KR20100016313A - 이성분 게놈 플라비바이러스 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이성분 게놈 플라비바이러스 및 이러한 바이러스의 증식 방법을 개시한다. 이 플라비바이러스의 유전 물질이 두 게놈에 분포되므로, 플라비바이러스는 질병을 유발할 수 없지만 면역 반응을 유도할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본원에 논의된 복제 결함 플라비바이러스의 설계는 산업적 수준으로 이들 플라비바이러스의 증식을 허용한다.
플라비바이러스, 게놈, 면역 반응

Description

이성분 게놈 플라비바이러스 및 그것의 용도{TWO-COMPONENT GENOME FLAVIVIRUS AND USES THEREOF}
본 발명은 분자 생물학, 바이러스학 및 면역학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 복제-결함 플라비바이러스를 제공하며, 플라비바이러스-연관 질병에 대한 백신으로서의 그것의 용도를 개시한다.
플라비비리대(Flaviviridae) 과의 플라비바이러스 속은 황열, 진드기-매개 뇌염, 일본 뇌염, 뎅기, 웨스트 나일, 돼지 열병(classical swine fever virus), 소 바이러스 설사 및 C형 간염 바이러스를 포함하는 다양한 중요한 인간 및 동물 병원체를 함유한다. 자연계에서, 플라비바이러스는 척추동물 숙주와 주로 다수의 모기 및 진드기 종으로 대표되는 절지동물 벡터 사이를 순환한다. 4종의 상이한 항원 복합체로 분류되는 이 속의 거의 40가지 구성원은 인간 질병을 유발할 수 있다.
플라비바이러스 게놈은 거의 12kb의 양극성의 단일-가닥 RNA이다. 이것은 감염성 바이러스 입자를 형성하는 바이러스 구조 단백질, C, prM/M, 및 E, 그리고 바이러스 게놈의 복제에 필요한 효소 복합체를 형성하는 비구조 단백질, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5로 세포성 및 바이러스성 프로테아제에 의해 동시 및 사후 번역 가공되는 단일 폴리펩티드를 암호화한다(Lindenbach and Rice, 2001). 플라비바이러스 게놈은 5' 메틸구아닐레이트 캡을 가짐으로써 세포 메신저 RNA의 구조를 모방하지만, 3'-말단 폴리(A) 서열의 부재에 의해 세포 RNA 주형과 상이하다.
플라비바이러스 비리온에서, 바이러스 게놈 RNA의 단일 카피는 M과 E 단백질의 이질이합체가 매립된 지질 외피에 의하여 둘러싸인 뉴클레오캡시드로 들어가 C(캡시드)로 패키지된다. 뉴클레오캡시드와 외피간의 상호작용의 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않지만, 예컨대 알파바이러스 뉴클레오캡시드-외피 상호작용 보다는 덜 특이적인 것으로 보이며, 플라비바이러스 비리온은 캡시드와 원거리 항원 복합체에 속하는 바이러스로부터 유래한 외피 단백질에 의해 효과적으로 형성될 수 있다(Chambers et al., 1999; Lorenz et al., 2002; Monath et al., 2002). 또한, 뉴클레오캡시드의 존재는 입자 조립에 절대적인 필요요건은 아니며, 바이러스-유사 입자 형성 및 세로포부터의 방출은 다양한 벡터로부터 prM 및 E 만의 발현에 의해 달성될 수 있다. 이들 소위 서브바이러스 입자(SVP)는 RNA 또는 캡시드 단백질을 함유하지 않지만(Mason et al., 1991), 정20면체의 지질-함유 구조로 조직된 외피 단백질을 갖는다. prM/E-매립 서브바이러스 입자는 복제-가능 바이러스로의 후속 감염에 대하여 동물을 보호하는 효과적인 면역반응을 유도할 수 있다(Konishi and Fujii, 2002; Konishi, Fujii, and Mason, 2001; Konishi et al., 1992; Qiao et al., 2004), DNA (Aberle et al., 1999; Colombage et al., 1998; Davis et al., 2001; Kochel et al., 1997; Kochel et al., 2000; Konishi et al., 2000a; Konishi et al., 2000b; Phillpotts, Venugopal, and Brooks, 1996; Schmaljohn et al., 1997). 뉴클레오캡시드-패키지된 복제-가능 RNA의 결핍은 매우 유리한 잠재적 백신으로서 서브바이러스 입자의 용도를 생성하지만, 이들의 대규모 생산 또는 발현 구조체의 전달을 위한 새로운 수단의 개발이 필요하다. prM/E-발현 카세트는 바이러스 및 비바이러스 벡터에 기초하여 설계될 수 있다. 바이러스 벡터의 경우, 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역반응이 발생하거나 이미 존재한다는 문제가 항상 존재한다. 효과적인 RNA 폴리머라제 II-기반 프로모터의 제어하에 이들 유전자를 암호화하는 DNA-기반 카세트가 선호되는 것으로 보인다. 그러나, 이들의 임상 실험에서의 적용은 의문으로 남아있다. 그러므로, 플라비바이러스에 대한 백신 접종은 아직 주로 불활성화 백신 또는 생-약독화 백신(각각 INV 및 LAV)을 사용함으로써 달성된다.
최근 연구는 플라비바이러스 구조 단백질이 RNA 게놈 복제에 없어도 된다는 것을 제안하였다. 이들은 전체 또는 부분 결실될 수 있으며 이러한 RNA(레플리콘)는 자가-복제성을 유지하고, 비구조 뿐만 아니라 나머지 구조 및/또는 추가의 이종 유전자도 여전히 발현할 수 있다. 예컨대, 기능적 캡시드 유전자는 결핍되지만 다른 구조 유전자는 손상되지 않은 플라비바이러스 게놈을 시험관내 합성하여 면역화에 직접 사용하였다. 이들 복제는 서브바이러스 입자 생성을 유도하고 최종적으로 방어 면역 반응을 유도하였다. 생산적인, 전파되는 감염의 발현이 불가능한 변형된 플라비바이러스의 적용은 안전하고 방어 면역 백신 생산에 있어서 안전하고 효과적인 설계를 하는 새로운 수단이다(Aberle et al., 2005; Kofler et al., 2004). 그러나, 이들 용도는 대개 시험관내 합성된 RNA를 RNA 복제가 가능한 세포로 전달되 는 것의 개선이 필요하다. 이는 가장 자연적인 접근을 사용함으로써, 이들 결함 게놈을 바이러스성 구조 단백질로 이루어진 감염성 입자로 패키징함으로써 달성할 수 있다.
플라비바이러스-연관 질병에 대한 우려가 크고, 플라비바이러스가 새로운 지역으로 지속적으로 전파됨에도 불구하고, 이러한 감염에 대한 항바이러스 치료제는 아직 개발되지 않았으며, 매우 제한된 수의 인가된 백신만이 현재까지 생산되고 있다. 불활성화 바이러스 백신(INV)은 진드기 매개 뇌염(TBEV) 및 일본 뇌염(JEV)을 예방하기 위하여 허가되었다. 그러나, 다른 불활성화 바이러스 백신과 마찬가지로, 이러한 백신은 제한된 효능을 지니며, 다중 접종을 필요로 하고, 생산 비용이 고가이다. 이러한 단점에도 불구하고, 일본 뇌염 및 진드기 매개 뇌염 불활성화 바이러스 백신은 양호한 안전성을 기록하고, 어떤 질병의 발생과 연관되지 않았다. 유일하게 허가받은 플라비바이러스의 생-약독화 백신(LAV)은 널리 사용되는 황열 바이러스(YFV) 17D 균주이며, 이는 닭 배아 조직 내에서 황열 바이러스의 야생형 Asibi 균주를 연속 계대(passaging)함으로써 개발되었다. 이 생-약독화 백신이 매우 안전하고 효과적이라고 간주됨에도 불구하고, US 육군 모병에 있어서의 최근 사례를 포함하여 백신 접종된 사람들에서 황열 및 부작용이 감지된 사례가 있다.
플라비바이러스에 대한 역 유전 시스템의 개발은 이러한 바이러스의 합리적인 약독화에 기초한 새로운 유형의 생-약독화 백신의 생산 및 설계에 대한 기회를 마련한다. 이 새로운 부류의 백신은 YFV 17D-기반 키메라를 포함하며, 여기서 황열 바이러스 prM-E-암호화 게놈 단편은 이종 플라비바이러스 유래 prM-E-카세트로 치 환되었다. 유사한 키메라 바이러스-기반 접근법이 뎅기- 및 진드기-매개 뇌염-기반 백본에 적용되었다. 대부분의 경우, 키메라 플라비바이러스는 고도로 약독화된 표현형을 나타내지만 효과적인 방어 면역 반응을 유발시킬 수 있고, 바이러스의 후속 감염으로부터 보호하게 되며, 이들의 구조 단백질은 키메라에 의하여 발현된다. 이러한 키메라 백신 후보물질에 의한 백신 접종은 다른 바이러스 벡터에 기반한 재조합 바이러스 백신의 효능을 방해하는 기존의 "벡터" 면역에 의하여 저해되지 않는다.
키메라 플라비바이러스가 신규의 백신을 생산하는 합리적인 보편적 접근법을 제공하는 것으로 보여도, 최소한 면역 손상 개체 내에서 키메라 자신이 병원성이 되거나, 또는 백신 제조가 필요한 이러한 바이러스의 증식 과정동안 돌연변이가 검출되었기 때문에 병원성 키메라가 발생할 수 있다는 우려가 있다.
따라서, 선행기술은 안전성, 효능 및 플라비바이러스 유전자에 대하여 사용할 수 있는 효과적인 백신의 종류에 결함이 있다. 본 발명은 이 장기간의 요구 및 기술 업계의 필요성을 충족시킨다.
발명의 개요
본 발명의 한 실시형태에서, 이성분 게놈 플라비바이러스를 제공한다. 이러한 플라비바이러스는 RNA 복제에 필요한 시스-작용 프로모터 구성요소, 외피 단백질 및 플라비바이러스의 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하는 가감염성(pseudoinfectious) 바이러스 게놈을 포함하고 플라비바이러스의 캡시드 단백질은 암호화하지 않는다. 추가적으로, 이것은 또한 RNA 복제에 필요한 시스-작용 프 로모터 구성요소, 캡시드 단백질 및 플라비바이러스의 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하는 보완 게놈을 포함하고 플라비바이러스의 외피 단백질을 암호화하지 않는다.
본 발명의 다른 관련 실시형태에서, 상기 설명한 이성분 게놈 플라비바이러스로 감염된 세포 배양 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관련 실시형태에서, 이성분 게놈 플라비바이러스의 대규모 증식 방법을 제공한다. 이러한 방법은 동일한 세포에서 두 게놈의 복제를 가능하게 하는데 효과적인 상기 설명한 이성분 게놈 플라비바이러스로의 세포 배양 시스템을 감염시키는 단계 및 이성분 플라비바이러스를 방출시키는 단계를 포함하며, 이로써 이성분 게놈 플라비바이러스의 대규모 증식이 가능해진다.
본 발명의 다른 관련 실시형태에서, 상기 설명한 이성분 게놈 플라비바이러스, 보조제, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 이들의 조합을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 관련 실시형태에서, 플라비바이러스 노출로 인한 감염으로부터 피험자를 보호하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 설명한 면역원성 조성물의 면역학적으로 효과적인 양을 피험자에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 조성물은 피험자에서 플라비바이러스에 대한 면역 반응을 도출하고, 이로써 플라비바이러스에 대한 노출로 인한 감염으로부터 피험자를 보호한다.
도 1A-1C는 감염성 바이러스 입자로의 캡시드 및 prM/E-암호화 결함 YFV 게 놈의 패키징을 나타낸다. 도 1A는 복제 결함 YFV 게놈 내의 5' 말단 서열의 개략도이다. 신호 펩티드 및 막통과 도메인의 위치는 채워진 박스로 표시된다. 도 1B는 시험관내-합성된 RNA에 의해 동시-트랜스펙션된 세포로부터 결함 게놈-함유 바이러스 입자의 방출을 나타낸다. 배지를 표시된 시점에서 교체하였고 본원에 설명된 바와 같이 역가를 결정하였다.
