias optimizadas por codón, artificiales, pueden usarse para excluir la posibilidad de recombinación entre los dos genomas virales defectuosos, lo cual podría llevar a formación de virus competentes de replicación (ver, v.gr., WO 2008/137163) . El uso del enfoque de genoma de dos componentes no requiere al desarrollo de líneas celulares expresando genomas complementarios, tal como las células transformadas con replicones, como se discute anteriormente en referencia al enfoque de PIV de un solo componente. Líneas celulares ejemplares que pueden usarse en el enfoque de genoma de dos componentes incluyen Vero (v.gr., ATCC CCL-81) , BHK-21 (v.gr., ATCC CCL-10) , C7/10, y otras células de origen de vertebrados o mosquitos .
Ejemplos adicionales de enfoques de d-PIV que pueden usarse en la invención son con base en el uso de genomas complementarios que incluyen supresiones en las secuencias de NS3 o NS5. Una supresión en, v.gr., proteínas NS1, NS3, o NS5 pueden usarse tan larga como de varios cientos de aminoácidos en el ORF, removiendo la secuencia de proteína elegida entera, o tan corta como 1 aminoácido desactivando la actividad enzimática de proteína (v.gr., actividad de polimerasa de ARN de NS5, actividad de helicasa de NS3, etc.) . Alternativamente, cambios de aminoácidos puntuales (tan pocos como 1 mutación de aminoácidos, u opcionalmente mas mutaciones) pueden introducirse en cualquier proteína NS, desactivando la actividad enzimática. Además, varias supresiones de ANS pueden combinarse en una molécula ayudante. El mismo gen heterólogo, es decir, expresado por el primer componente de d-PIV, puede expresarse en lugar o en combinación con las supresiones de NS en el segundo componente, incrementando la cantidad de inmunógeno expresado. Notablemente, la capacidad de inserción del ayudante se incrementará proporcionalmente con el tamaño de las supresiones de NS . Alternativamente, inmunógenos foráneos diferentes pueden insertarse en lugar de supresiones del ayudante para producir vacunas multivalentes .
Además, enfoques adicionales que pueden usarse para hacer vectores de PIV y PIVs para uso en la presente invención se describen, por ejemplo, en wo 99/28487, WO 03/046189, wo 2004/108936, US 2004/0265338, US 2007/0249032, y la patente US 7, 332, 322.
Los vectores de PIV y los PIVs de la invención pueden estar comprendidos por secuencias a partir de un solo tipo de flavivirus (v.gr., virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, v.gr., cepa Hypr) , Langat (LGT) , fiebre amarilla (v.gr., YF17D) , Nilo Occidental, encefalitis japonesa, dengue (serotipos 1-4) , encefalitis de San Luis, Kunjin, encefalitis de Roció, Ilheus, encefalitis europea central, encefalitis siberiana, encefalitis rusa de primavera-verano, enfermedad de Kyasanur Forest, fiebre hemorrágica de Omsk, encefalomielitis ovina, Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, y Apoi) , o puede comprender secuencias a partir de dos o mas flavivirus diferentes. Secuencias de algunas cepas de estos virus están fácilmente disponibles a partir de bases de datos de secuencias generalmente accesibles; secuencias de otras cepas pueden determinarse fácilmente por métodos bien conocidos en la materia. En el caso de vectores de PIV y PIVs incluyendo secuencias de mas de un flavivirus, las secuencias pueden ser aquellas de un flavivirus quimérico, como se describe anteriormente (también ver, v.gr., la patente US 6,962,708; la patente US 6,696,281; y la patente US 6,184,024) . En ciertos ejemplos, las quimeras incluyen secuencias de pre-membrana y de envoltura a partir de un flavivirus (tal como un flavivirus al cual puede desearse inmunidad) , y secuencias de cápsida y no estructurales a partir de un segundo flavivirus, diferente. En un ejemplo específico, el segundo flavivirus es un virus de la fiebre amarilla, tal como la cepa de vacuna YF17D. Otros ejemplos incluyen las quimeras YF/TBE, YF/LGT, W /TBE, y W /LGT descritas mas adelante. Otro ejemplo es una quimera LGT/TBE con base en un esqueleto de virus LGT conteniendo proteínas prM-E de virus TBE. Una vacuna PIV con base en este fondo genético tendría una ventaja, debido a que LGT se replica muy eficientemente in vitro y es altamente atenuado e inmunógeno para humanos. Por ende, se espera que una vacuna PIV de LGT/TBE quimérica proporcione una respuesta inmunológica específica robusta en humanos contra TBE, particularmente debido a la inclusión de genes de prM-E de TBE.
Vectores de la invención pueden basarse en construcciones de PIV o flavivirus quiméricos atenuados, vivos, como se describe en la presente (en particular, YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE y /LGT; ver mas adelante) . El uso de construcciones de PIV como vectores proporciona ventajas particulares en ciertas circunstancias, debido a que estas construcciones por necesidad incluyen supresiones grandes, las cuales hacen a las construcciones mas susceptibles a acomodamiento de inserciones que son por lo menos hasta el tamaño de las secuencias suprimidas, sin que haya una pérdida en la eficiencia de replicación. Por ende, vectores de PIV en general pueden comprender inserciones muy pequeñas (v.gr. , en el rango de 6-10, 11-20, 21-100, 101-500, o mas residuos de aminoácidos combinados con la supresión AC u otras supresiones) , así como inserciones relativamente grandes o inserciones de tamaño intermedio (v.gr., en el rango de 501-1,000, 1,001-1,700, 1,701-3,000, o 3-001-4,000 o mas residuos). En contraste, en ciertos ejemplos, puede ser ventajoso expresar secuencias relativamente cortas en virus atenuados vivos, particularmente si las inserciones se hacen en ausencia de una supresión correspondiente. Información adicional respecto de sitios de inserción que pueden usarse en la invención es provista mas adelante. Además, como se discute adicionalmente mas adelante, expresión de inmunógenos no de flavivirus en PIVs y flavivirus quiméricos de la invención puede resultar en vacunas duales que producen inmunidad protectora contra tanto un patógeno de virus de vector de flavivirus y un inmunógeno heterólogo objetivo (v.gr., un inmunógeno relacionado con patógeno (tal como un patógeno bacteriano, viral, parásito, o fungal) , cáncer, o alergia).
Como se discute anteriormente, los vectores de PIV y los PIVs de la invención pueden comprender secuencias de flavivirus quiméricos, por ejemplo, flavivirus quiméricos que incluyen secuencias de pre-membrana y envoltura de un primer flavivirus (v.gr., un flavivirus al cual se busca inmunidad), y secuencias de cápsida y no estructurales de un segundo flavivirus, diferente, tal como un virus de la fiebre amarilla (v.gr., YF17D; ver anteriormente y también la patente US 6,962,708; patente US 6,696,281; y patente US 6,184,024) . Además, flavivirus quiméricos de la invención, usados como una fuente para construir PIVs, o como vacunas/vectores de vacuna per se, pueden opcional-mente incluir una o mas mutaciones atenuantes específicas (v.gr. , mutaciones de proteína E, mutaciones de proteína prM, supresiones en la proteína C, y/o supresiones en la 3'UTR), tal como cualquiera de aquellas descritas en O 2006/116182. Por ejemplo, las supresiones en la proteína C o 3'UTR pueden aplicarse directamente a quimeras YF/TBE o YF/LGT. Supresiones similares pueden diseñarse e introducirse en otros candidatos de LAV quiméricos tal como con base en genomas de LGT/TBE, W /TBE, y WN/LGT. Con respecto a mutaciones de proteína E, mutaciones atenuantes similares a aquellas descritas para quimera YF/WN en WO 2006/116182 pueden diseñarse, v.gr., con base en el conocimiento de la estructura de cristal de la proteína E (Rey et al., Nature 375 (6529) : 291-298 , 1995), y emplearse. Además, ejemplos adicionales de mutaciones de proteína E atenuantes descritas para virus de TBE y otros flavivirus son provistas en la Tabla 9. Estas pueden introducirse similarmente en candidatos de vacuna quimérica .
La invención también proporciona nuevos flavivirus quiméricos particulares, los cuales pueden usarse como una base para el diseño de vectores de PIV y PIVs, como vectores de flavivirus quiméricos atenuados vivos, y como vacunas contra las fuentes de los componentes de pre-membrana y envoltura de las quimeras. Estas quimeras incluyen virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) o secuencias de prM-E relacionadas. Por ende, las quimeras pueden incluir secuencias de prM-E a partir de, por ejemplo, la cepa Hypr de virus de TBE o Langat (LGT) . Proteínas de cápsida y no estructurales de las quimeras pueden incluir aquellas a partir del virus de la fiebre amarilla (v.gr., YF17D) o virus del Nilo Occidental (v.gr., NY99) .
Un aspecto central de estas quimeras YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE, y WN/LGT ejemplares es la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y prM. Como se muestra en los ejemplos, mas adelante, se encontró que, en el caso de quimeras de PIV a base de YF, es ventajoso usar una secuencia de señal que comprende secuencias de fiebre amarilla y TBE (ver mas adelante) . En un ejemplo, la secuencia de señal incluye secuencias de fiebre amarilla en la región de terminal amino (v.gr., SHDVLTVQFLIL; SEQ ID N0:1) y secuencias de TBE en la región terminal carboxi (v.gr., GMLG TIA; SEQ ID NO : 2 ) , resultando en la secuencia SHDVLTVQFLILGMLGMTIA (SEQ ID NO : 3 ) . También se ha encontrado que, en el caso de quimeras de PIV a base de WN, es ventajoso usar una secuencia de señal que comprende secuencias de TBE (v.gr., GGTDW SWLLVIGMLGMTIA; SEQ ID NO : 4 ) . La invención por ende incluye quimeras de YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE, y WN/LGT, tanto PIVs y LAVs, las cuales incluyen las secuencias de señal mencionadas anteriormente, o variantes de las mismas teniendo, v.gr., 1-8, 2-7, 3-6, o 4-5 sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos, las cuales no interfieren sustancialmente con procesamiento en la secuencia de señal. En varios ejemplos, las sustituciones son "sustituciones conservadoras", las cuales se caracterizan por reemplazo de un residuo de aminoácidos por otro residuo biológicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como entre arginina y lisina, entre ácidos glutámico y aspártico, o entre glutamina y asparagina y similares. Información adicional respecto de estas quimeras es provista mas adelante, en los ejemplos.
Sitios de Inserción Secuencias que codifican inmunógenos pueden insertarse en uno o mas sitios diferentes dentro de los vectores de la invención. Péptidos relativamente cortos pueden entregarse en la superficie de glicoproteínas de PIV o LAV (v.gr., proteínas prM, E, y/o NS1) y/o en el contexto de otras proteínas (para inducir predominantemente respuestas de células B y células T, respectivamente) . Otros insertos, incluyendo porciones mas grandes de proteínas foráneas, así como proteínas completas, pueden expresarse intergénicamente, en las terminales N y de la poliproteína, o bicistrónicamente (v.gr., dentro del ORF ¡bajo un IRES o en la 31 UTR bajo un IRES; ver, v.gr., WO 02/102828, WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314, y mas adelante para detalles adicionales) . En construcciones de PIV, hay una opción adicional de insertar una secuencia de aminoácidos foránea directamente en lugar de supresiones introducidas. Inserciones pueden hacerse en, por ejemplo, AC, AprM-E, AC-prM-E, ANSI, ANS3, y ANS5. Por ende, en un ejemplo, en el caso de s-PIVs y el componente AC de d-PIVs, secuencias que codifican inmunógeno pueden insertarse en lugar de secuencias de cápsida suprimidas. Secuencias que codifican inmunógeno también pueden, opcionalmente , insertarse en lugar de secuencias de prM-E suprimidas en el componente AprM-E de d-PIVs. En otro ejemplo, las secuencias se insertan en lugar de o combinadas con secuencias suprimidas en construcciones AC-prM-E. Ejemplos de tales inserciones son provistas en la sección de ejemplos, siguiente.
En el caso de hacer inserciones hacia supresiones de PIV, las inserciones pueden hacerse con unos cuantos residuos específicos de vector adicionales (v.gr., 1, 2, 3, 4, o 5) en las terminales N y/o C del inmunógeno foráneo, si la secuencia está simplemente fusionada en cuadro (v.gr., ~20 primeros aminoácidos y unos cuantos últimos residuos de la proteína C si la secuencia reemplaza la supresión ?? , o sin, si el inmunógeno foráneo es flanqueado por elementos apropiados bien conocidos en el campo (v.gr., sitios de separación de proteasa viral; sitios de separación de proteasa celular, tales como señalasa, furina, etc; autoproteasa; codón de terminación; y/o elementos de IRES) .
Si una proteína es expresada por fuera del cuadro de lectura abierto (ORF) viral continuo, v.gr., si secuencias de vector y no de vector se separan por un sitio de entrada de ribosomas internos (IRES) , expresión citoplásmica del producto puede lograrse o el producto puede dirigirse hacia la trayectoria secretoria mediante usar segmentos de señal/ancl apropiados, según se desee. Si la proteína se expresa dentro del ORF de vector, consideraciones importantes incluyen separación de la proteína foránea a partir de la secuencia de poliproteína incipiente, y manteniendo topología corriente de la proteína foránea y todas las proteínas virales (para asegurar viabilidad de vector) con relación a la membrana de ER, v.gr., translocación de proteínas secretadas en el lumen de ER, o manteniendo proteínas citoplásmicas o proteínas asociadas con membrana en el citoplasma/en asociación con la membrana de ER.
En mas detalle, los enfoques anteriormente descritos para hacer inserciones pueden emplear el uso de, por ejemplo, secuencias derivadas de vector, derivadas de inserto, o de señal y ancla no relacionadas apropiadas incluidas en las terminales N y C de insertos de glicoproteína . Autoproteasas estándar, tales como autoproteasa FMDV 2A (-20 aminoácidos) o ubiquitina (gen ~ 500 nt) , o sitios de separación de proteasa NS2B/NS3 viral flanqueantes pueden usarse para dirigir separación de un producto expresad a partir de una cadena de polipéptido creciente, para liberar una proteína foránea a partir de una poliproteína de vector, y para asegurar viabilidad de la construcción. Opcional-mente, crecimiento de la cadena de poliproteína puede terminarse mediante usar un codón de terminación, v.gr., después de un inserto de gen foráneo, y síntesis de las proteínas restantes en las construcciones pueden re- iniciarse por incorporación de un elemento de IRES, v.gr., el IRES de virus de encefalomiocarditis (EMCV) usado en el campo de vectores de virus de ARN. Recombinan-tes viables pueden recuperarse a partir de células ayudantes (o células regulares para versiones de d-PIV) . Opcionalmente , secuencias de PIV de esqueleto pueden re-arreglarse, v.gr., si la última resulta en expresión mas eficiente de un gen foráneo. Por ejemplo, un re-arreglo de genes ha sido aplicado al virus de TBE, en el cual los genes de pr -E se movieron al extremo 3 ' del genoma bajo el control de un IRES (Orlinger et al., J. Virol . 80:12197-12208, 2006). translocación de prM-E o cualquier otro gen puede aplicarse a candidatos y vectores de expresión de vacuna de flavivirus de PIV, de acuerdo con la invención.
Detalles adicionales respecto de diferentes sitios de inserción que pueden usarse en la invención son como sigue (también ver WO 02/102828, WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314, como se menciona anteriormente). Secuencias de péptidos pueden insertarse dentro de la proteína de envoltura, la cual es el objetivo principal para neutralizar anticuerpos. Las secuencias pueden insertarse en la envoltura en, por ejemplo, posiciones correspondientes a posiciones de aminoácidos 59, 207, 231, 277, 287, 340, y/o 436 de la proteína de envoltura del virus de la encefalitis japonesa (ver, v.gr., WO 2008/115314 y WO 02/102828) . Para identificar los locus correspondientes en diferentes flavivirus, las secuencias de flavivirus se alinean con aquellas de virus de la encefalitis japonesa. Como puede no haber una concordancia exacta, deberá entenderse que, en virus no de JE, el sitio de inserción puede variar por, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos, en cualquier dirección.
Además, dada la identificación de tales sitios como siendo permisibles en JE, también pueden variar en JE por, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos, en cualquier dirección. Sitios permisivos adicionales pueden identificarse usando métodos tales como mutagénesis de transposón (ver, v.gr., WO 02/102828 y O 2008/036146) . Las inserciones pueden hacerse en los aminoácidos indicados por inserción solo terminal C a los aminoácidos indicados (es decir, entre aminoácidos 51-52, 207-208, 231-232, 277-278, 287-288, 340-341, y 436-437) , o en lugar de supresiones cortas (v.gr., supresiones de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 aminoácidos) comenzando en los aminoácidos indicados (o dentro de 1-5 posiciones de los mismos, en cualquier dirección) .
Además de la proteína de envoltura, inserciones pueden hacerse en otras proteínas de virus incluyendo, por ejemplo, la proteína de membrana/pre-membrana y NSl (ver, v.gr., WO 2008/036146) . Por ejemplo, inserciones pueden hacerse en una secuencia precediendo al sitio de separación de cápsida/pre-membrana (en, v.gr., -4, -2, o -1) o dentro de los primeros 50 aminoácidos de la proteína de pre-membrana (v.gr., en la posición 26) , y/o entre los aminoácidos 236 o 237 de NSl (o en regiones rodeando a las secuencias indicadas, como se describe anteriormente) . En otros ejemplos, inserciones pueden hacerse intergéni-camente. Por ejemplo, una inserción puede hacerse entre las proteínas de E y NSl y/o entre proteínas NS2B y NS3 (ver, v.gr., WO 2008/100464) . En un ejemplo de una inserción intergénica, la secuencia insertada puede fusionarse con la terminal C de la proteína E del vector, después de la secuencia de señal/ancla de la terminal C de la proteína E, y la inserción puede incluir una secuencia de ancla/señal de la terminal C, la cual se fusiona con secuencias NS1 de vector. En otro ejemplo de una inserción intergénica, las secuencias insertadas, con sitios de separación de proteasa flanqueantes (v.gr. , sitios de separación de YF 17D) , pueden insertarse en un sitio de restricción único introducido en la unión de NS2B/NS3 (WO 2008/100464) .
En otros ejemplos, una secuencia puede insertarse en el contexto de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, v.gr., un IRES derivado de virus de encefalomiocarditis ; EMCV) , como se menciona anteriormente, tal como se inserta en la región no traducida 3' (WO 2008/094674). En un ejemplo de tal un vector, empleando, por ejemplo, secuencias de virus de la fiebre amarilla, un cartucho de inmunógeno de IRES puede insertarse dentro de un sitio de clonación múltiple diseñado en la región no traducida 3' del vector, v.gr., en una supresión (v.gr., una supresión de 136 nucleótidos en el caso de un ejemplo a base de virus de la fiebre amarilla) después del codón de tope de poliproteína (WO 2008/094674) .
Detalles concernientes con la inserción de proteína G de virus de rabia y proteína F de virus sincitial respiratorio (RSV) de longitud completa hacia los vectores S-PIV y d-??? de la invención son provistos a continuación en el ejemplo 3. La información provista en el ejemplo 3 puede aplicarse en el contexto de otros vectores e inmunógenos descritos en la presente .
Inmunógenos PIVs (s-PIVs y d-PIVs) con base en secuencias de flavivirus y flavivirus quiméricos atenuados, vivos (v.gr., YF/TBE, YF/LGT, W /TBE, y WN/LGT) , como se describen anteriormente, pueden usarse en la invención para entregar inmunógenos relacionados con patógeno (v.gr., patógenos virales , bacterianos, fúngales, y parasíticos), cáncer, y alergia foráneos (v.gr., no de flavivirus) . Como se discute adicionalmente mas adelante, en ciertos ejemplos, puede ser ventajoso apuntar a varios patógenos ocupando el mismo nicho ecológico, en una región geográfica particular. Ejemplos no limitativos, específicos, de tales inmunógenos son provistos como sigue.
