CN102181408A - 圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

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CN102181408A CN 201110032709 CN201110032709A CN102181408A CN 102181408 A CN102181408 A CN 102181408A CN 201110032709 CN201110032709 CN 201110032709 CN 201110032709 A CN201110032709 A CN 201110032709A CN 102181408 A CN102181408 A CN 102181408A
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胡孔新
郭雪
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杨鹏飞
平芮巾
张丽萍
马雪征
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Abstract

本发明公开了一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用，本发明中通过哺乳动物细胞表达系统得到的圣路易斯脑炎病毒样颗粒是非复制型的，结构接近天然病毒，且免疫原性好，可作为天然病毒抗原建立检测圣路易斯脑炎感染的免疫检测方法，表达路易斯脑炎包膜蛋白的293T细胞，可建立间接免疫荧光检测方法，进一步的应用还包括将得到的病毒样颗粒或重组蛋白可按一定的作用剂量作为亚单位疫苗直接用于人体用于预防圣路易斯脑炎病毒感染及诊断试剂的研发。

Description

圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于病毒学、分子生物学和生物制品领域，尤其是一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用。
背景技术
圣路易斯脑炎病毒属于黄病毒科，黄病毒属，1933年在美国圣路易、堪萨斯和密苏里等地约发生3000多例圣路易斯脑炎病毒感染，于死亡病人脑中分离到此病毒而得名。圣路易斯脑炎病毒是有包膜的线性单股正链RNA病毒，基因组RNA约为11kb，病毒颗粒为圆形，大小约40～60 nm。通常，圣路易斯脑炎病毒的结构蛋白中，C蛋白构成病毒核衣壳，M蛋白、E蛋白为病毒的包膜蛋白。PrM蛋白是膜蛋白M的前体，除具有抗原功能区外，还有助于E蛋白的正确折叠及稳定。E蛋白位于病毒颗粒的脂质双层中，构成病毒颗粒表面的突起，含有多种B细胞和T细胞抗原表位，是圣路易斯脑炎病毒的主要保护性抗原。因此，prM蛋白和E蛋白成为研究圣路易斯脑炎的重要靶标。
圣路易斯脑炎作为严重损害人类健康的病原微生物，具有高度传染性，一经流行将引发巨大社会恐慌，因此，研制快速高效的诊断试剂并找到一种有效的疫苗对于防止圣路易斯脑炎感染无疑具有重要意义。
尽管相关的研究工作在不少实验室开展，但由于圣路易斯脑炎病毒的高度传染性，其病原体研究必须在P3级实验室中进行，这也极大的限制了对圣路易斯脑炎病毒的进一步了解。病毒样颗粒由于类似真实的病毒颗粒结构并不具有感染性使之成为用于圣路易斯脑炎病原体研究的安全的替代模型；其效果优于基于单个病毒蛋白的免疫学检测方法已得到证明，因此病毒样颗粒的研制成功对于烈性病毒诊断试剂的研制具有显著价值；同时，病毒样颗粒代表一类特殊的亚单位疫苗，相比之下，它们更容易被机体免疫系统识别，并以一个更接近真实构象的形式呈递病毒抗原，因而是一个非常好的疫苗候选物。病毒样颗粒是模拟真实病毒颗粒结构的一种高效的亚单位疫苗，并且不含有感染性的病毒遗传物质；实际上，病毒样颗粒完全没有RNA或DNA病毒的基因组成分，只是具有灭活病毒或减毒活疫苗病毒颗粒衣壳的真实构象，因而没有病毒毒力回复或病毒基因重组或重配的可能。
因此，作为一种很有发展前景的疫苗候选物和安全的病毒研究替代模型，对于圣路易斯脑炎病毒这样的病原体研究和预防控制无疑具有更为重要的意义。
开发一种方便、可靠的血清诊断方法来检测受感染个体血清内的抗圣路易斯脑炎病毒抗体不仅有利于临床病毒病的诊断，而且对于感染流行病学都具有重要的意义。在血清学免疫检测如EIA中使用细菌表达蛋白作为抗原存在较多潜在缺点。例如，在将大肠杆菌裂解液作为抗原用于免疫测试时会造成患者血清与大肠杆菌蛋白的非特异性交叉反应性（Purdy等，1992，Archives of Virology,123:335-349）。另外，已经证明，膜糖蛋白上的一些抗原和免疫原性表位与构象高度相关，在大肠杆菌中表达的糖蛋白丧失了免疫原性和抗原性。
此外，信号肽在外源蛋白质的表达中具有重要作用，不仅能引导外源蛋白质的分泌表达，还与蛋白质或其新生肽链在细胞内的全方位的定位有关。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，该方法具体为：