도 2A-2B는 중복된 캡시드-특이적 서열을 사용한 YFV의 복제를 나타낸다. 도 2A는 재조합 YFV 게놈의 개략도이다. 코돈-최적화 캡시드-암호화 서열은 회색으로 표시된다. 2개의 프레임-시프트 돌연변이의 도입으로부터 기인하는 YF/Cfrs/GFP/C 게놈의 캡시드 내의 교대 ORF는 채워진 박스로 표시된다. 역가 및 CPE 발현은 시험관내-합성된 RNA의 트랜스펙션 후 72시간에 평가하였다. 도 2B는 방출된 재조합 바이러스의 분석을 나타낸다. 시험관내-합성된 RNA를 세포로 트랜스펙션하였고, 배지를 표시된 시점에서 교체하였고, 플라크 분석법을 사용하여 바이러스 역가를 결정하였다.
도 3A-3B는 효과적인 복제가 가능한 YF/C/GFP/C 게놈-함유 변이체의 선택 및 적응 돌연변이의 확인을 나타낸다. 도 3A은 YF/C/GFP/C 게놈 및 효과적으로 복제되는 변형체에서 확인된 결실의 개략도이다. 숫자는 캡시드 및 GFP 단백질의 아미노산 서열에서 결실의 위치를 나타낸다. 도 3B는 BHK-21 세포에서 재조합된 결실 돌연변이체의 복제를 나타낸다. 시험관내-합성된 RNA를 세포로 트랜스펙션하였고, 배지를 표시된 시점에서 교체하였다. 방출된 바이러스의 역가를 본원에 설명한 플라크 분석법으로 측정하였다. 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 4A-4C는 폴리프로테인의 재조합 YFV 게놈 암호화 이종 유전자 상류의 복제를 나타낸다. 도 4A는 재조합 게놈 GFP 유전자의 상류에 위치한 ORF의 서열의 개략도를 나타낸다. 코돈-최적화 캡시드-암호화 서열은 회색으로 표시한다. 화살표는 GFP-암호화 서열의 시작을 표시한다. 소문자는 캡시드 및 GFP 서열에서 만들어진 돌연변이를 표시한다. 도 4B는 BHK-21 세포에서 설계된 YFV 변형체의 복제를 나타낸다. 시험관내 합성된 바이러스 RNA를 세포로 트랜스펙션하고 배지를 표시된 시점에서 교체하였다. 방출된 바이러스의 역가를 본원에 설명된 바와 같이 플라크 분석법으로 측정하였다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. 도 4C는 BHK-21 세포에서 연속 계대 후 재조합 YFmut/GFP 바이러스의 역가를 나타낸다.
도 5A-5F는 이성분 게놈 바이러스 복제의 분석을 나타낸다. 도 5A는 동일한 세포에서 복제 동안 교차 보완할 수 있는 YFV 캡시드- 및 prM/E-암호화 게놈의 개략도를 나타낸다. 코돈-최적화 캡시드-암호화 유전자는 회색으로 나타낸다. 도 5B는 시험관내-합성된 RNA에 의해 동시-트랜스펙션된 세포로부터의 결함 게놈-함유 바이러스 입자의 방출을 나타낸다. 배지를 표시된 시점에서 교체하였고 각 게놈을 함유하는 감염성 바이러스 입자의 역가를 본원에 설명된 바와 같이 측정하였다. 도 5C는 ~10 inf.u/세포의 MOI에서 계대 동안 이성분 게놈 YFV의 복제를 나타낸다. 배지를 표시된 시점에서 교체하였고 각 게놈을 함유하는 감염성 바이러스 입자의 역가를 본원에 설명된 바와 같이 측정하였다. 도 5D 는 상이한 MOI에서 세포 감염 후 이성분 게놈의 복제를 나타낸다. 배지를 표시된 시점에서 교체하였고 방출된 감염성 입자의 역가를 본원에 설명된 바와 같이 측정하였다. 도 5E는 감염된 세포에서 두 결함 게놈의 복제를 나타낸다. BHK-21 세포를 이성분 게놈 YFV으로 ~1 inf.u/세포의 MOI로 감염시켰고 감염 48시간 후 게놈의 복제를 평가하였다. 패널 (a)는 복제 YF/Cherry/Cco를 함유하는 세포를 나타내고; 패널 (b)는 복제 YF/GFP/prME 게놈을 갖는 세포를 나타내고, 패널 (c)는 오버레이이다. 도 5F는 상이한 YFV-특이적 RNA로 트랜스펙션된 세포로부터 감염성 바이러스 및 VLP 방출의 분석을 나타낸다. BHK-21 세포를 표시된 RNA로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 24시간 후에 수확한 무혈청 배지로 교체하였다. 원심분리에 의해 입자를 펠릿화하고 본원에 설명된 바와 같이 불연속 수크로스 구배 상에서 더 분석하였다. 바이러스 E 단백질을 인식하는 D1-4G2 MAB를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 분획 중의 YFV-특이적 단백질의 존재가 검출되었다.
도 6A-6C는 패키징 셀라인에서 구조 유전자가 모두 결핍된 YFV 레플리콘의 패키징을 나타낸다. 도 6A는 구조 단백질 대신에 형광 마커, Cherry를 암호화하는 TFV 레플리콘의 개략도이다. 도 6B는 이전에 설명된 C-prM-E를 암호화하는 VEE 레플리콘 및 그것의 새로운 형태의 개략도이다. VEEV 레플리콘 모두를 사용하여 발생된 패키징 셀라인에서 패키징된 Yfrep/Cherry의 역가를 나타낸다. 도 6C는 표시된 YF 레플리콘으로 트랜스펙션되거나 다음번 계대에서 동일한 입자로 감염된 VEErep/GFP-C-prM-E/Pac-함유 세포로부터의 감염성, Yfrep/Cherry 게놈-함유 바이러스 입자의 방출을 나타낸다. 배지를 표시된 시점에서 교체하고 방출된 패키지된 레플리콘의 역가를 본원에 설명한 바와 같이 측정하였다.
도 7은 높은 MOI 및 낮은 MOI에서 이성분 게놈 바이러스의 제안된 복제 전략 을 나타낸다. 높은 MOI에서, 두 게놈, PIV 게놈(prM/E 암호화) 및 보완 게놈(캡시드 암호화)이 동일한 세포로 전달되고 바이러스 복제에 필요한 단백질의 완전한 세트를 생성한다. 세포는 증가된 규모에서 더 계대될 수 있는 이성분 게놈 바이러스를 생성한다. 낮은 MOI에서, 세포는 두 게놈 중 하나만을 수용하고 PIV으로 감염된 것은 유전 물질 및 뉴클레오캡시드를 함유하지 않는 SVP를 생성한다.
본 발명의 목적은 플라비바이러스-연관 질병에 대한 예방 백신으로서 사용할 수 있는 새로운 종류의 복제-결함 플라비바이러스를 개발하는 것이었다. 이와 관련하여, 본 발명은 이성분 게놈 플라비바이러스, 예컨대 황열 바이러스(YFV)를 개시하며, 여기서 플라비바이러스의 게놈이 두개의 게놈으로 분리된다. 이들 게놈 모두는 생산적인 복제에 필요한 적어도 하나의 단백질(캡시드 또는 prM/E)의 발현에 결함이 있지만, 동일한 세포로 전달시 서로의 기능을 보완하였다. 이들 복제 결함 플라비바이러스는 감염성이고 동물 감염시 1회 감염을 행할 수 있기 때문에 플라비바이러스 감염에 대한 백신으로서의 이들의 추가적 용도를 위해 산업상 수준으로 생산될 수 있었다. 이들 동물에서, 오직 하나의 게놈을 함유하는 입자로 감염된 세포는 바이러스 비구조 및 구조 단백질의 불완전 세트를 생성한다. 합성된 prM/E 단백질은 유전 물질이 결핍되지만 효과적인 면역원으로서 기능하는 서브바이러스 입자만을 형성한다. 따라서, 이들 결함 플라비바이러스는 불활성화 백신의 안전성과 생 약독화 백신의 효능 및 확장성을 조합할 수 있다. 추가적으로, 이들 결함 플라비바이러스는 SVP를 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이종 단백질을 발현할 수도 있었다.
지금까지, 플라비바이러스는 주요 공중 보건 관심사 중 하나로 남아있다. 이들은 양 반구에 널리 분포하며 다양한 인간-연관 질병을 초래한다. 그러나, 안전하고 효과적인 백신은 소수의 플라비바이러스 감염에 대해서 생산된다. 이들 백신은 생-약독화 또는 불활성화 중 어느 하나로서 특징화될 수 있다. 유일하게 허가받은 플라비바이러스의 생-약독화 백신은 널리 사용되는 황열 바이러스 17D 균주이며, 이는 닭 배아 조직 내에서 황열 바이러스의 야생형 Asibi 균주를 연속 계대함으로써 개발되었다. 생-약독화 백신은 JEV, TBEV 및 YFV에 대하여 개발되었지만, 뎅기 및 WNE와 같은 다른 플라비바이러스에 대한 인가 제품은 생산되지 않았다. 생 백신은 불활성 바이러스 또는 서브유닛 백신보다 더욱 효과적인 것으로 보인다. 그러나, 병원성 표현형에 대한 반전의 가능성 때문에 명백한 안전성 우려는 남아있다. 불활성화 백신의 적용은 대개 다중 백신 접종 및 대량의 물질 생산 및 불활성 제품을 만드는데 사용되는 독성 바이러스를 증식시키기 위한 고도의 봉쇄 시설의 필요성을 요구한다. 따라서, 두 유형의 플라비바이러스 백신에 대한 유망한 후보물질이 존재하더라도, 이들의 개발을 위한 보편적인 접근은 존재하지 않는다.
플라비바이러스의 구별되는 특징은 소위 서브바이러스 입자(SVP)를 형성하는 외피 단백질의 능력에 있다. 이러한 입자는 표준 prM/E 글리코단백질-발현 벡터를 함유하는 진핵 세포에 의해, 또는 캡시드 유전자가 결실된 결함 플라비바이러스 게놈에 의해 효과적으로 생성될 수 있다. 이들 바이러스 유사 입자는 유전 물질 및 전체 뉴클레오캡시드가 결핍되지만, 효과적인 면역원으로서 기능하고 복제 가능 플라비바이러스로의 후속 감염에 대하여 방어 면역 반응을 유도한다. 캡시드-암호화 서열이 결핍된 결함 플라비바이러스 게놈은 세포로 RNA 형태로 전달되거나 패키징 셀라인을 사용하여 감염성 바이러스 입자로 패키지될 수 있으며, 여기서 캡시드는, 예컨대 서브게놈 프로모터의 제어하에서 플라비바이러스 캡시드 유전자를 암호화하는 연속 복제 알파바이러스 레플리콘에 의해 교차 공급된다. 나이브 세포의 시험관내 및 생체내 감염시, 이들 가감염성 플라비바이러스는 복제 및 SVP 생성이 가능하지만, 전파되는, 생산적 감염을 발생하지 않는다. 그러므로, 이들 적용은 질병 발생을 유도하지 않고, 이들은 생 바이러스와 불활성 바이러스 사이의 흥미로운 중간체를 나타낸다. 이들은 효과적인 면역 반응의 유도를 일으키는 1회의 감염을 행하고, 가감염성 바이러스(PIV)로 불린다.
