ES2682268T3 - Virus recombinante del sarampión que expresa polipéptidos del virus de Chikungunya y sus aplicaciones - Google Patents

Virus recombinante del sarampión que expresa polipéptidos del virus de Chikungunya y sus aplicaciones Download PDF

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Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales CE3- E2-6K-E1 de un virus de Chikungunya (CHIKV), estando dicho polinucleótido unido operativamente, en particular, clonado en una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos 5 de la cadena de ARN (+) antigenómica infecciosa, de longitud completa de un virus del sarampión (VS).

Description

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DESCRIPCION
Virus recombinante del sarampión que expresa polipéptidos del virus de Chikungunya y sus aplicaciones Campo de la invención
La invención se dirige al virus recombinante del sarampión que expresa las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un virus de Chikungunya, y se refiere en particular a partículas similares a virus (VLP, virus like partióles) que en su superficie contienen las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un virus Chikungunya. Estas partículas son partículas infecciosas recombinantes capaces de replicarse en un hospedador después de una administración. La invención proporciona medios, en particular ácidos nucleicos, vectores, células y sistemas de rescate, para producir estas partículas infecciosas recombinantes. La invención también se refiere al uso de estas partículas infecciosas recombinantes, en forma de una composición, más particularmente en una formulación de vacuna, para la prevención de una infección causada por el por virus de Chikungunya.
Antecedentes de la invención
El virus de Chikungunya (CHIKV) es un virus de ARN de cadena positiva del género Alphavirus dentro de la familia Togaviridae, aislado por primera vez en Tanzania en el año 1952.
la infección por este virus causa una enfermedad humana que se caracteriza por síntomas similares a los de la fiebre del dengue, con una fase febril aguda durante dos a cinco días, seguido de artralgia prolongada que afecta a las articulaciones de las extremidades. El CHIKV es endémico en África, India y el sudeste asiático y se transmite por mosquitos del género Aedes a través de un ciclo de transmisión urbano o selvático. En 2006, se produjo un brote de fiebre CHIKV en numerosas islas del Océano Índico (las Comoras, Mauricio, Seychelles, Madagascar, Reunión...), antes de saltar a la India, donde se han comunicado aproximadamente 1,4 millones de casos. Más recientemente, se han descrito infecciones importadas en Europa, y en Italia se han comunicado alrededor de 200 casos endémicos (José, J. et al., A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly. Future Microbiol, 2009. 4(7): págs. 837-56). Clínicamente, esta epidemia de CHIKV estuvo acompañada de síntomas más graves que los brotes previos, con informes de poliartralgia y mialgia grave, complicaciones y muertes.
El genoma del CHIKV es una molécula de ARN monocatenario de 11,8 kb de polaridad positiva. Este virus está estrechamente relacionado con el virus del bosque Semliki, conocido en inglés como Semliki Forest virus (SFV), virus Sindbis (SINV) y otros alfavirus del Viejo Mundo, y más lejanamente relacionados con alfavirus del Nuevo Mundo como el virus de la encefalitis equina venezolana (Grifin, DE, Alphaviruses, in Fields Virology, 5a ed., D.M. Knipe, Editor 2007, Wolters Kluwer, Lippincott Williams & Wilkins. págs. 1023-1067). El ARN genómico tiene caperuza, y se traduce directamente en una poliproteína no estructural (nsP, non-struotural polyprotein) de longitud completa denominada P1234, que está codificada por los dos tercios 5' del genoma (José, J., J.E. Snyder y R.J. Kuhn, A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly. Future Microbiol, 2009. 4(7): págs. 837-56; Kuhn, R. J., Togaviridae: the viruses and their replication, in Fields Virology, 5a ed., D.M. Knipe, Editor 2007, Wolters Kluwer, Lippincott Williams & Wilkins. Págs. 1001-1022). Este precursor se autoescinde para producir P123 y nsP4 que portan la actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN. Estas proteínas, junto con cofactores celulares, se ensamblan en un complejo de replicación que produce moléculas de ARN genómico antisentido. La escisión posterior de P123 en nsP1 y P23 da lugar a un complejo de polimerasa que produce ARN genómico tanto en sentido como antisentido. El procesamiento adicional de P23 en nsP2 y nsP3 da lugar a un complejo de polimerasa que produce solo moléculas de ARN genómico de sentido positivo. Además de replicar el genoma vírico, este complejo de proteína vírica transcribe un ARN subgenómico 26S desde el extremo 3' del genoma vírico. Este ARN mensajero se traduce en un precursor de poliproteína, que se escinde mediante una combinación de enzimas víricas y celulares para producir una proteína de la cápside (C), dos proteínas principales de la envoltura (E1 y E2) y dos péptidos accesorios más pequeños, E3 y 6k. Una vez ensamblados, los viriones CHIKV son partículas esféricas de 65-70 nm de diámetro, esencialmente compuestas por moléculas de ARN genómico asociadas con proteínas de la cápside, y envueltas en una membrana lipídica derivada del huésped adornada con los heterodímeros E1-E2 organizados en una red icosaédrica (Voss, J.E., et al., Glycoprotein organization of Chikungunya virus particles revealed by X-ray crystallography. Nature, 2010. 468(7324): págs. 709-12).
La gravedad de la enfermedad, tanto como la evolución y propagación del virus en nuevas áreas geográficas, son un asunto serio de salud pública que requiere solución. Para resolver estos problemas, se han desarrollado vacunas con virus vivos atenuados, con alfavirus quimérico, con ADN recombinante o con partículas similares a virus.
Se demostró que una vacuna inactivada con formalina es inmunogénica en primates no humanos y humanos, pero la gran cantidad de antígeno que se necesita para la inmunización masiva que debe prepararse en condiciones de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3, Biosafety Level 3), es una limitación para el desarrollo de esta estrategia (Tiwari, M., et al., Assessment of immunogenic potential of Vero adapted formalin inactivated vaccine derived from novel ECSA genotype of Chikungunya virus. (Vaccine, 2009. 27(18): págs. 2513-22). La vacuna viva atenuada TSI-GSD-218 CHIKV desarrollada por el Ejército de los Estados Unidos era inmunogénica pero causó efectos secundarios en ensayos clínicos en Fase II asociados con la reversión a problemas de seguridad que aumentan la virulencia. Por lo
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tanto, aunque los resultados obtenidos con vacunas basadas en virus vivos atenuados muestran que se puede lograr una inmunización eficaz de esta manera, esas vacunas son aún cuestionables ya que podría existir un riesgo de producirse posibles efectos secundarios (Edelman R et al., Am J Trop Med Hyg. junio de 2000;62(6):681-685). Las estrategias de vacunas de alfavirus quiméricos que codifican las proteínas E1, E2 y de la cápside de CHIKV son inmunogénicas en ratones (Wang, E., et al., Chimeric alphavirus vaccine candidates for Chikungunya. Vaccine, 2008. 26(39): págs. 5030-9), pero la capacidad del alfavirus de recombinarse fácilmente plantea problemas de seguridad contra el desarrollo de dichas estrategias (Weaver, S.C., et al., Recombinational history and molecular evolution of western equine encephalomyelitis complex alphaviruses. J Virol, 1997. 71(1): págs. 613-23).
Otra estrategia que se ha explorado es diseñar una construcción de ADN recombinante para su uso como vacuna. Se ha demostrado que las vacunas de CHIKV basadas en ADN que codifica las proteínas E1, E2 y de la cápside son inmunogénicas en ratones y en primates no humanos (Muthumani, K., et al., Immunogenicity of novel consensus- based DNA vaccines against Chikungunya virus. Vaccine, 2008. 26(40): págs. 5128-34; Mallilankaraman, K., et al., A DNA vaccine against chikungunya virus is protective in mice and induces neutralizing antibodies in mice and nonhuman primates. PLoS Negl Trop Dis, 2011,5(1): p. e928), pero las estrategias con ADN no inducen la fuerte respuesta inmunitaria neutralizante requerida para la eliminación de CHIKV en seres humanos. Las desventajas de las vacunas de ADN son que para inducir una respuesta inmunitaria se requieren grandes cantidades de ADN y se deben realizar múltiples vacunaciones de refuerzo. La necesidad de múltiples vacunaciones de refuerzo y de altas cantidades de ADN inyectado en los núcleos de muchas células, plantea inquietudes con respecto al hecho de que las vacunas de ADN pueden integrarse en el ADN del hospedador y causar mutagénesis de inserción. Por lo tanto, un estudio reciente informa sobre el uso de vacunas de ADN combinadas con virus vivos atenuados (WO2011/082388). Aunque esta técnica permite reducir los inconvenientes de las vacunas de virus vivos atenuados y ADN, todavía existe la necesidad de proporcionar una vacuna con efectos secundarios reducidos.
Para evitar los inconvenientes de las vacunas de virus vivos atenuados y de ADN, se han desarrollado otros tipos de vacunas, tales como las vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) que se obtienen al expresar las proteínas estructurales del virus de Chikungunya. Estas proteínas estructurales pueden autoensamblarse en partículas similares a virus. En consecuencia, se han elaborado vacunas que comprenden polinucleótidos que codifican todas las proteínas estructurales del virus de Chikungunya (Akahata, W., et al., A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection. Nat Med, 2010. 16(3): págs. 334-8; Akahata et al., A specific domain of the chikungunya virus E2 protein regulates particle formation in human cells: implications for alphavirus vaccine design. Journal of Virology, 2012, vol. 86, n.° 16, 8879-8883). Sin embargo, Las VLP producidas in vitro son costosas de fabricar y requieren tres administraciones para una inmunidad completa, por lo que estas vacunas no son económicamente asequibles. La estrategia de las VLP de CHIKV divulgada en Akata et al. requirió varias inmunizaciones con un adyuvante para inducir protección. Por este motivo, en cuanto al diseño, sigue habiendo una necesidad de vacunas mejoradas que permitan generar in vivo VLP de CHIKV en células infectadas, en particular en células infectadas de un hospedador, y así proporcionar una inmunidad eficaz y duradera, que especialmente induce inmunidad de por vida después de solo una o dos etapas de administración.
Descripción de la invención
Para este fin, los inventores lograron la producción de vacunas basadas en el virus del sarampión replicativo infeccioso recombinante, recombinado con polinucleótidos que codifican las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un virus de Chikungunya, que se recuperan cuando el virus recombinante se replica en particular en el hospedador después de la administración. Por tanto, la invención se refiere a un principio activo de la vacuna viva del CHIKV, que se basa en la vacuna infantil, de uso muy extendido, contra la cepa Schwarz del sarampión. En una realización preferida, esta vacuna viva recombinante de MV-CHIKV (virus del sarampión - virus de Chikungunya) produce partículas similares al virus CHIK al replicarse en células infectadas.
El virus del sarampión es un virus de ARN no segmentado, monocatenario, de sentido negativo y con envoltura, del género Morbilivirus dentro de la familia Paramyxoviridae. Este virus se ha aislado en el año 1954 (Enders, J. F., y T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.), y desde entonces se han obtenido vacunas vivas atenuadas de este virus para proporcionar cepas de vacunas y en particular de la cepa Schwarz. Las vacunas contra el sarampión se han administrado a cientos de millones de niños en los últimos 30 años y han demostrado su eficacia y seguridad. Se producen a gran escala en muchos países y se distribuyen a bajo coste. Por todos estos motivos, los inventores usaron virus del sarampión atenuados para generar partículas recombinantes del virus del sarampión que expresaban de manera estable antígenos estructurales del virus de Chikungunya, en particular como VLP (partículas similares a virus).
Por tanto, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un CHIKV, estando dicho polinucleótido unido operativamente, en particular clonado en una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN (+) antigenómica infecciosa, de longitud completa, de un virus del sarampión (MV, del inglés Measles Virus). Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la invención es, en particular, una molécula de ADN purificada, obtenida u obtenible, por recombinación de varios polinucleótidos de diferentes orígenes, unidos operativamente
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La expresión "unidos operativamente" se refiere al enlace funcional existente entre los diferentes polinucleótidos de la construcción de ácido nucleico de la invención de tal manera que dichos diferentes polinucleótidos y la construcción de ácido nucleico se transcriben de manera eficaz y, si es apropiado, se traducen, en particular en células o líneas celulares, especialmente en células o líneas celulares usadas como parte de un sistema de rescate para la producción de partículas de MV infecciosas quiméricas de la invención o en células hospedadoras.
En una realización particular de la invención, la construcción se prepara clonando un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV en el ADNc que codifica el ARN (+) antigenómico, de longitud completa, del virus del sarampión. Como alternativa, se puede preparar una construcción de ácido nucleico de la invención usando etapas de síntesis de fragmentos de ácido nucleico o polimerización a partir de un molde, incluyendo la PCR.
En un ejemplo particular, el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV se clona en una aTu (Additional Transcription Unit Unidad de Transcripción Adicional) insertada en el ADNc del virus del sarampión. El experto en la materia conoce las secuencias ATU y comprenden, para su uso en etapas de clonación en ADNc de MV, secuencias que actúan en cis, necesarias para la expresión de un transgén dependiente de MV, tal como un promotor del gen precedente, en ADNc de MV, el inserto representado por el polinucleótido que codifica la(s) proteína(s) CHIKV insertadas en un casete de sitios de clonación múltiple.
cuando su usa para llevar a cabo la presente divulgación, la ATU se localiza ventajosamente en la secuencia N- terminal de la molécula de ADNc que codifica la cadena de ARN (+) de longitud completa del antigenoma del MV y se localiza especialmente entre los genes P y M o entre los genes H y L de este virus. Se ha observado que la transcripción del ARN vírico del MV sigue un gradiente desde el extremo 5' al 3'. Esto explica que, cuando se inserta en el extremo 5' de la secuencia codificante del ADNc, la ATU permitirá una expresión más eficaz de la secuencia de ADN heteróloga (por ejemplo, el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV) que contiene.