1）选取 GenBank数据库中圣路易斯脑炎病毒Hubbard的基因序列、基因序列序列号为EU566860，进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，获得重组质粒；
2）重组质粒转染哺乳动物细胞293T，转染的293T细胞收获后进行瞬时表达分析；
3）通过相应的纯化方法获得相应的表达蛋白，并形成圣路易斯脑炎病毒样颗粒。
进一步，所述步骤1）中PCR方法进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，该PCR方法具体为：
1)      设计用于信号肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信号肽上游引物JF:5’CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’和下游引物JR:5’TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTCCTGCACAAGCTATGA 3’；ME上游引物 MEF：5’ TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3’和下游引物MER：5’ CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3’；
2)      以划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，以信号肽和SLEV-ME基因为模板，通过融合PCR扩增JME基因全长；
3)      凝胶回收试剂盒胶回收SLEV-JME片段，分别对SJME和pcDNA5/FRT进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收后T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α，挑取单克隆菌落，扩菌提取重组质粒。
进一步，所述扩增条件为：先于95℃、5 min，然后95℃、30s，65℃、30 s，72℃、3 min，扩增35个循环，72℃、10min。
进一步，所述步骤2）中重组质粒转染哺乳动物细胞293T的具体步骤为：转染前18-24小时接种细胞到T25细胞瓶中；将10ug质粒加入1ml无血清培养基中，再加入20ulPEI，室温孵育10min;倒掉旧的培养基，用无血清培养基洗两遍；加2ml培养基，37℃/5%CO2孵育3小时后补加2ml培养基，72小时后进行瞬时表达分析。
进一步，所述步骤3）中纯化方法具体为：
1） 将所述转染的293T细胞收获物经反复冻融及超声破碎；
2） 将上清和破碎细胞离心去除细胞碎片；
3） 将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤；
4） 收集上清，100KD超滤浓缩后加PBS离心缓冲液重复超滤浓缩；
5） 弃去上清， PBS重悬；
6） 用10%-60%的连续性蔗糖梯度离心；
7） 离心分层后，逐层向下穿刺收集各个层面的所有样品，分层收集各样品包被ELISA通过E蛋白单克隆抗体或圣路易斯脑炎病毒多克隆血清确定重组蛋白位置，获得圣路易斯脑炎病毒样颗粒。
一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒的293T细胞为抗原建立的间接免疫荧光检测方法，具体为：收集转染设定时间后的细胞，用预冷的1xPBS清洗细胞，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，用冷丙酮进行固定，加入稀释的抗SLEV抗体37度孵育设定时间，漂洗液洗涤; 加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠IgG 室温结合；漂洗液洗涤后于荧光显微镜下观察。
一种以纯化的圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的蛋白印迹检测方法，具体为：
1）裂解的蛋白行SDS-PAGE后转膜；
2） 封闭：将膜放入可密封的塑料袋中，加入适量的TBS配置的脱脂奶封闭液中，室温封闭设定时间；
3）抗体的结合：用TBS配置的脱脂奶稀释纯化的抗SLEV 鼠单克隆抗体作为一抗，将PVDF膜与稀释好的抗体室温摇床孵育设定时间；
4）洗去未结合的抗体：用TBS-T漂洗滤膜；
5）二抗的结合：用TBS配置的脱脂奶稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，将洗涤后的PVDF膜与稀释好的二抗室温摇床孵育设定时间后，将膜用TBS-T洗涤；
6）DAB显色：用TBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20，将膜放入DAB底物显色液中显色，注意观察显色情况，至棕色条带出现时终止反应，照相后避光保存。
