KR101719316B1 - 복제 결손성 플라비바이러스 백신 및 백신 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 복제 결손성 플라비바이러스 백신, 백신 벡터 및 이의 조성 및 방법을 제공한다.

Description

복제 결손성 플라비바이러스 백신 및 백신 벡터{Replication-Defective Flavivirus Vaccines and Vaccine Vectors}
본 발명은 복제 결손성 플라비바이러스 백신, 백신 벡터 및 이의 조성물 및 방법에 관한 것이다.
플라비바이러스는 전 세계적으로 분포하고 있으며, 공식적인 글로벌 건강 문제로 대두되고 있다. 플라비바이러스는 또한 가축 병원체로서 심각한 영향을 준다. 플라비바이러스 병원체는 황열병(YF), 뎅기 타입 1-4(DEN1-4), 일본 뇌염(JE), 웨스트 나일(WN), 진드기 매개 뇌염(TBE) 및 다른 키아사누르 산림병(KFD) 및 옴스크출혈열바이러스(OHF)와 같은, TBE 혈복합체(Serocomplex)로부터의 다른 바이러스를 포함한다. 황열병(YF) 백신으로는 [약독화 생백신(LAV) 스트레인 17D], 일본 뇌염(JE) 백신으로는 [사백신(INV) 및 약독화 생백신] 및 TBE 백신으로는 [약독화 생백신]이 유효하다. 현재 뎅기 타입 및 웨스트 나일(WN)에 대한 승인된 인간 백신은 존재하지 않는다. 가축의 백신으로는 예컨대 말의 웨스트 나일(WN) 백신(INV, 재조합 키메릭 생백신), 아시아에서 돼지의 사산 및 말의 뇌염을 예방하기 위한 일본 뇌염(JE) 백신(INV 및 LAV), UK에서 양의 신경질환을 예방하기 위한 도약병(louping ill) 플라비바이러스 백신(INV) 및 체코 공화국의 농장 동물들에 사용되는 진드기 매개 뇌염(TBE) 백신(INV)(Monath 및 Heinz, Flaviviruses, in Fields et al. Eds., Fields Virology, 3rd Edition, Philadelphia, New York, Lippincott-Raven Publishers, 1996, pp. 961-1034)을 포함하여 사용되고 있다. 진드기 매개 뇌염(TBE)은 인간의 가장 중요한 진드기 매개 바이러스성 질환이다. 이는 유럽 일부 및 북아시아의 풍토병이며, 매년 유럽에서 0.51.5% 및 시베리아 및 극동에서 640%의 사망률의 10,000 건 입원환자의 원인이다. 환자 중 대다수가 오랜 기간 지속되는 신경정신병 후유증에 고통 받는다. 닭의 배아 세포 배양으로 생산되는 사백신(INV)은 상기 질병을 예방하는데 효과적이라는 것이 증명되었다. 예컨대, 오스트리아 인구의 86%가 백신접종을 하여(유럽 국가 중 가장 높은 수치), 대략 90%의 입원 케이스를 감소시키는 결과를 가져왔다(Heinz 및 Kunz, Arch. Virol. Suppl. 18:201-205, 2004). 상기 사백신은 고가이고, 첫 번째 면역을 위해 세 번의 접종을 필요로 한다. 주기적 추가접종(2-5년 마다)이 면역성을 유지하기 위해 필요하다. 그러므로 1 내지 2회분으로 효과적이고, 면역성이 오래 유지되(YF 17D 면역에서 성취한 것과 유사함)는 지속성을 제공하는 저렴한 진드기 매개 뇌염(TBE) 백신이 필요하고, 이는 실제로 WHO에서 주요 우선순위로 인식하였다. 최근 몇 십년 동안 진드기 매개 뇌염 또는 란가트[LGT, TBE와 밀접하게 관련된(혈청학적으로) 자연적 약독화된 플라비바이러스] 바이러스와 4개의 뎅기 바이러스를 그대 키메라화를 통한 경험적이고 합리적인 모 진드기 매개 뇌염 바이러스의 약독화에 의한 진드기 매개 뇌염의 약독화 생백신의 후보군의 개발은 후보군의 잔존한 병독성 및/또는 낮은 면역원성/과약독화의 문제에 의한 어려움에 직면했다(Wright et al., Vaccine 26:882-890, 2008; Maximova et al., J. Virol. 82:5255-5268, 2008; Rumyantsev et al., Vaccine 24:133-143, 2006; Kofler et al., Arch. Virol. Suppl. 18:191-200, 2004; 및 본 명세서 내 참조문헌들).
플라비바이러스는 작고 피복된 양성가닥(plus-strand) RNA 바이러스로서 절지동물 질병 매개 곤충(모기 또는 진드기)에 의해 인간 및 새를 포함하는 다양한 포유류와 같은 척추동물 숙주에 주로 전염된다.
상기 플라비바이러스 지노믹 RNA 분자는 약 11,000 뉴클레오티드 길이이고, 긴 오픈리딩프레임(open reading frame, ORF)과 5′말단과 3′말단에 각각 120 및 500 뉴믈레오티드 길이를 가지는 비해독 말단 부위(UTRs)을 포함하고 있다. 상기 오픈리딩프레임은 co- 및 번역 후 생성되는 개개의 바이러스성 단백질로 분열되는 폴리단백질 전구체를 암호화하고 있다. 상기 단백질들은 다음 순서로 암호화 된다: C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5, C(코어/캡시드), prM/M (pre-membrane/membrane) 및 E(envelope)는 구조 단백질, 즉 바이러스 입자의 구성성분이고, 상기 NS 단백질은 세포내 복제를 담당하는 비구조 단백질이다. 플라비바이러스의 복제는 세포질에서 일어난다. 세포 감염 및 지노믹 RNA의 번역 이후, 폴리단백질의 가공이 prM, E 및 NS1 단백질을 위한 소수성 시그널의 지시에 따라, 폴리단백질의 prM 부분이 감염된 세포 소포체의 루멘(lumen)으로 이동하고 E 및 NS1 부분의 이동이 뒤따름으로써 시작된다. prM, E 및 NS1 단백질의 아미노 말단은 세포의 소포체 막의 루멘쪽에 위치하고 있는 시그널라제(signalase)에 의한 분열에 의해 생성되고, 그 결과 개개의 단백질은 카르복시 말단이 상기 막에 연결되어 남아있다. 비구조 부위에서 대부분의 잔여 분열은 바이러스 NS2B/NS3 세린 프로테아제에 의해 실행된다. 상기 바이러스 프로테아제는 또한 바이러스 입자에서 발견되는 성숙한 C 단백질의 C 말단 생성의 역할을 담당한다. 새롭게 합성된 지노믹 RNA 분자 및 C 단백질은 E 및 prM 단백질이 끼워진 세포막에 의해 둘러싸이게 되는 짙은 구형의 뉴클리오캡시드를 형성한다. 상기 성숙한 M 단백질은 세포의 퓨린 또는 유사한 프로테아제에 의한 바이러스 방출보다 약간 우선하여 prM의 분열에 의해 생성된다. 외피(envelope)의 주요 단백질인 E는 플라비바이러스 감염에 대응한 주요 면역반응과 관련 있는 중화항체의 주요 타겟이다. 바이러스 특이적 세포독성 T 림프구(CTL) 반응은 면역의 다른 주요 특질이다. 복합적인 CD8+ 및 CD4+ 세포독성 T 림프구 에피토프는 다양한 플라비바이러스의 구조 및 비구조 단백질에 의해 특징된다. 게다가, 내재 면역 반응은 바이러스 제거 및 적응 면역 반응 발달 및 면역 기억 조절 모두에 기여한다. 상기에서 논의하였던 플라비바이러스에 대한 사백신 및 약독화 생백신에 추가하여, 다른 백신 플랫폼이 개발되었다. 한 예가 황열병 바이러스 캡시드 및 면역원성이 발견된 다른 플라비바이러스의 비구조단백질 서열 및 prM-E 단백질을 포함한 키메라 플라비바이러스에 기초한다. 상기 기술은 뎅기(DEN), 일본뇌염(JE), 웨스트 나일(WN) 및 세인트루이스 뇌염(SLE) 바이러스에 대응하는 백신 후보군을 개발하기 위해 사용되었다(see, 예컨대, U.S. Patent Nos. 6,962,708 및 6,696,281). 황열병 바이러스를 기초로 한 키메라 플라비바이러스는 임상 시험에서 매우 장래성 있는 결과를 산출하였다.
다른 플라비바이러스 백신 플랫폼은 가감염성 바이러스(PIV) 기술의 사용에 기초한다(Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007 Widman et al., Adv. Virus. Res. 72:77-126, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008). 가감염성 바이러스는 결실에 의해 약독화 된 복제 결손성 바이러스이다. 플라비바이러스 생백신과는 다르게 그들은 생체 내에서 한 번의 원형 복제(또는 두 가지 구성성분의 구성체를 위한 선택적으로 제한된 원형; 하기 참조)를 하고, 이는 안전 면에서 이득을 제공할 수 있다. 가감염성 바이러스(PIV)는 또한 바이러스 혈증(viremia) 및 전신성 감염증(systemic infection)을 유도하지 않는다. 게다가, 사백신과는 다르게, 미믹 가감염성 전 바이러스 감염은 강한 B- 및 T-세포 반응 유도에 의해 증가된 효능, 높은 면역원성의 지속 및 감소된 1회 투여량을 제공한다. 전 바이러스와 유사하게, 가감염성 바이러스 백신은 수지상세포 및 자극된 톨-유사 수용체(toll-like receptors, TLRs)와 같은 항원 제시 세포를 타겟으로 하며, Th1/Th2 면역의 균형을 유도한다. 추가적으로, 가감염성 바이러스 구성체는 세포변성효과(CPE)가 없거나, 거의 없이 높은 기질 세포의 적정농도의 증가를 보여주고, 높은 수득율을 제공하며, 선택적으로 다중 수확 및/또는 감염된 기질 세포의 확장을 이용함을 보여준다.
PIV 기술의 원리는 도 1 및 2에 나타나 있다. 상기 기술의 2가지 변형이 있다. 첫 번째 기술에서, 단일-성분 가감염성 바이러스(s-PIV)는 캡시드 단백질(C)에서 대결손이 있는 것으로 구축되며, 이는 변이 바이러스를 정상 세포에서 감염성 있는 바이러스 입자를 형성할 수 없게 한다(도 1). 상기 결손은 C 단백질의 RNA 고리화 서열을 포함하는 첫 번째 약 20개 코돈을 제거하지 않으며, 또한 바이러스 프로테아제 절단 위치 및 prM의 시그널 펩타이드를 암호화 하는 C 말단의 유사한 개수의 코돈을 제거하지 않는다. s-PIV는, 예컨대 제조 과정 동안, C 단백질이 트랜스 방식으로 공급되는 기질(헬퍼) 세포 배지에서 증식될 수 있으며, 상기 트랜스 방식의 예는 C 단백질(또는 C 단백질을 포함하는 거대 헬퍼 카세트)을 생성하는 안정적 형질전환 세포에서의 증식, 또는 C 단백질을 발현하는 알파바이러스 레플리콘[예컨대, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE) 레플리콘] 또는 C 단백질을 발현하는 세포내 다른 발현 벡터를 포함하는 세포에서의 증식을 포함한다. 인 비보 접종 후, 예컨대 면역화 후, PIV는 감염 세포에서 상기 결손의 트랜스-보상 없이 일회 증식을 하며, 이 PIV는 주위 세포로 확산되지 않는다. 상기 감염 세포는 비어 있는 바이러스-유사 입자(VLPs)를 생성하며, 이는 PIV의 prM-E 유전자의 산물이고, 결국 중화 항체 반응을 유도한다. 또한, 바이러스 에피토프의 MHCI 전시를 통하여 T-세포 반응이 유도된다. 이러한 접근 방법은 YF 17D 바이러스, WN 바이러스 및 WN/JE과 WN/DEN2의 키메라 바이러스에 적용되었다(Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008; WO 2007/098267; WO 2008/137163).
두 번째 기술에서, 이중-성분 PIV(d-PIV)를 구축하였다(도 2). 기질 세포는 이중 결손 바이러스 RNAs로 형질전환된 것으로, 하나는 C 유전자의 결손이고, 나머지는 prM-E 엔벨럽 단백질 유전자의 결손이다. 상기 이중 결손 유전자는 상호 보완적이어서, 세포 배양액에서 두가지 종류의 PIVs의 축적을 나타낸다(Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008). 선택적으로, 상기 두가지 PIVs는 적당한 헬퍼 셀 라인에서 각각 제조될 수 있고, 이후 이중-성분 배합으로 교반하였다. 후자는 양 성분의 대응되는 농도 조절의 이익을 제공하고, 면역원성 및 효능을 증가시킨다. 이 타입의 PIV 백신은 인 비보에서 양 성분이 주입된 부위의 일부 세포의 복합감염에 의한 제한된 확장을 견딜 수 있어야 한다. 상기 확장은 자가-제한으로 예상되는데, 조직에는 최초 복합 감염된 세포에서 생산된 바이러스 입자보다 많은 세포가 존재하기 때문이다. 추가적으로, 비교적 높은 MOI가 효율적인 복합 감염에 필요하고, 주입부위 외부의 세포는 효율적으로 복합감염되지 않는 것으로 예상된다(예를 들면, 유출 림프절에서). ΔC PIV 단독으로 감염된 세포가 높은 면역원성의 바이러스 유사입자를 생산한다. 복합 감염된 세포는 역시 중화항체를 자극하는 두 종류의 일괄된 결손 바이러스 입자를 생산한다. 상기 제한된 감염은 s-PIVs와 비교하여 강화된 중화항체 반응 및 T 세포 반응을 초래할 것으로 예상된다. 순환하는 플라비바이러스를 포함하여, 제조 과정 또는 인 비보에서 재조합 기회를 감소하기 위해서 예를 들면, 동의적 코돈 대체를 사용하여, 바이러스 서열은 뉴클리오티드 서열 상동성을 줄이고, 5’및 3’요소(element)의 상보적 고리화를 변이하여 s-PIVs 및 d-PIVs 양쪽에서 변형될 수 있다.
본 발명은 (i) 캡시드(C), 전-막(prM), 엔벨럽(E), 비-구조 단백질 1(NS1), 비-구조 단백질 3(NS3), 및 비-구조 단백질 5(NS5)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이, 및 (ii) 하나 또는 그 이상의 이종 병원체, 암, 또는 알러지-관련 면역원을 암호화하는 서열을 포함하는 플라비바이러스 지놈을 포함하는 복제-결손성(결함) 가감염성(pseudoinfectious) 플라비바이러스를 제공한다. 예컨대, 상기 결손/변이는 캡시드(C) 서열; 전-막(prM) 및/또는 엔벨럽(E) 서열; 캡시드(C), 전-막(prM) 및 엔벨럽(E) 서열; 또는 비-구조 단백질 1(NS1) 서열내에 있을 수 있다.