Además del virus de TBE, las garrapatas son también conocidas por transmitir otra enfermedad mayor, enfermedad de Lyme. Por ende, en un primer ejemplo, PIVs de la invención, tales como PIVs que incluyen secuencias de TBE/LGT, así como flavivirus quiméricos que incluyen secuencias de TBE (v.gr., YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE, LGT/TBE, y WN/LGT; en todas las instancias donde "TBE" se indica, esto incluye la opción de usar la cepa Hypr) , pueden usarse como vectores para entregar inmunógenos protectores del agente causante de la enfermedad de Lyme (espiroqueta transmitida por garrapatas Borrelia burgdorferi) . Esta combinación, apuntando a ambos agentes infecciosos (TBE y B. burgdorferi) es ventajosa, ya que TBE y enfermedad de Lyme son ambas enfermedades transmitidas por garrapatas . Los enfoques de PIV pueden aplicarse a quimeras (v.gr., YF/TBE , YF/LGT, WN/TBE, o WN/LGT) , de acuerdo con la invención, así como a virus de TBE y LGT no quiméricos. Un inmunógeno ejemplar de 23. burgdorferi que puede usarse en la invención es OspA (Gipson et al., Vaccine 21:3875-3884, 2003). Opcionalmente, para incrementar seguridad y/o inmunogenicidad, OspA puede mutarse para reducir probabilidades de respuestas auto- inmunes y/o para eliminar sitios para modificación posttraducción no deseada en células de animales vertebrados, tales como glicosilación N-enlazada, la cual puede afectar la inmunogenicidad del producto de expresión. Mutaciones que disminuyen la auto-inmunidad pueden incluir, v.gr., aquellas descritas por Willett . et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101:1303-1308, 2004. En un ejemplo, FTK-OspA, un epítope de célula T de reacción cruzada putativo, Bb OspA165.173 (YVLEGTLTA; SEQ ID NO: 5) se altera para parecerse a la secuencia de péptido correspondiente de Borrelia afzelli (FTLEG VA ; SEQ ID NO: 6). En FTK-OspA, la secuencia correspondiente es FTLEGKLTA (SEQ ID NO: 7).
La secuencia de OspA es como sigue: 1 mkkyllgigl ilaliackqn vssldeknsv svdlpgemkv lvskeknkdg kydliatvdk 61 lelkgtsdkn ngsgvlegvk adkskvklti sddlgqttle vfkedgktlv skkvtskdks 121 steekfnekg evsekiitra dgtrleytgi ksdgsgkake vlkgyvlegt ltaekttlw 181 kegtvtlskn isksgevsve Indtdssaat kktaawnsgt stltitvns kktkdlvftke 241 ntitvqqyds ngtklegsav eitkldeikn alk La secuencia de longitud completa y/o fragmentos inmunógenos de la secuencia de longitud completa pueden usarse en la presente invención. Fragmentos ejemplares pueden incluir uno o mas de dominios 1 (aminoácidos 34-41) , 2 (aminoácidos 65-75) , 3 (aminoácidos 190-220), y 4 (aminoácidos 250-270) (Jiang et al., Clin. Diag. Lab. Immun. 1 (4 ): 406-412 , 1994). Por ende, por ejemplo, un péptido comprendiendo cualquiera una (o mas) de las siguientes secuencias (las cuales incluyen variaciones de secuencia que pueden incluirse en la secuencia listada anteriormente, en cualquier combinación) pueden entregarse: LPGE/GM/IK/T/GVL (SEQ ID NO: 9) ; GTSDKN/S/DNGSGV/T (SEQ ID NO: 10) ; N/H/EIS/P/L/A/SK/NSGEV/IS/TV/AE/ALN/DDT/SD/NS/TS/TA/Q/RATKKTA/G A/K/ TWN/DS/AG/N/KT (SEQ ID NO: 11); SN/AGTK/NLEGS/N/K/TAVEIT/KK/ TLD/KEI/LKN (SEQ ID NO:12).
Además de inmunógenos de B. burgdorferi, proteínas de saliva de garrapatas, tales como 64TRP, Isac, y Salp20, pueden expresarse, v.gr., para generar un candidato de vacuna de especificidad trivalente (TBE + enfermedad de Lyme + garrapatas) . Alternativamente, proteínas de saliva de garrapata pueden expresarse en lugar de inmunógenos de B. burgdorferi en vectores conteniendo secuencia de TBE. Además, hay muchas otras proteínas de saliva de garrapatas candidatas que pueden usarse para desarrollo de vacunas de vector de garrapatas de acuerdo con la invención (Francischetti et al., Insect Biochem. Mol. Biol . 35:1142-1161, 2005). Uno o mas de estos inmunógenos pueden expresarse en s-PIV-TBE. Sin embargo, d-PIV-TBE también se puede seleccionar, debido a su gran capacidad de inserción. Además de PIV-TBE, otras vacunas de PIV pueden usarse como vectores, v.gr., para proteger de enfermedad de Lyme y otra enfermedad de flavivirus, tal como virus del Nilo Occidental. Expresión de estos inmunógenos puede evaluarse en cultivo celular, e inmunoge-nicidad/protección examinarse en modelos animales disponibles (v.gr., como se describe en Gipson et al., Vaccine 21:3875-3884, 2003; Labuda et al., Pathog. 2 (e27) : 0251-0259, 2006). Inmunógenos de otros patógenos pueden expresarse de manera similar, además de inmunógenos de enfermedad de Lyme y de garrapatas, con el propósito de hacer candidatos de vacunas multivalentes . Inmunógenos de saliva de garrapatas ejemplares que pueden usarse en la invención incluyen los siguientes: 64TRP (AF469170) (SEQ ID NO: 13) MKAFFVLSLL STAALTNAAR AGRLGSDLDT FGRVHGNLYA GIERAGPRGY PGLTASIGGE VGARLGGRAG VGVSSYGYGY PSWGYPYGGY GGYGGYGGYG GYDQGFGSAY GGYPGYYGYY YPSGYGGGYG GSYGGSYGGS YTYPNVRASA GAAA Isac (AF270496) (SEQ ID NO: 14) MRTAFTCALL AISFLGSPCS SSEDGLEQDT IVETTTQNLY ERHYR HSGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLN HLPPWNATW EGIRHRINKT IPQFVKLICN FTVAMPQEFY LVYMGSDGNS DFEEDKESTG TDEDSNTGSS AAAKVTEALI IEAEENCTAH ITGWTTETPT TLEPTTESQF EAIP Salp20 (EU008559) (SEQ ID NO: 15) MRTALTCALL AISFLGSPCS SSEGGLEKDS RVETTTQNLY ERYYRKHPGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLS LLPLSV TTW EGIRHRINKT IPEFVNLICN FTVAMPDQFY LVYMGSNGNS YSEEDEDGKT GSSAAVQVTE QLIIQAEENC TAHITGWTTE APTTLEPTTE TQFEAIS Detalles adicionales concernientes a los PIVs y LAVs relacionados con TBE son provistos en el ejemplo 2, siguiente.
La invención además proporciona vacunas con vectores de PIV y LAV contra otros patógenos no de flavivirus, incluyendo vacunas teniendo acción dual, produciendo inmunidad protectora contra tanto flavivirus (según se especifica por las proteínas de envoltura de vector) y patógenos no de flavivirus (según se especifica por determinantes inmunológicos expresados) . Estas son similares a las vacunas de vector de PIV-TBE-enfermedad de Lyme-garrapatas descritas anteriormente. Como se menciona anteriormente, tales vacunas de acción dual pueden desarrollarse contra un rango amplio de patógenos por expresión de inmunógenos a partir de, por ejemplo, patógenos virales, bacterianos, fúngales, y parasíticos, e inmunógenos asociados con cáncer y alergias. Como ejemplos no limitativos específicos, se describe en la presente el diseño y las propiedades biológicas de candidatos de vacuna de virus de la rabia y virus sincitial respiratorio (RSV) con vector de PIV construidos por expresión de proteína G de virus de la rabia o proteína F de RSV de longitud completa en lugar de o en combinación con varias supresiones en los vectores de PIV de uno y dos componentes (ver ejemplo 3, siguiente) .
Como se demuestra en los ejemplos, siguientes, construcciones de s-PIV pueden usarse ventajosamente para entregar de manera estable inmunógenos foráneos relativamente cortos (similares a proteína OspA de agente de enfermedad de Lyme y proteínas de saliva de garrapatas) , debido a que las inserciones se combinan con una supresión AC relativamente corta. Vectores de PIV de dos componentes pueden usarse ventajosamente para expresar de manera estable inmunógenos relativamente grandes, tales como proteína G de rabia y F de RSV, pues las inserciones en tales vectores se combinan con, por ejemplo, supresiones AprM-E, AC-prM-E, y/o ANSI grandes. Algunos de los componentes de d-PIV pueden fabricarse y usarse como vacunas de manera individual, por ejemplo, la construcción F de PIV-RSV descrita a continuación conteniendo una supresión de AC-prM-E. Algunos de los componentes de d-PIV pueden fabricarse y usarse como vacunas individualmente, por ejemplo, la construcción de PIV-RSV F descrita mas adelante conteniendo una supresión AC-prM-E. En este caso, la vacuna induce una respuesta inmunplógica (v.gr., anticuerpos neutralizantes) predominantemente contra la proteína expresada, pero no contra el patógeno de virus de vector de flavivirus. En otros ejemplos de la invención, inmunidad dual se obtiene mediante tener inmunidad inducida tanto a componentes de vector y de inserto. Adicionalmente, debido a la gran capacidad de inserción de vectores PIV, y la opción de usar genomas de dos componentes, los vectores de PIV ofrecen la oportunidad de apuntar a varios patógenos no de flavivirus simultáneamente, v.gr., mediante expresar inmunógenos foráneos a partir de dos patógenos no de flavivirus diferentes en los dos componentes de un d-PIV.
Además de la proteína F de RSV, proteína G de rabia, inmunógenos protectores de enfermedad de Lyme, y proteínas de saliva de garrapatas, como ejemplos de inmunógenos foráneos descritos anteriormente, otros inmunógenos pueden expresarse para apuntar a enfermedades respectivas incluyendo, por ejemplo, inmunógenos de virus de la influenza tipos A y B. En estos ejemplos, unos cuantos epítopes cortos y/o genes enteros de proteínas de partícula viral pueden usarse, tales como los genes M2, HA, y NA de influenza A, y/o genes NB o BM2 de influenza B. Fragmentos mas cortos de M2, NB, y BM2, correspondientes por ejemplo a M2e, el fragmento extra-celular de M2 , también pueden usarse. Además, fragmentos del gen HA, incluyendo epítopes identificados como HAO (23 aminoácidos de longitud, correspondientes al sitio de separación en HA) pueden usarse. Ejemplos específicos de secuencias relacionadas con influenza que pueden usarse en la invención incluyen PAKLLKERGFFGAIAGFLE (SEQ ID NO: 16) (HAO), PAKLLKERGFFGAIAGFLEGSGC (SEQ ID NO: 17) (HAO), NNATFNYTNVNPISHIRGS (SEQ ID NO: 18) (NBe) , MSLLTEVETPIRNE GCRCND- SSD (SEQ ID NO: 19) (M2e) , MSLLTEVETPTRNE ECRCSDSSD (SEQ ID NO: 20) (M2e) , MSLLTEVETLTRNG GCRCSDSSD (SEQ ID NO:21) (M2e) , EVETPTRN (SEQ ID NO:22) (M2e) , SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO:23) (M2e) , y SLLTEVETPIRNEWGCR (SEQ ID NO:24) (M2e) . Secuencias de M2e adicionales que pueden usarse en la invención incluyen secuencias a partir del dominio extra-celular de proteína BM2 de influenza B (consenso MLEPFQ (SEQ ID NO:25), v.gr., LEPFQILSISGC) (SEQ ID NO:26)), y el péptido M2e a partir de influenza aviar H5N1 (MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD (SEQ ID NO: 27)).
Otros ejemplos de inmunógenos de patógeno que pueden entregarse en los vectores de la invención incluyen un gag de VIS o VIH optimizado por codón (55 kDa) , gpl20, gpl60, genes mac239-rev/tat/nef de VIS o análogos de VIH, y otros inmunógenos de VIH; inmunógenos a partir de virus HPV, tales como HPV16, HPV18, etc., v.gr., la proteína de cápsida Ll la cual se auto-ensambla en partículas similares a HPV, la proteína de cápsida L2 o sus porciones inmuno-dominantes (v.gr., aminoácidos 1-200, 1-88, o 17-36) , las proteínas E6 y E7 que se involucran en transformar e inmortalizar células mamíferas fusionadas juntas y mutadas apropiadamente (fusión de los dos genes crea una protéína de fusión, referida como E6E7Rb-, que es alrededor de 10 veces menos capaz de transformar fibroblastos, y mutaciones del componente E7 en 2 residuos hace al mutante de proteína de fusión resultante incapaz de inducir transformación (Boursnell et al., Vaccine 14:1485-1494, 1996). Otros inmunógenos incluyen inmunógenos protectores a partir de HVC, CMV, HSV2, virus, parásito de malaria, Mycobacterium tuberculosis ocasionando tuberculosis, C. difficile, y otras infecciones nosocomiales, que se conocen en la materia, así como patógenos fúngales, inmunógenos de cáncer, y proteínas asociadas con alergias que pueden usarse como objetivos de vacuna.
Insertos de inmunógeno foráneos de la invención se pueden modificar en varias maneras. Por ejemplo, optimización de codón se usa para incrementar el nivel de expresión y eliminar repeticiones largas en secuencias de nucleótidos para incrementar la estabilidad de inserto en el genoma de ARN de vectores de PIV. Inmunogenicidad puede incrementarse por quimerización de proteínas con fracciones inmuno-estimulatorias bien conocidas en la materia, tales como agonistas de TLR, citoquinas estimulato-rias, componentes de complemento, proteínas de choque de calor, etc. (v.gr. , revisado en "Immunopotentiators in Modern Vaccines" , Schijns y 0' Hagan editores, 2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston) .
Con respecto a construcción de vacunas duales contra rabia y otras enfermedades de flavivirus, otras combinaciones, tales como TBE + rabia, YF + rabia, etc., pueden ser de interés tanto para uso humano y veterinario en regiones geográficas correspondientes, y por ende pueden generarse de manera similar. Diseños posibles de construcciones de expresión no se limitan a aquellas descritas en la presente. Por ejemplo supresiones e inserciones pueden modificarse, elementos genéticos pueden re-arreglarse, u otros elementos genéticos (v.gr., señales no de flavivirus, no de rabia para secreción, determinantes de transporte intracelular, inclusión de o fusión con fracciones inmuno-estimulatorias tales como citoquinas, agonistas de TLR tales como flagelina, componentes de multimerización tales como cremallera de leucina, y péptidos que incrementan el periodo de circulación de proteína en la sangre) pueden usarse para facilitar presentación de antígeno e incrementar inmunogenicidad. Además, tales diseños pueden aplicarse a candidatos de vacuna de S-PIV y d-PIV con base en genomas de vector de otros flavivirus, y expresando inmunógenos de otros patógenos, v.gr., incluyendo pero no limitados a patógenos descritos en otros puntos en la presente .
Otros ejemplos de vectores PIV y LAV de la invención incluyendo vacunas de combinación tales como DEN+virus Chikungun-ya (CHIK V) y YF+CHIK V. CHIK V, un alfavirus, es endémico en África, el sureste de Asia, el sub-continente de la India y las Islas, y las Islas del Pacífico y comparte nichos ecológicos/geográficos con YF y DEN1-4. Ocasiona enfermedad seria principalmente asociada con dolor severo (artritis, otros síntomas similares a DEN) y secuelas de larga duración en la mayoría de los pacientes (Simón et al., Med. Clin. North Am. 92:1323-1343, 2008; Seneviratne et al., J. Travel Med. 14:320-325, 2007) . Otros ejemplos de vectores de PIV y LAV de la invención incluyen YF+Ebola o DEN+Ebola, los cuales co-circulan en África.
Inmunógenos para los patógenos no de flavivirus anteriormente mencionados, secuencias de los cuales son bien conocidas en la materia, pueden incluir glicoproteína B o una proteína de fusión pp65/IEl de CMV (Reap et al., Vaccine 25 (42) : 7441-744 , 2007; y referencias en la misma), varias proteínas TB (revisado en Skeiky et al., Nat. Rev. Microbiol . 4(6) :469-476, 2006), antígenos de parásito de malaria tales como RTS,S (una proteína de circunsporozoita pre-eritrocítica, CSP) y otros (v.gr., revisado en Li et al., Vaccine 25 (14) : 2567-2574 , 2007) , proteínas de envoltura de CHIKV El y E2 (o los cartuchos C-E2-E1, E2-E1) , proteínas estructurales de HCV C-E1-E2 formando VLPs (Ezelle et al., J. Virol . 76 (23 ): 12325-12334 , 2002) u otras proteínas para inducir respuestas de células T, glicoproteína de virus del Ébola GP (Yang et al., Virology 377(2) :255-264, 2008) .
Además de los inmunógenos descritos anteriormente, los vectores descritos en la presente pueden incluir uno o mas inmunógenos derivados de o que dirigen una respuesta inmunológica contra uno o mas virus (v.gr., antígenos de objetivo viral) incluyendo, por ejemplo, un virus de ADNds (v.gr., adenovirus, herpesvirus, virus de Epstein-Barr, herpes simplex tipo 1, herpes simplex tipo 2, virus de herpes simplex humano tipo 8, citomega-lovirus humano, virus de varicela-zóster, poxvirus) ; virus de ADNss (v.gr., parvovirus, papilomavirus (v.gr., El, E2 , E3 , E4 , E5, E6, E7, E8, BPV1, BPV2 , BPV3 , BPV4 , BPV5 , y BPV6 (en Papillomavirus and Human Cáncer, editado por H. Pfister (CRC Press, Inc. 1990)); Lancaster et al., Cáncer Metast. Rev. pp. 6653-6664, 1987; Pfister et al., Adv. Cáncer Res. 48:1 13-147, 1987)); virus de ARNds (v.gr., reovirus) ; virus de AR ss(+) (v.gr., picornavirus, virus de Coxsackie, virus de hepatitis A, poliovirus, togavirus, virus de rubéola, flavivirus, virus de hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus del Nilo Occidental); virus de ARNss(-) (v.gr., ortomixovirus , virus de la influenza, rabdovirus, paramixovirus , virus de la viruela, virus de paperas, virus de parainfluenza, rabdovirus, virus de la rabia); virus de ARNss-RT (v.gr., retrovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH)); y virus de ADNds-RT (v.gr., hepadnavirus , hepatitis B) . Inmunógenos aun pueden derivarse de otros virus no listados anteriormente pero disponibles a los técnicos en la materia.
Con respecto a VIH, inmunógenos pueden seleccionarse a partir de cualquier aislado de VIH. Como es conocido en la materia, aislados de VIH son ahora clasificados en sub-tipos genéticos discretos. VIH-1 se conoce por comprender por lo menos diez sub-tipos (A, B, C, D, E, F, G, H, J, y K) . VIH-2 se conoce por incluir por lo menos cinco sub-tipos (A, B, C, D, y E) . El sub-tipo B ha sido asociado con la epidemia de VIH en hombres homosexuales y usuarios de drogas intravenosas mundialmente . La mayoría de los inmunógenos de VIH-1, aislados adaptados en laboratorio, reactivos y epítopes mapeados pertenecen al sub-tipo B. En el África sub-sahariana, India, y China, áreas donde la incidencia de nuevas infecciones de VIH es alta, VIH-1 sub-tipo B cuenta por solamente una pequeña minoría de las infecciones, y el VIH-1 sub-tipo C parece ser el sub-tipo infeccioso mas común.
Por ende, en ciertas formas de realización, puede ser deseable seleccionar inmunógenos a partir de múltiples sub-tipos de VIH (v.gr., VIH-1 sub-tipos B y C, VIH-2 subtipos A y B, o una combinación de sub-tipos de VIH-1 y VIH-2) en una sola composición inmunológica . Inmunógenos adecuados de VIH incluyen ENV, GAG, POL, NEF, asi como variantes, derivados, y proteínas de fusión de los mismos, por ejemplo.