Por tanto, el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV se puede insertar en cualquier región intergénica de la molécula de ADNc del virus del sarampión, en particular en una ATU. En los ejemplos se ilustran construcciones particulares de la invención.
Como se describe en el presente documento, cuando en la construcción de ADN hay varios polinucleótidos distintos, cada uno de estos polinucleótidos, que codifican al menos una proteína estructural del CHIKV, puede insertarse en sitios diferentes del ADNc del MV, posiblemente en distintas ATU del ADNc del virus del sarampión.
En un ejemplo preferido, el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV se inserta en la región intergénica de los genes P y M de la molécula de ADNc del virus del sarampión, en una ATU.
La expresión "codificación" usada en la presente solicitud define la capacidad de las moléculas de ácido nucleico para transcribirse y, cuando sea apropiado, traducirse para la expresión del producto en células o líneas celulares seleccionadas. Por consiguiente, la construcción de ácido nucleico de la invención puede comprender elementos reguladores que controlan la transcripción de las secuencias codificantes, en particular promotores y secuencias de terminación para la transcripción y posiblemente potenciadores y otros elementos que actúan en cis. Estos elementos reguladores pueden ser heterólogos con respecto a las secuencias de polinucleótidos del CHIKV.
El término "proteína" se usa indistintamente con los términos "antígeno" o "polipéptido" y define una molécula resultante de una concatenación de restos de aminoácidos. En particular, las proteínas desveladas en la solicitud proceden del CHIKV y son proteínas estructurales que pueden ser idénticas a las proteínas nativas o, como alternativa, que pueden proceder de las mismas por mutación, incluyendo por sustitución (en particular por restos de aminoácidos conservativos) o por adición de restos de aminoácidos o por modificación secundaria después de la traducción o por deleción de porciones de la(s) proteína(s) nativa(s) que dan como resultado fragmentos que tienen un tamaño reducido con respecto a la proteína nativa de referencia. En la presente invención se incluyen fragmentos en la medida en que portan epítopos de la proteína nativa que son adecuados para suscitar una respuesta inmunitaria en un hospedador, en particular, en un hospedador humano, preferentemente una respuesta que permite la protección contra la infección por CHIKV o contra la enfermedad asociada al CHIKV. Los epítopos son, en particular, del tipo de epítopos B implicados en suscitar una respuesta inmunitaria humoral a través de la activación de la producción de anticuerpos en un hospedador al que se le ha administrado la proteína, o en el que se expresa la proteína, después de la administración de las partículas replicativas infecciosas de la invención. Como alternativa, los epítopos pueden del tipo de epítopos T implicados en suscitar una respuesta inmunitaria mediada por células (respuesta CMI, del inglés Cell Mediated Immune). Los fragmentos pueden tener un tamaño que represente más del 50 % del tamaño de la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa de CHIKV, preferentemente al menos el 90 % o 95 %. Como alternativa, los fragmentos pueden ser polipéptidos cortos con al menos 10 restos de aminoácidos, que albergan uno o más epítopos de la proteína nativa. a este respecto, los fragmentos también incluyen poliepítopos como se define en este documento.
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En un ejemplo particular, el ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de RNA (+) antigenómica infecciosa, de longitud completa, del MV en la construcción de ácido nucleico, cumple con la regla de seis (6) del genoma del virus del sarampión.
En la técnica anterior, la organización del genoma de los virus del sarampión y su procedimiento de replicación y transcripción se han identificado por completo y se desvelan especialmente en Horikami S.M. y Moyer S.A. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995) 191,35-50 o en Combredet C. et al (Journal of Virology, nov 2003, págs. 1154611554) para la cepa de vacunación Schwarz del virus o para virus de ARN de sentido negativo ampliamente considerados, en Neumann G. et al (Journal of Clinical Oncology (2002) 83, 2635-2662).
La "regla de seis" se expresa en el hecho de que el número total de nucleótidos presentes en un ácido nucleico que representa el genoma de ARN de cadena (+) del MV o en construcciones de ácido nucleico que lo comprenden, es un múltiplo de seis. La "regla de seis" ha sido reconocida en el estado de la técnica como un requisito con respecto al número total de nucleótidos en el genoma del virus del sarampión, que permite la replicación eficaz u optimizada del ARN genómico del MV. En las realizaciones de la presente invención en las que se define una construcción de ácido nucleico que cumple la regla de seis, dicha regla se aplica a la construcción de ácido nucleico que especifica el ADNc que codifica el genoma de ARN de cadena (+) de longitud completa del MV. A este respecto, la regla de seis se aplica individualmente al ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN (+) antigenómica infecciosa de longitud completa del virus del sarampión, posiblemente pero no necesariamente, al polinucleótido clonado en dicho ADNc y que codifica las proteínas estructurales C-E3- E2-6K-E1 del CHIKV.
De acuerdo con un aspecto particular de la invención, la construcción de ácido nucleico comprende las siguientes unidades de transcripción génica que incluyen, de 5 'a 3':
(a) un polinucleótido que codifica la proteína N de un MV,
(b) un polinucleótido que codifica la proteína P de un MV,
(c) el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV,
(d) un polinucleótido que codifica la proteína M de un MV,
(e) un polinucleótido que codifica la proteína F de un MV,
(f) un polinucleótido que codifica la proteína H de un MV, y
(g) un polinucleótido que codifica la proteína L de un MV,
estando dichos polinucleótidos y la construcción de ácido nucleico, unidos operativamente y bajo el control de secuencias reguladoras de transcripción y replicación vírica, tales como secuencias líder y terminadoras del MV.
Las expresiones "proteína N", "proteína P", "proteína M", "proteína F", "proteína H" y "proteína L", se refieren respectivamente, a la nucleoproteína (N), a la fosfoproteína (P), a la proteína de la matriz (M), a la proteína de fusión (F), a la proteína de hemaglutinina (H) y a la proteína de ARN polimerasa grande (L) del virus del sarampión. Estos componentes se han identificado en la técnica anterior y se describen especialmente en Fields, Virology (Knipe & Howley, 2001).
En una realización preferida de la invención, la molécula de ADNc que codifica la cadena de ARN(+) antigenómica infecciosa, de longitud completa, de un virus del sarampión, es característica de una cepa atenuada del MV o se obtiene de ella.
Una "cepa atenuada" del virus del sarampión se define como una cepa que es avirulenta o menos virulenta que la cepa precursora en el mismo hospedador, mientras que mantiene la inmunogenicidad y posiblemente la capacidad adyuvante cuando se administra en un hospedador, es decir, preservando epítopos de linfocitos T y B inmunodominantes y posiblemente la capacidad adyuvante, tal como la inducción de proteínas coestimuladoras de linfocitos T o de la citocina IL-12.
por consiguiente, una cepa atenuada de un virus de sarampión se refiere a una cepa que se ha sometido a pases en serie en células seleccionadas y, posiblemente, adaptado a otras células para producir cepas de semillas adecuadas para la preparación de cepas de vacunas, que albergan un genoma estable que no permitiría la reversión a la patogenicidad ni la integración en los cromosomas del hospedador. Como una "cepa atenuada" particular, una cepa autorizada para una vacuna, es una cepa atenuada adecuada para la invención cuando cumple los criterios definidos por la FDA (US Food and Drug Administration), es decir, cumple los criterios de seguridad, eficacia, calidad y reproducibilidad, después de realizar revisiones rigurosas de datos clínicos y de laboratorio (
www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm).
Las cepas particulares que se pueden usar para implementar la presente invención y especialmente obtener el ADNc del MV de la construcción de ácido nucleico son, la cepa Schwarz del MV, la cepa Zagreb, la cepa AIK-C y la cepa Moraten. Todas estas cepas se han descrito en la técnica anterior y el acceso a ellas se proporciona en particular como vacunas comerciales.
La molécula de ADNc puede colocarse bajo el control de secuencias de control de expresión heterólogas.
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La inserción de dicho control para la expresión del ADNc, es favorable cuando se busca la expresión de este ADNc en tipos de células que no permiten la transcripción completa del ADNc con sus secuencias de control nativas.
La secuencia de control de expresión heteróloga comprende las secuencias promotoras y terminadoras de T7. Estas secuencias están localizadas respectivamente en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante de la cadena de RNA(+) antigenómica de longitud completa del MV y a partir de las secuencias adyacentes en torno a esta secuencia codificante.
La molécula de ADNc, definida anteriormente, se modifica, es decir, puede comprender motivos o secuencias de nucleótidos adicionales.
El molécula de ADNc puede comprender adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena de ARN(+) antigenómica, de longitud completa, de la cepa de vacuna autorizada del MV, un motivo GGG, seguido de una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que puede comprender, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia de nucleótidos que codifica la cadena de ARN(+) antigenómica, de longitud completa, la secuencia de una ribozima. Puede ser apropiada la ribozima (8) del virus de la Hepatitis delta.
El motivo GGG colocado en el extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia codificante anterior, mejora la eficacia de la transcripción de dicha secuencia codificante de ADNc. Como un requisito para que se produzca un ensamblaje adecuado de las partículas del virus del sarampión, es el hecho de que cuando al ADNc que codifica el ARN(+) antigenómico que cumple con la regla de seis, se le añade el motivo GGG, también se le añada una ribozima en el extremo 5' de la secuencia codificante del ADNc, 3' del motivo GGG, para permitir la escisión del transcrito en el primer nucleótido codificante de la cadena de ARN(+) antigenómica de longitud completa del MV.
En una realización particular de la invención, para preparar la construcción de ácido nucleico de la invención, la preparación de una molécula de ADNc que codifica el ARN(+) antigenómico de longitud completa de un virus del sarampión desvelado en la técnica anterior se logra mediante métodos conocidos. Dicho ADNc proporciona especialmente el vector genómico cuando se inserta en un vector tal como un plásmido.
Una molécula de ADNc particular, adecuada para la preparación de la construcción de ácido nucleico de la invención, es la que se obtiene usando la cepa Schwarz del virus del sarampión. Por consiguiente, el ADNc usado en la presente invención puede obtenerse como se desvela en el documento WO2004/000876 o puede obtenerse a partir del plásmido pTM-MvSchw depositado por el Instituto Pasteur en la CNCM con el N° I-2889 el 12 de junio de 2002, cuya secuencia se desvela en el documento WO2004/000876. El plásmido pTM-MVSchw se ha obtenido de un plásmido Bluescript y comprende el polinucleótido que codifica la cadena de aRn(+) del virus del sarampión de longitud completa de la cepa Schwarz colocada bajo el control del promotor de la ARN polimerasa del fago T7. Tiene 18.967 nucleótidos y una secuencia representada como SEQ ID NO: 1.
De manera similar, las moléculas de ADN (también denominadas ADNc del virus del sarampión o ADNc MV por conveniencia) de otras cepas del MV pueden obtenerse a partir del ácido nucleico purificado de partículas víricas del MV atenuado, tales como las descritas en el presente documento.
La construcción de ácido nucleico de la invención es adecuada y está destinada a la preparación del virus del sarampión replicativo infeccioso recombinante con virus de Chikungunya (MV-CHIKV) y por consiguiente dicha construcción de ácido nucleico está destinada a la inserción en un vector genómico de transferencia que, como resultado, comprende la molécula de ADNc del virus del sarampión, especialmente de la cepa Schwarz, para la producción de dicho virus MV-CHIKV y producir las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV, en particular, las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1. El plásmido pTM-MVSchw es adecuado para preparar el vector de transferencia, mediante la inserción del polinucleótido CHIKV necesario para la expresión de las proteínas estructurales C-E3-E2- 6K-E1 del CHIKV, en particular, partículas similares a virus, VLP, C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV.
Por tanto, la invención se refiere a un vector de transferencia, que se usa para la preparación de partículas de MV- CHIKV recombinantes cuando se rescatan de células auxiliares. El vector de transferencia de la invención es un plásmido, en particular, un plásmido obtenido de un plásmido Bluescript.
La divulgación también se refiere al uso del vector de transferencia para transformar células adecuadas para el rescate de partículas MV-CHIKV víricas, en particular para transfectar o transducir dichas células respectivamente, con plásmidos que albergan la construcción de ácido nucleico de la invención, seleccionándose dichas células, por su capacidad para expresar las proteínas necesarias del virus del sarampión para la replicación, transcripción y encapsidación apropiadas, del genoma del virus recombinante correspondiente a la construcción de ácido nucleico de la invención en partículas recombinantes, infecciosas y replicativas de MV-CHIKV.
La invención también se refiere a las células o a las líneas celulares así transformadas por el vector de transferencia de la invención y por otros polinucleótidos que proporcionan funciones auxiliares y proteínas.
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Por tanto, en dichas células están presentes polinucleótidos que codifican proteínas que incluyen, en particular, las proteínas N, P y L de un virus del sarampión (es decir, proteínas MV nativas o variantes funcionales de las mismas capaces de formar complejos de ribonucleoproteína (rNp)), preferentemente como proteínas expresadas de forma estable al menos para las proteínas N y P funcionales en la transcripción y replicación de las partículas víricas recombinantes de MV-CHIKV. Las proteínas N y P pueden expresarse en las células a partir de un plásmido que comprende sus secuencias codificantes o pueden expresarse a partir de una molécula de ADN insertada en el genoma de la célula. La proteína L puede expresarse a partir de un plásmido diferente. Esta puede expresarse de manera transitoria. La célula auxiliar también es capaz de expresar una ARN polimerasa adecuada para permitir la síntesis del ARN recombinante procedente de la construcción de ácido nucleico de la invención, posiblemente como una ARN polimerasa expresada de manera estable. La ARN polimerasa puede ser la polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7).