상기 이종 면역원은 예컨대, 광견병 바이러스(예컨대, 광견병 바이러스 G 단백질 에피토프), 보렐리아 복도페리(예컨대, OspA 면역원 또는 이들의 면역원성 조각), 진드기(예컨대, 64TRP, Isac, 및 Salp20, 또는 이들의 면역원성 조각로 구성된 군으로부터 선택된 진드기 타액 단백질), 독감 바이러스(예컨대, 독감 바이러스 M2, 헤마글루티닌 (HA), 또는 뉴라미니다제 (NA) 에피토프, 또는 이들의 면역원성 조각), 인간 면역결핍 바이러스(예컨대, 코돈-최적화 HIV gag, tat/nef, 또는 gp120 단백질, 또는 이들의 면역원성 조각), 원숭이 면역결핍 바이러스(원숭이 면역결핍 질환), 인유두종 바이러스(예컨대, HPV16 또는 HPV18 캡시드 단백질 L1 또는 L2, 또는 이들의 면역원성 조각), 호흡기 세포융합 바이러스(예컨대, a 호흡기 세포융합 바이러스 F 또는 G 당단백질), 말라리아 기생충 및 마이코박테리움 튜버큐로시스로 구성된 군으로부터 선택된 것인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스일 수 있다(하기 참조).
상기 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스는 전-막(prM) 및/또는 엔벨럽(E) 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 상기 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스 지놈은 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 란가트 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 서열 및 이들의 키메라로 구성된 군으로부터 선택된 것인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스일 수 있다(하기 참조). 다양한 예시에서, 상기 키메라는 제1 플라비바이러스(예컨대, 진드기-매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스)의 전-막(prM) 및 엔벨럽(E) 서열, 및 제2 다른 플라비바이러스(예컨대, a 황열병, a 웨스트 나일, 또는 란가트 바이러스)의 캡시드(C) 및 비-구조 서열을 포함한다.
상기 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스 지놈은 상기 지놈의 플라비바이러스와 같거나 또는 다른 플라비바이러스로부터 유래한 전-막(prM) 및 엔벨럽(E) 서열을 포함한 입자 내에서 패키징될 수 있다.
게다가, 상기 이종 면역원을 암호화하는 서열은 대체하여 삽입되거나 또는 하나 또는 그 이상의 결손 또는 하나 또는 그 이상의 단백질의 변이와 조합하여 삽입될 수 있다.
상기 이종 면역원을 암호화하는 서열은 상기 플라비바이러스 지놈의 엔벨럽(E) 단백질을 암호화하는 서열 내, 비-구조(NS1) 단백질 1을 암호화하는 서열 내, 전-막(prM) 단백질을 암호화하는 서열 내, 엔벨럽(E) 단백질을 암호화하는 서열과 비-구조(NS1) 단백질 1을 암호화하는 서열 사이 또는 비-구조 단백질 2B(NS2B)와 비-구조 단백질 3(NS3) 사이에 삽입되거나, 및/또는 상기 플라비바이러스 지놈의 3’비번역 부위에 바이시스트로닉한 삽입으로 삽입될 수 있다.
본 발명은 또한 상기에서 언급한 제1복제-결손성 가감염성 플라비바이러스; 그리고, 캡시드(C), 전-막(prM), 엔벨럽(E), 비-구조 단백질 1(NS1), 비-구조 단백질 3(NS3) 및 비-구조 단백질 5(NS5)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이를 포함하는 지놈을 포함하는 다른 제2복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 조성물에서, 상기 제2복제-결손성 가감염성 플라비바이러스에서 발생되는 상기 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이가 있는 상기 서열에 의해 암호화 되는 상기 하나 또는 그 이상의 단백질은 상기 제1복제-결손성 가감염성 플라비바이러스에서 발생되는 상기 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이가 있는 상기 서열에 의해 암호화 되는 상기 하나 또는 그 이상의 단백질과 상이하다.
본 발명은 추가적으로 어느 하나 또는 그 이상의 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스 및/또는 상기 언급한 조성물을 시험 대상에 주입하는 것을 특징으로 하는 시험 대상에서 면역원의 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 다양한 예시에서, 상기 시험 대상은 감염 위험은 있으나, 병원체 또는 질병 또는 암 또는 알러지-연관 면역원와 연관된 질환에 감염되지 않았다. 다른 예시에서, 상기 시험 대상은 병원체 또는 질병 또는 암 또는 알러지-연관 면역원와 연관된 질환에 감염되었다. 본 발명은 이와 같이 예방 및 치료 방법을 제공한다. 본 방법에서, 상기 면역원은 예컨대, 광견병 바이러스, 보렐리아 복도페리, 진드기, 독감 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 인유두종 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 말라리아 기생충, 및 마이코박테리움 튜버큐로시스로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다(하기 참조). 게다가 상기 방법은 면역원의 출처에 추가하여 플라비바이러스 지놈에 의해 암호화된 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 것일 수 있다. 다양한 예시에서, 상기 시험 대상은 감염 위험은 있으나, 플라비바이러스 전-막 및/또는 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 상기 가감염 플라비바이러스의 지놈에 대응하는 플라비바이러스에 감염되지 않은 것이다. 다른 예시에서 상기 시험 대상은 플라비바이러스 전-막 및 또는 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 상기 가감염 플라비바이러스의 지놈에 대응하는 플라비바이러스에 감염된 것이다.
본 발명은 또한 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열이 진드기 매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스의 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열로 교체되고, 상기 키메라 플라비바이러스의 캡시드와 전-막 단백질사이 시그널 서열이 황열병 바이러스 및 진드기 매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 캡시드/전-막 시그널 서열의 하이브리드 또는 이들의 변종을 포함하는 황열병 바이러스를 포함하는 약독화 생 키메라 플라비바이러스를 포함한다. 다양한 예시에서, 상기 키메라 플라빕바이러스의 캡시드/전-막 시그널 서열은 아미노 말단 부위에 황열병 바이러스 서열 및 카복시 말단 부위에 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 서열을 포함한다(하기 참조).
게다가, 본 발명은 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열이 진드기-매개 뇌염 또는 란카트 바이러스의 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열로 교체되고, 상기 키메라 플라비바이러스의 캡시드 및 전-막 단백질 사이의 시그널 서열이 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 캡시드/전-막 시그널 서열 또는 이들의 변종을 포함하는 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 약독화 생 키메라 플라비바이러스를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 가감염성 플라비바이러스, 조성물, 또는 약독화 생 플라비바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석액을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 게다가 상기 조성물은 어쥬번트를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 비-구조 단백질 1(NS1), 비-구조 단백질 (NS3), 또는 비-구조 단백질 5(NS5)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이를 포함하는 플라비바이러스 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 제공한다.
게다가, 본 발명은 가감염성 바이러스의 지놈, 또는 여기서 언급하고 있는 약독화 생 플라비바이러스의 지놈 및 이들의 보체에 대응하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 상기 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스의 플라비바이러스 지놈으로부터 결손된 어느 서열과 대응하는 단백질을 발현하는 세포에 도입하는 것을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스 제조 방법을 제공한다. 본 방법에서 상기 단백질은 상기 세포내에서 제2 다른 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스의 지놈으로부터 발현된다. 다른 예시에서, 상기 단백질은 리플리콘으로부터 발현된다(예컨대, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 리플리콘 같은 알파 바이러스 리플리콘; 하기 참조)
본 발명은 또한 두개 또는 그 이상의 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 두 개의 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물을 포함한다: (a) 일본 뇌염 바이러스 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스, 및 뎅기 바이러스 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스; (b) 황열병 바이러스 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스, 및 뎅기 바이러스 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스; 및 (c) 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 서열 및 보렐리아 복도페리 면역원을 암호화하는 삽입된 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스, 및 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 서열 및 진드기 타액 단백질 면역원을 암호화하는 삽입된 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스, 또는 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 서열 및 보렐리아 복도페리 면역원 및 진드기 타액 단백질 면역원을 암호화하는 삽입된 서열을 포함하는 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
본 발명은 또한 상기 약독화 생 키메라 플라비바이러스를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 대상에 주입하는 것을 포함하는 시험 대상에서 진드기-매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다양한 예시에서, 상기 시험 대상은 진드기-매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스에 감염 위험은 있으나, 감염되지 않았다. 다른 예시에서, 상기 시험 대상은 진드기 매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스에 감염되었다.
본 발명은 추가적으로 캡시드(C), 전-막(prM), 엔벨럽(E), 비-구조 단백질 1(NS1), 비-구조 단백질 3(NS3), 및 비-구조 단백질 5(NS5)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이를 포함하는 플라비바이러스 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스에 있어서, 상기 플라비바이러스 지놈은 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열이 진드기-매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스의 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열로 대체되고, 상기 플라비바이러스 지놈의 캡시드 및 전-막 단백질 사이의 시그널 서열을 암호화하는 서열이 황열병 바이러스 및 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 캡시드/전-막 시그널 서열, 또는 이들의 변형을 암호화하는 서열의 하이브리드를 포함하는 황열병 바이러스 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 제공한다. 다양한 예시에서, 상기 플라비바이러스 지놈의 캡시드/전-막 시그널 서열을 암호화하는 서열이 5’부위에 황열병 바이러스 서열 및 3’부위에 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 서열을 포함한다.
게다가, 본 발명은 또한 캡시드(C), 전-막(prM), 엔벨럽(E), 비-구조 단백질 1(NS1), 비-구조 단백질 3(NS3), 및 비-구조 단백질 5(NS5)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이를 포함하는 플라비바이러스 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스에 있어서, 상기 플라비바이러스 지놈은 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열이 진드기-매개 뇌염 바이러스 또는 란가트 바이러스의 전-막 및 엔벨럽 단백질을 암호화하는 서열로 대체되고, 상기 플라비바이러스 지놈의 캡시드 및 전-막 단백질 사이의 시그널 서열을 암호화하는 서열이 진드기-매개 뇌염 또는 란가트 바이러스 캡시드/전-막 시그널 서열, 또는 이들의 변형을 암호화하는 서열을 포함하는 웨스트나일 바이러스 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 포함한다.
추가적으로, 본발명은 캡시드(C), 전-막(prM), 엔벨럽(E), 비-구조 단백질 1(NS1), 비-구조 단백질 3(NS3), 및 비-구조 단백질 5(NS5)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 하나 또는 그 이상의 결손 또는 변이를 포함하는 플라비바이러스 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스에 있어서, 상기 플라비바이러스 지놈내 어느 캡시드(C) 및 비-구조(NS) 단백질은 란가트 바이러스, 어느 전-막(prM) 및 엔벨럽(E) 단백질은 진드기 매개 뇌염 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 제공한다.
“복제-결손성 가감염성 플라비바이러스”또는“PIV”는 플라비바이러스 지놈에서 결손 또는 변이에 의한 복제-결손된 플라비바이러스를 의미한다. 상기 결손 또는 변이는 예컨대, 여기서 언급하고 있는 대부분의 캡시드 단백질과 같은 대형의 서열일 수 있다(잔여 고리화 서열로; 하기 참조). 다른 예시에서, 다른 단백질(예컨대, prM, E, NS1, NS3, 및/또는 NS5; 하기 참조) 또는 단백질의 결합(예컨대, prM-E 또는 C-prM-E)을 암호화하는 서열은 결손 되었다. 만약 PIV가 이종 면역원을 운반하기 위해 벡터로 사용되었다면, 이러한 유형의 결손은 이득일 수 있는데, 왜냐하면 상기 결손은 예컨대, 적어도 결손된 서열의 크기까지 서열의 삽입을 허용할 수 있기 때문이다. 다른 예시에서, 예컨대, 점 돌연변이 같은 상기 변이는 상기에서 논의한 것과 같이 복제 결손을 초래할 수 있다. 결손 또는 변이 때문에, 상기 지놈은 전체 플라비바이러스 입자를 생산하기 위해 모든 필수 단백질을 암호화하지 않는다. 상기 결손된 서열은 상기 결손된 서열을 발현하기 위해 설계된(예컨대, 리플리콘의 사용; s-PIV; 하기 참조) 상보적 세포주에서 또는 같은 두 개의 복제-결손 지놈을 포함하고 있고, 동시에 고려할 경우 생산(d-PIV 시스템; 하기 참조)을 위해 필요한 모든 단백질을 암호화 하고 있는, 세포에서 두 개의 복제-결손 지놈의 상호-발현에 의해 인 트랜스 방식으로 제공할 수 있다.
상보적 단백질을 발현하지 않는 세포에 도입 이후, 상기 지놈은 복제되고, 일부 예에서, 상기 세포로부터 방출되고, 상기 세포를 이탈할 수 있으며, 면역원성이 있으나, 다른 세포를 감염할 수 없고, 다른 세대 입자를 산출할 수 없는“바이러스 유사 입자”를 산출한다. 예컨대, 캡시드 단백질을 암호화하는 서열에 결손이 포함된 PIV의 경우, 캡시드를 발현하지 않는 세포의 감염 이후, prM-E 단백질을 포함하는 VLPs가 세포로부터 방출된다. 상기 캡시드 단백질의 결핍 때문에, 상기 VLPs는 캡시드 및 핵산 지놈이 결핍된다. d-PIV 접근에서, 증가된 PIVs의 생산이 모든 필요한 단백질의 생산에 대해 상보적인 두 개의 PIVs에 감염된 세포에서 가능하다(하기 참조).
본 발명은 다수의 이점을 제공한다. 예컨대, 본 발명의 상기 PIV 벡터 및 PIVs은 1 내지 2 용량 투여 이후, 우수한 약독화 및 효능성을 나타내고, 장기간의 면역성을 나타낸다. 더욱이, 사백신과는 다르게, PIVs 전(全) 바이러스 감염을 흉내내며, 이는 강력한 B- 및 T-세포 반응의 유도에 의한 향상된 효능, 면역성의 향상된 지속성, 및 감소된 필요 투여량을 나타낸다. 또한, 전(全) 바이러스와 유사하게, PIV 백신은 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포를 타케팅하고, 톨-유사 수용체(TLRs)를 자극하며, 균형 있는 Th1/Th2 면역성을 유도한다. PIV 구조체는 CPE가 거의 없이 기질 세포에서 높은 역가로 성장하며, 이는 고수율 제조를 가능하게 하며, 선택적으로 멀티플 회수 및/또는 감염된 기질 세포의 증식을 이용한다. 더욱이, 본 발명의 상기 PIV 벡터는 현재 이용가능한 백신이 없는 비-플라비바이러스 병원체에 대한 백신 개발을 위한 옵션을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음 발명의 상세한 설명, 도면 및 청구항에서 더욱 명백할 것이다.
도 1은 단일 성분 PIV(S-PIV) 기술의 도식적인 설명이다.
도 2는 이중-성분 PIV(d-PIV) 기술의 도식적인 설명이다.
도 3은 마우스에서 PIVs의 면역원성 및 효능 시험을 위한 일반적인 실험 디자인에 대한 도식적 설명이다.
도 4는 PIV-WN(RV-WN)에 의해 유도된 인간 면역 반응과 마우스에서 YF/WN LAV(CV-WN)의 면역 반응과 비교한 그래프이다.