Inmunógenos también pueden derivarse de o dirigir una respuesta inmunológica contra una o mas especies bacterianas (spp.) (v.gr., antígenos de objetivo bacteriano) incluyendo, por ejemplo, Bacillus spp. (v.gr., Bacillus anthracis) , Bordetella spp. (v.gr., Bordetella pertussis) , Borrelia spp. (v.gr., Borrelia burgdorferi) , Brucella spp. (v.gr., Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis) , Campylobac-ter spp. (v.gr., Campylobacter jejuni) , Chlamydia spp. (v.gr., Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis) , Clostridium spp. (v.gr., Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani) , Corynebacterium spp. (v.gr., Corynebacterium diptheriae) , Enterococcus spp. (v.gr., Enterococcus faecalis, enterococcus faecum) , Escherichia spp. (v.gr., Escherichia coli) , Francisella spp. (v.gr., Francisella tularensis) , Haemophilus spp. (v.gr., Haemophilus influenza), Helicobacter spp. (v.gr., Helicobacter pylori) , Legionella spp. (v.gr., Legionella pneumophila) , Leptospira spp. (v.gr., Leptospira interrogans) , Listeria spp. (v.gr., Listeria monocytogenes) , Mycobacterium spp. (v.gr., Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis) , Mycoplasma spp. (v.gr., Mycoplasma pneumoniae) , Neisseria spp. (v.gr., Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis) , Pseudomonas spp. (v.gr., Pseudomonas aeruginosa) , Rickettsia spp. (v.gr., Rickettsia rickettsii) , Salmonella spp. (v.gr. , Salmonella typhi, Salmonella typhinurium) , Shigella spp. (v.gr., Shigella sonnei) , Staphylococcus spp. (v.gr., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophytics , estafilococo de coagulasa negativa (v.gr., patente US 7,473,762)), Streptococcus spp. (v.gr., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes) , Treponema spp. (v.gr., Treponema pallidum) , Vibrio spp. (v.gr., Vibrio cholerae) , y Yersinia spp. (Yersinia pestis) . Inmunógenos también se pueden derivar de o dirigir una respuesta inmunológica contra otras especies bacterianas no listadas anteriormente pero disponibles a los técnicos en la materia.
Inmunógenos también pueden derivarse de o dirigir una respuesta inmunológica contra uno o mas organismos parásitos (spp.) (v.gr., antígenos objetivo de parásito) incluyendo, por ejemplo, Ancylostoma spp. (v.gr., A. duodenale) , Anisakis spp., Ascaris lumbricoides , Balantidium coli, Cestoda spp., Cimicidae spp., Clonorchis sinensis, Dicrocoelium dendriticum, Dicrocoelium hospes, Diphyllobothrium latum, Dracunculus spp., Echinococcus spp. (v.gr., E. granulosus, E. multilocularis) , Entamoeba histolytica, Enterobius vermicularis , Fasciola spp. (v.gr., F. hepática, F. magna, F. gigantica, F . jacksoni) , Fasciolopsis buski, Giardia spp. (Giardia lamblia) , Gnathostoma spp . , Hymenolepis spp. (v.gr., H. nana, H. diminuta), Leishmania spp., Loa loa, Metorchis spp. (M. conjunctus, M. albidus) , Necator americanus, Oestroidea spp. (v.gr., éstridos) , Onchocercidae spp., Opisthorchis spp. (v.gr., 0. viverrini, 0. felineus, 0. guayaquilensis , y 0. noverca) , Plasmodium spp. (v.gr., P. falciparum) , Protofasciola robusta, Parafasciolopsis fasciomorp-hae, Paragonimus westermani , Schistosoma sp . (v.gr., S. mansoni, S. japonicum, S. mekongi, S. haematobium) , Spirometra erinaceieu-ropaei, Strongyloides stercoralis, Taenia spp. (v.gr., T. saginata, T. solium) , Toxocara spp. (v.gr., T. canis, T. cati) , Toxoplasma spp. (v.gr., T. gondii) , Trichobilharzia regenti, Trichinella spiralis, Trichuris trichiura, Trombiculidae spp., Trypanosoma spp., Tunga penetrans, y/o Wuchereria bancrofti. Inmunógenos también pueden derivarse de o dirigir una respuesta imunológica contra otros organismos parásitos no listados anteriormente pero disponibles a los técnicos en la materia.
Inmunógenos pueden derivarse de o dirigir una respuesta inmunológica contra antígenos de objetivo de tumor (v.gr., antígenos de objetivo de tumor) . El término antígeno de objetivo de tumor (TA) puede incluir tanto antígenos asociados a tumor (TAAs) y antígenos específicos de tumor (TSAs) , donde una célula cancerosa es la fuente del antígeno. Un TA puede ser un antígeno que se expresa sobre la superficie de una célula de tumor en mayores cantidades que se observa sobre células normales o un antígeno. que se expresa sobre células normales durante desarrollo fetal . Un TSA es típicamente un antígeno que es único a células de tumor y no se expresa sobre células normales. TAs son típicamente clasificados en cinco categorías de acuerdo con su patrón de expresión, función, u origen genético: antígenos de testes de cáncer (CT) (es decir, MAG, NY-ESO-1) ; antígenos de diferenciación de melanocitos (v.gr., Melan A/ ART-1, tirosinasa, gplOO) ; antígenos mutacionales (v.gr., MU -1, p53, CDK-4) ; antígenos "propios" sobre-expresados (v.gr., HER-2/neu, p53); y antígenos virales (v.gr., HPV, EBV) . TAs adecuados incluyen, por ejemplo, gplOO (Cox et al., Science 264:716-719, 1994), MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347-352, 1994), gp75 (TRP-I) ( ang et al., J. Exp. Med. 186:1131-1140, 1996), tirosinasa (Wolfel et al., Eur. J. Immunol . , 24:759-764, 1994), NY-ESO-1 (WO 98/14464; O 99/18206), proteoglicano de melanoma (Hellstrom et al . , J. Immunol., 130:1467-1472, 1983 ), antígenos de familia MAGE (v.gr., MAGE-1, 2, 3, 4, 6, y 12; Van der Bruggen et al., Science 254:1643-1647, 1991 ; patente US 6,235,525), antígenos de familia BAGE (Boel et al., Immunity 2:167-175, 1995), antígenos de familia GAGE (v.gr., GAGE-1,2; Vañ den Eynde et al., J. Exp. Med. 182:689-698, 1995; patent US 6,013,765), antígenos de familia RAGE (v.gr., RAGE-l; Gaugler eü al., Immunogenetics 44:323-330, 1996; patente US 5,939,526), N- acetilglucosaminiltransferasa-V (Guilloux et al., J. Exp. Med. 183:1173-1183, 1996), pl5 (Robbins et al . , J. Immunol . 154:5944-5950, 1995), ß-catenina (Robbins et al . , J. Exp. Med. , 183:1185-1192, 1996), MUM-I (Coulie et al . , Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92:7976-7980, 1995), quinasa-4 dependiente de ciclina (CDK4) (Wolfel et al., Science 269:1281-1284, 1995), p21-ras (Fossum et al., Int. J. Cáncer 56:40-45, 1994), BCR-abl (Bocchia et al . , Blood 85:2680-2684, 1995), p53 (Theobald et al . , Proc . Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11993-11997, 1995), pl85 HER2/neu (erb-Bl; Fisk et al. , J. Exp. Med. , 181:2109-2117, 1995), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Harris et al., Breast Cáncer Res. Treat, 29: 1-2, 1994), antlgenos carcinoembriónicos (CEA) (Kwong et al., J. Natl. Cáncer Inst., 85:982-990, 1995) patentes US 5,756,103; 5,274,087; 5,571,710; 6,071,716; 5,698,530; 6,045,802; EP 263933; EP 346710; y EP 784483; mucinas mutadas asociadas con carcinoma (v.gr., productos de gen MUC-I; Jerome et al . , J. Immunol . , 151:1654-1662, 1993); productos de gen EBNA de EBV (v.gr., EBNA-1; Rickinson et al., Cáncer Surveys 13:53-80, 1992); proteínas E7 , E6 de papilomavirus humano (Ressing et al., J. Immunol. 154:5934-5943, 1995); antígeno específico de próstata (PSA; Xue eü al., The Prostate 30:73-78, 1997) ; antígeno de membrana específico de próstata (PSMA; Israeli et al., Cáncer Res. 54:1807-1811, 1994); epítopes o antígenos idiotípicos, por ejemplo, idiotipos de inmunoglobulina o idiotipos de receptor de células T (Chen et al., J. Immunol. 153:4775-4787, 1994); KSA (patente US 5,348,887), quinesina 2 (Dietz et al., Biochera. Biophys . Res. Commun. 275 ( 3 ): 731-738 , 2000), HIP-55, factor anti-apoptósico TGF -l (Toomey et al., Br. J. Biomed. Sci. 58(3): 177-183, 2001), proteína de tumor D52 (Bryne et al., Genomics 35:523-532, 1996), H1FT, NY-BR-1 (WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87, y NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, en Cáncer Vaccines 2000, Cáncer Research Institute, Nueva York, NY) , y/o antígenos de cáncer pancreático (v.gr., SEQ ID NOs:l-288 de la patente US 7,473,531) . Inmunogenos también pueden derivarse de o dirigir la respuesta inmunológica contra TAs no listados anteriormente pero disponibles a los técnicos en la materia.
Además de las secuencias de inmunógeno específicas listadas anteriormente, la invención también incluye el uso de análogos de las secuencias. Tales análogos incluyen secuencias que son, por ejemplo, por lo menos 80%, 90%, 95%, o 99% idénticas a las secuencias de referencia, o fragmentos de las mismas. Los análogos también incluyen fragmentos de las secuencias de referencia que incluyen, por ejemplo, uno o mas epítopes inmunogenos de las secuencias. Además, los análogos incluyen truncaciones o expansiones de las secuencias (v.gr., inserción de epítopes adicionales/repetidos inmunodominantes/ayudantes) por, v.gr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20, etc., aminoácidos en cualquiera o ambos extremos. Truncación puede remover secuencias inmunológicamente no importantes o que interfieren, v.gr., dentro de dominios estructurales/inmunológicos conocidos, o entre dominios; o dominios no deseados enteros pueden suprimirse; tales modificaciones pueden estar en los rangos de 21-30, 31-50, 51-100, 101-400, etc. aminoácidos. Los rangos también incluyen, v.gr., 20-400, 30-100, y 50-100 aminoácidos.
Cocteles La invención también incluye composiciones que incluyen mezclas de dos o mas PIVs y/o vectores de PIV, como se describe en la presente. Como se discute anteriormente, el uso de tales mezclas o cocteles puede ser particularmente ventajoso cuando inducción de inmunidad a mas de un inmunógeno y/o patógeno se desea. Esto puede ser útil, por ejemplo, en vacunación contra diferentes flavivirus que pueden ser endémicos a la región en la cual reside el receptor de la vacuna. Esto también puede ser útil en el contexto de administración de múltiples inmunógenos contra el mismo objetivo.
Ejemplos no limitativos de cocteles de PIV incluidos en la invención son aquellos incluyendo PIV-JE + PIV-DEN, y PIV-YF + PIV-DEN. En ambos de estos ejemplos, los PIVs para cualquiera o ambos componentes pueden ser PIVs de un solo componente o de componentes duales, como se describe anteriormente. Además, en el caso del PIV-DEN, el PIV puede incluir secuencias de solamente un serotipo de dengue seleccionado a partir del grupo que consiste en serotipos de dengue 1-4, o el coctel puede incluir PIVs expresando secuencias de dos, tres, o todos los cuatro de los serotipos. Además, las vacunas de TBE/Borrelia burgdorfe-ri/proteína de saliva de garrapata (v.gr., 64TRP, Isac, Salp20) descritas en la presente pueden basarse en incluir los diferentes inmunógenos dentro de un solo PIV o flavivirus atenuado vivo, o pueden basarse en mezclas de PIVs (o LAVs) , las cuales incluyen uno o mas de los inmunógenos . Los cocteles de la invención pueden formularse como tales o pueden mezclarse justo previo a administración.
Uso, Formulación, y Administración La invención incluye los vectores de PIV, PIVs, vectores de LAV, y LAVs, así como moléculas de ácido nucleico correspondientes, composiciones farmacéuticas o de vacuna, y métodos de su uso y preparación. Los vectores de PIV, PIVs, vectores de LAV, y LAVs de la invención pueden usarse, por ejemplo, en métodos de vacunación para inducir respuesta inmunológica a TBE u otros flavivirus, y/u otro inmunógeno expresado, como se describe en la presente. Estos métodos pueden ser profilácticos, en cuyo caso son llevados a cabo en sujetos (v.gr., sujetos humanos u otros sujetos mamíferos) no teniendo, pero en riesgo de desarrollar infección o enfermedad ocasionada por TBE u otro flavivirus y/o un patógeno a partir del cual se deriva el otro inmunógeno expresado. Los métodos también pueden ser terapéuticos, en los cuales son llevados a cabo en sujetos ya teniendo una infección por uno o mas de los patógenos relevantes .
Además, los virus y vectores pueden usarse individualmente o en combinación entre sí o con otras vacunas. Los sujetos tratados de manera acorde con los métodos de la invención incluyen humanos, así como mamíferos no humanos (v.gr., ganado, tal como vacas, cerdos, caballos, ovejas, y cabras, y animales domésticos, incluyendo perros y gatos) .
Formulación de los vectores de PIV, PIVs, vectores de LAV, y LAVs de la invención puede llevarse a cabo usando métodos que son estándar en la materia. Numerosas soluciones farmacéuti-camente aceptables para uso en preparación de vacunas son bien conocidas y pueden adaptarse fácilmente para uso en la presente invención por los técnicos en esta materia (ver, v.gr., Reming-ton's Pharmaceutical Sciences (18ma. edición), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA) . En dos ejemplos específi-eos, los vectores de PIV, PIVs, vectores de LAV, y LAVs se formulan en sal de Earle de medio esencial mínimo (MEME) conteniendo 7.5% de lactosa y 2.5% de albúmina de suero humano o MEME conteniendo 10% de sorbitol . Sin embargo, los vectores de PIV, PIVs, vectores de LAV, y LAVs pueden simplemente diluirse en una solución fisiológicamente aceptable, tal como solución salina estéril o solución salina regulada estéril.
Los vectores de PIV, PIVs, vectores de LAV, y LAVs de la invención se pueden administrar usando métodos que son bien conocidos en la materia, y cantidades apropiadas de los virus y vectores a ser administrados puede determinarse fácilmente por los técnicos en la materia. Lo que se determina que es una cantidad apropiada de virus a administrar puede determinarse por consideración de factores tales como, v.gr., el tamaño y la salud general del sujeto al cual se va a administrar el virus. Por ejemplo, en el caso de virus atenuados, vivos, de la invención, los virus pueden formularse en soluciones acuosas estériles conteniendo entre 102 y 108, v.gr., 103 a 107, unidades infecciosas (v.gr., unidades formadoras de placa o dosis infecciosas de cultivo de tejido) en un volumen de dosis de 0.1 a 1.0 mi. PIVs pueden administrarse en dosis similares y en volúmenes similares; títulos de PIV sin embargo son usualmente medidos en, v.gr., unidades formadoras de foco determinadas mediante inmuno-manchado de focos, pues estas construcciones defectuosas no tienden a formar placas similares a virus. Dosis pueden variar entre 102 y 108 FFU y administrarse en volúmenes de 0.1 a 1.0 mi.
Todos los virus y vectores de la invención pueden administrarse por, por ejemplo, rutas intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , u oral. En ejemplos específicos, células dendríticas se apuntan por administración intradérmica o transcutánea, mediante el uso de, por ejemplo, micro-agujas o dispositivos de micro-abrasión. Además, las vacunas de la invención se pueden administrar en una sola dosis u, opcionalmen-te, administración puede involucrar el uso de una dosis cebadora seguida por una dosis potenciadora que se administra, v.gr., 2-6 meses después, según se determina siendo apropiado por los técnicos en la materia. Opcionalmente, vacunas de PIV pueden administrarse mediante inmunización de ADN o ARN usando métodos conocidos por los técnicos en la materia (Chang et al., Nat . Biotechnol. 26:571-577, 2008; Kofler et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101:1951-1956, 2004).
Opcionalmente, adyuvantes que son conocidos a los técnicos en la materia pueden usarse en la administración de los virus y vectores de la invención. Adyuvantes que pueden usarse para acrecentar la inmunogenicidad de los virus incluyen, por ejemplo, formulaciones liposomales, adyuvantes sintéticos, tales como (v.gr., QS21) , dipéptido de muramilo, monofosforil lípido A, polifosfazina, oligonucleótidos de CpG, u otras moléculas que parecen trabajar mediante activar moléculas de receptor similar a Toll (TLR) en la superficie de células o sobre membranas nucleares dentro de las células. Aunque estos adyuvantes son típicamejite usados para acrecentar respuestas inmunológicas a vacunas desactivadas, también pueden usarse con vacunas vivas o deficientes de replicación. Tanto agonistas de TLRs o antagonistas pueden ser útiles en el caso de vacunas vivas o deficientes de replicación. Los candidatos de vacuna pueden diseñarse para expresar agonistas de TLR. En el caso de un virus entregado mediante una ruta mucosal, por ejemplo, oralmente, adyuvantes mucosales tales como la toxina lábil al calor de E. coli (LT) o derivaciones mutantes de LT pueden usarse como adyuvantes. Además, genes que codifican a citoquinas que tienen actividades de adyuvante pueden insertarse en los candidatos de vacuna. Por ende, genes que codifican citoquinas deseadas, tales como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, IL-5, etc., pueden insertarse juntos con genes de inmunógeno foráneos para producir una vacuna que resulta en respuestas inmunológicas acrecentadas, o para modular inmunidad dirigida mas específicamente hacia respuestas celulares, humorales, o mucosales (v.gr., revisado en "Immunopotentia-tors in Modera Vaccines" , Schijns y O'Hagan eds . , 2006, Elsevier Academic Press : Amsterdam, Boston, etc.). Opcionalmente, un parche conteniendo una capa de un adyuvante derivado de toxina apropiado, puede aplicarse sobre el sitio de inyección. La toxina promueve inflamación local atrayendo linfocitos, lo cual lleva a una respuesta inmunológica mas robusta.
Ejemplos Detalles adicionales concerniendo a la invención son provistos en los ejemplos, siguientes. En los ejemplos, experimentos se describen en los cuales PIVs con base en virus , JE, y YF (ver, v.gr., WO 2007/098267 y WO 2008/137163) se probaron. Primeramente, se demostró que las construcciones son significativamente mas atenuadas en un modelo de neuro-virulencia de ratón lactante sensible (cero mortalidad en todas las dosis probadas) según se compara con controles de LAV disponibles (YF 17D, LAV de YF/JE, y LAV de YF/WN) . Se demostró por primera vez que las construcciones de d-PIV fueron avirulentas en este modelo y que los PIVs de dos componentes no sufren esparcimiento descontrolado ( ilimitado) in vivo y no pueden causar signos clínicos. Segundo, se llevaron a cabo comparaciones de la inmunogenicidad y eficacia de los PIVs y los LAVs, y se demostró que vacunas de PIV pueden inducir respuesta inmunológica comparable a LAVs y pueden ser igualmente eficaces (v.gr., como se observa para par de vacunas PIV-WN y LAV de YF/WN) . En un par examinado, LAV de YF 17D fue significativamente mas inmunógeno que PIV-YF. Por ende, producción de VLPs puede variar entre construcciones de PIV diseñadas de manera similar, diferentes. Específicamente, se propone que PIV-YF no genera una gran cantidad de YF VLPs comparada con PIV-WN (VLPs de N) , y que producción incrementada de VLPs puede lograrse por modificaciones genéticas en la unión C/;prM en construcciones de PIV sub-óptimas. Específicamente, la unión de C/prM es una ubicación importante en la poliproteína de flavivi-rus orquestando la formación de envoltura viral y síntesis de proteínas virales (Yamshchikov y Compans, Virology 192:38-51, 1993; Amberg y Rice, J. Virol . 73:8083-8094, 1999; Stocks y Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998). Se propone que la secreción de VLPs en células infectadas con PIV (en contraste con producción de partículas virales en virus enteros) ; puede incrementarse mediante desacoplamiento de las separaciones de proteasa y señalasa virales en la unión, o el uso de un péptido de señal heterólogo fuerte (tPA, etc.) en lugar de la señal para prM, o por mutagénesis de la señal para prM. La eficiencia de separación de señalasa en la unión C/prM de flavivirus es baja (Stocks y Lobigs, J. Virol . 72:2141-2149, 1998), v.gr., como se predice por el programa en línea SignalP 3.0. Se espera que eficiencia de separación mas eficiente puede lograrse por análisis de sustituciones de aminoácidos específicos cerca del sitio de separación con SignalP 3.0 (v.gr., como se describe en la solicitud WO 2008/100464) , seguido por incorporación de mutaciones elegidas hacia genomas de PIV, recuperación de progenie de PIV y medir secreción de VLP. Señales no de flavivi-rus se insertan por métodos estándar en la materia. Desacoplamiento entre las separaciones de proteasa y señalasa virales pueden lograrse mediante extirpar el sitio de separación viral por cualquier mutación no conservadora (v.gr., RRS en YF17D C a RRA o GRS o RSS, etc.) , o supresión del sitio entero o algunos de sus 3 residuos. Si es necesario, formación de terminales N libres de la señal de proteína foránea puede lograrse mediante usar tales elementos como autoproteasa, o codón de terminación seguido por un IRES . Alternativamente, el codón de iniciación AUG de C puede ser extirpado (en construcciones donde secuencia de proteína C es innecesaria, v.gr., AC PIV) y AUG colocado en frente del gen foráneo. Optimización de señal de vector puede llevarse a cabo por mutagénesis aleatoria, v.gr., por inserción de secuencia aleatorizada sintética seguida por identificación de variantes de PIV viables con secreción de VLP incrementada.