El clon de ADNc de un virus de sarampión puede ser de la misma cepa de virus de sarampión que la de la proteína N y/o la proteína P y/o la proteína L. El clon de ADNc de un virus de sarampión puede ser de una cepa diferente de virus que la de la proteína N y/o la proteína P y/o la proteína L.
La divulgación describe un procedimiento para la preparación de partículas infecciosas recombinantes del virus de sarampión que comprende:
1) transferir, en particular transfectar, la construcción de ácido nucleico de la invención o el vector de transferencia que contiene dicha construcción de ácido nucleico, en una línea celular auxiliar que también expresa proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la secuencia de ARN(+) antigenómica de MV de este ADNc y en condiciones que permitan el ensamblaje de las partículas víricas y
2) recuperar el virus MV-CHIKV infeccioso recombinante que expresa al menos una proteína estructural de CHIKV.
Como se describe en el presente documento, este procedimiento comprende:
1) transfectar células auxiliares con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la invención con un vector de transferencia, en el que dichas células auxiliares son capaces de expresar funciones auxiliares para expresar una ARN polimerasa y expresar las proteínas N, P y L de un virus MV;
2) cultivar conjuntamente dichas células auxiliares transfectadas de la etapa 1), con células sometidas a pases, adecuadas para el pase de la cepa atenuada del MV de la cual se origina el ADNc;
3) recuperar el virus MV-CHIKV infeccioso recombinante que expresa al menos una proteína estructural de CHIKV.
Como se describe en el presente documento, el método para la producción de virus MV-CHIKV infeccioso recombinante comprende:
1) recombinar una célula o un cultivo de células que producen de manera estable una ARN polimerasa, la nucleoproteína (N) de un virus del sarampión y la fosfoproteína (P) cofactor de polimerasa de un virus del sarampión, con una construcción de ácido nucleico de la invención y con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína grande (L) de ARN polimerasa de un virus del sarampión, y
2) recuperar el virus MV-CHIKV infeccioso de dicha célula recombinante o cultivo de células recombinantes.
Se producen MV recombinantes, que expresan las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un CHIKV, en particular las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 en donde las partículas expresan antígenos C-E3-E2-6K-E1 del virus CHIK. Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento para rescatar MV recombinante que expresa las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un ChIkV, en particular las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 comprenden las etapas de:
1) transfectar conjuntamente (cotransfectar) células auxiliares, en particular, células auxiliares HEK293, que expresan de manera estable la ARN polimerasa de T7, y las proteínas N y P del sarampión con (i) un plásmido vector de transferencia, que comprende ADNc que codifica el ARN(+) antigenómico de longitud completa de un virus del sarampión recombinado con un polinucleótido que codifica los antígenos CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 y con (ii) un vector, especialmente un plásmido, que codifica la L polimerasa del MV;
2) cultivar dichas células auxiliares cotransfectadas en condiciones que permitan la producción del virus recombinante MV-CHIKV;
3) propagar el virus recombinante así producido cultivando conjuntamente (cocultivando) dichas células auxiliares de la etapa 2) con células, tales como células Vero, que permitan dicha propagación;
4) recuperar el virus recombinante MV-CHIKV replicante y las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV, en particular, las VLP de CHIKV-C-E3-E2-6K-E1.
Dicho procedimiento, junto con las construcciones y las condiciones utilizadas se ilustran en la Figura 1B.
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Como se usa en el presente documento, "recombinación" significa la introducción de un polinucleótido en una célula, por ejemplo, en forma de un vector, integrando (total o parcialmente), o no, dicho polinucleótido en el genoma de la célula (tal como se ha definido anteriormente).
La recombinación puede obtenerse con un primer polinucleótido, que es la construcción de ácido nucleico de la invención. La recombinación puede incluir, también o como alternativa, la introducción de un polinucleótido, que es un vector que codifica una proteína grande (L) de ARN polimerasa de un virus del sarampión, cuya definición, naturaleza y estabilidad de expresión se ha descrito en el presente documento.
De acuerdo con la invención, la célula o líneas celulares o un cultivo de células que producen de manera estable una ARN polimerasa, una nucleoproteína (N) de un virus del sarampión y una fosfoproteína (P) cofactor de polimerasa de un virus del sarampión, es una célula o línea celular como se define en la presente memoria descriptiva o un cultivo de células como se define en la presente memoria descriptiva, es decir, también son células recombinantes en la medida en que se han modificado por la introducción de uno o más polinucleótidos como se definió anteriormente. La célula o línea celular o cultivo de células, que produce de manera estable la ARN polimerasa, las proteínas N y P, no produce la proteína L de un virus del sarampión o no produce de manera estable la proteína L de un virus del sarampión, por ejemplo, permitiendo su expresión o producción transitoria.
La producción del virus MV-CHIKV de la invención puede implicar una transferencia de células transformadas como se describe en este documento. "Transferencia" como se usa en el presente documento, se refiere a la siembra en placa de las células recombinantes sobre un tipo diferente de células, y particularmente sobre monocapas de un tipo diferente de células. Estas últimas células son competentes para mantener tanto la replicación como la producción del virus MV-CHIKV infeccioso, es decir, respectivamente la formación de virus infecciosos dentro de la célula y posiblemente la liberación de estos virus infecciosos fuera de las células. Esta transferencia da como resultado el cocultivo de las células recombinantes de la invención con células competentes como se define en la oración anterior. La transferencia anterior puede ser una etapa adicional, es decir, opcional, cuando las células recombinantes no son cultivos productores de virus eficaces, es decir, cuando el virus MV-CHIKV infeccioso no se puede recuperar de manera eficaz de estas células recombinantes. Esta etapa se introduce después de recombinación adicional de las células recombinantes de la invención con la construcción de ácido nucleico de la invención, y opcionalmente con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína grande (L) de ARN polimerasa (L) de un virus del sarampión.
Se requiere una etapa de transferencia ya que las células recombinantes, normalmente elegidas por su capacidad para recombinarse fácilmente, no son lo suficientemente eficaces en el mantenimiento y la producción del virus MV- CHIKV infeccioso recombinante. En dicha realización, la célula o línea celular o cultivo de células de la etapa 1) de los métodos definidos anteriormente, es una célula o línea o cultivo celular de células recombinantes de acuerdo con la invención.
Las células adecuadas para la preparación de las células recombinantes de la invención son células procariotas o eucariotas, particularmente células animales o vegetales, y más particularmente células de mamífero, tales como células humanas o células de mamífero no humanas o células de ave o células de levadura. Antes de la recombinación de su genoma, las células se aíslan de un cultivo primario o de una línea celular. Las células de la invención pueden ser células que se dividen o que no se dividen.
De acuerdo con una realización preferida, las células auxiliares proceden de la línea celular de riñón embrionario humano 293, cuya línea celular 293 está depositada en la ATCC con el n. ° CRL-1573. La línea celular particular 293 es la línea celular desvelada en el documento WO2008 / 078198 y se menciona en los siguientes ejemplos.
De acuerdo con otro aspecto de este procedimiento, las células adecuadas para someter a pases son células CEF. Las células CEF pueden prepararse a partir de huevos de gallina fertilizados, como los que se obtienen en EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, Francia, o de cualquier otro productor de huevos de gallina fertilizados.
El procedimiento que se desvela de acuerdo con la presente invención, se usa ventajosamente para la producción de virus MV-CHIKV replicativo infeccioso, apropiado para uso como composiciones de inmunización.
Por tanto, la invención se refiere a una composición inmunogénica cuyo principio activo comprende el virus MV- CHIKV replicativo infeccioso rescatado de la construcción de ácido nucleico de la invención y en particular obtenido por el procedimiento desvelado.
Como se define en el presente documento, la construcción de ácido nucleico de la invención y el virus MV-CHIKV de la invención codifican o expresan las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV.
Por "proteína estructural del virus de Chikungunya" se entiende una "proteína" como se define en la presente memoria, cuya secuencia es idéntica a la de un homólogo en una cepa de CHIKV, incluyendo un polipéptido que es una proteína estructural madura nativa o precursora de CHIKV o es un fragmento o un mutante de la misma como se define en el presente documento, en particular, un fragmento o un mutante que tiene al menos el 50 %, al menos el
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http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Los fragmentos o mutantes de las proteínas estructurales de CHIKV se pueden definir con respecto a las secuencias de aminoácidos particulares ilustradas en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido que codifica al menos una de las proteínas estructurales de CHIKV, codifica una o una pluralidad de proteínas seleccionadas en el grupo de glicoproteínas estructurales, polipéptidos estructurales y proteína de cápside.
Como se describe en el presente documento, las glicoproteínas abarcan las glicoproteínas de la envoltura E1, E2 y E3. Los polipéptidos abarcan el polipéptido 6K y la proteína de la cápside. En los siguientes párrafos, los términos proteína o glicoproteína se usarán indistintamente para designar las glicoproteínas E1, E2 o E3 o sus combinaciones.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales del CHIKV se selecciona en el grupo de:
- Un polinucleótido que codifica una de las proteínas E1, E2, E3, 6K o C;
- Un polinucleótido de fusión que codifica diversas proteínas seleccionadas entre las proteínas E1, E2, E3, 6K y C; Un polinucleótido que codifica la poliproteína E3-E2-6K-E1.
Un polinucleótido que codifica la fase de lectura abierta (ORF, del inglés open reading frame ) procedente de un genoma de CHIKV o un ADNc correspondiente que codifica dicha poliproteína C-E3-E2-6K-E1;
Cualquiera de estos polinucleótidos que se ha modificado para codificar una forma mutada de una o más de estas proteínas, en particular una forma mutada de la proteína E2.
Como se describe en el presente documento, un polinucleótido particular a este respecto codifica una forma soluble de la proteína E2 (sE2) o codifica el ectodominio de la proteína E2 o su forma soluble (sE2Astem). En una realización particular, el polinucleótido codifica uno de los siguientes polipéptidos: E3-sE2-6K-E1, E3-sE2Astem-6K- E1, C-E3-sE2-6K-E1 y C-E3-sE2Astem-6K-E1.
Como se usa en el presente documento, el término "ectodominio" significa el dominio de la glicoproteína E2 que se extiende fuera de la partícula vírica y que es responsable de la unión y entrada en las células durante la infección por partículas víricas de CHIKV.
De acuerdo con la invención, el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales del CHIKV es un polinucleótido que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido codifica un único epítopo de una proteína estructural de CHIKV o codifica un poliepítopo resultante de la expresión de epítopos repetidos (que tienen secuencias idénticas o similares) o múltiples epítopos distintos de una o varias proteínas estructurales de CHIKV.
A modo de ilustración, un poliepítopo se forma por fusión de polinucleótidos repetidos que codifican el epítopo E2 EP3 único localizado en el extremo N de la glicoproteína E2 próxima a un sitio de escisión de furina E2/E3. La secuencia de aminoácidos del epítopo E2 EP3 se desvela en Kam Y. W et al. (EMBO Mol Med 4, 330-343) y como SEQ ID NO: 33.
Como se describe en el presente documento, para formar un polinucleótido que codifique varias proteínas estructurales del CHIKV, se combinan o fusionan varios polinucleótidos en los que cada polinucleótido codifica al menos una proteína estructural de CHIKV. Estos polinucleótidos pueden distinguirse entre sí por el hecho de que codifican proteínas de diversas cepas del CHIKV. Como resultado, el polinucleótido codifica un poliepítopo como se describe en este documento, tal como un poliepítopo del epítopo E2 EP3 individual.
El polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV, se clona en la molécula de ADNc que codifica la cadena de ARN(+) antigenómica infecciosa de longitud completa de un virus del sarampión, para producir la construcción de ácido nucleico de la invención, posiblemente en sitios diferentes.
De acuerdo con un aspecto de la invención, un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K- E1 del CHIKV procede del genoma de una o más cepas silvestres aisladas y purificadas del CHIKV. Puede ser cepas silvestres del CHIKV, por ejemplo, la cepa Ross (GenBank: AF490259.3), o la cepa S27 (GenBank: AF339485.1), ambas aisladas de pacientes durante el brote de Tanzania en 1952 o, una cepa aislada durante el brote de Senegal en 1983 y denominada Ae. furcifer (GenBank: AY726732.1).
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C- E3-E2-6K-E1 del CHIKV procede de las siguientes cepas silvestres aisladas y purificadas del CHIKV: 05.61, 05.115,
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05.209, 06.21, 06.27 y 06.49, descritas en el documento WO2007/105111. En el documento WO2007/105111 se han secuenciado y desvelado las secuencias del genoma casi completo de estos aislados de CHIKV que representan distintos orígenes geográficos, puntos temporales y formas clínicas del brote del virus de Chikungunya en el Océano Índico. En la secuencia de nucleótidos del aislado de Tanzania S27 de 1952, tomado como referencia (longitud total 11.826 nt), se determinaron 11.601 nucleótidos, correspondientes a las posiciones 52 (5'NTR) a 11.667 (3'NTR, final del tercer elemento de secuencia de repetición).
