KR20200090186A - 비-구조 단백질들을 포함하는 지카 바이러스 키메라 폴리에피토프 및 이의 면역원성 조성물로의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비-구조 단백질들을 포함하는 지카 바이러스(ZIKV) 키메라 폴리에피토프 및 이의 면역원성 조성물에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 수단, 특히 상기 키메라 폴리에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드들, 벡터들 및 세포들을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 대상체에서의 ZIKV 감염의 예방에서의 사용을 위한 또는 인간 대상체에서의 ZIKV 및 뎅기열 바이러스(DENV) 감염의 예방에서의 사용을 위한 상기 폴리에피토프, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포 중의 적어도 하나를 포함하는 조성물 또는 백신에 관한 것이다.

Description

비-구조 단백질들을 포함하는 지카 바이러스 키메라 폴리에피토프 및 이의 면역원성 조성물로의 용도
본 발명은 비-구조 단백질들을 포함하는 지카 바이러스(ZIKV) 키메라 폴리에피토프 및 이의 면역원성 조성물에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 수단, 특히 상기 키메라 폴리에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드들, 벡터들 및 세포들을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 대상체에서의 ZIKV 감염의 예방에서의 사용을 위한 또는 인간 대상체에서의 ZIKV 및 뎅기열 바이러스(DENV) 감염의 예방에서의 사용을 위한 상기 폴리에피토프, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포 중의 적어도 하나를 포함하는 조성물 또는 백신에 관한 것이다.
지카 바이러스는 숲모기 종(Aedes species) 모기들에 의해 전파되는 플라비바이러스(flavivirus)이다. 이는 황열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기열 바이러스(DENV) 및 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)와 밀접하게 연관되는 단일의, 양성-가닥 RNA 바이러스이다(Kuno G et al., 1998, J Virol. 72(1):73-83). 1947년에 우간다의 지카 숲에서 처음 단리된(Dick GW et al., 1952, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 46(5):509-520), 이 바이러스는 미크로네시아 연방(Federated States of Micronesia) 야프 섬(Yap Island)에서 처음으로 폭발적인 발발을 야기하였다(Duffy MR, et al. 2009, The New England journal of medicine 360(24):2536-2543). 후속하여 2013 내지 2014년에 프랑스령 폴리네시아(French Polynesia) 및 다른 남태평양 군도(South Pacific Islands)에서 그리고 보다 더 최근에는 아메리카에서 보다 더 많은 수의 경우들을 수반하면서 발발하였다(Cao-Lormeau VM, et al. 2014, Emerging infectious diseases 20(6):1085-1086; Campos GS, et al. 2015, Emerging infectious diseases 21(10):1885-1886; Dupont-Rouzeyrol M, et al. 2015, Emerging infectious diseases 21(2):381-382; Zanluca C, et al. 2015, Mem Inst Oswaldo Cruz 110(4):569-572; Pacheco O, et al. 2016, Zika Virus Disease in Colombia - Preliminary Report. The New England journal of medicine). 비록 초기에는 단지 온건한, 자기-제한적 질환(self-limiting disease)을 야기하는 것으로 여겨졌으나, 겨우 최근에야 프랑스령 폴리네시아 및 브라질에서의 2013년 및 2015년 발발들에 대하여 ZIKV와 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)과 같은 신경학적 합병증 또는 선천성 기형(congenital malformations) 간의 인과관계가 구축되었다(Oehler E, et al. 2014 Euro Surveill 19(9); Cao-Lormeau VM, et al. 2016, Lancet 387(10027):1531-1539; Cauchemez S, et al. 2016, Lancet 387 (10033): 2125-2132; Soares de Araujo JS, et al. 2016, Bull World Health Organ 94(11):835-840).
아메리카에서의 이의 최근의 재-출현을 설명할 수 있는(Enfissi A et al., Lancet 387(10015):227-228), NS1에서의 자발 돌연변이(spontaneous mutation)로 인한 ZIKV의 아시아 계통(Asian lineage)의 향상된 감염력에 더하여(Liu Y, et al. 2017, Nature 545 (7655): 482-486), 오늘날 가장 중요한 염려들 중의 하나는 ZIKV가 유행하고 있는 지역들에서의 높은 수준의 DENV 혈청학적 유병율(seroprevalence)과 연관된다(Katzelnick LC, et al., The Lancet. Infectious diseases 17(3):e88-e100). 사실, 최근의 연구들은 항-DENV 기존 항체들(anti-DENV pre-existing antibodies)이 ZIKV 감염을 향상시키고 질환 중증도를 증가시킬 수 있다는 것을 밝혔다(Dejnirattisai W, et al. 2016 Nat Immunol 17(9):1102-1108; Stettler K, et al. 2016 Science 353(6301):823-826; Paul LM, et al. 2016 Dengue Virus Antibodies Enhance Zika Virus Infection. BioRxiv ; Priyamvada L, et al. 2016, Proc Natl Acad Sci U S A 113(28):7852-7857; Bardina SV, et al. 2017, Science 356(6334):175-180). 이들 제약조건들 및 ZIKV 감염에 대한 적절한 치료의 결여의 조건 하에서, 이러한 감염성 질환에 대한 백신을 개발할 것이 시급히 요구되고 있다.
비록 DENV 또는 ZIKV의 E 단백질(E protein)에 대한 항체들이 고도로 교차-반응성인 것으로 나타났으나, 표적화된 펩티드들에 따라서는 T 세포들이 교차-반응성일 수 있다. 사실 이들 바이러스들 중의 하나에 대하여 면역성이 있는 인간 공여자들(human donors)에서 DENV와 ZIKV 간에 낮은 정도의 CD4 T-세포 교차-반응성이 관찰되었으나(Stettler K, et al. 2016, Science 353(6301):823-826), 반면에 ZIKV로의 도전 후의 DENV-면역 마우스에서는 DENV/ZIKV 교차-반응성 및 보호 CD8 T 세포들(protective CD8 T cells)이 확인되었다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036). 캡시드 및 엔벨로프 구조 단백질들(capsid and envelop structural proteins) 및 각각 DENV-특이적 CD4 및 CD8 T 세포들의 주 표적들을 나타내는 비-구조 단백질들 NS3 및 NS5에 대한 DENV와 ZIKV 간의 시퀀스 동일성 그리고 DENV-특이적 T 세포들의 보호 역할을 고려하면(Weiskopf D et al., Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110(22):E2046-2053; Weiskopf D et al., Proc Natl Acad Sci USA 2015, 112(31):E4256-4263, Rivino L & Lim MQ, 2016, Immunology 150(2):146-154), 현재 ZIKV에 대한 신규하고도 보다 더 효과적인 백신들을 디자인하기 위한 T-세포 에피토프의 매핑(mapping)을 위한 노력들이 이루어지고 있다. ZIKV 프로테옴의 서로 다른 HLA 클래스 I(HLA class I) 또는 클래스 II 대립형질들에 결합할 수 있는 잠재적 에피토프들을 모델링하고 그리고 인간 HLA-B*0702 및 HLA-A*0101 분자들을 발현하는 유전자 이식 마우스들(transgenic mice)의 생체 외(ex vivo) T-세포 반응을 분석하여 T세포 항원들이 예측되었다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036, 23-25). 놀랍게도, ZIKV 감염에 대한 보호를 매개할 수 있는 DENV-면역 마우스에서 DENV/ZIKV 교차 활성 T 세포들이 동정되었다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036, 23-25). 이러한 결과는 마우스에서 ZIKV에 대한 면역 보호에 있어서 CD8+T 세포들에 대한 보호 역할을 입증하는 관련 연구들과 일치한다(Elong Ngono A, et al. 2017, Cell host & microbe 21(1):35-46). 그러나, 이러한 연구들은 마우스의 ZIKV 감염에 대한 CD8+ T 세포들에 대한 보호 역할을 입증하였고, 그리고 ZIKV에서 파생된 여러 펩티드들이 DENV-유래와 DENV-사전-노출된 공여자들(DENV-pre-exposed donors)에서 확인되었지만(Grifoni A, et al. 2017, J. Virol. DOI: 10.1128/JVI. 01469-17, posted online on 4 October 2017), ZIKV에 고유하거나 DENV와 공유되는 인간 T-세포 에피토프들의 정확한 동정은 여전히 불완전하다. 본 발명에서, 본 발명자들은 오로지 ZIKV 감염만 또는 DENV와 ZIKV 둘 모두의 감염의 이력이 있는 혈액 공여자들로부터 이들 에피토프들을 동정하였다.
이전에 ZIKV 감염이 있었던 콜롬비아인 혈액 공여자들의 PBMCs(말초혈액 단핵세포들)을 이용하여, 본 발명자들은 효소-결합 면역흡착점(ELISPOT: enzyme-linked immunosorbent spot) 검사에 의해 ZIKV 단백질체학적 시퀀스(ZIKV proteomic sequence) 염기서열 전체를 피복하는 펩티드들에 대한 생체 외 IFNγ(감마 인터페론) 반응들을 정량화하여 ZIKV T-세포 에피토프들의 분포의 제1 지도(map)를 수립하였다. 이들 펩티드들에 대한 T-세포 반응들(CD4 및/또는 CD8 T 세포들로 매개된)의 크기를 측정하면 특정 HLA 대립형질들을 수반하는 공여자들에서 강한 반응들을 유도하는 면역우세 에피토프들(immunodominant epitopes)을 동정할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 구조 단백질 C 및 E들 그리고 비-구조(NS) 단백질 NS1, NS3, NS4B 및 NS5들, 특히 비-구조(NS) 단백질 NS1, NS3 및 NS5들이 강한 T-세포 반응들을 유도하는 면역우세 에피토프들의 대부분을 포함하고 있다는 것을 보여주었다. DENV 감염의 이력이 있는 공여자들에서, 가장 강한 T-세포 반응들이 DENV의 4가지 혈청형들(serotypes)과 높은 수준의 아미노산 동일성을 갖는 펩티드로 유도되었으며, 일부가 앞서 기술된 DENV CD8+ T-세포 에피토프들과 일치하여 교차-반응성 T-세포들의 활성화를 암시하고 있다. 본 발명자들의 이러한 결과들은 ZIKV에 대한 T-세포 반응에 대한 새로운 통찰력을 제공하였고, 최초로 면역성이 있는 개인들에서 ZIKV 및 DENV 백신 후보들로 사용될 수 있는 T-세포 에피토프들을 확인하였다.
따라서 본 발명은
(i) 적어도 하기 (a) 및 (b)의 T-세포 에피토프들 또는 (ii) 적어도 하기 (a) 및 (c)의 T-세포 에피토프들 또는 (iii) 적어도 하기 (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들:
(a) 시퀀스 동정 번호(SEQ ID NOs): 10-12, 14, 15, 17-19, 23, 24 및 78-83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 지카 바이러스(ZIKV)의 비-구조(NS) NS1 단백질의 T-세포 에피토프,
(b) 시퀀스 동정 번호: 28, 29, 31, 33-35, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프,
(c) 시퀀스 동정 번호: 46, 48-50, 52-55, 57-60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 및 86-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프
또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들(amino acid residues)의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 (a), (b) 또는 (c)의 T-세포 에피토프의 원래 아미노산 시퀀스와 다르고 그리고 상기 원래 시퀀스와 적어도 90% 시퀀스 동일성 또는 95% 이상 시퀀스 동일성 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖는 이들의 T-세포 에피토프 변종(variant)을 포함하는, 키메라 폴리에피토프에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는
(i) 적어도 하기 (a) 및 (b)의 T-세포 에피토프들 또는 (ii) 적어도 하기 (a) 및 (c)의 T-세포 에피토프들 또는 (iii) 적어도 하기 (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들:
(a) 시퀀스 동정 번호: 10-12, 14, 15, 17-19, 23, 24 및 78-83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS1 단백질의 T-세포 에피토프,
(b) 시퀀스 동정 번호: 28, 31, 33-35, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프,
(c) 시퀀스 동정 번호: 46, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 및 86, 87, 89-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프,
또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 점 돌연변이에 의해 (a), (b) 또는 (c)의 T-세포 에피토프의 원래 아미노산 시퀀스와 다르고 그리고 상기 원래 시퀀스와 적어도 90% 시퀀스 동일성 또는 95% 이상 시퀀스 동일성 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖는 이들의 T-세포 에피토프 변종을 포함한다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "폴리에피토프(polyepitope)"는 키메라 또는 재조합 분자, 특히 전장(full-length) 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한 ZIKV 단백질들에서, 특히 ZIKV의 전장 또는 천연의 NS1, NS3 또는 NS5 단백질들을 제외한 ZIKV의 비-구조 단백질 NS1, NS3 또는 NS5들 중에서 동정된 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 그리고 보다 바람직하게는 10개 또는 10개 이상 또는 15개 또는 15개 이상의 T-세포 에피토프들을 갖는 키메라 또는 재조합 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, "에피토프"는 항원 결정기(antigenic determinant), 즉 면역체계(immune system)의 세포들(면역세포들)에 의해 인식되는 펩티드 사이트(peptide site)와 특히 면역 반응을 유도하는 데 필요한 사이트인 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 용어 에피토프는 연속 아미노산들(9 내지 15개, 특히, 8개, 9개, 10개 또는 15개, 보다 바람직하게는 9개 또는 15개)이 면역세포들에 의해 인식되는 선형 에피토프 및 면역세포들이 적절한 배열(configuration) 또는 배좌(conformation)를 채택하는 정도까지 아미노산들을 인식하는 배좌적 에피토프(conformational epitope) 둘 다를 포함한다. 따라서 일부 에피토프들에서, 배좌(3차원 구조)가 아미노산 시퀀스(일차 구조) 만큼 중요하다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, "T-세포 에피토프"는 ZIKV 또는 ZIKV와 DENV에 대한, 특히 DENV1, DENV2, DENV3, DENV4에 대한 또는 복수, 특히 모든 DENV 혈청형들에 대한 T 세포 면역반응의 유도와 관련된 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 특히, 표적 세포들이 CD8+ T 림프구들인 것과 같은 에피토프들과 같은 클래스 I MHC(Major Histocompatibility Complex ; 주조직 적합 복합체)와 관련하여 상기 T-세포 에피토프들이 인식되거나 또는 표적 세포들이 CD4+ T 림프구들인 것과 같은 클래스 II MHC 분자들과 관련하여 T 에피토프들이 인식된다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "이의 변종(variant thereof)"은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들, 특히 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산 잔기들의 점 돌연변이에 의하여 (a), (b) 또는 (c)의 T-세포 에피토프의 원래 아미노산 시퀀스와 상이하고 그리고 상기 원래 시퀀스와 적어도 90% 시퀀스 동일성 또는 95% 이상 시퀀스 동일성 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖는 T-세포 에피토프를 의미한다. T-세포 에피토프의 변종을 정의하는 돌연변이는 특히 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산 잔기(들)의 점 결실(들)을 포함하여 결실(들)일 수 있거나 또는 치환(들), 특히 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산 잔기(들)의 보존적 치환(들)일 수 있다. T-세포 에피토프의 상기 변종은 (a), (b) 또는 (c)의 T-세포 에피토프의 원래 아미노산 시퀀스와 동일한 길이를 갖는 아미노산 시퀀스를 가질 수 있다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "키메라 폴리에피토프(chimeric polyepitope)"는 서로 다른 ZIKV 단백질들, 특히 서로 다른 ZIKV NS 단백질들, 바람직하게는 NS1, NS3 및 NS5 단백질들 중에서 선택되는 서로 다른 ZIKV NS 단백질들의 아-부분들(sub-portions) 또는 단편들을 포함하는 임의의 폴리에피토프 폴리펩티드를 의미한다. 상기 키메라 폴리에피토프는 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 포함하지 않고, 특히 전장 또는 천연의 ZIKV NS 단백질들을 포함하지 않고, 바람직하게는 NS1, NS3 및 NS5 단백질들 중에서 선택되는 전장 또는 천연의 ZIKV NS 단백질들을 포함하지 않는다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 30개 이하의 ZIKV T-세포 에피토프들, 특히 25개 이하의 ZIKV T-세포 에피토프들, 바람직하게는 20개 이하의 ZIKV T-세포 에피토프들을 포함한다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 전체로 취하여진 ZIKV 단백질의 T-세포 에피토프들의 아미노산 시퀀스들은 다른 ZIKV 단백질의 임의의 다른 에피토프들, 특히 다른 ZIKV 단백질의 임의의 다른 ZIKV T-세포 에피토프들과 상이하다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, ZIKV T-세포 에피토프들의 아미노산 시퀀스들은 다른 에피토프들, 특히 다른 ZIKV T-세포 에피토프들의 아미노산 시퀀스들과는 하나 또는 그 이상의 아미노산들로 다를 수 있고/있거나 중첩하는 시퀀스들(overlapping sequences)을 가질 수 있고, 따라서 일부 아미노산들을 공유할 수 있다.
