BR112020009157A2

BR112020009157A2 - poliepítopo quimérico, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira e composição imunogênica

Info

Publication number: BR112020009157A2
Application number: BR112020009157-0A
Authority: BR
Inventors: Claude Roth; Etienne Simon-Loriere; Anavaj Sakuntabhai; Felix DELGADO
Original assignee: Institut Pasteur; Universidad El Bosque
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-10-27
Also published as: US11305003B2; CA3079776A1; AU2018365296A1; MX2020004833A; JP2021502115A; KR20200090186A; CN111683959A; US11872276B2; PH12020550569A1; US20220233678A1; US20200282043A1; EP3707154A1; AU2018365296B2; JP7225254B2; SG11202004234SA; WO2019092142A1

Abstract

  A presente invenção é direcionada a um poliepítopo quimérico do vírus Zika (ZIKV) compreendendo proteínas não estruturais e ao seu uso em uma composição imunogênica. A presente invenção fornece meios, particularmente polinucleotídeos, vetores e células que expressam o referido poliepítopo quimérico. A presente invenção também trata de uma composição ou vacina compreendendo pelo menos um dos referidos poliepítopos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano, ou para uso na prevenção de infecções por ZIKV e vírus da dengue (DENV) em um sujeito humano.

Description

“POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA E COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA”

[001] A presente invenção é direcionada a um poliepítopo quimérico do vírus Zika (ZIKV) compreendendo proteínas não estruturais e ao seu uso em uma composição imunogênica. A presente invenção fornece meios, particularmente polinucleotídeos, vetores e células que expressam o referido poliepítopo quimérico. A presente invenção também trata de uma composição ou vacina compreendendo pelo menos um dos referidos poliepítopos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano, ou para uso na prevenção de infecções por ZIKV e vírus da dengue (DENV) em um sujeito humano.

[002] O vírus Zika (ZIKV) é um flavivírus transmitido por mosquitos da espécie Aedes. Ele é um vírus RNA de fita simples positiva, intimamente relacionado ao vírus da febre amarela, vírus da dengue (DENV) e vírus do Nilo Ocidental (Kuno G. et al., 1998, J Virol. 72 (1): 73-83). O vírus Zika foi inicialmente isolado na floresta Zika em Uganda em 1947 (Dick G.W. et al., 1952, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 46 (5): 509-520), causando um surto explosivo pela primeira vez em Yap Island, Estados Federados da Micronésia (Duffy MR, et al. 2009, The New England journal of medicine 360(24):2536-2543). Os surtos subsequentes com maior número de casos ocorreram entre 2013-2014 na Polinésia Francesa e em outras ilhas do Pacífico Sul e mais recentemente nas Américas (Cao- Lormeau VM, et al. 2014, Emerging infectious diseases 20(6):1085-1086; Campos GS, et al. 2015, Emerging infectious diseases 21(10):1885-1886; Dupont-Rouzeyrol M, et al. 2015, Emerging infectious diseases 21(2):381-382; Zanluca C, et al. 2015, Mem Inst Oswaldo Cruz 110(4):569-572; Pacheco O, et al. 2016, Zika Virus Disease in Colombia - Preliminary Report. The New

England journal of medicine). Embora se acredite que o vírus Zika inicialmente cause apenas uma doença leve e autolimitada, uma relação causal entre o ZIKV e complicações neurológicas, como a síndrome de Guillain-Barré ou malformações congênitas, foi estabelecida apenas recentemente com os surtos de 2013 e 2015 na Polinésia Francesa e no Brasil (Oehler E, et al. 2014 Euro Surveill 19(9); Cao-Lormeau VM, et al. 2016, Lancet 387(10027):1531-1539; Cauchemez S, et al. 2016, Lancet 387 (10033): 2125-2132; Soares de Araujo JS, et al. 2016, Bull World Health Organ 94(11):835-840).

[003] Além de uma maior infecciosidade da linhagem asiática do ZIKV devido a uma mutação espontânea no NS1 (Liu Y, et al. 2017, Nature 545 (7655): 482-486), o que poderia explicar seu recente ressurgimento nas Américas (Enfissi A et al., Lancet 387 (10015): 227-228), uma das preocupações mais importantes hoje está relacionada ao alto nível de soroprevalência de DENV em áreas onde o ZIKV está circulando (Katzelnick LC, et al., The Lancet, Infectious diseases 17 (3): e88-e100). De fato, estudos recentes mostraram que anticorpos anti-DENV pré-existentes podem potencializar a infecção por ZIKV e aumentar a gravidade da doença (Dejnirattisai W, et al. 2016 Nat Immunol 17(9):1102-1108; Stettler K, et al.

2016 Science 353(6301):823-826; Paul LM, et al. 2016 Dengue Virus Antibodies Enhance Zika Virus Infection. BioRxiv ; Priyamvada L, et al. 2016, Proc Natl Acad Sci U S A 113(28):7852-7857; Bardina SV, et al. 2017, Science 356(6334):175-180). Dadas essas restrições e a falta de tratamento adequado para a infecção pelo ZIKV, há uma necessidade urgente de desenvolver uma vacina contra essa doença infecciosa.

[004] Embora os anticorpos contra a proteína E do DENV ou ZIKV tenham demonstrado ser altamente reativos, as células T podem ser reativas ou não, dependendo dos peptídeos visados. De fato, foi observado um baixo grau de reatividade cruzada de células T CD4 entre DENV e ZIKV em doadores humanos imunes a um desses vírus (Stettler K, et al. 2016, Science 353 (6301): 823-826), enquanto a reatividade cruzada DENV/ZIKV e células T CD8 protetoras foram identificadas em camundongos imunes ao DENV após desafio com o ZIKV (Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2: 17036). Considerando a identidade de sequência entre DENV e ZIKV para as proteínas estruturais do capsídeo e do invólucro e as proteínas não estruturais NS3 e NS5, que representam os principais alvos das células T CD4 e CD8 específicas para DENV, respectivamente, e o papel protetor das células T DENV-específicas (Weiskopf D et al., Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110(22):E2046-2053; Weiskopf D et al., Proc Natl Acad Sci USA 2015, 112(31):E4256-4263, Rivino L & Lim MQ, 2016, Immunology 150(2):146-154), os esforços estão atualmente direcionados para o mapeamento de epítopos de células T com o intuito de projetar vacinas novas e mais eficazes contra o ZIKV. Foram realizadas predições de antígenos de células T modelando possíveis epítopos que poderiam se ligar a diferentes alelos HLA classe I ou classe II, do proteoma do ZIKV e analisando respostas ex vivo de células T em camundongos transgênicos que expressam moléculas HLA-B*0702 e HLA-A*0101 humanas (Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2: 17036, 23-25). Surpreendentemente, as células T com reatividade cruzada DENV/ZIKV foram identificadas nesses camundongos imunes para DENV, o que poderia mediar a proteção contra a infecção por ZIKV (Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036, 23-25). Este resultado está de acordo com estudos concomitantes que demonstram um papel protetor de células T CD8+ na proteção imunológica contra o ZIKV em camundongos (Elong Ngono A, et al. 2017, Cell host & microbe 21 (1): 35-46).

Entretanto, embora esses estudos tenham demonstrado um papel protetor de células T CD8+ contra a infecção por ZIKV em camundongos, e embora vários peptídeos derivados de ZIKV tenham sido identificados em doadores não expostos ao DENV e pré-expostos ao DENV (Grifoni A, et al. 2017, J. Virol.

DOI: 10.1128 / JVI. 01469-17, publicado on-line em 4 de outubro de 2017), a identificação precisa dos epítopos de células T humanas que são exclusivos do ZIKV ou compartilhados com o DENV ainda está incompleta. No presente estudo, os inventores identificaram estes epítopos a partir de doadores de sangue com um histórico de infecção apenas por ZIKV ou de infecções por DENV e ZIKV.

[005] Utilizando PBMCs a partir de doadores de sangue colombianos com infecção anterior por ZIKV, os inventores estabeleceram o primeiro mapa de distribuição de epítopos de células T de ZIKV, por quantificação de respostas IFNγ ex vivo contra peptídeos abrangendo toda a sequência proteômica de ZIKV por ensaio ELISPOT. A medição da magnitude das respostas das células T (mediadas por células T CD4 e/ou CD8) contra esses peptídeos permitiu a identificação de epítopos imunodominantes que induzem respostas fortes em doadores portadores de alelos HLA específicos.

Mais especificamente, os inventores mostram que proteínas estruturais C e E e as proteínas não estruturais (NS) NS1, NS3, NS4B e NS5, em particular, as proteínas não estruturais NS1, NS3 e NS5, contêm a maior parte dos epítopos imunodominantes que induzem uma forte resposta de células T. Em doadores com histórico de infecção por DENV, as respostas mais fortes das células T foram direcionadas contra peptídeos com alto nível de identidade de aminoácidos com os quatro sorotipos de DENV e alguns com epítopos de células T CD8+ DENV descritos anteriormente, sugerindo a ativação de células T com reatividade cruzada. Os resultados dos inventores fornecem novas perspectivas sobre as respostas de células T contra ZIKV e identificou pela primeira vez em indivíduos imunes, epítopos de células T que pode ser utilizado para futuras vacinas candidatas para ZIKV e DENV.

[006] A invenção refere-se, assim, a um poliepítopo quimérico compreendendo (i) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (a) e (b),

ou (ii) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (a) e (c), ou (iii) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (b) e (c): (a) um epítopo de células T da proteína não estrutural (NS) NS1 de um vírus Zika (ZIKV) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10-12, 14, 15, 17-19, 23, 24 e 78-83, (b) um epítopo de células T da proteína NS3 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 33-35, 84 e 85, (c) um epítopo de células T da proteína NS5 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48-50, 52-55, 57-60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 e 86-91, ou um epítopo de células T variante, que difere da sequência de aminoácidos original do epítopo de células T de (a), (b) ou (c) por mutação pontual em um ou mais resíduos de aminoácidos, e que possui pelo menos 90% de identidade de sequência ou mais de 95% de identidade de sequência ou 99% de identidade de sequência com a referida sequência original.

[007] Em um exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo quimérico compreende (i) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (a) e (b); ou (ii) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (a) e (c); ou (iii) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (b) e (c): (a) um epítopo de células T da proteína NS1 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10-12, 14, 15, 17- 19, 23, 24 e 78-83, (b) um epítopo de células T da proteína NS3 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28, 31, 33-35, 84 e 85, (c) um epítopo de células T da proteína NS5 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 e 86, 87, 89-91, ou um epítopo de células T variante, que difere da sequência de aminoácidos original do epítopo de células T de (a), (b) ou (c) por mutação pontual em um ou mais resíduos de aminoácidos, e que possui pelo menos 90% de identidade de sequência ou mais de 95% de identidade de sequência ou 99% de identidade de sequência com a referida sequência original.

[008] Tal como definido na presente invenção, o termo “poliepítopo” refere-se a uma molécula quimérica ou recombinante, em particular um polipeptídeo quimérico ou recombinante com pelo menos dois, em particular, pelo menos, três, de preferência pelo menos 5, e mais de preferência 10 ou mais do que 10, ou 15 ou mais do que 15 epítopos de células T identificados em proteínas ZIKV, com exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total (completas), e em particular em proteínas não estruturais NS1, NS3 ou NS5 do ZIKV, com exceção das proteínas NS1, NS3 ou NS5 de ZIKV nativas ou de comprimento total.

[009] Conforme definido na presente invenção, um “epítopo” é um peptídeo ou polipeptídeo que é um determinante antigênico, ou seja, o sítio peptídico reconhecido pelas células do sistema imune (células imunológicas) e, especialmente, o sítio necessário para estimular uma resposta imune. O termo epítopo abrange tanto um epítopo linear para que os aminoácidos consecutivos (a partir de 9 a 15, em particular, 8, 9, 10 ou 15, mais preferivelmente 9 ou 15) sejam reconhecidos por células do sistema imunológico, como um epítopo conformacional do qual as células imunes reconhecem aminoácidos na medida em que adotam uma configuração ou conformação adequada.

Consequentemente, em alguns epítopos, a conformação (estrutura tridimensional) é tão importante quanto a sequência de aminoácidos (estrutura primária).

[010] Conforme definido na presente invenção, um “epítopo de células T” é qualquer peptídeo ou polipeptídeo envolvido na indução de uma resposta imune de células T contra um ZIKV, ou ZIKV e DENV, em particular contra qualquer um dentre DENV1, DENV2, DENV3, DENV4 ou contra múltiplos, em particular todos os sorotipos de DENV. Em particular, o referido epítopo de células T é reconhecido em associação com moléculas do MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade) de classe I, tais como epítopos que são alvos de células T CD8+ ou epítopos reconhecidos em associação com moléculas MHC classe II, como epítopos que são alvos de linfócitos T CD4 +.

[011] Conforme definido na presente invenção, os termos “variante” ou “variante do mesmo” referem-se a um epítopo de células T que difere a partir da sequência de aminoácidos original do epítopo de células T de (a), (b) ou (c) por mutação pontual em um ou mais resíduos de aminoácidos, particularmente em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos, e que possui pelo menos 90% de identidade de sequência ou mais de 95% de identidade de sequência ou 99% de identidade de sequência com a referida sequência original. A(s) mutaçõa(ões) que define(m) a variante do epítopo de células T pode(m) ser deleção(ões), incluindo especialmente a(s) deleção(ões) pontual(ais) de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de aminoácidos; ou pode(m) ser substituição(ões), especialmente substituição(ões) conservadora(s) de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de aminoácidos. A referida forma variante do epítopo de células T pode ter uma sequência de aminoácidos que tem o mesmo comprimento que a sequência de aminoácidos original do epítopo de células T de (a), (b) ou (c).

[012] Conforme definido, o termo “poliepítopo quimérico” significa qualquer polipeptídeo poliepitópico compreendendo subporções ou fragmentos de diferentes proteínas ZIKV, em particular diferentes proteínas NS de ZIKV, de preferência diferentes proteínas NS de ZIKV selecionadas dentre as proteínas NS1, NS3 e NS5. O referido poliepítopo quimérico não compreende proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total, em particular não compreende proteínas NS ZIKV nativas ou de comprimento total, preferencialmente não compreende proteínas NS ZIKV nativas ou de comprimento total, selecionadas dentre as proteínas NS1, NS3 e NS5.

[013] Em um exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo quimérico compreende menos de 30 epítopos de células T ZIKV, em particular menos de 25 epítopos de células T ZIKV, de preferência menos de 20 epítopos de células T ZIKV.