En una realización particular de la invención, las secuencias genómicas de los aislados 05.61, 05.115, 05.209, 06.21, 06.27 y 06.49, presentadas en el documento WO2007/105111 y a partir de las cuales pueden obtenerse los polinucleótidos de acuerdo con la presente invención, se organizan de la siguiente manera. Secuencias codificantes que consisten en dos grandes fases de lectura abierta (ORF) de 7.422 nt y 3.744 nt que codifican la poliproteína no estructural (2.474 aminoácidos) y la poliproteína estructural (1.248 aminoácidos), respectivamente. La poliproteína no estructural es la precursora de las proteínas nsP1 (535 aa), nsP2 (798 aa), nsP3 (530 aa) y nsP4 (611 aa), y la poliproteína estructural es la precursora de las proteínas C (261 aa), p62 ( 487 aa, precursor de E3 - 64 aa - y E2 - 423 aa), 6K (61 aa) y E1 (439 aa). En las poliproteínas estructurales y no estructurales, se conservan los sitios de escisión característicos de la familia de alfavirus. También se conservan los sitos de glicosilación en E3, E2 y E1.
De acuerdo con una realización, un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV procede del genoma del siguiente grupo de cepas silvestres del CHIKV, denominadas: 06,115, 06,21, 06,27 y 06,49, como se ha descrito anteriormente.
El término "procede" que aparece en la definición de los polinucleótidos, solamente especifica que la secuencia de dicho polinucleótido puede ser idéntica a la secuencia correspondiente en una cepa CHIKV o que puede variar en la medida en que codifica una o más proteínas estructurales de CHIKV que cumplen con la definición de la "proteína" de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, el término no limite el modo de producción del polinucleótido.
El (Los) polinucleótido(s) y la construcción de ácido nucleico de la invención, pueden prepararse más bien de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica y en particular pueden clonarse, obtenerse por polimerización, especialmente usando métodos de PCR, o pueden sintetizarse.
Como se describe en el presente documento, las construcciones de ácido nucleico se definen además como que incluyen uno de los siguientes polinucleótidos que codifican al menos una de las proteínas estructurales de CHIKV. Como se describe en el presente documento, un polinucleótido que codifica una o varias proteínas estructurales de CHIKV, codifica una forma soluble de la glicoproteína E2. Como ejemplo, dicho polinucleótido comprende un dominio codificante que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8.
Como se describe en el presente documento, un polinucleótido que codifica una o varias proteínas estructurales de CHIKV, codifica el ectodominio E2. Como ejemplo, dicho polinucleótido comprende un dominio codificante que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 10, 12, 14.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido que codifica una forma soluble de la glicoproteína E2 codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido que codifica el ectodominio de la glicoproteína E2 codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo de SEQ ID NO: 11, 13, 15.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido que codifica la proteína estructural de CHIKV abarca una de las secuencias de nucleótidos definidas anteriormente que codifica la forma soluble de la glicoproteína E2 o el ectodominio de dicha proteína y comprende además, un polinucleótido que codifica una de las proteínas E3, E1, 6K o C; o un polinucleótido que codifica cualquier combinación de las mismas.
Por consiguiente, polinucleótidos particulares que codifican la poliproteína estructural E2-6K-E1 de cepas aisladas en Fréjus, Francia/2010, se seleccionan en el siguiente grupo: polinucleótidos que comprenden un dominio codificante que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16 (GenBank: Cca61130.1) y 20 (GenBank: CCA61131.1).
El polinucleótido de la invención codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de una cepa de CHIKV. En una realización particular, el polinucleótido codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 de una de las cepas denominadas S27 o 06.49 y tienen respectivamente las secuencias de SEQ ID NO: 20 y 27.
Como se describe en el presente documento, el polinucleótido que se utiliza codifica el epítopo E2 EP3 o un poliepítopo formado con una repetición de este epítopo o que comprende dicha repetición. Este polinucleótido tiene en particular la secuencia de nucleótidos desvelada como SEQ ID No: 32.
De acuerdo con una realización preferida, la invención también se refiere a modificaciones y optimización del polinucleótido para permitir una expresión eficaz de las proteínas del virus de Chikungunya en la superficie de
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partículas infecciosas quiméricas de MV-CHIKV en el hospedador.
De acuerdo con esta realización, la optimización de la secuencia de polinucleótidos puede activarse evitando dominios activos en cis de moléculas de ácido nucleico: cajas TATA internas, sitios chi y sitios de entrada al ribosoma; tramos de secuencias ricos en AT o ricos en GC; elementos de secuencias ARE, INS, CRS; secuencias repetidas y estructuras secundarias de ARN; sitios donadores y aceptores de corte y empalme crípticos, puntos de ramificación.
Los polinucleótidos optimizados también pueden optimizarse con codones para la expresión en un tipo de célula específica, en particular, puede modificarse para el uso de codones en macacos o para el uso de codones en seres humanos. Esta optimización permite aumentar la eficacia de la producción de partículas infecciosas quiméricas en las células sin afectar a la(s) proteína(s) expresada(s).
En particular, la optimización del polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV puede realizarse modificando la posición oscilatoria en los codones sin afectar a la identidad del resto de aminoácido traducido de dicho codón con respecto al original.
La optimización también se realiza para evitar secuencias de tipo edición del virus del sarampión. La edición de la transcripción del virus del sarampión es un procedimiento que se produce, en particular, en la transcripción codificada por el gen P del virus del sarampión. Esta edición, mediante la inserción de restos G adicionales en un sitio específico dentro de la transcripción P, da lugar a una nueva proteína truncada en comparación con la proteína P. La adición de un solo resto G da como resultado la expresión de la proteína V, que contiene un único extremo carboxilo (Cattaneo R et al., Cell. 10 de marzo de 1989; 56(5):759-64).
En los polinucleótidos de acuerdo con esta realización particular de la invención, pueden mutarse las siguientes secuencias de tipo edición del virus del sarampión: AAAGGG, AAAAGG, GGGAAA, GGGGAA, así como su secuencia complementaria: TTCCCC, TTTCCC, CCTTTT, CCCCTT. Por ejemplo, AAAGGG puede mutarse en AAAGGC, AAAAGG puede mutarse en AGAAGG o en TAAAGG o en GAAAGG y GGGAAA en GCGAAA.
Un polinucleótido modificado y optimizado descrito en el presente documento es como se define en SEQ ID NO: 29. Este polinucleótido codifica la forma soluble de la proteína E2 de la envoltura sin la región del tallo.
Una realización de un polinucleótido modificado y optimizado que codifica todas las proteínas estructurales C-E3-E2- 6K-E1 es como se define en SEQ ID NO: 31.
Estos polinucleótidos optimizados, de acuerdo con esta realización particular de la invención como se define en SEQ ID NO: 31, presentan mutaciones en sitios BsiWI y BssHI I dentro de las secuencias, pero no al final de estas secuencias, para conservar los sitios con fines de clonación.
Por lo tanto, de acuerdo con esta realización particular, la invención proporciona construcciones de ácido nucleico que comprenden polinucleótidos que aumentan la eficacia de la producción de partículas infecciosas MV-CHIKV quiméricas.
Como se describe en el presente documento, otros polinucleótidos optimizados que comprenden las secuencias que codifican proteínas estructurales del CHIKV y también adecuados para su uso en las construcciones de ácido nucleico, son polinucleótidos de fusión optimizados que codifican una de las siguientes combinaciones de proteínas estructurales: E3-E2-6K-E1, E3-sE2-6K-E1, E3-sE2Astem-6K-E1, C-E3-E2-6K- E1, C-E3-sE2-6K-E1 y C-E3- sE2Astem-6K-E1.
La invención también se refiere a una construcción de ácido nucleico en la que el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV codifica uno de los siguientes polipéptidos.
Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de proteínas estructurales del virus de CHIK descritas en el presente documento y relacionadas con una forma soluble de la glicoproteína E2 de las siguientes cepas denominadas 05.115, 06.21, 06.27 y 06.49, son como se define en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9.
Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de proteínas estructurales del virus de CHIK de acuerdo con realizaciones preferidas de la invención y relacionadas con el ectodominio de la glicoproteína E2 de las siguientes cepas denominadas 05.115, 06.21, 06.27 y 06.49, son como se define en SEQ ID NO: 11, 13, 15.
La divulgación describe proteínas de fusión constituidas por las proteínas estructurales E2-6K-E1 de una cepa aislada en Fréjus, Francia/2010. Estas proteínas son, respectivamente, el resultado de la expresión de los polinucleótidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 16 (GenBank: CCA61130.1) y 18 (GenBank: CCA61131.1). Sus secuencias se definen respectivamente en SEQ ID NO: 17 y 19.
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En una realización particularmente preferida, la invención se refiere a proteínas de fusión constituidas por todas las proteínas estructurales de CHIKV. Estas proteínas son el resultado de la expresión de los polinucleótidos que codifican todas las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 y se definen en SEC ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 28.
Las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 obtenidas, tienen la capacidad de autoensamblarse en partículas similares a virus (VLP) CHIKV, en las partículas CHIKV-MV.
Como se usa en el presente documento, la expresión "partícula similar a virus" (VLP), se refiere a una estructura que, en al menos un atributo, se asemeja a un virus, pero que no se ha demostrado que sea infecciosa como tal. Las partículas similares a virus de acuerdo con la invención no llevan información genética que codifique las proteínas de las partículas similares a virus, en general, las partículas similares a virus carecen de un genoma vírico y, por lo tanto, no son infecciosas ni replicativas. De acuerdo con la presente invención, Las partículas similares a virus pueden producirse en grandes cantidades y se expresan junto con partículas recombinantes CHIKV-MV.
Como se describe en el presente documento, la invención se refiere a una forma soluble de la glicoproteína E2 sin la región del tallo de la cepa de CHIKV denominada 06.49. Esta glicoproteína es el resultado de la expresión del polinucleótido modificado y optimizado como se define en SEC ID N°: 29. Su secuencia se define en SEQ ID NO: 30.
De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a partículas de virus de CHIKV-Sarampión recombinantes que expresan las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del virus de Chikungunya, como se define en el presente documento, en particular por referencia a sus secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos. El virus recombinante CHIKV-MV expresa ventajosamente las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV como VLP.
La invención también se refiere a la asociación, en una composición, de partículas similares a virus de las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV, con partículas de virus de replicación infecciosa de CHIKV-MV como se definió anteriormente.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el vector del virus del sarampión recombinante se diseña de tal manera y el procedimiento de producción implica células tales que las partículas del virus producidas en células auxiliares transfectadas o transformadas con dicho vector, originadas a partir de una cepa del virus del sarampión adaptada para la vacunación, posibilitan la producción de virus replicativo e infeccioso de Sarampión- Chikungunya recombinante, como se definió anteriormente y la producción de las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 para su uso en composiciones inmunogénicas, preferentemente composiciones protectoras o incluso vacunas.
Ventajosamente, el genoma del virus infeccioso de Sarampión-Chikungunya recombinante de la invención es competente en cuanto a la replicación. Por "competente en cuanto a la replicación', se entiende, un ácido nucleico, que cuando se transduce en una línea celular auxiliar que expresa las proteínas N, P y L de un MV, puede transcribirse y expresarse para producir nuevas partículas de virus.
La replicación del virus recombinante de la invención, obtenida usando ADNc de MV para la preparación del genoma de MV-CHIKV recombinante, también puede lograrse in vivo en el hospedador, en particular, en el hospedador humano al que se administra el MV-CHIKV recombinante.
La invención también se refiere a una composición o a un conjunto de ingredientes activos, que comprende el virus replicativo del sarampión-Chikungunya recombinante, como se definió anteriormente, en asociación con las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1. Estas composiciones o conjuntos inducen una respuesta inmunitaria, en particular, una respuesta inmunoprotectora, contra el virus de Chikungunya, y en particular, suscitan la producción de anticuerpos dirigidos contra las proteínas estructurales del virus de Chikungunya y/o suscitan una respuesta inmunitaria celular contra la infección por CHIKV. Por consiguiente, estas composiciones pueden comprender un vehículo adecuado, por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su administración a un hospedador, especialmente a un hospedador humano, y adicionalmente, pero no necesariamente, puede comprender un adyuvante para potenciar la respuesta inmunitaria en un hospedador. De hecho, los inventores han demostrado que la administración de los ingredientes activos de la invención puede suscitar una respuesta inmunitaria sin tener que utilizar adyuvantes.
La invención se refiere, en particular, a una composición para su administración a niños.
La invención también va dirigida a una composición inmunogénica, en particular una composición de vacuna y en particular una composición de vacuna para su administración a niños. Dicha composición o vacuna se usa para la protección contra la infección por CHIKV en un tratamiento profiláctico. Dicha composición de vacuna tiene ventajosamente principios activos (ingredientes activos) que comprenden partículas de virus replicativas infecciosas de Sarampión-Chikungunya recombinantes, como se definió anteriormente, rescatadas del vector que, en el presente documento, se ha definido asociado a las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1.
En el contexto de la invención, las expresiones "asociado" o "en asociación" se refieren a la presencia, en una composición única, de ambas partículas de virus MV-CHIKV recombinantes que expresan las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV y las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1, normalmente como entidades físicamente distintas.
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La invención también se refiere a las partículas de virus de replicación infecciosa de MV-CHIK recombinantes, como se definió anteriormente, en asociación con las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 o la composición de acuerdo con la invención, para su uso en un sujeto en la prevención de una infección por el por virus de Chikungunya, en particular, en un ser humano.
La invención también se refiere al virus replicativo, infeccioso, MV-CHIKV, como se definió anteriormente y a las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 asociadas, para su uso en un esquema de administración y de acuerdo con un régimen de dosificación que suscite una respuesta inmunitaria, ventajosamente una respuesta inmunoprotectora, contra una infección por el virus de CHIKV o enfermedad inducida por dicho virus, en particular, en un hospedador humano.