본 발명의 키메라 폴리에피토프는 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, 적어도 ZIKV의 NS1 및 NS3 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 적어도 ZIKV의 NS1 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 적어도 ZIKV의 NS3 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 키메라 폴리에피토프는 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, 적어도 ZIKV의 NS1 및 NS3 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 적어도 ZIKV의 NS1 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 적어도 ZIKV의 NS3 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, 적어도 ZIKV의 NS1, NS3 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, 적어도 ZIKV의 NS1, NS3 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들로 이루어진다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 동일한 ZIKV 단백질, 특히 ZIKV의 NS 단백질, 바람직하게는 ZIKV의 NS1, NS3 또는 NS5 단백질들로부터의 서로 다른 폴리에피토프들 또는 심지어 서로 다른 ZIKV 단백질들, 특히 ZIKV의 NS 단백질들, 바람직하게는 ZIKV의 NS1, NS3 및 NS5 단백질들로부터의 동일한 폴리에피토프들로부터의 아-부분들 또는 단편들을 포함한다. 본 발명의 폴리에피토프는 폴리에피토프 변종을 포함한다. 따라서 본 명세서에서 기술되는 각 정의 또는 구현예는 달리 기술적으로 무관하지 않는 한 변종 폴리에피토프에 적용된다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "단편(fragment)"은 단편이 유래하는 단백질, 바람직하게는 NS 단백질(즉, NS1, NS3 또는 NS5 단백질) 보다 더 길이가 짧은, ZIKV 단백질의, 바람직하게는 ZIKV의 NS 단백질(즉 NS1, NS3 또는 NS5 단백질)의 조각(a part) 또는 일부(a portion)를 의미한다. 각 단편은 면역 반응, 특히 ZIKV 감염에 대한 또는 ZIKV 및 DENV 감염들에 대한 면역 T-세포 반응을 유도하기에 적절한 복수의 에피토프를 포함할 수 있다. 각 단편은 연속 아미노산들의 시퀀스에 대응한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리펩티드는 적어도 상기 정의된 바와 같은 (a), (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들 또는 이들의 T-세포 에피토프 변종을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 (i) 상기 정의된 바와 같은 (a) 및 (b)의 T-세포 에피토프들 또는 (ii) 상기 정의된 바와 같은 (a) 및 (c)의 T-세포 에피토프들 또는 (iii) 상기 정의된 바와 같은 (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들 또는 (iv) 상기 정의된 바와 같은 (a) (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들 또는 이들의 T-세포 변종으로 이루어진다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, (a)의 T-세포 에피토프는 시퀀스 동정 번호: 17, 23 및 78-83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, (b)의 T-세포 에피토프는 시퀀스 동정 번호: 31, 33, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, 그리고 (c)의 T-세포 에피토프는 시퀀스 동정 번호: 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 및 86-91, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 46, 52, 57, 62, 64, 67, 86, 87 및 89-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 T-세포 에피토프 시퀀스들 각각은 15 아미노산 잔기들을 포함하며, 즉 개별적으로 그리고/또는 집단적으로 T 세포 면역 반응을 유도하는 15-량체(15-mer) 에피토프이다. 이들 15-량체 에피토프들 각각은 개별적으로 그리고/또는 집단적으로 또한 T 세포 면역 반응을 유도하는 적어도 9-량체 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 시퀀스 동정 번호: 17의 ZIKV의 NS1 단백질(NS1163-177) 중의 15-량체 에피토프의 시퀀스(FHTSVWLKVREDYSL)는 시퀀스 동정 번호 18의 9-량체 에피토프의 시퀀스(VWLKVREDY) 및 시퀀스 동정 번호: 19의 9-량체 에피토프의 시퀀스(WLKVREDYS)를 포함한다. 이는 상기 언급된 15-량체 에피토프들이 적어도 9-량체 에피토프를 포함하나 그러나 또한 9-량체 또는 그 이상의 다른 에피토프들을 포함할 수도 있다는 것을 암시한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, (a)의 T-세포 에피토프는 시퀀스 동정 번호: 11, 12, 17-19, 23, 24, 78, 80 및 83들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, (b)의 T-세포 에피토프는 시퀀스 동정 번호: 28, 31, 33, 34, 84 및 85들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, 그리고 (c)의 T-세포 에피토프는 시퀀스 동정 번호: 48-50, 52-55, 57, 58, 60, 62, 67, 88, 89 및 90, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 52-55, 57, 60, 62, 67, 89 및 90들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는:
(i) 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 4-6 및 75들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 캡시드(C) 단백질의 T-세포 에피토프,
(ii) 시퀀스 동정 번호: 7, 76 및 77들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 E 단백질의 T-세포 에피토프,
(iii) 시퀀스 동정 번호: 25의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS2B 단백질의 T-세포 에피토프,
(iv) 시퀀스 동정 번호: 36의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4A 단백질의 T-세포 에피토프 및
(v) 시퀀스 동정 번호: 40-43으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ZIKV 단백질의 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개 또는 4개, 보다 바람직하게는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 서로 다른 ZIKV 단백질들의 T-세포 에피토프들을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 4-6 및 75들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 C 단백질의 T-세포 에피토프 및 시퀀스 동정 번호: 40-43들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스들을 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프를 추가로 포함한다.
따라서, 키메라 폴리에피토프는 상기 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, 적어도 ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 특히, 키메라 폴리에피토프는 적어도 하기 T-세포 에피토프들:
(i) 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 4-6 및 75, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 1, 4 및 75들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 C 단백질의 T-세포 에피토프,
(ii) 시퀀스 동정 번호: 10-12, 14, 15, 17-19, 23, 24 및 78-83, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 17, 23 및 78-83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS1 단백질의 T-세포 에피토프,
(iii) 시퀀스 동정 번호: 28, 29, 31, 33-35, 84 및 85, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 28, 31, 33-35, 84 및 85, 보다 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 31, 33, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프,
(iv) 시퀀스 동정 번호: 40-43들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프,
(v) 시퀀스 동정 번호: 46, 48-50, 52-55, 57-60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 및 86-91, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 46, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 및 86, 87 및 89-91로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는, 또는 시퀀스 동정 번호: 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 및 86-91, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 46, 52, 57, 62, 64, 67, 86, 87 및 89-91로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프,
또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 점 돌연변이에 의해 (i), (ii), (iii), (iv) 또는 (v)의 T-세포 에피토프의 원래 아미노산 시퀀스와 다르고 그리고 상기 원래 시퀀스와 적어도 90% 시퀀스 동일성 또는 95% 이상 시퀀스 동일성 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖는 이들의 T-세포 에피토프 변종,
을 포함한다:
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 언급된 키메라 폴리에피토프에서:
(i) ZIKV의 C 단백질의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 4, 5, 6 및 75들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고,
(ii) ZIKV의 NS1 단백질의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 11, 12, 17-19, 23, 24, 78, 80 및 83들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고,
(iii) ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 28, 31, 33, 34, 84 및 85들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고,
(iv) ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 40 및 41들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고 그리고
(v) ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 48-50, 52-55, 57, 58, 60, 62, 67, 88, 89 및 90, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 52-55, 57, 60, 62, 67, 89 및 90들의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들로 이루어진다.
상기 언급된 ZIKV의 NS1, NS3 및 NS5 단백질들에 대한 모든 정의들은 ZIKV의 다른 단백질들, 특히 ZIKV의 C, E, NS1, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 단백질들에도 또한 적용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 (i) 인간 대상체에서 ZIKV 감염의 예방에 사용하기 위한 또는 (ii) 인간 대상체에서 ZIKV 및 뎅기열 바이러스(DENV) 감염들의 예방에 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "예방(prevention)"은 1차 예방, 2차 예방 및 3차 예방을 의미한다. ZIKV 감염 또는 ZIKV 및 DENV 감염들의 예방은 상기 감염(들) 및 연관된 위험 인자들을 최소화하는 것, 즉 차단하거나 지연시키는 것이다. 특히, 상기 감염(들)은 감염이 발생되거나 초기 단계에서 동정되기 이전에 예방될 수 있어서 상기 감염(들)의 증후군들이 감소될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 폴리에피토프가 인간 대상체에서 ZIKV 감염의 예방에 사용되는 경우, T-세포 에피토프들은 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 5, 10, 11, 19, 27, 31, 40-43, 46, 72, 73, 75, 78-80, 82, 84, 85, 87 및 91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV-특이적 에피토프들이다.
본 발명의 다른 보다 바람직한 구현예에 있어서, 폴리에피토프가 인간 대상체에서 ZIKV 및 DENV 감염들의 예방에 사용되는 경우, T-세포 에피토프들은 시퀀스 동정 번호: 1, 5, 6, 12, 14, 15, 17-19, 23, 24, 27, 28, 33-35, 40, 41, 46, 48-50, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73, 84, 85 및 86-91, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 1, 5, 6, 12, 14, 15, 17-19, 23, 24, 27, 28, 33-35, 40, 41, 46, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73, 84, 85, 86, 87 및 89-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV-DENV 교차-반응성 에피토프들이다.
시퀀스 동정 번호: 1, 5, 19, 27, 40, 41, 46, 72, 73, 84, 85, 87 및 91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 T-세포 에피토프들이 ZIKV 공여자들에서 그리고 DENV/ZIKV 공여자들에서 T 세포 면역 반응 둘 다를 유도할 수 있다는 것에 주목해야 한다.
ZIKV T-세포 에피토프, 특히 ZIKV-특이적 T-세포 에피토프들 및/또는 ZIKV-DENV 교차-반응성 T-세포 에피토프들의 불완전한 목록이 하기 표 2 및 표 3에 제공되었다. 상기 ZIKV T-세포 에피토프들은 시퀀스 동정 번호: 1-91들로 정의된 아미노산 시퀀스들을 포함한다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 인간 백혈구 항원-제한 에피토프들(human leukocyte antigen(HLA)-restricted epitopes)을 포함한다. 표현 "HLA-제한(HLA-restricted)"은 이러한 유형의 HLA 분자에 대한 친화력을 갖도록 하는 특정한 에피토프의 능력을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 HLA 분자들은 클래스 I 분자들(HLA-A, B 또는 C로 지정됨) 또는 클래스 II 분자들(DRB로 지정됨)을 포함한다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 (i) ZIKV에 대한 또는 (ii) ZIKV 및 DENV, 특히 DENV 혈청형 1(DENV1), DENV 혈청형 2(DENV2), DENV 혈청형 3(DENV3) 및 DENV 혈청형 4(DENV4)에 대한, 바람직하게는 DENV serotype 1(DENV1)에 대한 인간 백혈구 항원(HLA)-제한 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포 반응을 이끌어낸다.
4가지 뎅기열 바이러스 혈청형들의 기준 게놈들(reference genomes)의 완전 뉴클레오티드 시퀀스들은 Genbank 데이터베이스에서 각각 기탁 번호 NC_001477.1, NC_001474.2, NC_001475.2 및 NC_002640.1들로 접근할 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 상기 DENV는 하기 균주들: GenBank KDH0026A(DENV1), GenBank R0712259(DENV2), GenBank KDH0010A(DENV3) 및 GenBank CRBIP10.4VIMFH4(DENV4)로부터 유래한다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 폴리에피토프는 HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-B*0702, HLA-B*3501, HLA-B*4002, 바람직하게는 HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-B*0702 및 HLA-B*3501와 같은 HLA 제한과의 항원성 반응들을 이끌어낸다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 전장 또는 천연의 ZIKV 단백질들을 제외한, (i) 적어도 ZIKV의 NS1 및 NS3 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 (ii) 적어도 ZIKV의 NS1 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 (iii) 적어도 ZIKV의 NS3 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 (iv) 적어도 ZIKV의 NS1, NS3 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들 또는 (v) 적어도 ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 및 NS5 단백질들의 T-세포 에피토프들은 독특한 폴리펩티드로, 바람직하게는 융합 폴리펩티드로 조립된다. 바람직하게는, 상기 언급된 T-세포 에피토프들은 융합 폴리펩티드로 조립된다.
상기 T-세포 에피토프들은 직접적으로 또는 간접적으로 서로에 대하여 융합될 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 하나의 T-세포 에피토프는 다른 T-세포 에피토프와 "직접적으로" 융합 즉, T-세포 에피토프의 3' 말단이 적어도 2개의 서로 다른 ZIKV 단백질들, 특히 ZIKV C 단백질 및 NS1, NS3, NS4B 및 NS5 중에서 선택되는 ZIKV NS 단백질, 특히 ZIKV의 공통 시퀀스(consensus sequence)에서 유래하는 연속 T-세포 에피토프들로 이루어지는 키메라 폴리에피토프에 대응하는 제2 T-세포 에피토프(등등)의 5' 말단에 직접적으로 결합된다. 다른 구현예에 따르면, 적어도 2개의 T-세포 에피토프들, 특히 적어도 3개의 T-세포 에피토프들의 융합은 "간접적이고" 그에 따라 다른, 특히 인간 T-세포 에피토프들을 형성하지 않는 1 내지 15 아미노산 잔기들을 포함하는 특히 비-NS 아미노산 잔기들 단편(들)의 존재를 포함한다.
본 발명의 키메라 폴리에피토프는 하나 또는 그 이상의 항원성 영역들, 특히 2 내지 15개 항원성 영역들, 바람직하게는 10 내지 15개 항원성 영역들, 보다 더 바람직하게는 11개, 12개, 13개 또는 14개 항원성 영역들을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "항원성 영역(antigenic region)"은 하나 또는 그 이상의 ZIKV T-세포 에피토프들 즉, 일군의 ZIKV T-세포 에피토프들을 포함하는 영역을 의미한다. 상기 ZIKV T-세포 에피토프들의 아미노산 시퀀스들은 다른 ZIKV T-세포 에피토프들의 아미노산 시퀀스들로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들로 상이할 수 있고/있거나 중첩하는 시퀀스들을 갖고 그에 따라 일부 아미노산들을 공유할 수 있다. 결정된 항원 형역에서, 상기 ZIKV T-세포 에피토프들은 ZIKV 단백질이 동일하고, 특히 ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 및 NS5 단백질들이고, 바람직하게는 ZIKV의 NS1, NS3 및 NS5 단백질들이다. 본 발명의 키메라 폴리에피토프는 동일한 ZIKV 단백질의 하나 또는 그 이상의 서로 다른 항원성 영역들을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 두 개의 연속된 항원성 영역들 사이의 연접부의 양측에 위치하는 인접한 아미노산 시퀀스들이 신규한 에피토프들, 특히 신규한 강한 인간 T-세포 에피토프들을 형성하지 않는 지를 점검할 필요가 있다. 따라서, 상기 아미노산 시퀀스들은 15개 이하의 아미노산 잔기들로 이루어지고 그리고 Immuno Epitope Database(IEDB) 분석원(analysis resource)(http://tools.immuneepitope.org/mhci/)에 따라 HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02, HLA-B*35:01 및 HLA-B*40:03 대립형질들에 대한 이들의 낮은 결합 예측에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 2개의 ZIKV 단백질 단편들 간, 특히 ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 및 NS5 단백질들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 ZIKV 단백질 단편들 간 또는 2개의 항원성 영역들 간의 융합에서, 융합 연접부(fusion junction)를 둘러싸는 영역은 15개 이하의 아미노산 잔기들로 이루어지고 그리고 강한 에피토프를 형성하지 않는 펩티드 시퀀스를 포함한다. 따라서 연접 펩티드(junctional peptide)는 제1 ZIKV 단백질의 14개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 1개 아미노산 잔기 또는 제1 ZIKV 단백질의 13개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 2개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 12개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 3개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 11개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 4개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 10개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 5개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 9개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 6개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 8개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 7개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 7개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 8개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 6개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 9개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 5개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 10개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 4개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 11개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 3개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 12개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 2개 아미노산 잔기들 및 제2 ZIKV 단백질의 13개 아미노산 잔기들 또는 제1 ZIKV 단백질의 1개 아미노산 잔기 및 제2 ZIKV 단백질의 14개 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 ZIKV 단백질들은 서로 다르거나 또는 동일할 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 키메라 폴리에피토프는 1500개 이하의 아미노산 잔기들, 특히 1000개 이하의 아미노산 잔기들을 갖는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 키메라 폴리에피토프의 한 예는 962개 아미노산 잔기들로 이루어지는 시퀀스 동정 번호: 99의 아미노산 시퀀스를 갖는다. 상기 키메라 폴리에피토프는 11개 항원성 영역들로 이루어지고, 여기에서 제1 항원성 영역은 아미노산 잔기들 1 내지 93개 까지(시퀀스 동정 번호: 102)이고, 제2 항원성 영역은 아미노산 잔기들 94 내지 206개 까지(시퀀스 동정 번호: 104)이고, 제3 항원성 영역은 아미노산 잔기들 207 내지 270개 까지(시퀀스 동정 번호: 106)이고, 제4 항원성 영역은 아미노산 잔기들 271 내지 286개 까지(시퀀스 동정 번호: 108)이고, 제5 항원성 영역은 아미노산 잔기들 287 내지 331개 까지(시퀀스 동정 번호: 110)이고, 제6 항원성 영역은 아미노산 잔기들 332 내지 473개 까지(시퀀스 동정 번호: 112)이고, 제7 항원성 영역은 아미노산 잔기들 474 내지 547개 까지(시퀀스 동정 번호: 114)이고, 제8 항원성 영역은 아미노산 잔기들 548 내지 766개 까지(시퀀스 동정 번호: 116)이고, 제9 항원성 영역은 아미노산 잔기들 767 내지 821개 까지(시퀀스 동정 번호: 118)이고, 제10 항원성 영역은 아미노산 잔기들 822 내지 839개 까지(시퀀스 동정 번호: 120)이고 그리고 제11 항원성 영역은 아미노산 잔기들 840 내지 962개 까지(시퀀스 동정 번호: 122)이다.