[014] Em um exemplo de realização específico da invenção, as sequências de aminoácidos dos epítopos de células T de uma proteína ZIKV tomadas como um todo são diferentes das sequências de aminoácidos de qualquer outro epítopo de outra proteína ZIKV, em particular qualquer outro epítopo de células T ZIKV de outra proteína ZIKV.

[015] Em outro exemplo de realização específico da invenção, as sequências de aminoácidos dos epítopos das células T de ZIKV podem diferir em um ou mais aminoácidos a partir das sequências de aminoácidos de outros epítopos, em particular outros epítopos de células T do ZIKV e/ou podem possuir sequências sobrepostas e, portanto, compartilham alguns aminoácidos.

[016] O poliepítopo quimérico da invenção compreende pelo menos epítopos de células T das proteínas NS1 e NS3 de um ZIKV, ou pelo menos epítopos de células T das proteínas NS1 e NS5 de um ZIKV, ou pelo menos epítopos de células T das proteínas NS3 e NS5 de um ZIKV, com exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total.

Preferencialmente, o poliepítopo quimérico da invenção consiste em epítopos de células T das proteínas NS1 e NS3 de um ZIKV, ou epítopos de células T das proteínas NS1 e NS5 de um ZIKV ou epítopos de células T das proteínas NS3 e NS5 de um ZIKV, com exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total.

[017] Em um exemplo de realização preferido da invenção, os poliepítopos quiméricos compreendem no mínimo, os epítopos de células T das proteínas NS1, NS3 e NS5 de um ZIKV, com a exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total.

[018] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, os poliepítopos quiméricos consistem em epítopos de células T das proteínas NS1, NS3 e NS5 de um ZIKV, com a exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total.

[019] Em um exemplo de realização específico da invenção, os poliepítopos quiméricos compreendem subporções ou fragmentos de diferentes poliepítopos a partir da mesma proteína ZIKV, em particular uma proteína NS de ZIKV, de preferência uma proteína NS1, NS3 ou NS5 de ZIKV, ou mesmo a partir dos mesmos poliepítopos de diferentes proteínas ZIKV, em particular proteínas NS de ZIKV, de preferência proteínas NS1, NS3 e NS5 de ZIKV. O poliepítopo da invenção inclui o poliepítopo variante. Consequentemente, cada definição ou exemplo de realização aqui divulgado aplica-se ao poliepítopo variante, a menos que seja tecnicamente irrelevante.

[020] Conforme definido na presente invenção, o termo “fragmento” refere-se a uma parte ou porção de uma proteína ZIKV, de preferência de uma proteína NS (ou seja, proteína NS1, NS3 ou NS5) de um ZIKV, que é mais curta que a proteína, preferencialmente a proteína NS (ou seja, proteína NS1, NS3 ou NS5), da qual o fragmento se origina. Cada fragmento pode compreender uma pluralidade de epítopos adequados para obter uma resposta imune, especialmente uma resposta imune de células T contra uma infecção por ZIKV ou contra infecções por ZIKV e DENV. Cada fragmento corresponde a uma sequência de aminoácidos consecutivos.

[021] Em um exemplo de realização preferido da invenção, o poliepítopo quimérico compreende pelo menos os epítopos de células T de (a), (b) e (c) como definido acima, ou o epítopo de células T variante.

[022] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, o poliepítopo quimérico consiste em (i) epítopos de células T de (a) e (b) conforme definido acima, ou (ii) os epítopos de células T de (a) e (c) como definido acima, ou (iii) os epítopos de células T de (b) e (c) conforme definidos acima, ou (iv) os epítopos de células T de (a), (b) e (c) conforme definidos acima, ou as formas variantes de epítopo de células T.

[023] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, o epítopo de células T de (a) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17, 23 e 78-83, o epítopo de células T de (b) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31, 33, 84 e 85, e o epítopo de células T de (c) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 e 86-91, de preferência nas SEQ ID NOs: 46, 52, 57, 62, 64, 67, 86, 87 e 89-91. Cada uma das sequências do referido epítopo de células T contém 15 resíduos de aminoácidos, ou seja, é um epítopo de 15-mer que induz individualmente e/ou coletivamente uma resposta imune de células T. Cada um desses epítopos de 15-mer inclui individual e/ou coletivamente pelo menos um epítopo de 9-mer que também induz uma resposta imune de células T. Por exemplo, a sequência do epítopo de 15-mer na proteína NS1 de ZIKV (NS1 163-177) de SEQ ID NO:

17 (FHTSVWLKVREDYSL) inclui a sequência do epítopo de 9-mer de SEQ ID NO: 18 (VWLKVREDY) e a sequência do epítopo de 9-mer de SEQ ID NO: 19 (WLKVREDYS). Isto sugere que os epítopos de 15-mer mencionados acima compreendem pelo menos um epítopo de 9-mer, mas também podem compreender outros epítopos de 9-mer ou mais.

[024] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, o epítopo de células T de (a) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 11, 12, 17-19, 23, 24, 78, 80 e 83, o epítopo de células T de (b) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 31, 33, 34, 84 e 85, e o epítopo de células T de (c) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 448-50, 52-55, 57, 58, 60, 62, 67, 88, 89 e 90, de preferência, de SEQ ID NOs: 52-55, 57, 60, 62, 67, 89 e 90.

[025] Em outro exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo quimérico compreende ainda pelo menos um epítopo de células T de uma proteína ZIKV selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) um epítopo de células T da proteína de cápside (C) de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4-6 e 75; (ii) um epítopo de células T da proteína E de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 76 e 77; (iii) um epítopo de células T da proteína NS2B de um ZIKV compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (iv) um epítopo de células T da proteína NS4A de um ZIKV compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, e;

(v) um epítopo de células T da proteína NS4B de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 40-43.

[026] Em um exemplo de realização preferido da invenção, o poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T de pelo menos 2, preferencialmente pelo menos 3 ou 4, mais preferencialmente pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 proteínas de ZIKV diferentes.

[027] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, o poliepítopo quimérico compreende ainda um epítopo de células T da proteína C de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4-6 e 75, e um epítopo de células T da proteína NS4B de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 40-43.

[028] Assim, o poliepítopo quimérico compreende pelo menos os epítopos de células T das proteínas C, NS1, NS3, NS4B e NS5 de um ZIKV, com a exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total. De modo particular, o poliepítopo quimérico compreende pelo menos os seguintes epítopos de células T: (i) um epítopo de células T da proteína de cápside (C) de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4-6 e 75, preferencialmente nas SEQ ID NOs: 1, 4 e 75; (ii) um epítopo de células T da proteína NS1 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10-12, 14, 15, 17- 19, 23, 24 e 78-83, preferencialmente nas SEQ ID NOs: 17, 23 e 78-83; (iii) um epítopo de células T da proteína de NS3 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 33-35, 84 e 85, preferencialmente nas SEQ ID NOs: 28, 31, 33-35, 84 e 85, e mais preferencialmente nas SEQ ID NOs: 31, 33, 84 e 85; (iv) um epítopo de células T da proteína NS4B de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 40-43; (v) um epítopo de células T da proteína NS5 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48-50, 52-55, 57-60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 e 86-91, de preferência de SEQ ID NOs: 46, 52- 55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 e 86, 87 e 89 -91, ou compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 e 86-91, preferencialmente nas SEQ ID NOs: 46, 52, 57, 62, 64, 67, 86, 87 e 89-91, ou um epítopo de células T variante, que difere da sequência de aminoácidos original do epítopo de células T do item (i), (ii), (iii), (iv) ou (v) por mutação pontual em um ou mais resíduos de aminoácidos, e que possui pelo menos 90% de identidade de sequência ou mais de 95% de identidade de sequência ou 99% de identidade de sequência com a referida sequência original.

[029] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, no poliepítopo quimérico mencionado acima: (i) o epítopo de células T da proteína C de um ZIKV compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 6 e 75; (ii) o epítopo de células T da proteína NS1 de um ZIKV compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12,

17-19, 23, 24, 78, 80 e 83; (iii) o epítopo de células T da proteína NS3 de um ZIKV compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, 31, 33, 34, 84 e 85; (iv) o epítopo de células T da proteína NS4B de um ZIKV compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e 41; e (v) o epítopo de células T da proteína NS5 de um ZIKV compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48-50, 52-55, 57, 58, 60, 62, 67, 88, 89 e 90, preferencialmente na sequência de SEQ ID NOs: 52-55, 57, 60, 62, 67, 89 e 90.

[030] Em outro exemplo de realização preferido da invenção, os poliepítopos quiméricos consistem em epítopos de células T das proteínas C, NS1, NS3, NS4B e NS5 de um ZIKV, com a exceção das proteínas ZIKV nativas ou de comprimento total.

[031] Todas as definições direcionadas às proteínas NS1, NS3 e NS5 de um ZIKV mencionadas acima também se aplicam a outras proteínas de ZIKV, em particular às proteínas C, E, NS1, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 de um ZIKV.

[032] Em um exemplo de realização preferido da invenção, o poliepítopo quimérico é (i) para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano ou (ii) para uso na prevenção de infecções por ZIKV e vírus da dengue (DENV) em um sujeito humano.

[033] Conforme definido na presente invenção, o termo “prevenção” refere-se a prevenções primárias, secundárias e terciárias. A prevenção de uma infecção por ZIKV ou infecções por ZIKV e DENV significa que a(s) infecção(ões) e os fatores de risco associados são minimizados, ou seja, são obstruídos ou atrasados. Em particular, as referidas infecções podem ser prevenidas antes que ocorram ou podem ser identificadas em um estágio inicial, para que os sintomas das referidas infecções possam ser reduzidos.

[034] Em um exemplo de realização mais preferido da invenção, quando o poliepítopo é usado na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano, os epítopos de células T são epítopos específicos para ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 10, 11, 19, 27, 31, 40-43, 46, 72, 73, 75, 78-80, 82, 84, 85, 87 e 91.

[035] Em outro exemplo de realização mais preferido da invenção, quando o poliepítopo é usado na prevenção de uma infecção por ZIKV e DENV em um sujeito humano, os epítopos de células T são epítopos de reatividade cruzada ZIKV-DENV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 12, 14, 15, 17-19, 23, 24, 27, 28, 33-35, 40, 41, 46, 48-50, 52- 55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73, 84, 85 e 86-91, preferencialmente SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 12, 14, 15, 17-19, 23, 24, 27, 28, 33-35, 40, 41, 46, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73, 84, 85, 86, 87 e 89-91.

[036] Deve-se notar que os epítopos de células T compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 5, 19, 27, 40, 41, 46, 72, 73, 84, 85, 87 e 91 são capazes de induzir uma resposta imune de células T em doadores ZIKV e doadores DENV/ZIKV.

[037] Uma lista não exaustiva de epítopos de células T de ZIKV, em particular epítopos de células T específicos de ZIKV e/ou epítopos de células T de reatividade cruzadas ZIKV-DENV, é fornecida nas Tabelas 2 e 3 abaixo. Os referidos epítopos de células T de ZIKV compreendem sequências de aminoácidos definidas como SEQ ID NOs: 1-91.

[038] Em um exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo quimérico compreende epítopos restritos ao antígeno leucocitário humano (HLA). A expressão “restrito ao HLA” designa a capacidade de um epítopo específico ter afinidade por este tipo de molécula HLA. As moléculas de HLA utilizadas no presente invenção englobam moléculas da classe I (denominadas HLA-A, B ou C) ou moléculas da classe II (denominadas DRB).

[039] Em outro exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo quimérico suscita uma resposta de células T CD8 + e/ou CD4+ restrita ao antígeno leucocitário humano (HLA) (i) contra ZIKV ou (ii) contra ZIKV e DENV, em particular o DENV sorotipo 1 (DENV1), DENV sorotipo 2 (DENV2), DENV sorotipo 3 (DENV3) e DENV sorotipo 4 (DENV4), preferencialmente contra DENV sorotipo 1 (DENV1).

[040] Sequências nucleotídicas completas dos genomas de referência dos 4 sorotipos do vírus da dengue podem ser acessadas no banco de dados Genbank sob os números de acesso NC_001477.1, NC_001474.2, NC_001475.2 e NC_002640.1, respectivamente.

[041] Em um exemplo de realização específico da invenção, o referido DENV é das seguintes cepas: GenBank KDH0026A (DENV1), GenBank R0712259 (DENV2), GenBank KDH0010A (DENV3) e GenBank CRBIP10.4VIMFH4 (DENV4).

[042] Em um exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo suscita respostas antigênicas com restrição HLA, como HLA- A*0201, HLA-A*2402, HLA-B*0702, HLA-B*3501, HLA-B*4002, de preferência HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-B*0702 e HLA-B*3501.

[043] Em um exemplo de realização específico da invenção, (i) pelo menos epítopos de células T das proteínas NS1 e NS3 de um ZIKV, ou (ii) pelo menos epítopos de células T das proteínas NS1 e NS5 de um ZIKV, ou (iii) pelo menos epítopos de células T das proteínas NS3 e NS5 de um ZIKV, ou (iv) pelo menos epítopos de células T das proteínas NS1, NS3 e NS5 de um

ZIKV ou (v) pelo menos epítopos de células T das proteínas C, NS1, NS3, NS4B e NS5 de um ZIKV, com a exceção de proteínas de ZIKV nativas ou de comprimento total, são montados em um único polipeptídeo, de preferência em um polipeptídeo de fusão. Preferencialmente, os epítopos de células T definidos acima são montados em um polipeptídeo de fusão.

[044] Os referidos epítopos de células T podem ser direta ou indiretamente fundidos entre si.

[045] De acordo com um exemplo de realização específico da invenção, um epítopo de células T é fundido “diretamente” com outro epítopo de células T, ou seja, a extremidade 3' do epítopo de células T está diretamente ligada à extremidade 5' do segundo epítopo de células T (e assim por diante), correspondendo a um poliepítopo quimérico composto por epítopos de células T consecutivos de pelo menos duas proteínas ZIKV diferentes, em particular a proteína C de ZIKV e as proteínas NS de ZIKV escolhidas dentre NS1, NS3, NS4B e NS5, particularmente originadas de uma sequência de consenso de ZIKV. De acordo com um exemplo de realização alternativo, a fusão de pelo menos dois epítopos de células T, em particular os pelo menos três epítopos de células T, é “indireta” e, consequentemente, envolve a presença de outros resíduos, em particular resíduos de aminoácidos que não pertencem ao(s) segmento(s) NS, em particular compreendendo de 1 a 1 5 resíduos de aminoácidos, que não formam epítopos de células T humana.