도 5는 햄스터-적용 아시비(PIV-YF 및 YF17D 백신) 및 PIV-YF(RV-YF), YF17D, PIV-WN(RV-WN), 및 YF/WN LAV(CVWN) 및 야생형 WN-NY99(PIV-WN 및 YF/WN LAV 백신)로 면역화된 챌린지 마우스의 결과를 일련의 그래프로 보여주고 있다.
도 6은 지적한 키메라 플라비바이러스로 얻어진 YF/TBE 및 YF/LGT 바이러스 역가 및 플라그 형태를 나타내는 표이다.
도7은 WN/TBE PIV 역가 및 지적한 PIVs을 포함하는 세포의 면역형광의 예시를 나타내는 표이다.
도 8은 베로 및 BHK 세포주에서 YF/TBE LAV 및 PIV-WN/TBE의 복제 정도를 나타내는 일련의 그래프이다(CV-Hypr = YF/Hypr LAV; CV-LGT = YF/LGT LAV; RV-WN/TBEV = PIV-WN/TBEV).
도 9는 신경 독성 검사에서 PIV-TBE 및 YF/TBE LAV 구조체로 IC 주입된 마우스의 생존률을 일련의 그래프를 통해 나타내고 있다(3.5 주령 ICR 마우스; RV-WN/Hypr = PIV-WN/TBE(Hypr); CV-Hypr = YF/TBE(Hypr) LAV; CV-LGT = YF/LGT LAV).
도 10은 신경 침투 검사에서 PIV-WN/TBE(Hypr)(RV-WN/Hypr), YF/TBE(Hypr) LAV(CV-Hypr), 및 YF/LGT LAV(CV-LGT) 구조체 및 YF17D로 IP 주입된 마우스의 생존률을 일련의 그래프를 통해 나타내고 있다(3.5 주령 ICR 마우스).
도 11은 s-PIV-TBE 후보군(좌상단 패널), YF/TBE 및 YF/LGT 키메라 바이러스(후상단 패널), 및 대조군(YF 17D, 인간 TBE 사백신, 및 가백신; 하기 패널)로 면역화된 집단의 TBE 바이러스 챌린지 이후 체중 감소의 변동을 통해 측정된 마우스의 질병률을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 12는 가감염성 바이러스 및 면역화를 만들기 위한 구조체 패키징의 설명 뿐만 아니라 광견병 바이러스 G 단백질을 발현하는 PIV 구조체의 도식적 설명을 나타낸다.
도 13은 독자 생존 가능한/구조체 발현을 초래하는 삽입 디자인의 도식적 설명을 나타낸다(전형적 예시로서 광견병 G).
도 14는 지시된 PIV-WN 구조체(C-Rabies G, PrM-E-Rabies G, 및 C-PrM-E-Rabies G)로 트랜스펙션된 세포의 성장곡선 및 면역형광 분석을 나타내는 일련의 사진 및 그래프이다.
도 15는 지시된 PIV 구조체(C-Rabies G, PrM-E-Rabies G, 및 C-PrM-E-Rabies G)로 트랜스펙션된 베로 세포의 플라스마 막에 발현된 RavG의 면역 형광 분석을 나타내는 일련의 사진이다.
도 16은 PIV-WN-광견병 G 구조체의 도식적 설명 및 상기 구조체의 헬퍼세포에서의 확산, 그러나 원시 세포에서는 그렇지 않은 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 17은 PIV-WN 벡터에서 광견병 G 단백질 유전자의 안정성을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 18은 베로 세포에서 단일-성분 대 이중-성분 PIV-WN-광견병 G 변이체의 확산의 비교를 보여주는 일련의 사진이다.
도 19는 트랜스펙션 후 헬퍼 세포에서 d-PIV-WN의 DprM-E 성분에 의한 전장 RSV F 단백질(스트레인 A2)의 발현을 보여주는 일련의 면역형광 이미지이다.
본 발명은 플라비바이러스 서열을 포함하고 있는 복제-결손 또는 부족 가감염성 바이러스(PIV) 벡터를 제공하는데, 이는 선택적으로 벡터 자체뿐만 아니라 이종 병원체, 암 및 알러지-연관 면역원이 벡터에 삽입되어 면역 유발 방법으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 여기서 기술한 것처럼 PIVs 및/또는 PIV 벡터의 혼합을 포함하는 조성물 및 이와 같은 조성물을 이용하여 면역원 서열 및 또는 PIVs 자체 서열에 대항하는 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 추가적으로, 본 발명은 특별한 PIVs, 진드기-매개 뇌염 바이러스 서열을 포함하고 있는 약독화 생 키메라 플라비바이러스, 이와 연관된 벡터 및 조성물 및 이들의 사용방법을 포함한다. 상기 PIV 벡터, PIVs, 약독화 생 키메라 플라비바이러스, 조성물 및 본 발명의 사용 방법은 하기에서 보다 자세히 기술하도록 한다.
PIV 벡터 및 PIVs
본 발명의 상기 PIV 벡터 및 PIVs는 상기에서 기술한 단일 또는 이중-성분 PIV에 기초하였다(WO 2007/098267 및 WO 2008/137163 참조). 이와 같이, 예컨대, 단일 성분 PIVs에서, 상기 PIV 벡터 및 PIVs는 캡시드 단백질 암호화 서열을 대결손 하는 유전체를 포함할 수 있고, 트랜스 방식으로 캡시드 단백질을 생산하는 상보적 세포주에서 생산될 수 있다(단일 성분 ; 도 1 및 도 12). 상기 접근방법에 따를 경우, 대부분의 캡시드-암호화 부위은 결손되었는데, 이는 PIV 유전체가 통상적인 세포주에서 감염성있는 자손(예를 들면, 세포주는 캡시드 서열을 발현하지 않음) 및 백신화된 물체를 생산하는 것을 방지한다. 상기 캡시드 결손은 전형적으로 유전체 고리화(예를 들면, 1-26 위치의 부위에서 아미노산을 암호화하는 서열)를 위해 필요한 RNA 서열 및/또는 prM에서 M 성숙을 위해 필요한 상기prm 서열을 파괴하지 않는다. 특별한 예로, 상기 결손된 서열은 C 단백질의 26-100, 26-93, 31-100 또는 31-93의 암호화하는 아니노산과 일치한다. 단일 성분 PIV 벡터 및 PIVs는 C 또는 C-prM-E 카세트가 모두 발현되는 세포주에서 배양될 수 있고, 여기서 이들은 높은 수준에서 복제한다. 단일 성분 PIV 및 PIVs을 발현하는데 이용되는 대표적인 세포주는 BHK-21 (예를 들면, ATCC CCL-10), Vero (예를 들면, ATCC CCL-81), C7/10 및 다른 척추동물 또는 모기 기원 세포를 포함한다. 상기 C 또는 C-prM-E 카세트는 이와 같은 세포에서 알파바이러스 리플리콘(예를 들면, Venezuelan Equine Encephalitis virus (VEEV), Sindbis virus, Semliki Forest virus (SFV), Eastern Equine Encephalitis virus (EEEV), Western Equine Encephalitis virus (WEEV), 또는 RossRiver virus)과 같은 바이러스 벡터-유래 리플리콘을 이용하여 발현될 수 있다. PIV 벡터/PIVs 및 상보적 서열 간 생산적인 재결합 확률을 감소하기 위해서, 상기 리플리콘(C, prM 및/또는 E 암호화)의 서열은 뉴클레오티드 변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상보적 C 단백질을 암호화하는 서열은 인위적 고리화 서열을 포함할 수 있다. 상기 변이는 코돈 최적화로부터 일어날 수 있고, 이는 PIV 수율면에서 추가적 이득을 제공할 수 있다. 게다가, C 단백질 서열을 발현하는 상보적 세포(및 C-prM-E 카세트는 아님)의 경우, C 단백질을 포함하는 예를 들면, prM의 20 아미노산 카르복시 말단의 고정서열을 포함하는 것이 이로울 것이다(예를 들면, WO 2007/098267 참조).
본 발명의 상기 PIV 벡터 및 PIVs는 상기에서 기술한 이중-성분 유전체 기술에 기반할 수 있다. 본 기술은 두 가지 유전자 구조체를 이용하는데, 이들 각각은 생산적 복제(캡시드 또는 prM/E)에 필요한 적어도 하나의 단백질 발현이 결실되었지만, 상기 같은 세포에 나타날 때에는, PIV를 만드는데 필수적인 성분 모두를 제조한다. 이와 같이, 이중-성분 유전체 기술의 한 예시에서, 첫 번째 성분은 상기에서 설명한 단일 성분 PIVs 처럼 C의 대 결손을 포함하고, 두 번째 성분은 prM 및 E의 결손을 포함한다(도 2 및 도 12). 다른 예시에서, 첫 번째 성분은 C, prM 및 E의 결손을 포함하고, 두 번째 성분을 NS1의 결손을 포함한다(도 12). 두 성분은 RNA 복제에 필요한 시스-작용(cis-acting) 프로모터 요소를 포함할 수 있고, 복제 효소 복합체를 형성하는 일련의 비구조 단백질을 완성할 수 있다. 이와 같이, 양 결손 유전체들은 5′-비번역 부위 및 다음과 같이 캡시드 단백질의 아미노-종결 조각을 포함하는 자연 단백질-코딩 서열인 적어도 60개의 뉴클레오티드(요소 1)를 포함한다. 상기 서열은 예컨대 캡시드 또는 엔벨럽(prM-E) 코딩 서열과 융합할 수 있는 유비퀴틴(ubiquitine) 또는 수족구병 바이러스(FAMDV)-특이적 2A 프로테아제 서열처럼 프로테아제 절단 서열에 뒤따른다. 게다가, 인공의, 코돈 최적화 서열은 복제 가능한 바이러스를 초래할 수 있는(예를 들면, WO 2008/137163 참조) 양 결손 바이러스 유전체의 재결합 가능성을 배제하는데 이용할 수 있다. 이중-성분 유전체 접근의 사용은 단일 성분 PIV 접근에 관해 상기에서 논의했던 것처럼 세포가 리플리콘으로 치환된 것과 같이 상보적 유전체를 발현하는 세포주의 개발을 필요로 하지 않는다. 이중-성분 유전체 접근에 사용될 수 있는 대표적인 세포주는 Vero (예를 들면, ATCC CCL-81), BHK-21 (예를 들면, ATCC CCL-10), C7/10 및 다른 척추동물 또는 모기 기원의 세포가 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 d-PIV 접근의 추가적인 예로는 NS3 또는 NS5 서열 결손을 포함하는 상보적 유전체의 사용에 기초한다. 예컨대, NS1, NS3 또는 NS5 단백질의 결손은 ORF의 수백 아미노산 길이만큼, 선택된 단백질 서열 전체를 제거하거나, 또는 1 아미노산 만큼 짧게 단백질 효소 활성도(예컨대, NS5 RNA 폴리머라제 활성도, NS3 헬리카제 활성도 등)를 불활화시켜 이용할 수 있다. 양자택일로, 점 아미노산 변환(최소 1 아미노산 변이, 또는 선택적으로 그 이상의 변이)은 단백질 효소 활성도를 불활화하기 위해서 어떠한 NS단백질에도 도입될 수 있다. 추가적으로, 몇 개의 ΔNS 결손이 결합하여 하나의 헬퍼 분자가 될 수 있다. 예컨대, 첫 번째 d-PIV 성분으로 발현된 같은 비상동 유전자는 발현된 면역원의 양을 늘리기 위해서 제자리에서 발현되거나 또는 두 번째 성분에서 NS 결손과 협력한다. 명백하게, 상기 헬퍼의 삽입 능력은 NS 결손의 크기와 비례적으로 증가할 것이다. 양자택일로, 다른 외래 면역원이 다가 백신을 생산하기 위해서 헬퍼의 결손 부위로 삽입될 수 있다.
게다가, 추가적인 접근은 PIV 벡터 및 본 발명에서 기술한 사용을 위한 PIVs를 제조하기 위해 사용될 수 있는데, 예컨대, WO 99/28487, WO 03/046189, WO 2004/108936, US 2004/0265338, US 2007/0249032 및 U.S. Patent No. 7,332,322가 있다.
본 발명의 상기 PIV 벡터 및 PIVs는 단일 플라비바이러스 타입으로부터(예컨대, 진드기-매개 뇌염(TBE, 예컨대, 스트레인 Hypr), 란가트(LGT), 황열병(예컨대, YF17D), 웨스트나일, 일본뇌염, 뎅기(혈청형 1-4), 세인트루이스뇌염, 쿤진(Kunjin), 로시오 뇌염, 일헤우스, 중유럽 뇌염, 시베리안 뇌염, 러시안 봄-여름 뇌염, 키아사누르 산림병, 옴스크 출혈열, 루핑병, 포와센, 네기시, 압세타로프(Absettarov), 한살로바 및 아포이 바이러스) 서열을 포함할 수 있고, 또는 둘 또는 그 이상의 플라비바이러스로부터 서열을 포함할 수 있다. 상기 바이러스들의 일부 스트레인의 서열은 이미 일반적인 서열 데이터베이스에 접근 가능하고; 다른 스트레인의 서열도 당업계에서 공지된 방법에 의해 쉽게 결정할 수 있다. PIV 벡터 및 PIVs의 경우 하나 이상의 플라비바이러스 서열을 포함하는데, 상기 서열은 상기에서 언급한 일련의 키메라 플라비바이러스일 수 있다(예컨대, U.S. Patent No. 6,962,708; U.S. Patent No. 6,696,281; 및 U.S. Patent No. 6,184,024 역시 참조). 어떤 예에서는, 상기 키메라는 첫번째 플라비바이러스로부터 전-막 및 엔벨럽 서열(소망하는 명역성이 있는 플라비바이러스와 같은)을 포함하고, 다른 두 번째 플라비바이러스부터 캡시드 및 비구조 서열을 포함한다. 하나의 특별한 예로서, 상기 두 번째 플라비바이러스는 백신 스트레인 YF17D와 같은 황열병 바이러스이다. 다른 예는 하기에서 언급한 YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE 및 WN/LGT 키메라를 포함한다. 나머지 예는 TBE 바이러스 prM-E 단백질을 포함하고 있는 LGT 바이러스 백본을 기초하는 LGT/TBE 키메라이다. 이러한 유전적 배경에 기초한 PIV 백신은 장점을 가질 수 있는데, 왜냐하면 LGT 인 비트로에서 매우 효율적으로 복제하고, 고도로 약독화 되었으며, 인간에게 면역원이 있기 때문이다. 이와 같이, 키메라 LGT/TBE PIV 백신은 특별히 TBE prM-E 유전자를 포함하기 때문에 TBE에 대응하여 인간에서 강력한 특이적 면역 반응을 제공할 것으로 기대된다.