상기 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연의 그리고 최적화된 시퀀스들은 각각 시퀀스 동정 번호: 100 및 101들에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 다른 뉴클레오티드 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 124에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제1 항원성 영역은 ZIKV의 C 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제1 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 103에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제2 항원성 영역은 ZIKV의 NS1 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제2 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 105에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제3 항원성 영역은 ZIKV의 NS1 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제3 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 107에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제4 항원성 영역은 ZIKV의 NS1 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제4 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 109에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제5 항원성 영역은 ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제5 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 111에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제6 항원성 영역은 ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제6 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 113에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제7 항원성 영역은 ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제7 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 115에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제8 항원성 영역은 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제8 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 117에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제9 항원성 영역은 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제9 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 119에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제10 항원성 영역은 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제10 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 121에서 정의되는 바와 같다.
상기 키메라 폴리에피토프의 제11 항원성 영역은 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프들을 포함한다. 상기 제11 항원성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 천연 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 123에서 정의되는 바와 같다.
본 발명은 또한 다른 ZIKV 항원들을 포함하는 뚜렷하게 다른 면역원성 폴리펩티드와 본 발명의 키메라 폴리에피토프와의 결합(association)에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드들의 결합은 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 벡터로부터 상기 키메라 폴리에피토프 및 뚜렷하게 다른 면역원성 폴리펩티드 각각을 인코딩하는 폴리뉴클레오티듣의 발현의 결과로서 달성될 수 있다. 달리, 상기 결합은 상기 키메라 폴리에피토프 및 뚜렷하게 다른 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 구조(amino acid construct)로부터 발생될 수 있다.
본 발명의 키메라 폴리에피토프는 화학적으로 합성되거나 또는 시험관 내(무세포계(cell free system))이나 세포계에서 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 핵산 분자의 발현 이후에 생체 내에서 생산될 수 있다.
시험관 내 세포계에서의 본 발명의 키메라 폴리에피토프의 정확한 발현을 확인하기 위하여, 상기 키메라 폴리에피토프는 그의 3' 말단에 태그 시퀀스(tag sequence)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, ZIKV 단백질, 특히 ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 또는 NS5 단백질, 바람직하게는 ZIKV의 NS1, NS3 또는 NS5 단백질은 특히 ZIKV에 대한 공통 시퀀스를 사용하여 설계된 항원이다. 특히, 상기 항원은 2013년 및 그 이후에 유행하는 것으로 관찰된 바와 같은 지카 바이러스들의 공통 아미노산 시퀀스를 사용하여 설계된다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 상기 ZIKV는 아프리카 계통에서, 특히 아프리카 균주 ArD158084(GenBank: KF383119)나 아프리카 균주 ArD128000(GenBank: KF383117)에서, 또는 아프리카 단리물(African isolate) ARB13565(GenBank: KF268948), 또는 아시아 계통에서, 특히 아시아 균주 FLR(GenBank: KX087102)에서, 또는 아시아 단리물 SSABR1(GenBank: KU707826), 또는 아시아 단리물 Z1106031(GenBank: KU312314), 또는 아시아 단리물 Bahia07(GenBank: KU940228), 또는 아시아 균주 FVM00318/VEN/Maracay/2016(GenBank: KY693680), 또는 아시아 단리물 FLR(GenBank: KU820897)에서 유래한다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, 상기 ZIKV는 2013년 이래 태평양 및 아메리카에서 유행한 균주들을 포함하여 ZIKV 바이러스들의 여러 계통들에 대응한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, ZIKV의 C, NS1, NS3, NS4B 또는 NS5 단백질은 아시아 계통에서, 특히 ZIKV 균주들(GenBank: KX087102, KU707826, KU312314, KU940228, KY693680, KU820897)에서 유래하는 것인 ZIKV의 여러 균주들에서 엄선된 C, NS1, NS3, NS4B 또는 NS5 시퀀스들을 대표하는 공통 아미노산 시퀀스인 아미노산 시퀀스를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다른 ZIKV 항원들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하여 핵산 구조 중에서 본 발명에 따른 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "단리되거나 정제된(isolated or purified)"은 인간에 의해 천연의 상태에서 변형된 분자들 즉, 분자들이 자연에 존재하는 경우, 이들이 초기 환경으로부터 변화되고/되거나 회수된 것을 의미한다. 한 예로서, 자연적으로 발현되는 생물(living organism)의 생물학적 환경에서 자연적으로 존재하고 발견되는 폴리뉴클레오티드는 이러한 정황에서 "단리되지" 않았다. 그러나, 천연의 환경으로부터 분리되고/되거나 클로닝(cloning), 증폭(amplification) 및/또는 화학적 합성에 의해 수득되는 경우 동일한 폴리뉴클레오티드는 본 발명에서 "단리된" 것으로 여겨진다. 더욱이, 형질전환(transformation), 유전자 조작 또는 임의의 다른 재조합법에 의해 유기체 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 심지어 상기 유기체 내에 존재하는 경우에서 조차도 "단리된" 것이다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "인코딩(encoding)"은 핵산 분자가 전사를 위한 프로모터(promoter)를 포함하는 발현 조절 시퀀스들(expression control sequences) 하에 놓여지는 경우, 선택된 세포들 또는 세포주들로의 생성물 발현을 위하여 전사되고 그리고 그곳에서 적절하게 번역되는 핵산 분자들의 능력을 정의한다. 따라서 본 발명에 따른 "폴리뉴클레오티드 인코딩"은 아미노산 시퀀스 내로 전사되는 시퀀스를 갖거나 또는 달리 특정되는 경우 또한 발현 조절 시퀀스를 포함하는 핵산으로 한정된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 키메라 폴리에피토프를 전달하기에 적절한 벡터, 특히 비-자가복제 벡터(non-replicating vector)에 관한 것이고, 여기에서 상기 벡터는 폴리에피토프를 수반하는 재조합 분자이거나 또는 폴리에피토프를 발현하는 바이러스성 벡터이거나 또는 pcDNA3 벡터, pcDNA5 벡터, pcDNA6 벡터, pCI 벡터 및 pCMV 벡터와 같이 폴리에피토프를 발현하는 포유동물 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 용어 "벡터(vector)"는 하나 또는 그 이상의 세포 형들의 형질도입/형질주입(transduction/transfection)을 위하여 설계된 폴리뉴클레오티드 구조에 관한 것이다. 벡터는, 예를 들어, 삽입된 폴리뉴클레오티드(삽입물(insert)로서 설계된)의 단리, 증식 및 복제를 위하여 설계된 "클론 벡터들(cloning vectors)", 특별히 숙주 세포 중에서 삽입물의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 위하여 설계된 "발현 벡터들(expression vectors)" 또는 재조합 바이러스 입자들 또는 바이러스-유사 입자들의 제조의 결과를 가져오도록 설계된 "바이러스 벡터(viral vector)" 또는 하나 이상의 벡터의 형태의 속성들(attributes)을 포함하는 "셔틀 벡터들(shuttle vector)"일 수 있다.
세포들의 형질도입에 또는 형질주입에, 특히 세포들 및 박테리아들의 안정한 형질주입에 적절한 다수의 벡터들이 일반 공중에 획득가능하고(예를 들어 플라스미드들, 바이러스들) 이러한 세포주들을 구축하기 위한 방법들도 마찬가지이다. 본 발명이 본 발명의 폴리뉴클레오티드들 중의 임의의 것을 포함하는 임의의 형태의 벡터를 포함한다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 발현 벡터에 관한 것이고, 이는 폴리뉴클레오티드 삽입물(들)로서 본 명세서에서 정의되는 하나 또는 복수의 핵산 분자들을 포함하는 플라스미드일 수 있다. 특정한 구현예에 있어서, 플라스미드는 삽입물로서 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 본 발명의 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그리고 선택적으로 다른 ZIKV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는, 통상의 기술자에게 잘 알려진 벡터들은 홍역 바이러스 벡터, 특히 약독화 생 홍역 바이러스 벡터(예를 들어, Combredet, C. et al., 2003, J Virol, 77(21): 11546-11554에서, 유럽 특허 출원 EP17305676.3에서 그리고 국제특허출원 WO2004/000876, WO2004/001051, WO2014/049094, WO2015/197565들에서 기술된 바와 같은), 렌티바이러스 벡터들(예를 들어, 국제특허출원 WO2005/111221, WO2007/052165, WO2008/078198, WO2009/019612 및 WO2016/091836들에서 기술된 바와 같은) 또는 mRNA(예를 들어, Moderna’s mRNA Therapeutics™ 플랫폼; 국제특허출원 WO2012135805, WO2013039861 및 WO2015/085318들에서 또는 Expert Opinion by Youn H. and Chung JK. Expert Opin Biol Ther. 2015 Sep 2; 15(9): 1337-1348 published online 2015 Jun 30. doi: 10.1517/14712598.2015.1057563에서 기술된 바와 같은)을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
숙주 세포는 본 발명의 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 그리고 선택적으로 다른 ZIKV 항원들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 유전적으로 형질전환될 수 있다. 따라서 특정한 숙주 세포는 본 발명의 벡터로 유전적으로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의하여, 즉 화학적 형질주입(칼슘포스페이트, 리포펙타민(lipofectamine)), 지질-기반 기술들(lipid-based techniques ; 리포좀), 전기 천공(electroporation), 광천공(photoporation), 바이러스 벡터들의 사용 등에 의하여 게놈 벡터로 형질주입될 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 세포는 상동 세포 시퀀스(homologous cellular sequence)로의 재조합에 의하거나 또는 세포 게놈 내에의 삽입에 의하여 세포 게놈 중에서의 폴리뉴클레오티드의 통합(integration)을 가능하게 하는 방법으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 형질도입된다. 형질주입, 감염 또는 형질도입은 생체 외에서 즉, 생물 밖의 인공 환경 중에서 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어들 "형질주입된(transfected)", "형질도입된(transformed)" 또는 "감염된(infected)"은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 의미하나(일과성 발현), 반면에 용어 "유전적으로 형질전환된(genetically transformed)"은 그의 게놈이 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 확실히 조작된 세포를 의미한다(영구적 발현).
상기 일과성 또는 안정하게 형질전환된 세포들은 임의의 원핵(prokaryotic ; 박테리아) 또는 진핵(eukaryotic ; 효모, 곤충 또는 포유동물, 특히 인간을 포함하여 동물) 세포들일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 세포들은 비-인간 세포들이다. 특정한 구현예에 있어서, 본 발명의 세포들은 인간 세포들로부터 단리되고, "단리된"은 이들의 자연적인 환경 밖을 의미한다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 숙주 세포는 조류 세포, 특히 CEF(chick embryo fibroblast ; 병아리 배아 섬유아세포) 세포, 포유동물 세포, 특히 HEK-293(human embryonic kidney ; 인간 배아 신장) 세포들(이 세포주 293은 국제특허출원 WO2008/078198에서 기술된 바와 같이 ATCC에 번호 CRL-1573으로 기탁되었음) 또는 효모 세포와 같은 진핵 세포이다.
본 발명은 또한:
(i) 본 발명에 따른 키메라 폴리에피토프,
(ii) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드,
(iii) 본 발명에 따른 벡터 및
(iv) 본 발명에 따른 숙주 세포
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 면역원성 조성물은 보조제(adjuvant) 및/또는 약제학적으로 수용가능한 비히클(vehicle)을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, 면역원성 조성물은 다른 ZIKV 항원들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 면역원성 조성물은 보조제(adjuvant) 및/또는 약제학적으로 수용가능한 비히클을 포함하지 않는다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 약제학적으로 수용가능한 비히클은 조성물 내의 본 발명에 따른 폴리에피토프, 폴리뉴클레오티드, 벡터의 제형화(formulation)를 가능하게 하는 임의의 물질을 포함한다. 비히클은 생리학적으로 수용가능한 즉, 숙주, 특히 인간과 접촉하는 조성물에서의 그의 사용을 위하여 적절하고 따라서 비-독성인 임의의 물질 또는 물질들의 조합이다. 이러한 비히클들의 예들은 인산염 완충 식염수, 증류수, 수중유 에멀젼들(oil/water emulsions)과 같은 에멀젼들, 여러 형태들의 적심제들 멸균용액 등이다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 보조제는, 예를 들어, 리포좀들, 수성상과의 에멀젼의 형태로 일반적으로 사용되는 프로인트 타입(Freund type) 보조제들과 같은 아쥬반트와 같은 오일상들을 포함하거나 또는 수산화알루미늄, 황산아연, 콜로이드성 수산화철, 인산칼슘 또는 염화칼슘 등과 같은 수-불용성 무기염들을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, 면역원성 조성물은 피하(s.c.), 피내(i.d.), 근육내(i.m.), 복강내(i.p.) 또는 정맥내(i.v.) 주사 등과 같은 비경구적 경로를 통한 투여를 위하여 제형화된다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에 있어서, 면역원성 조성물은 단일 또는 다중 투여 용량(들), 특히 프라임-부스트(prime-boost) 투여 요법으로 투여된다.
투여하고자 하는 양(투여량)은 환자의 상태, 개체의 면역계의 상태, 투여의 경로 및 숙주의 크기를 포함하여 치료하고자 하는 대상체에 의존한다. 적절한 투여량들은 바이러스 벡터에 대하여는 103 TCID50 내지 107 TCID50 또는 100 ㎍의 플라스미드 DNA의 범위이고, 상황에 따라 통상의 기술자에 의해 변경될 수 있다.
본 발명은 또한:
(i) 본 발명에 따른 키메라 폴리에피토프,
(ii) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드,
(iii) 본 발명에 따른 벡터 및
(iv) 본 발명에 따른 숙주 세포
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 면역원성 또는 백신 조성물은 (i) 인간 대상체에서 ZIKV 감염의 예방에서의 사용을 위한 또는 (ii) 인간 대상체에서 ZIKV 및 뎅기열 바이러스(DENV) 감염들의 예방에서의 사용을 위한 것이다.