[046] O poliepítopo quimérico da invenção compreende ou consiste em uma ou mais regiões antigênicas, em particular entre 2 e 15 regiões antigênicas, preferencialmente entre 10 e 15 regiões antigênicas, mais preferencialmente 11, 12, 13 ou 14 regiões antigênicas.

[047] Conforme definido na presente invenção, o termo “região antigênica” refere-se a uma região compreendendo um ou mais epítopos de células T de ZIKV, isto é, um grupo de epítopos de células T de ZIKV. As sequências de aminoácidos dos referidos epítopos de células T de ZIKV podem diferir em um ou mais resíduos de aminoácidos das sequências de aminoácidos de outros epítopos de células T de ZIKV e/ou podem ter sequências sobrepostas e, portanto, compartilhar alguns aminoácidos. Em uma determinada região antigênica, os referidos epítopos de células T de ZIKV são da mesma proteína de ZIKV, em particular as proteínas C, NS1, NS3, NS4B e NS5 do ZIKV, preferencialmente as proteínas NS1, NS3 e NS5 do ZIKV. O poliepítopo quimérico da invenção pode compreender uma ou mais regiões antigênicas diferentes da mesma proteína de ZIKV.

[048] Em um exemplo de realização específico da invenção, é necessário verificar que as sequências de aminoácidos adjacentes localizadas em ambos os lados da junção entre 2 regiões antigênicas contíguas não formam novos epítopos, em particular novos epítopos de células T humanas fortes. Como consequência, as referidas sequências de aminoácidos consistem em não mais que 15 resíduos de aminoácidos e são selecionadas com base em sua baixa previsão de ligação aos alelos HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA- A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02, HLA-B*35:01 e HLA- B*40:03, de acordo com a base de dados de epítopos imunes (IEDB - Immune Epitope Data Base) (http://tools.immuneepitope.org/mhci/). Por exemplo, na fusão entre dois fragmentos de proteína de ZIKV, em particular, entre dois fragmentos de proteína ZIKV selecionados a partir do grupo que consiste nas proteínas C, NS1, NS3, NS4B e NS5 de um ZIKV, ou entre ou duas regiões antigênicas, a região circundante da junção de fusão compreende uma sequência peptídica que consiste em não mais do que 15 resíduos de aminoácidos e não forma um epítopo forte. Assim, o peptídeo de junção pode compreender 14 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 1 resíduo de aminoácido de uma segunda proteína ZIKV, ou 13 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 2 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 12 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 3 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 11 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 4 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 10 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 5 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 9 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 6 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 8 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 7 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 7 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 8 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 6 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 9 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 5 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 10 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 4 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 11 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 3 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 12 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 2 resíduos de aminoácidos de uma primeira proteína ZIKV e 13 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV, ou 1 resíduo de aminoácido de uma primeira proteína ZIKV e 14 resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína ZIKV. As referidas primeira e segunda proteínas de ZIKV podem ser diferentes ou idênticas.

[049] Em um exemplo de realização específico da invenção, o poliepítopo quimérico tem menos de 1500 resíduos de aminoácidos, em particular menos de 1000 resíduos de aminoácidos.

[050] Um exemplo de um poliepítopo quimérico que pode ser utilizado na presente invenção tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 que consiste em 962 resíduos de aminoácidos. O referido poliepítopo quimérico consiste em 11 regiões antigênicas, em que a primeira região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 1 a 93 (SEQ ID NO: 102), a segunda região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 94 a 206 (SEQ ID NO: 104), a terceira região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 207 a 270 (SEQ ID NO: 106), a quarta região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 271 a 286 (SEQ ID NO: 108), a quinta região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 287 a 331 (SEQ ID NO: 110), a sexta região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 332 a 473 (SEQ ID NO: 112), a sétima região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 474 a 547 (SEQ ID NO: 114), a oitava região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 548 a 766 (SEQ ID NO: 116), a nona região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 767 a 821 (SEQ ID NO: 118), a décima região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 822 a 839 (SEQ ID NO: 120) e a décima primeira região antigênica está localizada a partir dos resíduos de aminoácidos de 840 a 962 (SEQ ID NO: 122).

[051] As sequências nativas e otimizadas do polinucleotídeo que codifica o referido poliepítopo quimérico são conforme definidas nas SEQ ID NOs: 100 e 101, respectivamente.

[052] Outra sequência nucleotídica do polinucleotídeo que codifica o referido poliepítopo quimérico é como definida na SEQ ID NO: 124.

[053] A primeira região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína C de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida primeira região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 103.

[054] A segunda região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS1 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida segunda região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 105.

[055] A terceira região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS1 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida terceira região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 107.

[056] A quarta região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS1 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida quarta região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 109.

[057] A quinta região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS3 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida quinta região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 111.

[058] A sexta região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS3 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida sexta região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 113.

[059] A sétima região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS4B de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida sétima região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 115.

[060] A oitava região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS5 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida oitava região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 117.

[061] A nona região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS5 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida nona região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 119.

[062] A décima região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS5 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida décima região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 121.

[063] A décima primeira região antigênica do referido poliepítopo quimérico compreende epítopos de células T da proteína NS5 de ZIKV. A sequência nativa do polinucleotídeo que codifica a referida décima primeira região antigênica é como definida na SEQ ID NO: 123.

[064] A presente invenção também se refere a uma associação do poliepítopo quimérico da invenção, com um polipeptídeo imunogênico distinto compreendendo outros antígenos de ZIKV. A referida associação de polipeptídeos pode ser alcançada como resultado da expressão dos polinucleotídeos que codificam cada um dos referidos polipeptídeos quiméricos e polipeptídeo imunogênico distinto, a partir de um vetor, tal como divulgado na presente invenção. Alternativamente, a referida associação pode resultar de uma construção de aminoácidos que abrange o referido poliepítopo quimérico e polipeptídeo imunogênico distinto.

[065] O poliepítopo quimérico da invenção pode ser sintetizado quimicamente, ou produzido in vitro (sistema livre de células) ou in vivo após a expressão da molécula de ácido nucleico que codifica o poliepítopo quimérico em um sistema celular.

[066] Para verificar a expressão correta do poliepítopo quimérico da invenção em um sistema celular in vitro, o referido poliepítopo quimérico pode compreender uma sequência de marcadores em sua extremidade 3'.

[067] Na presente invenção, a proteína ZIKV, em particular a proteína C, NS1, NS3, NS4B ou NS5 de ZIKV, preferencialmente a proteína

NS1, NS3 ou NS5 de ZIKV, é particularmente um antígeno projetado usando uma sequência de consenso para o ZIKV. De modo particular, o referido antígeno é projetado usando a sequência de aminoácidos consensual dos vírus Zika, como observado em circulação a partir de 2013 e em diante.

[068] Em um exemplo de realização específico da invenção, o referido ZIKV é da linhagem Africana, em particular da cepa Africana ArD158084 (GenBank: KF383119) ou cepa Africana ArD128000 (GenBank: KF383117), ou isolado Africano ARB13565 (GenBank: KF268948), ou a partir da linhagem asiática, em particular a partir da cepa asiática FLR (GenBank: KX087102), ou isolado asiático SSABR1 (GenBank: KU707826), ou isolado asiático Z1106031 (GenBank: KU312314), ou isolado asiático Bahia07 (GenBank: KU940228), ou cepa asiática FVM00318/VEN/Maracay/2016 (GenBank: KY693680), ou isolado asiático FLR (GenBank: KU820897).

[069] Em outro exemplo de realização específico da invenção, o referido ZIKV corresponde a várias linhagens de vírus ZIK, incluindo cepas que circulavam no Pacífico e nas Américas desde 2013.

[070] Em um exemplo de realização preferido da invenção, a proteína C, NS1, NS3, NS4B ou NS5 do ZIKV tem uma sequência de aminoácidos que é uma sequência de aminoácidos de consenso representativa das sequências C, NS1, NS3, NS4B ou NS5 de uma seleção de várias cepas de ZIKV, incluindo da linhagem asiática, em particular, de cepas de ZIKV (GenBank: KX087102, KU707826, KU312314, KU940228, KY693680, KU820897).

[071] A invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a invenção.

[072] A invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a invenção,

em uma construção de ácidos nucleicos compreendendo ainda um polinucleotídeo que codifica outros antígenos ZIKV.

[073] Conforme definido na presente invenção, o termo “isolado ou purificado” significa moléculas que foram alteradas pelo homem a partir de seu estado nativo, ou seja, se as moléculas existem na natureza, elas foram alteradas e/ou retiradas de seu ambiente inicial. Como exemplo, um polinucleotídeo naturalmente presente e encontrado no ambiente biológico de um organismo vivo que o expressa naturalmente não é “isolado” nesse contexto. No entanto, o mesmo polinucleotídeo quando separado de seu ambiente natural e/ou obtido por clonagem, amplificação e/ou síntese química é considerado na presente invenção como “isolado”. Além disso, um polinucleotídeo que é introduzido em um organismo por transformação, manipulação genética ou qualquer outro método de recombinação é “isolado”, mesmo que esteja presente no referido organismo.

[074] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “codificação” ou “codificante” utilizado no presente pedido define a capacidade das moléculas de ácido nucleico de serem transcritas e, quando apropriado, traduzidas em produtos da expressão em células ou linhagens celulares selecionadas, quando a mencionada molécula é colocada sob sequências de controle da expressão, incluindo o promotor para a transcrição.

Consequentemente, um “polinucleotídeo que codifica” de acordo com a invenção é limitado ao ácido nucleico que possui a sequência traduzida na sequência de aminoácidos ou, alternativamente, quando especificado, compreende também as sequências de controle de expressão.

[075] A presente invenção também se refere a um vetor, em particular um vetor não replicante, adequado para a entrega do poliepítopo quimérico de acordo com a invenção, em que o referido vetor é uma molécula recombinante que transporta o poliepítopo, ou é um vetor viral que expressa o poliepítopo, ou um vetor de expressão de mamífero que expressa o poliepítopo, como o vetor pcDNA3, vetor pcDNA5, vetor pcDNA6, vetor pCI e vetor pCMV.

[076] A presente invenção também se refere a um vetor compreendendo o polinucleotídeo de acordo com a invenção.

[077] Conforme definido na presente invenção, o termo “vetor” refere-se a uma construção polinucleotídica projetada para transdução/transfecção de um ou mais tipos de células. Os vetores podem ser, por exemplo, “vetores de clonagem” que são projetados para isolamento, propagação e replicação de polinucleotídeos inseridos (designados como inserção); “vetores de expressão” que são projetados para expressão de uma molécula de polinucleotídeo, especialmente para expressão da inserção em uma célula hospedeira; ou um “vetor viral” que é projetado para resultar na produção de partículas de vírus recombinantes ou partículas semelhantes a vírus (VLP, virus-like particles), ou “vetores transportadores” “shuttle”, que compreendem os atributos de mais de um tipo de vetor.

[078] Diversos vetores adequados para transdução ou transfecção de células, em particular para transfecção estável de células e bactérias, está disponível ao público (por exemplo, plasmídeos, vírus), assim como métodos para a construção de tais linhagens de células. Será entendido que a presente invenção abrange qualquer tipo de vetor compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos da invenção.

[079] Em um exemplo de realização específico da invenção, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão, que pode ser um plasmídeo compreendendo como inserção(ões) polinucleotídicas, uma ou uma pluralidade das moléculas de ácido nucleico aqui definidas. Em um exemplo de realização específico, o plasmídeo compreende como uma inserção um polinucleotídeo que codifica o poliepítopo quimérico da invenção, conforme definido na presente invenção e opcionalmente compreende o polinucleotídeo que codifica outros antígenos do ZIKV.

[080] Os vetores bem conhecidos pelos versados na técnica que podem ser utilizados na presente invenção abrangem o vetor do vírus do sarampo, em particular o vetor do vírus do sarampo vivo atenuado (por exemplo, como divulgado em Combredet, C. et al., 2003, J Virol, 77(21): 11546-11554, No pedido de patente europeu EP17305676.3 enos pedidos internacionais WO2004/000876, WO2004/001051, WO2014/049094, WO2015/197565), vetores lentivirais (por exemplo, conforme descrito nos Pedidos Internacionais WO2005/111221, WO2007/052165, WO2008/078198, WO2009/019612 e WO2016/091836), ou mRNA (por exemplo, a plataforma mRNA Therapeutics® da Moderna; tal como divulgado nos pedidos internacionais WO2012135805, WO2013039861 e WO2015/085318 ou em Expert Opinion por Youn H. e Chung JK. Expert Opin Biol Ther. 2015 Sep 2; 15(9): 1337–1348 publicado online em 20 de junho de 2015. doi:

10.1517/14712598.2015.1057563).

[081] A presente invenção também diz respeito a uma célula hospedeira transformada com o polinucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção.

[082] A célula hospedeira pode ser transformada geneticamente com o polinucleotídeo que codifica o poliepítopo quimérico da invenção e, opcionalmente, com o polinucleotídeo que codifica outros antígenos ZIKV.

Assim, uma célula hospedeira específica pode ser geneticamente transformada com um vetor da invenção.

[083] A célula hospedeira da invenção pode ser transfectada com um vetor de genoma por métodos bem conhecidos pelos especialistas no assunto, isto é, por transfecção química (fosfato de cálcio, lipofectamina), técnicas baseadas em lipídios (lipossoma), eletroporação, fotoporação, uso de vetores virais, etc.

[084] Em um exemplo de realização específico da invenção, uma célula é transformada ou transduzida com um polinucleotídeo da invenção, de maneira a permitir a integração do polinucleotídeo no genoma da célula por recombinação com a sequência celular homóloga ou por inserção no genoma celular. A transfecção, infecção ou transdução pode ocorrer ex vivo, ou seja, em um ambiente artificial fora do organismo vivo.

[085] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “transfectado”, “transformado” ou “infectado” se referem a uma célula que compreende um vetor da invenção (expressão transitória), enquanto o termo “geneticamente transformado” ou “geneticamente modificado” refere-se a uma célula cujo genoma foi definitivamente modificado por um polinucleotídeo da invenção (expressão permanente).

[086] As referidas células transitórias ou estavelmente transformadas podem ser quaisquer células procarióticas (bactérias) ou eucarióticas (leveduras, insetos ou animais, incluindo mamíferos, especialmente humanos). Em um exemplo de realização, as células são células não humanas. Em um exemplo de realização específico, as células da invenção são células humanas isoladas, “isoladas” significando fora de seu ambiente natural.