进一步，所述步骤1）具体为：
a 取样品进行SDS-PAGE；
b当电泳结束时，用蒸馏水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2张3MM滤纸和一张PVDF滤膜，使其大小与凝胶大小相适应；
d.先将滤纸浸入转移缓冲液中，至少平衡15min,PVDF膜需进行前处理，置于100％甲醇中浸湿约5min将膜激活，再用转移缓冲液漂洗2次；
e.半干转移仪下面的电极是阳极，故在转移缓冲液中按从下至上的顺序排列：滤纸－转移膜－凝胶－滤纸(可在膜的右上角切一标记，以标记膜的正反面),各层之间应避免留有气泡；
f.将其置入半干转移仪中，胶侧置负极，膜侧置正极；
g.通电转移：根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，电转移45min；
h.转移结束后，断开电源并拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，凝胶可移至盛有考马斯亮蓝染色液的托盘中进行染色，以便检查蛋白转移是否完全，PVDF膜用于下一步实验。
一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的检测圣路易斯病毒抗体的间接ELISA法，具体为：
1）包被抗原：将纯化的蛋白抗原用ELISA包被液稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；
2）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3）加15％FBS封闭液200ul，37℃放置2h；
4）拍干后超净台风机吹干；
5）加抗体：小鼠抗SLEV抗体用封闭液1:200倍稀释，反应板每孔100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；
6）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次；
7）加辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG, 每孔100ul， 37℃放置1h；
8）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次；
9）加底物：加TMB100ul，室温暗处放置10min；
10）加终止液：每孔50ul；
11）观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数。
一种用于人体以预防圣路易斯脑炎病毒感染的疫苗，它含有所述圣路易斯脑炎病毒样颗粒的配伍组合。
一种检测圣路易斯脑炎病毒的试剂盒，将重组的圣路易斯脑炎病毒样颗粒作为抗原组分构成，用于SLEVIgG ELISA诊断试剂盒或SLEVIgM ELISA诊断试剂盒。
本发明基于当前圣路易斯脑炎病毒的研究现状和293T细胞已经用于重组蛋白大量生产的现实，建立通过这种哺乳动物细胞分泌表达圣路易斯脑炎病毒重组蛋白并使之装配成病毒样颗粒的方法将是非常有用的。该系统产生的重组蛋白具有天然蛋白的免疫学特性，且不含有圣路易斯脑炎病毒感染性基因组，可以作为更具代表性的抗原或者更有效的免疫原，从而应用于圣路易斯脑炎病毒的诊断、预防和治疗工作中。
附图说明
图1为显示Hubbard 和Kern217毒株全基因组同源性分析结果；
图2为显示25株圣路易斯脑炎病毒E基因同源性分析结果；
图3为显示重组质粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鉴定结果；
图4为显示用于真核表达圣路易斯脑炎病毒蛋白而构建的重组质粒；
图5A为正常293T细胞检测结果；
图5B为转染重组质粒PCDNA5-SJME的检测结果；
图6为用圣路易斯脑炎病毒E单抗（millipore）进行Western印迹杂交；
图7A为显示细胞培养上清收获物中病毒样颗粒的电子显微镜照片；
图7B为图7A中C部放大图。
具体实施方式
如图1至图7所示，图1显示Hubbard 和Kern217毒株全基因组同源性分析结果，两个毒株的同源性为94.3%，差异较小。
图2显示25株圣路易斯脑炎病毒E基因同源性分析结果，不同毒株间，SE基因同源性为90.2%-99.7%不等，相对来说差异不大。
图3显示重组质粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鉴定结果，泳道M1为DNA分子量标记物，泳道1显示 BamH I和Xho I双酶切重组质粒，泳道2显示BamH I 单酶切重组质粒pcDNA5/FRT-SJME。
图4显示用于真核表达圣路易斯脑炎病毒蛋白而构建的重组质粒。
图5A、5B显示间接免疫荧光检测蛋白表达结果，图5A为正常293T细胞检测结果，图5B为转染重组质粒PCDNA5-SJME的检测结果。