El esquema de administración y el régimen de dosificación pueden requerir una administración única de una dosis seleccionada del virus replicativo, infeccioso MV-CHIKV, como se definió anteriormente y las VLP CHIKV-C-E3-E2- 6K-E1 asociadas.
Como alternativa, esto puede requerir la administración de dosis múltiples en un régimen de sensibilización y refuerzo. La sensibilización y el refuerzo se pueden lograr con idénticos ingredientes activos que consisten en el virus replicativo, infeccioso MV-CHIKV, como se definió anteriormente y las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 asociadas.
Como alternativa, la administración de sensibilización y refuerzo puede lograrse con diferentes ingredientes activos, que implican el virus replicativo, infeccioso MV-CHIKV, como se definió anteriormente y las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K- E1 asociadas, en al menos una de las etapas de administración y otros inmunógenos activos de CHIKV, tales como proteínas CHIKV o las VLP que expresan la poliproteína C-E3-E2-6K-E1, en otras etapas de administración.
La invención también se refiere a un conjunto de diferentes ingredientes activos que, como uno de estos ingredientes, incluye el virus replicativo, infeccioso, MV-CHIKV, como se definió anteriormente y las VLP CHIKV-C- E3-E2-6K-E1 asociadas. Ventajosamente, el conjunto de ingredientes activos, es para su uso en la inmunización de un hospedador, en particular, un hospedador humano.
Los inventores han demostrado que la administración del virus replicativo, infeccioso, MV-CHIKV, como se definió anteriormente y las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 asociadas, suscitan una respuesta inmunitaria y especialmente suscitan anticuerpos que tienen reactividad cruzada para varias cepas de CHIKV, al menos en el genotipo ECSA (este, centro y Sudáfrica). Por consiguiente, se ha demostrado que, cuando la administración de los ingredientes activos de acuerdo con la invención, se prepara con las secuencias codificantes de una cepa particular de CHIKV, se puede suscitar una respuesta inmunitaria contra un grupo de cepas de CHIKV, en particular, un grupo de cepas del genotipo ECSA, en particular, un grupo de cepas que abarca la cepa India de CHIKv, la cepa del Congo de CHIKV, la cepa de Tailandia de CHIKV y la cepa de la isla Reunión de CHIKV.
Teniendo en cuenta los conocimientos disponibles sobre las dosis de vacunas adecuadas para otros patógenos (como el HBV o el HPV) que implican la administración de partículas similares a virus (VLP) y también para vacunas de MV humanas conocidas, los inventores han determinado que la recuperación de las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 con el virus MV-CHIKV recombinante como se definió anteriormente, permite proponer la administración de dosis eficaces bajas de los ingredientes activos. De hecho, teniendo en cuenta que el virus MV-CHIKV recombinante permite la producción de aproximadamente 104 VLP de CHIKV por partícula replicada de MV-CHIKV recombinante, y teniendo en cuenta que las dosis actualmente conocidas para las vacunas de MV humanas están en el intervalo de 103 a 104 ufp, una dosis adecuada del virus MV-CHIKV recombinante a administrar puede estar en el intervalo de 0,1 a 10 ng, en particular de 0,2 a 6 ng, y posiblemente tan solo de 0,2 a 2 ng. Para comparar, las dosis de VLP administradas en el caso de las vacunas contra el HBV o el HPV, están en el intervalo de l0 |jg, lo que significa que una dosis de vacuna MV-CHIKV recombinante podría comprender aproximadamente 2000 o hasta 5000 a 10000 veces menos VLP.
Como se describe en el presente documento, la composición inmunogénica o la vacuna definida en el presente documento, también puede usarse para la protección contra una infección por el virus del sarampión.
Descripción de los dibujos
Figura 1 Representación esquemática de las ORF para proteínas estructurales del virus de Chikungunya y para el esqueleto del genoma del MV - Se proponen construcciones de MV-CHIKV que incluyen antígenos de dicho virus CHIK para la expresión del virus del sarampión.
Figura 1B. Rescate de MV recombinante que expresa VLP de CHIKV
Figura 2 Detección con inmunofluorescencia de antígeno E2 en células Vero infectadas por MV-CHIKV recombinante durante 24 h a una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1
E2 se detectó usando el Mab (anticuerpo monoclonal) anti-E2, 3E4, usado a una dilución 1/100 y se usaron anticuerpos secundarios a una dilución 1/5000.
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Figura 3: Expresión de E2 y proteínas de la cápside por vectores de MV-CHIKV. Mediante transferencia de Western, se analizaron lisados celulares (células) y sobrenadantes (SN) de células Vero infectadas durante 24 horas con MV-sE2A y MV-CE3E26KE1. E2 se exploró con el Mab 3E4 y se detectó proteína C usando un Mab anti-cápside (de P. Despres) usado a una dilución 1/100 y se usaron anticuerpos secundarios a una dilución 1/5000.
Figura 4. Análisis por microscopía electrónica de VLP de CHIKV secretadas en el sobrenadante de células Vero infectadas con el virus recombinante MV-CE3E26KE1 a una MOI de 0,1. Barra de escala 200 nm (izquierda) y 100 nm (derecha). Las flechas rojas indican la disposición específica de picos en la superficie de las partículas y la simetría icosaédrica de la proteína de la cápside dentro de las partículas.
Figura 5. Secuencia de sE2, (forma soluble de la proteína E2) truncada, expresada por el virus recombinante MV-sE2 (156 aa, 19 kDa).
Figura 6: Cinética de crecimiento de virus recombinantes MV-sE2Astem y MV-CE3E26KE1 comparada con la del MV estándar en células Vero (MOI de 0,01). Los títulos de los virus asociados a células se indican en TCID50 (siglas del inglés, Tissue Culture Infective Dose 50, 50 % de dosis infecciosa de cultivo tisular).
Figura 7: Programa de inmunización y exposición del ejemplo 2.
Figura 8: Curva de supervivencia de ratones expuestos letalmente a 100 UFP de CHIKV-06-49 después de dos inmunizaciones con el virus recombinante MV-CE3E26KE1.
Figura 9: Programa de inmunización y exposición del ejemplo 3.
Figura 10: Curva de supervivencia de ratones expuestos letalmente a 100 UFP de CHIKV-06-49 después de una sola inmunización con el virus recombinante MV-CE3E26KE1.
Figura 11: Programa de inmunización y exposición del ejemplo 4.
Figura 12: Curva de supervivencia de ratones expuestos letalmente a 100 UFP de CHIKV-06-49 después de inmunización con diferentes dosis de virus recombinante MV-CE3E26KE1.
Figura 13: Transferencia pasiva de sueros inmunes y programa de exposición del ejemplo 5.
Figura 14: Curva de supervivencia de ratones expuestos letalmente a 100 UFP de CHIKV-06-49 después de la transferencia pasiva de sueros inmunes MV-CE3E26KE1.
Figura 15: Respuestas inmunitarias mediadas por células, suscitadas en esplenocitos de ratones CD46-IFNAR inmunizados con una sola inyección de 106 TCID50 de MV-CHIKV.
Figura 16: Programa de inmunización y exposición del ejemplo 6.
Figura 17: Curva de supervivencia de ratones preinmunes a MV expuestos letalmente a 100 UFP de CHIKV-06- 49 después de inmunización con MV-CE3E26KE1.
Figura 18: Ensayos PRNT realizados contra CHIK antes de la primera inmunización el día 90 (antes del refuerzo) y el día 111 (21 días después del refuerzo).
Ejemplos
Construcción y caracterización de vectores del virus del sarampión recombinante que expresan proteínas del virus de Chikungunya.
Los inventores diseñaron tres antígenos del virus de Chikungunya basados en secuencias peptídicas de proteínas nativas de la cepa 06-49 del virus de Chikungunya. Las proteínas nativas que permitieron la preparación de estas secuencias peptídicas fueron las cinco proteínas estructurales que consisten en la envoltura de la cápside (C) y las proteínas accesorias E1, E2, E3 y 6K.
La primera construcción se dirigió a la expresión de la forma soluble de la proteína E2 (sE2) de la envoltura, la segunda construcción a la expresión de la sE2 sin la región del tallo (stem en inglés) (sE2Astem), y la tercera construcción se dirigió a la expresión de todas las proteínas estructurales (C-E3-E2-6K-E1) víricas (Fig. 1). en el presente documento se han descrito los protocolos experimentales con respecto a esta última construcción.
Cultivo celular. Células Vero (de riñón de mono verde africano) se conservaron en DMEM GlutaMAX ™ (Gibco-BRL) complementado con suero bovino fetal al 5 % termoinactivado (FCS, Invitrogen, Frederick, MD). Células auxiliares
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HEK-293-T7-MV (WO2008 / 078198) utilizadas para el rescate del virus del sarampión recombinante se cultivaron en DMEM complementado con FCS al 10 %.
Construcción de pTM-MVSchw-CE3E26KE1. El plásmido pTM-MVSchw, que contiene un ADNc de MV infeccioso correspondiente al antigenoma de la cepa de vacuna Schwarz del MV, ha sido descrito en otro lugar (Combredet, C., et al., A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. J Virol, 2003. 77(21): págs. 11546-54). El ADNc que codifica los antígenos estructurales CE3E26KE1 del CHIKV se generó por síntesis química (GenScript, USA). Contiene la secuencia de las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 víricas de la cepa 06-49 del virus de CHIKV (WO2007/105111). La secuencia completa respeta la "regla de seis", que estipula que el número de nucleótidos en el genoma del MV debe ser un múltiplo de 6, y contiene el sitio de restricción BsiWI en el extremo 5 ' y BssHIl en el extremo 3'. La secuencia se optimizó para la expresión del virus del sarampión en células de mamífero. Este ADNc se insertó en pTM-MVSchw-ATU2 digerido con BsiWI/BssHII, que contiene una unidad de transcripción adicional (ATU) entre los genes de la fosfoproteína (P) y la matriz (M) del genoma MV de Schwarz (Combredet, C., et al., A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. J Virol, 2003. 77(21): págs. 11546-54). El plásmido resultante se denominó pTM-MVSchw-CE3E26KE1.
Rescate del MV-CE3E26KE1 recombinante. El rescate de Schwarz MV-CHIKV recombinante del plásmido pTM- MVSchw-CE3E26KE1 se realizó como se ha descrito anteriormente usando un sistema de rescate anteriormente descrito (Radecke, F., et al., Rescue of measles viruses from cloned DNA. Embo J, 1995. 14(23): págs. 5773-84; documento WO2008/078198). Los títulos víricos se determinaron mediante ensayo por dilución límite final en células Vero y la TCID50 se calculó usando el método de Karber.
Inmunofluorescencia. Se realizó tinción con inmunofluorescencia en células infectadas, como se describe en otra parte (Lucas, M., et al., Infection of mouse neurons by West Nile virus is modulated by the interferon-inducible 2'-5' oligoad- enylate synthetase 1b protein. Immun. Cell Biol., 2003. 81: págs. 230-236). Las células se exploraron con anticuerpos anti-E2 (3E4) y anti-cápside de ratón. Como anticuerpo secundario se usó anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con Cy3 (Jackson Immunoresearch laboratories).
Análisis de transferencia de Western. Los lisados de proteínas de células Vero infectadas con virus recombinante se fraccionaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de celulosa (Amersham Pharmacia Biotech). Las transferencias se exploraron con el Mab 3E4, anti-E2 y anti-cápside de ratón. Como anticuerpo secundario se usó anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina G (IgG) de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Amersham). La actividad de peroxidasa se visualizó con un kit de detección de quimioluminiscencia mejorado (Pierce).
Análisis de producción de VLP por microscopía electrónica. Se infectaron células Vero (3 matraces T-150) con virus recombinante MV-CHIKV a una MOI de 1. Los sobrenadantes recogidos después de 36 h de infección, se clarificaron por centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos, se depositaron en capas en un amortiguador de sacarosa al 20 % en PBS y se centrifugaron a 41.000 rpm durante 2 horas en un rotor SW41. Los sedimentos se resuspendieron en PBS con BSA al 1 % y se analizaron mediante microscopía electrónica. Se realizó una tinción negativa con acetato de uranilo al 2 % sobre rejillas de cobre recubiertas con carbono y se descargó el brillo justo antes del uso. Las muestras se observaron a 80 kV con un microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM1200 (Tokio, Japón). Las imágenes se grabaron con una cámara Eloise Keenview y la versión de Analysis Pro-software 3,1 (Eloise SARL, Roissy, Francia).
Experimentos en ratones. Se produjeron ratones CD46-IFNAR susceptibles a infección por VM como se describió anteriormente (Combredet, C., et al., A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. J Virol, 2003. 77(21): págs. 11546-54). Los ratones se alojaron en la instalación para animales del Instituto Pasteur en condiciones sin gérmenes patógenos específicos. Para la inmunización, ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con 105 TCID50 de MV-CE3E26KE1 recombinante o MV. Para los ensayos de protección, los ratones inmunizados se inocularon i.p con 100 ufp de la cepa 06-49 de CHIKV y se siguió la mortalidad durante 2 semanas. Todos los experimentos se autorizaron y realizaron de conformidad con las directrices de la Oficina de Cuidado de Animales de Laboratorio del Instituto Pasteur. Para el estudio de transferencia pasiva, ratones CD46-IFNAR se inocularon por vía intraperitoneal con 20 pl de sueros reunidos de 6 ratones inmunizados con 105 TCID50 de MV-CE3E26KE1. Los ratones de control recibieron 20 pl de sueros reunidos de ratones inmunizados con 105 TCID50 de MVSchw vacío o 20 pl de HMAF (siglas del inglés Hyper-immune Mouse Ascitic Fluid, líquido ascítico de ratón hiperinmune) anti- CHIKV. Los sueros se diluyeron en PBs en un volumen total de 100 pl antes de la transferencia pasiva a las 24 h y 16 h antes de la exposición con 100 ufp de la cepa 06-49 del CHIKV, y después de 12 h desde la exposición para simular la persistencia de los anticuerpos en los animales infectados. La mortalidad de los ratones se analizó durante 2 semanas para determinar la protección.