También se ha descubierto que construcciones de PIV fueron sustancialmente mas inmunógenas en hámsteres cuando se administran por la ruta IP, según se compara con la ruta subcutánea. Se concluyó que esto era mas probablemente debido a mejor apunte de células presentadoras de antígeno en tejidos linfoides, los cuales son abundantes en el abdomen, pero no abundantes en tejidos por debajo de la piel. Con base en estas observaciones, se concluyó que apunte eficiente de PIVs a células dendríticas, abundantes en la piel, se logró por inoculación cutánea, v.gr., mediante micro-abrasión de la piel o inyección intradérmica usando micro-agujas (Dean e al., Hum. Vaccin. 1:106-111, 2005) .
Además, se han llevado a cabo experimentos que muestran la factibilidad de administrar mezclas, o cocteles, de diferentes PIVs, tales como aquellos descritos en la presente (v.gr., JE+DEN y YF+DEN) . Para administrar cocteles, es importante verificar que no hay interferencia entre componentes co-administrados , y que una respuesta inmunológica balanceada se induce. Varias mezclas de PIV se usaron para inmunizar roedores y respuestas inmunológi-cas y se compararon con construcciones de PIV administradas individualmente. No se observó interferencia en mezclas, y por ende vacunas de PIV de coctel son factibles. Tales formulaciones pueden ser de significación particular en regiones geográficas donde diferentes flavivirus co-circulan. Esto también podría usarse para administrar simultáneamente varias vacunas a base de PIV contra patógenos no de flavivirus.
Además, se ha demostrado que ninguna respuesta de anticuerpo neutralizante se induce contra envoltura de empaque después de por lo menos dos dosis de PIV (y por ende anticuerpos son producidos contra VLPs secretados a partir de células infectadas) . Esto se demostró usando al componente ayudante (AprM-E) de un d-PIV (ver en la figura 2) empacado individualmente, o mediante medir anticuerpos neutralizantes a envolturas de empaque heterólogas (v.gr., a la envoltura WN usada para empacar PIV-JE en células ayudantes proporcionando proteínas C-prM-E específicas de WN en trans) . Estas últimas observaciones soportan uso secuencial de diferentes vacunas de PIV fabricadas en una línea de células de empaque ayudantes universal, y uso secuencial de diferentes vacunas de vector de PIV recombinantes en el mismo individuo, como se discute anteriormente. Además, se confirmaron observaciones previas que construcciones de PIV pueden propagarse de manera estable en altos rendimientos in vitro, y que ninguna recombinación restableciendo virus entero ocurre después de paso prolongado en células de sustrato (Masón et al., Virology 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol . 21:11737-11748, 2007) .
Estos y otros aspectos de la invención se describen adicionalmente en los ejemplos, siguientes.
Ejemplo 1. Estudios de desarrollo de plataforma de virus pseudo-infeccioso Atenuación en modelo de neuro-virulencia (NV) de ratón lactante Materiales usados en los estudios descritos a continua- ción y descritos en la Tabla 1 y en las referencias citadas en la misma. Estos incluyen s-PIV-W (con base en secuencias de cepa NY99 de virus WN wt) , s-PIV-JE, s-PIV-WN/JE (con base en esqueleto de virus WN wt y genes prM-E a partir de cepa Nakayama de virus JE wt) , s-PIV-F/WN (esqueleto YF 17D y genes prM-E a partir de virus WN) , y s-PlV-YF (con base en secuencias de YF 17D) . Materiales adicionales incluyen d-PIV-YF (d-PIV de YF, crecido en células BHK regulares (Shustov et al., J. Virol . 21:11737-11748, 2007), y d-PIV-WN de dos componentes (crecido en células Vero regulares; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008) .
Atenuación de estos prototipos de PIV se comparó con LAVs de YF 17D, un virus YF/JE quimérico, y un virus YF/WN quimérico en prueba de NV de ratón lactante (inoculación IC) usando ratones ICR de 5 días de edad altamente susceptibles (los virus quiméricos incluyen cápsida de fiebre amarilla y secuencias no estructurales, y secuencias prM-E de JE o WN) . Ninguno de los animales que recibió construcciones de PIV mostró signos clínicos o murió, mientras que mortalidad se observó en animales inoculados con LAVs (Tabla 2) . El virus YF 17D es neurovirulento para ratones de todas las edades, mientras que las vacunas quiméricas no son neurovirulentas para ratones adultos, pero pueden ocasionar mortalidad dependiente de dosis en ratones lactantes mas sensibles (Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004) . De manera acorde, 90%- 100% de ratones lactantes que recibieron dosis tan bajas como I PFU de YF 17D murieron. LAVs de YF/JE y YF/W ocasionaron mortalidad parcial a dosis mucho mas altas (> 2 log10 PFU y 3 log10 PFU, respectivamente) , con tiempo de supervivencia promedio mayor (AST) de animales que murieron, como se esperaba. Por ende, construcciones de PIV son completamente avirulentas en este modelo sensible (por lo menos 20,000-200,000 veces menos neuro-virulentas que la vacuna de YF 17D licenciada) .
Las d-PIV de YF y d-PIV de WN no ocasionaron ninguna mortalidad o señales clínicas. Por ende, las variantes de PIV de dos componentes que teóricamente podrían esparcirse dentro de tejido cerebral a partir de células co-infectadas por ambos de sus componentes no ocasionaron enfermedad. Mas aun, se trataron de detectar los d-PIVs en los cerebros de animales adicionales en este experimento, sacrificados en el día 6 post-inoculación por titulación, y no se detectó ninguno (tejidos cerebrales de 10 y II ratones que recibieron 4 log10 FFU de d-PIV de YF y d-PIV de WN, respectivamente, se homogeneizaron y se usaron para titulación) . Por ende, los d-PIVs no ocasionaron esparcimiento de infección característica de virus entero. LAV de YF/JE ha sido mostrado replicándose en el cerebro de ratones ICR adultos inoculados por la ruta IC con un título pico de ~6 log10 PFU/g en el día 6, aunque sin signos clínicos (Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999) . Co-infección de células con componentes de un d-PIV es claramente un proceso menos eficiente que infección con virus entero. Los datos mostraron que replicación de d-PIV in vivo es rápidamente llevada bajo control por respuestas inmunoló-gicas innatas (y respuestas adaptativas en animales mas viejos) . Inmunogenicidad/eficacia en ratones y hámsteres Inmunogenicidad/eficacia de los prototipos de PIV descritos anteriormente se comparó con aquellas de contrapartes de LAV quimérico y YF 17D en ratones y hámsteres sirios. El diseño de experimentos general se ilustra en la figura 3 (ratones, inmunización IP) . Experimentos en hámsteres se llevaron a cabo similarmente (mas menos unos cuantos días, inoculación SC o IP con dosis indicadas mas adelante) . Ratones ICR de 3-5 semanas de edad (para grupos de s-PIV-WN y -YF, LAV de YF/W , y YF 17D) o ratones C57/BL6 (para grupos de s-PIV-JE y LAV de YF/JE) se inmunizaron IP con dosis graduadas de construcciones de PIV (4-6 log10 FFU/dosis) o LAV quimérico y controles de LAV de YF 17D (4 log10 PFU) . Grupos de PIV-W , -JE y -YF selectos se potenciaron en el día 21 con 5 log10 FFU de construcciones correspondientes (Tabla 3) . Respuestas de anticuerpos neutralizantes se determinaron en sueros de animales por PR T50 estándar contra LAVs de YF/WN o /JE, o virus YF 17D. PIV-WN indujo respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas de WN altas en todos los grupos, con o sin potenciador, como es evidenciado por títulos de PRNT50 en conjuntos de sueros a partir de animales inmunizados en los días 20 y 34, que fue comparable a aquel en el grupo de control de LAV de YF/WN. De manera acorde, animales inmunizados con tanto PIV-WN y LAV de YF/WN se protegieron del reto letal en el día 35 con virus WN wt (IP, 270 LDS0) , pero no animales inmunizados de manera simulada (Tabla 3) . Cuando anticuerpos neutralizantes de WN se midieron en sueros a partir de ratones individuales, alta uniformidad de respuestas inmunoló-gicas se observó (figura 4) . Por ende, vacunas de PIV de una sola ronda pueden ser tan inmunógenas y eficaces como LAVs correspondientes. PIV-JE también fue altamente inmunógeno (ratones negros) , mientras que inmunogenicidad de PIV-YF fue significativamente menor comparada con el control de YF 17D (ratones ICR) . Sin embargo, protección dependiente de dosis de animales inmunizados con PIV-YF (pero no animales inmunizados de manera simulada) se observó después de un reto IC letal severo con virus YF wt cepa Asibi (500 LD50) (Tabla 3) , lo cual es una concordancia con el conocimiento de que títulos de anticuerpo neutralizantes tan bajos como 1:10 son protectores contra infecciones de flavivirus .
El virus de control YF 17D fue altamente inmunógeno (v.gr., título PRNT50 1:1,280 en el día 34), y por ende es capaz de infectar células y replicar de manera eficiente in vivo, y su envoltura es un inmunógeno fuerte. Por lo tanto, es poco probable que baja inmunogenicidad de PIV-YF fue debido a su incapacidad para infectar células o replicarse de manera eficiente en células infectadas in vivo. Se cree que la baja inmunogenicidad de PIV-YF (v.gr., comparada con PIV-WN) fue mas probablemente debida a una producción de bajo nivel de VLPs específicos de YF en células infectadas con PIV-YF (mientras que secreción de VLP es alta en células infectadas con Piv- N) . Como se discute anteriormente, se propone que inmunogenicidad de PIV-YF puede incrementarse significativamente, v.gr., por modificaciones apropiadas en la unión C/prM, v.gr., mediante desacoplar las dos separaciones de proteasa que ocurren en esta unión (separaciones de proteasa y señalasa virales) , y/o mediante usar una señal heteróloga fuerte [v.gr., señal de proteína G de virus de la rabia, o señal de activador de plasminógeno de tejido (tPA) eucariota (Malin et al., Microbes and Infection, 2:1677-1685, 2000), etc.] en lugar de la señal de YF para prM.
Un experimento similar se llevó a cabo en hámsteres sirios de ~4-5 semanas de edad, para comparar inmunogenicidad de construcciones de PIV a controles de LAV en este modelo. Animales se inmunizaron SC con dosis graduadas de los artículos de prueba (Tabla 4) . PIV-WN fue altamente inmunógeno, v.gr., títulos de PRNT50 específicos de WN en el día 38 (pre-reto) fueron 1:320, 1:640, y 1:1,280 en grupos que recibieron dosis de 5, 6, y 6 (cebado) + 5 (potenciado) log10 FFU, respectivamente. Esto fue un tanto menor comparado con control de LAV de YF/WN 4 log10 PFU (=1:2,560). PIV-JE y -YF indujeron respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas, aunque con títulos menores comparados con LAV de YF/JE y YF 17D. Todos los animales inmunizados con PIV-WN y YF/WN fueron protegidos de manera sólida contra reto letal con virus WN wt según es evidente por la ausencia de mortalidad y morbidez (v.gr. , pérdida de peso corporal después de reto) , asi como ausencia o una reducción significativa de viremia de virus WN post-reto. Animales inmunizados de manera simulada no fueron protegidos (Tabla 4) . PIV-JE y -WN protegieron a animales contra retos respectivos en forma dependiente de dosis. Eficacia protectora en este experimento se ilustra adicionalmente en la figura 5. Por ejemplo, viremia de virus YF (cepa Asibi adaptada a hámster) post-reto alta se observó en animales inmunizados de manera simulada, haciendo pico en el día 3 a un título de >8 log10 PFU/ml (panel izquierdo superior) ; todos los animales perdieron peso, y 1 de cada 4 murió (panel derecho superior) . En contraste, viremia se redujo significativamente o estuvo ausente en hámsteres inmunizados con PIV-YF (dos dosis; a pesar de títulos neutralizantes relativamente bajos) o YF 17D; ninguno de estos animales perdió peso. De manera similar, animales inmunizados con PIV-WN o LAV de YF/WN se protegieron significativamente o completamente en términos de viremia de virus WN post-reto y pérdida de peso corporal/mortalidad, en contraste con controles de simulación (comparar en paneles inferiores) . Por ende, inmunogenicidad/eficacia alta de PIV se demostró en un segundo modelo animal .
En otro experimento de hámsteres, animales fueron inmunizados con construcciones de PIV por la ruta IP, con dos dosis. La Tabla 5 compara respuestas inmunológicas neutralizantes (específicas para cada vacuna) determinadas en sueros conjuntados de hámsteres en el experimento anteriormente descrito (inoculación SC) con aquellas después de inmunización IP, para PIV-WN, -YF/WN, -WN/JE, y -YF después de la primera dosis (días 20-21) y la segunda dosis (días 34-38) . Un efecto claro de la ruta de inmunización se observó tanto después de la Ira. y la 2da. dosis. Por ejemplo, para PIV-WN después de la Ira. dosis, inmunización SC resultó en título PRNT50 específico de WN de 1:40, mientras que inoculación IP resultó en título mas alto 1:320 (y después de la 2da. dosis, títulos fueron similares) . Un efecto mas pronunciado se observó para otras construcciones después de tanto la Ira. y 2da. dosis. De manera interesante, PIV-YF/WN fue muy altamente inmunógeno por ruta IP (título 1:320 después de Ira. dosis IP contra 1:20 por SC, y 1:1,280 después de 2da. dosis contra 1:160 por SC) . De manera similar, inmunogenicidad de PIV-JE se incrementó significativamente (v.gr., título específico de JE de 1:640 después de dos dosis IP) . Por ende, mejor apunte de células linfoides, células presentadoras de antígeno específicas (las cuales son mas abundantes en el abdomen a diferencia de tejidos bajo la piel) , es una consideración importante para uso de vacunas de PIV. En humanos, apunte eficiente de células dendríticas de la piel, incrementando la magnitud de respuesta inmunoló-gica, puede lograrse por entrega intradérmica, la cual se propone para una ruta de inmunización PIV de humanos.
En los experimentos anteriormente descritos, también se determinó si una respuesta de anticuerpos neutralizantes se indujo contra envolturas de empaque (a diferencia de respuesta a VLPs codificados por construcciones de PIV y secretados por células infectadas) . Ningún anticuerpo neutralizante específico de WN se detectó por PRNT50 en animales inmunizados con 5 log10 FFU del segundo componente de d-PIV de WN, conteniendo la supresión AC-prM-E y por ende no codificando VLPs, sino empacado en la envoltura de WN en células ayudantes BHK-CprME (WN) , y ninguna actividad neutralizante específica de YF se encontró en sueros a partir de animales inmunizados con 4 log10 FFU del segundo componente de d-PIV de YF empacado en la envoltura de YF. Ninguna respuesta neutralizante específica de YF se indujo por dos dosis de PIV-YF/WN empacado en envoltura de YF, y de manera similar, ninguna respuesta específica de WN se indujo por dos dosis de PIV-JE empacado en envoltura de WN. La ausencia de respuesta neutralizante contra envolturas de empaque permite fabricar diferentes vacunas de PIV en una línea celular ayudante de manufactura (universal) , o inmunización de un individuo con diferentes vacunas recombinantes con base en el mismo vector, de acuerdo con la presente invención.
Cocteles de PIV Debido a que los PIVs sufren una sola (opcionalmente varias, pero limitadas) ronda de replicación in vivo, se consideró que mezclas de diferentes vacunas de PIV pueden administrarse sin interferencia entre construcciones individuales en la mezcla (coctel) . Para dilucidar si las vacunas de PIV pueden usarse en formulaciones de coctel, respuestas inmunológi-cas en ratones y hámsteres a varias construcciones de PIV dadas como mezclas se compararon con las mismas construcciones dadas individualmente. Resultados similares se obtuvieron en ambos modelos animales. Resultados de experimentos de ratón se muestran en la Tabla 6. Títulos de anticuerpos neutralizantes anti-JE similares se observaron en conjuntos de suero a partir de animales a los que fueron dadas una o dos dosis de ya sea mezcla de PIV-JE + PIV-WN o PIV-JE solo (1:20 contra 1:80 y 1:640 contra 1:160, para una y dos dosis, respectivamente) . De manera similar, títulos específicos de WN contra mezcla de PIV-JE + PIV-WN y PIV-WN solo fueron similares (1:320 contra 1:640 y 1:5,120 contra 1:5,120 para una y 2 dosis, respectivamente). Ninguna o poca respuesta específica cruzada se indujo mediante ya sea PIV-JE o -WN. El resultado también se confirmó mediante medir títulos de PRNT50 en suero a partir de animales individuales. Por ende, está claro que vacunas de PIV pueden administrarse eficientemente como cocteles, induciendo inmunidad contra dos o mas patógenos de flavivirus. Además, como se discute anteriormente, varios cocteles pueden hacerse entre vacunas de PIV no de flavivirus, o entre cualquiera de vacunas de PIV de flavivirus y no de flavivirus.
Estudios in vitro Diferentes prototipos de PIV se pasaron en serie hasta 10 veces en células BHK ayudantes, para s-PIVs, o en células Vero regulares, para d-PIVs. Muestras cosechadas después de cada paso se titularon en células Vero mediante inmuno-manehado . Construcciones crecieron a altos títulos, y no se observó recombinación restableciendo virus entero. Por ejemplo, PIV-W consistentemente creció a títulos de 7-8 log10 FFU/ml en células ayudantes BHK-CprME(WN) (conteniendo un replicón VEE expresando las proteínas C-prM-E de virus WN) , y d-PIV de W creció a títulos excediendo 8 log10 FFU/ml en células Vero, sin recombinación.
Ejemplo 2. PIV-TBE Candidatos de vacuna de PIV-TBE pueden ensamblarse con base por completo en secuencias a partir de virus de TBE wt o el virus Langat (LGT) relacionado serológicamente de manera cercana (virus atenuado naturalmente, v.gr., cepa wt TP-21 o su variante empíricamente atenuada, cepa E5) , o con base en secuencias quiméricas conteniendo al esqueleto (secuencias de cápsida y no estructurales) de YF 17D u otros flavivirus, tales como virus WN, y los genes de proteína de envoltura prM-E a partir de TBE, LGT, u otros flavivirus serológicamente relacionados a partir del sero-complejo TBE. Candidatos de LAV de YF/TBE se construyen con base en el esqueleto de YF 17D y los genes prM-E de TBE u otros virus relacionados (v.gr., la cepa E5 de LGT), similar a otras vacunas de LAV quimérico.