본 발명의 벡터는 PIV 구조체 또는 여기서 기술하고 있는(상세하게, YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE 및 WN/LGT; 하기 참조) 약독화 생 키메라 플라비바이러스에 기초할 수 있다. 벡터로서 PIV 구조체의 사용은 일정한 환경에서 특별한 이득을 제공하는데, 왜냐하면 이러한 구조체는 필연적으로 대 결손을 포함하고, 이들은 복제효율의 감소가 없고, 적어도 결손된 서열의 크기를 가지고 있는 삽입체의 정착에 좀더 안정적인 구조체가 되기 때문이다. 이와 같이, PIV 벡터는 상대적으로 큰 삽입부 또는 중간 사이즈(예컨대, 범위 501-1000, 1001-1700, 1701-3000 또는 3001-4000 또는 좀더 많은 잔기)뿐만 아니라, 일반적으로 매우 작은 삽입부(예컨대, 범위 6-10, 11-20, 21-100, 101-500, 또는 상기 DC 결손 또는 다른 결손과 결합한 좀 더 많은 아미노산 잔기)를 포함할 수 있다. 대조적으로, 어떤 예에서, 특별하게 삽입부가 상응하는 결손의 부재에서 제조된 경우라면, 약독화 생 바이러스에서 상대적으로 짧은 서열을 발현하는 것이 이득일 것이다. 본 발명에서 사용되는 삽입부 위치에 관한 추가적인 정보는 하기에서 제공한다. 게다가, 하기에서 추가적으로 논의한 것처럼, 본 발명의 PIVs 및 키메라 플라비바이러스에서 비-플라비바이러스 면역원의 발현은 플라비바이러스 벡터 바이러스 병원체 및 타겟 이종 면역원(예컨대, 병원체(박테리아, 바이러스, 기생충, 곰팡이 병원체와 같은), 암 또는 알러지-연관 면역원)둘다에 대응하는 보호적 면역원성을 유도하는 이중 백신의 결과를 낳을 수 있다.
상기에서 논의했듯이, 본 발명의 상기 PIV 벡터 및 PIVs는 예컨대, 키메라 플라비바이러스는 첫 번째 플라비바이러스(예컨대, 면역원성이 발견된 플라비바이러스)의 전-막 및 엔벨럽 서열 및 황열병 바이러스(예컨대, YF17D; 상기 참조 및 U.S. Patent No. 6,962,708; U.S. Patent No. 6,696,281; 및 U.S. Patent No. 6,184,024 참조) 같은 두 번째의 캡시드 및 비구조 서열을 포함하는 키메라 플라비바이러스의 서열을 포함할 수 있다. 게다가, PIVs 구축의 소스 또는 백신/백신 벡터 그 자체로 이용되는 본 발명의 키메라 플라비바이러스는 WO 2006/116182에서 기술한 것들처럼 선택적으로 하나 또는 그 이상의 특이적 약독화 변이(예컨대, E 단백질 변이, prM 단백질 변이, C 단백질에서 결손 및/또는 3'UTR에서 결손)를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 C 단백질 또는 3’UTR 결손은 직접적으로 YF/TBE 또는 YF/LGT 키메라에 적용할 수 있다. 유사한 결손이 디자인될 수 있고, LGT/TBE, WN/TBE 및 WN/LGT 유전체에 기초한 다른 키메라 LAV 후보군에 도입될 수 있다. E 단백질 변이에 관하여, WO 2006/116182에서 기술된 YF/WN 키메라와 유사한 약독화 변이는 예컨대, E 단백질 결정 구조 지식(Rey et al., Nature 375(6529):291-298, 1995)에 기초하여 디자인되고, 이용될 수 있다. 게다가, TBE 바이러스 및 다른 플라비바이러스를 위해서 기술한 약독화 E 단백질 변이의 추가적인 예시는 표 9에서 제공한다. 이것은 키메라 백신 후보군에 유사하게 도입될 수 있다.
상기 발명은 또한 새롭고, 특별한 키메라 플라비바이러스를 제공하는데, 이는 약독화 생 키메라 플라비바이러스 벡터 및 키메라의 전-막 및 엔벨럽 성분의 원천에 대응한 백신으로서 PIV 벡터 및 PIVs 디자인의 기초로 사용할 수 있다. 상기 키메라는 진드기-매개 뇌염(TBE) 바이러스 또는 연관된 prM-E 서열을 포함한다. 이와 같이, 상기 키메라는 예컨대, TBE의 Hypr 스트레인 또는 란가트(LGT) 바이러스로부터 prM-E 서열을 포함할 수 있다. 키메라의 캡시드 및 비구조 단백질은 황열병 바이러스(예컨대, YF17D) 또는 웨스트 나일 바이러스로(예컨대, NY99)부터의 것을 포함할 수 있다.
상기 전형적인 YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE 및 WN/LGT 키메라의 주요 특징은 캡시드 및 prM 단백질 사이의 시그널 서열에 있다. 하기 실시예에서 보여주는 것과 같이, YF-기반 PIV 키메라의 케이스에서, 황열병 및 TBE 서열을 포함하는 시그널 서열을 사용하는 것이 이롭다는 것을 발견하였다(하기 참조). 하나의 예시로, 상기 시그널 서열은 아미노 말단 부위에 황열병 서열(예컨대, SHDVLTVQFLIL) 및 카르복시 말단 부위에 TBE 서열(예컨대, GMLGMTIA)을 포함하여, 결국 서열 SHDVLTVQFLILGMLGMTIA로 된다. 또한 WN-기초 PIV 키메라에서, TBE 서열(예컨대, GGTDWMSWLLVIGMLGMTIA)을 포함하는 시그널 서열을 사용하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다. 상기 발명은 이와 같이 PIVs 및 LAVs인 YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE 및 WN/LGT 키메라를 포함하는데, 이들은 상기 기술한 시그널 서열 또는 시그널 서열 과정에 실질적으로 간접하지 않는 예컨대, 1-8, 2-7, 3-6 또는 4-5 아미노산 치환, 결손 또는 삽입된 이들의 변형을 포함한다. 다양한 예시에서, 상기 치환은“보존적 치환”인데, 이는 하나의 아미노산 잔기가 생물학적으로 동일한 잔기를 가진 다른 것으로 교체되는 것에 특징이 있다. 보존적 치환의 예시는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기 하나를 다른 것으로 치환 또는 아르기닌 및 리신 사이, 글루탐산 및 아스파르산 사이 또는 글루타민 및 아스파라긴 사이 등과 같은 극성 잔기 하나를 다른 것으로 치환을 포함한다. 상기 키메라에 관한 추가적인 정보는 하기의 실시예에서 제공한다.
삽입 위치
면역원을 암호화하는 서열은 본 발명의 벡터 내의 하나 또는 그 이상의 다른 위치에 삽입될 수 있다. 상대적으로 짧은 펩타이드가 PIV 또는 LAV 글리코단백질(예컨대, prM, E 및/또는 NS1 단백질)의 표면 상에서 운반되거나 및/또는 다른 단백질의 컨텍스트(context) 안에서 운반될 수 있다(현저한 B 세포 및 T 세포 반응 각각을 유도하기 위함). 완전 단백질뿐만 아니라, 외래 단백질의 대부분을 포함하는 다른 삽입체는 폴리단백질의 N- 및 C-말단에서 인터제니컬리(intergenically)하게 발현될 수 있으며 또는 바이시스트로니컬리(bicistronically)하게 발현될 수 있다(예컨대, IRES 하의 ORF 내 또는 IRES 하의 3’UTR 내; 예컨대, WO 02/102828, WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314 및 보다 상세하게는 하기 참조). PIV 구성체에서, 결손을 도입하는 것 대신에 외부 아미노산 서열을 직접 삽입하는 추가적 선택이 존재한다. 결손은 예컨대, ΔC, ΔprM-E, ΔC-prM-E, ΔNS1, ΔNS3 및 ΔNS5로부터 만들어질 수 있다. 이와 같이, 한 예로서, s-PIVs 및 d-PIVs의 ΔC 성분의 경우, 면역원-암호화 서열은 결손된 캡시드 서열을 대신하여 삽입될 수 있다. 면역원-암호화 서열은 또한 선택적으로, d-PIVs의 ΔprM-E 성분에서 결손된 prM-E 서열을 대신해서 삽입될 수 있다. 나머지 예로, 상기 서열은 ΔC-prM-E 구조체에서 결손된 서열을 대신하거나 또는 결합하여 삽입된다. 이와 같은 삽입체의 예시는 하기 실시예에서 제공한다.
PIV 결손에 삽입체를 만드는 경우, 만일 상기 서열이 단순히 인-프레임으로 융합하는 경우(예컨대, 만약 상기 서열이 ΔC 결손을 대체한다면 C 단백질의 ~ 20 첫 번째 아미노산 및 몇 개의 최종 잔기들)에는, 상기 삽입체는 상기 외래 면역원의 N- 및/또는 C- 말단에 있는 몇 개(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 추가적 벡터-특이 잔기를 가지는 상태로 제조될 수 있고, 상기 외래 면역원에 당업계에 공지된 적합한 요소들(예컨대, 바이러스 프로테아제 절단 위치; 시그날라제, 퓨린 등과 같은 세포 프로테아제 절단 위치; 오토프로테아제; 터미네이션 코돈; 및/또는 IRES 요소)이 플랭킹 되는 경우에는, 상기 추가적 벡터-특이 잔기 없이 제조될 수 있다.
만일, 단백질이 연속된 바이러스 오픈리딩프레임(ORF)의 바깥쪽에서 발현된다면, 예컨대 벡터 및 비벡터 서열이 내부 리보솜 유입 위치(IRES)에 의해 언커플링된다면, 상기 단백질의 세포질 발현이 이루어지거나 또는 상기 단백질은 적절한 시그널/앵커단편에 의해 분비 경로로 방향 지워진다.
만일, 상기 단백질이 벡터 ORF 내에서 발현된다면, 중요 고려사항은 초기의 폴리단백질 서열로부터 외래 단백질의 절단하는 것, 그리고 ER 막에 대한 상기 외래 단백질 및 모든 바이러스 단백질의 정확한 토폴로지를 유지(벡터 생존성을 달성하기 위함)하는 것, 예컨대, ER 루멘으로의 분비 단백질의 이동, 세포질 단백질 또는 막-연관 단백질을 세포질/ER 막에 연관되도록 유지하는 것을 포함한다.
보다 상세하게는, 삽입체 제조를 위한 상기 접근은 예컨대, 당단백질 삽입체의 N 및 C 말단에서 적절한 벡터-유래, 삽입체-유래, 또는 비연관 시그널 및 결합 포함 서열의 사용을 이용할 수 있다. FMDV2A 오토프로테아제(~20 아미노산) 또는 유비퀴틴(유전자 ~ 500 nt), 또는 바이러스 NS2B/NS3 프로테아제 절단 위치 측면에 위치한 오토프로테아제와 같은 표준 오토프로테아제는 벡터 폴리단백질로부터 외래 단잭질을 제거하기위하여 및 구조체의 생존력을 보증하기 위해서 자라나는 폴리펩타이드 사슬로부터 발현된 산물의 절단을 지시하는데 이용할 수 있다. 선택적으로, 폴리단백질 사슬의 성장은 예컨대, 뒤따르는 외래 유전자의 삽입과 같은 종결 코돈을 사용하여 종결될 수 있고, 상기 구조체에서 잔여 단백질의 합성은 예컨대, RNA 바이러스 벡터 분야에서 통상적으로 이용되는 뇌 심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus, EMCV) IRES와 같은 IRES 요소를 사용하여 재시작될 수 있다. 생존 가능한 재조합체가 헬퍼 세포로부터 회복될 수 있다(또는 d-PIV 버전을 위한 보통의 세포). 예컨대, 만약 후자가 외래 유전자의 효율적 발현을 초래한다면, 선택적으로, 중추 PIV 서열은 재배열될 수 있다. 예컨대, 재배열된 유전자는 TBE 바이러스에 적용되었는데, 이는 상기 prM-E 유전자가 IRES에 의해 조절되는 유전자의 3′말단으로 이동한다(Orlinger et al., J. Virol. 80:12197-12208, 2006). prM-E 또는 다른 유전자의 이동은 본 발명에 따른 PIV 플라비바이러스 백신 후보군 및 발현 벡터에 적용될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 다른 삽입 위치에 관한 추가적 세부사항은 다음과 같다(상기에서 언급했던 WO 02/102828, WO 2008/036146, WO 2008/094674 및 WO 2008/100464, WO 2008/115314 역시 참조할 것). 펩타이드 서열은 중화항체를 위한 주요 타겟인 엔벨럽 단백질에 삽입될 수 있다. 상기 서열은 엔벨럽에 예컨대, 일본 뇌염 바이러스 엔벨럽 단백질의 아미노산 위치 59, 207, 231, 277, 287, 340, 및/또는 436에 상응하는 위치에 삽입될 수 있다(예컨대, WO 2008/115314 및 WO 02/102828 참조). 다른 플라비바이러스에서 대응하는 좌위를 확인하기 위해서, 플라비바이러스 서열은 일본 뇌염 바이러스와 정렬한다. 정확한 일치는 이루어지지 않을 것이기 때문에, 비-일본 뇌염 바이러스에서, 상기 삽입 위치는 양방향에서 예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산만큼 바뀌는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, JE에서 이와 같이 허용되는 위치를 발견한 것을 고려할 때, 일본뇌염에서 그들은 양방향에서 예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산만큼 바뀔 수 있다. 추가적으로 허용되는 위치는 트랜스포존 돌연변이생성과 같은 방법을 사용하여 밝힐 수 있다(예컨대, WO 02/102828 및 WO 2008/036146 참조).
상기 삽입은 C-말단에서 삽입되어 지시한 아미노산(예컨대, 아미노산 51-52, 207-208, 231-232, 277-278, 287-288, 340-341, 및 436-437 사이)까지 지시한 아미노산에서 만들어지거나, 또는 짧은 결손(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 아미노산의 결손)을 대신해서 지시한 아미노산(또는 이들의 1-5 위치 내에서, 양방향으로)에서 시작한다.
엔벨럽 단백질에 추가하여, 삽입은 예컨대, 상기 막/전-막 단백질 및 NS1을 포함하는 다른 바이러스 단백질에서 이루어질 수 있다. 예컨대, 삽입은 캡시드/전-막 절단 위치 이전 위치(예컨대, -4, -2, 또는 1에서)에서 이루어지거나, 또는 전-막 단백질의 최초 50 아미노산내(예컨대, 26 위치에서)에서 이루어지거나, 및/또는 NS1의 아미노산 236 및 237 사이에서(또는 상기에서 언급한 지시한 서열을 둘러싸고 있는 부위) 이루어진다. 다른 예에서, 삽입은 인터제니컬리(intergenically)하게 이루어진다. 예컨대, 삽입은 E 및 NS1 단백질 사이에서 및/또는 NS2B 및 NS3 단백질 사이에서 이루어진다(예컨대, WO 2008/100464 참조). 인터제닉 삽입의 한 예로, 상기 삽입되는 서열은 상기 E-단백질의 C-말단 시그널/결합 서열 뒤에, 벡터의 E 단백질의 C-말단과 융합될 수 있고, 상기 삽입은 NS1 서열 벡터와 융합하는 C-말단 시그널/결합 서열을 포함할 수 있다. 인터제닉 삽입의 다른 실시예로, 플랭킹 프로테아제 절단 위치(예컨대, YF 17D 절단 위치)가 있는 상기 삽입 서열을 상기 NS2N/NS3 정크션에 도입된 독특한 제한 부위에 삽입될 수 있다(WO 2008/100464).