플라비바이러스에 대한 역유전 시스템의 개발은 이들 바이러스의 합리적인 약독화를 기반으로 생-약독화 백신의 새로은 종류의 설계에 대한 기회를 마련했다. 이 새로운 백신의 부류는 황열 바이러스 17D-기반 키메라를 포함하며, 여기서 황열 바이러스 prM-E-암호화 게놈 단편은 이종 플라비바이러스로부터 유래된 prM/E-카세트로 교체되었다. 이들 키메라 플라비바이러스는 새로운 백신 생산에 대하여 합리적인 보편적 접근을 제공하는 것으로 보인다. 그러나, 키메라 자체가 적어도 면역 손상 개체에서 병원성일 것이며, 면역화된 척추동물에서 복제 동안 병원성 키메라가 발생할 수 있거나, 재조합, 복제-가능 플라비바이러스가 모기 또는 진드기에 의해 전파될 수 있다는 우려가 있다.
또 다른 유망한 백신 개발의 방향은 백신 접종된 숙주에서 생산적인 바이러스 복제를 덜 효과적이거나 불가능한 경우로 만드는 플라비바이러스 게놈의 회복불능 결실 생성에 기초한다. 후자 경우, 전체 복제 기구를 암호화하지만 예컨대 C-암호화 영역은 결핍된 바이러스 게놈이, 자가 복제 가능한 시험관내-합성된 RNA로서 생체내 면역화를 위해 전달될 수 있다. 완전한 바이러스 복제 사이클의 부재에서 서브바이러스 입자(SVP)의 생성을 특정하는 시험관내 합성된 결함 RNA 게놈을 사용한 직접 면역화는 방어 면역을 생성하는데 안전하고 효과적인 것으로 나타났다. 그러나 합성, 안정성 및 전달 문제로 인하여 RNA-기반 백신 후보물질을 생산하는데 상당한 방해가 있을 수 있다. 따라서 플라비바이러스 백신의 개발을 위한 이전의 방법은 매우 안전하지만 효능이 제한되고 다중 백신 접종이 필요한 불활성화 바이러스 백신 또는 야생형, 병원성 표현형으로의 반전 및 절지동물 벡터에 의한 전달에 대하여 강한 잠재성을 갖는 생-약독화 백신 제조를 기반으로 하였다.
또한, 백신 목적을 위한 PIV의 용도는 이들의 대규모 생산 및 결함 게놈을 가능성이 입증된 감염성 비리온으로 패키징하는 셀라인의 개발을 필요로 한다. PIV는 패키징 셀라인에서 계대될 수 있지만, 증가된 규모에서 나이브 세포에서는 그렇지 않다. 그러나, 이것은 그들의 대규모 증식의 유일한 수단이 되지 않는 것으로 보인다. 본 발명의 플라비바이러스의 생산은 이러한 셀라인의 개발을 필요로 하지 않았지만 본원에 논의된 방법은 효과적인 PIV 생성을 유도하였다. 추가적으로, 본 발명의 복제 결함 플라비바이러스는 사용하기에 안전할 뿐만 아니라 증가된 산업적 규모로 조직 배양액에서의 복제 및 추가의 유전자 발현이 가능하다. 따라서, 이들 플라비바이러스는 복제에 결함이 있으며 사람 및 동물에서의 생산적인 전파되는 감염을 유발할 수 없다.
일반적으로, 바이러스 복제에 필요한 유전 물질은 서로의 결함을 교차보완할 수 있는 두 게놈에 분리되었다. 이 둘은 RNA 복제에 필요한 시스-작용 프로모터 구성요소 및 복제 효소 복합체를 형성하는 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하였다. 따라서 두 RNA 게놈은 자가 복제가 가능하지만, 이들 중 하나는 캡시드를 암호화하고 외피 단백질을 암호화하는 유전자는 결실되며 두번째의 것은 외피 유전자를 암호화하지만 캡시드는 암호화하지 않는다.
동일한 세포로 전달시, 두 게놈은 구조 단백질의 전체 세트를 생성하고, 세포는 각 게놈을 갖는 높은 역가의 감염성 바이러스 입자를 방출한다. 다음번 계대에서, 나이브 세포는 두 게놈이 동일한 세포로 전달되도록 하는 MOI에서 바이러스로 감염될 수 있다. 이는 생산적인 복제의 개발 및 각 게놈을 함유하는 감염성 바이러스 입자의 방출을 유도한다. 따라서, 이 시스템은 증가된 규모로 재조합 바이러스의 증식을 허용한다. (매우 높은 숫자의 감수성 세포를 갖는) 동물로의 접종시, 각 게놈은 상이한 세포로 전달되고, 전파되는 감염은 불가능하게 되고, 외피 단백질을 암호화하는 게놈을 갖는 비리온으로 감염된 세포는 유전 물질이 결핍되지만 효과적인 면역원으로서 기능하고 야생형 바이러스로의 후속 감염에 대하여 방어 면역 반응을 유도하는 비감염성, 바이러스-유사 입자를 생산한다(도 7).
효과적인 복제 및 보완을 촉진하기 위해서, 두 결함 게놈은 5'UTR 및 대부분의 플라비바이러스에 대한 캡시드 또는 페스티바이러스 유전자의 구성원에 대한 Npro 유전자의 아미노-말단 단편으로 표시되는 후속의 천연 단백질-암호화 서열 중 60 nt(Element 1) 이상의 존재를 필요로 한다. 이 서열에 이어서 캡시드- 또는 외피 단백질-암호화 서열과 융합된 유비퀴틴 또는 수족구병 바이러스 (FAMDV)-특이적 2A 프로테아제가 후속한다. 이 융합 유전자의 조합은 두 게놈의 복제 및 동일한 효율성을 가지고 바이러스 입자로의 패키징에 필수적이다.
바이러스 구조 단백질을 암호화하는 인공의, 코돈-최적화 서열의 사용은 복제-가능 플라비바이러스의 형성을 잠재적으로 유도할 수 있는 두 결함 바이러스 게놈간의 재조합의 가능성을 배재한다. 두 결함 게놈은 추가의 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있으며, 따라서 이종 단백질을 위한 면역 반응을 발생시키기 위한 벡터로서 기능한다. 추가의 유전자는 Element 1과 유비퀴틴 또는 FAMDV 2A 프로테아제의 서열 사이에 클로닝될 수 있다.
상기 논의한 바와 같이, 백신 접종을 위한 이들 이성분 게놈 플라비바이러스의 적용은 면역화된 사람 및 동물에서 생산적인 전파되는 감염의 발생을 유도하지 않는다. 사람 및 동물은 다수의 세포를 가지므로, 이들 세포는 매우 낮은 다중도로 감염되고, 이것은 오직 하나의 게놈으로의 감염을 유도한다. 이러한 세포는 뉴클레오캡시드 및 어떤 유전 물질이 결핍된 소위 바이러스-유사 입자만을 생성할 수 있다. 후자 입자는 효과적인 면역원으로서 기능하지만, 다음 회의 감염을 행할 수 없다. 또한 본원에서 교차-보완 기능을 갖는 결함 바이러스 게놈이 추가의 유전 정보를 발현하고 다가 백신으로서 기능할 수 있다는 것으로 생각된다.
구체적으로, 본 발명은 상기 논의한 방법의 효능을 입증하기 위해 황열 바이러스의 유전 물질을 사용하였다. 이에 관하여, 황열 바이러스의 유전 물질은 서로의 결함을 교차 보완할 수 있는 두 바이러스 게놈 사이에 분리되었다. 최초 설계된 결함 YFV 게놈 각각은 전체 RNA 복제 기구를 암호화하였고, 이들 중 하나는 거의 전체 캡시드 유전자가 결실되고, 두번째 게놈은 prM/E를 암호화하지 않았다. 조직 배양액에서 각 제놈의 복제 이후에 감염성 입자의 역가를 측정하기 위해서, 게놈은 상이한 형광 마커, GFP 및 Cherry를 암호화하였다. 이들 세포에서의 발현은 특정 게놈의 감염 및 복제를 나타내었다. 동일한 세포로 전달시, YF/GFP/prME 및 YF/C/Cherry는 바이러스 구조 단백질의 전체 세트를 생성할 것으로 예상되었으며, 최종적으로 감염성 비리온으로 패키지된다. 그러나, 놀랍게도 생산적 복제를 달성하기 위한 초기 시도는 YF/C/Cherry 복제의 높은 세포 독성 때문에 성공적이지 않았다. 이것은 매우 높은 수준의 형광 단백질을 생성하였지만 낮은 수준의 감염성 바이러스 입자의 방출로 인한 강한 CPE도 유발하였다.
이 현상을 더 이해하기 위해서, 캡시드 유전자의 두 카피를 암호화한 YFV 게놈을 설계하였고, 이들 중 하나는 광범위한 유전자 조작에 활용할 수 있었다. 이 바이러스는 또한 드물게 세포 독성이었으며, 낮은 역가로 복제되었다. 캡시드-암호화 서열의 후속 조작은 세포 독성의 증가가 RNA 2차 구조에서의 가능한 변화에 의해서 보다는 캡시드 단백질 자체에 의해(C-prM-E 카세트의 컨텍스트에서 발현되지 않은 경우) 유발되었다는 것을 강하게 나타내었다(도 2). 또한, 게놈에 캡시드 유전자의 두 카피를 갖는 YF/C/GFP/C 바이러스는 더 낮은 수준의 CPE 발현과 함께 더 높은 역가로의 성장에 적합하게 된 변형체를 더욱 발달 및 개발할 수 있었다. 최근까지 CPE 유도에 대한 YF/C/Cherry 또는 YF/C/GFP/C 바이러스에 의한 YFV 캡시드 발생의 효과의 정확한 메커니즘은 불명료하게 남아있다.
높은 수준의 바이러스 방출에 적합하게 된 YF/C/GFP/C 변형체의 서열화는 추가의 이종 단백질의 생체내 또는 시험관내 안정한 발현이 가능한 변형된 감염성 바이러스의 발생 수단을 제공하였다. 그러나, 가장 중요하게는, 확인된 자발적 결실이 최초 설계된 복제 결함 YF/C/Cherry 바이러스 게놈의, 상이한 단백질-암호화 전략을 갖고 효과적인 YF/GFP/prME 복제의 교차-보완이 가능한 YF/Cherry/Cco으로의 변형에 대한 기회를 제공하였다. 두 게놈의 시험관내-합성된 RNA로 동시-트랜스펙션된 세포는 바이러스 입자를 생성하였으며, 여기서 두 캡시드 또는 prME 암호화 게놈이 동일한 농도로 존재하였고, 이 통상적이지 않은 바이러스는 증가된 규모에서 나이브 세포에서 더욱 계대 배양될 수 있었다.
낮은 MOI에서의 세포 감염은 두 게놈이 분리된 바이러스 입자로 패키지된다는 것이 명백하게 입증되었으므로, 보완 기능이 있는 두 게놈을 갖는 이 YFV가 (동일한 비리온으로 패키지된 모든 게놈 분절을 갖는 것으로 추측되는) 분할된 게놈 바이러스로서 불리지 못하고 오히려 이성분 게놈 바이러스로 불릴 수 있다. 분리되어 패키지된 두 게놈 세그먼트를 갖는 이러한 종류의 바이러스는 이전에 설비에서 설명되었다. 면역화를 위한 이러한 바이러스의 다른 적용은 감염성, 완전한, 복제 가능 바이러스의 형성을 유도할 수 있는 두 게놈간의 가능한 재조합에 대한 우려를 유발할 수 있다. 그러므로, 매우 드문 경우지만, YF/Cherry/C RNA 내의 캡시드 유전자는 고리화 서열이 결핍된 합성의 코돈-최적화 형태로 나타났다. 이성분 게놈 YFV를 사용한 다수의 실험에서, 미분절 게놈을 갖는 감염성 YFV의 형성은 검출되지 않았다. 그러나, 캡시드- 및 prME-암호화, 자가-복제 분절에서 상이한 고리화 서열의 쌍을 사용함으로써 재조합의 가능성을 추가로 감소시킬 수 있다.