[087] Em um exemplo de realização específico da invenção, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, como uma célula aviária, em particular uma célula CEF (fibroblasto de embrião de galinha), uma célula de mamífero, em particular células HEK-293 (rim embrionário humano), cuja linhagem de células 293 está depositada no ATCC sob o número CRL-1573 (como divulgado no pedido internacional WO2008/078198), ou uma célula de levedura.

[088] A presente invenção também diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) o poliepítopo quimérico de acordo com a invenção, (ii) o polinucleotídeo de acordo com a invenção, (iii) o vetor de acordo com a invenção, e (iv) a célula hospedeira de acordo com a invenção.

[089] Em um exemplo de realização específico da invenção, a composição imunogênica compreende ainda um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[090] Em outro exemplo de realização específico da invenção, a composição imunogênica compreende ainda um polinucleotídeo que codifica outros antígenos ZIKV.

[091] Em um exemplo de realização específico da invenção, a composição imunogênica não compreende um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[092] Conforme definido na presente invenção, um veículo farmaceuticamente aceitável abrange qualquer substância que permita a formulação do poliepítopo, polinucleotídeo ou vetor de acordo com a invenção dentro de uma composição. Um veículo é qualquer substância ou combinação de substâncias fisiologicamente aceitáveis, ou seja, apropriada para seu uso em uma composição em contato com um hospedeiro, especialmente um humano, e, portanto, não tóxico. Exemplos de tais veículos são soluções salinas tamponadas com fosfato, água destilada, emulsões como emulsões de óleo/água, vários tipos de soluções estéreis de agentes umectantes e similares.

[093] Conforme definido na presente invenção, um adjuvante inclui, por exemplo, lipossomas, fases oleosas, como adjuvantes do tipo Freund, geralmente usadas na forma de uma emulsão com uma fase aquosa ou podem compreender sais inorgânicos insolúveis em água, como hidróxido de alumínio, sulfato de zinco, hidróxido de ferro coloidal, fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio.

[094] Em outro exemplo de realização particular da invenção, a composição imunogênica é formulada para uma administração por via parenteral, como injeção subcutânea (s.c.), intradérmica (i.d.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.) ou intravenosa (i.v.).

[095] Em outro exemplo de realização particular da invenção, a composição imunogênica é administrada em uma dose ou múltiplas doses, em particular em um regime de administração por “dose inicial-reforço” (prime- boost).

[096] A quantidade a ser administrada (dose) depende do sujeito a ser tratado, incluindo a condição do paciente, estado do sistema imunológico do indivíduo, da via de administração e do tamanho do hospedeiro. As dosagens adequadas variam de 103 TCID50 a 107 TCID50 para um vetor viral ou 100 microgramas de DNA plasmidial, e podem ser modificadas por um especialista na técnica, dependendo das circunstâncias.

[097] A presente invenção também diz respeito a uma composição de vacina compreendendo pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) o poliepítopo quimérico de acordo com a invenção, (ii) o polinucleotídeo de acordo com a invenção, (iii) o vetor de acordo com a invenção, e (iv) a célula hospedeira de acordo com a invenção.

[098] Em um exemplo de realização preferido da invenção, a composição imunogênica ou de vacina é (i) para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano ou (ii) para uso na prevenção de infecções por ZIKV e vírus da dengue (DENV) em um sujeito humano.

[099] A presente invenção também diz respeito à indução de respostas imunes in vivo contra os epítopos do poliepítopo ZIKV, em camundongos que expressam os alelos do HLA de classe I humanos: HLA- A*02:01, ou HLA-A*24:02, ou HLA-B*07:02 ou HLA-B*35:01. A imunização dos camundongos é realizada após um regime de administração pela estratégia prime-boost (dose inicial e de reforço), com uma primeira injeção intradérmica de DNA plasmidial que codifica o poliepítopo ZIKV (2 injeções intradérmicas simultâneas de 50 microgramas de DNA plasmidial na região lombar, seguidas de eletroporação in vivo, usando um procedimento predefinido), seguido de uma imunização de reforço 3 semanas depois (2 injeções intradérmicas de 50 microgramas de DNA plasmidial na região lombar e eletroporação, usando o mesmo procedimento predefinido). As configurações de eletroporação, usando o aparelho AgilePulse (BTX, aparelho de Harvard), consistem em 3 grupos de tensão: incluindo o primeiro com 450V, um comprimento de pulso de 50 microssegundos, um intervalo de pulso de 0,2 microssegundos e 1 pulso, o segundo com 450V, um comprimento de pulso de 50 microssegundos, um intervalo de pulso de 50 microssegundos e 1 pulso, e um terceiro com 110V, um comprimento de pulso de 10 milissegundos, um intervalo de pulso de 20 milissegundos e 8 pulsos. Dez dias após a imunização de reforço, o baço dos camundongos imunizados é retirado e as células do baço são testadas quanto à sua capacidade de secretar Interferon-gama em resposta à estimulação in vitro com os peptídeos específicos derivados do poliepítopo ZIKV, de acordo com o ensaio ELISPOT.

[100] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir dos exemplos a seguir e que também serão ilustrados nas figuras.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[101] Figura 1. Magnitude da resposta específica do ZIKV e frequência dos doadores respondedores. Respostas cumulativas de IFN-γ

(como células formadoras de manchas (SFCs) por milhão de células) para cada peptídeo sobreposto que abrange o proteoma do ZIKV são mostradas para (A) todos os doadores, (B) doadores ZIKV ou (C) doadores DENV/ZIKV. O mapa de calor (heat map) indica o número de doadores com uma resposta IFN- γ positiva a cada peptídeo dentro de cada proteína (C, capsídeo; M, membrana; E, envelope, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). Os números abaixo de cada gráfico representam porcentagens da resposta total para cada proteína.

[102] Figura 2. Doadores de ZIKV com infecção prévia por DENV revelam uma resposta mais ampla de células T com uma magnitude mais alta.

(A) amplitude e (B) magnitude das respostas em doadores ZIKV e DENV/ZIKV.

Cada ponto representa um doador (círculos abertos, doadores ZIKV; círculos cheios, doadores DENV/ZIKV) e as barras representam o valor mediano para cada grupo de doadores. Os valores de P foram calculados pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney bicaudal. Frequência de respostas contra peptídeos individuais, por doador, em doadores ZIKV (C) e DENV/ZIKV (D).

Cada ponto representa um peptídeo. As barras representam a resposta mediana para cada doador.

[103] Figura 3. Comparação da magnitude da resposta e identidade de sequência com DENV em doadores ZIKV e DENV/ZIKV. Cada ponto representa a resposta cumulativa de diferentes doadores contra um peptídeo. As porcentagens representam o valor médio da identidade entre as sequências de ZIKV e os 4 sorotipos de DENV. (A) peptídeos que induzem uma resposta em doadores ZIKV. (B) peptídeos que induzem uma resposta em doadores DENV/ZIKV.

[104] Figura 4. Representação esquemática do plasmídeo 18AAHK3C_pVAX-ZIKV_PolyEpitop_pVAX1. Os inventores usaram o plasmídeo pVAX1 comercializado pela Thermo Fisher Scientific. O polinucleotídeo que codifica um poliepítopo quimérico de ZIKV conforme definido na SEQ ID NO: 124 foi inserido no referido plasmídeo.

[105] Figura 5. Camundongos transgênicos HLA-A*2402 foram imunizados com injeções intradérmicas e eletroporação in vivo (imunização inicial (prime) com 2 x 50 μg de DNA no dia 0, e imunização de reforço (boost) com 2 x 50 μg de DNA no dia 21) com o DNA plasmidial que codifica um poliepítopo quimérico de ZIKV. O referido poliepítopo quimérico de ZIKV tinha a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99. A sequência nucleotídica do polinucleotídeo que codifica o referido poliepítopo quimérico era como a sequência definida na SEQ ID NO: 124. Quatorze dias após a imunização de reforço (boost), os camundongos imunizados foram transitoriamente depletados para a resposta de IFN-alfa por injeção intraperitoneal com 2 mg de anticorpo anti-IFNAR (MAR1-5A3) e a inoculação do vírus foi realizada 24 horas após o tratamento com anticorpo anti-IFNAR. Para inoculação do vírus, os camundongos receberam injeção intraperitoneal da cepa da Guiana Francesa de ZIKV, FG15, usando 103 pfu por camundongo, e a viremia foi quantificada por qRT-PCR nos dias 1, 2, 3 e 6 após a inoculação do vírus.

Quatro camundongos foram utilizados como controle (eletroporação com um vetor vazio) e 5 camundongos foram vacinados com a construção pZIKV (eletroporação com o DNA plasmidial que codifica o poliepítopo quimérico de ZIKV). As configurações de eletroporação, usando o aparelho AgilePulse (BTX, aparelho de Harvard), consistiram em 3 grupos de tensão: incluindo o primeiro gruo com tensão de 450V, um comprimento de pulso de 50 microssegundos, um intervalo de pulso de 0,2 microssegundos e 1 pulso, o segundo com 450V, um comprimento de pulso de 50 microssegundos, um intervalo de pulso de 50 microssegundos e 1 pulso, e um terceiro com 110V, um comprimento de pulso de 10 milissegundos, um intervalo de pulso de 20 milissegundos e 8 pulsos.

EXEMPLOS DECLARAÇÃO DE ÉTICA

[106] As amostras de sangue humano foram obtidas de doadores adultos saudáveis da Fundação Hematológica da Colômbia (Bogotá D.C., Colômbia) de maneira anônima. Todos os protocolos descritos neste estudo foram aprovados pelo conselho de revisão institucional (IRB) da Universidade EL Bosque (Colômbia).

AMOSTRAS DE SANGUE HUMANO

[107] Os doadores eram de ambos os sexos e entre 20 e 60 anos de idade. Foram obtidas 82 amostras de diferentes áreas endêmicas do ZIKV perto de Bogotá DC (principalmente de Villavicencio, Meta) ao longo de um período de três meses entre outubro e dezembro de 2016. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram purificadas por centrifugação por gradiente de densidade (Lymphoprep ®; Stemcell technologies) e ressuspensas em SBF (Gibco) contendo 10% de dimetilssulfóxido e as células foram criopreservadas em nitrogênio líquido.

Onze das 82 amostras de sangue obtidas tiveram que ser excluídas do estudo devido à baixa viabilidade das células.

VÍRUS E LINHAGENS DE CÉLULAS

[108] Os ensaios in vitro foram conduzidos usando o DENV1 KDH0026A (fornecido pelo Dr. L. Lambrecht, Instituto Pasteur, Paris), DENV2 R0712259 (fornecido pelo Dr. A. Failloux, Instituto Pasteur, Paris), DENV3 KDH0010A (fornecido pelo Dr. L. Lambrecht, Instituto Pasteur, Paris), DENV4 CRBIP10.4VIMFH4 (da coleção do Instituto Pasteur) e ZIKV KU312312 (fornecido pelo Dr. Dominique Rousset, Instituto Pasteur. Cayenne). Todos os vírus foram cultivados usando a linhagem celular C6/36 de mosquito Aedes Albopictus cultivada em meio L-15 de Leibovitz suplementado com soro bovino fetal (SBF) a 10% contendo 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e caldo de triptose fosfato 1X. As células Vero-E6 e U937 que expressam DC-SIGN foram gentilmente fornecidas pelo Dr. M. Flamand e pelo Dr. B. Jacquelin (Instituto Pasteur, Paris), respectivamente.

TIPAGEM HLA

[109] DNA genômico isolado de PBMCs dos sujeitos do estudo por técnicas padrão (QIAmp; Qiagen) foi usado para tipagem de HLA. A tipagem baseada em Luminex de alta resolução para HLA classe I (alelos A, B e C) e HLA classe II (alelo DRB1) foi usada de acordo com o protocolo do fabricante (tipagem com oligonucleotídeos de sequência específica (SSO); Immucor, Lifecodes).

SOROLOGIA

[110] A soropositividade para o ZIKV foi determinada usando um ELISA indireto baseado em antígeno recombinante (antígeno EDIII), conforme descrito anteriormente (Aubry M, et al. 2017, Emerging infectious diseases 23 (4): 669-672). Resumidamente, placas de 96 poços (Nunc, Life Technologies, Rochester, NY) foram revestidas durante a noite a 4ºC com 50 ng de antígeno em PBS. Após a lavagem, 200 μL de PBS contendo 3% de leite desnatado e 0,1% de Tween-20 foram adicionados por 1 hora a 37ºC. A solução de bloqueio foi substituída com 100 µL de plasma diluído 1:500 em PBS contendo 1,5% de BSA e 0,1% de Tween-20, e as placas foram incubadas a 37ºC por 60 min.

Após três lavagens, os anticorpos ligados foram detectados com uma imunoglobulina IgG anti-humana de cabra conjugada com peroxidase de rábano silvestre (ROCKLAND). Após a incubação a 37ºC por 1 hora e três lavagens, foram adicionados 100 μL de uma solução de substrato contendo TMB (KPL, Eurobio). Após 15 min de incubação, a densidade óptica (OD) foi determinada a 650 nm com um leitor de placas automatizado (Tecan infinite 200 pro). Cada amostra de plasma foi testada em duplicatas. As amostras de plasma obtidas de indivíduos com sorologia IgG DENV positiva coletada antes do surto de ZIKV foram usadas como controle negativo. O ponto de corte foi calculado a partir dos controles negativos e foi de 0,196. A soropositividade para DENV foi determinada por ELISA indireto para IgGs (Panbio; Alere) e por ELISA de captura para IgM (Tecnosuma), seguindo as instruções do fabricante.