图6为用圣路易斯脑炎病毒E单抗（millipore）进行Western印迹杂交。泳道1为蔗糖密度梯度超速离心纯化后共表达圣路易斯脑炎病毒Ｍ、Ｅ蛋白的293T细胞收获物沉淀物样品；泳道2显示蔗糖密度梯度超速离心纯化后共表达圣路易斯脑炎病毒Ｍ、Ｅ蛋白的293T细胞培养上清液沉淀物样品；泳道3为正常的293T细胞；泳道M为蛋白质分子量标记物。图中箭头所指A部表示相应蛋白带：膜蛋白Ｅ 。
图7A显示细胞培养上清收获物中病毒样颗粒的电子显微镜照片，这些颗粒是膜蛋白（Ｍ和Ｅ蛋白）在293T细胞中共表达而产生并分泌到上清的。图7B为图7A中B部放大图，该空心颗粒表面具有钉状突起，为在哺乳动物细胞中表达的M、E蛋白共同装配形成。）
本发明针对具有天然圣路易斯脑炎病毒免疫特性的重组圣路易斯脑炎病毒膜蛋白的生产方法和应用。本发明特别针对用于圣路易斯脑炎ELISA诊断试剂的制备及其间接免疫荧光检测试剂的生产。本发明特别针对圣路易斯脑炎病毒感染的预防性疫苗的生产。本发明通过以293T哺乳动物细胞表达圣路易斯脑炎病毒重组蛋白以及共表达M、E蛋白的重组病毒样颗粒进行实际举例说明。这种举例说明不限制本发明的使用范围。
本发明解决的技术问题是要将圣路易斯脑炎病毒PrM、E片段编码区序列克隆到真核表达载体，转染293T细胞，通过相应的纯化方法获得这些表达蛋白并可以形成相应病毒样颗粒成分，以及这些重组蛋白及病毒样颗粒的应用。
本发明涉及制备衍生自圣路易斯脑炎病毒PrM、E片段基因组编码区序列的重组病毒蛋白的方法，它通过将DNA插入表达载体，然后在宿主细胞中表达重组蛋白形成病毒样颗粒。
本发明生产的重组蛋白、病毒样颗粒可用于对圣路易斯脑炎病毒进行临床诊断。可将重组蛋白，病毒样颗粒置于圣路易斯脑炎病毒检测试剂盒的配方中。
提供下列实施例以进一步明确本发明，但并不限制本发明于这些实施例的个别事例。
一：包含引入外源信号肽的圣路易斯脑炎病毒M、E蛋白基因编码区序列的真核表达载体的构建（pcDNA5/FRT -SJME）:
对GenBank数据库中两株圣路易斯脑炎病毒Hubbard 和Kern217全基因组和25个毒株E基因进行比对，最终确定以Hubbard的基因序列(GenBank序列号为EU566860)进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成。
通过拼接PCR方法扩增带有外源信号肽的prM-E基因, 将其基因克隆至pcDNA5/FRT载体，获得重组质粒pcDNA5-SJME。具体步骤如下：
设计用于信号肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信号肽上游引物JF：5’ CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’和下游引物JR：5’ TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTCCTGCACAAGCTATGA 3’；ME上游引物 MEF：5’ TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3’和下游引物MER：5’ CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3’，划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，以信号肽和SLEV-ME基因为模板，通过融合PCR扩增JME基因全长。扩增条件先于95℃、5 min，然后95℃、30s，65℃、30 s，72℃、3 min，扩增35个循环，72℃、10min。
凝胶回收试剂盒胶回收SLEV-JME片段，分别对SJME和pcDNA5/FRT进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收后T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α，挑取单克隆菌落，扩菌提取质粒。
二、重组质粒瞬时转染293T细胞：
以前面构建引入信号肽的共表达圣路易斯脑炎病毒M、E蛋白的重组质粒转染哺乳动物细胞293T，转染的293T细胞收获后进行瞬时表达分析。具体步骤如下：
转染前18-24小时接种细胞到T25细胞瓶中（密度>85%）；将10ug质粒加入1ml无血清培养基中，在加入20ulPEI (1mg/ml)，室温孵育10min;倒掉旧的培养基，用无血清培养基洗两遍。加2ml(2%serum)培养基共3ml，37℃/5%CO2孵育3小时后补加2ml (2%serum)培养基，72小时后进行瞬时表达分析。
三、圣路易斯脑炎病毒蛋白在293T细胞中的表达：
在重组质粒瞬时转染293T细胞的基础上，建立了间接免疫荧光检测转染细胞病毒蛋白表达的鉴定方法，具体步骤如下：