흥미롭게도, YFV 게놈-기반 구조체가 아닌 것에서의 C-prM-E 암호화 전략의 변형은 전혀 구조 단백질을 암호화하지 않는 YFV 벡터의 패키징의 현저한 증가를 유도하였다. 연속 복제 VEErep/GFP-C-prM-E/Pac로부터 C-GFP-Copt-prM-E의 25 아미노산을 생성하는 셀라인은 C-prM-E 카세트만을 발현하는 유사한 셀라인 보다 현저하게 높은 역가를 위해 YFV 레플리콘을 패키징하였다. 패키지된 YFV 레플리콘은 108inf.u/ml을 초과하는 역가로 방출될 뿐만 아니라, 역가 감소 없이 이 패키징 셀라인에서 계대될 수도 있었다. 따라서, 구조 폴리단백질 상류의 25 캡시드-특이적 코돈 클로닝에 의한 C-prM-E 암호화 서브게놈 RNA의 간단한 변형은 감염성 입자 방출에 매우 강한 긍정적 효과를 미치며, 이종 유전 정보의 전달 및 발현을 위한 YFV-기반 벡터의 숫자를 넓힐 수 있다. C-prM-E 발현의 설계된 통상적이지 않은 전략이 감염성 비리온 형성을 촉진하는 번역된 구조 단백질의 상이한 구획화를 유도할 수 있다는 것으로 생각된다.
결론적으로, 상기 논의한 결과는 prM/E 발현 가능한 YF PIV, 및 대개 다른 플라비바이러스로부터 유래된 PIV는 또 다른 복제 결함, 캡시드-생성 플라비바이러스 게놈 결함을 사용하는 조직 배양액에서 계대될 수 있다는 것을 제안한다(도 7). 동일한 세포에서 복제 동안, 이들 두 결함 게놈은 바이러스 구조 단백질의 완전한 세트를 생성하고, 이성분 게놈 바이러스로서 특징화될 수 있는 분리된 감염성 바이러스 입자로 효과적으로 패키지된다. 상기 나타내었듯이, PIV는 효과적인 면역원으로서 기능하고, 따라서 이성분 게놈 바이러스는 재조합 플라비바이러스-특이적 백신의 개발에 적용될 수 있다(도 7). 이들 백신은 불활성화 백신보다 저렴하고 생 약독화 백신보다 안전할 것이다. 결실된 prM/E 유전자를 갖는 YFV 게놈으로부터의 캡시드의 발현은 5' 말단 서열의 추가 변형 및 추가의 캡시드-특이적 서열의 클로닝을 필요로 하였다. 복제-가능 YFV로의 동일한 변형의 적용은 추가의 유전 정보를 발현할 수 있는 바이러스의 개발을 유도하였다. 패키징 셀라인 발생에 사용되는 VEEV 레플리콘에서 YFV C-prM-E 발현 카세트의 변형은 패키징 YFV-기반 벡터를 현저하게 개선시켰다. YFV 게놈 또는 캡시드-암호화, 복제 결함 YFV 게놈에서 캡시드-암호화 서열과 프로모터 구성요소의 분리는 고리화 신호에 독립적으로 이종 플라비바이러스로부터 유래된 구조 유전자의 발현에 대한 기회를 제공하며, 패키징 프로세스의 메커니즘 연구를 위한 가능한 수단을 제공한다.
본 발명은 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 새로운 종류의 RepliVAX 구조체의 제조 및 평가를 계획한다:
(1) 이성분 게놈 입자 제조(존재하는 구조체로부터 리포터 유전자의 제거 포함) 및 분석 시스템. RepliVAX을 안정한 셀라인을 사용하여 또는 고유의 이성분 게놈 시스템에서 복제할 수 있다. YFV의 경우, 두개의 결함 게놈을 갖는 시스템, 필수적인 C 유전자 및 적색 형광 단백질을 암호화하는 것, 및 prM 및 E 단백질 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 것을 개발하였다. 두 게놈의 시험관내-합성된 RNA로 공동-트랜스펙션된 세포가 바이러스 입자를 생성하였고, 여기서 C 또는 prME-암호화 게놈이 동일한 농도로 존재하였으며, 이 이성분 게놈 바이러스는 MOI가 1inf.u/세포를 초과한다면 증가된 규모에서 나이브 세포에서 더 계대 배양될 수 있었다.
이 시스템을 강화하기 위해서, 두 YFV 게놈(RepliVAX YF 및 헬퍼) 내의 리포터 유전자를 결실하여 동물 테스트에 적용가능한 이성분 게놈 바이러스를 만들고, 각 게놈을 함유하는 입자의 정량 분석에 적용할 수 있는 셀라인을 개발한다. 본 발명은 WNV의 발생에서 유사한 작업을 계획한다. 변형된 C- 및 prM/E-암호화 게놈을 시험관내 합성하고 베로 세포로 트랜스펙션한다. 이성분 동시-배양액의 희석에 이어서 C 또는 prM/E 단백질을 발현하는 셀라인에 대한 포커스 형성에 의해 각 게놈 입자(C 또는 prM/E-암호화)의 양을 정하기 위한 방법을 개발한다. prM/E-게놈-암호화 RepliVAX 입자는 C-생성 세포에서 포커스를 형성할 수 있고 C-생성 "헬퍼" 게놈은 C-생성 셀라인에서 포커스를 형성할 것이다.
(2) TBE 키메라의 발생: TBEV prM/E-암호화 YFV-기반 RepliVAX를 사용한다. prM/E-암호화 카세트를 올리고뉴클레오티드로부터 합성하고, 가장 효과적으로 번역된 인간 mRNA로부터 유래한 코돈 빈도를 적용함으로써 가장 효과적인 발현을 위하여 서열을 최적화한다. 예비 데이터에 기초하여 prM 중의 TBEV 신호 펩티드를 YFV-특이적 아미노산 서열로 교체하는데, 예비 실험이 이러한 교체가 바이러스 입자 생성을 매우 증가시키는 것으로 제안하기 때문이다. 이들 RepliVAX 게놈을 i) SVP 생성에 대한 능력에 대하여 평가하고 ii) 패키징 베로 셀라인, 발현 TBEV 캡시드 및 이성분 게놈-기반 패키징 시스템을 사용하여 TBEV 외피로 패키징하는데, 여기서 두번째 결함 게놈은 코돈-최적화되 TBEV C를 발현한다.
이에 더하여, 본 발명은 트랜스인캡시데이션 시스템의 개발을 계획한다: 본 발명은 YFV RepliVAX 플랫폼을 위한 트랜스-패키징 시스템의 개발을 계획한다. 수지상 세포 감염, 결과적으로 항원 제시에 가장 효과적인, RepliVAX YF의 외피로의 패키징을 위한 보편적인 시스템을 개발한다. 이 패키징은 RepliVAX 게놈에 의해 암호화되는 플라비바이러스 글리코단백질에 독립적이다. 이 트랜스-패키징 시스템은 DEN 글리코단백질의 사용 및 상이한 DEN 바이러스로부터 유래된 외피 글리코단백질을 암호화하는 RepliVAX 게놈에 의해 유도된 면역 반응의 차이로부터 초래되는 가능한 비효과적 감염을 극복할 것으로 예상된다.
본 발명은 i) 가장 효과적인 감염성 입자 생성을 위한 상이한 패키징 전략(패키징 셀라인 대 이성분 게놈); ii) 상이한 DEN 바이러스(DEN1 및 DEN2)로부터 유래된 단백질; iii) 베로 세포에서 패키지된 RepliVAX 게놈의 대규모 제조의 효율성; iv) 후속 계대 동안 DEN 카세트의 안정성; 및 v) RepliVax 면역화 후 DEN1 및 2에 대하여 마우스에서 유도된 면역 반응의 효율성을 시험하는 것을 계획한다.
본 발명은 또한 TBEV prM/E-암호화 RepliVAX YF의 동종, YFV, 구조 단백질로의 패키징을 계획한다. 예비 데이터는 이러한 패키징이 효과적이며, 그 이상의 개발은 최종적으로 어떤 이종 prM/E 카세트를 암호화하는 RepliVAX 게놈에 대한 보편적 패키징 시스템의 개발을 유도할 수 있다는 것을 강하게 제시한다.
본 발명은 RNA 복제에 필요한 시스-작용 프로모터 구성요소, 외피 단백질 및 플라비바이러스의 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하고 플라비바이러스의 캡시드 단백질은 암호화하지 않는 가감염성 바이러스 게놈; 및 RNA 복제에 필요한 시스-작용 프로모터 구성요소, 캡시드 단백질 및 플라비바이러스의 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하고 플라비바이러스의 외피 단백질은 암호화하지 않는 보완 게놈을 포함하는 이성분 게놈 플라비바이러스에 관한 것이다. 추가적으로, 가감염성 바이러스 게놈 및 보완 게놈은 또한 RNA 복제에 필수적인 고리화 서열을 함유하는 5' UTR 및 캡시드 단백질 오픈 리딩 프레임의 아미노 말단 단편을 암호화하여야 한다. 또한, 가감염성 바이러스 게놈 또는 보완 게놈은 외피 단백질 또는 캡시드 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 유비퀴틴 또는 수족구병 (FAMDV)-특이적 2A 프로테아제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 가감염성 바이러스 게놈 및 보완 게놈은 다른 바이러스, 박테리아 또는 기생충의 구조 유전자를 포함하는 추가의 유전 물질을 더 포함할 수 있으며, 여기서 유전자의 발현은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의해 유발된 감염에 대한 면역 반응을 유도한다. 플라비바이러스의 대표적인 예는 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머리 벨리 뇌염 바이러스, 돼지 열병 바이러스 또는 C형 간염 바이러스를 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 본원에 설명한 이성분 게놈 플라비바이러스로 감염된 세포 배양 시스템에 관한 것이다. 세포 배양 시스템의 대표적인 예는 Vero, BHK-21, C7/10 또는 척추동물 또는 모기 기원의 다른 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 세포 배양 시스템을 동일한 세포에서 두 게놈 복제를 가능하게 하는데 효과적인 상기 설명한 이성분 게놈 플라비바이러스로 감염시키는 단계; 및 이성분 게놈 플라비바이러스를 방출시키는 단계를 포함하고, 이로써 이성분 게놈 플라비바이러스의 대규모 증식을 가능하게 한다. 이성분 게놈 플라비바이러스의 대규모 증식 방법에 관한 것이다. 일반적으로 세포 배양 시스템은 1 감염 유닛/세포 보다 많은 다수의 감염으로 이성분 게놈 플라비바이러스로 감염된다. 추가적으로, 복제 결함 플라비바이러스는 복제에 결함이 있고, 질병을 초래할 수 없고, 감염성이며, 생체내에서 1회 감염을 행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 설명한 이성분 게놈 플라비바이러스, 보조제, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 이들의 조합을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역학적으로 효과적인 양의 상기 설명한 면역원성 조성물을 피험자에 투여하며, 이때 조성물은 피험자에서 플라비바이러스에 대한 면역 반응을 유도하고, 이로써 플라비바이러스에 대한 노출로 인한 감염으로부터 피험자를 보호하는 것을 포함하는, 플라비바이러스에 대한 노출로 인한 감염으로부터 피험자를 보호하는 방법에 관한 것이다. 추가적으로, 투여는 복막내, 피내, 피하, 근육내, 경구 또는 비강내 경로를 통할 수 있다. 플라비바이러스의 예는 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머리 벨리 뇌염 바이러스, 돼지 열병 바이러스 또는 C형 간염 바이러스를 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용하는 경우 단어 "하나" 또는 "하나의"의 사용은 "한개"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 의미와 일치할 수도 있다. 본 발명의 일부 실시형태는 하나 이상의 구성요소, 방법 단계, 및/또는 본 발명의 방법으로 이루어지거 필수적으로 이루어질 수 있다. 본원에 설명된 어떤 방법 또는 조성물은 본원에 설명된 어떤 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 수행될 수 있다는 것으로 생각된다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 개시 내용이 오직 대안 및 "및/또는"을 뜻하는 정의를 뒷받침하더라도, 오직 대안을 의미하도록 설명되지 않거나 대안이 서로 배타적이지 않으면 "및/또는"을 의미하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "면역학적으로 효과적인 양"은 면역 반응의 도입에 의해서 질병 또는 상태의 징후의 개선 또는 교정을 야기하는 양을 의미한다. 당업자는 효과적인 양이 환자 또는 피험자의 상태를 개선시킬 수 있지만, 질병 및/또는 상태를 완전히 치료하지 않을 수 있다는 것을 이해한다. 본원에 사용된 "보조제"는 백신 제형에 포함될 때 항원에 대한 면역 반응을 비특이적으로 향상시키는 물질로서 정의된다.