본 발명은 또한 마우스에서 인간 HLA 클래스 I 대립형질들: HLA-A*02:01 또는 HLA-A*24:02 또는 HLA-B*07:02 또는 HLA-B*35:01을 발현하는 ZIKV 폴리에피토프의 에피토프들에 대한 생체 내에서의 면역 반응들의 유도에 관한 것이다. 마우스의 면역화는 먼저 ZIKV 폴리에피토프를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 피내 주사(등 아래 부분에의 50 ㎍의 플라스미드 DNA의 2회 동시 피내 주사 후 소정의 절차를 사용하여 생체 내 전기 천공), 3 주 후 부스트 면역화(boost immunization)(등 아래 부분에의 50 ㎍의 플라스미드 DNA의 2회 피내 주사 및 동일한 소정의 절차를 사용하여 전기 천공)의 프라임 부스트 투여 요법(prime boost administration regimen)에 따라 수행된다. AgilePulse 장치(BTX, Harvard apparatus)를 사용하는 전기 천공 설정들은 450 V, 50 ㎲의 펄스 길이, 0.2 ㎲의 간격 및 1 펄스의 제1 전압군, 450 V, 50 ㎲의 펄스 길이, 50 ㎲의 간격 및 1 펄스의 제2 전압군 및 110 V, 10 ㎳의 펄스 길이, 20 ㎳의 간격 및 8 펄스의 제3 전압군을 포함하여 3 가지 전압군들(3 Voltage groups)로 이루어진다. 부스트 면역화 10 일 후, 면역화된 마우스의 비장을 취하고 ELISPOT 분석법에 따라 ZIKV 폴리에피토프로부터 파생된 특정한 펩티드들로의 시험관 내 자극에 대한 감마인터페론을 분비하는 비장 세포들의 능력에 대하여 시험하였다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들이 후속하는 실시예들로부터 명백해질 것이고 그리고 또한 도면들에서 설명될 것이다.
도 1. 응답 공여자들의 ZIKV-특이적 반응 크기 및 빈도. ZIKV 단백체(proteome)에 걸치는 각 중첩 펩티드에 대한 누적 IFN-γ 반응(세포 백만개 당 반점 형성 세포들(SFCs: spot-forming cells)로서)을 (a) 모든 공여자들, (b) ZIKV 공여자들 또는 (c) DENV/ZIKV 공여자들에 대하여 나타내었다. 열 지도(heat map)는 각 단백질(C, 캡시드; M, 멤브레인(membrane); E, 엔벨롭, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5) 내의 각 펩티드에 대한 양성 IFN-γ 반응을 갖는 공여자들의 수를 나타내고 있다. 각 그래프 아래의 숫자들은 각 단백질에 대한 총 반응의 백분율들을 나타낸다.
도 2. 이전에 DENV 감염이 있는 ZIKV 공여자들이 보다 더 높은 크기를 갖는 보다 더 넓은 T-세포 반응을 나타내고 있다. (a) 전폭(Breadth) 및 (b) ZIKV 및 DENV/ZIKV 공여자들에서의 반응들의 크기. 각 점은 한 공여자(빈 원들, ZIKV 공여자들; 채워진 원들, DENV/ZIKV 공여자들)를 나타내고 그리고 막대들은 공여자들의 각 군에 대한 중간값을 나타낸다. 비모수의 양측검정(nonparametric two-tailed) Mann-Whitney 시험을 사용하여 P 값들이 산출되었다. ZIKV (c) 및 DENV/ZIKV (d) 공여자들에서 공여자 당 개개 펩티드들에 대한 반응들의 빈도. 각 점은 하나의 펩티드를 나타낸다. 막대들은 각 공여자에 대한 중간값(median response)을 나타낸다.
도 3. ZIKV 및 DENV/ZIKV 공여자들에서의 반응의 크기 및 DENV와의 시퀀스 동일성의 비교. 각 점은 하나의 펩티드에 대한 서로 다른 공여자들의 누적 반응을 나타낸다. 백분율들은 ZIKV 및 4가지 DENV 혈청형들의 시퀀스들 간의 평균 동일성 값을 나타낸다. (a) ZIKV 공여자들에서 반응을 유도하는 펩티드들. (b) DENV/ZIKV 공여자들에서 반응을 유도하는 펩티드들.
도 4. 18AAHK3C_pVAX-ZIKV_PolyEpitop_pVAX1 플라스미드의 도식 표현. 본 발명자들은 Thermo Fisher Scientific에서 상용화된 pVAX1 플라스미드를 사용하였다. 시퀀스 동정 번호: 124에서 정의되는 바와 같은 ZIKV의 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상기 플라스미드에 삽입되었다.
도 5. ZIKV의 키메라 폴리에피토프를 코딩하기 위한 플라스미드 DNA로의 피내 주사들 및 생체 내 전기 천공(0일차에서 2 x 50 ㎍ DNA로의 프라임 및 21일차에서 2 x 50 ㎍ DNA로의 부스트)에 의하여 HLA-A * 2402 유전자 이식 마우스를 면역화시켰다. 상기 ZIKV의 키메라 폴리에피토프는 시퀀스 동정 번호: 99의 아미노산 시퀀스를 가졌다. 상기 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 124에서 정의되는 바와 같다. 부스트 14일 후, 2 ㎎ 항-IFNAR 항체(MAR1-5A3)로의 복강 내 주사로 면역화된 마우스를 일시적으로 알파 인터페론 반응을 고갈시키고 그리고 항-IFNAR 항체로의 처리 24 시간 후 바이러스 접종을 수행하였다. 바이러스 접종을 위하여는, 마우스들에 마우스 당 103 pfu를 사용하여 ZIKV의 French Guyana 균주 FG15를 복강 내 주사하고 그리고 바이러스 접종 후 1, 2, 3 및 6일차에서 qRT-PCR로 바이러스혈증(viremia)을 정량하였다. 대조 마우스(공 벡터(empty vector)로의 전기 천공)로서 4개체의 마우스가 사용되었고 그리고 5개체의 마우스가 pZIKV 구조물(ZIKV의 키메라 폴리에피토프를 코딩하기 위한 플라스미드 DNA로의 전기 천공)로 예방접종되었다(vaccinated). AgilePulse 장치(BTX, Harvard apparatus)를 사용하는 전기 천공 설정들은 450 V, 50 ㎲의 펄스 길이, 0.2 ㎲의 간격 및 1 펄스의 제1 전압군, 450 V, 50 ㎲의 펄스 길이, 50 ㎲의 간격 및 1 펄스의 제2 전압군 및 110 V, 10 ㎳의 펄스 길이, 20 ㎳의 간격 및 8 펄스의 제3 전압군을 포함하여 3 가지 전압군들(3 Voltage groups)로 이루어졌다.
실시예들
윤리 선서(Ethics Statement)
인간 혈액 샘플들은 익명의 방법으로 Fundacion Hematologica Colombia(Bogota D.C., Colombia)의 건강한 성인 공여자들로부터 수득되었다. 본 발명에서 기술되는 모든 규약들(protocols)은 EL Bosque University(Colombia)의 기관감시위원회(IRB: institutional review board)에서 승인되었다.
인간 혈액 샘플들
공여자들은 20 내지 60세의 남성 및 여성들이었다. 2016년 10월부터 12월까지 3개월 간 Bogota D.C. 인근(주로 Villavicencio, Meta)에서 ZIKV-풍토병 지역에서 총 82개의 샘플들을 수득하였다. PBMCs(말초 혈액 단핵세포들)는 밀도 구배 원심분리(Limphoprep™; Stemcell technologies)로 정제되고 그리고 10% 디메틸술폭사이드를 포함하는 FBS(Gibco)에 재현탁시키고 액체 질소 중에 냉동 보관 시켰다. 수득된 82개의 혈액 샘플들 중의 11개는 세포의 생존성이 낮아서 연구에서 배제하였다.
바이러스들 및 세포주들
DENV1 KDH0026A(Dr L. Lambrecht, Institut Pasteur, Paris에서 제공됨), DENV2 R0712259(Dr. A. Failloux, Institut Pasteur, Paris에서 제공됨), DENV3 KDH0010A(Dr. L. Lambrecht, Institut Pasteur, Paris에서 제공됨), DENV4 CRBIP10.4VIMFH4(Institut Pasteur Collection에서 수령) 및 ZIKV KU312312(Dr. Dominique Rousset, Institut Pasteur. Cayenne에서 제공됨)들을 사용하여 시험관 내 분석들이 수행되었다. 모든 바이러스들은 0.1mM 비-필수 아미노산들 및 1X 트립토스 포스페이트 브로쓰(1X tryptose phosphate broth)를 포함하는 10% 우태혈청으로 보충된 Leibovitz's L-15 배지에서 배양시킨 흰줄숲모기(Aedes Albopictus mosquito) 세포주 C6/36를 사용하여 성장시켰다. Vero-E6 세포들 및 DC-SIGN-발현 U937은 각각 Dr M. Flamand 및 Dr B. Jacquelin(Institut Pasteur, Paris)에서 감사히 제공받았다.
HLA 타이핑(HLA Typing)
표준 기술들로 시험 대상체들의 말초 혈액 단핵세포들에서 단리된 게놈 DNA를 HLA 타이핑에 사용하였다. HLA 클래스 I(대립형질들 A, B 및 C) 및 HLA 클래스 II(대립형질 DRB1)에 대한 고해상도 Luminex-기반 타이핑(High resolution Luminex-based typing)이 제조업자의 규약(시퀀스-특이적 올리고뉴클레오티드(SSO) 타이핑; Immucor, Lifecodes)에 따라 사용되었다.
혈청학
앞서 기술된 바와 같이 재조합 항원-기반(EDIII 항원) 간접 ELISA를 사용하여 ZIKV 혈청 반응 양성(seropositivity)을 결정하였다(Aubry M, et al. 2017, Emerging infectious diseases 23(4):669-672). 요약하면, 96-웰 플레이트들(Nunc, Life Technologies, Rochester, NY)을 밤새도록 4℃에서 PBS 중의 50 ng의 항원으로 코팅하였다. 세척 후, 3% 탈지유(skimmed milk) 및 0.1% Tween-20을 포함하는 200 ㎕ PBS를 1 시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 1.5% BSA(우태혈청) 및 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS 중에 1:500으로 희석한 100 ㎕의 혈장으로 블로킹 용액(blocking solution)을 치환하고 그리고 플레이트들을 37℃에서 60 분 동안 배양시켰다. 3회 세척 후, 결합된 항체들을 고추냉이 과산화효소-결합 염소 항-인간 IgG 면역글로블린(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgG immunoglobulin: ROCKLAND)으로 검출하였다. 37℃에서 1 시간 동안 배양하고, 3회 세척한 후, TMB(KPL, Eurobio)를 포함하는 100 ㎕의 기질 용액(substrate solution)을 첨가하였다. 15 분 배양 후, 자동화 플레이트 판독기(automated plate reader: Tecan infinite 200 pro)로 650 ㎚에서 광학밀도(OD: optical density)를 결정하였다. 각 혈장 샘플을 이중으로 시험하였다. ZIKV 발발 이전에 수집된 양성 DENV IgG 혈청형을 갖는 개체들로부터 수득된 혈장 샘플들이 음성 대조들로 사용되었다. 음성 대조들로부터 컷-오프(cut-off)를 산출하였고 0.196이었다. 제조업자의 지시들에 따라 IgGs(Panbio; Alere)에 대한 간접 ELISA에 의하여 그리고 IgM(Tecnosuma)에 대하여 캡쳐 ELISA(capture ELISA)에 의하여 DENV 혈청 반응 양성을 결정하였다. 혈청 반응 양성 공여자들을 추가로 특정하기 위하여 그리고 ELISA의 민감도(specificity)를 확인하기 위하여, 유세포분석-기반 중화 분석(flow cytometry-based neutralization assay)을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Andreatta M, et al. 2015, Immunogenetics 67(11-12):641-650; Nielsen M & Andreatta M 2016, Genome Med 8(1):33). 요약하면, 혈장 샘플들의 일련의 10-배수 희석물들(10-fold serial dilutions)을 37℃에서 1 시간 동안 바이러스의 희석물과 함께 배양하여 7 내지 15% 감여을 유도하였다. 계속해서 바이러스-항체 혼합물을 DENV1-4 감염의 중화를 위하여 U937-DC-SIGN 세포들에 또는 ZIKV 감염의 중화를 위하여 Vero 세포들에 2 시간 동안 37℃에서 첨가하고, 그 후 세포들을 신생 배지로 2회 세척하고 그리고 계속해서 24 시간 동안 배양하였다. 계속해서 세포들을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, Alexa-488에 결합된 4G2 항체로 염색하고, 그리고 감염된 세포들의 백분율을 유세포분석기(flow cytometry)로 측정하였다. 항체들의 중화 역가(neutralization titer)를 50%의 바이러스가 억제되는 혈장의 상호 희석(reciprocal dilution)으로 표현하였다. ZIKV 발발 이전 수집된 공여자들로부터의 또는 항-DENV 항체들을 검출하기 위한 킷트들(Kits)로부터 제공된 음성 샘플들로부터의 혈장 샘플들은 각각 ZIKV 또는 DENV 감염에 대하여 어떠한 중화 활성도 나타내지 않았다. ELISA 및 중화 분석에 따라, 본 발명을 위해 선택된 71개의 혈장 샘플들 중에서 전체로 ZIKV-혈청 반응 양성 개체들로부터의 9개의 샘플들 및 DENV/ZIKV-혈청 반응 양성 개체들로부터의 11개의 샘플들이 ELISPOT 분석을 위하여 추가적으로 선택되었다. 본 발명에 포함된 20명의 혈액 공여자들의 전체 목록을 표 1에 나열하였다.
바이러스 시퀀스들
Colombia(GenBank KX087102 및 KU820897)로부터의 ZIKV의 동일 아미노산 시퀀스를 중첩 15-량체 펩티드들의 셋트에 대한 기준으로 사용하였다.
Colombia로부터의 DENV 혈청형들(혈청형 1: 14개 시퀀스들; 혈청형 2: 16개 시퀀스들; 혈청형 3: 13개 시퀀스들; 혈청형 4: 7개 시퀀스들)을 코딩하는 총 50개 전장 단백질을 GenBank로부터 입수하고 그리고 서로의 시퀀스 동일성 비교를 위하여 사용하였다.
펩티드들
모든 펩티드들을 Mimotopes (Victoria, Australia)로 합성하였다. 전체로 11개 아미노산들이 중첩하는 853개의 15-량체 펩티드들 및 8개 아미노산들이 중첩하는 197개의 9-량체 펩티드들이 ELISPOT 분석으로 시험되었다. T-세포 에피토프들의 동정을 위하여, 15-량체 펩티드들이 12개 펩티드들의 풀들(pools) 내로 결합되고, 그리고 양성 풀들로부터의 개개 펩티드들이 2차 ELISPOT 분석에서 시험되었다. 양성 15-량체 펩티드들의 동정 후 그리고 이들의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 제한 포텐셜(restriction potential ; 적어도 2인의 공여자들 간에서 예측되거나 또는 공유된)에 따라, 9-량체 펩티드들이 합성되고 그리고 개별적으로 시험되었다.
생체 외 IFN-γ ELISPOT 분석
PBMC들(2x105)을 항-IFN-γ mAb(클론 1-D1K, Mabtech, Sweden)로 코팅된 96-웰 편평바닥 플레이트(96-well flat bottom plates ; MSIPS 4510, Millipore, Bedford, MA) 내에서 12개 펩티드들(2 ㎍/㎖, 최종 농도) 또는 개개 펩티드들(1 ㎍/㎖, 최종 농도)의 풀들을 갖는 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 0.2 ㎖의 완전 RPMI와 함께 20 시간 동안 배양시켰다. 37℃에서의 20시간 배양 후, 웰들을 PBS/0.05% Tween 20으로 세척하고 그리고 계속해서 비오티닐화 항-IFN-γ mAb(클론 7-B6-1, Mabtech)와 함께 1시간 30분 동안 배양하였다. 스폿들을 스트렙타비딘-알칼라인 포스페이트(Mabtech) 및 BCIP/NBT 기질(Promega, France)들을 사용하여 전개시키고 그리고 자동화 ELISPOT 판독기(Immunospot, Cellular Technology Limited, Germany)를 사용하여 계수하였다. IFN-γ-생성 세포들의 수는 1 x 106 PBMCs에 대한 스폿형성 세포들(SFC)로 표현되었다. 비-자극 대조 웰들 중에서 검출된 스폿들의 수를 차감하는 것에 의하여 값들이 산출되었다. 값들이 20개 스폿들 이상이고 그리고 자극되지 않은 대조 웰들의 평균의 적어도 3배인 경우 양성으로 고려되었다. 양성 대조로서, 세포들을 CEF 펩티드 풀(Mabtech)로 자극시켰다.