Análisis de respuestas inmunitarias humorales. Para evaluar las respuestas específicas de los anticuerpos, se extrajo sangre de los ratones por vía periorbitaria a diferentes momentos después de la inmunización. Los sueros se termoinactivaron a 56 °C durante 30 min y los anticuerpos anti-MV se detectaron mediante ELISA (ENZYGNOST-
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Siemens). como anticuerpo secundario se usó anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch laboratories). Los anticuerpos anti-CHIKV se detectaron con un ELISA específico. Resumiendo, Placas de 96 pocillos se recubrieron con una proteína recombinante CHIKV-E2 producida en E. coli. Como anticuerpo secundario se usó anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón conjugado con HRP. Los títulos finales de los sueros reunidos se calcularon como la recíproca de la última dilución que daba el doble de la absorbancia de los sueros de los ratones inoculados con MV que sirvieron como controles negativos. Los anticuerpos neutralizantes anti-CHIKV se midieron usando una prueba de neutralización por reducción en placas (PRNT, siglas del inglés plaque reduction neutralization test). Durante 24 horas, se sembraron células Vero en placas de 12 pocillos. Las muestras de suero se diluyeron en serie en DMEM Glutamax/FCS al 2 %. Durante 2 horas, se incubaron diluciones de 100 |jl a 37 °C, agitando suavemente, con el mismo volumen de CHIKV que contenía 100 ufp de la cepa 06-49. A continuación, se ensayó la infectividad restante en monocapas de células Vero superpuestas con DMEM GlutaMAX™/FCS al 2 % que contenía carboximetilcelulosa final al 0,8 % (p / vol). Después de 3 días de incubación, las células de fijaron y se tiñeron con violeta de cristal para determinar el recuento de placas. El título de neutralización final se calculó como la dilución de suero más alta ensayada que redujo el número de placas en al menos 50 % (PRNT50).
Análisis de respuesta inmunitaria mediada por células. Ratones CD46+/-IFN(a/pR-/-) de seis semanas de vida se inocularon por vía intraperitoneal con 106 TCID50 de virus recombinante. Los ratones de control se inmunizaron con 106 TCID50 de vector vacío de MV. Los ratones se sacrificaron 7 días después de la infección y se extrajeron los bazos. Se incubaron esplenocitos de ratones inmunizados en RPMI, FCS al 10 % y 10 UI de interleucina 2 humana recombinante (rh-IL-2; Boehringer Mannheim). Su capacidad para secretar IFN-y después de la estimulación, se analizó mediante un ensayo de inmunomancha ligado a enzimas (ELISPOT, siglas del inglés enzyme-linked immunospot). Las células se estimularon durante 18 horas con concavalina A (5 jg/ml; Sigma) como control positivo, RPMI-IL-2 (10 U/ml) como control negativo, CHIKV (MOI 1) o MV (MOI 1). Placas de 96 pocillos Multiscreen-HA se recubrieron durante la noche a 4 °C con 5 jg de anti-IFN-Y de ratón/ml (R4-6A2; Pharmingen) en PBS, se lavaron y después se incubaron con 100 jl de RPMI y FCS al 10 % durante 1 hora a 37 °C. El medio se reemplazó por 100 jl de suspensión celular (5x105 esplenocitos por pocillo por triplicado) y 100 jl de agente estimulante. Después de 2 h a 37 °C, se añadió FCS caliente (10 %), y las placas se incubaron durante 18 h a 37 °C. Después de lavar, se añadió anticuerpo anti-IFN-y de ratón marcado con biotina (XMG1.2; Pharmingen) y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Como etapa secundaria su usó conjugado de fosfatasa alcalina-estreptavidina (Roche). Las manchas se revelaron BCIP/NBT (Promega) y se contaron (lector ELISpot; Bio-Sys).
Expresión de partículas similares a virus CHIKV mediante un vector MV recombinante. Se ha demostrado que las VLP de CHIKV suscitan inmunidad protectora contra infección por CHIKV (Akahata, W., et al., A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection. Nat Med, 2010. 16(3): págs. 334-8). Para beneficiarse de esta capacidad, los inventores diseñaron un vector de MV recombinante, con capacidad para inducir la secreción de las VLP de CHIKV. Para este objetivo, un ADNc, que codificaba las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 requeridas para la producción de las VLP de CHIKV, se sintetizó químicamente (Gen- script) y se optimizó para la expresión del virus del sarampión en células de mamífero, después se introdujo en una unidad de transcripción adicional (ATU) del ADNc infeccioso de la vacuna MV de Schwarz (Figura 1). El virus recombinante MV-CHIKV se obtuvo por transfección de este plásmido en células auxiliares HEK-293 y propagación en células Vero. Reservas de virus se cultivaron en células Vero y se determinó el título.
En el medio de cultivo de las células infectadas, se secretaron altas cantidades de VLP (partículas similares a virus) de CHIKV, como se demuestra mediante inmunofluorescencia, transferencia de Western y microscopía electrónica.
Esta estrategia proporciona un virus vivo de la vacuna MV recombinante que secreta las VLP de CHIKV en cada ronda de replicación. No se esperaba que tuviera lugar el ensamblaje de partículas de alfavirus nativos y que estas VLP no obstaculizarían la replicación simultánea de un paramixovirus. Esto se demuestra por primera vez en el presente documento. Dado que la vacuna del MV se produce industrialmente como un extracto vírico bruto, los lotes de MV-CHIKV recombinante contienen tanto virus MV vivos como VLP CHIKV no replicantes. Esta estrategia permite beneficiarse de la propiedad inmunogénica ventajosa de los antígenos multiméricos presentados en las VLP sin necesidad de tener que realizar un procedimiento de purificación y concentración exigente y costoso. Por otra parte, no se necesita adyuvante, ya que las VLP se benefician de las características inmunogénicas ventajosas de las vacunas vivas, tales como una respuesta Th1 equilibrada y una memoria prolongada.
La expresión de los antígenos E2 y de cápside de CHIKV, se demostró en células Vero infectadas mediante inmunofluorescencia usando un anticuerpo específico (Mab 3E4) dirigido contra la proteína E2 de CHIKV (Figura 2). Para investigar la presencia de VLP secretadas, el medio de cultivo de las células infectadas se clarificó mediante centrifugación a baja velocidad, después se depositó en capas en un amortiguador de sacarosa al 20 % y se concentró por centrifugación a 41.000 rpm durante 2 horas en un rotor SW41. Los sedimentos se disolvieron en PBS con BSA al 1 %. Las proteínas extraídas de los lisados celulares y de los medios de cultivo concentrados, se fraccionaron mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de celulosa. Las transferencias se exploraron con el Mab 3E4 de ratón, producido por el hibridoma depositado en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Paris, Francia) el 6 de septiembre de 2007 con el número I- 3824, en nombre del Instituto Pasteur para la detección de E2 y un Mab anticápside (Figura 3). La proteína E2 se
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encontró al tamaño correcto (46KDa), tanto en lisados celulares como en sobrenadante concentrado de células infectadas, lo que indicaba la capacidad del virus MV-CHIKV para inducir la secreción de partículas de alta densidad que contenían la proteína E2. La proteína de la cápside también se encontró en partículas de alta densidad, lo que confirmaba la formación de las VLP de CHIKV. La presencia de las proteínas C y E2 en el sobrenadante concentrado de células infectadas, sugiere la formación de las VLP de CHIKV. Para observar su presencia física, los inventores analizaron por microscopía electrónica los sedimentos concentrados del sobrenadante de células infectadas con MV-CHIKV. Las imágenes revelaron la presencia de una gran cantidad de partículas de tamaño y morfología similares a las descritas después de la infección por CHIKV de tipo silvestre (Pletnev, S.V., et al., Locations of carbohydrate sites on alphavirus glycoproteins show that E1 forms an icosahedral scaffold. Cell, 2001. 105(1): págs. 127-36; Zhang, W., et al., Placement of the structural proteins in Sindbis virus. J Virol, 2002. 76(22): págs. 11645-58) (Figura 4). Las partículas observadas presentaban un diámetro externo de 65 nm y un diámetro de núcleo de 40 nm. La organización de la superficie indica la presencia de picos en la superficie de las VLP, dispuestos de manera similar en comparación con otros alfavirus (Pletnev, S.V., et al., Locations of carbohydrate sites on alphavirus glycoproteins show that E1 forms an icosahedral scaffold. Cell, 2001. 105(1): págs. 127-36; Zhang, W., et al., Placement of the structural proteins in Sindbis virus. J Virol, 2002. 76(22): págs. 11645-58). Esta observación confirma que la infección de las células Vero por el virus recombinante MV-CHIKV permite la secreción de grandes cantidades de CHIK VLP que se autoensamblan.
Las células infectadas con virus recombinantes del virus del sarampión-E2Astem y con virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1, también expresaron y secretaron la proteína E2 al tamaño correcto (46KDa).
Lamentablemente, el análisis de células infectadas con MV-sE2 mostró la expresión reiterada de una forma truncada de la proteína E2. Los inventores secuenciaron el ARNm de E2 producido por el virus MV-sE2 después de la amplificación por RT-PCR de las células infectadas. El análisis demostró la presencia de una mutación que generaba un codón de terminación (STOP), responsable del truncamiento (Fig. 5).
Después, los inventores compararon en células Vero, la tasa de replicación de los virus recombinantes del virus del sarampion-sE2, virus del sarampión-E2Astem y virus del sarampión-CE3E26KE1, para la producción estándar de reservas del virus del sarampión, usando una MOI baja (0,01) (Fig. 6). El crecimiento de MV-sE2 fue similar al de MV de control. El crecimiento de los virus recombinantes del virus del sarampión-sE2Astem y virus del sarampión- CE3E26KE1, se retrasó ligeramente, pero sus títulos finales estaban en el mismo intervalo que el del virus del sarampión vacío.
Inmunogenicidad de MV-sE2 y MV-CE3E26KE1 y protección en ratones CD46-IFNAR.
Para evaluar la inmunogenicidad de los virus recombinantes MV-CHIKV y su eficacia protectora, se usaron ratones CD46-IFNAR susceptibles a infección por MV. Estos ratones expresan el gen humano CD46 con especificidad tisular similar a la humana y carecen de los receptores de interferón de tipo I. Los ratones se alojaron en la instalación para animales del Instituto Pasteur en condiciones sin gérmenes patógenos específicos y todos los experimentos se autorizaron y realizaron de conformidad con las directrices del Office of Laboratory Animal Care del Instituto Pasteur. Ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida, se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con dosis que variaban de 103 a 105 TCID50 de virus recombinantes MV-CHIKV y 1 mes después recibieron un refuerzo con la misma dosis de virus recombinantes. Los ratones de control se inmunizaron con la misma dosis de vector vacío de MVSchw. Para la determinación de los anticuerpos, se extrajeron muestras de sangre por vía periorbitaria 1 mes después de la primera inoculación, después, a las 2 o 4 semanas de recibir el refuerzo.
Estudios anteriores han demostrado que los ratones IFNAR son susceptibles a infección letal por el virus de Chikungunya, mostrando manifestaciones patológicas de infección y proporcionando un modelo para evaluar los mecanismos de protección inmunitaria (Couderc et al; 2008).
Para evaluar la inmunogenicidad de los virus recombinantes Sarampión-Chikungunya y su eficacia protectora, se usaron ratones CD46-IFNAR susceptibles a infección por el virus del sarampión. Estos ratones expresan el gen humano CD46 con especificidad tisular similar a la humana y carecen de los receptores de interferón de tipo I. Los ratones se alojaron en la instalación para animales del Instituto Pasteur en condiciones sin gérmenes patógenos específicos y todos los experimentos se autorizaron y realizaron de conformidad con las directrices del Office of Laboratory Animal Care del Instituto Pasteur.
Experimento 1 Análisis de inmunogenicidad y de eficacia protectora de virus recombinantes del virus del sarampión- CE3E26KE1 en ratones CD46-IFNAR.
Ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida, susceptibles a infección por el virus del sarampión, se inocularon por vía intraperitoneal con 2.104 TCID50 de virus recombinantes del virus del sarampión-virus de Chikungunya y 1 mes después recibieron un refuerzo con la misma dosis de virus recombinantes. Los ratones de control se inmunizaron con la misma dosis de vector vacío de virus de sarampión Schwarz (MV Schw). Para la determinación de los anticuerpos, se extrajeron muestras de sangre por vía periorbitaria 1 mes después de la primera inoculación, después, a las 2 semanas de recibir el refuerzo. Para evaluar la protección (en la figura 7 se muestra el programa de
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inmunización y exposición), los ratones se expusieron a inyección i.p. de 100 ufp de la cepa 06-49 del virus de Chikungunya.