본원에 개시된 면역원성 조성물은 단독으로 또는 다른 약물, 화합물 또는 항생물질과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 약물, 화합물 및 항생물질은 본원에 개시된 면역원성 조성물과 동시에 또는 순차로 투여할 수 있다. 면역원성 조성물과 동시 투여의 효과는 치료하는 질병에 대하여 적어도 최소한의 약리 또는 치료적 효과를 갖는 것으로 알려진 보통 요구되는 약물, 화합물 또는 항생물질의 투약을 낮춘다. 부수적으로, 정상 세포, 조직 및 기관에 대한 약물, 화합물 또는 항생물질의 독성은 세포 독성, 세포증식 억제, 아폽토시스 또는 다른 사멸의 감소, 경감, 억제 또는 방해, 또는 약물, 화합물 또는 항생물질의 치료적 효과 억제 없이 감소된다.
본원에 설명된 조성물, 약물, 화합물 또는 항생물질은 독립적으로 전신 또는 국부적으로, 당해 기술 분야의 표준 방법으로, 예컨대, 피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 국소적, 장관내, 직장내, 비강내, 볼점막, 질내 또는 흡입 스프레이, 약물 펌프 또는 경피 패치 또는 이식편 내에 함유된 것에 의하여 투여될 수 있다. 본원에 설명된 조성물의 투약 제형은 투여 방법에 적합한 종래의 비독성, 생리학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 운반체를 포함할 수 있다.
본원에 설명된 면역원성 조성물 및 약물, 화합물 또는 항생물질은 치료 효과를 달성, 유지 또는 향상시키도록 1회 이상 독립적으로 투여할 수 있다. 투약량 또는 면역원성 조성물 및 약물, 화합물 또는 항생물질의 적절한 투약량이 단일 투여 투약 또는 다중 투여 투약을 포함하는지의 여부는 당해 기술 분야의 숙련자의 범위 내에 있다.
당업계 잘 알려진 바와 같이, 어떤 특정 환자에 대한 이러한 면역원성 조성물의 특정 투약 수준은 사용하는 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 건강 상태, 성별, 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 약물 조합 및 치료하는 특정 질병의 심각성에 달려 있다. 투여하는 사람은 개별 피험자에 대하여 적절한 투약을 결정할 것이다. 또한, 사람 투여를 위해서, 조제품은 FDA의 생물학적 기준에 의해 요구되는 바와 같이 불임증, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도 기준을 충족해야 한다.
본 발명의 면역원성 조성물의 피험자 투여는 필요하다면 면역원성 조성물 내의 성분들의 독성, 및/또는 병용 치료의 실시형태에서 항생물질의 독성을 고려하는 박테리아 감염의 요법에 사용되는 치료의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 치료 사이클은 필요에 따라 반복할 수 있는 것으로 예상된다. 또한 다양한 표준 요법 및 외과적 개입을 설명한 요법과 병용하여 적용할 수 있다는 것도 고려된다.
당업자에게 알려진 바와 같이 본원에 설명된 면역원성 조성물은 어떤 알려진 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여할 수 있다. 추가적으로, 면역원성 조성물은 피하, 비강내 또는 점막과 같은 알려진 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 투여되는 조성물의 투약량은 당업자에게 알려진 바와 같이 실험을 행함으로써 결정될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 실시상태를 설명하기 위한 목적으로 제시되고 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 의미가 아니다. 당업자는 본 발명이 이러한 목적을 수행하고, 전술한 목표 및 이점을 달성하기 위하여 잘 응용될 수 있다는 것과, 본원의 고유의 목적, 목표 및 이점을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 청구 범위에 의하여 정의된 본 발명의 사상 내에 포괄된 본원의 변화 및 다른 용도를 당업자가 발견할 것이다.
실시예 1
세포 배양
BHK-21 세포는 폴 올리보(Paul Olivo, Washington University, St. Louis, Mo)로부터 제공되었다. 이들은 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 비타민이 보충된 알파 최소 필수 배지(aMEM) 내에서 37℃로 유지되었다.
실시예 2
플라스미드 구조체
표준 재조합 DNA 기법을 모든 플라스미드 제조에 사용하였다. YFV 17D 균주 게놈의 감염성 cDNA를 함유하는 모계 낮은-카피 수 플라스미드 pACNR/FLYF-17Dx가 설명되어 있으며(Bredenbeek et al., 2003), 찰스 엠. 라이스 박사(Dr. Charles M. Rice, Rockefeller University, New York)로부터 제공받았다.
pYF/GFP/prME는 결함 YFV 게놈(YF PIV)을 함유하였으며, 여기서 YF 캡시드 유전자의 아미노산 26-100을 암호화하는 단편을 pEGFP-N1에서 유래한 코돈-최적화 GFP 유전자로 교체하였다(Clontech). 이 플라스미드는 이전 연구에서 설계되었으며, 여기에서는 Cherry(적색 형광 단백질 중 하나)-암호화 서열과 융합된, 전체 캡시드 단백질, 이어서 prM 신호 펩티드 및 prM의 6 아미노산을 암호화한 pYF/PFV. pYF/C/Cherry로 명명되었다. 후자의 유전자는 E 단백질의 막통과 도메인으로부터 출발하는 YF ORF의 나머지와 함께 프레임에 융합되었다(상세는 도 1A 참조).
플라스미드 pYF/C/GFP/C는 YFV 게놈을 함유하였으며, 여기서 101 아미노산-길이의 캡시드-암호화 서열은 GFP, 이어서 수족구병 바이러스의 2A 프로테아제(FAMDV 2A), 코돈-최적화 캡시드 유전자 및 YF 폴리단백질 prM-NS5-암호화 서열의 나머지와 융합되었다. pYF/Cfrs/GFP/C 및 pYF/Chyb/GFP/C은 기본적으로 동일한 설계를 가졌지만(도 2A), pYF/Cfrs/GFP/C에서, nt 202 및 nt 422 결실 후 하나의 뉴클레오티드를 삽입하였고, pYF/Chyb/GFP/C에서, nt 201와 422 사이의 서열은 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만 상이한 코돈 용법를 사용하는 합성 유전자로 교체하였다.
pYF/DC/GFP/C 및 pYF/C/DGFP/C는 pYF/C/GFP/C의 유도체였으며, 각각 선택한 결실 돌연변이체에서 확인된 캡시드- 및 GFP-암호화 서열 내에 결실을 포함하였다(상세는 도 3A 참조). pYF/GFP는 YFV 게놈을 포함하였고, 여기서 5'UTR에 이어서 GFP 및 FAMDV 2A과 융합된 YFV 캡시드의 25 아미노산을 암호화하는 ORF 및 전체 YFV 폴리단백질 C-NS5이 후속하며, 여기서 캡시드 유전자는 코돈-최적화 형태로 제공된다(도 4A). pYF/GFPmut는 기본적으로 동일한 설계를 갖지만, 캡시드의 25 아미노산을 암호화하는 단편은 GFP-암호화 서열의 시작시 3 1-nt-길이의 삽입 및 점 돌연변이를 함유하였다.
pYF/Cherry/Cco는 결함 YFV 게놈을 함유하였으며, 여기서 캡시드의 75 nt는 Cherry 유전자, 이어서 FAMDV 2A 프로테아제, prM 신호 펩티드가 있는 코돈-최적화 캡시드, prM의 6 아미노산, E 단백질의 49 카르복시 말단 아미노산 및 YFV 폴리펩티드의 나머지를 암호화하는 서열과 융합되었다(도 5A). pYFrep/Cherry는 YFV 레플리콘을 함유하였으며, 여기서 구조 유전자는 Cherry 단백질-암호화 서열로 교체되었다. 아미노 말단에서 Cherry는 YFV 캡시드의 25 아미노산과 융합되었고, 카르복시 말단에서, 이것에 이어서 FAMDV 2A, 이어서 NS1 신호 펩티드 및 YFV 폴리단백질의 나머지가 후속하였다(도 6A).
pVEErep/C-prM-E/Pac 플라스미드는 본원에 설명되었다. pVEErep/GFP-C-prM-E/Pac 플라스미드는 VEEV 레플리콘을 함유하였으며, 여기서 서브게놈 RNA는 GFP와 융합된 YFV 캡시드의 25 아미노산, 이어서 FMDV 2A 프로테아제, 코돈-최적화 YFV 캡시드 및 prM/E 유전자를 암호화하였다. 제2 서브게놈 프로모터는 Pac, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제의 발현을 작동하고 있었다. 모든 재조합 바이러스 게놈 및 레플리콘은 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터의 제어하에 클로닝하였다.
실시예 3
RNA 전사
플라스미드는 CsCl 구배의 원심분리에 의하여 정제되었다. 전사 반응 전에, 플라스미드는 YFV 게놈 또는 레플리콘-함유 플라스미드는 Xhol에 의하여 선형화되었다. VEEV 레플리콘을 갖는 플라스미드는 MluI에 의해 선형화되었다. RNA는 본원에 설명한 바와 같이 캡 유사체의 존재하에 SP6 RNA 폴리머라제에 의하여 합성되었다. 전사의 수득률 및 통합성은 비변성 조건 하에서 겔 전기영동에 의하여 분석되었다. 전사 반응의 분취액을 추가의 정제 없이 전기천공에 사용하였다.
실시예 4
RNA 트랜스펙션
BHK-21 세포의 전기천공은 전술한 조건하에서 수행하였다(Liljestrom et al., 1991). 패키징 세포 배양액을 제조하기 위하여, VEEV 레플리콘의 전기천공 24 시간 후 Pur를 10 g/ml 농도로 배지에 첨가하였다. 레플리콘-함유 세포가 효과적인 성장을 다시 시작하는 경우, 시험관내-합성된 YF PIV 게놈의 트랜스펙션을 5일 후 수행하였다.
실시예 5
결함 YFV 게놈을 함유하는 감염성 바이러스 입자의 역가의 측정
상이한 결함 게놈을 함유하는 방출된 비리온의 역가를 측정하기 위하여, BHK-21 세포를 5 x 105 세포/웰의 농도로 6-웰 코스타르 디쉬에 파종하였다. 4시간 후, 세포를 상이한 샘플 희석액으로 감염시켰다. 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃로 1시간 배양 후, 이들을 10% FBS으로 보충한 2ml의 aMEM로 오버레이하였다. 감염된 세포의 수는 36시간 인큐베이션 후 전환 UV 현미경으로 GFP- 및 Cherry-양성 세포를 계수함으로써 측정하였다. 파종 양으로부터 감염된 세포의 비율을 현미경 범위에서 정의된 영역 내에서 형광-생성 세포를 계수함으로써 측정하였다. 5개의 서로 다른 영역을 계수하여 평균을 내었으며, 각각 연속 희석에 대응하는 역가로 재계산하였다.