收集转染后细胞，用预冷的1xPBS清洗细胞两遍，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，冷丙酮固定10min，加入稀释的抗SLEV抗体(使用PBS 1:40稀释)37度孵育1 h，漂洗液洗涤5次,每次3min; 加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG 室温结合40min(使用伊文思兰 1:50 稀释)。漂洗液洗涤5 次后于荧光显微镜下观察。
四：哺乳动物细胞表达圣路易斯脑炎病毒样颗粒的纯化：
细胞收获物经反复冻融及超声破碎和细胞培养上清10000rpm 离心10min去除细胞碎片，将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤后，以100KD超滤管浓缩浓缩50000 rpm超速离心弃去上清，细胞重悬于约200ulPBS后，用10%-60%的连续性蔗糖梯度离心，离心分层后，逐层向下穿刺收集各个层面的所有样品，分层收集各样品包被ELISA通过E蛋白单克隆抗体或圣路易斯脑炎病毒多克隆血清确定重组蛋白位置，是为圣路易斯脑炎病毒样颗粒所在组分。具体步骤如下：
（1） 细胞反复冻融3次，超声破碎；
（2） 将上清和破碎细胞 4℃10000rpm 离心10min去除细胞碎片；
（3） 将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤；
（4） 收集上清，100KD超滤浓缩后加PBS离心缓冲液重复超滤浓缩，透过的液体-80℃保存；
（5）50000rpm,3h,4℃(SW55Ti转子)弃去上清，200ul PBS重悬；
（6） 10%-60%的连续性蔗糖梯度离心，30000rpm,2.5h,10℃(SW55Ti转子)；
（7）收集各层，每层55000rpm，3h,4℃ (SW55Ti转子),留沉淀加20ulPBS (蛋白酶抑制剂)，4℃保存。
五：纯化产物的蛋白印迹检测：
Western Blot分析
采用Bio-Rad公司的Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell 进行半干法蛋白质转移实验：
1）裂解的蛋白行SDS-PAGE后转膜
a 取样品进行SDS-PAGE；
b当电泳结束时，用蒸馏水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2张3MM滤纸和一张PVDF滤膜，使其大小与凝胶大小相适应；
d.先将滤纸浸入转移缓冲液中，至少平衡15min,PVDF膜需进行前处理，置于100％甲醇中浸湿约5min将膜激活，再用转移缓冲液漂洗2次；
e.半干转移仪下面的电极是阳极，故在转移缓冲液中按从下至上的顺序排列：滤纸－转移膜－凝胶－滤纸(可在膜的右上角切一标记，以标记膜的正反面),各层之间应避免留有气泡；
f.将其置入半干转移仪中，胶侧置负极，膜侧置正极；
g.通电转移：根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，电转移45min；
h.转移结束后，断开电源并拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，凝胶可移至盛有考马斯亮蓝染色液的托盘中进行染色，以便检查蛋白转移是否完全，PVDF膜用于下一步实验；
2) 封闭：将膜放入可密封的塑料袋中，加入适量的TBS配置的5%（w/v）脱脂奶封闭液中，室温封闭1－2小时；
3）抗体的结合：用TBS配置的5%（w/v）脱脂奶1：200稀释纯化的抗SLEV 鼠单克隆抗体作为一抗，将PVDF膜与稀释好的抗体室温摇床孵育2小时；
4）洗去未结合的抗体：用TBS-T(0.5%的 Tween20)漂洗滤膜3次，每次5min；
5) 二抗的结合：用TBS配置的5%（w/v）脱脂奶1：500稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，将洗涤后的PVDF膜与稀释好的二抗室温摇床孵育1小时后将膜用TBS-T洗涤3次；
6）DAB显色：用50ml TBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20。将膜放入DAB底物显色液中显色10～30分钟，注意观察显色情况。至棕色条带出现时终止反应，照相后避光保存。
六：间接ELISA法的建立：
1）包被抗原：将纯化的蛋白抗原用ELISA包被液稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；
2）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3）加１５％FBS封闭液200ul，37℃放置2h；
4）拍干后超净台风机吹干；
5）加抗体：小鼠抗SLEV抗体用封闭液1:200倍稀释，反应板每孔100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；
6）洗涤同2）；