Construcción de prototipos de vacuna de PIV-TBE y LAV de YF/TBE se llevó a cabo mediante clonación de elementos genéticos apropiados hacia plásmidos para PIV-WN (Masón et al., Virology 351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol . 82:6942-6951, 2008), o plásmidos para LAVs quiméricos (v.gr., pBSA-ARl, una versión de un solo plásmido del clon infeccioso de LAV de YF/JE; WO 2008/036146) , respectivamente, usando métodos estándar en la materia de genética inversa. Las secuencias de prM-E de cepa Hypr de virus TBE (número de acceso GenBank U39292) y cepa E5 de LGT (número de acceso Genbank AF253420) fueron primero optimizadas en codones por computador para conformarse al uso de codones preferencial en el genoma humano, y para eliminar repeticiones de secuencia de nucleótidos mayores que 8 nt para asegurar alta estabilidad genética de insertos (si de determina que sea necesario, recorte adicional de repeticiones de secuencia de nt puede llevarse a cabo) . Los genes se sintetizaron química-mente y se clonaron hacia plásmidos para PIV-WN y LAV de YF/JE, en lugar de genes prM-E correspondientes. Plásmidos resultantes se transcribieron in vitro y células apropiadas (Vero para virus quiméricos, y células BHK ayudantes para PIV) se transíectaron con transcripciones de ARN para generar muestras de virus/PIV. Construcciones de LAV de YF/TBE En construcciones de YF/TBE conteniendo ya sea a los genes prM-E de TBE Hypr (plásmidos p42, p45, y p59) o LGT E5 (plásmido p43) , dos tipos diferentes de la unión C/prM se examinaron primero (ver en la figura 6/ uniones C/prM solamente se muestran en el apéndice de secuencias 1, y secuencias terminales 5' completas cubriendo 51 UTR-C-prM-E-comienzo de la región NS1 se muestran en el apéndice de secuencias 2) . La quimera YF17D/Hypr derivada de p42 contuvo un péptido de señal YF17D/Hypr híbrido para la proteína prM, mientras que la quimera YF17D/Hypr derivada de p45 contuvo un péptido de señal YF17D/WN híbrido para prM (apéndice de secuencias 1) . El virus quimérico anterior produjo títulos muy altos en tanto P0 (inmediatamente después de transfección) y Pl (el siguiente paso en células Vero), hasta 7.9 log10 PFU/ml, lo cual fue 0.5 log10 veces mayor, comparado con el último virus; además formó placas significativamente mayores en células Vero (figura 6) . Por ende, el uso de residuos específicos de TBE en el péptido de señal para prM confirió una ventaja de crecimiento significativa sobre los residuos específicos de W conteniendo señal. La quimera YF17D/LGT derivada de p43 tuvo la misma señal de prM como el virus derivado de p42; también produjo títulos muy altos en los pasajes P0 y Pl (hasta 8.1 log10 PFU/ml) y formó placas grandes. Un derivado del virus derivado de p42 también se produjo a partir del plásmido p59, el cual contuvo una mutación de atenuación fuerte caracterizada previamente en el contexto de un virus de vacuna de LAV de YF/WN, específicamente, una supresión de 3 aminoácidos en la proteína C específica de YF17D (PSR, residuos 40-42 en el comienzo de una a-hélice I; O 2006/116182) . Como se espera, el virus p59 creció a títulos menores (5.6 y 6.5 log10 PFU/ml en P0 y Pl, respectivamente), y formó placas pequeñas (determinadas en un experimento de titulación separado y por ende no mostradas en la figura 6) , comparado con la quimera derivada de p42 madre. Estas observaciones iniciales de propiedades de crecimiento de prototipos de LAV de YF/TBE, y correlación de replicación in vitro con morfologías de placa, han sido confirmadas en experimentos de curva de crecimiento (figura 8) .
Construcciones de PIV-TBE Variantes de PIV-WN/TBE se construyeron, y muestras de PIV empacadas se derivaron a partir de plásmidos p39 y p40 (figura 7; apéndice de secuencias 1 para secuencias de unión de C/prM, y el apéndice de secuencias 3 para 51 UTR-AC-prM-E-comienzo completo de secuencias NS1) . Estos contuvieron señales prM de Hypr o WN completas, respectivamente. Ambos PIVs se recuperaron exitosamente y se propagaron en células ayudantes BHK-CprME (WN) o BHK-C(WN) (Masón et al., Virology 351:432-443, 2006; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008) . Los títulos de muestra P0 y Pl del variante p39 fueron 0.2-1.0 log10 veces mayores que el variante p40. Además, células Vero infectadas con variante p39 se mancharon de manera mas brillante en el ensayo de inmunofluores-cencia usando un anticuerpo policlonal específico de TBE, comparado con p40, indicativo de replicación mas eficiente (figura 7) . La mayor tasa de replicación del candidato p39 que el candidato p40 se confirmó en un experimento de curva de crecimiento (figura 8) . En este último experimento, ambos candidatos parecieron crecer mejor en células ayudantes BHK-C(W ) comparadas con BHK-CprME (WN) , con el variante p39 alcanzando un título de ~7 log10 PFU/ml en el día 5 (nótese que títulos pico no se habían alcanzado) . El descubrimiento del efecto de la señal prM sobre las tasas de replicacion de candidatos de vacuna tanto de PIV y de LAV quimérico, y comparación de cabeza con cabeza de señales diferentes para generar la construcción replicando mas eficientemente y mas inmunógena (ver anteriormente) , son un aspecto distintivo de este enfoque. Como se discute anteriormente, la invención también incluye el uso de otras señales de flavivirus, incluyendo con mutaciones apropiadas, el desacoplamiento de separaciones de proteasa y señalasa virales en la unión C/prM, v.gr., mediante mutar o suprimir el sitio de separación de proteasa viral en la terminal C de C precediendo a la señal de prM, el uso de señales fuertes no de flavivirus (v.gr., señal tPA, etc.) en lugar de la señal de prM, así como optimización de secuencias corriente abajo del sitio de separación de señalasa.
Otras variantes de PIV-TBE con base por completo en virus TBE wt (cepa Hypr) y LGT (cepa TP21 de tipo silvestre o cepa E5 atenuada) , y secuencias de esqueleto YF 17 quimérico/prM-E (TBE o LGT) también se incluyen en la invención. Células ayudantes proporcionando proteínas apropiadas C, C-prM-E, etc. (v.gr., específicas de TBE) para complemento trans pueden construirse mediante transfección estable de ADN o a través del uso de un vector apropiado, v.gr., un replicón de alfavirus, tal como con base en la cepa VEE de TC-83, con selección de antibió- tico de células conteniendo replicón. Células Vero y BHK21 pueden usarse en la práctica de la invención. Las primeras son un sustrato aprobado para manufactura de vacunas humanas; cualquier otra línea celular aceptable para manufactura de vacunas humanas y/o veterinarias también se puede usar. Además de construcciones s-PIV, construcciones d-PIV también se pueden ensamblar. Para evaluar adicionalmente seguridad para vacunas y el ambiente, modificaciones apropiadas pueden emplearse, incluyendo el uso de codones degenerados y mutaciones complementarias en los elementos 5' y 3' CS, para minimizar las probabilidades de recombinación que teóricamente pudieran resultar en virus viable. Después de construcción, todos los candidatos de vacuna pueden evaluarse in vitro para capacidad de manufactura/estabilidad, e in vivo para atenuación e inmunogenicidad/eficacia, en modelos animales pre-clínicos disponibles, tales como aquellos usados en el desarrollo y control de calidad de vacunas de TBE y YF.
Neuro-virulencia y neuro-invasividad en ratones de construcciones de PIV-TBE y LAV de YF/ BE Ratones ICR adultos jóvenes (-3-5 semanas de edad) se inocularon con dosis graduadas de candidatos de PIV-TBE y LAV de YF/TBE por la ruta IC para medir neuro-virulencia, o ruta ?? para medir neuro-invasividad (y posteriormente inmunogenicidad/eficacia) . Animales que recibieron 5 log10 FFU de variantes PIV-Hypr (p39 y p40) por ambas rutas sobrevivieron y no mostraron señales de enfermedad, similar a animales inoculados de manera simulada (Tabla 7) , y por ende vacunas de PIV-TBE son completamente avirulentas . Ratones inoculados IC con control de YF 17D (1-3 log10 PFU) mostraron mortalidad dependiente de dosis, mientras que todos los animales inoculados IP (5 log10 PFU) sobrevivieron, de acuerdo con el conocimiento de que el virus YF 17D no es neuro-invasivo. Todos los animales que recibieron dosis IC graduadas (2-4 log10 PFU) de prototipos p42, p45, p43, y p59 de LAV YF/TBE murieron (animales moribundos fueron sometidos a eutanasia de manera humana) . Estas variantes parecieron ser menos atenuadas que YF 17D, v.gr. , como es evidente por mortalidad completa y AST mas corto en la dosis de 2 log10 PFU, la dosis mas baja probada para candidatos de LAV de YF/TBE. El fenotipo no neuro-virulento de PIV-TBE, fenotipo virulento de LAV de YF/TBE y fenotipo de virulencia intermedia de YF 17D también se ilustran en la figura 9, mostrando curvas de supervivencia de ratones después de inoculación IC. Deberá notarse que p43 (genes pr -E de LGT) y p59 (la variante de supresión dC2 de LAV de YF/Hypr) fueron menos neuro-virulentos que construcciones de LAV de YF/Hypr p42 y p45 como es evidente por valores AST mayores para dosis correspondientes (Tabla 7) . Además, candidatos p43 y p59 fueron no neuro-invasivos, mientras que p42 y p45 ocasionaron mortalidad parcial después de inoculación IP (5 log10 PFU/dosis) (Tabla 7; figura 10) . Deberá notarse sin embargo que todas de las construcciones de LAV de YF/TBE se atenuaron significativamente según se compara con los virus TBE wt, v.gr., comparados con virus TBE Hypr wt, los cuales son uniformemente altamente virulentos para ratones, pero a dosis IC (LD50 ~ 0.1 PFU) e IP (LD50 < 10 PFU) muy bajas (Wallner eü al., J. Gen. Virol . 77:1035-1042, 1996; Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998; Mandl et al., J. Gen. Virol. 78 : 1049-1057, 1997) .
Inmunogenicidad/eficacia de construcciones de PIV-TBE y LAV de YF/TBE en ratones Respuestas de anticuerpo neutralizante específicas de TBE en ratones inmunizados IP con una o dos dosis de las variantes de PIV-TBE o LAV de YF/TBE descritas anteriormente, o un control de vacuna TBE desactivada por formalina humana (1:30 de dosis humana) se miden. Animales han sido retados con una dosis IP elevada (500 PFU) de virus TBE Hypr wt; morbidez (v.gr., pérdida de peso) , y mortalidad después de reto se monitorizan. Inmunogenicidad/eficacia de construcciones de PIV-TBE y LAV de YF/TBE en ratones Respuestas de anticuerpo neutralizante específicas de TBE en ratones inmunizados IP con una o dos dosis de las variantes de PIV-TBE o LAV de YF/TBE descritas anteriormente (a partir del experimento en la Tabla 7) , o un control de vacuna de TBE desactivada por formalina humana (1:20 de dosis humana; una o dos dosis) , o YF 17D y controles de simulación, se midieron en el día 20 por PRNT50 contra virus TBE Hypr wt (Tabla 8; segunda dosis de artículos de prueba indicados fue dada en el día 14) . [Títulos se determinaron en sueros individuales, o sueros conjuntados a partir de dos animales en la mayoría de los casos, o sueros conjuntados a partir de 4 animales para YF17D y controles negativos de simulación] . Títulos en muestras de prueba individuales así como GMTs para cada grupo son provistos en la Tabla 8. Títulos en muestras de prueba fueron similares dentro de cada grupo, v.gr., en grupos inmunizados con PIVs, indicando alta uniformidad en la respuesta inmunológica en animales. Como se esperaba, ninguno de los anticuerpos neutralizantes específicos de TBE se detectaron en los grupos de control negativos (YF I7d y simulación; GMTs < 1:10); de manera acorde, animales en estos grupos no se protegieron de reto en el día 21 post-inmunización con una dosis IP alta (500 PFU) de virus TBE Hypr wt. Mortalidades a partir de observación parcial (en el día 9 post-reto; observación siendo continuada) son provistas en la Tabla 8, y dinámica de pesos corporales post-reto promedio indicativos de morbidez se muestran en la figura 11. Anticuerpos neutralizantes se detectaron en controles de vacuna muertos, los cuales fueron particularmente altos después de dos dosis (GMT 1:1,496); animales en el grupo de 2 dosis se protegieron por completo en que no hubo mortalidad o pérdida de peso corporal (pero no animales en el grupo de 1 dosis) . Animales que recibieron tanto una y dos dosis de PIV-Hypr p39 tuvieron títulos de anticuerpos muy altos (GMTs 1:665 y 1:10,584) y fueron protegidos de! manera sólida, demostrando que inmunidad protectora robusta puede inducirse por vacuna defectuosa de s-PIV-TBE. Los dos animales que sobrevivieron inmunización con quimera de YF/Hypr p42 (ver en Tabla 7) también tuvieron altos títulos de anticuerpos (GMT 1:6,085) y estuvieron protegidos (Tabla 8; figura 11) . De manera interesante, PIV-Hypr p40 y YF/Hypr p45 fueron pobremente inmunógenos (GMTs 1:15 y 1:153 para una y dos dosis, y 1:68 respectivamente) . Como se discute anteriormente, estas contuvieron secuencias específicas de WN en la señal para prM, mientras que las construcciones de PIV-Hypr p39 y YF/Hypr p42 altamente inmunógenas contuvieron secuencias de señal específicas de TBE. En concordancia con la discusión anterior, este resultado demuestra la importancia de elegir la señal prM correcta, v.gr., la señal específica de TBE, para lograr replicación de alto nivel/secreción de VLP, que en este experimento in vivo resultó en respuestas inmunológicas drásticamente diferentes. Inmunogeni-cidad de quimeras YF/LGT p43 y YF/Hypr dC2 p59 fue relativamente baja lo cual podría esperarse, debido al uso de una envoltura heteróloga (LGT, diferente de virus TBE de reto) y efecto altamente atenuante de la supresión dC2 , respectivamente.
Ejemplo 3. Expresión de gen foráneo En los ejemplos de construcciones de PIV recombinante descritas a continuación, genes de interés fueron optimizados en codones (v.gr., para expresión eficiente en un hospedero de vacunación objetivo) y para eliminar repeticiones de secuencia de nt largas para incrementar estabilidad de inserto (= 8 nt de longitud; recorte adicional de repeticiones puede llevarse a cabo si es necesario), y luego sintetizarse químicamente. Los genes fueron clonados hacia plásmidos de vector de PIV-W usando métodos estándar de biología molecular bien conocidos en la materia, y PIVs empacados se recuperaron después de transcripción in vi tro y transíección de células ayudantes (para s-PIV) o regulares (para d-PIVs) apropiadas.
Expresión de proteína G de virus de la rabia en s-PIV y d-PIV de WN El virus de la rabia, familia Rhabdoviridae, es un patógeno humano y veterinario significativo. A pesar de la disponibilidad de varias vacunas (muertas) , vacunas mejoradas aun son necesarias para uso tanto veterinario y humano (v.gr., como vacunas profilácticas pre-exposición no costosas) . La glicopro-teína G de virus de la rabia media entrada del virus hacia células y es el inmunógeno principal. Se ha expresado en otros vectores con el propósito de desarrollar vacunas veterinarias (v.gr., Pastoret y Brochier, Epidemio . Infect. 116:235-240, 1996; Li et al., Virology 356:147-154, 2006).
Proteína G de virus de la rabia de longitud completa (aislado de virus Pasteur original, número de acceso GenBank NC_001542) fue optimizada en codones, sintetizada químicamente, e insertada adyacente a las supresiones de AC, AprM-E y AC-prM-E en vectores de PIV-WN (figura 12) . Las secuencias de construcciones son provistas en el apéndice de secuencias 4. Diseños generales de las construcciones se ilustran en la figura 13. La proteína G entera conteniendo su propio péptido de señal se insertó en cuadro corriente abajo de la proteína WN C ya sea con la supresión AC (construcciones AC y AC-prM-E) o sin (AprM-E) y unos cuantos residuos a partir de la señal de prM. Auto-proteasa de virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV) 2A se colocó corriente abajo de la ancla terminal C de trans-membrana a G para proporcionar separación de la terminal C de G a partir de la poliproteína viral durante la traducción. El elemento FMDV 2A es seguido por señal específica de WN para genes prM y prM-E-NSl-5 en la construcción de AC, o señal para genes NS1 y NS1-5 en construcciones AprM-E y AC-prM-E.
PIVs de WN(AC) -rabiaG, WN (AprME) -rabiaG, y WN (ACprME) -rabiaG empacados se produjeron por transfección de células BHK ayudantes complementando la supresión de vector de PIV [conteniendo un replicón de virus de la encefalitis equina venezolana (cepa TC-83) expresando proteínas estructurales de virus WN para trans -complemento] . Replicación y expresión eficientes de proteína G de rabia se demostró para las tres construcciones por transíección/infección de células ayudantes de BHK-C(WN)y/o BHK-C-prM-E(WN), así como células BHK regulares, mediante inmuno-manchado y ensayo de inmuno- fluorescencia (IFA) usando anticuerpo monoclonal anti-rabia G (RabG-Mab) (figura 14) . Títulos se determinaron en células Vero por inmuno-manchado con el Mab o un anticuerpo policlonal de virus anti-WN. Curvas de crecimiento de las construcciones en células BHK-CprME (WN) después de transfec- ción con transcripciones de ARN in vitro se muestren en la figura 14, paneles inferiores. Los PIVs crecieron eficientemente a títulos ~6 a >7 log10 FFU/ml . De manera importante, títulos casi idénticos se detectaron por tanto manchado de RabG-Mab y anticuerpo de WN, lo cual fue la primera evidencia de la estabilidad genética del inserto. En células Vero infectadas con PIV, las cuales se fijaron pero no se permeabilizaron, manchado fuerte de membrana se observó por manchado RabG-Mab, demostrando que el producto se entregó de manera eficiente a la superficie celular (figura 15) . Esto último se conoce como siendo el pre-requisito principal para alta inmunogenicidad de G expresada. PIVs empacados individuales pueden esparcirse después de infección de células BHK ayudantes, pero no puede esparcirse en células reglares como se ilustra para PIV de WN(AC) -rabiaG en la figura 16. El hecho de que no hay esparcimiento en células BHK ingenuas demuestra que los genomas de ARN recombinantes no pueden empacarse no específicamente hacia vesículas de membrana conteniendo la proteína G, si se producen por células infectadas con PIV. Un resultado idéntico se obtuvo con la proteína G de otro rabdovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) , contrario a observaciones previas de empaque no específico de replicón de virus Semliki Forest (SFV) expresando proteína G de VSV (Rolls et al., Cell 79:497-506, 1994). Esto último es un aspecto de seguridad deseado . [Alternativamente, algún empaque no específico podría resultar en un esparcimiento limitado de PIV in vivo, potencialmente acrecentando la respuesta inmunológica anti-rabia. Esto último también podría ser un aspecto benéfico, dado que se demuestra que tal PIV es seguro] . La estabilidad del inserto de rabia G en los tres PIVs se demostró por pasajes en serie en células BHK-CprME (W ) ayudantes a MOI alto o bajo (0.1 o 0.001 FFU/célula) . En cada paso, sobrenadantes de células se cosecharon y se titularon en células regulares (v.gr., células Vero) usando inmuno-manehado con un anticuerpo policlonal anti-WN para determinar título de PIV total, o anticuerpo monoclonal anti-rabia G para determinar título de partículas conteniendo el gen G (ilustrado para MOI 0.1 en la figura 17; resultados similares se obtuvieron a MOI 0.001) . El PIV de WN(AC) -rabiaG fue estable para 5 pasajes, mientras que el título del PIV conteniendo el inserto comenzó a declinar en el pasaje 6, indicativo de inestabilidad de inserto. Esto podría esperarse, debido a que en esta construcción, el inserto de gen G grande (~1,500 nt) se combina con una supresión de ?? (-200 nt) , significativamente incrementando el tamaño global del genoma de ARN recombinante . En contraste, en PIVs de WN (AprME) -rabiaG, y WN (ACprME) -rabiaG, el inserto se combina con una supresión mucho mayor (~2,000 nt) . Por lo tanto, estas construcciones mantienen de manera estable al inserto para todos los 10 pasos examinados (figura 17) . Además, puede observarse en la figura 17 que en algunos pasos, títulos tan altos como 8 log10 FFU/ml, o mayores, se lograron para todos los tres PIVs, adicionalmente demostrando que PIVs pueden propagarse fácilmente en altos rendimientos.