면역원성 및 HLA 제한 예측
펩티드들의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 대립형질들에의 결합 가능성의 평가를 각각 NetMHCpan3.0 및 NetMHCIIpan3.1 서버들을 사용하여 분석하였다(Andreatta M, et al. 2015, Immunogenetics 67(11-12):641-650; Nielsen M & Andreatta M 2016, Genome Med 8(1):33).
통계학
모든 데이터들을 Prism 소프트웨어 버젼 7.0(GraphPad Software)로 분석하였다. 2개의 독립적인 군들을 비교하기 위하여 비모수의 양측검정 Mann-Whitney 검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다. 편차들은 P < 0.05에서 유의적인 것으로 고려되었다.
결과
ZIKV 프로테옴의 면역우세 영역들의 동정
ZIKV 감염 이후 유도된 T-세포 면역을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 감마인터페론(IFN-γ)-특이적 효소-결합 면역흡수점(ELISPOT) 분석들에서 ZIKV 풍토병 지역에 거주하는 혈액 공여자들로부터의 반응을 조사하였다. ELISA에 의하여 ZIKV IgG 및 DENV IgM 그리고 IgG의 존재에 대하여 그리고 ZIKV 및 4가지 DENV 혈청형들에 대한 유세포분석-기반 중화 분석에 의하여 바이러스-특이적 항체들의 존재에 대하여 모든 시험 참여자들로부의 혈액 샘플들을 시험하였고, 그리고 ZIKV-혈청 반응 양성 개체들로부터의 PBMC들을 HLA-타이핑하였다. 본 시험에 참여한 혈액 공여자들의 상세들을 표 1에 나열하였다. 전체 ZIKV 프로테옴에 걸치는 15-량체 펩티드들(11개 아미노산들로 중첩)의 풀들에 대하여 20개체의 ZIKV-혈청 반응 양성 공여자들로부터의 PBMC들을 스크리닝하였다. 반응 크기(점형성 세포(106개 세포 당 SFC)들로서) 및 응답 공여자들의 빈도의 분석으로 비-구조(NS) 단백질 NS1, NS3 및 NS5들이 가장 강력하게 그리고 빈번하게 인식된 단백질들이고 그리고 총 반응의 69%로 확인되었다는 것으로 나타났다(도 1a). 놀랍게도, 이들 NS1, NS3 및 NS5 단백질들이 ZIKV 공여자들에서 각각 총 반응의 15%, 19% 및 35%를 나타났으나, 반면에 NS3, NS4B 및 NS5 단백질은 각각 DENV-특이적 T-세포 반응의 31%, 15% 및 22%로 확인되는 것으로 보고되었다(Simmons CP, et al. 2005, J. Virol. 79(9):5665-5675; Duangchinda T, et al. 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107(39):16922-16927; Rivino L, et al. 2013, J. Virol. 87(5):2693-2706 ; Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046-2053). 이들 공여자들이 DENV- 및 ZIKV-풍토병 지역들에서 선택되었기 때문에 그리고 이들 바이러스들이 전체 43% 단백질 시퀀스 동일성을 공유하기 때문에(비-구조 단백질들에 대하여 68%까지로), 본 발명자들은 ZIKV-특이적 에피토프들과 두 바이러스들에 의해 공유된 에피토프들 간을 구별할 것을 추구하였다. 20개체의 ZIKV-혈청 반응 양성 혈액 공여자들 중, 11개체들이 항-DENV 및 항-ZIKV IgG 항체들 둘 다를 가졌고, 그리고 9개체들이 어떠한 검출가능한 항-DENV 항체들도 나타내지 않았다(표 1). 따라서 본 발명자들은 단지 ZIKV 감염의 이력만을 갖는 공여자들(ZIKV 공여자들)로부터의 T-세포 반응들과 DENV 및 ZIKV 감염들의 이력을 갖는 공여자들(DENV/ZIKV 공여자들)로부터의 T-세포 반응들을 별도로 분석하였다. 도 1b 및 도 1c에 나타난 바와 같이, NS1, NS3 및 NS5 단백질들이 각각 ZIKV 공여자들에서의 반응들의 13%, 31% 및 32%를 차지하는 데 반하여, DENV/ZIKV 공여자들에서의 반응들의 15%, 16% 및 36%를 차지하였다. 이들 결과들은 이전의 DENV로의 감염과는 무관하게 NS1, NS3 및 NS5들이 ZIKV-감염 공여자들에서의 T 세포들에 대한 주요 표적들이었고, 그리고 ZIKV 만으로 감염된 공여자들과 비교하여 DENV로 이전에 감염된 공여자들에서의 NS5에 대한 반응들의 빈도 및 크기에서 증가하였다는 것을 확증하였다.
[표 1] 에피토프 반응성 시험을 위하여 사용된 ZIKV 환자 집단의 특징들.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
전체 ZIKV 프로테옴에 걸치는 853개 펩티드들로부터, 410개 펩티드들이 유의미한 T-세포 반응을 이끌어내었고, 그 중 일부가 복수의 공여자들에 의해 인식되었다. 대부분의 항원성 펩티드들의 경우, 응답 공여자들의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 대립형질들이 이러한 에피토프에 결합할 것으로 예측된 대립형질들과 일치하였다(Andreatta M, et al. 2015, Immunogenetics 67(11-12):641-650; Nielsen M & Andreatta M 2016, Genome Med 8(1):33). ZIKV 및 DENV/ZIKV 공여자들에서 강한 반응을 유도하는 에피토프들 중에서, 여러 개의 15-량체 펩티드들이 응답 공여자들에 의해 발현된 적어도 하나의 대립형질에 강하게 결합하는 것으로 예측된 짧은 시퀀스들을 포함하였다(표 2). 예를 들어, NS2B117-131 펩티드(시퀀스 동정 번호: 25로 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)는 응답 공여자 55번에 의해 발현된 HLA-A*0301 및 -A*1101 분자들에 강하게 결합할 것으로 예측된 10-량체 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 26에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)를 포함하였다. 다른 경우들에 있어서, 복수의 응답 공여자들이 자극 펩티드(stimulating peptide)에 결합하는 강한 잠재력을 갖는 적어도 하나의 공통의 대립형질을 발현하였다. 이는 둘 모두 응답 공여자 1 및 77들에 의해 발현된 것인 대립형질인 HLA-B*5101 및 HLA-A*0201 대립형질들에 결합할 것으로 예측된 9-량체(시퀀스 동정 번호: 9에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 10-량체(시퀀스 동정 번호: 8에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 시퀀스들을 포함한 엔벨로프 중에 E455-469 펩티드(시퀀스 동정 번호: 7에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)를 보유하고 있다. 이는 또한 NS513-27 펩티드(시퀀스 동정 번호: 46에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)에도 적용되며, 이 펩티드는 높은 친화도(affinity)를 갖는 9-량체 펩티드 MSALEFYSY(시퀀스 동정 번호: 47에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)에 결합할 것으로 예측되는 대립형질인 HLA-B*3501 대립형질을 공유하는 공여자 55 및 69들에서 강한 반응을 유도하였다. 흥미롭게도, 이러한 에피토프는 또한 공여자 69에 의해 발현된 HLA-A*0101 분자를 수반하는 유전자 이식 마우스들에서 유의미한 반응을 유도하는 것으로 나타났다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036). 유사하게, HLA-B*4002 및 -B*4403 대립형질들을 발현한 공여자 28, 53 및 66들에서 NS5546-560 펩티드(시퀀스 동정 번호: 67에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)에 대하여 그리고 예측된 HLA-A*2402 대립형질을 공유한 공여자 33 및 59들에서 NS5605-619 펩티드(시퀀스 동정 번호: 72에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)에 대하여 강한 T-세포 반응이 관측되었다. 마지막으로, 본 발명자들은 또한 NS4B112-126(시퀀스 동정 번호: 41에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS5293-307(시퀀스 동정 번호: 49 및 50들에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS5297-311(시퀀스 동정 번호: 53-55들에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5345-359(시퀀스 동정 번호: 58에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드들을 포함한 NS4B 및 NS5 단백질들 중에서 여러 9-량체 면역우세 에피토프들을 동정하였으며, 이들 펩티드들은 이들 펩티드들에 결합하는 강한 잠재력을 갖는 하나 또는 여러 대립형질들을 공유한 공여자들에서 실질적인 T-세포 반응들을 유도하였다.
뚜렷하게도, NS3 및 NS5 단백질들 중에서, 여러 에피토프들이 이미 DENV 감염 이후 또는 인간들에서의 예방접종 또는 마우스들에서의 ZIKV 감염 이후 예측되거나 또는 실험적으로 평가된 면역우세 에피토프로서 기술되었었다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036; Dar H, et al. 2016, Asian Pac J Trop Med 9(9):844-850; Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128; Dikhit MR, et al. 2016, Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases 45:187-197). 사실, DENV/ZIKV 공여자들에서 동정된 9-량체 펩티드들 중에서, NS5293-307(시퀀스 동정 번호: 50에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS5297-311(시퀀스 동정 번호: 53-55들에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5345-359(시퀀스 동정 번호: 58에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)들이 DENV1, DENV2로의 감염 또는 각각 ZIKV로부터의 NS5297-311(시퀀스 동정 번호: 53-55들에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5345-359(시퀀스 동정 번호: 58에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드들에서의 잔기들 302 및 350에서의 라이신 내지 아르기닌 및 페닐알라닌 내지 티로신 아미노산 치환을 갖는 DENV 생약독화 백신(DLAV)으로의 예방접종 이후에 HLA-B*3501 개체들로부터의 PBMC들에서 이미 검출되었다(Rivino L, et al. 2013, J. Virol. 87(5):2693-2706; Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128; Imrie A, et al. 2007, J. Virol. 81(18):10081-10091) (표 2). 따라서 DENV/ZIKV 공여자들로부터 얻어진 이들 결과들은 내포 에피토프들(nested epitopes)을 포함하는 이들 NS5 펩티드들이 HLA-B*3501 분자에 의해 제한되었다는 것을 확증하였다. 그렇지만 비록 이들 대립형질들이 DLAV로 예방접종 받은 응답 공여자들에서 또는 ZIKV 감염 이후 ifnar-/- HLA-B*0702 유전자 조작 마우스들에서 발현되었음에도 불구하고, APTRVVAAEM 에피토프(시퀀스 동정 번호: 29에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)를 포함하는 15-량체 NS3219-233 펩티드(시퀀스 동정 번호: 28에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)는 HLA-B*0702 또는 B*3501 중 어느 것도 발현하지 않는 2개체 DENV/ZIKV 공여자들에서 실질적인 반응을 유도하였다(Wen J, et al. 2017, Nat. Microbiol. 2:17036; Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128). 이는 NS3219-233 펩티드(having the amino acid sequence as defined in SEQ ID NO: 28)가 다른 에피토프 또는 HLA-B*0702나 B*3501를 제외한 다른 HLA 대립형질들에 결합된 잡다한 에피토프를 포함하였다는 것을 암시하였다.
[표 2] 본 발명에서 동정된 ZIKV(시퀀스 동정 번호: 1-75들에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)로부터의 항원성 펩티드들의 특징들.
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이전에 DENV 감염이 있는 공여자들에서의 보다 더 높은 크기를 갖는 보다 더 광범위한 반응들
NS1에 대한 ZIKV-특이적 항체 반응 및 E와 NS1 단백질들에 대한 DENV와 ZIKV 간의 CD4 T-세포 교차-반응성의 낮은 수준을 고려해 볼 때(Stettler K, et al. 2016, Science 353(6301):823-826), 본 발명자들은, 면역우세 에피토프들 중에서, ZIKV 공여자들로부터의 PBMC들과 DENV/ZIKV 공여자들로부터의 PBMC들에서의 T-세포 반응들을 비교하였다. 먼저, ZIKV 및 DENV/ZIKV에서의 반응하는 T 세포들의 빈도의 비교에서 ZIKV 공여자들에 비하여 DENV/ZIKV 공여자들에서 보다 더 높은 반응의 크기가 강조되었다(도 1b 및 도 1c). 공여자 당 평균 반응과 마찬가지로 공여자 당 자극 펩티드들의 수는 이전의 DENV 감염이 있는 공여자들에서 보다 더 넓은 반응 및 보다 더 높은 반응의 크기로 이들 두 그룹들에서 달랐다(도 2a, 좌측 및 우측 패널들). 이러한 차이가 오로지 각 공여자에서 보다 더 강한 반응을 이끌어낸 소수의 펩티드들에만 관련된 것인지의 여부 또는 차이가 대부분의 펩티드들에 관련된 것인지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 2개의 서로 다른 군들 중에서 공여자 당 서로 다른 펩티드들에 대한 반응들의 빈도를 플로팅하였다. 도 2b에 나타난 바와 같이, ZIKV 공여자들 중에서 9개체들 중 2개체들이 100 SFC/백만 세포들 보다 더 높은 중간 반응을 나타내었으나, 반면에 11개체의 DENV/ZIKV 공여자들 중 6개체의 공여자들이 이러한 강한 반응으로 발달하였고, 이는 또한 보다 많은 수의 펩티드들에 대해 유도되었다. 이러한 결과는 감염을 경험하지 않은 공여자들에 비하여 DENV로 이전에 감염된 공여자들에서 보다 더 높은 반응의 크기로 ZIKV 펩티드들에 대한 T 세포들의 보다 더 높은 빈도의 활성화를 나타내었다. 이는 DENV 및 ZIKV로의 순차적인 감염 이후의 마우스들에서 최근에 나타난 바와 같이, DENV로의 초기 감염 동안 프라이밍되고 그리고 그 후 ZIKV로의 후속 감염 동안 확대되는 교차-반응성 T 세포들의 존재를 분명히 보여주었다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036).
DENV/ZIKV-교차-반응성 T 세포들은 주로 NS5 단백질을 표적한다
보다 구체적으로 ZIKV-특이적 펩티드들 및 DENV/ZIKV 교차-반응성 펩티드들을 동정하기 위하여, 본 발명자들은 두 가지 타입들의 공여자들에 의해 인식되 최 면역우세 에피토프들(the most immunodominant epitopes)의 시퀀스들을 비교하였다. 도 2a 및 표 3에 나타난 바와 같이, NS1 및 NS3 단백질들이 ZIKV 및 DENV/ZIKV 공여자들 둘 모두에서 강한 반응들을 이끌어낸 펩티드들을 높은 비율로 포함하였는데 반하여, E 단백질 및 높은 정도로 NS5 단백질은 단지 DENV/ZIKV 공여자들에서만 강한 반응을 유도하는 펩티드들 대부분을 포함하였다. 이는 NS1 및 NS3 단백질들이 ZIKV-특이적 에피토프들을 보다 더 많이 포함하였는데 반하여, NS5 단백질은 DENV 및 ZIKV에 의해 공유된 에피토프들을 보다 더 많이 포함하였고 그리고 교차-반응성 T 세포들에 의해 인식되었다는 것을 암시하였다. 놀랍게도, 대부분의 펩티드들은 4가지 DENV 혈청형들과 높은 정도의 동일성을 나타낸 DENV/ZIKV 공여자들에 의해서만 인식되었다. 예를 들어, NS1 단백질 중에서, ZIKV 공여자들에서 반응을 유도한 5개의 에피토프들 중의 2개는 4가지 DENV 혈청형들과 60% 이상의 시퀀스 동일성을 나타났는데 반하여, DENV/ZIKV 공여자들에서 강한 반응을 유도한 NS5 단백질 중의 11개의 에피토프들 중의 8개는 4가지 DENV 혈청형들과 66.7% 이상의 시퀀스 동일성을 나타내었다(표 3). 증가된 반응의 크기가 DENV와 보다 더 높은 시퀀스 동일성을 갖는 펩티드들의 인식과 상관되는 지의 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 각 팹티드에 대한 누적 반응들을 DENV와 ZIKV 시퀀스들 간의 동일성의 백분율에 대하여 플로팅하였다. ZIKV 공여자들 중에서, DENV와 약 60% 동일성을 갖는 단지 4가지 ZIKV 펩티드들만이 백만 세포들 당 300 SFC 이상의 반응을 이끌어낼 수 있었는데 반하여, DENV와 적어도 70% 동일성을 갖는 21개 ZIKV 펩티드들은 DENV/ZIKV 공여자들에서 이러한 강한 반응을 유도하였다(도 3); 이들 공여자들에서 가장 강한 T-세포 반응을 유도하는 4가지 펩티드들은 DENV와 가장 높은 시퀀스 동일성을 공유하였다. 전체적으로 보아, 이들 데이터들은 DENV와 ZIKV 간에서 공통 에피토프들을 인식하고, 그리고 ZIKV에 대하여 T-세포 반응을 지배하는 DENV 및 ZIKV 감염들 이후 유도된 교차-반응성 T 세포들의 활성화를 강하게 지지하였다.