Para evaluar las respuestas específicas de los anticuerpos, se extrajo sangre de los ratones a diferentes momentos después de la inoculación. Los sueros se termoinactivaron a 56 °C durante 30 min y los anticuerpos anti-virus de Chikungunya se detectaron mediante ELISA. Placas de 96 pocillos se recubrieron con la proteína E2 del virus de Chikungunya recombinante producida en E. coli. Como anticuerpo secundario se usó anticuerpo anti- inmunoglobulina de ratón conjugado con HRP y como control positivo se usaron anticuerpos anti-virus de Chikungunya de ratón. Se detectaron anticuerpos neutralizantes anti-virus de Chikungunya mediante una prueba de neutralización por reducción en placas (PRNT) (Warter L y col., JIM 2011 (D4 adjunto) y Russell PK y col. JIM 1967) realizada en células Vero, usando 50 UFP de la cepa 06-49 del virus de Chikungunya (producido en células Vero). El título final se calculó como la dilución de suero más alta ensayada que redujo el número de UFP en al menos 50 % (PRNT50) o 90 % (PRNT90).
Una sola inyección de virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1, indujo títulos de anticuerpos altos, que se reforzaron contundentemente con una segunda inyección (tabla 1 -figura 8). Después de dos inmunizaciones, se indujeron títulos de neutralización altos (PRNT50 = 450-4050 y PRNT90 = 50-450). Todos los animales inmunizados con 104 o 105 TCIDsüfueron protegidos de exposición letal a CHIKV con 100 UFP de la cepa 06-49 de CHIKV, mientras que la inmunización con la dosis más baja (103 TCID50) protegió al 83 % de los animales.
Tabla 1. Respuesta de anticuerpos de ratones CD46-IFNAR a la inmunización con MV-sE2 y MV-CE3E26KE1 _________________________(determinada en sueros agrupados de ratones)_________________________
Dosis 1 Elisa Dosis 2 Elisa PRNT50 PRNT90
MV
<100 <100 <50 <50
MV-CHIK.sE2
450 4000 <50 <50
VH-CHIK.CE3E26KE1
4000 >12000 1350 150
HMAF anti-CHIKV
ND ND 4050 450
Después de dos inmunizaciones, se indujeron títulos de neutralización altos (PRNT50 = 1350 y PRNT90 = 150) que protegían a los ratones de una exposición letal con 100 UFP de la cepa 06-49 del virus de Chikungunya.
Experimento 2 Análisis de inmunogenicidad y de eficacia protectora de una sola dosis de virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1, en ratones CD46-IFNAR.
Ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida, se inocularon por vía i.p. con 105 TCID50 de virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1. Los ratones de control se inmunizaron con la misma dosis de vector del virus del sarampión Schw vacío. Para la determinación del anticuerpo, 2 semanas después de la inmunización, se extrajeron muestras de sangre por vía periorbitaria y después los ratones se expusieron a inyección i.p. de 100 ufp de la cepa 06-49 del virus de Chikungunya (en la figura 9 se muestra el programa de inmunización y exposición).
Los virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1, indujeron títulos de anticuerpos altos después de una sola inyección (tabla 2 - figura 10), y títulos neutralizantes que fueron suficientes para otorgar protección contra una exposición letal con 100 UFP de la cepa 06-49 del virus de Chikungunya en ratones IFNAR.
Tabla 2. Respuesta de anticuerpos suscitada en ratones CD46-IFNAR después de una sola inmunización con el
virus MV-CE3E26KE1
título de MV mediante Elisa título de CHIKV mediante Elisa CHIKV PRNT50 CHIKV PRNT90
MV
10 000 <100 <50 <50
MV-CHIKV
10 000 4 050 150 50
HMAF anti-CHIKV
ND ND 12150 450
Experimento 3 Determinación de la dosis protectora de virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1 en ratones CD46- IFNAR.
Ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida, se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con dosis que variaban de 103 a 105 TCID50 de virus recombinantes MV-CHIKV y un mes después con un refuerzo de la misma dosis. Los ratones de control se inmunizaron con la misma dosis de vector vacío de MVSchw. Un mes después de la última inmunización, los ratones se expusieron a inyección i.p. de 100 ufp de la cepa 06-49 del CHIKV (en la figura 11 se muestra el programa de inmunización y exposición). Para la determinación de los anticuerpos, se extrajeron muestras de sangre por vía periorbitaria 1 mes después de la primera inoculación, después, al mes de recibir el refuerzo, justo antes de la exposición. Se realizaron ensayos Elisa específicos para detectar anticuerpos de unión a anti-MV y anti-CHIKV. Usando una prueba de neutralización por reducción en placas (PRNT) en células Vero, se determinaron los títulos de los anticuerpos neutralizantes anti-CHIKV.
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Los resultados se dan en la tabla 3 y en la figura 12.
Tabla 3. Respuesta de anticuerpos después de inmunización con diferentes dosis de MV-CE3E26KE1 1a inmunización 2a inmunización
título de MV mediante Elisa título de CHIKV mediante Elisa CHIKV PRNT50 CHIKV PRNT 90 título de MV mediante Elisa título de CHIKV mediante Elisa CHIKV PRNT50 CHIKV PRNT90
MV 105
10 000 <100 <50 <50 300 000 <100 <50 <50
MV-CHIKV 103
1 000 1 350 50 <50 3000 2 700 450 50
MV-CHIKV 104
3 000 4 050 150 50 30 000 12 150 1 350 150
MV-
3000 12 150 450 150 300 000 48 600 4 050 450
CHIKV-
105
Los títulos de anticuerpos anti-MV y anti-CHIKV aumentaron cuando aumentó la dosis de MV recombinante. Una sola inmunización con virus MV-CE3E26KE1 indujo títulos de anticuerpos altos, que se reforzaron con la segunda inyección. Después de dos inmunizaciones, se indujeron títulos de neutralización altos (PRNT50 = 450-4050 y PRNT90 = 50-450). Todos los animales inmunizados con 104 o 105 TCID50fueron protegidos de exposición letal a CHIKV con 100 UFP de la cepa 06-49 de CHIKV, mientras que la inmunización con la dosis más baja (103 TCID50) protegió al 83 % de los animales (Figura 12).
Experimento 4 Evaluación de la protección otorgada por transferencia pasiva de sueros de ratones inmunizados con el virus recombinante MV-CE3E26KE1.
Ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida, se inocularon por vía i.p. con 20 pl de sueros reunidos de ratones inmunizados con 105 TCID50 de MV-CE3E26KE1 recombinante. Los ratones de control recibieron 20 ul de sueros reunidos de ratones inmunizados con 10 TCID50 de cepa Schwarz del virus de sarampión vacío o 20 pl de HMAF anti-virus CHIKV. Los sueros se diluyeron en un volumen total de 100 pl de PBS. Los sueros se transfirieron a las 24 h y 16 h antes de la exposición con 100 ufp de cepa 06-49 del virus Chikungunya y después a las 12 h desde la exposición para simular la persistencia de los anticuerpos en los animales infectados. La mortalidad de los ratones se analizó durante 2 semanas para determinar la protección (en la figura 13 se muestra el programa de inmunización y exposición).
La transferencia pasiva de sueros inmunes de ratones inmunizados con el virus MV-CE3E26KE1 protegió al 83 % de los ratones receptores de la exposición letal del virus Chikungunya, mientras que los ratones que recibieron HMAF anti-virus Chikungunya, estaban completamente protegidos. Por el contrario, todos los ratones que recibieron sueros inmunes de ratones inmunizados con virus del sarampión vacío murieron. Estos resultados indican que las respuestas inmunitarias humorales inducidas por los virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1, otorgan protección contra la infección por el virus Chikungunya en ratones CD46-IFNAR (figura 14).
Experimento 5 Inducción de respuestas inmunitarias específicas mediadas por células.
Para determinar si la inmunización con MV-CHIKV suscitaba respuestas inmunitarias mediadas por células, se midió, mediante el ensayo ELISPOT, la capacidad de los esplenocitos de ratones inmunizados para secretar IFN-y tras estimulación específica ex vivo. Se recogieron esplenocitos 7 días después de una sola inmunización y se evaluaron las respuestas específicas tanto a MV como a CHIKV. Para la estimulación de los esplenocitos, CHIKv y MV se usaron a MOI de 1. Se detectó un número significativo de células específicas de CHIKV (hasta 300/106 esplenocitos, media 150/106) (Figura 15), que representa un tercio de la respuesta específica de MV en condiciones de estimulación similares (hasta 600/106 esplenocitos, media 500/106). Todos los ratones inmunizados con MV- CHKV, excepto uno de ocho, tuvo una respuesta CMI significativa contra CHIKV. Por el contrario, los ratones de control inmunizados con MVSchw vacío tenían una respuesta específica de MV similar pero no tenían respuesta específica de CHIKV. Estos resultados muestran que una sola inoculación de MV-CHIKV indujo niveles altos de respuesta inmunitaria celular específica de CHIKV y MV en el bazo de ratones inmunizados.
Experimento 6 Análisis del impacto de la preinmunidad del virus del sarampión sobre la inmunogenicidad y eficacia protectora del virus recombinante MV-CE3E26KE1 en ratones CD46-IFNAR.
Ratones CD46-IFNAR de seis semanas de vida, se inocularon por vía i.p. con 5.103 TCID50 de cepa Schwarz de virus de sarampión vacío (Grupo 1 Figura 16) para simular preinmunidad. Tres meses después, estos ratones se inyectaron dos veces con 105 TCID50 de virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1 a un mes de intervalo. Los ratones de control se inmunizaron con 105 TCID50 de virus recombinantes del virus del sarampión-
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CE3E26KE1 (Grupo 2) o con 105 TCID50 de virus de sarampión Schw vacío (Grupo 3). Para la determinación de los anticuerpos, como se indica en la Figura 16, para los ensayos de protección, se extrajeron muestras de sangre por vía periorbitaria, y después los ratones se expusieron a inyección i.p. de 100 ufp de la cepa 06-49 del virus Chikungunya.
Este experimento demuestra que los ratones CD46-IFNAR previamente inmunizados con 5.103 TCID50 de virus vacíos de sarampión pueden generar una respuesta inmunitaria protectora contra el virus de Chikungunya después de la inmunización con virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1. Los títulos según los ensayos ELISA y PRNT (Tabla 4 - figura 17) permanecen altos y en el mismo intervalo que los inducidos en ratones sin tratamiento previo (el título del ensayo ELISA permaneció invariable y los títulos del ensayo PRNT se redujeron a 1/2 de dilución). El 100 % de los animales vacunados se protegieron de la exposición letal al virus de Chikungunya en grupos de animales preinmunes y sin tratamiento previo inmunizados con virus recombinantes del virus del sarampión-CE3E26KE1.
Tabla 4. Respuesta de anticuerpos de ratones CD46-IFNAR contra MV-CE3E26KE1 en presencia de preinmunidad
al vector de MV
Inmunizaciones
1a 2a 3a
MV Elisa MV CHIKV CHIKV CHIKV MV CHIKV CHIKV CHIKV
Elisa Elisa PRNT50 PRNT90 Elisa Elisa PRNT50 PRNT90
MV + MV-CHIKV
3 000 30 000 12 150 150 50 30 000 150 000 12 150 150
MV-CHIKV
ND 10 000 12 150 450 150 100 000 150 000 12 150 450
MV
ND 10 000 <50 <50 <50 100 000 <50 <50 <50
Experimento 7: Reactividad cruzada de anticuerpos (Ab) suscitada mediante vacunación
Para determinar si la inmunización con MV-CHIKV suscitaba una respuesta de anticuerpos de reacción cruzada contra diferentes aislados primarios de CHIKV, los sueros obtenidos de los animales del experimento 4 se analizaron para determinar su capacidad de neutralizar diferentes aislados primarios de CHIKV. Se eligieron cuatro cepas pertenecientes al genotipo ECSA.
• cepa de la India de CHIKV, aislado clínico n° 3710 (NRC para Arbovirus, Francia), aislada en 2011. Pase 1 en células Vero (diciembre de 2011), título del virus 6,3 log UFP/ml
• cepa del Congo de CHIKV, aislado clínico n° 525 (NRC para Arbovirus, Francia), aislada en 2011. Pase 1 en células Vero (junio de 2011), título del virus 6,5 log UFP/ml
• cepa de Tailandia del CHIKV, aislado clínico n° 1499 (NRC para Arbovirus, Francia), aislada en 2009. Pase en células C6/36 (diciembre de 2009), título del virus 6,3 log UFP/ml
• cepa de La Reunión del CHIKV, aislado clínico 2006.49 (NRC para Arbovirus, Francia), aislada en 2006. Pase 3 en células Vero (4 de abril de 2011), título del virus 7,3 log UFP/ml
Usando una prueba de neutralización por reducción en placas (PRNT), se detectaron anticuerpos neutralizantes anti- CHIKV. Se sembraron células Vero en placas de 12 pocillos durante 24 h. Las muestras de suero se diluyeron en serie en DMEM Glutamax/FCS al 2 %. Durante 2 horas, se incubaron diluciones de 100 ml a 37 °C, agitando suavemente, con el mismo volumen de CHIKV que contenía 100 ufp de la cepa 06-49. A continuación, se ensayó la infectividad restante en monocapas de células Vero superpuestas con DMEM GlutaMAX/FCS al 2 % que contenía carboximetilcelulosa final al 0,8 % (p/vol). Después de 3 días de incubación, las células de fijaron y se tiñeron con violeta de cristal para determinar el recuento de placas. El título de neutralización final se calculó como la dilución de suero más alta ensayada que redujo el número de placas en al menos 50 % (PRNT50).