본 발명의 다른 실시예에서, 위에서 언급한 바와 같이, 3’-비번역 부위에 삽입되는 것과 같이, 하나의 서열이 내부 리보솜 유입 위치(IRES, 예컨대, 뇌 심근염 바이러스(EMCV)로부터 유래된 IRES)의 컨텍스트에 삽입될 수 있다(WO 2008/094674). 이와 같은 벡터의 한 예로, 예컨대 황열병 바이러스 서열을 이용한 IRES-면역원 카세트는 예컨대, 폴리단백질 종결 코돈 뒤의 결손(예컨대, 황열병 바이러스-기반 예시에서 136 뉴클레오티드 결손) 내와 같이 벡터의 3’-비번역 부위에 있는 다중 클로닝 위치에 삽입될 수 있다(WO 2008/094674).
본 발명의 광견병 바이러스 G 단백질 및 전체-길이 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 단백질의 s-PIV 및 d-PIV 벡터로의 삽입에 관한 자세한 사항은 하기 실시예 3에서 제공한다. 실시예 3에서 제공하는 정보는 다른 벡터의 컨텍스트 및 여기서 언급하고 있는 면역원에서 사용할 수 있다.
면역원( Immunogens )
상기에서 기술한 플라비바이러스 및 약독화 생 키메라 플라비바이러스(예컨대, YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE, 및 WN/LGT)에 기초한 PIVs(s-PIVs 및 s-PIVs)는 본 발명에서 외래(예컨대, 비-플라비바이러스) 병원체(예컨대, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 및 병원성 기생충), 암, 및 알러지-연관 면역원을 운반하기 위해 사용할 수 있다. 하기에서 상세히 논의하겠지만, 어떤 예시에서, 이는 특별한 지리적 부위에서 동등한 생태학적 지위를 차지하고 있는 몇몇의 타켓 병원체에 이로울 수 있다. 이와 같은, 면역원의 특별하고, 비-제한적 예시는 다음과 같이 제공된다.
TBE에 추가하여, 진드기는 라임병과 같은 다른 주요 질병을 옮기는 것으로 알려졌다. 이와 같이, 첫 번째 예시에서, TBE 서열(예컨대, YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE, LGT/TBE, 및 WN/LGT; "TBE"가 지시하는 모든 예시에서, 이는 Hypr 스트레인을 사용하는 선택을 포함한다.)을 포함하고 있는 키메라 플라비바이러스뿐만 아니라 TBE/LGT 서열을 포함하는 본 발명의 PIVs는 라임 병(tick-borne spirochete Borrelia burgdorferi)의 원인이 되는 물질의 방어성 면역원을 운반하는 벡터로서 사용될 수 있다. 전염성 물질 양자 모두(TBE 및 B. burgdorferi)를 표적화 하는 본 조합은, TBE 및 라임병 모두가 진드기 매개이기 때문에 이점이 있다. 상기 PIV 접근은 비-키메라 TBE 및 LGT 바이러스뿐만 아니라, 본 발명에 따라, 키메라(예컨대, YF/TBE, YF/LGT, WN/TBE, 또는 WN/LGT)에 적용될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 B. burgdorferi로부터의 대표적인 면역원은 OspA이다(Gipson et al., Vaccine 21:3875-3884, 2003). 선택적으로, 안정성 및/또는 명역성을 높이기 위해서, OspA는 자가 면역 반응의 기회를 줄이고, 및/또는 척추 동물 세포에서 원하지 않는 번역 후 변이를 일으키는 위치를 제거하기 위해서 발현 생성물의 면역원성에 영향을 줄 수 있는 N-결합 당화와 같이 변이될 수 있다. 자가 면역을 줄이는 변이는 예컨대, Willett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1303-1308, 2004에서 기술된 것들을 포함할 수 있다. 하나의 예로, 교차-반응 T 세포 에피톱으로 추정되는 FTK-OspA로서, Bb OspA165 -173(YVLEGTLTA)는 Borrelia afzelli(FTLEGKVAN)의 대응하는 펩타이드 서열과 공통점이 있게 변한다. FTK-OspA에서, 상기 대응하는 서열은 FTLEGKLTA이다.
상기 OspA의 서열은 다음과 같다:
1 mkkyllgigl ilaliackqn vssldeknsv svdlpgemkv lvskeknkdg kydliatvdk
61 lelkgtsdkn ngsgvlegvk adkskvklti sddlgqttle vfkedgktlv skkvtskdks
121 steekfnekg evsekiitra dgtrleytgi ksdgsgkake vlkgyvlegt ltaekttlvv
181 kegtvtlskn isksgevsve lndtdssaat kktaawnsgt stltitvnsk ktkdlvftke
241 ntitvqqyds ngtklegsav eitkldeikn alk
상기 전체-길이 서열 및/또는 전체-길이 서열의 면역원성을 나타내는 조각은 본 발명에서 이용될 수 있다. 대표적인 조각은 하나 또는 그 이상의 도메인 1(아미노산 34-41), 도메인 2(아미노산 65-75), 도메인 3(아미노산 190-220), 및 4(아미노산 250-270)을 포함할 수 있다(Jiang et al., Clin. Diag. Lab. Immun. 1(4):406-412, 1994). 이와 같이, 예컨대, 다음 서열(이는 어떤 조합에서든지 상기에서 나열한 서열을 포함할 수 있는 서열 변이를 포함한다.)의 어떠한 하나(또는 그 이상)를 포함하는 펩타이드는 전달될 수 있다: LPGE/GM/IK/T/GVL; GTSDKN/S/DNGSGV/T; N/H/EIS/P/L/A/SK/NSGEV/IS/TV/AE/ALN/DDT/SD/NS/TS/TA/Q/RATKKTA/GA/K/TWN/DS/AG/N/KT; SN/AGTK/NLEGS/N/K/TAVEIT/KK/TLD/KEI/LKN.
B. burgdorferi에 추가하여, 64TRP, Isac, 및 Salp20와 같은 진드기 타액 단백질은 예컨대, 3가-특이성의 백신 후보(TBE+라임병+진드기)를 생성하는 것과 같이 발현될 수 있다. 선택적으로, 진드기 타액 단백질은 TBE 서열-포함 벡터에서 B. burgdorferi 면역원을 대신해서 발현될 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 따라 진드기 벡터 백신 개발에 이용될 수 있는 다른 진드기 타액 단백질 후보가 많이 존재한다(Francischetti et al., Insect Biochem. Mol. Biol. 35:1142-1161, 2005). 하나 또는 그 이상의 이러한 면역원이 s-PIV-TBE에서 발현될 수 있다. 그러나, d-PIV-TBE는 그것은 대량 삽입 능력 때문에 또한 선택될 수 있다. PIV-TBE에 추가적으로, 다른 PIV 백신이 예컨대, 라임병 및 웨스트 나일 바이러스와 같은 다른 플라비바이러스 병으로부터 보호하기 위해서 벡터로 사용될 수 있다. 이러한 면역원의 발현은 세포 배양에서 평가될 수 있고, 면역원성/보호성은 동물 모델에서 검사하는 것이 가능하다(예컨대, as described in Gipson et al., Vaccine 21:3875-3884, 2003; Labuda et al., Pathog. 2(e27):0251-0259, 2006). 라임병 및 진드기 면역원에 추가하여, 다가 백신 후보군을 제조하기 위한 목적으로 다른 병원체의 면역원이 유사하게 발현될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 대표적인 진드기 타액 면역원은 다음을 포함한다:
64 TRP ( AF469170 )
MKAFFVLSLL STAALTNAAR AGRLGSDLDT FGRVHGNLYA GIERAGPRGY PGLTASIGGE VGARLGGRAG VGVSSYGYGY PSWGYPYGGY GGYGGYGGYG GYDQGFGSAY GGYPGYYGYY YPSGYGGGYG GSYGGSYGGS YTYPNVRASA GAAA
Isac ( AF270496 )
MRTAFTCALL AISFLGSPCS SSEDGLEQDT IVETTTQNLY ERHYRNHSGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLN HLPPVVNATW EGIRHRINKT IPQFVKLICN FTVAMPQEFY LVYMGSDGNS DFEEDKESTG TDEDSNTGSS AAAKVTEALI IEAEENCTAH ITGWTTETPT TLEPTTESQF EAIP
Salp20 ( EU008559 )
MRTALTCALL AISFLGSPCS SSEGGLEKDS RVETTTQNLY ERYYRKHPGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLS LLPLSVNTTW EGIRHRINKT IPEFVNLICN FTVAMPDQFY LVYMGSNGNS YSEEDEDGKT GSSAAVQVTE QLIIQAEENC TAHITGWTTE APTTLEPTTE TQFEAIS
TBE-연관 PIVs 및 LAVs에 관한 추가적 세부 사항은 하기 실시예 2에서 제공한다.
본 발명은 플라비바이러스(엔벨럽 단백질 벡터에 의해 특징된) 및 비-플라비바이러스 병원체(발현된 면역 결정자에 의해 특징된) 모두에 대항하여 보호성 면역을 유발하는 이중 작용 백신을 포함하기 때문에 다른 비-플라비바이러스 병원체에 대항하는 PIV 및 LAV-벡터 백신을 추가적으로 제공한다. 이것은 상기에서 언급한 PIV-TBE-라임병-진드기 벡터 백신의 예시와 유사하다. 상기에서 언급한 바와 같이, 이중-작용 백신은 예컨대, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 및 기생충 병원체, 및 암 및 알러지에 연관된 면역원 등으로부터 면역원의 발현에 의해 넓은 범위의 병원체에 대항할 수 있게 개발될 수 있다. 구체적이고, 비-제한적 예시와 같이, 여기서 본 발명자들은 단일- 및 이중-성분 PIV 벡터의 결손과 조합하거나, 또는 이를 대체한 광견병 바이러스 G 단백질 또는 전체-길이 RSV F 단백질의 발현에 의해 구축된 PIV 벡터-광견병 및 -호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 백신 후보군의 디자인 및 생물학적 조성을 기술한다(하기 실시예 3 참조).
하기 실시예에 기술된 것처럼, s-PIV 구조체는 삽입이 상대적으로 짧은 ΔC 결손과 결합하기 때문에, 상대적으로 짧은 외래 면역원(라임병 작용제인 OspA 단백질 및 진드기 타액 단백질과 유사한)의 안정적 전달에 유용하게 이용될 수 있다.
이중-성분 PIV 벡터는 광견병 G 단백질 및 RSV F와 같은 상대적으로 대형의 면역원을 안정적으로 발현하는데 유용하게 이용될 수 있는데, 이와 같은 벡터에서 삽입은 예컨대, 대형의 ΔprM-E, ΔC-prM-E, 및/또는 ΔNS1 결손과 결합하기 때문이다. 일부 d-PIV 성분은 예컨대, 하기에서 언급하고, ΔC-prM-E 결손을 포함한 상기 PIV-RSV F 구조체와 같이 제조되고, 각각 백신으로 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 백신은 발현된 단백질에 대해 현저하나, 플라비바이러스 벡터 바이러스 병원체에 대해서는 그러하지 아니한 면역 반응(예컨대, 중화 항체)을 유발한다. 본 발명의 다른 예시에서, 이중 면역원성은 벡터 및 삽입 성분에 의해 유도된 면역원성을 보유함으로써 획득한다. 추가적으로, PIV 벡터의 대량 삽입 능력 및 이중-성분 유전자 사용의 옵션에 기인하여, PIV 벡터는 예컨대, d-PIV의 이중 성분에서 두 개의 다른 비-플라비바이러스 병원체로부터 외래 면역원을 발현하는 것에 의해서 몇 개의 비-플라비바이러스 병원체를 동시에 표적화 할 수 있는 기회를 제공한다.
외래 면역원의 예시로 상기에서 기술한 RSV F 단백질, 광견병 G 단백질, 라임병 보호 면역원 및 진드기 타액 단백질에 추가하여, 다른 외래 면역원은 예컨대, 독감 바이러스 A 및 B 타입 면역원을 포함하는 각각의 질병을 표적화 하기 위해서 발현될 수 있다. 본 예시에서, 소수의 짧은 에피토프 및/또는 독감 A의 M2, HA 및 NA 유전자 및/또는 독감 B의 NB 또는 BM2 유전자와 같은 바이러스 입자 단백질의 전체 유전자가 사용될 수 있다. M2의 세포외부 조각인 예컨대, M2e에 대응하는 M2, NB 및 BM2의 짧은 조각이 사용될 수 있다. 추가적으로, HAO로 밝혀진 에피토프(HA에서 절단 위치에 대응하는, 23 아미노산 길이)를 포함하는 HA 유전자의 조각이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 독감-연관 서열의 특별한 예시는 PAKLLKERGFFGAIAGFLE(HA0), PAKLLKERGFFGAIAGFLEGSGC(HA0), NNATFNYTNVNPISHIRGS(NBe), MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(M2e), MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(M2e), MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(M2e), EVETPTRN(M2e), SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(M2e), 및 SLLTEVETPIRNEWGCR(M2e)를 포함한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 추가적인 M2e 서열은 독감 B의 BM2 단백질의 세포외 도메인으로부터의 서열(MLEPFQ 일치, 예컨대, LEPFQILSISGC), 및 조류독감(avian flu) H5N1으로부터의 M2e 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 벡터로 이동할 수 있는 병원체 면역원의 다른 예시는 코돈 최적화 SIV 또는 HIV gag(55 kDa), gp120, gp160, SIV mac239-rev/tat/nef, genes 또는 HIV로부터의 유사물, 및 다른 HIV 면역원; 예컨대, HPV-유사 입자로 자가-조립되는 캡시드 단백질 L1, L2 또는 이들의 면역우세 부분(예컨대, 아미노산 1-200, 1-88, 또는 17-36), 포유류 세포의 변형 및 불멸화에 관여하는 서로 융합되고, 적절하게 변이된 E6 및 E7 단백질(두개의 유전자의 융합은 E6E7Rb-로 불리우는 융합 단백질을 생성하는데, 이는 약 10-배 적은 섬유아세포 변형, 및 E7 성분 2 잔기의 변이는 변형 유도를 불가능하게 하는 융합 단백질 변이를 초래한다(Boursnell et al., Vaccine 14:1485-1494, 1996)의 HPV16, HPV18 등과 같은 HPV 바이러스로부터의 면역원을 포함한다. 다른 면역원은 균상 병원체, 암 면역원, 및 백신 타겟으로 이용될 수 있는 알러지와 연관된 단백질뿐만 아니라 HCV, CMV 및 HSV2 바이러스, 말라리아 기생충, 결핵의 원인이 되는 결핵균, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 및 본 분야에서 알려진 다른 병원내 감염의 보효성 면역원을 포함한다.
본 발명의 외래 면역원 삽입체는 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 예컨대, 코돈 최적화는 발현 수준을 높이기 위해서 그리고 뉴클레오티드 서열의 긴 반복된 부분의 제거는 PIV 벡터의 RNA 지놈의 삽입체 안정성을 증가시키기 위해서 사용된다.
면역원성은 TLR 효능제, 자극성 사이토카인, 보체 인자 및 열-충격 단백질 등과 같은 본 분야에서 주지된 면역자극 모이어티로 단백질의 키메라화에 의해 증가될 수 있다(예컨대, reviewed in "Immunopotentiators in Modern Vaccines," Schijns 및 O’Hagan Eds., 2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston).