[표 3] ZIKV 및 DENV/ZIKV 공여자들에서의 면역우세 에피토프들(시퀀스 동정 번호: 17, 25, 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 and 76-93들에서 정의된 바와 같은 아미노산 시퀀스들을 갖는)
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본 시험에서, ZIKV-감염 인간 혈액 공여자들로부터의 PBMC들을 사용하여, 본 발명자들은 ZIKV에 특이적이거나 또는 DENV 및 ZIKV 간에 공유되는 여러 T-세포 에피토프들을 동정하였다. DENV-특이적 T-세포 반응들이 우세적으로 NS3, NS4B 및 NS5에 대하여 지향되는 데 반하여, ZIKV에 대한 반응은 주로 NS1, NS3 및 NS5 단백질들을 표적하였다. 이전에 DENV로 감염된 공여자들에서 관측된 NS5 단백질로부터의 펩티드들에 대한 보다 더 강하고 그리고 보다 더 광범위한 IFN-γ 반응들로 본 발명자들은 이 영역이 교차-반응성 T-세포들에 의해 인식되는 보다 많은 펩티드들을 포함하고 있음에 반하여, NS1 단백질은 우선적으로 ZIKV-특이적 T 세포들에 의해 표적된다는 것을 상정하기에 이르렀다. 이들 데이터들은 NS1 단백질과 비교하여 NS5 단백질 중의 ZIKV 및 DENV 시퀀스들 간에서 관찰된 보다 더 높은 백분율의 동일성과 일치하였다. 그의 시퀀스 동일성에 더하여, ZIKV의 아시아 계통에 대하여 관측된 높은 NS1 분비능(secretability)(Liu Y, et al. 2017, Nature 545 (7655): 482-486)이 또한 DENV-감염 공여자들에서 관측된 NS1-특이적 T 세포들의 빈도와 비교하여 ZIKV-감염 공여자들에서 유도된 NS1-특이적 T 세포들의 보다 더 높은 빈도를 설명할 수 있다(Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046-2053).
여러 에피토프들에 대하여, 15-량체 또는 9-량체 펩티드들이 인간 HLA 분자들을 발현하는 유전자 이식 마우스들에서 최근 동정된 에피토프들과 매칭되었으며, 따라서 이러한 펩티드에 대한 클래스 I 대립형질 제한을 확증하고 있다. 이는 ZIKV로 감염된 HLA-B*0702 유전자 이식 마우스들에서 유의미한 반응을 이끌어내는 것으로 나타난 C25-35 펩티드 SPFGGLKRLPA(시퀀스 동정 번호: 93에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)를 포함한 HLA-B*0702 대립형질들(데이터는 나타나지 않았음)을 발현하는 공여자에서의 반응을 유도하는 15-량체 펩티드 VARVSPFGGLKRLPA(시퀀스 동정 번호: 92에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)에 대한 경우이다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036). 동일한 상관관계들은 각각 HLA-B*0702 및 HLA-A*0101 대립형질들을 발현하는 인간 공여자들에서(데이터 나타내지 않음 그리고 표 2), 그리고 이들 대립형질들을 발현하는 유전자 이식 마우스들에서(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036) 강한 반응을 유도하는 NS3(FPDSNSPIM, 시퀀스 동정 번호: 94에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS4B(RGSYLAGASLIYTVT, 시퀀스 동정 번호: 95에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5(NQMSALEFYSY, 시퀀스 동정 번호: 96에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드들에 대하여도 구축되었다. 다른 경우들에 있어서, HLA-B*0702 및 HLA-A*0101 유전자 이식 마우스들에서 동정된 에피토프들이 또한 이들 두 대립형질들 HLA-B*0702 또는 HLA-A*0101의 어느 것도 발현하지 않는 공여자들에서의 반응을 이끌어내는 NS3219-233 펩티드(시퀀스 동정 번호: 28에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)(표 2) 및 NS119-33(시퀀스 동정 번호: 78에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 또는 NS513-27(시퀀스 동정 번호: 46에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드들(표 3)과 같은 이들 대립형질들을 발현하지 않았음에도 불구하고 응답 공여자들에서 동정되었다. 이들 공여자들에 대하여, 하나의 가능성은 유전자 이식 마우스들에서 동정된 에피토프가 유전자 이식 마우스들에서 동정된 에피토프가 유전자 이식 마우스들에 의해 발현된 대립형질들과는 다른 인간 HLA 대립형질들에 대하여 보다 더 높은 친화도를 가졌다는 것 또는 15-량체 펩티드가 다른 대립형질에 결합된 다른 에피토프를 포함하였다는 것일 수 있다. 9-량체 에피토프들로의 결합 시험들 및 TAP-결핍 세포들을 사용하는 HLA 클래스 I 안정화 분석들은 이들 가능성들 간을 식별할 수 있어야 한다.
본 발명자들은 또한 DENV와 공통 시퀀스들을 공유하였고 그리고 DENV 및 ZIKV 감염 이후 교차-반응성 T 세포들에 의해 우선적으로 표적화된 여러 펩티드들의 동정을 보고하였다. 이들 펩티드들 중에서, NS5293-307(시퀀스 동정 번호: 48에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5297-311(시퀀스 동정 번호: 52에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드들이 DENV1으로 감염된 태평양 군도인들(Pacific Islanders)에서 이전에 동정된 에피토프와 아미노산들을 공유한 아미노산 시퀀스 HPYRTWAYH(시퀀스 동정 번호: 49에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)를 포함하였다(Imrie A, et al. 2007, J. Virol. 81(18):10081-10091). 유사하게, NS5325-339(시퀀스 동정 번호: 86에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드는 또한 DENV1으로 감염된 이들 개체들에서 동정된 에피토프 KPWDVIPMV(시퀀스 동정 번호: 98에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)와 66.7% 동일한 아미노산 시퀀스 KPWDVVTGV(시퀀스 동정 번호: 97에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는)를 포함하였다(Imrie A, et al. 2007 J. Virol. 81(18):10081-10091). 마지막으로, DENV/ZIKV 공여자들에서 가장 강한 반응을 유도하는 NS5345-359(시퀀스 동정 번호: 58에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS5465-479(시퀀스 동정 번호: 88에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5481-495(시퀀스 동정 번호: 89에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 펩티드들(표 3)이 또한 DENV-감염 개체들에서 이전에 동정된 9-량체 에피토프들을 포함하였다(Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128). 종합하면, 이들 데이터들은 순차적인 DENV 및 ZIKV 감염들에 후속하는 반응을 지배하는 DENV/ZIKV 교차-반응성 T 세포들의 활성화를 나타내었다. 특히, 비록 이들 교차-반응성 펩티드들이 DENV와 높은 정도의 시퀀스 동일성을 나타내고 그리고 DENV 감염 이후 T-세포 반응을 자극할 수 있었으나, 이들 펩티드들은 ZIKV로의 일차 감염 이후 반응을 유도하지 않아 이들 펩티드들이 DENV의 정황에서 면역우세이었으나 ZIKV 감염의 정황에서는 면역우세가 아니었음을 암시하고 있다. 이러한 결과는 에피토프의 면역우세 또는 단백질에 의해 발현된 다른 에피토프들에 따른 그의 상대적인 풍부함(abundance)으로 기대되었다. 이는 또한 에피토프 생산이 단백질 시퀀스에서 발현된 곁가지 잔기들(flanking residues)의 개열가능성(cleavability)과 상관되었다는 것을 나타내는 이전의 관측과도 일치하였다(Zhang SC, et al. 2012, J. Immunol. 188(12):5924-5934). 중요한 것은, 이들 교차-반응성 에피토프들의 경우, ZIKV-감염 공여자들에서의 T-세포 반응의 부재는 단순히 이 모집단(population)에서 HLA 대립형질들의 부재로 인한 것 만은 아니고, 응답 DENV/ZIKV 공여자들에서 발현된 대립형질들 대부분이 ZIKV 공여자들에서 발현되었기 때문이다(표 1). 이것이 각각 ZIKV 공여자들에 의해 빈번하게 발현되는 HLA-B*3501 및 HLA-B*4002 대립형질들에 강한 바인더들(binders)일 것이라 예견된 NS513-27(시퀀스 동정 번호: 46에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS5293-307(시퀀스 동정 번호: 48에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는), NS5345-359(시퀀스 동정 번호: 57에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 및 NS5546-560(시퀀스 동정 번호: 67에서 정의되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는) 에피토프들에 대하여 관측한 것이다(표 2 및 도 3). 종합하면, 이들 결과들은, 초기 ZIKV 감염의 경우에서, ZIKV-특이적 에피토프들의 우선적인 인식이 존재하는 데 반하여, 이종의 DENV/ZIKV 감염 이후 교차-반응성 에피토프들에 대한 보다 더 빈번하고도 보다 더 강한 T-세포 반응이 존재한다는 것을 나타내었다. 흥미롭게도, 이들 NS5 에피토프들에 대하여 DENV 공여자들에서 관측된 강한 T-세포 반응은 DENV에 대한 높은 크기의 응답과 관련된 대립형질인 HLA-B*3501 대립형질을 발현한 공여자들에 그리고 DENV 감염 및 질환에 대한 보다 더 강한 보호에 일차적으로 의존하였다(Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046-2053). 모든 혈액 샘플들이 무증상(asymptomatic)의 ZIKV 감염된 공여자들로부터 수득되었기 때문에, 본 발명자들은 HLA-B*3501 공여자들에서 수득된 ZIKV-특이적 T-세포 반응의 강도를 질환에 대한 보호와 연관시킬 수 없었다. DENV와 마찬가지로 ZIKV 감염에서의 T 세포들에 대한 HLA-결합 보호 역할이 있는지의 여부를 판단하기 위하여는 일차 ZIKV 감염 후 질환에 대한 보다 더 높은 감수성(susceptibility)을 갖는 보다 많은 대상체들에 대한 추가의 연구들이 필요하다. 유사하게, 최근 마우스들에서 제안된 바와 같이, DENV 감염 이후 유도된 교차-반응성 T 세포들이 ZIKV 감염 및 질환에 대한 보다 더 나은 보호를 매개할 수 있는 지의 여부를 결정하기 위하여는 이전의 DENV 감염이 되었거나 이를 경험하지 않은 공여자들에서의 질환 중증도(disease severity)를 비교하는 것이 또한 중요할 수 있다(Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036; Elong Ngono A, et al. 2017, Cell host & microbe 21(1):35-46). CD4+ 및 CD8+ T 세포들 둘 모두 DENV 감염에 대한 보호에 기여하는 것으로 나타났기 때문에, ZIKV 감염과 질환 보호에서의 CD4의 역할을 결정하기 위해서는 MHC 클래스 II-제한 반응의 종합적인 분석이 필요하다. 마지막으로, 무증상 또는 유증상의 공여자들에서의 추가의 ZIKV-특이적 T 세포들의 표현형 분석이 ZIKV 감염 및 질환에 대한 자연 면역 및 예방 접종의 보호의 상관관계를 정의하는 데 도움이 될 것이다. DENV-특이적 T 세포들에 대하여와 마찬가지로, ZIKV-특이적 펩티드들에 대한 강한 반응들이 특정한 HLA 대립형질들에서 더 빈번하고 그리고 다기능성(multifunctionality)과 관련이 있는지의 여부를 결정하는 것이 특히 중요할 수 있다(Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046-2053).
결론적으로, 많은 연구들이 ZIKV에 대한 항체 반응, 보다 구체적으로 ZIKV와 DENV 간에 공유되는 B 세포 에피토프들의 동정에 초점을 맞추고 있지만, ZIKV 감염의 통제에서의 T 세포들의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 최근 ZIKV 감염, 혈청 반응 양성의 이력이 있거나 또는 DENV에 대하여 이력이 없는 혈액 공여자들로부터의 PBMC들을 사용하여, 본 발명자들은 인터페론 (IFN)-γ 효소-결합 면역반점(ELISPOT) 분석으로 완전한 프로테옴을 스크리닝하는 것에 의하여 ZIKV T-세포 에피토프들의 분포의 제1 지도를 수립하였다. 본 발명자들은 비-구조 단백질 NS1, NS3, NS5들이 강한 T-세포 반응을 유도하는 면역우세 펩티드들을 대부분 포함하였다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 NS5 단백질이 두 바이러스들에 의해 공유되는 많은 에피토프들을 포함하고 있으며, 이는 DENV 및 ZIKV 감염들에 후속하는 가장 높은 반응을 유도하였다는 것을 입증하였다. 놀랍게도, DENV 감염 이력이 있는 공여자들은 이전에 DENV CD8+ T-세포 에피토프들로 동정되었던 펩티드들에 대해 상당한 반응을 나타내었다. 이들 공여자들에서 관측된 가장 강한 T-세포 반응들은 4개의 DENV 혈청형들과 높은 수준의 아미노산 동일성을 갖는 시퀀스들에 대응하여 교차-반응성 T 세포들의 활성화를 암시하였다. 이들 결과들은 장래의 ZIKV 및 DENV 백신들에 대한 결정적인 영향들을 미치고 그리고 이들 바이러스들에 대한 장기 면역성의 유도에서의 ZIKV-특이적이고 DENV/ZIKV 공유 T-세포 에피토프들의 역할을 연구할 수 있는 새로운 기회를 제공한다.
마우스들에서의 폴리-ZIKV DNA 예방 접종
DNA 면역화는 2 x 50 ㎍ DNA로 3주 간격들과 바이러스로의 부스트(103 pfu/마우스로의 ZIKV의 복강내 주사) 후 15일에서 시도하는 키메라 폴리에피토프에 대한 플라스미드 코딩 및 전기 천공을 사용하여 수행될 수 있다.
플라스미드 및 전기 천공(EP)으로의 DNA 예방 접종은 다음과 같이 수행될 수 있다:
예방 접종을 위하여는, 2 ㎎/㎖의 DNA 각 25 ㎕의 2회 주사들을 등에 피내 접종 후, 즉각적으로 AgilePulse 장치(BTX Harvard Apparatus)를 사용하는 전기 천공에 의하여 수행될 수 있다.
전기 천공 절차는 3가지 전압군들로 이루어질 수 있다:
제1 전압군: 450 V, 50 ㎲의 펄스 길이, 0.2 ㎲의 간격, 펄스들의 수(Nb pulses): 1; 제2 전압군: 450 V, 50 ㎲의 펄스 길이, 50 ㎲의 간격, 펄스들의 수: 1; 제3 전압군: 110 V, 10 ㎳의 펄스 길이, 20 ㎳의 간격, 펄스들의 수: 8.
ZIKV로의 시도 이전 -1일차에서, 2 ㎎ 항-IFNAR 항체(MAR1-5A3)로 복강내 주사하여 IFN 타입 I 반응을 일시적으로 차단시킬 수 있다.
바이러스혈증은 qRT-PCR(정량 실시간 중합효소 연쇄반응)로 시도 후 1일 내지 6일차에서 혈장 샘플들 중에서 정량될 수 있다.
비-인간 영장류들(인디언 레서스 마카쿠스 원숭이(Indian Rhesus Macaques monkeys))에서의 DNA 예방 접종
DNA 예방 접종은, 이전에 기술된 바와 같이, 0주차 및 4주차에서 ZIKV의 키메라 폴리에피토프를 코딩하는 플라스미드 1 ㎎으로의 2회의 근육내 주사들 및 후속하여 4주 후 피하로의 104 pfu ZIKV의 접종에 의한 시도로 수행될 수 있다(Dowd, K.A., et al. Science 2016, 354, 237-240).
PBMC는 0일차(프라이밍 전), 프라이밍 후 7일차, 계속해서 35일차(부스트 후 1주일 후) 및 60일차(ZIKV로의 시도 이전)에 수집되어 전체 키메라 폴리에피토프 시퀀스를 피복하는 중첩 펩티드들에 대한 ELISpot에 의한 T세포 반응(IFN-γ 및 TNF-α)을 분석할 수 있다. 단핵구들 CD14, DC들, T 세포들, B 세포들 및 NK 세포들의 수 및 표현형, 그리고 T 세포들(CD8 T 세포들)의 사이토카인 프로파일을 세포내 염색법(intracellular staining)에 의해 분석될 수 있다.