Para caracterização adicional de doadores soropositivos e para confirmar a especificidade do ELISA, foi realizado um ensaio de neutralização baseado em citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente (Andreatta M, et al. 2015, Immunogenetics 67 (11-12): 641-650; Nielsen M & Andreatta M 2016, Genome Med 8 (1):33). Resumidamente, diluições seriadas de 10 vezes das amostras de plasma foram incubadas a 37ºC durante 1 hora com uma diluição de vírus induzindo 7-15% de infecção. A mistura vírus-anticorpo foi então adicionada às células U937-DC-SIGN para neutralização da infecção por DENV1-4, ou células Vero para neutralização da infecção por ZIKV, por 2 horas a 37ºC, em seguida, as células foram lavadas 2 vezes com meio fresco e depois incubadas por 24h. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com anticorpo 4G2 conjugado com Alexa-488, e a porcentagem de células infectadas foi medida por citometria de fluxo. O título de neutralização dos anticorpos foi expresso como a diluição recíproca de plasma na qual 50% do vírus foi inibido. As amostras de plasma de doadores coletados antes do surto de ZIKV ou de amostras negativas fornecidas pelos kits para detectar anticorpos anti-DENV não revelaram nenhuma atividade de neutralização contra infecções por ZIKV ou DENV, respectivamente. Na sequência dos ensaios de ELISA e de neutralização, a partir das 71 amostras de plasma selecionadas para este estudo, um total de nove amostras de indivíduos soropositivos para ZIKV e onze amostras de indivíduos soropositivos para DENV/ZIKV foram adicionalmente selecionados para análise ELISPOT. A lista completa dos vinte doadores de sangue incluídos neste estudo está listada na Tabela 1.

SEQUÊNCIAS VIRAIS

[111] A sequência de aminoácidos idêntica de ZIKV da Colômbia (GenBank KX087102 e KU820897) foi usada como referência para o conjunto de peptídeos de 15-mer sobrepostos.

[112] Um total de 50 sequências DENV codificadoras de proteínas de comprimento total da cepa da Colômbia (sorotipo 1: 14 sequências; sorotipo 2: 16 sequências; sorotipo 3: 13 sequências; sorotipo 4: 7 sequências) foram recuperadas do GenBank e usadas para comparações de identidade de sequência em pares.

PEPTÍDEOS

[113] Todos os peptídeos foram sintetizados pela Mimotopes (Victoria, Austrália). Um total de 853 peptídeos de 15-mer sobrepostos por 11 aminoácidos e 197 peptídeos de 9-mer sobrepostos por oito aminoácidos foram testados pelo ensaio ELISPOT. Para a identificação de epítopos de células T, peptídeos de 15-mer foram combinados em conjuntos de 12 peptídeos e peptídeos individuais dos conjuntos positivos foram testados em um segundo ensaio ELISPOT. Após a identificação dos peptídeos de 15-mer positivos, e de acordo com seu potencial de restrição HLA classe I ou classe II (previsto ou compartilhado entre pelo menos dois doadores), os peptídeos de 9-mer foram sintetizados e testados individualmente.

ENSAIO IFN-γ POR ELISPOT EX VIVO

[114] PBMCs (2x105) foram incubadas em placas de 96 poços de fundo plano (MSIPS 4510, Millipore, Bedford, MA) revestidas com anticorpo monoclonal (mAb) anti-IFN-γ (clone 1-D1K, Mabtech, Suécia) com 0,2 ml de meio RPMI completo contendo 10% de soro AB humano com pools de 12 peptídeos (2 μg/mL, concentração final) ou peptídeos individuais (1 μg/mL, concentração final) durante 20 horas. Após uma incubação de 20 h a 37ºC, os poços foram lavados com PBS/Tween 20 a 0,05% e depois incubados com mAb anti-IFN-γ biotinilado (clone 7-B6-1, Mabtech) por 1 h 30 min. As manchas

(spots) foram desenvolvidas usando a estreptavidina-fosfatase alcalina (Mabtech) e o substrato BCIP/NBT (Promega, França) e contadas usando um leitor ELISPOT automatizado (Immunospot, Cellular Technology Limited, Alemanha). O número de células produtoras de IFN-γ foi expresso em células formadoras de spots (SFC) relativo a 1 x 106 PBMCs. Os valores foram calculados subtraindo o número de spots detectados nos poços de controle não estimulados. Os valores foram considerados positivos se fossem iguais ou superiores a 20 spots e pelo menos três vezes acima das médias dos poços de controle não estimulados. Como controle positivo, as células foram estimuladas com o pool de peptídeos CEF (Mabtech).

PREDIÇÃO DE IMUNOGENICIDADE E RESTRIÇÕES DE HLA

[115] A avaliação das possibilidades de ligação de peptídeos aos alelos MHC classe I e classe II foi analisada usando os servidores NetMHCpan3.0 e NetMHCII pan3.1, respectivamente (Andreatta M, et al. 2015, Immunogenetics 67 (11-12): 641-650; Nielsen M & Andreatta M 2016, Genome Med 8 (1): 33).

ESTATÍSTICA

[116] Todos os dados foram analisados com o software Prism versão 7.0 (GraphPad Software). A significância estatística foi determinada usando o teste não paramétrico de Mann-Whitney bicaudal para comparar dois grupos independentes. As diferenças foram consideradas significativas em P < 0,05.

RESULTADOS IDENTIFICAÇÃO DE REGIÕES IMUNODOMINANTES DO PROTEOMA DO ZIKV

[117] Para investigar a imunidade de células T induzida após a infecção por ZIKV, os inventores examinaram as respostas de doadores de sangue que vivem em uma área endêmica de ZIKV em ensaios específicos de imunoabsorvente ligados a enzima (ELISPOT) para gama-interferon (IFN-γ). As amostras de sangue de todos os participantes do estudo foram testadas quanto à presença de IgG para ZIKV e IgM e IgG para DENV por ELISA, e quanto à presença de anticorpos específicos para vírus pelo teste de neutralização baseado em citometria de fluxo contra ZIKV e os 4 sorotipos de DENV e

PBMCs do indivíduos soropositivos para ZIKV foram submetidas a tipagem

HLA.

Os detalhes dos doadores de sangue incluídos neste estudo estão listados na Tabela 1. As PBMCs de 20 doadores soropositivos para ZIKV foram rastreadas quanto à reatividade de células T contra conjuntos de peptídeos de

15-mer (sobreposição de 11 aminoácidos) abrangendo todo o proteoma do

ZIKV.

A análise da magnitude da resposta (como células formadoras de spots

(SFC) por 106 células) e da frequência dos doadores respondedores revelou que as proteínas não estruturais (NS) NS1, NS3 e NS5 eram as proteínas mais vigorosas e frequentemente reconhecidas, e representavam 69% do total de respostas (Figura 1A). Notavelmente, estas proteínas NS1, NS3 e NS5 representam 15%, 19% e 35% do total de resposta, respectivamente, nos doadores ZIKV+, ao passo que as proteínas NS3, NS4B e NS5 foram responsáveis por 31%, 15% e 22% da resposta de células T específicas para

DENV, respectivamente (Simmons C.P., et al. 2005, J.

Virol. 79(9):5665-5675;

Duangchinda T, et al. 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107(39):16922-16927;

Rivino L, et al. 2013, J.

Virol. 87(5):2693-2706; Weiskopf D, et al. 2013, Proc

Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046-2053). Como esses doadores foram selecionados em áreas endêmicas de DENV e ZIKV, e como esses vírus compartilham uma identidade geral de sequência de 43% de proteínas (com até 68% para as proteínas não estruturais), os inventores procuraram distinguir entre epítopos específicos de ZIKV e aqueles compartilhados por ambos os vírus.

Dentre os 20 doadores de sangue soropositivos para ZIKV, 11 indivíduos tinham anticorpos IgG anti-DENV e anti-ZIKV e 9 indivíduos não revelaram anticorpos anti-DENV detectáveis (Tabela 1). Os inventores, portanto,

analisaram separadamente respostas de células T a partir de doadores possuindo apenas um histórico de infecção por ZIKV (doadores ZIKV) e aqueles a partir de doadores possuindo um histórico de infecções por DENV e ZIKV (doadores DENV/ZIKV). Como mostrado nas Figuras 1B e 1C, as proteínas NS1, NS3 e NS5 foram responsáveis por 13%, 31% e 32% das respostas em doadores ZIKV, respectivamente, ao passo que foram responsáveis por 15%, 16% e 36% das respostas em doadores DENV/ZIKV.

Estes resultados confirmam que NS1, NS3 e NS5 foram os principais alvos para as células T em doadores infectados com ZIKV, independentemente de uma infecção anterior com DENV, e revelam um aumento da frequência e magnitude da resposta contra NS5 em doadores previamente infectados com DENV, em comparação com doadores infectados apenas com ZIKV.

TABELA 1

CARACTERÍSTICAS DA COORTE DE PACIENTES COM ZIKV USADA NO ESTUDO DE REATIVIDADE EPITÓPICA. Teste Idade (ano) sorológico Doadora Genotipagem HLA Atividade neutralizante (Neut50)c Gêner DEN ZIKV o V HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 Ig Ig Ig DENV DENV DENV3 DENV ZIK M G G 1 2 4 V 1 4 Masc. 02:01:0 35:43:0 01:02:0 04:07:0 - - + 17 23 16 25 311 1 1 1 1 1 24:02:0 51:01:0 01:02:0 12:01:0 1 1 1 1 1 2 Fem. 01:01:0 15:17:0 07:01:0 13:01:0 - + + 158 79 47 357 227 6 0 1 1 1 1 0 03:01:0 38:01:0 12:03:0 13:02:0 1 1 1 1 2 2 Fem. 01:01:0 07:02:0 07:02:0 04:11:0 + + + 2049 452 214 438 247 0 8 1 1 1 1 0 31:01:0 39:05:0 07:02:0 15:01:0 2 1 1 1 2 2 Masc. 04:01:0 - - + 13 13 19 14 566 31b 35:01 01b 1 6 1 03:01 18:01 17:02 03:01 2 2 Masc. 02:01:0 07:02:0 01:02:0 14:02:0 - + + 5397 601 735 235 247 6 9 1 1 1 1 6 24:02:0 48:01:0 07:02:5 15:01:0 1 1 7 1

Teste Idade (ano) sorológico Doadora

Genotipagem HLA Atividade neutralizante (Neut50)c Gêner DEN ZIKV o V HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 Ig Ig Ig DENV DENV DENV3 DENV ZIK M G G 1 2 4 V 2 3 Fem. 02:17:0 40:02:0 04:11:0 - + + 75 39 24 67 558 03:05 8 5 1 1 1 7 16:01:0 29:02:0 44:03:0 07:01:0 1 1 1 1 3 3 Fem. 24:02:0 04:07:0 - + + 306 114 63 51 829 01:02:0 3 2 1 15:46 1 1 24:02:0 35:31 04:07:0 03:05 1 1 3 3 Fem. 24:02:0 14:01:0 - - + 11 13 10 <10 340 01:03 5 9 1 1 03:05 08:02:0 68:01:0 40:02:0 05:129 1 2 1 3 3 Masc. - - + 18 12 35 12 280 35:01:0 04:01:0 7 4 02:45 01:03 3 1 1 11:01:0 13:01:0 5 50:01:0 06:02:0 1 1 3 1 1 535 4 4 Masc. 26:01:0 35:01:0 04:01:0 04:02:0 - - + 11 12 25 12 168 2 0 1 1 1 1 9 26:01:0 38:01:0 06:76:0 11:04:0 1 1 2 1 4 2 Masc. 32:01:0 39:01:0 06:02:0 04:07:0 - - + 14 11 12 11 903 6 5 1 1 1 1 68:01:0 50:01:0 07:02:0 07:01:0 2 1 1 1 5 5 Fem. 23:01:0 40:02:0 07:01:0 - + + 464 116 29 543 308 01:10 3 4 1 1 1 1 04:01:0 31:01:0 44:03:0 08:02:0 1 2 1 1 5 2 Masc. 03:01:0 35:01:0 04:11:0 01:01:0 - + + 2395 612 222 301 319 5 3 1 1 1 1 6 11:01:0 51:01:0 15:02:0 07:01:0 1 1 1 1 5 2 Fem. 02:01:0 15:17:0 05:01:0 03:01:0 - + + 215 55 <10 156 110 6 8 1 1 1 1 02:01:0 18:01:0 07:01:0 11:01:0 1 1 1 1

5 2 Masc. 03:01:035:43:0 01:02:0 04:01:0 - - + 31 30 16 24 194 9 6 1 1 1 1 24:02:040:01:0 03:04:0 04:07:0 1 1 1 1 6 2 Fem. 55:01:0 01:02:0 11:01:0 - - + 11 <10 10 10 514 02:05:0 0 0 1 1 1 1 58:01:0 07:01:0 13:03:0 69:01 1 1 1 6 2 Fem. 02:01:0 07:02:0 07:02:0 15:01:0 - + + 999 187 126 144 405 3 4 1 1 1 1 7

Teste Idade (ano) sorológico Doadora Genotipagem HLA Atividade neutralizante (Neut50)c Gêner DEN ZIKV o V HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 Ig Ig Ig DENV DENV DENV3 DENV ZIK M G G 1 2 4 V 23:01:0 51:08:0 17:02:0 15:03:0 1 1 1 1 6 2 Fem. 02:01:0 39:01:0 03:02:0 08:02:0 - + + 2572 471 1386 167 290 6 1 1 1 1 1 5 03:01:0 40:02:0 07:29:0 15:01:0 1 1 1 1 6 2 Masc. 01:01:0 35:01:0 01:02:0 04:07:0 + + + 749 463 961 92 120 9 5 1 1 1 1 5 24:02:0 35:43:0 04:01:0 13:05:0 1 1 1 1 7 1 Fem. 02:01:0 40:02:0 04:01:0 13:01:0 - - + 17 12 15 33 110 7 8 1 1 1 1 02:01:0 51:01:0 07:01:0 14:02:0 1 1 1 1 a As linhas sombreadas mostram doadores com infecção prévia por DENV b Variante alélica não foi determinada c Os valores em cada célula são os títulos de 50% de neutralização determinados a partir de duas repetições de um experimento. Os títulos mais altos para cada amostra estão indicados em negrito.

[118] Dos 853 peptídeos que abrangem todo o proteoma do ZIKV, 410 peptídeos provocaram uma resposta significativa de células T, algumas das quais reconhecidas por múltiplos doadores. Para a maioria dos peptídeos antigênicos, os alelos HLA de classe I e de classe II dos doadores que respondem coincidem com os alelos previstos para se ligar a este epítopo (Andreatta M, et al 2015, Immunogenetics 67 (11-12):. 641-650; Nielsen M e Andreatta M 2016, Genome Med 8(1): 33). Entre os epítopos que induzem uma forte resposta nos doadores ZIKV e DENV/ZIKV, vários peptídeos de 15-mer continham sequências curtas previstas para se ligarem fortemente a pelo menos um alelo expresso pelos doadores respondedores (Tabela 2). Por exemplo, o peptídeo NS2B117-131 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 25) contém uma sequência de 10-mer (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 26) prevista para se ligar fortemente às moléculas HLA-A*0301 e -A*1101 expressas pelo doador respondedor 55. Em outros casos, vários doadores respondedores expressaram pelo menos um alelo comum com potencial para forte ligação ao peptídeo estimulante. Isto suporta que o peptídeo E 455-469 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 7) no envelope que continha as sequências de 9-mer (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 9) e 10-mer (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 8) previstas se liga aos alelos HLA-B*5101 e HLA- A*0201, sendo ambos os alelos expressos pelos doadores respondedores 1 e

77. Isto também se aplicou ao peptídeo NS513-27 (com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 46), que induziu uma forte resposta nos doadores 55 e 69 que partilharam o alelo HLA-B*3501, prevendo-se que este alelo se ligue ao peptídeo MSALEFYSY de 9-mer (com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 47) com uma grande afinidade.