Siguiendo inoculación in vivo individualmente, se espera que el s-PIV de W (?? -rabiaG induzca respuestas inmunoló-gicas de anticuerpos neutralizantes fuertes contra tanto virus de rabia y WN, así como respuestas de células T. Los PIVs de WN (AprME) -rabiaG y WN (ACprME) -rabiaG inducirán respuesta inmunológica humoral solamente contra rabia ya que no codifican a los genes prM-E de WN. La construcción de s-PIV de WN(AC)-rabiaG también puede co-inocularse con construcción de WN(AprME) -rabiaG en una formulación d-PIV (ver en la figura 12) , incrementando la dosis de proteína G expresada, y con inmunidad acrecentada contra tanto patógenos debidos a esparcimiento limitado. Como un ejemplo del esparcimiento, resultados de titulación en células Vero de una muestra de s-PIV, WN (AprME) -rabiaG, y una muestra de d-PIV, WN (AprME) -rabiaG + WN(AC) PIV (la última no codifica proteína G de rabia), se muestran en la figura 18. Infección de células Vero ingenuas con s-PIV solamente dio células individuales capaces de mancharse con RabG-Mab (o grupos pequeños formados debido a división de células) . En contraste, focos grandes se observaron después de infección con la muestra de d-PIV (figura 18, panel derecho) que fueron productos de coinfección con los dos tipos de PIV.
La construcción de WN (ACprME) -rabiaG puede usarse en una formulación de d-PIV, es co-inoculada con un genoma ayudante que proporciona C-prM-E en trans (ver en figura 12) . Por ejemplo puede ser un genoma de virus WN conteniendo una supresión de una de las proteínas NS, v.gr., NS1, NS3 , o NS5, las cuales se conocen por ser trans-complementables (Khromykh et al., J. Virol. 73:10272-10280, 1999; Khromykh et al., J. Virol. 74:3253-3263, 2000) . Se construyó un genoma WN-ANS1 (secuencia provista en el apéndice de secuencias 4) y se obtuvo evidencia de co- infección con construcciones de WN (AprME) -rabiaG o WN (ACprME) -rabiaG, y esparcimiento in vitro, mediante inmuno-manchado . En el caso de tales d-PIVs, la proteína de rabia G puede también insertarse y expresarse en genoma ayudante, v.gr., genoma WN-ANS1, para incrementar la cantidad de proteína G de rabia expresada resultando en una respuesta inmunológica anti-rabia incrementada. Como con cualquiera de las versiones de dPIV, un inmunógeno puede ser a partir de un patógeno (v.gr. , rabia G)y el otro a partir de un segundo patógeno, resultando en tres especificidades antigéni-cas de vacuna. Como se discute anteriormente, supresiones de ANSI pueden reemplazarse con o usarse en combinación con supresiones/mutaciones de ANS3 y/o ANS5, en otros ejemplos.
Expresión de proteína F de RSV en s-PIV y d-PIV de WN Virus sincitial respiratorio (RSV) , miembro de la familia Paramyxoviridae, es la causa principal de enfermedad severa del tracto respiratorio en niños jóvenes mundialmente (Collins y Crowe, Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovi-rus, en: Knipe et al. eds., Fields Virology, 5ta. ed., Filadel-fia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams y Wilkins, 2007:1601-1646). Proteína F de fusión del virus es un antígeno viral clave para desarrollar una vacuna segura y efectiva. Para evitar exacerbación post-vacunación de infección de RSV observada previamente con un candidato de vacuna desactivada con formalina, una respuesta Thl/Th2 balanceada a F se requiere la cual puede lograrse por mejor estimulación de TLR, un pre-requisito para inducción de anticuerpos de alta-afinidad (Delgado et al., Nat. Med. 15:34-41, 2009), lo cual debería lograrse a través de entregar F en un vector a base de virus robusto. Se ha demostrado previamente la capacidad de vectores de LAV quiméricos a base de virus de la fiebre amarilla para inducir una respuesta de Thl/Th2 balanceada, fuerte, in vivo contra un antígeno de influenza (WO 2008/036146). En la presente invención, tanto LAVs quiméricos y vectores de PIV a base de virus de la fiebre amarilla se usan para entregar RSV F para inducir perfil de respuesta inmunológica óptima. Otros LAVs y vectores de PIV descritos en la presente también pueden usarse para este propósito.
Proteína F de RSV de longitud completa de la cepa A2 del virus (número de acceso GenBank P03420) se optimizó por codones como se describe anteriormente, se sintetizó, y se clonó en plásmidos para s-PIV y d-PIV PIV- N, usando los esquemas de inserción mostrados en las figuras 12 y 13 para proteína G de rabia, mediante aplicar métodos estándar de biología molecular. Secuencias exactas de las inserciones y elementos genéticos circundantes son provistas en el apéndice de secuencias 5.
Transcripciones de ARN in vi tro de construcciones de PIV resultantes de WN(AC)-RSV F, W (AprME) -RSV F, y W (ACprME) -RSV F se usaron para transfectar células ayudantes BHK-CprME (WN) . Replicación y expresión eficiente de proteína de RSV F se demostró primero mediante inmuno-manchado de células transfecta-das con un Mab anti-RSV F, como se ilustra para la construcción de WN (AprME) -RSV F en la figura 19. La presencia de PIVs empacados en los sobrenadantes a partir de células transfectadas (título tan alto como 7 log10 FFU/ml) se determinó por titulación en células Vero con inmuno-manchado . Adicionalmente, construcciones similares pueden usarse que contienen un gen de proteína F de longitud completa modificado. Específicamente, el péptido de señal nativo terminal N de F es reemplazado en proteína F modificada con uno de proteína G de virus de la rabia. La modificación tiene la intención de dilucidar si el uso de una señal heteróloga puede incrementar la tasa de síntesis de proteína F y/o replicación de PIVs.
Tabla 1. Construcciones prototipo de PIV usadas en estudios desarrollo de plataforma Construcción Composición Genética Empacado en PIV-WN virus N NY99 t Envoltura WN; células ayudantes BHK-CprME (WN) O BHK- (WN) (Masón et al., Virology 2006, 351:432- 43; Widman et al., Vaccine 2008, 26 : 2762-71) PIV-YF/WN Envoltura (VLP) : WN NY99 wt Envoltura YF 17D; células ayudanEsqueleto: YF 17D tes BHK-CprME (YF) (Widman et al., Adv. Virus Res. 2008, 72:77-126) PIV-WN/JE Envoltura (VLP) : JE Nakayama wt Envoltura JE o WN; células ayuEsqueleto: WN NY99 wt dantes BHK-C(WN) o BHK-CprME (WN) (Ishikawa et al., Vaccine 2008, 26:2772-8) PIV-YF YF 17D Envoltura YF 17D; células ayudantes BHK-CprME (YF) O BHK-C(YF) (Masón et al., Virology 2006, 351:432-43) Tabla 2. Seguridad: Neuro-virulencia de ratones lactantes1 1 Una sola dosis, inoculación IC, ratones ICR de 5 días de edad, dosis log calificadas administradas . 2 AST para ratones que murieron; na, no aplicable.
Tabla 3. PIV altamente inmunógeno y eficaz en ratones1 1 Inmunización IP (cebador do, y potenciador d2l en grupos selectos) ; reto en d35: WN NY99 wt, 3 log10 PFU IP, 270 LDS0; YF Asibi wt , 3 logl0 PFU IC, 500 LD50; N/D, no determinado Tabla 4. PIV son inmunógenos en hámsteres y protegen contra Grupo Dosis PRNT POST- ETO Día 38 Mortalidad Morbidez Viremia pico (log) PIV-WN 105 320 0/5 (0%) 0/5 (0%) 2.3 10' 640 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1.8 105+105 1280 0/5 (0%) 0/5 (0%) <1.3 control YF/WN 104 22560 0/5 (0%) 0/5 (0%) <1.3 PIV-WN/JE 104 20 2/5 (40%) 2/5 (40%) 2.2 105+10s 40 0/5 (0%) 0/5 (0%) <1.3 control YF/JE 104 2560 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1.3 PIV-YF 104 <10 1/3 (33%) 3/3 (100%) 8.3 105 <10 1/5 (20%) 4/5 (80%) 8.3 105+105 20 0/4 (0%) 0/4 (0%) 2.5 control YF17D 104 22560 0/4 (0%) 0/4 (0%) <1.3 Control de simulación reto WN Diluyente <10 3/4 (75%) 4/4 (100%) 4.0 reto YF Diluyente <10 1/4 (25%) 4/4 (100%) 8.4 • reto JE Diluyente <10 2/5 (40%) 2/5 (40%) 3.0 1 Hámsteres sirios, inoculación se (do, y d2l en grupos selectos) ; reto (d39) WN NY385/99 wt 6 log10 PFU IP, JE Nakayama wt 5.8 loglO PFU IC, o YF Asibi adaptado a hámsteres 7 log10 PFU IP, (McArthur et al., J.virol. 77:1462-1468, 2003; McArthur et al., Virus Res. 110:65-71, 2005).
Tabla 5. Inmunización de hámsteres con PIV: comparación de rutas SC e IP Inoculoa PRNT Día 20-21 Potenciador PRNT Día 34-38 og10) SC IP SC IP PIV-WN 40 320 5 1280 1280 PIV-YF/WN 10 320 5 160 1280 PIV-WN/JE 10 80 5 40 640 PIV-YF <10 10 5 20 80 Tabla 6. Respuestas inmunológicas a cocteles PIV (ratones)1 1 Ratones C57/BL6, inoculaciones IP en días 0 y 21; títulos PRNT de suero conjuntados.
Tabla 7. Neuro-virulencia (inoculación IC) y neuro-invasividad (inoculación IP) de construcciones de vacuna PIV-TBE y YF/TBE en ratones ICR adultos ' AST para ratones que murieron.
Tabla 8. Títulos de anticuerpo neutralizante (PRNT50) en ratones inmunizados IP (determinados contra virus TBE Hypr wt) , y protección contra reto (observación post-reto , día 9) Inmunógeno Dosis, Título PRNTS0, PRNTso Mortalidad postlog10 muestras indiv.1 GMT reto ( ) en día 9' PIV-Hypr p39, 1 dosis 5 1746 (2) 665 0/8 (0%) 1187 (2) 164 (2) 574 (2) PIV-Hypr p39, 2 dosis 5+5 16229 (2) 10, 584 0/8 (0%) 12928 (2) 12927 (2) 4627 (2) PIV-Hypr p40, 1 dosis 5 <10 (2) 15 6/8 (75%) <10 (2) 18 (2) 33 (2) PIV-Hypr p40, 2 dosis 5+5 169 (2) 153 1/8 (12.5%) 638 (2) 26 (2) 192 (2) YF/Hypr p42 5 9210 (1) 6,085 0/2 (0%) 4020 (1) YF/LGT p43 5 123 (2) 68 1/8 (12.5%) 32 (2) 96 (2) 45 (2) YF/Hypr p45 5 292 (2) 68 0/3 (0%) 16 (1) YF/Hypr dC2 p59 5 194 (2) 12 0/8 (0%) 93 (2) 45 (2) 26 (2) Vacuna TBE humana muerta, 1/20 19 (2) 1, 496 1/8 (12.5%) I dosis (a 1/20 de dosis humana) <10 (2) 13 (2) <10 (2) Vacuna TBE humana muerta, 1/20+1/20 3435 (2) <10 0/6 (0%) 2 dosis (a 1/20 de dosis humana) 1267 (2) 770 (2) Control YF 17D 5 <10 (4) <10 5/8 (62.5%) 11 (4) Simulación ninguna <10 (4) 4/8 (50%) <10 (4) 1 Números en paréntesis corresponden a número de ratones en cada muestra de suero conjuntada probada. 2 Mortalidades en día 9 se muestran.
Tabla 9. Ejemplos de mutaciones de proteína E atenuantes publicadas que pueden usarse para atenuación de candidatos de LAV de TBE quiméricos Residuo Dominio Comentarios Atenuación en Referencia N52R II Articulación DI-DII, posiblemente involucrado JE, YF Hasegawa et al., 1992 en movimiento de articulación requerido para Schlesinger et al., 1996 activación de fusión E84K II conservado, E en TBE , K/R en otros, atenuado TBE Labuda et al., 1994 por pasaje en garrapatas Ixodes ricinus, DII contiene epítopes reactivos cruzados con fla- vivirus E85K II Conservado, E en TBE, K/R en otros, atenuación JE Wu et al. , 1997 obtenida como variantes de placa en células Vero, DII contiene epítopes reactivos cruzados con flavivirus H104K II Dentro de péptido de fusión altamente conserTBE Rey et al. , 199S vado (aa 98-113) , H en TBE, G en otros L107F II Dentro de péptido de fusión altamente conserTBE, JE, WN Rey et al . , 1995 vado (aa 98-113), L en todos los flavivirus, F Arroyo et al . , 1999 , en JE atenuado 2004 T123K II Articulación DI-DII, T en TBE, A en FD TBE Holzmann et al. , 1997 K126E II Articulación DI-DII, K en TBE, E en D-2 DEN2 Bray, 98 K136E II Articulación DI-DII, K en TBE y JE, E en D-2 JE N154L(Y) I Sitio de glicosilación, empacado con H 104 DEN2 , DEN4 , Guirakhoo et al., 1993 conservado, involucrado en fusión YF Pletnev et al. , 1993 Kawano et al . , 1993 Jennings et al., 1994 171E I Borde externo de DI, involucrado en fusión TBE Mandl, 1989, Holzmann, 1997 I173T Borde externo de DI, involucrado en fusión YF Chambers y Nickells, 2001 D181Y Articulación DI-DII TBE Holzmann et al., 1997 K204R Bolsa hidrófoba de revestimiento, involucrado DEN1 , DEN3 Guirakhoo et al., 2004 en fusión P272S II Altamente conservado, unión de una de las 2 JE Cecilia et al., 1991 hélices alfa G308N III Unión celular, DKT en TBE, EGS en KFD, T-X en LI Jiang et al. , 1993 otros, cambio al sitio de glicosilación produGao et al. , 1994 cido N en LI y virulencia reducida, motivo de glicosilación N-X-T/s S310K III Unión celular putativa, cambio de E a G en JE Jiang et al. , 1993 virulencia reducida a JE Gao et al. , 1994 Wu et al. , 1997 K311E III Altamente conservado, unión celular putativa TBE, YF Rey et al. , 1995 Jennings, 1994 T333L III Unión celular putativa YF, LGT Raynman et al., 1998 G334K III Unión celular putativa YF Chambers y Nickells, 2001 S335K III Unión celular putativa JE Wu et al. , 1997 K336D III Unión celular putativa JE Cecilia y Gould, 1991 P337D III Unión celular putativa JE Cecilia y Gould, 1991 G368R III Unión celular putativa TBE, JE Holzmann et al., 1997 Hasega a et al., 1992 Y384H III Cambio a TBE atenuado por H, unión celular TBE Holzmann et al., 1990 putativa, posición -3 a RGD suprimido en TBE V385R III Conservado, posición -2 a RGD suprimido en D2 Hiramatsu et al., 1996 TBE, unión celular putativa Lobigs, 1990 G386R III Altamente conservado, posición -1 a RGD supriD2, MVE Hiramatsu, 1996 mido en TBE, unión celular putativa Lobigs et al. , 1990 E387R III Conservado, posición +2 a RGD suprimido en D2, MVE Hiramatsu, 1996 TBE, unión celular putativa Lobigs et al., 1990 F403K ninguno Altamente conservado, región terminal C no D-2, D-4 Kawano et al., 1993 incluida en estructura de cristal SE Bray et al. , 1998 H438Y ninguno Altamente conservado, región terminal C no LGT Campbell y Pletnev, 2000 incluida en estructura de cristal Se H496R ninguno Altamente conservado, región terminal C no TBE Gritsun et al., 2001 incluida en estructura de cristal Se Referencias: Hasegawa et al., Virology 191 (1) : 158-165 ; Schlesin-ger et al., J. Gen. Virol . 1996, 77 (Pt 6) : 1277-1285 , 1996; Labuda et al., Virus Res. 31 (3) : 305-315, 1994; Wu et al., Virus Res. 51 (2) :173-181 , 1997; Holzmann et al., J. Gen. Virol. 78 (Pt 1) :31-37, 1997 ; Bray et al . , J . Virol . 72 (2) : 1647-1651, 1998; Guirakhoo et al., Virology 194 (1) : 219-223 , 1993; Pletnev et al., J. Virol. 67 (8) :4956-4963, 1993; Kawano et al., J. Virol . 