혈액 샘플들은 또한 0일차(면역화 이전), 14일차, 28일차(부스트 이전) 및 56일차(시도 이전)에 수집되어 포커스 리덕션 중화 적정(Focus Reduction Neutralization Titres: FRNT)에 의한 중화 항체 역가(neutralizing Ab titres)를 결정할 수 있다.
56일차(시도 이전) 부터 66일차까지 매일 qRT-PCR에 의해 바이러스혈증의 정량을 위하여 혈장 샘플들이 시험될 수 있다.
전기 천공을 피하기 위한 유전적 보조제들(genetic adjuvants)로서 사이토카인을 발현하는 플라스미드들로의 DNA 예방 접종을 사용하는 대안의 프로토콜
최근 연구들에서는 IL-12 또는 GM-CSF, 또는 IL-12와 GM-CSF 둘 다의 조합을 발현하는 플라스미드들과 T 세포 에피토프들을 발현하는 플라스미드들의 공동-투여가 T 세포 반응들을 개선하여 전기 천공(EP)의 필요성을 충분히 제거할 수 있는 것으로 나타났다(Boyer, J.D., et al. J Med Primatol 2005, 34, 262-270; Suschak, J.J., et al. The Journal of infectious diseases 2018; Suschak, J.J., et al. Antiviral research 2018, 159, 113-121).
따라서 본 발명자들은 ZIKV 펩티드들에 대한 T 세포 반응의 크기 및 Rhesus 원숭이들에서의 ZIKV 감염에 대한 면역 보호에 대한 폴리-ZIKV DNA 면역화와 결합된 IL-12 및 GM-CSF DNA 면역화의 효과를 평가할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR UNIVERSIDAD EL BOSQUE <120> A ZIKA VIRUS CHIMERIC POLYEPITOPE COMPRISING NON-STRUCTURAL PROTEINS AND ITS USE IN AN IMMUNOGENIC COMPOSITION <130> IP20203826FR <140> PCT/EP2018/xxxxx <141> 2018-11-08 <150> EP17306553.3 <151> 2017-11-09 <160> 124 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-13-27) <400> 1 Ile Val Asn Met Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser Pro Phe 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-13-27) <400> 2 Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer predicted epitope in the C protein of ZIKV (C-13-27) <400> 3 Met Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-85-99) <400> 4 Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn 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<223> 9-mer first predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-163-177) <400> 21 His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer second predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-163-177) <400> 22 Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val 1 5 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-275-289) <400> 23 Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-275-289) <400> 24 Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu 1 5 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS2B protein of ZIKV (NS2B-117-131) <400> 25 Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer predicted epitope in the NS2B protein of ZIKV (NS2B-117-131) <400> 26 Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer predicted epitope in the NS2B protein of ZIKV (NS2B-117-131) <400> 27 Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg 1 5 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-219-233) <400> 28 Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Glu 1 5 10 15 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-219-233) <400> 29 Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer predicted epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-219-233) <400> 30 Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-271-285) <400> 31 Leu Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu 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Artificial sequence <220> <223> 10-mer predicted epitope in the NS4A protein of ZIKV (NS4A-86-100) <400> 37 Ser Ala Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile 1 5 10 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer first predicted epitope in the NS4A protein of ZIKV (NS4A-86-100) <400> 38 Val Thr Leu Gly Ala Ser Ala Trp Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer second predicted epitope in the NS4A protein of ZIKV (NS4A-86-100) <400> 39 Leu Gly Ala Ser Ala Trp Leu Met Trp 1 5 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126) <400> 40 Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly 1 5 10 15 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126) <400> 41 Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr 1 5 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126) <400> 42 Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile 1 5 10 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 8-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126) <400> 43 Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer first predicted epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126) <400> 44 Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer second predicted epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126) <400> 45 Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile 1 5 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-13-27) <400> 46 Lys Ala Arg Leu Asn Gln Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-13-27) <400> 47 Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307) <400> 48 Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His 1 5 10 15 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer first epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307) <400> 49 His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer second epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307) <400> 50 Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 8-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307) <400> 51 Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr 1 5 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311) <400> 52 Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu 1 5 10 15 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer first epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311) <400> 53 Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer second epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311) <400> 54 Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer third epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311) <400> 55 Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr 1 5 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311) <400> 56 Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-345-359) <400> 57 Thr Asp Thr Thr Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys 1 5 10 15 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-345-359) <400> 58 Thr Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe 1 5 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-425-439) <400> 59 Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Lys Glu 1 5 10 15 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-425-439) <400> 60 Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp 1 5 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 13-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-425-439) <400> 61 Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-461-475) <400> 62 Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile 1 5 10 15 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 12-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-461-475) <400> 63 Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile 1 5 10 <210> 64 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<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-565-579) <400> 69 Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr Gln Asn Lys Val Val 1 5 10 15 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-565-579) <400> 70 Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-565-579) <400> 71 Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr 1 5 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-605-619) <400> 72 Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Val Val 1 5 10 15 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-605-619) <400> 73 Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu 1 5 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-605-619) <400> 74 Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu 1 5 10 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-49-63) <400> 75 Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the E protein of ZIKV (E-67-81) <400> 76 Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the E protein of ZIKV (E-87-101) <400> 77 Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-19-33) <400> 78 Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-55-69) <400> 79 Cys Gly Ile Ser 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40 45 Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val 50 55 60 Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu 65 70 75 80 Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala Arg Lys Glu Lys Val Phe Val 85 90 95 Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp 100 105 110 Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Asp Gly 115 120 125 Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg 130 135 140 Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro 165 170 175 Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala 180 185 190 Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn His Arg 195 200 205 Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His 210 215 220 Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp 225 230 235 240 Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala Val His Ser 245 250 255 Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Ile Arg 260 265 270 Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu Thr Ile Phe 275 280 285 Lys Thr Lys Asp Gly Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala 290 295 300 Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly 305 310 315 320 Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly Lys Thr Arg Arg Val 325 330 335 Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu Ala Ile Lys Thr Arg Leu Arg Thr Val 340 345 350 Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Gly Leu Pro Val Arg Tyr Met Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His 370 375 380 Ser Gly Thr Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser 385 390 395 400 Arg Leu Leu Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met 405 410 415 Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr 420 425 430 Ile Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr 435 440 445 Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser Pro 450 455 460 Ile Met 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Val Arg Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu 675 680 685 Lys Glu Trp Lys Thr Ala Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp 690 695 700 Ala Leu Val Asp Lys Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys Gln 705 710 715 720 Ser Cys Val Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu 725 730 735 Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly 740 745 750 Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Arg Phe 755 760 765 Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met Glu Lys Gly His 770 775 780 Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr Gln Asn Lys Val 785 790 795 800 Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys Gly Lys Thr Val Met Asp Ile 805 810 815 Ile Ser Arg Gln Asp Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met Gln Asp 820 825 830 Leu Trp Leu Leu Arg Arg Ser Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp 835 840 845 Glu Glu Val Pro Phe Cys Ser His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys 850 855 860 Asp Gly Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile 865 870 875 880 Gly Arg 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tggtatctgc gggatctcct ctgtttcaag aatggaaaac 420 atcatgtgga gatcagtaga aggggagctc aacgcaatcc tggaagagaa tggagttcaa 480 ctgacggtcg ttgtgggatc tgtaaaaaac cccatgtgga gaggtccaca gagattgccc 540 gtgcctgtga acgagctgcc ccacggctgg aaggcttggg ggaaatcgta cttcgtcaga 600 gcagcaaaga caaataacca tagagcatgg aacagctttc ttgtggagga tcatgggttc 660 ggggtatttc acactagtgt ctggctcaag gttagagaag attattcatt agagtgtgat 720 ccagccgtta ttggaacagc tgttaaggga aaggaggctg tacacagtga tctaggctac 780 tggattgaga gtgagaagaa tgacacatgg attcggtttg aggaatgccc aggcactaag 840 gtccacgtgg aggaaacaat atttaagaca aaggatgggg acattggagc ggttgcgctg 900 gattacccag caggaacttc aggatctcca atcctagaca agtgtgggag agtgatagga 960 ctttatggca atggggtcgt gatcaaaaat gggaaaacca ggagagttct tcctgaaata 1020 gtccgtgaag ccataaaaac aagactccgt actgtgatct tagctccaac cagggttgtc 1080 gctgctgaaa tggaggaagc ccttagaggg cttccagtgc gttatatgac aacagcagtc 1140 aatgtcaccc actctggaac agaaatcgtc gacttaatgt gccatgccac cttcacttca 1200 cgtctactac agccaatcag agtccccaac tataatctgt atattatgga tgaggcccac 1260 ttcacagatc cctcaagtat agcagcaaga ggatacattt caacaagggt tgagatgggc 1320 gaggcggctg ccatcttcat gaccgccacg ccaccaggaa cccgtgacgc atttccggac 1380 tccaactcac caattatgga caccgaagtg gaagtcccac aagctggagt gttgtttggt 1440 atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct aatgataggt 1500 tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct cgtggcgcac 1560 tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca gaagagaacg 1620 gcagctggca tcatgaagaa catcattggt aaccgcattg aaaggatccg cagtgagcac 1680 gcggaaacgt ggttctttga cgagaaccac ccatatagga catgggctta ccatggaagc 1740 tatgaggccc ccacacaagg gtcagcgtcc tctctaataa acggggttgt caggctcctg 1800 tcaaaaccct gggatgtggt gactggagtc acaggaatag ccatgaccga caccacaccg 1860 tatggtcagc aaagagtttt caaggaaaaa gtggacacta gggtgccaga cccccaagaa 1920 ggcactcgtc aggttatgag catggtctct tcctggttgt ggaaagagct aggcaaacac 1980 aaacggccac gagtctgtac caaagaagag ttcatcaaca aggttcgtag caatgcagca 2040 ttaggggcaa tatttgaaga ggaaaaagag 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DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Optimised nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a chimeric polyepitope of ZIKV <400> 101 ggcggcttca gaatcgtgaa catgctgaag cgcggcgtgg ccagagtgtc tccatttggc 60 ggactgaaga gactgcctgc cggactgctt ctcggacacg gccctattag aatggtgctg 120 gccatcctgg cctttctgcg gttcacagcc atcaagccta gcctgggcct gatcaacaga 180 tggggcagcg tgggcaagaa agaagccatg gaaatcatca agaagttcaa gaaagacctg 240 gccgccatgc tgcggatcat caacgcccgg aaagaaaagg tgttcgtgta caacgacgtg 300 gaagcctggc gggacagata caagtatcac cctgacagcc ccagacggct ggccgctgct 360 gtgaaacaag cttgggagga tggcatctgc ggcatcagca gcgtgtcccg gatggaaaac 420 atcatgtggc ggagcgtgga aggcgagctg aacgccattc tggaagagaa cggcgtgcag 480 ctgacagtgg ttgtgggctc cgtgaagaac cctatgtggc ggggacctca gagactcccc 540 gtgcctgtta atgagctgcc tcacggatgg aaggcctggg gcaagagcta ttttgtgcgg 600 gctgccaaga ccaacaacca cagagcctgg aacagcttcc tggtggaaga tcacggcttc 660 ggcgtgttcc acacaagcgt gtggctgaaa gtgcgcgagg actacagcct ggaatgcgac 720 cctgccgtga 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actgcaggcc gctgccgcta gagctgctca gaaaagaaca 1620 gccgccggaa tcatgaagaa catcatcggc aaccggatcg agcggatcag aagcgagcac 1680 gccgagacat ggttcttcga cgagaatcac ccctaccgga cctgggccta ccacggctct 1740 tatgaagctc ctacacaggg cagcgccagc agcctgatta acggcgttgt cagactgctg 1800 agcaagccct gggatgtcgt gacaggcgtg accggaatcg ccatgaccga cacaacacct 1860 tacggccagc agcgggtgtt caaagaaaaa gtggacacca gggtgcccga tcctcaagag 1920 ggcaccagac aagtgatgag catggtgtcc agctggctgt ggaaagagct gggcaagcac 1980 aagaggccca gagtgtgcac caaagaggaa ttcatcaaca aagtgcggag caacgccgct 2040 ctgggcgcca tctttgagga agagaaagaa tggaaaaccg ccgtcgaggc cgtgaacgac 2100 cctagatttt gggccctcgt ggacaaagag agagagcacc acctgagagg cgagtgccag 2160 agctgcgtgt acaatatgat gggcaaacgc gagaaaaagc agggcgagtt cggcaaggcc 2220 aagggcagta gagccatctg gtacatgtgg ctgggagcca gattcctgga attcgaggcc 2280 ctgggcttcc tgaacgagag attcgacctg gaaaatgagg ccctgatcac caaccagatg 2340 gaaaagggac acagagccct ggctctggcc attatcaagt acacctacca gaacaaggtg 2400 gtcaaggtgc tgcggcctgc 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Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a second fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 106 His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val 1 5 10 15 Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu 20 25 30 Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala Val 35 40 45 His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp 50 55 60 <210> 107 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a second fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 107 catagagcat ggaacagctt tcttgtggag gatcatgggt tcggggtatt tcacactagt 60 gtctggctca aggttagaga agattattca ttagagtgtg atccagccgt tattggaaca 120 gctgttaagg gaaaggaggc tgtacacagt gatctaggct actggattga gagtgagaag 180 aatgacacat gg 192 <210> 108 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a third fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 108 Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu Thr 1 5 10 15 <210> 109 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a third fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 109 attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaaca 48 <210> 110 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a fragment of the NS3 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 110 Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 15 Pro Ala Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val 20 25 30 Ile Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly 35 40 45 <210> 111 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a