7）加辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG（1:5000倍稀释）, 每孔100ul， 37℃放置1h；
8）洗涤同2）；
9）加底物：加TMB100ul，室温暗处放置10min；
10）加终止液：每孔50ul；
11）观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数。
本发明中，使圣路易斯脑炎病毒样颗粒能够高分泌表达的信号肽及包含编码包括所述信号肽和圣路易斯脑炎病毒包膜蛋白（M，E）重组病毒的构建及其在相应重组病毒感染哺乳动物细胞中的共表达，以及由这些共表达蛋白在哺乳动物细胞中自动组装而形成的病毒样颗粒。以哺乳动物细胞生产的这些蛋白或病毒样颗粒可作为抗原建立圣路易斯脑炎病毒的免疫检测方法，亦可用于制备圣路易斯脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发及治疗方面。通过哺乳动物细胞表达系统得到的圣路易斯脑炎病毒样颗粒是非复制型的，结构接近天然病毒，且免疫原性好，可作为天然病毒抗原建立检测圣路易斯脑炎感染的免疫检测方法，表达路易斯脑炎包膜蛋白的293T细胞，可建立间接免疫荧光检测方法，进一步的应用还包括将得到的病毒样颗粒或重组蛋白可按一定的作用剂量作为亚单位疫苗直接用于人体用于预防圣路易斯脑炎病毒感染。

Claims (10)

1.一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，该方法具体为：
1）选取 GenBank数据库中圣路易斯脑炎病毒Hubbard的基因序列、基因序列序列号为EU566860，进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，获得重组质粒；
2）重组质粒转染哺乳动物细胞293T，转染的293T细胞收获后进行瞬时表达分析；
3）通过相应的纯化方法获得相应的表达蛋白，并形成圣路易斯脑炎病毒样颗粒。
2. 如权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR方法进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，该PCR方法具体为：
1）设计用于信号肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信号肽上游引物JF:5’CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’和下游引物JR:5’TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTCCTGCACAAGCTATGA 3’；ME上游引物 MEF：5’ TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3’和下游引物MER：5’ CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3’；
2）以划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，以信号肽和SLEV-ME基因为模板，通过融合PCR扩增JME基因全长；
3）凝胶回收试剂盒胶回收SLEV-JME片段，分别对SJME和pcDNA5/FRT进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收后T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α，挑取单克隆菌落，扩菌提取重组质粒。
3. 如权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中重组质粒转染哺乳动物细胞293T的具体步骤为：转染前18-24小时接种细胞到T25细胞瓶中；将10ug质粒加入1ml无血清培养基中，再加入20ulPEI，室温孵育10min;倒掉旧的培养基，用无血清培养基洗两遍；加2ml培养基，37℃/5%CO2孵育3小时后补加2ml培养基，72小时后进行瞬时表达分析。
4. 如权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中纯化方法具体为：
1） 将所述转染的293T细胞收获物经反复冻融及超声破碎；
2） 将上清和破碎细胞离心去除细胞碎片；
3） 将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤；
4） 收集上清，100KD超滤浓缩后加PBS离心缓冲液重复超滤浓缩；
5） 弃去上清， PBS重悬；
6） 用10%-60%的连续性蔗糖梯度离心；
7） 离心分层后，逐层向下穿刺收集各个层面的所有样品，分层收集各样品包被ELISA通过E蛋白单克隆抗体或圣路易斯脑炎病毒多克隆血清确定重组蛋白位置，获得圣路易斯脑炎病毒样颗粒。