복제-가능 바이러스의 역가를 BHK-21 세포 상의 샘플의 표준 플라크 분석법에 의하여 측정하였다(Lemm et al., 1990). 37℃에서 3일 동안 인큐베이션 후, 2.5% 포름알데히드로 단일층을 고정시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
실시예 6
바이러스의 계대
시험관내-합성된 VEEV 레플리콘 RNA의 트랜스펙션, 그 다음 Pur 선택에 의해 패키징 셀라인을 수립하였다. 이들 셀라인은 시험관내-합성된 YFV 레플리콘 RNA에 의해 트랜스펙션되거나 미리 패키지된 레플리콘으로 감염되었다. 도면에 표시된 시점에서 배지 교체에 의해 샘플을 수확하였다. 세포를 상기 표시된 MOI에서 감염시킴으로써 이성분 게놈 YF 바이러스의 계대를 행하였다. 도면에 표시된 시점에서 배지 교체에 의해 샘플을 수확하였고, 결함 게놈을 함유하는 입자의 역가를 상기 나타낸 바와 같이 측정하였다. 이전 계대에서 수확한 바이러스 100μl으로 순수 BHK-21 세포를 감염시킴으로써 복제-가능 바이러스를 계대하였다. 감염 72시간 후 샘플을 수확하고 플라크 분석법으로 역가를 측정하였다.
실시예 7
YF SVP 제조의 분석
BHK-21 세포를 8mg의 인비트로 합성된 YFV 17D 또는 YF/GFP/prME 바이러스 게놈으로 트랜스펙션하거나, YF/Cherry/Cco 및 YF/GFP/prME 게놈으로 동시-트랜스펙션하였다. 10% FBS로 보충한 10ml의 aMEM 내에서 24시간 배양 후, 24시간 내에 수확되는 10ml의 무혈청 배지 VP-SF(Invitrogen)로 나중의 배지를 교체하여 SVP 방출을 분석하였다. 수집된 VP-SF 샘플을 저속 원심분리(5,000r.p.m, 10분, 4℃)로 정화한 다음, SW-41 로터에서 39,000r.p.m, 4℃에서 6시간 동안, PBS에서 제조된 2ml의 10% 수크로스에 의한 초원심분리로 농축하였다.
펠릿 물질을 이전에 설명된 수크로스 밀도 구배에서 더 분석하였다(Schalich et al ., 1996). 간단히 설명하자면, 0.5ml 샘플을 불연속적 수크로스 구배(PBS 완충액에서 제조된 1.5ml의 50%, 1.5ml의 35% 및 1.5ml의 10% 수크로스)가 되도록 첨가하였다. 원심분리를 SW-55 로터로 45,000rpm, 4℃로 4시간 동안 수행하였다. 분 리 후, 샘플을 PBS로 3배 희석하고 옵티마 맥스 원심분리기(Beckman) 내에서 SW-55 로터로 45,000rpm, 4℃로 1시간 동안 원심분리를 행하여 SVP를 펠릿화화였다. 펠릿을 (D1-4G2 MAB에 대한 결합을 보존하기 위하여) b-머캅토에탄올이 결핍된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위한 로딩 완충액에 용해시키고, 추가로 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 단백질 전이 후, 니트로셀룰로오스 막은 D1-4G2 MAB, 및 Santa Cruz Biotechology로부터 구입한 홍당무 과산화효소(HRP)-컨쥬게이트화된 2차 당나귀 항-마우스 항체에 의하여 처리되었다. HRP를 제조사(Santa Cruz Biotechnology)의 권장사항에 따라 웨스턴 블롯팅 루미놀 시약을 사용하여 검출하였다. 병렬적(Side by side) 구배 분석을 YFV(2 X 108 PFU)로 수행하고, YFV-PIV 유도된 SVP에 대하여 상기 설명한 바와 동일한 절차를 실시하였다.
실시예 8
생체내 실험
6일된 마우스(outbred Swiss Webster, Harlan)를 도면에 표시된 투여량으로 두개내(i.e.) 경로(20ml 부피)에 의해 재조합 YFV으로 감염시켰다. 질병 및 죽음의 징후, 그 다음 죽어가는 동물에 대하여 8일 동안 마우스를 모니터한 다음, 뇌 중의 역가를 플라크 분석법으로 평가하였다.
실시예 9
캡시드- 및 prM/E-발현 결함 YFV 게놈은 복제 효율성이 매우 다르다
이전 연구에서, YFV 복제 결함의 교차-보완 및 결함 게놈의 감염성 YF 바이 러스 입자로의 패키징을 위한 시스템을 개발하였다. 이를 달성하기 위해서, 셀라인을 이들이 YFV 캡시드 또는 캡시드-결함 YFV 게놈의 복제를 보완하는 전체 구조 폴리단백질을 생성하는 VEEV 레플리콘을 함유하도록 설계하였다. 그러나, 알파바이러스 레플리콘의 사용은 교차-보완의 절대적인 필요조건은 아니다. 기능적 캡시드는 플라비바이러스 게놈 패키징에 충분한 수준으로 그것의 생성할 수 있는 다른 카세트에 의해 명백하게 공급될 수 있다. 그러므로, 시도는 패키징 시스템으로부터 어떤 이종 발현 벡터를 제외하고 캡시드-암호화 것 이외에 구조 유전자가 결핍된 제2 YFV 게놈으로부터 캡시드를 생성하도록 이루어졌다.
PIV 게놈(YF/GFP/prME)은 거의 전체 캡시드-암호화 서열이 결실되었고, 제2의, 보완 게놈(YF/C/Cherry)은 prM/E-암호화 서열이 결실되었으며, 캡시드 유전자는 무손상으로 남아있었다. 조직 배양액에서 두 게놈의 복제 패턴을 분석하기 위해서, 두개의 상이한 형광 단백질, GFP 및 Cherry을 그들의 ORF로 클로닝하였다(도 1A). 두 게놈은 구조 단백질의 완전한 세트를 생성하지 못하기 때문에 생산적인, 전파되는 감염을 발생하지 못할 것으로 예상되었다. 그러나, 이들은 동일한 세포에서 복제하면서 바이러스 입자 형성에 필요한 모든 단백질을 생성할 수 있었다.
시험관내-합성된 RNA를 BHK-21 세포로 공동-트랜스펙션하였고, 두 마커, GFP 및 Cherry의 발현은 이들의 복제를 확인하였다. 놀랍게도, 캡시드- 또는 prM/E-암호화 게놈을 함유하는 방출된 감염성 바이러스, 입자의 역가는 106inf.u/ml에 근접하여 예상보다 낮았는데, 이는 교차-보완이 비효과적이었다는 것을 암시한다(도 1B). GFP와 Cherry 발현 패턴의 비교는 캡시드-암호화 게놈이 그것의 prM/E-생성 대응물 보다 더욱 효과적으로 현저하게 복제되었다는 것을 나타내었다. 전기 천공 후, Cherry의 발현은 GFP-발현 결함 게놈보다 18 내지 24시간 빨리 검출가능한 수준에 도달하였지만, 가장 중요한 것은, 그것의 복제 또한 트랜스펙션 후 2-3일 내에 세포사를 유발하였다는 것이다. 신속한 CPE 발생은 Cherry 단백질의 부작용이 아니었는데, Cherry가 GFP로 교체된 동일한 카세트도 높은 세포병원성를 나타내었기 때문이다(데이터는 나타내지 않음).
추가 실험에서, GFP 및 Cherry 발현 게놈의 복제를 전체 YFV 구조 폴리단백질 전구체, C-prM-E가 VEEV 레플리콘으로부터 발현된 이전에 설계된 셀라인과 비교하였다. 상기 설명한 데이터와 일치하여, 캡시드-발현 YF/C/Cherry 게놈의 복제는 세포에 해로운 효과를 가졌으며, 기본적으로 트랜스펙션된 모든 세포는 트랜스펙션 후 96시간 이내에 사멸하였고(도 1C), 감염성 바이러스 입자는 prM/E-발현 구조체, YF/prME/GFP로 트랜스펙션된 동일한 세포의 배지에서 발견된 것 보다 낮은 역가로 방출되었다.
이전에 설명된 바와 같이(Mason, Shustov, and Frolov, 2006), YF/prME/GFP를 보유하는 세포는 CPE를 발생하지 않았고(도 1C) 후속 세포 계대 배양 후에도 패키지된 바이러스 게놈을 계속 방출하였다. 따라서, 상기 실험은 YF/C/Cherry 게놈 내의 캡시드-암호화 서열의 존재 또는 캡시드 단백질 자체의 발현(또는 두 요소 모두)이 이 복제 RNA의 세포병원성을 강하게 결정하므로, 비효과적인 교차-보완에 대한 근거가 될수 있는 캡시드- 및 prM/E-생성 게놈의 충분한 복제 차이를 생성하였 다. 또한, 트랜스펙션된 세포는 높은 역가로 감염성 바이러스 입자의 방출 이전에 사멸되었을 수도 있다.
실시예 10
YFV 게놈 RNA의 복제에 대한 캡시드 단백질의 효과
결함 YFV-특이적 RNA의 복제에 대한 캡시드 또는 캡시드-암호화 서열의 효과 사이를 구별하기 위해서 설계하였고, 이때 재조합 YFV 게놈의 세트에서, 구조 및 비구조 유전자의 모두를 포함하는 전체 폴리단백질을 암호화하는 서열 및 복제에 필요한 RNA 프로모터 구성요소를 함유하는 5'-말단 서열이 분리되었다. 이를 달성하기 위해서, 폴리단백질 중의 천연 캡시드 유전자를 RNA 복제에서 기능하지 못하는 돌연변이 고리화 서열을 갖는 그것의 코돈-최적화 형태(Cco)로 교체하였다. 그 다음, YFV 5'UTR를 Cco의 상류 이어서 GFP 및 FAMDV 2A 프로테아제 유전자와 융합된 prM-특이적 신호 펩티드가 없는 천연 캡시드를 암호화하는 서열을 클로닝하였다. 따라서, 상류 캡시드 유전자는 RNA 복제에 필수적인 고리화 신호, 및 개시 메티오닌 코돈을 포함하였다.
최종 구조체 YF/C/GFP/C에서, ORF는 이 개시 AUG으로부터 출발하여 전체 폴리단백질을 통해 계속되었다. Cco 아미노산 서열은 제1 아미노산으로서 프롤린을 갖는 것에 의해서만 천연 YFV 캡시드와 상이하였는데, 이것은 FAMDV 2A-특이적 가공에 필요하였기 때문이다. 이 실험 시스템은 기능적 캡시드 단백질(Cco) 발현에 영향을 미치지 않고 아미노-말단, ORF의 천연 캡시드-암호화 부분에 광범위한 변형을 포함하는, 매우 다양한 5' 말단 조작을 행하는 것을 허용하였다. 그러므로, 또 다른 카세트, YF/Cfrs/GFP/C에서 제1 캡시드는 nt 202 후 1 nt 삽입 및 nt 421 후 1 nt 결실되었다. 이들 변형은 바이러스 게놈의 5' 말단 및 음성 주형 RNA의 3' 말단의 컴퓨터 예상 2차 구조를 세이브하는 방식으로 이루어졌지만, 이들은 대형 캡시드 단편을 포함하는 73 아미노산-길이의 펩티드의 서열이 변화하였다.
제3 구조체, YF/Chyb/GFP/C에서, 제1 캡시드 유전자는 천연 및 코돈-최적화 서열 사이의 하이브리드였다. 이것은 야생형 단백질을 암호화하였지만, nt 202로부터 출발하는 고리화 서열로부터 하류의 RNA 서열은 야생형 YFV 게놈의 것과 상이하였다. 따라서, 재조합 바이러스 게놈의 5' 말단은 i) GFP와 융합된 천연 캡시드 유전자(YF/C/GFP/C), 또는 ii) 거의 천연 RNA 서열(두개의 프래임-시프트 돌연변이만을 갖는)를 암호화하였지만, 단백질(YF/Cfrs/GFP/C), 또는 iii) 변형된 RNA 서열을 강하게 변성시켰고, 천연 단백질(YF/Chyb/GFP/C)은 그렇지 않았다. 모든 3개의 RNA 및 YF 17D 게놈의 RNA를 시험관내 합성하였고 동일한 양을 BHK-21 세포로 트랜스펙션하였다.