67 (11) : 6567-6575, 1993; Jennings et al., J. Infect . Dis. 169 (3) : 512-518, 1994; Mandl et al., J. Virol. 63 (2) : 564-571, 1989; Chambers et al., J. Virol. 75 (22) : 10912-10922 , 2001; Cecilia et al., Virology 181 (i) : 70-77, 1991; Jiang et al., J. Gen. Virol. 74 (Pt 5): 931-935, 1993; Gao et al., J. Gen. Virol. 75 (Pt 3):609-614, 1994; Holzmann et al., J. Virol. 64(10) :5156-5159, 1990; Hiramatsu et al., Virology 224 (2) : 437-445 , 1996; Lobigs et al., Virology 176 (2) :587-595, 1990; Campbell et al., Virology 269 (1) : 225-237 , 2000; Gritsun et al., J. Gen. Virol. 82(Pt 7) : 1667-1675, 2001. o Apéndice de Secuencias 1 CV-TBEV Hypr o CV-LGT ET con señal quimérica YFV/TBEV (construcciones p42, p59, y p43) (SEQ ID NOS: 28-30) CV-TBEV Hypr con señal quimérica YFV/WNV (p45)(SEQ ID NOS: 31-33) RV-WNV/TBEV Hypr con señal TBEV (p39) (SEQ ID NOS: 34-36) RV-WNVrTBEV Hypr con señal WNV (p40) (SEQ ID NOS: 37-39) o Apéndice de Secuencias 2 CV-TBEV Hypr con señal quimérica YFV/TBEV (p42) (SEQ ID NOS: 40-42) o • ? G ? K Y H t K S G H V T C K V G L E L M K G L T Y T H C D K CGAAGGAACG AAGTAC ACC TGAAGTCAGG CCATGTAACT TGCCAQGTGG GCCTGGAGAA GTTGAAAATG AAAGGTCTTA CGTACACAAT GTGTGACAAG ecrrCCTTGC TTCATGGTGG ACTTCAGTCC GGTACATTGA ACGCTCCACC OKiftCeTCTT AACTTTTAC TTTCCAGAAT GCATG GTTA CACACTGTTC proteína E de Hypr T K P T W K R A P T D S G H D T V V H E V T F S C T K P C R I P V R ACCAAGTTCA CATGGAAGAG GGCCCCCACA GATAGCGGCC ACQATÁC GT GGTOAK-GAG GTGACCTTTT CTGGAACAAA ACC TGCAGA ATACCCGTGC TGGTTCAAGT GTACCTTCTC CCOGGGGTGT CTATCGCCGG TCCTATGACA CCACTACCTC CACTGGAAAA GACCTTGTTT TGGGACGTCT TATGGGCACG proteina E de Hypr • A V A H G S P D N V A M L I T P K P T I E M N G G G G I E M 0 I. - GGGCTGTAGC TCACGOATCT (XCGATGTCft ATGTTGCTÁT GCTGATTACA CCTAACCCTA CCATCGAGAA TAACGGTGGT GGTT TATTG AGATGCAGCT CCCOACATCG ASTGCCTAGA GQGC ACAGT TACAACGATA CGACTAATGT GGAT GGGAT GOTAGCTCTT ATTGCCACCA CCAAAATAA TCTACGTCGA proteína E de Hypr • P P G D H I I X V G E L S Y 0 K F Q K G S 3 I G R V P Q K T K G TCCGCCAGGC GATAACATCA TCTACGTCGG CGAACTCTCT TACCAGTGGT TTCAGAAAGG. GAGTTCAATT GGGCGGGTCT TCCAAAAAAC GAAGAAGGGA AGGCGGTCCG CTATTGTAGT AGA GCACCC GCTTGAGAGA A GGTCACCA AAGTCTTTCC C CAAGTTAA CCCGCCCAGA AaGTTTTTTO C TCTTCCCT proteína E de Hypr I E L T V I G S K A W D P G S A G G P L S S I G K A L H T V L G G ATCGAACGAT TGACGGTTAT CGCCGAGCAC GCATGGGATT TTGGTTCCGC AGGGGGATTC CTGTCT CTA TTGGTAAGGC ACTGCATACC GTGCTGGGGG TAGCTTGCTA ACTGOCAATA Ck GCTCOTG CGTACOCTAA AACCAAGGCO TCCCCCTAAG GACAGAASAT AACCÁTTCCG TOACGTATGG CACGACCCCC proteína E de Hypr • A F M S I P G G V G F L P K L L L G V A L A » L G L H M R S P T M · GCGCATTCAA TTCTATTTTC GGGGGCGTQG GGTTCCTGCC TAAACTCCTG CTGGGAGTAG CCCTGSCCTG GTTGGGACTG AATATGCGGA ATCCGACGAT O OGCCTAAGTT AAGATAAAAG ' CCCCCGCACC CCAAGGACGG ATTTGAGGAC GACCCTCATC GGGACCGGAC CAACCCTGAC TTATACGCCT TAGGCTGCTA proteína E de Hypr gen HS1 de Y 17D S M S P L Ii A G V L V L A H T L G V G A D Q G C I tf P G K R B L 2401 GTCCATGTCA TTCCTCTTGG CCGGCGTSCT TGTACTGGCC ATGACACTGG GCGTTGGCGC CGATCAAGGA TGCGCCATCA ACTTTGGCAA GAGAGAGCTC CAGGTACAGT AAGGAGAACC GGCCGCACGA ACATGACCGG TACTGTGACC CGCAACCGCG GCTAGTTCCT ACGCGGTAGT TGAAACCGTT CTCTCTCGAG CV-TBEV Hypr con señal quimérica YFV/WNV (p45) (SEQ ID NOS: 43-45) S' ÜTR 1 ACTAAATCCT GTGTGCTAAT TGAGGTGCAT TBGTCTGCAA ATCGAGTTGC TAGGCAATAA ACACATTTGC ??????G??? ATCGTTCOTT GAGCGATTAG TCATTTAOGA CACACGATTA ACTCCACOTA ACCAGACGTT TAGCTCAACG ATCCGTTArT TGTGTAAACC TAATTAAAAT TAGCAAGCAA CTCGCTAATC 5' DTR proteína C de YP17D H S G R K A Q G K · T L G V N B U R R G V R S L S N K I K CAGAQAACTG ACCAGAACAT GTCTGGTCGT AAAGCTCAGG GAAAAACCCT GGGCGTCAftT ATGGTACGAC GAGGAGTTCG CTCCTTGTCA AACAAAATAA GTCTCTTGAC TGGTCTTGTA CAGACCAGCA TTTCGAGTCC CTTTT QGGA CCCGCAGTTA TACCAXGCTG CTCCTCAAGC GAGGAACAGT TTGTTTTATT protelna C de YP17D - 109- o • M G P A T L A 8 B H Q G G T V C K R D Q S D R G W G N H C G L P G 1201 AATSGGACCG GCCACCCTGG CGGAGGAACA TCAGGGAGG ACAGTGTGCA AACGGGACCA GAG GATAGA GGCTGGGGTA ATCACTGCGG CCTGTTCGGC TTACCCTOGC CGGTGGGACC GCCTCCTTGT AGTCCCTCCA TGTCACACGT TTGCCC GGT CTCAC ATC CCOACCCCAT TAGTGACGCC GGACAAGCCG prateina E de Hypr K G S I V A C V K A A C B A K K K A T G H V Y D A N K T V Y T V K V 1301 AAAGGAAGTA TTGTCGCTTG CGTCAAOGCA GCCTGTGAGG CCAAAAAG GGCTACTGGG CACGTCTATG ACGCCAACAA GATCGTTTAT ACAGTGAAAG TTTC TTCAT AACAGCGAA GCAGTTCCGT CGGACACTCC GTrTTTXCTT CCGATGACCC GTCCAGATAC TGCGGTTGTT CTAGCAAATA TGTCACTTTC proteina E de Hypr • 8 P H I G D Y V A A N E T B S G S K T A S F T V S S B K T I L T M H01 TGGAACCACA CACAGGGGAT TACGTGGCGG CCAACGAGAC TCATTCCGGT CGCAAAACGG CCAGCTTCAC CGTGTCATCC GAAAAGACCA TCCTCACTAT ACCTTGGTGT GTGTCCCC A ATGCACCGCC GGTTGCTCTC AGTAAGGCCA GCG TTTGCC GGTCGAAGTG GCACAGTAGG CTT TCTGGT AGGAGTGATA proteina E de Hypr ¦ G B Y G D V S L L C R V A S G V D L A Q T V I L E L D K T V 8 B - l 1501 GGGGGAGTAT GGCGACOTTT CTCTGCTCTG CCGGGTGGCT AGCGGAGTCG ACCTGGCCCA GACAGTCATC CTGGAACTGG ATAAAACAGT TGAGCATCTG COCCCTCATA CCGCTCCAAA GAGACGAGAC GGCCCACCCA TCGCCTCAGC TGGACCGGGT CTGTCAGTAG GACCTTGACC TATTTTGTCA ACTCGTAGAC proteina E de Hypr P T A W O V H H D W F N D L A L P K K H B G A R N W H N A E R L V E 1601 CC ACCGCTT GGCAGGTGCA CAGGGATTGG TTTAACGACC TTGCCCTGCC ATGGAAACAT GAAGGAOCGA GAAACTCGAA TAATGCAGAG CGACTCGTAG GGATGGOGAA CCGTCCACGT GTCCCTAACC AAATTGCTGG AACGGGACGG TACCTTTGTA CTTCCTCGCT CTTTGACCTT ATTACGTCTC GCTGAGCATC proteina E de Hypr • F G A P H A V fC M D V Y N L G D Q T G V L L A L A G V P V A B I ?01 AATTCGGTGC CCCTCATGCC GTGAAGATGG AOGT TACAA TCTGGGTGAT CAGACCGGCC TTCTCCTTAA AGCTCTCGCT GOCGTACCAG TTGCCCACA? GGGAGTACGG C¾CTTCTACC TGCAGATGTT AGACCCACTA GTCTCGCCGC AAGAGGAATT TCGAGAGCGA CCGCATGGTC AACGGGTGTA proteina E de Hyp - B O T K Y H L S G H V T C B . G L E K I. K M K G L T Y T M C D K 1801 CGAAGGAACG AAQTACCACC TGAAGTCAGG CCATGTAACT TGCGAGGTGG GCCTGGACAA GTTGAAAATG AAAGGTCTTA CGTACACAAT GTGTGACAAG GCTTCCTTGC TTCATGGTGG ACTTCAGTCC GGTACATTGA ACGCTCCACC CGGACCTCTT CAACTTTTAC TTTCCAGAAT GCATGTGTTA CACACTGTTC proteina E de Hypr T K P T W Jt R A P T D S G H D T V V M E V T P S G T K P C R I P V R 1901 ACCAAGTTCA CATGGARGAG GGCCCCCACA GATAGCGGCC ACGAIACTGT GGTGATGGAO GTSACCTTTT CTGGAAJCAAA ACCCTGCAGA ATACCCGTGC TGGTTCAAGT GTACCTTCTC CCGGCGGTGT CTATCGCCGG TGCTATGACA CCACTACCTC CACTGGAAAA GACCTTGTTT TGGGACGTCT TATGCGCACG proteina E de Hypr • A V A H G S P D V N V A K L I T N P T I B N N G G . O F I E M O L 2001 GGGCTGTAGC TCACGGATCT CCCGATGTCA ATGTTGCTAT GCTOATTACA CCTAACCCTA CCATCGAGAA TAACGGTGGT GGTTTTATTG AGATGCAGCT CCCBACATCG AGTGCCTAGA GGGCTACAGT TACAACGATA CGACTAATGT GGATTQGGAT GCTAGCTCTT ATTGCCACCA CCAAAATAAC TCTACGTCGA proteina E de Hypr • P P G D S I I Y V G E L S Y Q W F Q K G S S I G E V P Q K T K K G 2101 TCCGCCAGGC GATÁACATCA TCTACCTGGG CGAACTCTCT TACCAGTGGT TTCAGAAAGG GAGTTCAATT GG0CO0GTCT TCCAAAAAAC GAAGAAGGGA AGGCGGTCCG CTATTGTAGT AGATGCACCC GCTTGAGAGA ATGGTCACCA AAGTCTTTCC CTCAAGTTAA CCCGCCCAOA AGGTTTTTTG CTTCTTCCCT proteina E de Hypr I E H L T V I G E H A O P G S A G G F L S S I G K A t, H T V L G C 2201 ATCGAACGAr TOACGOTTAT CGGCGAGCAC GCATGOGATT TTGGTTCCGC AGGGGGATTC CTGTCTTCTA TTGGTAAGGC ACTGCATACC GTGCTGGGGG TAGCTTGCTA ACTGCCAATA GCCGCTCGTG CGTACCCTAA AACCAAOGCG TCCCCCTAAG OACAGAAGAT AACCATTCCG TGACGTATGG CACGACCCCC 111 - -112- -113 - - 114- o 1>? CCTCAGACAC CAATGAGCGC ACCGTCACGA CCACCACGAG GAGACAGAAC GGGGACAGAT GCGCAGGTCC ACATGAGTAA ACCTTTTGTC TCTAAAACAG proteina E de Hypr T G T 0 G T T R V T L V L B L G G C V T I T A E G K P S M D V B _. D 1001 ACOGGCA CC AGGGGACGAC TCGGGTAACC CTGGTGCTTG AACTGGGTGG TTGCGTTACT ATTACCCCTG AGGGCAAACC CTCTATGGAT GTGTGGCTGG TGGCCGTGGG TCCCCTGCTG AGCCCATTGG GA CACGAAC TTGACCCACC AACGCAATGA TAATGGCGAC TCCCGTTTGG GAGATACCTA CACACCGACC proteina ? de Hypr - A I Y Q B B P A 0 T R E Y C L H A X I. S D T K V A A R C P T M G P · 1101 ATGCAATCTA TCAGGAGAAT CCCGCACAAA CCAGGGAATA TTGCCTTCAC GCAAAGCTGT CCGATACAAA GGTCGCGGCT AGGTGCCCAA CAATGOGACC TACGTTAGAT AGTCCTCTTA GGGCGTGTTT GGTCCCTTAT AACGGAAGTG CG TTCGACA GGCTATGTTT CCAGCGCCGA TCCACGGOTT GTTACCCTGG proteina E de Hypr A T L A S B H Q G G T V C K R D Q S D R G M G N H C G L F G K G S 1201 GGCCACCCTG GCGGAGGAAC ATCAGGGAGG TACAGTGTGC AAACGGGACC AGAGTGATAG AGGCTGGGGT AATCÁCTGCG GCCTGTTCGG CAAAGGAAGT CCGGTGGGAC CGCCTCCTTG TAGTCCCTCC ATGTCACACG TTTGCCCTGG TCTCACTATC TCCGACCCCA TTAGTGACGC CGGACAAGCC GTTTCCTTCA proteina £ de Hypr I V A C V" K A A C E A E K E A G H V Y D. A K K I V Y T V Tt V B P H 1301 ATTGTCGCTT GCGTCAAGGC AGCCTGTGAS GCCAAAAAGA AGGCTACTGG GCACGTCTAT GACGCCAACA AGATCGTTTA TACAGTGAAA GTGGAACCAC TAACAGCGAA CGCAGTTCCG TCGGACACTC CGGTTTTTCT TCCGATGACC CGTGCAGATA CTOCGGTTGT TCTAGCAAAT ATGTCACTTT CACCTTGGTG proreina E de Hypr • T G D Y V A A H B T K S G R K T A S F T V S S E K T I L T K G E Y -1401 ACACAGGGGA TTACGTGGCG GCCAACGAGA CTCATTCCGG TCGCAAAACG GCCRGCTTCA CCGTGTCATC CGAAAAGACC ATCCTCACTA TGGGGGAGTA TSTGTCCCCT AATGCACCGC CGGTTGCTCT GAGTAAGGCC AGCGTTTTGC CGGTCGAAGT GGCACAGTAG GCTTTTCTGG TAGGAGTGAT ACCCCCTCAT prGteina E de Hypr - G D V S L L C X V A S G V D L A O X V I L B L D K T V B H -, P T A 1S01 TGGCGACGTT TCTCTGCTCT GCCGGG GGC TAGCGGAGTC GACCTGGCCC AGACAGTCAT CCTGGAACTG GATAAftACAG TTGAGCATCT GCCTACCGCT ACCGCTGCAA AGAGACGAGA CGGCCCACCG ATOGCCTCAG CTGGACCGGG TCTGTCAGTA GGACCTTGAC CTATTTTGTC AACTCGTAGA CGGATGGCGA proteina E de fíypr B Q V H R D M F H D L A L P H K H E G A R N K N K A B R L V E F G A 1601 TSGCAGGTGC ACAGGGBTTG GTTTAACGAC CTTOCCCTGC CATGGAAACA TGAAGGAGCG AGAAACTGGA ATAATGCAGA GCGACTCGTA GAATTCGGTG ACCGTCCACG TGTCCCTAAC CAAATTGCTG GAACGGGACG GTACCTTTGT ACTTCCTCGC TCTTTGACCT TATTACGTCT CGCTGAGCAT CTTAAGCCAC proteina ? de Hypr ¦ P H A V K H D V Y N L G D Q T G V i* L K A L A G V P V A H I E G T -1701 CCCCTCATGC CGTGAAGATG GACGTCTACA ATCTGGGTGA TCAGACCGGC GTTCTCCTTA AAGCTCTOGC TGGCCTACCA GTTGCCCACA TCGAAGGAAC GGGGAGTAOG GCACTTCTAC CTGCAGATGT TAGACCCACT AGTCTGGCCG CAAGAGGAAT TTCGAGAGCG ACCGCATGGT CAACGGGTGT AGCTTCCTTG proteina E de Hypr - K t H 1 K S G H V T C E V G L E K L K K K G L T Y T M C D T K P 1601 GAAGTACCAC CTGAAGTCAG GCCATGTAAC TTGCGAGGTG GGCCTGGAGA AGTTGAAAAT GAAAGGTCTT ACGTACACAA TGTGTGACAA GACCAAGTTC CTTCATGGTG GACTTCAGTC CGCTACATTG AACGCTCCAC CCGGACCTCT TCAACTTTTA CTTTCCAGAA TGCATGTGTT ACACACTGTT CTGGTTCAAG proteina E de Hypr T W K R - A P T D S G H D T V V H E V T F S G T P C R I P V R A V A 1901 ACATGGAAGA GGGCCCCCAC AGATAGCGGC CACGATACTG TGGTGATGGA GGTGACCTTT TCTQGAACAA ÁACCCTGCAG AATACCCGTG CGGGCTGTAG TGTÁCCTTCT CCCGGGGGTO TCTATCGCCG GTGCTATGAC ACCACTACCT CCACTGGAAA AOACCTTGTT TTGGCACGTC TTATGGGCAC GCCCGACATC proteina E de Hypr H G S P D V N V - A M L I T P N P T I E N K G G G F I E M Q L G - 116- o • O D V S X X* C R V A S G V D I, A Q T V I L B L D K T V E R I» P T A 1301 ATGGCGACGT TTCTCTGCTC TGCCGGGTGG CTAGCGGAGT CGACCTGGCC CAGACAGTCA TCCTGGAACT GGATAAAACA GTTGAGCATC TGCCTACCGC TACCGCTGCA AAGAGACGAG ACGGCCCACC GATOGCCTCA GCTGGACCGG GTCTGTCAGT AGGACCTTGA CCTATTTTGT CAACTCCTAS ACGGATGGCG E de Hypr • W Q V H R O W P S D L A X. P W K H E G A K N » N K A E H L V E F G 1401 TTGGCAGGTQ CBCAGGGATT GGTTTAACGA CCT ECCCTG CCATGGAAAC ATCAAGGAGC GAGAAACTCG AATAATGCAG AGCGACTCGT ACAATTCGGT AACCGTCCAC GTGTCCCTAA CCAAATTGCT GGAACGGGAC GGTACCTTTG TACTTCCTCG CTCTTTGACC TTATTACGTC TCGCTGAGCA TCTTAAGCCA E de Hypr A P H A K D V Y N L G D O G V L 1 A L A G V P V A H I B G T 1S01 GCCCCTCATG CCGTGAAGAT OGACOTCTAC AATCTGGGTG ATCAGACCGG CGTTCTCCTT AAAGCTCTCG CTGGCGTACC AfiTTGCCCAC ATCGAAGGAA CGGGGAGTAC GGCACTTCTA CCTGCAGATG TTAGACCCAC TM3TCTGGCC GCAAGAGGAA TTTCGAGAGC GACCGCATGG TCAACGGGTG TAGCTTCCTT E de Hypr • K Y H L K S G H V T C E V C L E K L K M K G L T Y T M C D K T K F 1601 CGAAGTACCA CCTGAAGTCA GGCCATGTAA CTTGCGAGGT GGGCCTGQAG AAGTTGAAAA TGAAAGGTCT TACGTACACA ATGTGTGACA AGACCAAGTT GCTTCATGGT ©3ACTTCAGT CCGGTACATT GAACCCTCCA CCCGGACCTC TTCAACTTTT ACTTTCCAGA ATGCATGTGT TACACACTGT TCTGGTTCAA E de Hypr • T W K R A P T D S G B D T V V M E V T F S G T K P C R I P V R A V 1701 CACATGGAAG AGGGCCCCCA CAGATAGCGG CCACOATACT GTGGTGATGG AJ3GTCACCTT TTCTGGAACA AAACCCTGCA GAATACCCGT GCGGGCTGTA GTGTACCTTC TCCCGGGGGT GTCTATCGCC GGTGCTATGA CACCACTACC TCCACTGGAA AAGACCTTGT TTTGGGACGT CTTATGGGCA CGCCCGACAT E de Hypr A H G B P D V N V A M L I T P N P T I B U N G G G F I B K Q L P P G 1801 GCTCACGGAT CTCCCGAIGT CAATGTTGCT ATGCTGATTA CACCTAACCC TACCATCGAG AATAACGGTG GTGCTTTTAT TGAGATGCAG CTTCCGCCAG CGSCTCCCTA GAGGGCTACA GTTACAACGA TACGACTAAT GTGGATTGGG ATGGTAGCTC TTATTGCCAC CACCAAAATA ACTCTACGTC GAAGGCQGTC E de Hypr • D N I I Y V G E L S Y Q W P Q K G S 3 I G R V F Q K T K G 1 B R · 1»01 GCGATAACAT CATCTACGTG GGOGAACTC CTTACCAGTG GTTTCAQAAA GGGAGTTCAA TTGCGCGGGT. CTTCCAAAAA ACCAAGAACC GAATCGAACG CGCTATTGTA GTAGATGCÁC CCGCTTGAGA GAATGGTCAC CAAAGTCTTT CCCTCAAGTT AACCCGCCCA GASGGTTTTT TGC7TCTTCC CTTAGCTTGC E de Hypr - L I <¡ B H A W O F G S A G G F L S 3 I G K A L H T V L G G A P 2001 ATTGACGGTT ATCGGCGAGC AOSCATOGGA TTTTGGTTCC OCAGGGGGAT TCCTGTCTTC TATTGGTAAQ GCACTGCATA COGTGCTGGG GGGCGCATTC TAACTGCCAA TA3C0GCTCS TGCGTACCCT AAAACCAAGG CGTCCCCCTA AGGACAGAAG ATAACCATTC CGTGACGTAT GGCACGACCC CCCGCGTAAG E de Hypr K S I F G G V G F L P K L L L G V A L A W L G L H M R K P T M S K S .101 AATTCTATTT TCBGGGGCGT GGGGTTCCTG CCTAAACTCC TGCTGGGAGT AGCCCTGGCC TGGTTGGGAC TGAATATGCG GAATCCGACG ATGTCCATGT TTAAGATAAA AGCCCCCGCA CCCCAÍGGAC GGATTTGAGG ACGACCCTCA TCGGGACCGG ACCAACCCTG ACTTATACGC CTTAGGCTGC TACAGGTACA E de Hypr proteina MSI de WNV • F L L A G V L V L A M T L G V G A D T G C A I O I S S Q CATTCCTCTT GGCCGGCGTO CTTGTSCTGG CCATGACACT GGGCGTTGGC GCCGACACTG GGTGTGCCAT AGACATCAGC CGGCAA GTAAGGAGAA CCGOCCGCAC GAACATCACC GGTACTGTGA CCCGCAACCG CGCCTGTGAC CCACACGGTA TCTGTAGTCG GCCGTT o PIV-WN/TBEV Hypr con señal WNV (p40) (SEQ ID NOS: 55-57) - 121 - Apéndice de Secuencias 4. Construcciones de PIV de WN expresando proteína G de virus de la rabia.