Curiosamente, este epítopo também mostrou induzir uma resposta significativa em camundongos transgênicos portadores da molécula HLA-A*0101, que foi expressa pelo doador 69 (Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2: 17036). Da mesma forma, uma resposta de células T forte foi observada contra o peptídeo NS5546-560 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 67) em doadores 28, 53 e 66 que expressavam os alelos HLA-B*4002 e -B*4403 e contra o peptídeo NS5605-619 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 72) nos doadores 33 e 59 que compartilhavam o alelo HLA- A*2402 previsto. Finalmente, os inventores também identificaram vários epítopos imunodominantes de 9-mer nas proteínas NS4B e NS5, incluídos nos peptídeos NS4B112-126 (possuindo a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 41), NS5293-307 (possuindo a sequência de aminoácidos conforme definida nas SEQ ID NOs: 49 e 50), NS5 297-311 (possuindo a sequência de aminoácidos conforme definida nas SEQ ID NOs: 53-55) e NS5345-359 (possuindo a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 58), que induziram respostas substanciais de células T em doadores que compartilham um ou vários alelos com um forte potencial de ligação a esses peptídeos.

[119] Notavelmente, entre as proteínas NS3 e NS5, vários epítopos já foram descritos como epítopos imunodominantes, previstos ou validados experimentalmente após infecção ou vacinação por DENV em humanos ou após a infecção por ZIKV em camundongos (Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2:17036; Dar H, et al. 2016, Asian Pac J Trop Med 9(9):844-850; Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128; Dikhit MR, et al. 2016, Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases 45:187-197). De fato, entre os peptídeos de 9-mer identificados em doadores DENV/ZIKV, o NS5293-307 (possuindo a sequência de aminoácidos definida nas SEQ ID NOs: 49 e 50), NS5297-311 (possuindo a sequência de aminoácidos definida nas SEQ ID NOs: 53-55) e NS5345-359 (possuindo a sequência de aminoácidos definida nas SEQ ID NO: 58) já foram detectados em PBMCs de indivíduos HLA- B*3501, após infecção por DENV1, DENV2 ou vacinação com vacina viva atenuada de DENV (DLAV), com uma substituição de aminoácidos lisina- arginina e fenilalanina-tirosina nos resíduos 302 e 350 nos peptídeos NS5297- 311 (possuindo a sequência de aminoácidos definida nas SEQ ID NOs: 53-55) e NS5345-359 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 58) de ZIKV, respectivamente (Rivino L, et al. 2013, J. Virol. 87(5):2693- 2706; Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128; Imrie A, et al. 2007, J.

Virol. 81(18):10081-10091) (Tabela 2). Estes resultados obtidos a partir de doadores DENV/ZIKV confirmaram assim que estes peptídeos NS5 contêm epítopos nested restritos pela molécula HLA-B*3501. Entretanto, um peptídeo de 15-mer, NS3219-233 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 28), o qual continha o epítopo APTRVVAAEM (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 29), induziu resposta substancial em 2 doadores DENV/ZIKV que expressavam HLA-B*0702 ou B*3501, embora estes alelos foram expressos em doadores respondedores vacinados com DLAV ou em camundongos transgênicos IFNAR-/- HLA-B*0702 após infecção por ZIKV (Wen J, et al. 2017, Nat. Microbiol. 2:17036; Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89(1):120-128). Isto sugere que o peptídeo NS3219-233 (possuindo a sequência de aminoácido tal como definida na SEQ ID NO: 28) continha outro epítopo ou um epítopo promíscuo que se liga a outros alelos HLA, além do HLA-B*0702 ou B*350.

TABELA 2 CARACTERÍSTICAS DOS PEPTÍDEOS ANTIGÊNICOS DE ZIKV (POSSUINDO AS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS TAL COMO DEFINIDAS NAS SEQ ID NOS: 1-75) IDENTIFICADOS NESTE ESTUDO.

* A posição dos peptídeos foi determinada de acordo com a sequência de referência NCBI YP_002790881.1; † A sequência sublinhada e em negrito corresponde ao peptídeo de 9-mer testado; ‡ Os alelos comuns entre doadores estão sublinhados e em negrito; § SFC cumulativo/milhão de PBMCs; NT, não testado; ¶ Calculado usando os servidores NetMHCpan 3.0 e NetMHCIIpan3.1: para MHC classe I, ligantes fortes < 0,5, ligantes fracos < 2. SFC/milh Doadores ão de Esco Peptíde d PBMCs Epítopo predido HLA re Sequênciab HLAc oa Predito (rank 15- 9- )e mer mer C13-27 IVNMLKRGVARV 2 A02,29; B40,44; 170 <20 MLKRGVARV A0217 1,9 SPF 8 C03,16; 50 60 A0205 1,3 6 DRB104,07 0 A02,69; B55,58;

SFC/milh

Doadores ão de Esco Peptíde d PBMCs Epítopo predido HLA re Sequênciab HLAc oa Predito (rank 15- 9- )e mer mer C01,07; DRB111,13

C85-99 KKDLAAMLRIINA 2 A02,24; B07,48; 100 <20 AAMLRIINA A0201 4,5 RK 6 C01,07; <20 75 KDLAAMLRI B5501 1,4 KKDLAAMLRIINA 6 DRB114,15 230 65 B4002 2,0 RK 0 A02,69; B55,58; 2 C01,07; 8 DRB111,13 A02,29; B40,44; C03,16; DRB104,07

E455-469 GMSWFSQILIGTL 1 A02,24; B35,51; 120 NT GMSWFSQILI A0201 0,9 LM 7 C01,01; 35 NT MSWFSQILI B5101 0,12 7 DRB104,12 A02,02; B40,51; C04,07; DRB113,14

NS163-77 MENIMWRSVEGE 2 A31,03; B35,18; 65 50 MENIMWRSVEG DRB104 50 LNA 1 C01,17; 245 58 ELNA 05 0,5 MENIMWRSVEGE 2 DRB104,03 70 148 IMWRSVEGEL A0217 1,2 LNA 8 A02,29; B40,44; A0201 5 C03,16; 6 DRB104,07 A02,02; B15,18; C05,07; DRB103,11

NS183-97 GVQLTVVVGSVK 2 A02,24; B07,48; 145 23 VQLTVVVGSV A0201 1,7 NPM 6 C01,07; 165 35 A0217 3 2 DRB114,15 8 A02,29; B40,44; C03,16; DRB104,07

NS1163- FHTSVWLKVRED 2 A02,29;B40,44;C0 230 75 HTSVWLKVRED A0101 0,4 177 YSL 8 3,16; DRB104,07 110 125 Y A3101 0,4 FHTSVWLKVRED 5 A03,11;B35,51;C0 50 32 HTSVWLKVR A6801 0,6 YSL 5 4,15; DRB101,07 310 105 VWLKVREDY A2902 1,3 4 A32,68;B39,50;C0 FHTSVWLKV B3905 0,4 6 6,07; DRB104,07 B3901 0,4 2 A01,31;B07,39;C0 0 7,07; DRB104,15

NS1275- IRFEECPGTKVHV 3 A24,24; B15,35; 215 55 CPGTKVHVE B3501 8,5 289 EE 3 C01,03; 130 115 B3531 6,5 5 DRB104,04

SFC/milh

Doadores ão de Esco Peptíde d PBMCs Epítopo predido HLA re Sequênciab HLAc oa Predito (rank 15- 9- )e mer mer 5 A03,11; B35,51; C04,15; DRB101,07

NS2B11 AAGAWYVYVKTG 5 A03,11; B35,51; 445 NT AAGAWYVYVK A0301 0,6 7-131 KRS 5 C04,15; YVYVKTGKR A1101 0,12 DRB101,07 A0301 1,8

NS3219- TVILAPTRVVAAE 5 A23,31; B40,44; 100 NT TVILAPTRVVAAE DRB108 1,5 233 ME 3 C01,04; 65 NT ME 02 1,6 6 DRB107,08 ILAPTRVVAA A0201 6 A02,03; B39,40; C03,07; DRB108,15

NS3271- LQPIRVPNYNLYI 4 A26,26; B35,38; 165 NT VPNYNLYIM B3501 0,06 285 MD 2 C05,06; DRB104,11

NS3311- AAIFMTATPPGTR 2 A02,29; B40,44; 255 85 AAIFMTATPPGT DRB104 4 325 DA 8 C03,16; 215 30 RDA 01 5,5 AAIFMTATPPGTR 3 DRB104,07 FMTATPPGT A0217 5 DA 3 A24,24; B15,35; IFMTATPPG A2402 C01,03; DRB104,04

NS4A86- VTLGASAWLMWL 5 A03,11; B35,51; 178 NT SAWLMWLSEI B5101 0,9 100 SEI 5 C04,15; 125 NT VTLGASAWL A6901 1,3 6 DRB101,07 LGASAWLMW B5801 0,07 0 A02,69; B55,58; C01,07; DRB111,13

NS4B11 AIILLVAHYMYLIP 2 A02,29; B40,44; 60 58 AIILLVAHY A2902 0,6 2-126 G 8 C03,16; 75 30 LLVAHYMYL A1101 3,5 AIILLVAHYMYLIP 3 DRB104,07 100 68 LVAHYMYLI A0205 0,3 G 7 A02,11; B35,50; 100 35 A6901 0,15 AIILLVAHYMYLIP 6 C04,06; A0205 0,2 G 0 DRB101,13 6 A02,69; B55,58; 0 C01,07; DRB111,13 A02,69; B55,58; C01,07; DRB111,13

NS513-27 KARLNQMSALEF 5 A03,11; B35,51; 260 NT MSALEFYSY B3501 0,15 YSY 5 C04,15; 145 NT A0101 0,09

SFC/milh

Doadores ão de Esco Peptíde d PBMCs Epítopo predido HLA re Sequênciab HLAc oa Predito (rank 15- 9- )e mer mer 6 DRB101,07 9 A01,24; B35,35; C01,04; DRB104,13

NS5293- WFFDENHPYRT 5 A03,11; B35,51; 158 308 HPYRTWAYH B3501 0,4 307 WAYH 5 C04,15; 0 218 FFDENHPY A0101 1,6 WFFDENHPYRT 6 DRB101,07 40 WAYH 9 A01,24; B35,35; C01,04; DRB104,13

NS5297- ENHPYRTWAYH 5 A03,11; B35,51; 128 358 NHPYRTWAY B3501 3 311 GSYE 5 C04,15; 0 188 YRTWAYHGSY B3501 1,7 ENHPYRTWAYH 6 DRB101,07 75 205 RTWAYHGSY A0101 0,3 GSYE 9 A01,24; B35,35; 75 A0101 0,5 6 C01,04; ENHPYRTWAYH 9 DRB104,13 GSYE A01,24; B35,35; C01,04; DRB104,13

NS5345- TDTTPYGQQRVF 3 A24,24; B15,35; 131 395 TPYGQQRVF B3531 0,7 359 KEK 3 C01,03; 5 523 B3501 0,3 5 DRB104,04 209 763 5 A03,11; B35,51; 5 6 C04,15; 785 9 DRB101,07 A01,24; B35,35; C01,04; DRB104,13

NS5425- EAVNDPRFWALV 2 A02,29; B40,44; 150 100 AVNDPRFWALV A0301 1,1 439 DKE 8 C03,16;DRB104,0 120 125 DK A1101 0,6 5 7 90 240 5 A03,11; B35,51; 5 C04,15; 6 DRB101,07 A02,02; B15,18; C05,07; DRB103,11

NS5461- KKQGEFGKAKGS 2 A02,29; B40,44; 300 NT KKQGEFGKAKG DRB107 32 475 RAI 8 C03,16;DRB104,0 105 NT SRAI 01 0,7 5 7 GEFGKAKGSRAI B4002 3 A23,31; B40,44;

SFC/milh

Doadores ão de Esco Peptíde d PBMCs Epítopo predido HLA re Sequênciab HLAc oa Predito (rank 15- 9- )e mer mer C01,04; DRB107,08

NS5473- RAIWYMWLGARF 2 A02,29; B40,44; 210 NT YMWLGARFL A0217 0,03 487 LEF 8 C03,16; 295 NT AIWYMWLGAR A0301 1,3 5 DRB104,07 RAIWYMWLGAR DRB107 16 5 A03,11; B35,51; FLEF 01 C04,15; DRB101,07

NS5546- RFDLENEALITNQ 2 A02,29; B40,44; 245 NT NEALITNQM B4002 0,8 560 ME 8 C03,16; 190 NT B4403 0,6 5 DRB104,07 80 NT B3901 1,8 3 A23,31; B40,44; 6 C01,04; 6 DRB107,08 A02,03; B39,40; C03,07; DRB108,15

NS5565- LALAIIKYTYQNKV 2 A02,29; B40,44; 240 NT LALAIIKYTY A2902 0,5 579 V 8 C03,16; 120 NT ALAIIKYTY A2902 0,25 5 DRB104,07 150 NT LALAIIKYTY B1517 1,2 3 A23,31; B40,44; 5 C01,04; 6 DRB107,08 A02,02; B15,18; C05,07; DRB103,11

NS5605- QVVTYALNTFTNL 3 A24,24; B15,35; 240 NT TYALNTFTNL A24:02 0,09 619 VV 3 C01,03; 50 42 YALNTFTNL B35:43 0,4 5 DRB104,04 B35:31 0,25 9 A03,24; B35,40; C01,03; DRB104,04

RESPOSTAS MAIS AMPLAS COM MAIOR MAGNITUDE EM DOADORES COM INFECÇÃO PRÉVIA POR DENV

[120] Dada a resposta de anticorpos específicos para ZIKV contra NS1 e o baixo nível de reatividade cruzada de células T CD4 entre DENV e ZIKV contra as proteínas E e NS1 (Stettler K, et al. 2016, Science 353 (6301): 823-826), os inventores comparam, entre os epítopos imunodominantes, as respostas de células T em PBMCs de doadores ZIKV com as de doadores DENV/ZIKV. Primeiro, a comparação da frequência de células T respondedoras em pacientes ZIKV e DENV/ZIKV evidenciou a maior magnitude de resposta em doadores DENV/ZIKV, em relação aos doadores ZIKV (Figura s 1B e 1C). O número de peptídeos estimulantes por doador, bem como a resposta média por doador, diferiram nesses dois grupos, com uma resposta significativamente mais ampla e uma magnitude de resposta maior em doadores com infecção prévia por DENV (Figura 2A, painéis esquerdo e direito). Para determinar se esta diferença diz respeito a apenas um pequeno número de peptídeos que provocam uma resposta mais forte em cada doador, ou se diz respeito a maioria dos peptídeos, os inventores representaram graficamente a frequência de respostas contra os diferentes peptídeos, por doador, nos dois grupos diferentes. Conforme mostrado na Figura 2B, dois em cada nove indivíduos entre os doadores ZIKV revelaram uma resposta mediana superior a 100 SFC/milhão de células, enquanto seis em onze doadores DENV/ZIKV desenvolveram essa forte resposta, que também foi direcionada contra um número maior de peptídeos. Este resultado revelou a ativação de uma frequência mais elevada de células T contra peptídeos ZIKV, com uma magnitude maior de resposta, em doadores previamente infectados com DENV, em comparação com doadores naïve (ingênuos). Isso argumenta fortemente para a existência de células T de reação cruzada, estas células T são ativadas durante a infecção inicial por DENV e seriam expandidas posteriormente durante a infecção seguinte por ZIKV, como mostrado recentemente em camundongos após a infecção sequencial com DENV e ZIKV (Wen J, et al., 2017, Nat Microbiol 2:17036).