fragment of the NS3 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 111 atatttaaga caaaggatgg ggacattgga gcggttgcgc tggattaccc agcaggaact 60 tcaggatctc caatcctaga caagtgtggg agagtgatag gactttatgg caatggggtc 120 gtgatcaaaa atggg 135 <210> 112 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a second fragment of the NS3 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 112 Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu Ala Ile Lys Thr 1 5 10 15 Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu 20 25 30 Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val Arg Tyr Met Thr Thr Ala 35 40 45 Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His 50 55 60 Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Tyr Ile Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala 100 105 110 Ala Ile Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro 115 120 125 Asp Ser Asn Ser Pro Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro 130 135 140 <210> 113 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a second fragment of the NS3 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 113 aaaaccagga gagttcttcc tgaaatagtc cgtgaagcca taaaaacaag actccgtact 60 gtgatcttag ctccaaccag ggttgtcgct gctgaaatgg aggaagccct tagagggctt 120 ccagtgcgtt atatgacaac agcagtcaat gtcacccact ctggaacaga aatcgtcgac 180 ttaatgtgcc atgccacctt cacttcacgt ctactacagc caatcagagt ccccaactat 240 aatctgtata ttatggatga ggcccacttc acagatccct caagtatagc agcaagagga 300 tacatttcaa caagggttga gatgggcgag gcggctgcca tcttcatgac cgccacgcca 360 ccaggaaccc gtgacgcatt tccggactcc aactcaccaa ttatggacac cgaagtggaa 420 gtccca 426 <210> 114 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a fragment of the NS4B protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 114 Gln Ala Gly Val Leu Phe Gly Met Gly Lys Gly Met Pro Phe Tyr Ala 1 5 10 15 Trp Asp Phe Gly Val Pro Leu Leu Met Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Leu 20 25 30 Thr Pro Leu Thr Leu Ile Val Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr 35 40 45 Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gln 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn 65 70 <210> 115 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a fragment of the NS4B protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 115 caagctggag tgttgtttgg tatgggcaaa gggatgccat tctacgcatg ggactttgga 60 gtcccgctgc taatgatagg ttgctactca caattaacac ccctgaccct aatagtggcc 120 atcattttgc tcgtggcgca ctacatgtac ttgatcccag ggctgcaggc agcagctgcg 180 cgtgctgccc agaagagaac ggcagctggc atcatgaaga ac 222 <210> 116 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 116 Ile Ile Gly Asn Arg Ile Glu Arg Ile Arg Ser Glu His Ala Glu Thr 1 5 10 15 Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly 20 25 30 Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala Ser Ser Leu Ile Asn Gly 35 40 45 Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp Asp Val Val Thr Gly Val Thr 50 55 60 Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe 65 70 75 80 Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg Val Pro Asp Pro Gln Glu Gly Thr Arg 85 90 95 Gln Val Met Ser Met Val Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys 100 105 110 His Lys Arg Pro Arg Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Asn Lys Val 115 120 125 Arg Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu Lys Glu Trp 130 135 140 Lys Thr Ala Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val 145 150 155 160 Asp Lys Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys Gln Ser Cys Val 165 170 175 Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys 180 185 190 Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe 195 200 205 Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu 210 215 <210> 117 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 117 atcattggta accgcattga aaggatccgc agtgagcacg cggaaacgtg gttctttgac 60 gagaaccacc catataggac atgggcttac catggaagct atgaggcccc cacacaaggg 120 tcagcgtcct ctctaataaa cggggttgtc aggctcctgt caaaaccctg ggatgtggtg 180 actggagtca caggaatagc catgaccgac accacaccgt atggtcagca aagagttttc 240 aaggaaaaag tggacactag ggtgccagac ccccaagaag gcactcgtca ggttatgagc 300 atggtctctt cctggttgtg gaaagagcta ggcaaacaca aacggccacg agtctgtacc 360 aaagaagagt tcatcaacaa ggttcgtagc aatgcagcat taggggcaat atttgaagag 420 gaaaaagagt ggaagactgc agtggaagct gtgaacgatc caaggttctg ggctctagtg 480 gacaaggaaa gagagcacca cctgagagga gagtgccaga gttgtgtgta caacatgatg 540 ggaaaaagag aaaagaaaca aggggaattt ggaaaggcca agggcagccg cgccatctgg 600 tatatgtggc taggggctag atttctagag ttcgaagccc ttggattctt gaacgag 657 <210> 118 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a second fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 118 Arg Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met Glu Lys 1 5 10 15 Gly His Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr Gln Asn 20 25 30 Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys Gly Lys Thr Val Met 35 40 45 Asp Ile Ile Ser Arg Gln Asp 50 55 <210> 119 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a second fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 119 aggtttgatc tggagaatga agctctaatc accaaccaaa tggagaaagg gcacagggcc 60 ttggcattgg ccataatcaa gtacacatac caaaacaaag tggtaaaggt ccttagacca 120 gctgaaaaag ggaaaacagt tatggacatt atttcgagac aagac 165 <210> 120 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a third fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 120 Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met Gln Asp Leu Trp Leu Leu Arg 1 5 10 15 Arg Ser <210> 121 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a third fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 121 atggaggctg aggaagttct agagatgcaa gacttgtggc tgctgcggag gtca 54 <210> 122 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of a fourth fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 122 Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp Glu Glu Val Pro Phe Cys Ser 1 5 10 15 His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys Asp Gly Arg Ser Ile Val Val 20 25 30 Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Ala Arg Val Ser Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr 50 55 60 Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu 65 70 75 80 Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ser Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr 85 90 95 Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr 100 105 110 Glu Asp Met Leu Val Val Trp Asn Arg Val Trp 115 120 <210> 123 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a fourth fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV <400> 123 aaaccctcaa ctggatggga caactgggaa gaagttccgt tttgctccca ccacttcaac 60 aagctccatc tcaaggacgg gaggtccatt gtggttccct gccgccacca agatgaactg 120 attggccggg cccgcgtctc tccaggggcg ggatggagca tccgggagac tgcttgccta 180 gcaaaatcat atgcgcaaat gtggcagctc ctttatttcc acagaaggga cctccgactg 240 atggccaatg ccatttgttc atctgtgcca gttgactggg ttccaactgg gagaactacc 300 tggtcaatcc atggaaaggg agaatggatg accactgaag acatgcttgt ggtgtggaac 360 agagtgtgg 369 <210> 124 <211> 2886 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a chimeric epitope of ZIKV <400> 124 ggcggcttcc ggatcgtgaa tatgctgaag agaggcgtgg ccagagtcag cccttttggc 60 ggactgaaaa gactgcctgc cggactgctt ctcggccacg gacctattag aatggtgctg 120 gccatcctgg cctttctgcg gtttacagcc atcaagccta gcctgggcct gatcaataga 180 tggggcagcg tgggcaagaa agaagccatg gaaatcatca agaagttcaa gaaagacctg 240 gccgccatgc tgcggatcat caacgcccgg aaagaaaagg tgttcgtgta caacgacgtc 300 gaggcctggc gggacagata caagtatcac cctgacagcc ctagaaggct ggccgctgct 360 gtgaaacagg cctgggagga tggcatctgt ggcatcagca gcgtgtcccg gatggaaaac 420 atcatgtggc ggagcgtgga aggcgagctg aacgccattc tggaagaaaa cggcgtgcag 480 ctgacagtgg tcgtgggctc cgtgaagaat cctatgtggc gaggacctca gagactgccc 540 gtgcctgtga atgaactgcc tcatggatgg aaggcctggg gcaagagcta ttttgtgcgg 600 gctgccaaga ccaacaacca cagagcctgg aacagcttcc tggtggaaga tcacggcttc 660 ggcgtgttcc acaccagcgt gtggctgaaa gtgcgcgagg attacagcct ggaatgcgat 720 cctgccgtga tcggaacagc cgtgaaggga aaagaagccg tgcacagcga tctcggctac 780 tggatcgaga gcgagaagaa cgacacctgg atcagattcg aggaatgccc cggcaccaag 840 gtgcacgtgg aagagacaat cttcaagacc aaggacggcg acatcggcgc cgtggctctt 900 gattatcctg ccggaacaag cggcagcccc atcctggata agtgtggcag agtgatcggc 960 ctgtacggca acggcgttgt gatcaagaac ggcaagacca gaagagtgct gcccgagatc 1020 gtgcgggaag ccattaagac ccggctgaga acagtgattc tggcccctac aagagtggtg 1080 gccgccgaaa tggaagaagc cctgagaggc ctgcctgtgc ggtacatgac aaccgccgtg 1140 aatgtgacac acagcggcac agagatcgtg gacctgatgt gtcacgccac cttcacctct 1200 agactgctgc agcccatcag agtgcccaac tacaacctgt acatcatgga cgaggcccac 1260 ttcacagacc ccagctctat tgccgccaga ggctacatca gcaccagagt ggaaatgggc 1320 gaagccgccg ctatcttcat gacagccaca cctccaggca ccagggacgc ctttccagac 1380 agcaacagcc ctatcatgga caccgaggtg gaagtgcctc aggctggcgt tctgtttggc 1440 atgggcaagg gcatgccttt ctacgcctgg gattttggcg tgcccctgct gatgatcggc 1500 tgctactctc agctgacccc tctgacactg atcgtggcca ttattctgct ggtggcccac 1560 tacatgtatc tgatccctgg actgcaggcc gctgcagcca gagctgctca aaaaagaaca 1620 gccgccggaa tcatgaagaa catcatcggc aaccggatcg agcggatcag aagcgagcac 1680 gccgagacat ggttcttcga cgagaatcac ccctaccgga catgggccta ccacggatct 1740 tatgaagccc ctacacaggg cagcgccagc agccttatca atggcgttgt gcggctgctg 1800 agcaagccct gggatgttgt tacaggcgtg accggaatcg ccatgaccga tacaacaccc 1860 tacggccagc agcgggtgtt caaagaaaaa gtggacacca gggtgcccga tcctcaagag 1920 ggcacaagac aagtgatgag catggtgtcc agctggctgt ggaaagagct gggcaagcac 1980 aagaggccca gagtgtgcac caaagaggaa ttcatcaaca aagtgcggag caacgccgct 2040 ctgggcgcca tctttgagga agagaaagaa tggaaaactg ccgttgaggc cgtgaacgac 2100 cctagatttt gggccctcgt ggacaaagag agagagcacc atctgagagg cgagtgccag 2160 tcctgcgtgt acaatatgat gggcaaacgc gagaaaaagc agggcgagtt cggcaaggcc 2220 aagggaagca gagccatctg gtatatgtgg ctgggagcca gattcctgga attcgaggcc 2280 ctgggcttcc tgaacgagag attcgacctg gaaaatgagg ccctgatcac caaccagatg 2340 gaaaagggac acagagccct ggctctggcc atcatcaagt acacctacca gaacaaggtg 2400 gtcaaggtgc tgaggccagc cgagaagggc aagactgtga tggacatcat cagccggcag 2460 gacatggaag ccgaagaggt gctggaaatg caggatctgt ggctgctgcg gagaagcaag 2520 ccttccacag gctgggacaa ctgggaagaa gtgcccttct gcagccacca cttcaacaag 2580 ctgcacctga aggacggcag atccatcgtg gtgccttgca gacaccagga cgaactgatc 2640 ggcagagcta gagtttctcc tggcgccgga tggtccatca gagaaacagc ctgtctggcc 2700 aagagctacg cccagatgtg gcagctgctg tacttccaca gacgggacct gagactgatg 2760 gccaatgcca tctgtagcag cgtgccagtg gattgggtgc caaccggcag aaccacatgg 2820 tctatccacg gcaaaggcga gtggatgacc accgaggata tgctggtcgt gtggaataga 2880 gtttgg 2886

Claims (24)

  1. (i) 적어도 하기 (a) 및 (b)의 T-세포 에피토프들, 또는 (ii) 적어도 하기 (a) 및 (c)의 T-세포 에피토프들, 또는 (iii) 적어도 하기 (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들을 포함하는, 키메라 폴리에피토프:
    (a) 시퀀스 동정 번호: 10-12, 14, 15, 17-19, 23, 24 및 78-83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 지카 바이러스(ZIKV)의 비-구조(NS) NS1 단백질의 T-세포 에피토프,
    (b) 시퀀스 동정 번호: 28, 29, 31, 33-35, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS3 단백질의 T-세포 에피토프,
    (c) 시퀀스 동정 번호: 46, 48-50, 52-55, 57-60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 및 86-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS5 단백질의 T-세포 에피토프,
    또는 이들의 T-세포 에피토프 변종,
    상기 T-세포 에피토프 변종은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 점 돌연변이에 의해 (a), (b) 또는 (c)의 T-세포 에피토프의 원래 아미노산 시퀀스와 상이하고 상기 원래 시퀀스와 적어도 90% 시퀀스 동일성 또는 95% 이상 시퀀스 동일성 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖음.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 (a), (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들, 또는 이들의 T-세포 변종을 포함하는, 키메라 폴리에피토프.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (i) (a) 및 (b)의 T-세포 에피토프들, 또는 (ii) (a) 및 (c)의 T-세포 에피토프들, 또는 (iii) (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들, 또는 (iv) (a), (b) 및 (c)의 T-세포 에피토프들, 또는 이들의 T-세포 에피토프 변종으로 이루어지는, 키메라 폴리에피토프.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, (a)의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 17, 23 및 78-83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, (b)의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 31, 33, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, 그리고 (c)의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 및 86-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는, 키메라 폴리에피토프.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, (a)의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 11, 12, 17-19, 23, 24, 78, 80 및 83들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, (b)의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 28, 31, 33, 34, 84 및 85들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지고, 및 (c)의 T-세포 에피토프가 시퀀스 동정 번호: 48-50, 52-55, 57, 58, 60, 62, 67, 88, 89 및 90들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는, 키메라 폴리에피토프.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (i) 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 4-6 및 75들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 C 단백질의 T-세포 에피토프,
    (ii) 시퀀스 동정 번호: 7, 76 및 77들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 E 단백질의 T-세포 에피토프,
    (iii) 시퀀스 동정 번호: 25의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS2B 단백질의 T-세포 에피토프,
    (iv) 시퀀스 동정 번호: 36의 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4A 단백질의 T-세포 에피토프, 및
    (v) 시퀀스 동정 번호: 40-43으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프,
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ZIKV 단백질의 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 추가로 포함하는, 키메라 폴리에피토프.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ZIKV 단백질의 적어도 하나의 T-세포 에피토프가:
    - 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 4-6 및 75들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 C 단백질의 T-세포 에피토프, 및
    - 시퀀스 동정 번호: 40-43들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV의 NS4B 단백질의 T-세포 에피토프,
    로 이루어지는 군으로부너 선택되는, 키메라 폴리에피토프.
  8. 제7항에 있어서, 시퀀스 동정 번호: 99의 아미노산 시퀀스를 갖는, 키메라 폴리에피토프.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 인간 대상체에서 ZIKV 감염의 예방에 사용하기 위한 또는 (ii) 인간 대상체에서 ZIKV 및 뎅기열 바이러스(DENV) 감염들의 예방에 사용하기 위한, 키메라 폴리에피토프.
  10. 제9항에 있어서, T-세포 에피토프들이 시퀀스 동정 번호: 1, 2, 5, 10, 11, 19, 27, 31, 40-43, 46, 72, 73, 75, 78-80, 82, 84, 85, 87 및 91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV-특이적 에피토프들인, 인간 대상체에서 ZIKV 감염의 예방에 사용하기 위한 키메라 폴리에피토프.
  11. 제9항에 있어서, T-세포 에피토프들이 시퀀스 동정 번호: 1, 5, 6, 12, 14, 15, 17-19, 23, 24, 27, 28, 33-35, 40, 41, 46, 48-50, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73, 84, 85 및 86-91들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이로 이루어지는 ZIKV-DENV 교차-반응성 에피토프들인, 인간 대상체에서 ZIKV 및 DENV 감염의 예방에 사용하기 위한 키메라 폴리에피토프.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) ZIKV에 대한 또는 (ii) ZIKV 및 DENV, 특히 DENV 혈청형 1(DENV1), DENV 혈청형 2(DENV2), DENV 혈청형 3(DENV3) 및 DENV 혈청형 4(DENV4)에 대한 인간 백혈구 항원(HLA)-제한 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포 반응을 이끌어내는, 키메라 폴리에피토프.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, T-세포 에피토프들이 융합 폴리펩티드로 조립되는(assembled), 키메라 폴리에피토프.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 ZIKV가 아프리카 계통에서, 특히 아프리카 균주 ArD158084(GenBank: KF383119)나 아프리카 균주 ArD128000(GenBank: KF383117)에서, 또는 아프리카 단리물(African isolate) ARB13565(GenBank: KF268948), 또는 아시아 계통에서, 특히 아시아 균주 FLR(GenBank: KX087102)에서, 또는 아시아 단리물 SSABR1(GenBank: KU707826), 또는 아시아 단리물 Z1106031(GenBank: KU312314), 또는 아시아 단리물 Bahia07(GenBank: KU940228), 또는 아시아 균주 FVM00318/VEN/Maracay/2016(GenBank: KY693680), 또는 아시아 단리물 FLR(GenBank: KU820897)에서 유래하는 것인, 키메라 폴리에피토프.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 키메라 폴리에피토프를 인코딩하는 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드.
  16. 폴리에피토프를 수반하는 재조합 분자이거나 또는 폴리에피토프를 발현하는 바이러스성 또는 포유동물 발현 벡터인, 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 키메라 폴리에피토프를 전달하기에 적절한, 벡터, 특히 비-자가복제 벡터.
  17. 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  18. 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 또는 제17항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 조류 세포, 특히 CEF(병아리 배아 섬유아세포) 세포, 포유동물 세포, 특히 HEK-293(인간 배아 신장) 세포들 또는 효모 세포와 같은 진핵 세포인, 숙주 세포.
  20. (i) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리에피토프,
    (ii) 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드,
    (iii) 제16항 또는 제17항에 따른 벡터, 및
    (iv) 제18항 또는 제19항에 따른 숙주 세포,
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는, 면역원성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 보조제(adjuvant) 및/또는 약제학적으로 수용가능한 비히클을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 조성물이 피하(s.c.), 피내(i.d.), 근육내(i.m.), 복강내(i.p.) 또는 정맥내(i.v.) 주사 등과 같은 비경구적 경로를 통한 투여를 위하여 제형화되는, 면역원성 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 단일 또는 다중 투여 용량(들), 특히 프라임-부스트 투여 요법으로 투여되는, 면역원성 조성물.
  24. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 인간 대상체에서 ZIKV 감염의 예방에의 사용을 위한, 또는 (ii) 인간 대상체에서 ZIKV 및 뎅기열 바이러스(DENV) 감염들의 예방에의 사용을 위한, 면역원성 조성물.
KR1020207016579A 2017-11-09 2018-11-08 비-구조 단백질들을 포함하는 지카 바이러스 키메라 폴리에피토프 및 이의 면역원성 조성물로의 용도 KR20200090186A (ko)

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