Tabla 5. Reactividad cruzada de Ab neutralizante de ratones inmunizados con MV-CHIKV
PRNT50 post 1a PRNT50 post 2a PRNT50 post exposición
MV-CHIKV MV MV-CHIKV MV MV-CHIKV MV
06-49
50 < 50 1350 < 50 450 ND
India
150 < 50 1350 < 50 13250 ND
Congo
< 50 < 50 1350 < 50 1350 ND
Tailandia
150 < 50 4050 < 50 12150 ND
El resultado muestra que la inmunización de ratones con MV-CHIKV induce anticuerpos de reacción cruzada que pueden neutralizar diversos aislados primarios de CHIKV de diferentes países. Curiosamente, la exposición de los animales con el virus 06-49 de la isla de La Reunión da como resultado una amplificación uniforme de la respuesta y refuerza la neutralización de los aislados de India y Tailandia a niveles muy fuertes. Solo se analizó el genotipo ECSA debido a su disponibilidad en el Instituto Pasteur.
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Experimento 8: Inmunogenicidad de MV-CHIKV en macacos cynomolgus
La inmunogenicidad de la vacuna del virus del sarampión recombinante contra el Chikungunya se probó en primates no humanos. Dos grupos de cuatro macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) previamente seleccionados por ser seronegativos para los flavivirus y el virus del sarampión, se vacunaron por vía subcutánea con 104 o 105 TCID50 de MV-CHIKV el día 0 y después con una misma dosis de refuerzo el día 90. El suero y el plasma se extrajeron y se conservaron a -20 °C para su posterior análisis. Utilizando un ensayo PRNT, se detectaron anticuerpos neutralizantes contra el virus de Chikungunya.
Tabla 6.
Grupo
Animal Código Vacuna Dosis Recíproca de CHIK mediante ensayo PRNT
Día 0 Día 21 Día 90 Día 111
D
D1 12/9 MV-CHIK 104 <10 574 <10 14
D2
12/4 MV-CHIK 104 <10 142 73 97
D3
12/5 MV-CHIK 104 <10 16 17 121
D4
12/10 MV-CHIK 104 <10 70 83 118
E
E1 12/16 MV-CHIK 105 <10 247 101 382
E2
12/23 MV-CHIK 105 <10 103 178 355
E3 12/26 MV-CHIK 105 <10 6173 151 652
E4
12/22 MV-CHIK 105 <10 97 386 228
Los resultados presentados en la Tabla 6 muestran que todos los monos desarrollaron títulos altos de anticuerpos que neutralizaron CHIKV. La dosis más alta fue más eficaz que la dosis más baja. Como se muestra en la figura 18 (día 90, el día del refuerzo frente al día 111, 21 días después del refuerzo), en la mayoría de los animales, el refuerzo fue eficaz. Estos resultados demuestran la inmunogenicidad de la vacuna candidata de MV-CHIKV en primates no humanos.
CONCLUSIÓN GENERAL
Los inventores han generado un virus recombinante MV-CHIK que expresa de manera estable las proteínas estructurales completas CE3E26KE1 de la cepa 06.49 de CHIKV. Las células Vero infectadas por este virus recombinante expresaban altos niveles de proteínas CHIKV y secretaban partículas similares a virus (VLP) de alta densidad. La cinética de crecimiento del virus recombinante se retrasó ligeramente pero produjo títulos similares a los del vector vacío del MV. Evaluada en ratones CD46-IFNAR susceptibles a infección por MV, esta vacuna candidata indujo altos niveles de anticuerpos neutralizantes contra CHIKV dependiendo de la dosis y del número de administraciones (PRNT50 = 450-4050; PRNT90 = 150-450). Todos los ratones inmunizados quedaban reiteradamente protegidos, incluso después de una sola administración, demostrando la fuerte capacidad inmunitaria de esta vacuna candidata. La transferencia pasiva de sueros inmunes en animales sin tratamiento previo otorgó protección a exposición letal, incluso en estos ratones sumamente susceptibles. Por último, los inventores demostraron que la presencia de inmunidad preexistente al vector del MV en ratones CD46-IFNAR, no impedía la inducción de inmunidad protectora después de la inmunización con la vacuna candidata del MV-CE3E26KE1. A la vista de los resultados, el vector recombinante así obtenido merece evaluarse en un modelo de infección fiable de primates no humanos.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE THEMIS BIOSCIENCE GMBH
<120> VIRUS RECOMBINANTE DEL SARAMPIÓN QUE EXPRESA POLIPÉPTIDOS DEL VIRUS
CHIKUNGUNYA Y SUS APLICACIONES
<130> B09995A - AD/DP/AM
<140> PCT/ EP XXXXXXX
<141> 2013-09-26
<150> EP 12306176.4
<151> 2012-09-27
10
<160> 33
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211>18967 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> pTM-MVSchw (GenBank: FW366202.1) <400> 1

Claims (19)

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    1. Una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C- E3-E2-6K-E1 de un virus de Chikungunya (CHIKV), estando dicho polinucleótido unido operativamente, en particular, clonado en una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN (+) antigenómica infecciosa, de longitud completa de un virus del sarampión (VS).
  2. 2. La construcción de ácido nucleico según la reivindicación 1 nucleico cumple con la regla de 6 del genoma de sarampión.
  3. 3. La construcción de ácido nucleico según la reivindicación 1 genes que abarcan de 5' a 3':

    (a) un polinucleótido que codifica la proteína N de un MV,

    (b) un polinucleótido que codifica la proteína P de un MV,
    (c) el polinucleótido que codifica las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV,

    (d) un polinucleótido que codifica la proteína M de un MV,

    (e) un polinucleótido que codifica la proteína F de un MV,
    (f) un polinucleótido que codifica la proteína H de un MV, y
    (g) un polinucleótido que codifica la proteína L de un MV,
    estando dichos polinucleótidos unidos operativamente en la construcción de ácido nucleico y bajo el control de secuencias reguladoras de transcripción y replicación vírica, tales como secuencias líder y terminadoras del MV.
  4. 4. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada
    porque dicho virus del sarampión es una cepa de virus atenuada, seleccionándose dicha cepa en particular del
    grupo de la cepa Schwarz, la cepa Zagreb, la cepa AIK-C y la cepa Moraten.
  5. 5. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho polinucleótido que codifica las proteína estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV se ha optimizado para el uso de codones en macacos o se ha optimizado para el uso de codones en seres humanos.
  6. 6. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada
    porque se han delecionado secuencias de tipo edición del sarampión de dicho polinucleótido que codifica las
    proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 del CHIKV.
  7. 7. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dicho virus de Chikungunya proviene de la cepa denominada cepa 06-49.
  8. 8. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el ectodominio de la proteína de envoltura E2 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11, 13, 15.
  9. 9. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dichas proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 son como se define en SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 28.
  10. 10. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dicha construcción de ácido nucleico comprende una secuencia como se define en SEQ ID NO: 20, 27 y 31.
  11. 11. Un plásmido vector de transferencia que comprende una construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
  12. 12. Células caracterizadas porque dichas células se transforman con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un plásmido vector de transferencia de acuerdo con la reivindicación 11, en particular células eucariotas, tales como células de ave, en particular células CEF, células de mamífero o células de levadura.
  13. 13. Partículas de virus de MV-CHIK recombinantes, infecciosas, replicantes, que comprenden en su genoma una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
  14. 14. Las partículas de virus de MV-CHIK recombinantes, infecciosas, replicantes de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizadas porque dichas partículas de virus comprenden en su genoma una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia como se define en SEQ ID NO: 27 o 31.
    , caracterizada porque dicha construcción de ácido o 2, que comprende unidades de transcripción de
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  15. 15. Una composición o un conjunto de ingredientes activos que comprende las partículas de virus de MV-CHIK recombinantes, infecciosas, replicantes de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en asociación con las VLP CHIKV- C-E3-E2-6K-E1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  16. 16. La composición o el conjunto de ingredientes activos de acuerdo con la reivindicación 15, para su uso en suscitar una respuesta inmunoprotectora contra el virus CHIK suscitando anticuerpos dirigidos contra dicha(s) proteína(s) CHIKV y/o una respuesta inmunitaria celular, en un hospedador, en particular, un hospedador humano que lo necesite.
  17. 17. Las partículas de virus de MV-CHIK recombinantes, infecciosas, replicantes de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en asociación con las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1, o la composición o el conjunto de ingredientes activos de acuerdo con la reivindicación 15, para su uso en un sujeto en la prevención de una infección por el por virus de Chikungunya, en particular, en un ser humano.
  18. 18. Un procedimiento para rescatar un virus del sarampión (MV) recombinante que expresa las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de un virus de Chikungunya (CHIKV), en particular, partículas similares a virus (VLP) CHIKV-C-E3-E2-6K-E1, que comprende las etapas de:
    1) transfectar conjuntamente células auxiliares, en particular, células auxiliares HEK293, que expresan de manera estable ARN polimerasa de T7, y proteínas N y P del sarampión con (i) un plásmido vector de transferencia de acuerdo con la reivindicación 11 y con (ii) un vector, especialmente un plásmido, que codifica la L polimerasa del MV;
    2) cultivar dichas células auxiliares cotransfectadas en condiciones que permitan la producción del virus recombinante MV-CHIKV;
    3) propagar el virus recombinante así producido cultivando conjuntamente dichas células auxiliares de la etapa 2) con células, tales como células Vero, que permitan dicha propagación;
    4) recuperar el virus recombinante MV-CHIKV replicante y las proteínas estructurales C-E3-E2-6K-E1 de CHIKV, en particular, las VLP CHIKV-C-E3-E2-6K-E1.
  19. 19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el plásmido vector de transferencia comprende una secuencia como se define en SEQ ID NO: 27 o 31.
    FIGURA 1A
    CO
    CD
    imagen1
    5’UTR
    Unión E3 6K
    imagen2
    3’UTR
    AAAAAAM
    imagen3
    imagen4
    Dominio II de E1
    de E1 Membrana
    (Voss et al; Nature 2010)
    3 construcciones:
    1 - MV-CE3E26KE1
    2 - MV-sE2
    3 - MV-sE2Astem
    Dominio C de E2
    Suele de furina
    Dominio B de E2
    Dominio A de E2
    lazo (i de E2
    antígenos CHIKV
    imagen5
    imagen6
    ADNc de MVSchw
    Re-infección
    Células Vero infectadas
    FIGURA 1 B
    Rescate de MV recombinante que expresa VLP de CHIKV
    CHIKV-CE3E26kE 1
    X ó ADNc de MVSchw- L polimerasa
    Cotransfeccion
    Célula HEK293 auxiliar
    que expresa de manera
    estable ARN pal de T7 y
    proteínas N/P de
    sarampión
    16h/37 °C
    2rv42.5 “C
    40h/37 °C
    t VLP de CHIKV
    MV recomblnante
    Cocultivo en células Vero (2-7 días)
    imagen7
    FIGURA 2
    Células SN
    imagen8
    'V
    A-
    191
    j?
    Mab Ant¡-E2 (3E4) 1/1000
    SN cargado en un amortiguador de sacarosa al 20 %
    MV-CE3E26KE1 MV
    imagen9
    Mab Anti-cápsida 1/2000
    FIGURA 3
    TCiDsWkril
    imagen10
    imagen11
    FIGURA 4
    FIGURA 5
    imagen12
    1,E>€8 1^4)7 l,£+06 l.Et-UÉ UHM I,t+Ü3 E.É+'M I,M1 L£*íü
    12 24 SÉ 4¡8 60 11 84
    Dias desde la ¡afección
    *"**MV-s£2
    MV-sE 2 A st£tn '*..'MV-CE3EZBKÉI
    **«“*M!V
    FIGURA 6
    Porcentaje de ratones supervivientes
    imagen13
    144
    Porcentaje de ratones supervivientes
    imagen14
    <
    \
    MV-CHtKV
    120
    imagen15
    O
    c
    73
    >
    co
    13
    <ñ
    co
    <
    ó 6 m
    ¡i i ifo CaJ
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    ro
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    tn
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    Cfl
    O
    "a
    o
    — ^ g ^ b c O» ^
    ! T3
    Xfc
    CG
    imagen16
    imagen17
    07; Ob;
    5/5/11
    2a inmunización
    inmunización
    7/07/11
    MV-CE3E26KE 1
    MV CE3E20KE'
    Exposición a 100 UFP de CHKv
    MV-Scnw
    Mv-Schw
    2/5/11
    5/06/11
    04/07/11
    MV-CE3E26KE1
    Grupo 1: 6 ratones 103 TCID/ratón
    Grupo 2: 6 ratones 104 TCID/ratón
    Grupo 3: 6 ratones 10= TCID/ratón
    MV-Schw :
    Grupo 4: 6 ratones 105 TCID/ratón
    FIGURA 11
    J
    ■..MV-CHIKV lüe>3
    'MV-CH KV
    MV-CHIKV
    MV IDeS
    M 4 M. n A 5a Ü A
    Tiempo desde la exposion (d)
    FIGURA 12
    Porcentaje de ratones supervivientes
    imagen18
    imagen19
    Días desde la exposición
    —►-MV-CHIKV
    ™gp' MV
    de CHIKV
    FIGURA 14
    SFC/ millón de esplenocitos
    imagen20
    FIGURA 15
    imagen21
    21/07/11
    22/08/11
    21/04/11
    21/09 11
    CE3E26KE1 MV-CE3E26KE1 Exp0SlCIÓn a 100 UFP de CHKV
    Fv'V
    MV-5ChW
    3 meses
    20/04/11
    20/07/11
    19/08/11
    19/09/11
    FIGURA 16
    ICO
    MV-CHÍKV
    P/V + MV-CHlKV
    MV
    Días desde la exposición
    FIGURA 17
    Título según ensayo PRNT
    imagen22
    ■ Día 90 □ Día 111
    1O4TCID50 1O5TCID50
    FIGURA 18
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