AS CÉLULAS T COM REATIVIDADE CRUZADA DENV/ZIKV TÊM COMO ALVO PRINCIPAL A PROTEÍNA NS5

[121] Para identificar mais especificamente peptídeos específicos para ZIKV e peptídeos de reatividade cruzada para DENV/ZIKV, os inventores compararam as sequências dos epítopos mais imunodominantes reconhecidos pelos dois tipos de doadores. Como mostrado na Figura 2A e Tabela 3, as proteínas NS1 e NS3 continham uma elevada proporção de peptídeos que provocam respostas fortes em ambos doadores, ZIKV e DENV/ZIKV, ao passo que a proteína E e, em uma maior extensão, proteína NS5 continham a maioria dos peptídeos que induzem uma forte resposta apenas em doadores DENV/ZIKV. Isto sugere que as proteínas NS1 e NS3 contêm mais epítopos específicos de ZIKV, enquanto a proteína NS5 contém mais epítopos partilhados por DENV e ZIKV e reconhecidos por células T que reagem cruzadamente. Surpreendentemente, a maioria dos peptídeos reconhecidos apenas pelos doadores DENV/ZIKV exibiu elevado grau de identidade com os quatro sorotipos DENV. Por exemplo, na proteína NS1, dois dos cinco epítopos que induziram uma resposta em doadores ZIKV exibiram uma identidade de sequência maior do que 60% com os quatro sorotipos de DENV, enquanto oito dos onze epítopos na proteína NS5 que induziram uma forte resposta em doadores DENV/ZIKV exibiram uma identidade de sequência maior do que 66,7% com os quatro sorotipos de DENV (Tabela 3). Para determinar se a magnitude aumentada da resposta estava correlacionada com o reconhecimento de peptídeos com uma identidade de sequência mais alta com o DENV, os inventores plotaram as respostas cumulativas para cada peptídeo em relação à porcentagem de identidade entre as sequências de DENV e

ZIKV. Entre os doadores ZIKV, apenas quatro peptídeos ZIKV com cerca de 60% de identidade com DENV puderam provocar uma resposta maior que 300 SFC por milhão de células, enquanto vinte e um peptídeos ZIKV com pelo menos 70% de identidade com DENV induziam essa forte resposta em doadores DENV/ZIKV (Figura 3); os quatro peptídeos que induziram a resposta mais forte de células T nesses doadores compartilharam a identidade de sequência mais alta com o DENV. Em conjunto, estes dados suportam fortemente a ativação de células T de reação cruzada induzida após infecções por DENV e ZIKV, que reconhecem epítopos comuns entre DENV e ZIKV, e dominam a resposta de células T contra ZIKV.

TABELA 3 EPÍTOPOS IMUNODOMINANTES EM DOADORES ZIKV E DENV/ZIKV (COM SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DEFINIDAS NAS SEQ ID NOS: 17, 25, 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 E 76-93) ZIKV DENV/ZIKV % de identidade Peptíde SFC/milh SFC/milh DEN DEN DEN DEN Sequência Doadore Doadore oa ão de ão de V1 V2 V3 V4 s s PBMCsb PBMCsb C49-63 AILAFLRFTAIKPS 60 60 28,63 365 60,0 53,3 60,0 40,0 L % % % % E67-81 DMASDSRCPTQG 33 465 66,7 53,3 66,7 53,3 EAY % % % % E87-101 DTQYVCKRTLVD 56 505 66,7 53,8 73,3 66,7 RGW % % % % NS119-33 VFVYNDVEAWRD 21,46,60 195 28,56 380 46,7 33,3 46,7 40,0 RYK % % % % NS155-69 CGISSVSRMENIM 35,46 125 56 275 67,1 66,3 60,0 60,0 WR % % % % NS191- GSVKNPMWRGP 21,35,46, 275 28 165 13,3 33,3 20,0 33,3 105 QRLP 60 % % % % NS1107- PVNELPHGWKA 28,53 430 40,0 46,7 46,7 50,5 121 WGKS % % % % NS1147- HRAWNSFLVEDH 46 40 33,53 445 66,7 73,3 66,7 76,2 161 GFG % % % % NS1163- FHTSVWLKVRED 46 35 20,28,55 450 46,7 46,3 53,3 46,7 177 YSL % % % % NS1195- HSDLGYWIESEK 28,33 615 80,0 73,3 66,2 73,3 209 NDT % % % %

ZIKV DENV/ZIKV % de identidade Peptíde SFC/milh SFC/milh DEN DEN DEN DEN Sequência Doadore Doadore oa ão de ão de V1 V2 V3 V4 s s PBMCsb PBMCsb NS2B11 AAGAWYVYVKTG 55 445 33,3 33,3 26,7 26,7 7-131 KRS % % % % NS3131- PAGTSGSPILDKC 21,42 405 26,55,63 495 53,3 60,8 53,3 54,3 145 GR % % % % NS3143- CGRVIGLYGNGV 21 350 20,55,63, 550 60,0 66,7 72,3 80,0 157 VIK 66 % % % % NS3311- AAIFMTATPPGTR 28,33 470 80,0 80,0 93,3 80,0 325 DA % % % % NS513-27 KARLNQMSALEF 55,69 405 53,3 46,7 53,3 40,0 YSY % % % % NS5293- WFFDENHPYRT 55, 69 1620 66,7 66,7 60,0 66,7 307 WAYH % % % % NS5297- ENHPYRTWAYHG 55,69 1330 80,0 80,0 73,3 80,0 311 SYE % % % % NS5325- VVRLLSKPWDVV 28, 55, 495 73,3 80,0 73,3 66,7 339 TGV 66 % % % % NS5345- TDTTPYGQQRVF 33,55,69 4195 93,3 93,3 93,3 93,3 359 KEK % % % % NS5373- QVMSMVSSWLW 60 130 55,66,69 340 40,0 53,3 46,7 46,7 387 KELG % % % % NS5461- KKQGEFGKAKGS 28,53 405 93,3 93,3 93,3 86,7 475 RAI % % % % NS5465- EFGKAKGSRAIW 28,53,55, 1085 100,0 100,0 100,0 93,3 479 YMW 56 % % % % NS5473- RAIWYMWLGARF 28,55 505 100,0 100,0 93,3 100,0 487 LEF % % % % NS5481- GARFLEFEALGFL 28,53,56, 1870 93,3 100,0 93,3 100,0 495 NE 63 % % % % NS5546- RFDLENEALITNQ 28,53,66 515 60,0 47,1 53,3 60,0 560 ME % % % % NS5573- TYQNKVVKVLRP 28,53,56 615 72,9 66,7 73,3 80,0 586 AEK % % % % NS5849- CGSLIGHRPRTT 60 90 33,55 340 66,7 66,7 66,7 66,7 863 WAE % % % % † Acumulado SFC/milhão de PBMCs * A posição dos peptídeos foi determinada de acordo com a sequência de referência NCBI: YP_002790881.1

[122] Neste estudo, usando PBMCs de doadores de sangue humano infectados com ZIKV, os inventores identificaram vários epítopos de células T que são específicos para ZIKV ou compartilhados entre DENV e ZIKV. Enquanto as respostas de células T específicas para DENV são predominantemente direcionadas contra NS3, NS4B e NS5, a resposta contra ZIKV foi principalmente direcionada a epítopos nas proteínas NS1, NS3 e NS5.

A resposta de IFN-γ mais forte e mais ampla contra peptídeos da proteína NS5, observada em doadores previamente infectados com DENV, levou os inventores a postular que esta região continha mais peptídeos reconhecidos por células T de reação cruzada, ao passo que a proteína NS1 foi preferencialmente direcionada para células T específicas para ZIKV. Esses dados são consistentes com a maior porcentagem de identidade observada entre as sequências de ZIKV e DENV na proteína NS5, em comparação com a proteína NS1. Além de sua identidade de sequência, a alta secretabilidade de NS1 observada com as linhagens asiáticas de ZIKV (Liu Y, et al. 2017, Nature 545 (7655): 482-486) também poderia explicar a maior frequência de células T específicas para NS1 induzidas em doadores infectados com ZIKV, em comparação com a frequência de células T específicas para NS1 observadas em doadores infectados por DENV (Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci USA 110 (22): E2046-2053).

[123] Para vários epítopos, os peptídeos de 15-mer ou 9-mer correspondiam aos epítopos recentemente identificados em camundongos transgênicos que expressam moléculas de HLA humano, confirmando assim a restrição de alelo de classe I para esse peptídeo. Esse é o caso do peptídeo de 15-mer VARVSPFGGLKRLPA (com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 92) que induziu uma resposta em um doador que expressa o alelo HLA-B*0702 (dados não mostrados), que continha o peptídeo C25-35 SPFGGLKRLPA (com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 93)

e demonstrou provocar uma resposta significativa em camundongos transgênicos HLA-B*0702 infectados com ZIKV (Wen J, et al. 2017, Nat Microbiol 2: 17036). As mesmas correlações foram estabelecidas com peptídeos NS3 (FPDSNSPIM, com a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 94), NS4B (RGSYLAGASLIYTVT, com a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 95) e NS5 (NQMSALEFYSY, com a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 96) que induziram uma forte resposta em doadores humanos que expressam os alelos HLA-B*0702 e HLA-A*0101, respectivamente (dados não mostrados e Tabela 2), e em camundongos transgênicos expressando esses alelos (Wen J, et al.

2017, Nat Microbiol 2: 17036). Em outros casos, os epítopos identificados em camundongos transgênicos HLA-B*0702 e HLA-A*0101 também foram identificados em doadores respondedores que, no entanto, não expressam estes alelos, tais como os peptídeos NS3219-233 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 28) (Tabela 2) e NS1 19-33 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 78) ou NS5 13-27 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 46) (Tabela 3), que provocaram uma resposta em doadores que não expressavam nenhum dos dois alelos, HLA-B*0702 ou HLA-A*0101. Para estes doadores, uma possibilidade pode ser que o epítopo identificado em camundongos transgênicos tinha uma maior afinidade para um alelo HLA humano diferente do alelo expresso pelos camundongos transgênicos, ou que o peptídeo de 15- mer continha outro epítopo que se ligava a um alelo diferente. Estudos de ligação com epítopos de 9-mer e ensaios de estabilização de HLA classe I utilizando células deficientes de TAP devem discriminar entre essas possibilidades.

[124] Os inventores também divulgaram a identificação de vários peptídeos que compartilham sequências comuns com DENV e eram preferencialmente alvos de células T de reação cruzada, após a infecção por DENV e ZIKV. Dentre estes peptídeos, os peptídeos NS5 293-307 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 48) e NS5 297-311 (possuindo a sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 52) que continham a sequência de aminoácidos HPYRTWAYH (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 49), que compartilhava sete aminoácidos com um epítopo previamente identificado em habitantes de ilhas do Pacífico infectados com DENV1 (Imrie A, et al. 2007, J. Virol. 81 (18).): 10081-10091).

De forma similar, o peptídeo NS5325-339 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 86) continha a sequência de aminoácidos KPWDVVTGV (possuindo a sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 97), que, igualmente, era 66,7% idêntico ao epítopo KPWDVIPMV (com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 98) identificada nesses indivíduos infectados com DENV1 (Imrie A, et al. 2007 J. Virol. 81 (18): 10081- 10091). Finalmente, o peptídeo NS5345-359 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 58), o peptídeo NS5 465-479 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 88) e o peptídeo NS5 481-495 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 89) que induzem a resposta mais forte em doadores DENV/ZIKV (Tabela 3) também continham epítopos de 9-mer que foram previamente identificados em indivíduos infectados por DENV (Weiskopf D, et al. 2015, J. Virol. 89 (1): 120- 128). Em conjunto, estes dados revelam a ativação de células T de reação cruzada DENV/ZIKV que dominam a resposta após infecções consecutivas por DENV e ZIKV. Notavelmente, embora estes peptídeos com reatividade cruzada exibam um elevado grau de identidade de sequência com o DENV e possam estimular uma resposta de células T após a infecção por DENV, estes peptídeos não induzem uma resposta após a infecção primária por ZIKV, o que sugere que estes peptídeos eram imunodominantes no contexto de DENV, mas não no contexto de infecção por ZIKV.

Este resultado é esperado, pois a imunodominância de um epítopo ou sua abundância relativa depende dos outros epítopos expressos pela proteína.

Isto também está de acordo com observações anteriores que mostram que a produção de epítopos se correlaciona com a clivabilidade dos resíduos de flanqueamento expressos na sequência da proteína (Zhang SC, et al. 2012, J.