광견병 및 다른 플라비바이러스 질병, TBE + 광견병, YF + 광견병 등과 같은 다른 조합에 대항하는 듀얼 백신의 구축은 상응하는 지리적 지역에서 인간 및 가축의 사용에 관심을 가질 수 있고, 이와 같이 유사하게 만들어질 수 있다. 구조체 발현의 가능한 디자인은 여기서 언급하고 있는 것에 제한되지 않는다. 예컨대, 결손 및 삽입은 변형될 수 있고, 유전 인자는 재배열될 수 있으며, 또는 다른 유전 인자(예컨대, 비-플라비바이러스, 비-광견병 분비 시그널, 세포내부 운반 결정자, 사이토카인같은 면역자극 모이어티, 플라젤린 같은 TLR 효능제 및 류신 지퍼와 같은 다량체 성분의 포함 또는 융합 및 혈액내에서 단백질 순환의 기간을 증가시키는 펩타이드)는 항원 제시 촉진 및 면역원성의 증가에 사용될 수 있다. 게다가, 이와 같은 디자인은 s-PIV 및 d-PIV 다른 플라비바이러스 벡터 지놈에 기초한 백신 후보군에 적용될 수 있고, 예컨대, 여기서 언급한 병원체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 병원체의 면역원을 발현할 수 있다.
본 발명의 PIV 및 LAV 벡터의 다른 예시는 DEN+치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 및 YF+CHIKV와 같은 조합 백신을 포함한다. 알파바이러스인 CHIKV는 아프리카, 동남아시아, 인도 아대륙, 남태평양 섬들 및 태평양 섬들의 풍토병이며, YF 및 DEN1-4로 생태학/지리학적 지위를 나눈다. 이는 대다수의 환자에게서 주로 심한 통증(관절염, 다른 증상은 DEN과 유사함) 및 장기간의 후유증을 동반하는 심각한 질병의 원인이다(Simon et al., Med. Clin. North Am. 92:1323-1343, 2008; Seneviratne et al., J. Travel Med. 14:320-325, 2007). 본 발명의 PIV 및 LAV의 다른 예시는 아프리카에서 동시에 유행하고 있는 YF+에볼라 또는 DEN+에볼라를 포함한다. 상기 기술한 비-플라비바이러스 병원체를 위한 면역원의 당업계에서 잘 알려진 서열은 당단백 B 또는 CMV의 pp65/IE1 융합 단백질(Reap et al., Vaccine 25(42):7441-7449, 2007; 및 references therein), 몇 개의 TB 단백질(Skeiky et al., Nat. Rev. Microbiol. 4(6):469-476, 2006), RTS,S 및 다른 것(예컨대, Li et al., Vaccine 25(14):2567-2574, 2007)과 같은 말라리아 기생충 항원(a pre-erythrocytic circumsporozoite 단백질, CSP), CHIKV 엔벨럽 단백질 E1 및 E2(또는 C-E2-E1, E2-E1 카세트), HCV 구조 단백질 C-E1-E2 형성 VLPs(Ezelle et al., J. Virol. 76(23):12325-12334, 2002) 또는 T-세포 반응을 유도하는 다른 단백질, 에볼라 바이러스 당단백질 GP(Yang et al., Virology 377(2):255-264, 2008)를 포함할 수 있다.
상기에서 언급한 면역원에 추가하여, 여기서 언급하고 있는 벡터는 예컨대, dsDNA 바이러스(예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 헤르페스 심플렉스 타입 1, 헤르페스 심플렉스 타입 2, 인간 헤르페스 바이러스 심플렉스 타입 8, 인간 사이토메갈로 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 폭스 바이러스); ssDNA 바이러스(예컨대, 파보바이러스, 파필로마바이러스 (예컨대, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, BPV1, BPV2, BPV3, BPV4, BPV5, 및 BPV6 (In Papillomavirus 및 Human Cancer, edited by H. Pfister (CRC Press, Inc. 1990)); Lancaster et al., Cancer Metast. Rev. pp. 6653-6664, 1987; Pfister et al., Adv. Cancer Res. 48:113-147, 1987)); dsRNA 바이러스(예컨대, 레오바이러스); (+)ssRNA 바이러스(예컨대, 피코나바이러스, 콕사키 바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오 바이러스, 토가바이러스, 루벨라 바이러스, 플라비 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스); (-)ssRNA 바이러스 (예컨대, 오르토믹소 바이러스, 독감 바이러스, 랩도 바이러스, 파라믹소 바이러스, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 파라독감 바이러스, 랩도 바이러스, 광견병 바이러스); ssRNA-RT 바이러스(예컨대, 레트로 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)); 및 dsDNA-RT 바이러스 (예컨대, 헤파드나 바이러스, B형 간염 바이러스)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 바이러스에 대해 면역 반응을 지시하거나 또는 이들로부터 유래한 면역원을 포함할 수 있다. 면역원은 또한 상기에서 기술된 것아 아닌 당해 분야에서 이용 가능한 기술을 이용하여 다른 바이러스로부터 유래될 수 있다.
HIV에 관하여, 면역원은 어떤 분리된 HIV로부터 선택될 수 있다. 당해 분야에서 주지된 바와 같이, 분리된 HIV는 현재 분리된 유전적 아형으로 분류된다. HIV-1는 적어도 10 아형을 포함하는 것으로 알려졌다(A, B, C, D, E, F, G, H, J, 및 K). HIV-2는 적어도 5 아형을 포함하는 것으로 알려졌다(A, B, C, D, 및 E). 아형 B는 남성 동성애자 및 전 세계 정맥주사 마약 사용자의 유행성 HIV와 연관이 있다. 대부분의 HIV-1 면역원, 실험실 적용된 분리된 것, 시약 및 지도화된 에피토프는 아형 B에 속한다. 새로운 HIV 감염 빈도가 높은 아-사하라 아프리카, 인도 및 중국 지역은 HIV-1 아형 B는 감염의 낮은 비율을 차지하고, 아형 HIV-1 C가 가장 빈번하게 감염되는 아형에 해당한다. 이와 같이, 어떤 구현예에서는 HIV-1 아형 B 및/또는 C 면역원의 선택이 바람직할 수 있다. 단독의 면역학적 조성물에 복수의 HIV 아형으로부터(예컨대, HIV-1 아형 B 및 C, HIV-2 아형 A 및 B, 또는 a combination of HIV-1 및 HIV-2 아형) 면역원을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 적절한 HIV 면역원은 ENV, GAG, POL 및 NEF 뿐만 아니라 예컨대 이들의 변형물, 파생물 및 융합 단백질을 포함한다.
면역원은 또한 예컨대, 바실러스 종(예컨대, Bacillus anthracis), 보데텔라 종(예컨대, Bordetella pertussis), 보렐리아 종(예컨대, Borrelia burgdorferi), 부르셀라 종(예컨대, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis), 캄필로박터 종(예컨대, Campylobacter jejuni), 클라미디아 종(예컨대, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 종(예컨대, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), 코리네박테리움 종(예컨대, Corynebacterium diptheriae), 엔테로코쿠스 종(예컨대, Enterococcus faecalis, enterococcus faecum), 에스케리치아 종(예컨대, Escherichia coli), 프란시셀라 종(예컨대, Francisella tularensis), 헤모필러스 종(예컨대, Haemophilus influenza), 헬리코박터 종(예컨대, Helicobacter pylori), 리지오넬라 종(예컨대, Legionella pneumophila), 렙토스피라 종(예컨대, Leptospira interrogans), 리스테리아 종(예컨대, Listeria monocytogenes), 마이코박테리아 종(예컨대, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라즈마 종(예컨대, Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 종(예컨대, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), 슈도모나스 종(예컨대, Pseudomonas aeruginosa), 리켓시야 종(예컨대, Rickettsia rickettsii), 살모넬라 종(예컨대, Salmonella typhi, Salmonella typhinurium), 시젤라 종(예컨대, Shigella sonnei), 스테필로 코코스 종(예컨대, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, coagulase negative staphylococcus (예컨대, U.S. Patent No. 7,473,762)), 스트렙토코코스 종(예컨대, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes), 트레포니아 종(예컨대, Treponema pallidum), 비브리오 종(예컨대, Vibrio cholerae), 및 예르시니아 종(Yersinia pestis)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 박테리아종(spp.)에 대해 면역 반응을 지시하거나, 이들로부터 유래할 수 있다(예컨대, bacterial target antigen(s)). 면역원은 또한 상기에서 기술된 것아 아닌 당해 분야에서 이용 가능한 기술을 이용하여 다른 박테리아로부터 유래될 수 있다.
면역원은 또한 예컨대, 안실로스토마 종(예컨대, A. duodenale), 애니사키스(Anisakis) 종, 아스크리스룸브리코이더스(Ascaris lumbricoides), 발란티듐 콜라이(Balantidium coli), 세스토다(Cestoda) 종, 시미시대(Cimicidae) 종, 크로노치스 시넨시스(Clonorchis sinensis), 디크로코에리움 덴드리티큠(Dicrocoelium dendriticum), 디크로코에리움 호스페스(Dicrocoelium hospes), 디필로보트리움 라튬(Diphyllobothrium latum), 드라쿤크루스(Dracunculus) 종, 에치노코쿠스(Echinococcus) 종(예컨대, E. granulosus, E. multilocularis), 엔타모에바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 엔테로비우스 버미큘라리스(Enterobius vermicularis), 파스시올라(Fasciola) 종(예컨대, F. hepatica, F. magna, F. gigantica, F. jacksoni), 파시오롭시스 부스키(Fasciolopsis buski), 지알디아 종(Giardia lamblia), 그나토스토마(Gnathostoma) 종, 히메노레피스(Hymenolepis) 종(예컨대, H. nana, H. diminuta), 레쉬마니아(Leishmania) 종, 로아 로아(Loa loa), 메토르치스(Metorchis) 종(M. conjunctus, M. albidus), 네카토 아메리카누스(Necator americanus), 오에느트로이대(Oestroidea) 종(예컨대, botfly), 온코세르시대(Onchocercidae) 종, 오피스토르치스(Opisthorchis) 종(예컨대, O. viverrini, O. felineus, O. guayaquilensis, 및 O. noverca), 플라스모디움(Plasmodium) 종(예컨대, P. falciparum), 프로토패스시올라 로버스타(Protofasciola robusta), 파라파시오립시스 파시오몰패(Parafasciolopsis fasciomorphae), 파라고니무스 웨스터마니(Paragonimus westermani), 시스토소마(Schistosoma) 종(예컨대, S. mansoni, S. japonicum, S. mekongi, S. haematobium), 스피로메트라 에리내세이유로파이(Spirometra erinaceieuropaei), 스트로지로이데스 스터코라리스(Strongyloides stercoralis), 태니아(Taenia) 종(예컨대, T. saginata, T. solium), 톡소카라(Toxocara) 종(예컨대, T. canis, T. cati), 톡소플라스마(Toxoplasma) 종(예컨대, T. gondii), 트리코빌하비아 리젠티(Trichobilharzia regenti), 트리시넬라 스피라리스(Trichinella spiralis), 트리큘리스 트리키우라(Trichuris trichiura), 트롬비큘리대(Trombiculidae) 종, 트리파노소마(Trypanosoma) 종, 퉁가 페넨트란스(Tunga penetrans), 및/또는 유케렐리아 방크로프티(Wuchereria bancrofti)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 기생충종(spp.)에 대해 면역 반응을 지시하거나, 이들로부터 유래할 수 있다(예컨대, 기생충 타겟 항원). 면역원은 또한 상기에서 기술된 것아 아닌 당해 분야에서 이용 가능한 기술을 이용하여 다른 기생충 조직체로부터 유래될 수 있다.
면역원은 종양 표적 항원으로부터 유래하거나 또는 이들로부터 면역 반응을 지시할 수 있다(예컨대, 종양 타겟 항원). 상기 종양 표적 항원(TA) 용어는 암세포 항원의 원천인 종양-관련 항원(TAAs) 및 종양-특이적 항원 (TSAs)을 모두 포함할 수 있다. TA는 종양 세포의 표면에서 정상 세포에서 관찰되는 것보다 많은 양이 발현되는 항원이거나, 또는 태아 발달기간에 정상세포에서 발현되는 항원일 수 있다. TSA는 정상 세포에서는 발현되지 않고, 종양 세포에서 독특하고, 전형적인 항원이다. TAs는 그들의 발현 패턴, 기능, 또는 유전적 기원에 따라 전형적으로 5개지 카테고리로 분류된다: 고환암(CT) 항원(예컨대, MAGE, NY-ESO-1); 멜라닌세포 분화 항원(예컨대, Melan A/MART-1, tyrosinase, gp100) 돌연변이 항원(예컨대, MUM-1, p53, CDK-4); 과발현‘자가’항원(예컨대, HER-2/neu, p53); 및 바이러스 항원(예컨대, HPV, EBV). 적절한 TAs는 예컨대, gp100(Cox et al., Science 264:716-719, 1994), MART-1/Melan A(Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352, 1994), gp75(TRP-1)(Wang et al., J. Exp. Med., 186:1131-1140, 1996), 티로시나제(Wolfel et al., Eur. J. Immunol., 24:759-764, 1994), NY-ESO-1(WO 98/14464; WO 99/18206), 멜라노마 프로테오글리칸(Hellstrom et al., J. Immunol., 130:1467-1472, 1983), MAGE과 항원(e.gl, MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 및 12; Van der Bruggen et al., Science 254:1643-1647, 1991; U.S. Patent No. 6,235,525), BAGE과 항원(Boel et al., Immunity 2:167-175, 1995), GAGE과 항원(예컨대, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 182:689-698, 1995; U.S. Patent No. 6,013,765), RAGE과 항원(예컨대, RAGE-1; Gaugler et al., Immunogenetics44:323-330, 1996; U.S. Patent No. 5,939,526), N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V(Guilloux et al., J. Exp. Med. 183:1173-1183, 1996), p15(Robbins et al., J. lmmunol. 154:5944-5950, 1995), ß-카테닌(Robbins et al., J. Exp. Med., 183:1185-1192, 1996), MUM-1(Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7976-7980, 1995), 사이클린 의존 키나제-4(CDK4)(Wolfel et al., Science 269:1281-1284, 1995), p21-ras(Fossum et al., Int. J. Cancer56:40-45, 1994), BCR-abl(Bocchia et al., Blood 85:2680-2684, 1995), p53(Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11993-11997, 1995), p185 HER2/neu(erb-B1; Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117, 1995), 표피성장인자수용체(EGFR)(Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2, 1994), 암배항원(CEA)(Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990, 1995) 미국 특허번호 5,756,103; 5,274,087; 5,571,710; 6,071,716; 5,698,530; 6,045,802; EP 263933; EP 346710; 및 EP 784483; 암종-연관 변이 뮤신(예컨대, MUC-1 gene products; Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662, 1993); EBV의 EBNA 유전자 산물(예컨대, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Surveys 13:53-80, 1992); 인간 파필로마바이러스의 E7, E6 단백질(Ressing et al., J. Immunol. 154:5934-5943, 1995); 전립선 특이 항원(PSA; Xue et al., The Prostate 30:73-78, 1997); 전립선 특이 막 항원(PSMA; Israeli et al., Cancer Res. 54:1807-1811, 1994); 예컨대,면역글로블린 유전자형 또는 T 세포 수용체 유전자형과 같은 에피토프 또는 항원의 유전자형(Chen et al., J. Immunol. 153:4775-4787, 1994); KSA (U.S. Patent No. 5,348,887), 키네신 2(Dietz, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 275(3):731-738, 2000), HIP-55, TGFβ-1 사멸-억제 인자(Toomey et al., Br. J. Biomed. Sci. 58(3):177-183, 2001), 종양 단백질 D52(Bryne et al., Genomics 35:523-532, 1996), H1FT, NY-BR-1(WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87, 및 NY-BR-96(Scanlan, M. Serologic 및 Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY), 및/또는 췌장암 항원(예컨대, SEQ ID NOs: 1-288 of U.S. Patent No. 7,473,531)을 포함한다. 면역원은 또한 상기에서 언급되지 않았으나, 당해 분야의 사용가능한 기술의 하나인 TAs에 면역 반응을 지시하거나, 또는 이들로부터 유래할 수 있다.