Secuencia de PIV WN (ACprME)-Rabia (parcial) (SEQ ID NOS : 58-60) terminal N de C terminal N de C P A V Y . L K GGGOGCACAA CAGCAACTAA N-terminuo o* c señal de rabia señal parcial proceina de rabia G "PC proceina de rabia H proceina de rabia i. i r r proteina de rabia proceina de rabia Secuencia PIV de WN (AQ-Rabia G (parcial) (SEQ ?) NOS: 61-63) l. ß v a s ? c s t e s a t V * l c prME)-Rabies G PIV sequence (partial) (SEQ ID NOS : 64-66) proteína C UTR TTOTcacTAc señal de rabia proceina C señal C parcial proteina G de rabia proceina de rabia C B ATTCeACTTT proceina da rabia (1 proceina de rabia proceina de rabia A Tf f A s UOl CTOOTaCCAa proceina ds rabia proceina de rabia proceine de rabia señal pre-KSl A señal - 129- o prM - D S T K A T R ? L V K T E S W I i R ti P G Y A L V A A V I G W M L 801 GGACAOCACC AAGGCCACAA GGTAtTTGGT AAAAACAGAA TCATGGATCT TGAGGAACCC TGGATATGCC CTGGTGGCAG CCGTCATTGG TTGGATGCTT CCTGTCGTOG TTCCGGTCTT CCATAAACCA TTTTTGTCTT AGTACCTAGA ACTCCTTGGG ACCTATACGG GACCACCGTC GGCAGTAACC AACCTACGAA E prM G S N T K Q R V V P V V L L L L V A P A Y S P N C L G M S N R D F L 901 GOGAGCAACA CCATGCAGAG SGTTeTGTTT G CGTGCTAT TGCTrTTGGT GGCCCCAGCT TACAGCTTTA ACTGCCTTQG AATGAGCAAC AGAGACTTCT CCCTCGTTGT GGTAOGTCTC TCAACACAAA CAGCACGATA ACGAAAACCA CCGGGGTCGA ATCTCGAAAT TOACGGAACC TTA TCG TG TCTCTGAAGA E • E G V S G A T H V D L V L B G D S C V T I M S K D K P T I D V K M 1001 TGGAAGGAGT GTCTGCAGCA ACATGGGTGQ ATTTGGTTCT CGAAGGCGAC AGCTGCGTGA CTATCATGTC TAAGGACAAG CCTACCATCG ATGTGAAGAT ACCTTCCTCA CAGACCTCGT TGTACCCACC TAAACCAAGA GCTTCCGCTG TCGACGCACT GATAGTACAO ATTCCTGTTC GGATGGTAGC TACACTTCTA E - M K M E A A N L A B V R S Y C ? L A T V S D L S T K A A C P A H G 1101 GATGAATATG GAGGCGGCCA ACCTGGCAGA GGTCCGCAGT TATTGCTATT TGGCTACCGT CÁGCGATCTC TCCACCAAAG CTGCGTGCCC GGCCATGGGA CTACTTATAC CTCCGCCGGT TGGACCGTCT CCAGGCGTCA ATAACGATAA ACCGATGGCA GTCGCTAGAG AGGTGGTTTC GACGCACGGG CCGGTACCCT E E A H B D K R A D P A P V C R O G V V D R G W G K G C G L F O K G S 1201 GAAGCTCACA ATGACAAACG TGCTGACCCA GCTTTTGTGT GCAGACAAGG AGTGGTGGAC AGGGGCTGGG GCAACGGCTG CGGACTATTT GGCAÁAGGAA CTTCGAGTGT TACTGTTTGC ACGACTGGGT CGAAAACACA CGTCTGTTCC TCACCACCTG TCCCCGACCC CGTTGCCGAC GCCTGATAAA CCSTTTCCTT • I D T C A K F A C S T K A I G R T I L K B K I K Y E V A 1 F V H G 1301 GCATTGACAC ATGCGCCAAA TTTGCCTCCT CTACCAAGGC AATAGGAAGA ACCATTTTCA AAGAGAATAT CAAGTACGAA GTGGCCATTT TTGTCCATGG CGTAACTGTO TACGCGGTTr AAACGGACGA GATGGTTCCG TTATCCTTC TGGTAAAACT TTCTCTTATA GTTCATGCTT CACCGGTAAA AACAGGTACC B • E T T V B S H G H Y S T Q V G A T Q A G R P S I T P A S Y T L 1401 ACCAACTACT GTGGAGTCGC ACGGAAÁCTA CTCCACACAG GTTGGAGCCA CTCAGGCAGG GAGATTCAGC ATCACTCCTG CGGCGCCTTC ATACACACTA TGOTIGATOA CACCTCAGCG TGCCTTTGAT GAGGTGTGTC CAACCTCGGT GAGTCCGTCC CTCTAAGTCG TAGTGAGGAC GCCGCGGAAQ TATGTGTGAT E 1> G B Y G E V T V D C E P R S G I D T ? ? ? ? V M T V G T T F L -1501 AAGCTTGGAG AATATGGAGA GGTGACAGTG GACTGTGAAC CACGBTCAGG GATTGACACC AATGCATACT ACGTGATGAC TGTTGGAACA AAGACGTTCT TTCGAACCTC TTATACCTCT CCACTGTCAC CTGACACTTG GTGCCRGTCC CTAACTGTGG TTACGTATGA TGCACTACTG ACAACCTTGT TTCTGCAAGA E • V H R B H F K D L N L P W S S A G S T V R N R E T L M E F E B P -1601 TGGTCCATCG TGAGTGGTTC ATGGACCTCA ACCTCCCTTG GAGCAGTGCT GGAAGTACTC TGTGGAGGAA CAGAGAGACG TTAATGGAGT TTGAGGAACC ACCAGGTAGC ACTCACCAAG TACCTGGAGT TOGAGGGAAC CTCGTCACGA CCTTCATGAC ACACCTCCTT GTCTCTCTGC AATTACCTCA AACTCCTTGG ¦ H K Q S V 1 A L G S Q E G A L H Q A L A G A I P V E F S S B ?01 ACACGCCACG AAGCAGT TG TGATACCATT GGGCTCACAA GAGGGAGCTC TGCATCAAGC TTTGGCTGGA GCCATTCCTG TGGAATTTTC AAGCAACACT TOTGCGGTGC TTCGTCAGAC ACTATCGTAA CCCGAGTGTT CTCCCTCGAG ACGTAGTTCO AAACCGACCT CGGTAAGGAC ACCTTAAAAG TTCGTTGTCA E - 131 - 132- - 136 137- - 138- - 139- - 140- Otras Formas de Realización Todas las publicaciones, solicitudes de patente, y patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia en su totalidad como si cada publicación, solicitud de patente, o patente individual se indicara específicamente o individualmente para incorporarse por referencia.
Varias modificaciones y variaciones de los virus, vectores, composiciones, y métodos de la invención descritos serán aparentes a los técnicos en la materia sin salirse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con formas de realización específicas, deberá entenderse que la invención como se reivindica no deberá limitarse indebidamente a tales formas de realización específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias a los técnicos en los campos de medicina, farmacología, o campos relacionados tienen la intención de estar dentro del alcance de la invención. El uso de formas singulares presentes, tales como "un", "una", y "el" o "la" no excluyen indicación de la forma plural correspondiente, a menos de que el contexto indique lo contrario. De manera similar, el uso de términos plurales no excluye indicación de una forma singular correspondiente. Otras formas de realización están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

Claims (50)

REIVINDICACIONES
1. Un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma de flavivirus que comprende (i) o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , proteína no estructural 5 (NS5) , y (ii) una secuencia que codifica uno o mas inmunógenos heterólogos relacionados con patógeno, cáncer, o alergia.
2. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 1, donde dichas una o mas supresiones o mutaciones están dentro de secuencias de cápsida (C) del genoma de flavivirus.
3. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 1, donde dichas una o mas supresiones o mutaciones están dentro de las secuencias de pre-membrana (prM) y/o envoltura (E) del genoma de flavivirus.
4. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 1, donde dichas una o mas supresiones o mutaciones están dentro de las secuencias de cápsida (C) , pre-membrana (prM) , y envoltura (E) del genoma de flavivirus .
5. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 1, donde dichas una o mas supresiones o mutaciones están dentro de las secuencias de prote na no estructural 1 (NS1) del genoma de flavivirus.
6. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho inmunógeno heterólogo es a partir de un patógeno seleccionado a partir de grupo que consiste en un virus de rabia, Borrelia burgdorferi, una garrapata, un virus de la influenza, un virus de inmunodeficiencia humana, un virus de inmunodeficiencia simia, un virus del papiloma humano, un virus sincitial respiratorio, parásito de malaria, y ycojbacterium tuberculosis.
7. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende un inmunógeno de proteína G del virus de la rabia o ún fragmento inmunógeno del mismo.
8. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende inmunógeno Ospa de Borrelia burgdorferi o un fragmento inmunógeno del mismo.
9. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende una proteína de saliva de garrapata seleccionada a partir del grupo que consiste en 64TRP, Isac, y Salp20, o un fragmento inmunógeno del mismo.
10. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende un epítope de virus de la influenza M2 , hemaglutinina (HA) , o neuraminidasa (NA) , o un fragmento inmunógeno del mismo.
11. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende una proteína gag, tat/nef, o gpl20 de VIH optimizada por codón, o un fragmento inmunógeno del mismo.
12. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende una proteína de cápsida Ll o L2 de HPV16 o HPV18, o un fragmento inmunógeno del mismo.
13. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 6, donde dicho inmunógeno heterólogo comprende una glicoproteína F o G de virus sincitial respiratorio .
14. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde dicho genoma de flavivirus comprende secuencias que codifican una proteína de pre-membrana (prM) y/o envoltura (E) .
15. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el genoma de flavivirus se selecciona a partir de aquel de secuencias de virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus Langat, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de encefalitis de San Luis, y quimeras de las mismas.
16. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 15, donde dicha quimera comprende secuencias de pre-membrana (prM) y envoltura (E) de un primer flavivirus, y secuencias de cápsida y no estructurales de un segundo flavivirus, diferente.
17. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 16, donde dicho primer flavivirus es un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o un virus Langat .
18. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de las reivindicaciones 16 o 17, donde dicho segundo flavivirus, diferente, es un virus de la fiebre amarilla o un virus del Nilo Occidental o virus Langat.
19. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde dicho genoma se empaca en una partícula comprendiendo secuencias de pre-membrana (prM) y envoltura (E) a partir de un flavivirus que es el mismo o diferente de aquel del genoma.
20. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de las reivindicaciones 1-19, donde secuencias que codifican dicho inmunógeno heterólogo se insertan en el lugar de o en combinación con las una o mas supresiones o mutaciones de las una o mas proteínas .
21. El flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, donde secuencias que codifican dicho inmunógeno heterólogo se insertan en el genoma de flavivirus dentro de secuencias que codifican la proteína de envoltura (E) , dentro de secuencias que codifican la proteína no estructural 1 (NS1) , dentro de secuencias que codifican la proteína de pre-membrana (prM) , intergénicamente entre secuencias que codifican la proteína de envoltura (E) y la proteína no estructural 1 (NS1) , intergénicamente entre la proteína no estructural 2B (NS2B) y la proteína no estructural 3 (NS3) , o como una inserción bicistrónica en la región no traducida 31 del genoma de flavivirus .
22. Una composición que comprende un primer flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 y un segundo flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación diferente que comprende un genóma que comprende una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) , donde las una o mas proteínas codificadas por las secuencias en las cuales las una o mas supresiones o mutaciones ocurren en el segundo flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación diferente son diferentes de las una o mas proteínas codificadas por las secuencias en las cuales las una o mas supresiones o mutaciones ocurren en el primer flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación.
23. Un método para inducir una respuesta inmunológica a un inmunogeno en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto uno o mas flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 y/o una composición de la reivindicación 22 al sujeto.
24. El método de la reivindicación 23, donde el sujeto está en riesgo pero no tiene una infección por dicho patógeno o una enfermedad o condición asociada con dicho inmunogeno relacionado con cáncer o alergia.
25. El método de la reivindicación 23, donde el sujeto tiene una infección por dicho patógeno o una enfermedad o condición asociada con dicho inmunogeno relacionado con cáncer o alergia .
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-25, donde el inmunogeno es a partir de un patógeno seleccionado a partir del grupo que consiste en virus de rabia, Borrelia burgdorferi , una garrapata, un virus de la influenza, un virus de inmunodeficiencia humana, un virus de inmunodeficiencia simia, un virus del papiloma humano, un virus sincitial respiratorio, parásito de malaria, y ycojbacterium tuberculosis .
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-26, donde el método es para inducir una respuesta inmunológica contra una proteína codificada por el genoma de flavivirus, además de la fuente del inmunógeno.
28. El método de la reivindicación 27, donde el sujeto está en riesgo pero no tiene una infección por el flavivirus correspondiente al genoma del flavivirus pseudo-infeccioso, el cual comprende secuencias que codifican una proteína de pre-membrana y/o envoltura de flavivirus.
29. El método de la reivindicación 27, donde el sujeto tiene una infección por el flavivirus correspondiente al genoma del flavivirus pseudo-infeccioso que comprende secuencias que codifican una proteína de pre-membrana y/o envoltura de flavivirus .
30. Un flavivirus quimérico atenuado, vivo, que comprende un virus de la fiebre amarilla en el cual secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura se reemplazan con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o un virus Langat, y la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y de pre-membrana del flavivirus quimérico comprende un híbrido de secuencias de señal de cápsida/pre-membrana de virus de la fiebre amarilla y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o una variante de las mismas .
31. El flavivirus quimérico atenuado, vivo, de la reivindicación 30, donde la secuencia de señal de cápsida/pre-membrana del flavivirus quimérico comprende secuencias del virus de la fiebre amarilla en la región terminal amino y secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat en la región terminal carboxi.
32. Un flavivirus quimérico atenuado, vivo, que comprende un virus del Nilo Occidental en el cual secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura se reemplazan con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o un virus Langat, y la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y de pre-membrana del flavivirus quimérico comprende secuencias de señal de cápsida/pre-membrana virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o una variante de las mismas.
33. Una composición farmacéutica que comprende un flavivirus pseudo-infeccioso de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, la composición de la reivindicación 22, o el flavivirus atenuado, vivo, de cualquiera de las reivindicaciones 30-32 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
34. La composición farmacéutica de la reivindicación 33, comprendiendo además un adyuvante.
35. Un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma de flavivirus que comprende una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótido que codifican proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , o proteína no estructural 5 (NS5) .
36. Una molécula de ácido nucleico que corresponde al genoma de un flavivirus pseudo-infeccioso de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 o 35, o el genoma del flavivirus atenuado, vivo, de cualquiera de las reivindicaciones 30-32.
37. Un método para hacer un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 o 35, el método comprendiendo introducir una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 36 hacia una célula que expresa la proteína correspondiente a cualquiera de las secuencias suprimidas del genoma de flavivirus del flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación.
38. El método de la reivindicación 37, donde la proteína se expresa en la célula a partir del genoma de un segundo flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación, diferente .
39. El método de la reivindicación 37, donde la proteína se expresa a partir de un replicón.
40. El método de la reivindicación 39, donde el replicón es un replicón de alfavirus.
41. El método de la reivindicación 40, donde el alfavirus es un virus de la encefalitis equina venezolana.
42. Una composición que comprende dos o mas flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicación, donde dos de los flavivirus pseudo-infecciosos deficientes de replicación se seleccionan a partir de los grupos que consisten en: (a) un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende secuencias de virus de la encefalitis japonesa, y un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende secuencias de virus del dengue; (b) un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende secuencias del virus de la fiebre amarilla, y un flavivirus pseudo-infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende' secuencias de virus del dengue; y (c) un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat y una secuencia insertada que codifica un inmunógeno de Borrelia burgdorféri, y un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat y una secuencia insertada que codifica un inmunógeno de proteína de saliva de garrapata, o un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma que comprende secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat y secuencias insertadas que codifican un inmunógeno de Borrelia burgdorféri y un inmunógeno de proteína de saliva de garrapata.
43. Una composición farmacéutica que comprende al flavivirus quimérico atenuado, vivo, de cualquiera de las reivindicaciones 30-32.
44. Un método para inducir una respuesta inmunológica a virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o virus Langat en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 43.
45. El método de la reivindicación 44, donde el sujeto no tiene pero está en riesgo de desarrollar infección por virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o virus Langat.
46. El método de la reivindicación 44, donde el sujeto está infectado con virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o virus Langat .
47. Un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma de flavivirus que comprende una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótido que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) , donde el genoma de flavivirus comprende secuencias de virus de la fiebre amarilla en las cuales secuencias codificando proteínas de pre-membrana y envoltura se reemplazan con secuencias que codifican proteína de pre-membrana y envoltura de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o un virus Langat, y secuencias que codifican la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y pre-membrana del genoma de flavivirus comprenden un híbrido de secuencias que codifican secuencias de señal de cápsida/pre-raerabrana de virus de la fiebre amarilla y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o una variante de las mismas.
48. El flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación de la reivindicación 47, donde las secuencias que codifican la secuencia de señal de cápsida/pre-membrana del genoma de flavivirus comprenden secuencias de virus de la fiebre amarilla en la región 51 y secuencias de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat en la región 31.
49. Un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma de flavivirus que comprende una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3) , y proteína no estructural 5 (NS5) , donde el genoma de flavivirus comprende secuencias del virus del Nilo Occidental en las cuales secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura se reemplazan con secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y de envoltura de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, y las secuencias que codifican la secuencia de señal entre las proteínas de cápsida y pre-membrana del genoma de flavivirus comprenden secuencias que codifican una secuencia de señal de cápsida/pre-membrana de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o Langat, o una variante de las mismas.
50. Un flavivirus pseudo- infeccioso deficiente de replicación que comprende un genoma de flavivirus que comprende una o mas supresiones o mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican una o mas proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste en cápsida (C) , pre-membrana (prM) , envoltura (E) , proteína no estructural 1 (NS1) , proteína no estructural 3 (NS3), y proteína no estructural 5 (NS5) , donde cualquier proteína de cápsida (C) y no estructural (NS) en dicho genoma de flavivirus es a partir de virus Langat y cualquier proteína de pre-membrana (prM) y envoltura (E) es a partir de virus de la encefalitis transmitida por garrapatas.
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