Immunol. 188 (12): 5924-

5934). De modo importante, para estes epítopos de reatividade cruzada, a ausência de uma resposta de células T em doadores infectados com ZIKV não é simplesmente devido à ausência do alelo HLA de apresentação nesta população, pois a maior parte dos alelos expressos em doadores DENV/ZIKV respondedores também foi expressa em doadores ZIKV (Tabela 1). Isto é o que os inventores observaram para os peptídeos NS5 13-27 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 46), NS5 293-307 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 48), NS5 345-359 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 57) e NS5 546-560 (possuindo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 67), previstos como fortes ligantes aos alelos HLA-B*3501 e HLA-B*4002, respectivamente, que foram frequentemente expressos por doadores ZIKV (Tabela 2 e Figura 3). Em conjunto, estes resultados mostraram que, no caso de infecção inicial por ZIKV,

houve reconhecimento preferencial de epítopos específicos para ZIKV, ao passo que houve uma resposta de células T mais frequente e mais forte contra epítopos de reatividade cruzada após uma infecção heteróloga por

DENV/ZIKV.

Interessantemente, a forte resposta de células T observada em doadores DENV/ZIKV contra estes epítopos NS5 baseia-se principalmente em doadores que expressam o alelo HLA-B*3501, um alelo associado com respostas de magnitude elevada contra DENV, e uma maior proteção contra infecção e doença por DENV (Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci USA

110 (22):E2046-20 53). Como todas as amostras de sangue foram obtidas de doadores com histórico de infecção assintomática por ZIKV, os inventores não conseguiram relacionar a força da resposta de células T específica para ZIKV obtida em doadores HLA-B*3501 quanto à proteção contra a doença. Estudos adicionais com mais indivíduos com maior suscetibilidade à doença após infecção primária por ZIKV são necessários para determinar se, como para DENV, existe um papel protetor vinculado ao HLA para células T na infecção por ZIKV. Da mesma forma, também seria importante comparar a gravidade da doença em doadores que sofreram ou não uma infecção prévia por DENV, para determinar se as células T com reatividade cruzada induzidas após a infecção por DENV poderiam mediar uma melhor proteção contra a infecção e doença por ZIKV, como sugerido recentemente em camundongos (Wen J, et al.

2017, Nat Microbiol 2: 17036; Elong Ngono A, et al. 2017, Cell host & microbe 21 (1): 35-46). Como as células T CD4+ e CD8+ demonstraram contribuir para a proteção contra a infecção por DENV, é necessária uma análise abrangente da resposta restrita ao MHC classe II para determinar o papel do CD4 na infecção por ZIKV e na proteção da doença. Finalmente, análises fenotípicas adicionais de células T específicas para ZIKV, em doadores assintomáticos ou sintomáticos, ajudarão a definir correlatos de proteção na imunidade natural e vacinação contra infecção e doença por ZIKV. Será particularmente importante determinar se, como nas células T específicas para DENV, respostas fortes contra peptídeos específicos para ZIKV são mais frequentes em alelos HLA específicos e estão associadas à multifuncionalidade (Weiskopf D, et al. 2013, Proc Natl Acad Sci USA 110 (22): E2046-2053).

[125] Em conclusão, embora muitos estudos tenham se concentrado na resposta de anticorpos contra o ZIKV, mais especificamente na identificação de epítopos de células B compartilhados entre o ZIKV e DENV, pouco se sabe sobre o papel das células T no controle da infecção por ZIKV.

Usando PBMCs de doadores de sangue com histórico recente de infecção por

ZIKV, soropositivos ou não para DENV, os inventores estabeleceram o primeiro mapa da distribuição de epítopos de células T de ZIKV, pesquisando o proteoma completo pelo ensaio para interferon gama (IFN-γ) por imunoadsorção ligado à enzima em pontos (ELISPOT). Os inventores mostram que as proteínas não estruturais NS1, NS3 e NS5 contêm mais dos peptídeos imunodominantes que induzem uma forte resposta de células T. Os inventores também mostraram que a proteína NS5 continha muitos epítopos compartilhados por ambos os vírus e que induziam a resposta mais alta após infecções por DENV e ZIKV. Surpreendentemente, os doadores com histórico de infecção por DENV revelaram uma resposta substancial contra peptídeos previamente identificados como epítopos de células T CD8 + de DENV. As respostas mais fortes de células T observadas nesses doadores corresponderam a sequências com alto nível de identidade de aminoácidos com os quatro sorotipos de DENV, sugerindo a ativação de células T com reatividade cruzada. Esses resultados têm implicações cruciais para futuras vacinas contra o ZIKV e DENV e oferecem novas oportunidades para estudar o papel de epítopos de células T específicos para o ZIKV e compartilhados pelo DENV/ZIKV na indução de imunidade em longo prazo contra esses vírus.

VACINAÇÃO DE DNA POLI-ZIKV EM CAMUNDONGOS

[126] Imunização de DNA será realizada utilizando o plasmídeo que codifica o poliepítopo quimérico e eletroporação, com 2 x 50 μg de DNA, com 3 semanas de intervalo e desafio de 15 dias após a imunização de reforço com o vírus (injeção intraperitoneal de ZIKV com 103 pfu/camundongo).

[127] A vacinação de DNA com plasmídeos e eletroporação (EP) será realizada da seguinte forma: - Para a vacinação, duas injeções de 25 μL cada de DNA a 2 mg/mL serão realizadas por inoculação intradérmica nas costas, seguida imediatamente por eletroporação usando o aparelho AgilePulse (BTX Harvard

Apparatus).

[128] O procedimento de eletroporação irá consistir de 3 grupos de tensão: - Grupo 1: 450V, comprimento de pulso 50 µseg, intervalo de pulso de 0,2 µseg, pulsos Nb: 1; Grupo 2: 450V, comprimento de pulso 50 µseg, intervalo de pulso de 50 µseg, pulsos Nb: 1; Grupo 3: 110V, comprimento de pulso 10 mseg, intervalo de pulso de 20 mseg, pulsos Nb: 8.

[129] No dia -1 antes do desafio com o ZIKV, a injeção intraperitoneal com 2 mg de anticorpo anti-IFNAR (MAR1-5A3) será realizada para bloquear transitoriamente a resposta de IFN tipo I.

[130] A viremia será quantificada por qRT-PCR em amostras de plasma a partir do dia 1 até o dia 6 após o desafio.

VACINAÇÃO DE DNA EM PRIMATAS NÃO HUMANOS (MACACOS RHESUS INDIANOS)

[131] A vacinação de DNA será realizada por 2 injeções intramusculares com 1 mg de plasmídeo codificante do poliepítopo quimérico de ZIKV, nas semanas 0 e 4, seguido de um desafio após 4 semanas por inoculação subcutânea de 104 pfu de ZIKV, conforme descrito anteriormente (Dowd, KA, et al. Science 2016, 354, 237-240).

[132] As PBMCs serão coletadas no dia 0 (antes da imunização inicial (prime)), dia 7 após a imunização inicial, e então no dia 35 (uma semana após a imunização de reforço (boost)) e no dia 60 (antes do desafio com ZIKV), para analisar a resposta das células T (IFN-γ e TNF-α) por ELISpot contra peptídeos sobrepostos que cobrem a sequência inteira do poliepítopo quimérico. O número e o fenótipo dos monócitos CD14, DCs, células T, células B e células NK e o perfil de citocinas das células T (células T CD8) serão analisados por coloração intracelular.

[133] As amostras de sangue também serão coletadas no dia 0 (antes da imunização), dia 14, dia 28 (antes do reforço) e dia 56 (antes do desafio) para determinar os títulos de anticorpos neutralizantes por Testes de Neutralização por Redução de Focos Virais (FRNT).

[134] As amostras de plasma serão testadas para quantificação da viremia por qRT-PCR, diariamente desde o dia 56 (antes do desafio) até o dia 66.

PROTOCOLO ALTERNATIVO USANDO VACINAÇÃO DE DNA COM PLASMÍDEOS QUE EXPRESSAM CITOCINAS, COMO ADJUVANTES GENÉTICOS PARA REMOVER A ELETROPORAÇÃO

[135] Estudos recentes mostraram que a coadministração de plasmídeos que expressam epítopos de células T com plasmídeos que expressam IL-12 ou GM-CSF, ou uma combinação de IL-12 e GM-CSF melhora a resposta das células T de maneira suficiente para remover a necessidade da eletroporação (EP) (Boyer, J.D., et al. J Med Primatol 2005, 34, 262-270; Suschak, J.J., et al. The Journal of infectious diseases 2018; Suschak, J.J., et al. Antiviral research 2018, 159, 113-121).

[136] Os inventores avaliarão, assim, o efeito da imunização com DNA para IL-12 e GM-CSF combinada com imunização com DNA Poli-ZIKV na magnitude da resposta de células T contra peptídeos ZIKV e na proteção imunológica contra a infecção por ZIKV em macacos Rhesus.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, caracterizado por compreender; (i) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (a) e (b), ou (ii) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (a) e (c), ou (iii) pelo menos os seguintes epítopos de células T de (b) e (c): (a) um epítopo de células T da proteína não estrutural (NS) NS1 de um vírus Zika (ZIKV) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10-12, 14, 15, 17-19, 23, 24 e 78-83, (b) um epítopo de células T da proteína NS3 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 33-35, 84 e 85, (c) um epítopo de células T da proteína NS5 de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48-50, 52-55, 57-60, 62, 64, 67, 69, 72, 73 e 86-91, ou um epítopo de células T variante, que difere da sequência de aminoácidos original do epítopo de células T de (a), (b) ou (c) por mutação pontual em um ou mais resíduos de aminoácidos, e que possui pelo menos 90% de identidade de sequência ou mais de 95% de identidade de sequência ou 99% de identidade de sequência com a referida sequência original.

2. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender pelo menos os epítopos de células T de (a), (b) e (c), ou um epítopo de células T variante dos mesmos.

3. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por consistir; (i) nos epítopos de células T de (a) e (b), ou (ii) nos epítopos de células T de (a) e (c), ou (iii) nos epítopos de células T de (b) e (c), ou (iv) nos epítopos de células T de (a), (b) e (c) ou epítopos de células T variantes dos mesmos.

4. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado; pelo epítopo de células T de (a) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17, 23 e 78-83; pelo epítopo de células T de (b) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31, 33, 84 e 85; e pelo epítopo de células T de (c) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48, 52, 57, 62, 64, 67 e 86-91.

5. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo epítopo de células T de (a) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 11, 12, 17-19, 23, 24, 78, 80 e 83, pelo epítopo de células T de (b) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 31, 33, 34, 84 e 85, e pelo epítopo de células T de (c) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 48-50, 52-55, 57, 58, 60, 62, 67, 88, 89 e 90.

6. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por compreender pelo menos um epítopo de células T de uma proteína ZIKV selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um epítopo de células T da proteína de C de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4-6 e 75; (ii) um epítopo de células T da proteína E de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 76 e 77;

(iii) um epítopo de células T da proteína NS2B de um ZIKV compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (iv) um epítopo de células T da proteína NS4A de um ZIKV compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, e (v) um epítopo de células T da proteína NS4B de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 40-43.

7. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo referido pelo menos um epítopo de células T de uma proteína ZIKV ser selecionado a partir do grupo que consiste: - no epítopo de células T da proteína de C de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4-6 e 75; e - no epítopo de células T da proteína NS4B de um ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 40-43.

8. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por possuir uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99.

9. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por ser (i) para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano ou (ii) para uso na prevenção de infecções por ZIKV e vírus da Dengue (DENV) em um sujeito humano.

10. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelos epítopos de células T serem epítopos específicos de

ZIKV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 10, 11, 19, 27, 31, 40-43, 46, 72, 73, 75, 78-80, 82, 84, 85, 87 e 91.

11. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, para uso na prevenção de infecções por ZIKV e DENV em um sujeito humano de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelos epítopos de células T serem epítopos de reatividade cruzada ZIKV-DENV compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consiste nas SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 12, 14, 15, 17-19, 23, 24, 27, 28, 33-35, 40, 41, 46, 48-50, 52-55, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 73, 84, 85 e 86-91.

12. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado por suscitar uma resposta de células T CD8+ e/ou CD4+ restrita ao antígeno leucocitário humano (HLA) (i) contra ZIKV ou (ii) contra ZIKV e DENV, em particular o DENV sorotipo 1 (DENV1), DENV sorotipo 2 (DENV2), DENV sorotipo 3 (DENV3) e DENV sorotipo 4 (DENV4).

13. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelos epítopos de células T serem montados em um polipeptídeo de fusão.

14. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo ZIKV ser da linhagem Africana, em particular da cepa Africana ArD158084 (GenBank: KF383119) ou cepa Africana ArD128000 (GenBank: KF383117), ou isolado Africano ARB13565 (GenBank: KF268948), ou a partir da linhagem asiática, em particular a partir da cepa asiática FLR (GenBank: KX087102), ou isolado asiático SSABR1 (GenBank: KU707826), ou isolado asiático Z1106031 (GenBank: KU312314), ou isolado asiático Bahia07 (GenBank: KU940228), ou cepa asiática FVM00318/VEN/Maracay/2016 (GenBank: KY693680), ou isolado asiático FLR (GenBank: KU820897).

15. POLINUCLEOTÍDEO isolado ou purificado, caracterizado por codificar o poliepítopo quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. VETOR, em particular um vetor não replicante adequado para a entrega do poliepítopo quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo referido vetor ser uma molécula recombinante transportando o poliepítopo, ou um vetor de expressão de mamífero ou viral que expressa o poliepítopo.

17. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 15.

18. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por ser transformada com o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 15 ou com o vetor de acordo com a reivindicação 16 ou 17.

19. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por ser uma célula eucariótica, tal como uma célula de ave, em particular uma célula CEF (fibroblastos de embrião de galinha), uma célula de mamífero, célula HEK-293 (de rim embrionário humano) ou uma célula de levedura.

20. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada por compreender pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste: (i) no poliepítopo quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, (ii) no polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 15, (iii) no vetor de acordo com a reivindicação 16 ou 17, e (iv) na célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18 ou

19.

21. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por compreender um adjuvante e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

22. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada por ser formulada para uma administração por via parenteral, tal como por injeção subcutânea (s.c.), intradérmica (i.d.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.) ou intravenosa (i.v.).

23. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 22, caracterizada pela referida composição ser administrada em uma ou várias doses de administração, em particular em um regime de administração de dose inicial-reforço (prime-boost).

24. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 23, caracterizada por ser; (i) para uso na prevenção de uma infecção por ZIKV em um sujeito humano; ou (ii) para uso na prevenção de infecções por ZIKV e vírus da Dengue (DENV) em um sujeito humano.