상기 열거된 특이 면역원 서열에 추가하여, 본 발명은 또한 상기 서열의 유사형태 사용을 포함한다. 이러한 유사형태는 예컨대, 참고 서열 또는 이들의 조각과 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 99% 일치하는 서열을 포함한다. 상기 유사형태는 또한 예컨대, 하나 또는 그 이상의 상기 서열의 면역원성 에피토프를 포함하는 참고 서열의 조각을 포함한다. 게다가, 상기 유사형태는 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20 등 아미노산의 한쪽 또는 양쪽에 의한 상기 서열(예컨대, 추가적/반복적 면역우세/헬퍼 에피토프의 삽입)의 절단 또는 확장을 포함한다. 절단은 면역학적으로 비중요 또는 간섭 서열을 제거할 수 있고, 예컨대, 알고 있는 구조/면역원성 도메인 안, 또는 사이; 또는 전체 소망하지 않은 도메인이 제거될 수 있다; 이러한 변형은 21-30, 31-50, 51-100, 101-400 등 아미노산 범위에서 나타날 수 있다. 상기 범위는 또한 예컨대, 20-400, 30-100, 및 50-100 아미노산을 포함한다.
칵테일
본 발명은 또한 둘 또는 그 이상의 여기서 언급하고 있는 PIVs 및/또는 PIV 벡터의 혼합물을 포함하는 성분을 포함한다. 상기에서 논의한 것과 같이, 이러한 혼합물 또는 칵테일의 사용은 바람직하게는 하나 이상의 면역원 및/또는 병원체에 면역원성을 유도할 경우에 특별히 유용할 수 있다. 이는 예컨대, 백신 투여자가 살고 있는 지역의 풍토병일 수 있는 다른 플라비바이러스에 대항하는 예방접종에 유용할 수 있다. 이는 또한 같은 목표에 대항하는 다중 면역원 투여의 맥락에서 유용할 수 있다.
본 발명에서 포함하고 있는 PIV 칵테일의 비-제한 예시는 PIV-JE + PIV-DEN, 및 PIV-YF + PIV-DEN를 포함하는 것들이다. 이러한 두 가지 예시에서, 어느 하나 또는 양 성분을 위한 상기 PIVs은 상기에서 언급했던 단독 또는 이중 성분 PIVs일 수 있다. 추가적으로, 상기 PIV-DEN의 경우, 상기 PIV는 뎅기 혈청형 1-4로 구성되는 그룹으로부터 선택된 단지 하나의 뎅기 혈청형의 서열을 포함할 수 있고, 또는 상기 칵테일는 상기 혈청형의 둘, 셋 또는 넷 모두로부터 PIVs 발현 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 여기서 언급하고 있는 상기 TBE/보렐리아 복도페리(Borrelia burgdorferi)/진드기 타액 단백질(예컨대, 64TRP, Isac, Salp20) 백신은 단일의 PIV 또는 약독화 생 플라비바이러스 내의 다른 면역원들을 포함하는 것에 기초하거나, 또는 각자 하나 또는 그 이상의 면역원을 포함하는 PIVs의 혼합물에 기초할 수 있다. 본 발명의 상기 혼합체는 이와 같이 만들어질 수 있고, 또는 투여에 앞서 바로 혼합될 수 있다.
용도, 제제 및 투여
본 발명은 PIV 벡터, PIVs, LAV 벡터 및 LAV 뿐만 아니라 대응하는 핵산 분자, 약제학적 또는 백신 조성물 및 이들의 용도 및 제조를 포함한다. 본 발명의 상기 PIV 벡터, PIVs, LAV 벡터 및 LAVs는 예컨대, TBE 또는 다른 플라비바이러스, 및/또는 여기서 언급하고 있는다른 발현된 면역원에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 예방접종 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 감염 또는 질병을 보유하고 있지는 않으나, TBE 또는 다른 플라비바이러스 및/또는 다른 발현된 면역원으로부터 유래한 병원체에 의한 감염 또는 질병 발생의 위험에 있는 대상(예컨대, 인체 대상 또는 다른 포유류 대상)에 실시되는 경우에서 예방목적일 수 있다. 상기 방법은 이미 하나 또는 그 이상의 상기 관련된 병원체에 의한 감염을 보유하고 있는 대상에 실시되는 경우에서 치료 목적일 수 있다. 게다가, 상기 바이러스 및 벡터는 각자 또는 서로 또는 다른 백신과 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 다뤄지는 상기 대상은 비-인간 포유류뿐만 아니라 인간을 포함한다(예컨대, 예컨대, 소, 돼지, 말, 양 및 염소와 같은 가축 및 개와 고양를 포함하는 애완 동물).
본 발명의 PIV 벡터, PIVs, LAV 벡터 및 LAVs의 제제는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 실시될 수 있다. 백신 제조에 사용하기 위한 수많은 약제학적으로 허용가능한 용액은 주지되었고, 본 발명에 사용하기 위하여 당해 분야의 기술에 의해 손쉽게 적용될 수 있다(예컨대, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 참조). 두 가지 특별한 예시에서, 상기 PIV 벡터, PIVs, LAV 벡터 및 LAVs는 7.5% 락토즈 및 2.5% 인간혈청 알부민을 포함하고 있는 MEME(Minimum Essential Medium Earle’s Salt)에서 또는 10% 솔비톨을 포함하고 있는 MEME에서 제조될 수 있다. 그러나, 상기 PIV벡터, PIVs, LAV 벡터 및 LAVs는 생리식염수 또는 완충된 생리식염수와 같이 생리학적으로 허용가능한 용액에서 간단히 희석될 수 있다.
본 발명의 상기 PIV벡터, PIVs, LAV 벡터 및 LAVs는 당해 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 주입할 수 있고, 주입하는 바이러스 및 벡터의 적절한 양은 당해 분야의 기술을 이용하여 쉽게 결정할 수 있다. 주입하는 바이러스의 적절한 양이 되기 위해 결정하여야 할 것은 예컨대 바이러스가 주입되는 대상의 크기 및 일반적 건강 상태를 고려해서 결정할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약독화 생 바이러스에서, 상기 바이러스는 0.1에서 1.0 ml의 1회 주입 부피에서 102에서 108 사이 예컨대, 103에서 107의 감염 단위(예컨대, 플라그-형성 단위 또는 조직 배양 감염성 투여량)를 포함한 소독된 액체 용액과 같이 제조될 수 있다. PIVs는 유사한 투여량 및 부피로 주입될 수 있으며; 상기 결손성 구조체들은 바이러스-유사 플라그를 형성하지 않는 경향이 있기 때문에 PIV 역가는 예컨대, 포커스의 면역염색에 의해 결정된 포커스 형성 단위로 주로 측정된다. 투여량은 102 내지 108의 FFU 범위일 수 있고 0.1 내지 1.0 ml의 부피로 투여될 수 있다.
본 발명의 모든 바이러스 및 벡터는 예컨대, 피내, 피하, 근육 내부, 또는 구강 루트로 주입될 수 있다. 특이한 예로, 수지상세포는 예컨대, 미세 바늘 또는 미세 절삭 장치를 이용하여 피내 또는 경피내 주입에 의해 타겟이 될 수 있다. 게다가, 본 발명의 상기 백신은 단독 투여량으로, 또는 선택적으로 당해 분야의 기술에 의해 적절하게 결정된 애벌투여량(priming dose) 사용 2-6 개월 이후 뒤따르는 추가투여량(booster dose)의 사용에 의해 주입될 수 있다. 선택적으로, PIV 백신은 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 DNA 또는 RNA 면역화를 통해서 주입될 수 있다Chang et al., Nat. Biotechnol. 26:571-577, 2008; Kofler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1951-1956, 2004).
선택적으로 당해 분야에서 알려진 어쥬번트가 본 발명의 바이러스 및 벡터의 주입에 사용될 수 있다. 상기 바이러스의 면역원성을 증강하기 위해 사용되는 어쥬번트는 예컨대 리포좀화 제제, 뮤라밀 디펩티드, 모노포스포릴 지질 A, 폴리포스파진, CpG 올리고뉴클레오티드, 또는 세포내 핵막 또는 세포 표면의 톨-유사 수용체(TLR)의 활성에 의해 작용하는 것으로 나타난 다른 분자와 같은 합성 어쥬번트(예컨대, QS21)를 포함한다. 이러한 어쥬번트는 전형적으로 불활화 백신의 면역 반응을 증가하기 위해 사용됨에도 불구하고, 이들은 또한 생 또는 복제-결손 백신에도 사용될 수 있다. TLRs 또는 길항체의 작용약 모두는 생 또는 복제-결손 백신의 경우에도 유용할 수 있다. 상기 백신 후보군은 TLR 작용약을 발형하기 위해 디자인될 수 있다. 구강과 같이 점막 경로를 통해 운반된 바이러스의 경우, 대장균의 열-불안정 독소 또는 LT의 변이 파생물과 같은 점막 어쥬번트가 어쥬번트로 이용될 수 있다. 추가적으로, 어쥬번트 활성을 보유하는 사이토카인을 인코딩한 유전자는 백신 후보군에 삽입될 수 있다. 이와 같이, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 및 IL-5 등과 같이 소망하는 사이토카인을 암호화하는 유전자는 보강된 면역 반응을 유도하는 백신을 생산하기 위해서 또는 세포성, 체액성 또는 점막성 반응에 대한 면역원성 지시 조절을 좀더 구체적으로 지시하기 위해서 외래 면역원 유전자와 함께 삽입될 수 있다(예컨대, "Immunopotentiators in Modern Vaccines", Schijns 및 O’Hagan Eds., 2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston, etc.). 선택적으로, 적절한 독소-유래 어쥬번트 층을 포함하는 팻치는 주입 위치 위에 적용될 수 있다. 독소는 림프구를 유도하는 국소 염증을 촉진하여, 보다 강력한 면역 반응을 일으킨다.
실시예
본 발명에 관한 추가적인 설명은 하기 실시예에서 제공한다. 실시예에서, WN, JE 및 YF 바이러스에 기반한 PIVs(참조, 예컨대, WO 2007/098267 및 WO 2008/137163)를 시험하는 것으로 실험들이 기재되었다. 첫째, 본 발명자들은 민감성 영아마우스 신경독성 모델에서 상기 구조체가 구입가능한 LAV 대조군(YF 17D, YF/JE LAV, 및 YF/WN LAV)과 비교하여 상당히 약독화된 것을 증명하였다(모든 실험 투여량에서 0의 사망률). 본 발명자들은 d-PIV 구조체가 상기 모델에서 독성이 없다는 것 및 이와 같은 이중-성분 PIVs이 인 비보에서 통제되지 않은(무제한의) 확산이 일어나지 않고, 임상적 소견을 유발하지 않는 다는 것을 최초로 증명하였다. 둘째, 본 발명자들은 상기 PIVs 및 상기 LAVs의 면역원성 및 효능을 비교하였고, PIV 백신이 LAVs와 거의 유사한 정도로 면역 반응을 유도할 수 있고 동등한 정도로 효과적이라는 것을 설명하였다(예컨대, 백신의 PIV-WN 및 YF/WN LAV 페어에서 관찰되는 것). 검사한 한 쌍에서, YF 17D LAV가 PIV-YF보다 상당히 면역원성이 높았다. 따라서, 유사 디자인된 다른 PIV 구조체들에서 VLPs의 생산이 다양하게 변화될 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 PIV-YF가 PIV-WN(WN VLPs)과 비교하여 많은 양의 YF VLPs를 유발하지 않는다는 것을 제안하며, VLPs의 증가된 생산은 서브최적의 PIV 구조체들에서 C/prM 정크션(junction)에서의 유전적 변형에 의해 이루어질 수 있다는 것을 제안한다. 구체적으로, 상기 C/prM 정크션은 바이러스 단백질의 합성 및 바이러스 엔벨럽의 형성을 조율하는 플라비바이러스 폴리단백질에 있는 중요한 위치이다(Yamshchikov 및 Compans, Virology 192:38-51, 1993; Amberg 및 Rice, J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Stocks 및 Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998). 본 발명자들은 PIV 감염 세포에서 VLPs의 분비(전체 바이러스에서 바이러스 입자의 생성과 반대됨)가, 상기 정크션에서의 바이러스 프로테아제 및 시느날라제 절단의 언커플링에 의해 증가되거나, 또는 prM에 대한 시그널 대신 강력한 이종 시그널 펩타이드(tPA 등)를 사용하여 증가되거나, 또는 prM에 대한 시그널의 돌연변이에 의해 증가될 수 있음을 제안한다. 플라비바이러스의 C/prM 정크션에서 시그널라제 절단 효율은 예컨대, SignalP 3.0 on-line에서 예상된 바와 같이 낮다(Stocks 및 Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998). SignalP 3.0을 이용하여 상기 절단 위치 근처의 구체적인 아미노산 치환의 분석(예컨대, WO 2008/100464에 기재 내용), 이어 PIV 지놈내로 선택된 돌연변이(들)의 삽입, PIV 자손의 회수 및 VLP 분비의 측정을 통해서 보다 효율적인 절단 효율이 달성된다는 것이 기대된다. 비-플라비바이러스 시그널는 당업계의 통상적적인 방법을 통해서 삽입된다. 바이러스 프로테아제 및 시그널라제 절단 사이의 언커플링은, 어떤 비-보존적 변이(예컨대, RRS in YF17D C to RRA or GRS or RSS, 등)에 의한 바이러스 절단 위치의 제거, 또는 전체 위치에서의 결손 또는 그의 3개 잔기의 일부 결손을 통해 달성될 수 있다. 필요한 경우, 외래 단백질의 상기 시그널의 자유로운 N-말단의 형성은 오토프로테아제와 같은 요소 또는 IRES가 뒤따르는 종결 코돈을 사용함으로써 달성돌 수 있다. 택일적으로, C의 본래 AUG 시작 코돈을 제거하고(C 단백질 서열이 필요하지 않은 구조체에서, 예컨대 ΔC PIV), 외래 유전자 앞에 AUG를 배치할 수 있다. 벡터 시그널의 최적화는 예컨대, VLP 분비가 증가된 생존 가능한 PIV 변이체를 동정하는 과정이 후속되는 무작위 합성 서열의 삽입과 같은 무작위 변이 생성에 의해 실시할 수 있다.