감염성 바이러스 방출의 분석은 돌연변이된 제1 캡시드를 발현하는 구조체, YF/Cfrs/GFP/C만이 YFV 17D에 의해 달성되는 것과 견줄만한 역가로 효과적인 복제가 가능하였다는 것을 입증하였다(도 2B). 그러나, 아직 복제율 차이는 현저하였다. YF/Chyb/GFP/C 및 특히 YF/C/GFP/C, GFP와 융합된 wt 캡시드를 발현하는 두 게놈은, 이들이 YF/Cfrs/GFP 보다 높은 수준으로 GFP를 발현하였다는 사실에도 불구하고, 매우 높은 세포변성 표현형 및 현저한 감염성 바이러스 방출의 감소를 나타내었다. 종합하여, 이들 실험의 결과 및 앞선 단락에 나타낸 것은 그것의 천연 컨 텍스트 외부에서 발현된 YFV 캡시드가 재조합 바이러스의 세포병원성 및 결과적으로 그들의 세포 배양액에서의 성장에 대하여 강한 효과를 갖는다는 것을 나타내었다. 추가 실험에서, 구조체의 세포독성이 GFP-융합된 또는 자유 형태(나타내지 않음)에서 캡시드 발현에 의존하지 않는다는 것을 나타내었다. 융합된 또는 자유 형태로 발현된 GFP 사이의 오직 주목할만한 효과는 그 세포내 분포에 있었다.
실시예 11
감소된 세포병원성을 갖는 YFW 변형체의 선택
설명한 상기 실험에서, 캡시드 유전자의 두 카피를 함유하는 YF/C/GFP/C 바이러스는 시험관내-합성된 RNA의 트랜스펙션 후 처음 3일 이내에 감염성 바이러스의 매우 비효과적인 방출 및 세포 군집의 대부분의 사멸에 의해 특징화되는 매우 드문 복제를 나타내었다(도 2B). 그러나, GFP-양성 세포의 적은 퍼센트가 생존하였고, 성장을 계속하였으며, 트랜스펙션 72시간 후에 트랜스펙션 후 초기 시간 동안 보다 더욱 효과적으로 바이러스를 생성하였다(도 2B). 5일 후, 바이러스 역가는 108inf.u/ml에 도달하였다. 이들 데이터는 높은 세포변성 표현형에 영향을 미치고 연장된, 보다 효과적인 감염성 바이러스 방출을 유도할 수 있는 바이러스 게놈 내의 돌연변이의 축적의 가능성을 제안하였다.
이들 적응 변화를 확인하기 위해서, 5'UTR, 임의로 선택한 돌연변이체의 아미노 말단 캡시드- 및 GFP-암호화 단편을 서열화하였다. 이들은 캡시드(아미노산 29-66) 또는 GFP(아미노산 3-121) 유전자에서 큰 프레임 결실, 또는 두 결실 모두 를 포함하였다(도 3A). 흥미롭게도, 결실은 GFP 유전자에서 (컴퓨터-예상 2차 구조의 루프 내의) 캡시드 서열에 위치한 매우 짧은(UAAA; SEQ ID NO: 1) 반복과 UGGUGA(SEQ ID NO: 2) 반복 사이에서 발생하였다. 이들 서열화 데이터는 결실이 바이러스 복제에 대하여 중요한 이로운 효과를 갖는다는 최종적 해석에 불충분하였다. 그러므로 두 GFP- 및 캡시드-특이적 결실을 분리하여 YF/C/GFP/C 게놈으로 클로닝하였다(도 3B). 시험관내-합성된 RNA를 BHK-21 세포로 트랜스펙션하였고, 캡시드 내의 결실만이 감염성 바이러스 방출의 수득율에 대한 긍정적인 효과를 나타내었다. YF/C/DGFP/C이 아닌 재조합 YF/DC/GFP/C는 YFV 17D와 유사한 성장율을 나타내었다(도 3B). 따라서, 이들 실험의 결과는 제1 캡시드-암호화 서열의 변화가 바이러스의 복제 효율 변경 및 조직 배양액에서 효과적인 증식이 가능한 변형체의 구성의 효과적인 수단일 수 있다는 것을 제안하였다.
실시예 12
이종 유전자를 발현할 수 있는 YFV 의 개발
효과적인 복제 가능한 YFV 설계 및 이종 유전자의 안정한 발현의 가능성을 실험적으로 테스트하기 위해서, 두 재조합 YFV 게놈, YF/GFP 및 YFmut/GFP를 설계하였다. 캡시드-암호화 서열의 75 nt-길이의 단편을 GFP 및 FAMDV 2A 유전자 상류에 클로닝하였고, 이것에 이어서 코돈-최적화 캡시드 유전자를 함유하는 전체 YFV 폴리단백질-암호화 서열이 후속하였다(도 4A). YF/GFP는 5'-말단 서열에 어떤 다른 변화를 갖지 않았고, YFmut/GFP에서 추가의 변형은 다음과 같다: i) GFP 중의 UGGUGA(SEQ ID NO: 2) 서열을 암호화된 단백질 서열은 변화시키지 않지만 YF/C/DGFP 및 YF/DC/DGFP 게놈에서 결실 형성 동안 사용되는 것으로 발견된 반복 중 하나를 변형시키는 UCGUCA로 교체하였다(SEQ ID NO: 3); ii) 고리화 서열과 GFP 사이의 짧은 단편을 3개 단일-뉴클레오티드 삽입을 형성함으로써 변형시켰다.
GFP-특이적 돌연변이를 형성하여 암호화 서열의 결실을 유도하는 GFP 유전자에서의 재조합의 가능성을 추가적으로 감소시켰다. 캡시드-암호화 서열의 변화를 형성하여 GFP의 하류에 위치한 코돈-최적화 캡시드 유전자를 갖는 ORF의 시작부에서 나머지, 75-nt-길이의 서열 사이의 가능한 재조합을 회피하였다. 시험관내-합성된 RNA를 BHK-21 세포로 트랜스펙션하였다. 기본적으로 모든 세포는 트랜스펙션 후 18시간 이내에 검출가능한 GFP 발현의 매우 유사한 수준을 나타내었으며, 이로써 두 바이러스가 생육가능하고 복제를 위한 추가의 적합화를 필요로 하지 않았다는 것을 암시한다. YF/GFP 및 YFmut/GFP 바이러스는 wt YFV 17D 보다 덜 세포독성이었으며, GFP-양성 세포는 완전한 컨플루언시에 도달할 때까지 성장을 계속하였다. 그러나, 감소된 세포병원성에도 불구하고, 두 바이러스는 효과적인 복제가 가능하였고 5x108inf.u/ml 보다 높은 역가로 배지에 축적되었다(도 4B).
GFP 삽입의 안정성을 평가하기 위해서, YFmut/GFP 바이러스의 스톡 중 하나를 BHK-21 세포에서 5회 블라인드 계대 배양하였다. 수확한 샘플의 역가에서 현저한 변화가 검출되지 않았다(도 4C). 5회 계대 후, 포커스의 11%는 GFP-음성이었지만, YFV-특이적 항체로 훼손되었다. 이들 GFF 변형체는 아직 플라크를 발생할 수 없었고, 이로써 돌연변이는 더 나은 복제 바이러스의 선택의 결과가 아닌, 기능적 단백질에 대한 긍정적인 선택의 결핍으로 인해 GFP 유전자에 축적되기 쉬었다는 것을 암시한다. PCR-기반 분석도 예상보다 두드러지게 짧은 단편을 검출하지 않았다. 따라서, GFP 이외의 이종 유전자를 발현하는 카세트를 사용하였다면, 단백질 생성의 차이가 검출되지 않았을 것이다.
또 다른 실험에서, 5x106 및 5x1O5 inf.u의 YF/GFP으로 6일된 마우스를 두개골 내로 접종하였다. 모든 마우스는 뇌염의 임상적 징후를 발현하였고 감염 후 8일째에 안락사되었다. 모든 마우스는 뇌에 2.46±0.68x108inf.u/ml 농도로 GFP-발현 바이러스의 존재를 나타내었다. 더 높은 GFP의 수준을 발현하거나 더욱 세포변성 표현형을 나타내는 더 나은 복제 변형체가 검출되지 않았다. 감염 후 8일에 뇌로부터 분리한 바이러스 샘플도 3% 미만의 GFP-음성 변형체를 함유하였다. 이들 데이터는 설계된 YFV 게놈 변형의 전략이 기능적 폴리단백질-암호화 서열 분리에 목적이 있었다는 것을 제안하였으며 프로모터 구성성분은 이종 단백질의 안정한 발현에 대한 기회를 마련한다. YF/GFP 및 YFmut/GFP는 매우 유사한 복제 특징을 나타내며, 그럼에도 불구하고 YFmut-기반 벡터는 장기 실험 및/또는 반복 계대배양을 필요로 하는 연구에 대하여 보다 우선한다.
실시예 13
두 결함 YFV 게놈간의 교차-보완
상기 설명한 실험의 데이터에 기초하여, 복제 결함 YFV 게놈, YF/Cherry/Cco 를 설계하였다(도 5A). 이것은 캡시드 유전자의 발현이 가능하였고 결실된 prM/E- 암호화 서열을 가졌다. 이는 YFV 5'UTR, 이어서 적절한 가공 및 후속 NS1-5 폴리단백질의 구획화에 필요한 캡시드의 25 아미노산, Cherry, FAMDV 2A, prM-특이적 신호 펩티드가 있는 Cco 및 E 단백질의 카르복시 말단 단편을 포함하였다. 시험관내-합성된 YF/Cherry/Cco 및 교차-보완 대응부, YF/GFP/prME 게놈을 BHK-21 세포로 트랜스펙션하였다. 이들은 구조 단백질 합성에서 서로의 결함을 보완하였고, 세포는 각각 Cherry 또는 GFP의 발현이 가능한 캡시드- 또는 prM/E-암호화, 결함 게놈을 갖는 감염성 바이러스 입자를 효과적으로 생성하였다(도 5B). 중요하게는, 두 게놈을 108 inf.u/ml에 근접한 매우 비슷한 역가로 패키징하였다. 이들은 비효과적으로 CPE를 유발하였고, 연속 감염을 용이하게 수립하였다. 세포는 성장을 계속하였고 트랜스펙션 4-5일 후 뿐만 아니라 그들의 계대 후에도 바이러스를 생성하였다.
대규모 제조의 가능성을 테스트하기 위해서, 바이러스 스톡을 나이브 BHK-21 세포에서 더 계대하였고, 각 게놈을 함유하는 입자의 역가는 108inf.u/ml에 근접하였다. 또한, 높은 MOI에서 계대를 행할 필요는 없었다. 세포는 ~10inf.u/세포의 MOI로 감염된 것만큼 효과적으로 ~1inf.u/세포 방출 패키지된 게놈의 MOI에서 감염되었다. 그러나 ~0.1inf.u/세포의 MOI로의 추가적 감소는 바이러스 역가를 현저히 낮추었다(도 5D). 1의 MOI에서 감염된 세포 단층에서, 오직 하나의 GFP 또는 Cherry 마커를 발현하는 세포를 용이하게 검출할 수 있었다. 그러나, 이들 중 대분분의 분획은 모두를 발현하였다(도 5E). 수크로스 구배에서 바이러스 밀도의 분석은 YF/GFP/prME RNA로 감염된 세포가 오직 낮은 밀도의 바이러스 입자를 방출한다 는 것을 나타내었며, 이는 뉴클레오캡시드 및 RNA가 결핍된 소위 서브바이러스 입자(SVP)를 함유하는 prM/E에 대응한다. 그러나, 두 결함 교차-보완 게놈을 함유하는 바이러스로의 감염은, 수크로스 밀도 구배에서 야생형 YF 17D 바이러스의 샘플이 행한 것과 동일한 분포를 나타내는 저밀도 및 고밀도 입자 모두의 방출을 유도하였다. 이들 데이터는 추가적으로 이성분 게놈을 갖는 바이러스가 천연 YFV의 것과 유사한 특징을 나타낸다는 것을 나타내었다.