5. 一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒的293T细胞为抗原建立的间接免疫荧光检测方法，其特征在于，该方法具体为：收集转染设定时间后的细胞，用预冷的1xPBS清洗细胞，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，用冷丙酮进行固定，加入稀释的抗SLEV抗体37度孵育设定时间，漂洗液洗涤; 加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠IgG 室温结合；漂洗液洗涤后于荧光显微镜下观察。
6. 一种以纯化的圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的蛋白印迹检测方法，其特征在于，该方法具体为：
1）裂解的蛋白行SDS-PAGE后转膜；
2） 封闭：将膜放入可密封的塑料袋中，加入适量的TBS配置的脱脂奶封闭液中，室温封闭设定时间；
3）抗体的结合：用TBS配置的脱脂奶稀释纯化的抗SLEV 鼠单克隆抗体作为一抗，将PVDF膜与稀释好的抗体室温摇床孵育设定时间；
4）洗去未结合的抗体：用TBS-T漂洗滤膜；
5）二抗的结合：用TBS配置的脱脂奶稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，将洗涤后的PVDF膜与稀释好的二抗室温摇床孵育设定时间后，将膜用TBS-T洗涤；
6）DAB显色：用TBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20，将膜放入DAB底物显色液中显色，注意观察显色情况，至棕色条带出现时终止反应，照相后避光保存。
7. 如权利要求6所述的蛋白印迹检测方法，其特征在于，所述步骤1）具体为：
a 取样品进行SDS-PAGE；
b当电泳结束时，用蒸馏水淋洗玻璃板；
c戴上手套，切2张3MM滤纸和一张PVDF滤膜，使其大小与凝胶大小相适应；
d先将滤纸浸入转移缓冲液中，至少平衡15min,PVDF膜需进行前处理，置于100％甲醇中浸湿约5min将膜激活，再用转移缓冲液漂洗2次；
e半干转移仪下面的电极是阳极，故在转移缓冲液中按从下至上的顺序排列：滤纸－转移膜－凝胶－滤纸(可在膜的右上角切一标记，以标记膜的正反面),各层之间应避免留有气泡；
f将其置入半干转移仪中，胶侧置负极，膜侧置正极；
g通电转移：根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，电转移45min；
h转移结束后，断开电源并拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，凝胶可移至盛有考马斯亮蓝染色液的托盘中进行染色，以便检查蛋白转移是否完全，PVDF膜用于下一步实验。
8.一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的检测圣路易斯病毒抗体的间接ELISA法，其特征在于，所述间接ELISA法具体为：
1）包被抗原：将纯化的蛋白抗原用ELISA包被液稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；
2）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3）加15％FBS封闭液200ul，37℃放置2h；
4）拍干后超净台风机吹干；
5）加抗体：小鼠抗SLEV抗体用封闭液1:200倍稀释，反应板每孔100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；
6）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次；
7）加辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG, 每孔100ul， 37℃放置1h；
8）洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次；
9）加底物：加TMB100ul，室温暗处放置10min；
10）加终止液：每孔50ul；
11）观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数。
9. 一种用于人体以预防圣路易斯脑炎病毒感染的疫苗，其特征在于，该疫苗含有权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的配伍组合。
10.一种检测圣路易斯脑炎病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒将重组的圣路易斯脑炎病毒样颗粒作为抗原组分构成，用于SLEVIgG ELISA诊断试剂盒或SLEVIgM ELISA诊断试剂盒。
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