실시예 14
구조 유전자가 결핍된 YFV 레플리콘의 패키징
이전 연구에서, YFV C-prM-E 카세트를 발현하는 셀라인이 연속 복제 VEEV 레플리콘으로부터 개발되었다. 이 셀라인은 YF/prME/GFP 결함 바이러스 게놈 패키징에서 효과적으로 기능하였으며, 이 활성은 캡시드 단백질이 생성되었고 게놈 인캡시데이션을 위해 적절히 가공되었다는 것을 나타내었다. 그러나, 동일한 셀라인은 비구조 단백질을 암호화하는 YF 레플리콘 패키징에 비효과적이었다. 그 결과, 패키지된 레플리콘의 역가는 항상 107inf.u/ml 미만이었다. 이 낮은 패키징 수준에 대한 원인은 명확하지 않았지만, 이들 데이터는 YF C-prM-E 카세트를 생성하는 Sindbis 바이러스 레플리콘이 마찬가지로 비효과적으로 유사 YF 레플리콘을 패키지한 이전의 또 다른 연구의 공개된 결과와 일치하였다.
높은 역가로 YF 레플리콘 패키징의 가능성을 테스트하기 위해서, 본 출원인은 YF/GFP/Cco 바이러스 게놈에서와 동일한 융합 단백질에서 YFV C-prM-E을 암호화 하는 VEEV 레플리콘을 설계하였다. 서브게놈 RNA 중 하나는 캡시드 단백질의 25 아미노산으로 출발하고, GFP 유전자, FAMDV 2A 프로테아제, 코돈-최적화 캡시드 및 prM/E 암호화 서열로 계속되는 ORF를 암호화하였다. 두번째 서브게놈 RNA는 세포를 배지 내의 퓨로마이신의 존재에 의해 초래되는 번역 정지에 저항하게 만드는 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제를 암호화하는 PAC 유전자의 발현을 작동하고 있었다. 시험관내-합성된 VEErep/GFP-C-prM-E/Pac RNA를 BHK-21 세포로 트랜스펙션하였고, Pur 셀라인을 Pur 선택의 몇일 이내에 수립하였다. 그 다음, 세포를 YFV 레플리콘으로 트랜스펙션하였고(YFrep/Cherry), 여기서는 모든 구조 유전자가 Cherry-암호화 서열로 교체되었다(도 6A). 도 6B에 나타낸 바와 같이, 셀라인은 후자의 레플리콘을 매우 높은 역가로 패키징하였고, 충분한 CPE의 발생없이 수일 이내에 감염성 입자를 계속 생성하였다(도 6C). YF 레플리콘-함유 세포는 성장을 계속하였고, GFP와 Cherry를 발현하는 세포가 그들의 사멸을 초래하는 컨플루언시에 도달했기 때문에 통상적으로 실혐을 종료하였다. 다수 실험에서, VEEV 레플리콘의 YFV 구조 단백질로의 패키징은 아직 검출되지 않았다. VEErep/GFP-C-prM-E/Pac-함유 셀라인의 추가적 이점은 YFV 레플리콘의 다음 계대를 위한 그것의 사용의 가능성에 있다. 이들 세포는 이전의 패키지된 구조체로 감염될 수 있었고, 이는 전파되는 감염의 발생 및 108inf.u/ml에 근접한 역가로 레플리콘-함유 입자의 방출을 유도하였다.
본원에서 하기 참조문헌을 인용하였다:
Aberle et al. (1999). J Immunol 163(12), 6756-61.
Aberle et al . (2005). J Virol 79(24), 15107-13.
Chambers et al. (1999) J Virol 73(4), 3095-101.
Colombage et al. (1998) Virology 250(1), 151-63.
Davis et al. (2001) Journal of Virology 75(9), 4040-4047.
Kochel et al. (1997) Vaccine 15(5), 547-52.
Kochel et al (2000). Vaccine 18(27), 3166-3173.
Kofler et al (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101(7), 1951-6.
Konishi and Fujii (2002) Vaccine 20(7-8), 1058-67.
Konishi et al (2001) Journal of Virology 75(5), 2204-2212.
Konishi, et al (1992) Virology 188(2), 714-20.
Konishi, et al (2000a) Vaccine. Jan. 18(11-12), 1133-1139.
Konishi , et al. (2000b) Virology 268(1), 49-55.
Lindenbach and Rice (2001). Flaviviridae: The Viruses and Their Replication. Fourth ed. In "Fields Virology" (D. M. Knipe, P. M. Howley, D. G. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, and B. Roizman, Eds.), Vol. 1, pp. 991-1041. 2 vols. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Lorenz et al (2002) J Virol 76(11), 5480-91.
Mason et al (1991) Virology 180(1), 294-305.
Mason et al (2006) Virology 351(2), 432-43.
Monath, et al (2002) Vaccine 20(7-8), 1004-18.
Phillpotts et al (1996) Arch Virol 141(3-4), 743-9.
Qiao et al (2004) J Infect Dis 190(12), 2104-8.
Schmaljohn et al (1997) J Virol 71(12), 9563-9.
<110> THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> Tow-Component Genome Flavivirus And Uses Thereof <130> D6775PCT <150> US 60/927,993 <151> 2007-05-07 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> repeats in the capsid sequence <400> 1 uaaa 4 <210> 2 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> repeats in the GFP gene <400> 2 ugguga 6 <210> 3 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modification in YFmut/GFP <400> 3 ucguca 6 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> capsid protein in YF/C/Cherry plasmid <400> 4 Leu Leu Met Thr Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> prM protein in YF/C/Cherry plasmid <400> 5 Val Thr Leu Val Arg Lys 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cherry protein in YF/C/Cherry plasmid <400> 6 Glu Leu Tyr Lys Asp 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope protein in YF/C/Cherry plasmid <400> 7 Leu Phe Gly Gly Leu Asn 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> capsid protein in YF/GFP/prME plasmid <400> 8 Arg Ser Leu Ser Asn 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP in YF/GFP/prME plasmid <400> 9 Thr Met Val Ser Lys Gly 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP in YF/GFP/prME plasmid <400> 10 Glu Leu Tyr Lys Leu 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FMDV 2A protein in YF/GFP/prME plasmid <400> 11 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> capsid protein in YF/GFP/prME plasmid <400> 12 Arg Ser His Asp Val 1 5 <210> 13 <211> 87 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capsid gene in YF/GFP plasmid <400> 13 augucugguc guaaagcuca gggaaaaacc cugggcguca auaugguacg acgaggaguu 60 cgcuccuugu caaacaccau ggugagc 87 <210> 14 <211> 90 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capsid gene in YFmut/GFP <400> 14 augucugguc guaaagcuca gggaaaaacc cugggcguca auaugguaac gacgaggagu 60 ucgcuccuug ucaaaccacc ggucgucagc 90

Claims (14)

  1. RNA 복제에 필요한 시스-작용 프로모터 구성요소, 외피 단백질 및 플라비바이러스의 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하고 플라비바이러스의 캡시드 단백질은 암호화하지 않는 가감염성 바이러스 게놈; 및
    RNA 복제에 필요한 시스-작용 프로모터 구성요소, 캡시드 단백질 및 플라비바이러스의 비구조 단백질의 완전한 세트를 암호화하고 플라비바이러스의 외피 단백질은 암호화하지 않는 보완 게놈
    을 포함하는 이성분 게놈 플라비바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 가감염성 바이러스 게놈 및 보완 게놈은 RNA 복제에 필수적인 고리화 서열을 함유하는 5' UTR 및 캡시드 단백질 오픈-리딩 프레임의 아미노-말단 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는 이성분 게놈 플라비바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 가감염성 바이러스 게놈 또는 상기 보완 게놈은 외피 단백질 또는 캡시드 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 유비퀴틴 또는 수족구병(FAMDV)-특이적 2A 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 이성분 게놈 플라비바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 가감염성 바이러스 게놈 및 보완 게놈은 다른 바이러스, 박 테리아 또는 기생충의 구조 유전자를 포함하는 추가의 유전 물질을 더 포함하고, 상기 유전자의 발현은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의해 초래되는 감염에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 이성분 게놈 플라비바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 플라비바이러스는 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머리 벨리 뇌염 바이러스, 돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus) 또는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는 이성분 게놈 플라비바이러스.
  6. 제1항의 이성분 게놈 플라비바이러스로 감염된 세포 배양 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포 배양 시스템은 Vero, BHK-21, C7/10 또는 척추동물 또는 모기 기원의 다른 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양 시스템.
  8. 동일한 세포에서 두 게놈의 복제를 가능하게 하는데 효과적인 제1항의 이성분 게놈 플라비바이러스로 세포 배양 시스템을 감염시키는 단계; 및
    상기 이성분 게놈 플라비바이러스를 방출시키는 단계를 포함하고, 이로써 이성분 게놈 플라비바이러스의 대규모 증식을 가능하게 하는, 이성분 게놈 플라비바이러스의 대규모 증식 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포 배양 시스템을 1 감염 유닛/세포 이상의 감염 다중도로 이성분 게놈 플라비바이러스로 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 복제 결함 플라비바이러스는 복제에 결함이 있고, 질병을 초래할 수 없고, 감염성이며, 생체내에서 1회 감염을 행할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항의 이성분 게놈 플라비바이러스, 보조제, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 이들의 조합을 포함하는 면역원성 조성물.
  12. 면역학적으로 효과적인 양의 제11항의 면역원성 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물이 피험자에서 플라비바이러스에 대한 면역 반응을 도출하고, 이로써 플라비바이러스 노출로 인한 감염으로부터 피험자를 보호하는 것을 특징으로 하는, 플라비바이러스 노출로 인한 감염으로부터 피험자를 보호하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 투여는 복막내, 피내, 피하, 근육내, 경구 또는 비강내 경로를 통하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머리 벨리 뇌염 바이러스, 돼지 열병 바이러스 또는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8815564B2 (en) 2008-03-14 2014-08-26 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Replication-defective flavivirus vaccines and vaccine vectors
CA2755257A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-23 Sanofi Pasteur Biologics Co. Replication-defective flavivirus vaccine vectors against respiratory syncytial virus
EP2435572B1 (en) 2009-05-28 2017-08-16 The United States of America, as Represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Antigenic chimeric tick-borne encephalitis virus (tbev)/dengue virus type 4 (den4) recombinant viruses
US8691961B1 (en) * 2009-11-09 2014-04-08 Integral Molecular, Inc. Flavivirus reporter virus and methods of making and using the same
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
GB201716222D0 (en) * 2017-10-05 2017-11-22 Univ Leuven Kath Chimeric Flavivirus Vaccines
CN113355292B (zh) * 2021-06-04 2024-02-06 天康制药股份有限公司 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6676936B1 (en) 1988-07-14 2004-01-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services. Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses
ATE314476T1 (de) 1997-10-08 2006-01-15 Us Gov Health & Human Serv Chimärer impfstoff gegen das zeckenenzephalitis virus
US6541011B2 (en) 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
RU2288266C2 (ru) * 2000-02-10 2006-11-27 Зе Гавернмент Оф Зе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Зе Секретэри, Департмент Оф Хелс Энд Хьюмэн Сервисиз ИНФЕКЦИОННЫЕ КЛОНЫ ПОЛНОМЕРНОЙ кДНК КЛЕЩЕВОГО ФЛАВИВИРУСА
ES2374131T3 (es) 2000-02-16 2012-02-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos.
US7244434B2 (en) * 2002-08-13 2007-07-17 Intervet International B.V. Replicons of pestviruses that do not express C and or E1 protein and infectious viral particles containing same, that can be used in vaccines
AU2003297860A1 (en) * 2002-12-12 2004-07-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Large scale production of packaged alphavirus replicons

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