본 발명자들은 또한 PIV 구조체는 햄스터에서 피하 경로로 투여된 것과 비교하여 IP 경로로 투여되었을 때 실질적으로 보다 면역원성이 높다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이것이 필시 복부에서 풍부하고 피하 조직에서 풍부하지 않은 림프 조직에서 항원 제시 세포의 더 나은 표적화에 기인한다고 결론을 내렸다. 이러한 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 피부에 풍부한 수지상 세포에 대한 PIVs의 효율적인 표적화는 예컨대, 피부 미세 절삭을 통해 또는 마세 바늘을 이용한 피내 주입(Dean et al., Hum Vaccin. 1:106-111, 2005)과 같은 피부 접종에 의해 이루어질 수 있다고 결론을 내렸다.
게다가, 여기서 언급하고 있는 것(예컨대, JE+DEN 및 YF+DEN)과 같은 다른 PIVs의 칵테일 또는 혼합물 주입의 실행가능성을 보여주기 위해서 실험을 진행하였다. 칵테일를 주입하기 위해서, 상호-주입된 성분 사이에 간섭이 없고, 균형 있는 면역 반응을 유발하는 것을 확인하는 것은 중요하다. 몇몇의 PIV 혼합물이 설치류를 면역화 시키기 위해 사용되었고, 면역 반응을 PIV 구조체 단독으로 주입된 것과 비교하였다. 혼합물에서 어떠한 간섭도 관찰되지 않았고, 이와 같은 PIV 칵테일 백신은 이용 가능하였다. 이러한 제제는 다른 플라비바이러스가 상호-유행하는 지리학적 지역에서 특별하고, 중요할 수 있다. 이는 또한 비-플라비바이러스 병원체에 대항하기 위한 몇몇의 PIV-기반 백신의 동시 주입에 사용될 수 있다.
게다가, 본 발명자들은 적어도 PIV의 2회 분량 투여 이후 엔벨럽 패키징에 대한 중화 항체 반응을 유도하지 않는다는 것을 설명하였다(및 감염 세포에서 분비된 VLPs에 의해 유도된 항체). 이는 각각 패키징된 d-PIV(도 2 참조)의 헬퍼(ΔprM-E) 성분을 사용하거나, 또는 이종 엔벨럽 패키징에 대한 중화 항체를 측정함으로써 설명할 수 있었다(예컨대, WN-특이적 C-prM-E 단백질을 인 트랜스 방식으로 공급하는 헬퍼세포내에서 WN 엔벨럽을 패키징하기 위해 사용). 상기 후기 관찰은 상기에서 논의된 것처럼 일반적인 헬퍼 패키징 세포주에서 제조된 다른 PIV 백신의 순차적 사용 및 같은 개체에서 다른 재조합 PIV-벡터 백신의 순차적 사용을 뒷받침하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 이전 관찰에서 PIV 구조체는 인 비보에서 안정적으로 높은 수율로 배양될 수 있고, 기질 세포에서 장기간의 통과 이후 재조합 복원 전체 바이러스가 나타나지 않는다는 것을 확인하였다(Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007).
본 발명의 이러한 면 및 다른 면은 하기 실시예에서 보다 자세하게 설명하도록 하겠다.
실시예 1. 가감염성 바이러스 플랫폼 개발 연구
영아마우스 신경독성(NV) 모델 약독화
하기에서 언급하고 있는 본 연구에서 사용하는 재료는 표 1 및 여기서 인용한 레퍼런스에 있다. 이는 s-PIV-WN(wt WN 바이러스 스트레인 NY99 서열 기초), s-PIV-JE, s-PIV-WN/JE(wt JE 바이러스 Nakayama 스트레인로부터 wt WN 바이러스 백본 및 prM-E 유전자 기초), s-PIV-YF/WN(WN 바이러스로부터 YF 17D 백본 및 prM-E 유전자), 및 s-PIV-YF(YF 17D 서열 기초)를 포함하였다. 추가적 재료는 d-PIV-YF(일반적인 BHK 세포에서 배양한 YF d-PIV(Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007), 및 이중-성분 d-PIV-WN(일반적인 베로 세포에서 배양; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008)를 포함하였다. 이러한 PIV 초기형의 약독화는 고민감성 5-일된 ICR 마우스들을 사용하여(상기 키메라 바이러스는 황열병 캡시드 및 비-구조 서열, 및 JE 또는 WN prM-E 서열을 포함) 영아 마우스 NV 테스트에서 LAVs YF 17D, 키메라 YF/JE 바이러스, 및 키메라 YF/WN 바이러스와 비교하였다. LAVs가 주입된 동물에서는 사망률이 관찰된 반면에 PIV 구조체를 투여한 동물에서 임상적 현상 또는 사망한 경우는 관찰되지 않았다(표 2).
키메라 백신은 성체 마우스에서 신경독성을 나타내지 않으나, 좀 더 민감한 영아마우스에서는 투여량-의존 사망률을 나타낼 수 있음에 반해서, 상기 YF 17D 바이러스는 모든 연령의 마우스에서 신경독성을 나타냈다(Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). 그런 이유로, YF 17D의 1 PFU만큼 낮게 투여한 영아 마우스의 90%-100%가 사망했다. YF/JE 및 YF/WN LAVs는 예상대로, 보다 높은 투여량(> 2 log10 PFU 및 3 log10 PFU, respectively)에서 부분적 사망률을 기록하고, 사망한 동물의 보다 긴 평균 생존 시간(AST)을 나타내는 원인일 수 있었다. 이와 같이, PIV 구조체는 이렇게 민감한 모델에서 완전히 비독성이었다(YF 17D 백신에 비해 적어도 20,000 - 200,000배 약한 신경독성).
상기 YF d-PIV 및 WN d-PIV는 사망률 또는 임상적 현상의 원인이 아니었다. 이와 같이, 상기 이중-성분 PIV 변이체는 이론적으로 이들의 양 성분에 상호-감염된 세포로부터 뇌 조직으로 확산될 수 있으나, 질병을 유발하지 않는다. 게다가, 본 발명자들은 본 실험에서 접종 6일 후 희생된 추가적 동물들의 뇌속에서 적정 방법을 통해서 상기 d-PIVs를 탐지하려고 하였으나, 탐지되지 않았다(각각 YF d-PIV 및 WN d-PIV의 4 log10 FFU 투여한 10 및 11 마우스로부터의 뇌 조직은 균질되고, 적정에 사용됨). 이와 같이, 상기 d-PIVs는 전체 바이러스의 확산 감염 특징을 나타내지 않았다. YF/JE LAV는 비록 임상 증상은 나타내지 않았으나, 6 일째에 ~ 6 log10 PFU/g 최고 역가에서 IC 경로로 접종한 ICR 성체 마우스의 뇌에서 복제하는 것이 관찰되었다(Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999). d-PIV의 성분에 의한 세포의 상호-감염은 전체 바이러스에 의한 감염에 비해서 보다 효율적이지 못했다. 상기 데이터는 인 비보에서 d-PIV 복제는 선천성 면역 반응에 의해 신속한 통제를 초래한다는 것을 보여준다.
마우스와 햄스터에서 면역원성/효능
상기에서 언급한 상기 초기형 PIV의 면역원성/효능은 마우스 및 시리안 햄스터에서 대응하는 키메라 LAV 및 YF17D와 비교하였다. 일반적인 실험 디자인이 도 3에 도시되었다(마우스, IP 면역). 햄스터에서의 실험은 유사하게 실시하였다(플러스-마이너스 수일간, 하기의 투여량으로 SC 또는 IP 접종). 3.5-주령 ICR 마우스(s-PIV-WN 및 -YF, YF/WN LAV, 및 YF 17D 그룹의 경우) 또는 C57/BL6 마우스(s-PIV-JE 및 YF/JE LAV 그룹의 경우)가 PIV 구조체의 단계적 투여량(4-6 log10 FFU/투여량) 또는 키메라 LAV 및 YF 17D LAV 콘트롤(4 log10 PFU)으로 IP 면역화 하였다. 선택된 PIV-WN, -JE 및 -YF 그룹은 21 일째 대응하는 구조체의 5 log10 FFU로 부스트하였다(표 3). 중화 항체 반응은 동물 혈청에서 YF/WN 또는 /JE LAVs, 또는 YF 17D 바이러스에 대한 표준 PRNT50에 의해 결정되었다. PIV-WN은 20 일 및 34 일째의 면역화 동물로부터의 혈청 풀에서 결정된 PRNT50 역가에 의해 증명된 것처럼, 모든 그룹에서 부스트로 또는 부스트 없이 매우 높은 WN-특이적 중화 항체 반응을 유도하는데, 이는 YF/WN LAV 대조 그룹과 비슷하였다. 따라서, PIV-WN 및 YF/WN LAV 양자에 면역화 된 동물은, wt WN 바이러스에 의한 35일째 치사적 챌린지(IP, 270 LD50)로부터 보호되었으나, 허위로-면역화한 동물에서는 그러하지 않았다(표 3). WN 중화 항체가 개별 마우스의 혈청에서 측정되었을 때, 일정하게 높은 면역 반응이 관찰되었다(도 4). 따라서 단일-라운드 PIV 백신은 대응하는 LAVs만큼 면역원성 및 효능성이 있을 수 있다. PIV-JE 또한 높은 면역원성을 나타내었으나(흑색 마우스), PIV-YF의 면역원성은 YF 17D 대조군(ICR 마우스)과 비교하여 상당히 낮았다. 그러나, PIV-YF 면역화 동물의 투여량-의존적 보호(허위-면역화 동물의 경우에는 그러하지 않음)가, wt YF 스트레인 아시비(Asibi) 바이러스(500 LD50)에 의한 심각한 치사적 IC 첼린지 후에 관찰되었고(표 3), 이는 1:10 정도의 중화 항체 역가가 플라비바이러스 감염에 보호성이 있다는 기술적 상식과 일치하는 것이다.
상기 YF 17D 대조군 바이러스는 높은 면역원성을 나타냈고(예컨대, PRNT50 역가 1:1, 280 34일째), 따라서 인 비보에서 세포를 감염시킬 수 있고, 효율적으로 복제할 수 있으며 이들의 엔벨럽은 강력한 면역원이다. 그럼으로, PIV-YF의 낮은 면역원성은, 세포 감염 불능 또는 인 비보 감염 세포에서으 효율적 복제 불능으로부터 기인하지 않을 것으로 판단된다. 본 발명자들은 낮은 PIV-YF의 면역원성(예컨대, PIV-WN와 비교하여)은 PIV-YF 감염 세포에서 YF-특이적 VLPs의 생산이 낮은 레벨로 이루어 졌음에 기인한다고 보았다(반면에, VLP 분비는 PIV-WN 감염 세포에서 높은 레벨로 나타남). 상기에서 논의한 것과 같이, 본 발명자들은 PIV-YF의 면역원성을 상당히 증가시킬 수 있음을 제안하는 바, 예컨대, C/prM 정크션에서의 적절한 변형에 의해, 예컨대, 상기 정크션에서 일어나는 상기 두 프로테아제 절단의 언커플링에 의해(바이러스 프로테아제 및 시그날라제 절단), 및/또는 상기 prM의 YF 시그널을 대신하여 강력한 이종 시그널[예컨대, 광견병 바이러스 G 단백질 시그널, 또는 진핵 조직 플라스미노겐 촉진자(tPA) 시그널(Malin et al., Microbes 및 Infection, 2:1677-1685, 2000), etc.]의 사용에 의해 증가시킬 수 있다.
유사한 실험이 4.5 주령 시리안 햄스터에서 수행되어 이러한 모델에서 PIV 구조체의 면역원성을 LAVs 대조군과 비교하였다. 동물은 테스트 물건의 단계적 투여량으로 SC 면역화 하였다(표 4). PIV-WN은 예컨대, 5, 6, 및 6(prime)+5(boost) log10 FFU를 받은 그룹에서 38일째 WN-특이적 PRNT50 역가(pre-challenge)가 1:320, 1:640, 및 1:1280에서 높은 면역원성을 나타냈다. 이는 YF/WN LAV 4 log10 PFU 대조군(≥ 1:2560)과 비교할 경우 다소 낮다. PIV-JE 및 PIV-YF는 비록 YF/JE LAV 및 YF 17D 대조구와 비교하여 낮은 역가임에도 불구하고, 탐지 가능한 특이적 중화 항체 반응을 유도한다. PIV-WN 및 YF/WN에 면역화한 모든 동물은 wt WN 바이러스의 치명적 도전으로부터 강력한 보호를 받았는데, 이는 추후 WN 바이러스 혈증의 부재 또는 중대한 감소 뿐만 아니라, 사망 및 병적상태(예컨대, 챌린지 후 체중 감소)의 부재에 의해 증명되었다. 허위-면역 동물은 보호되지 않았다(표 4). PIV-JE 및 PIV-WN은 투여량-의존적 방법에서 각각의 도전으로부터 동물을 보호하였다. 본 실험에서 보호 효능은 추가적으로 도 5에서 추가적으로 설명하였다. 예컨대, 높은 추후-도전 YF 바이러스(햄스터 적용 아시비 스트레인) 혈증이 허위로 면역된 동물에서 관찰되었다. 3 일째 역가 >8 log10 PFU/ml(좌상 패널)에서 최고조에 달함; 모든 동물은 체중이 줄었고, 4마리 중 1마리는 사망했다(우상 패널). 대조적으로, 바이러스 혈증은 PIV-YF(2 투여량; 상대적으로 낮은 중화 역가에 불구) 또는 YF 17D에 면역화된 햄스터에서 상당히 감소하거나 또는 없어졌다; 체중이 감소한 경우는 없었다. 유사하게, PIV-WN 또는 YF/WN LAV에 면역된 동물은 대조군과 비교하여(하기 패널과 비교) 추후-도전 WN 바이러스 혈증 및 체중 감소/사망률의 면에서 상당하게 또는 완전히 보호되었다. 이와 같이, PIV의 높은 면역원성/효능은 두 번째 동물 모델에서 설명하였다.
다른 햄스터 실험에서, 동물들을 IP 경로를 통해 2 투여량으로 PIV 구조체로 면역화 하였다. 표 5는 상기 실험(SC 접종)에서 햄스터의 혈청 풀에서 결정된 중화 면역반응(각각의 백신에 특이적인)과 IP 면역화 후의 중화 면역반응을 비교한 것으로서, 첫 번째 투여(20-21일째) 및 두 번째 투여(34-38일째) 후 PIV-WN, - YF/WN, WN/JE, 및 YF에 대한 실험 결과이다. 면역화 경로의 명백한 영향이 첫 번째 및 두 번째 투여 후 양자 모두에서 관찰되었다. 예컨대, 첫 번째 투여 후 PIV-WN의 경우, SC 면역화는 WN-특이적 PRNT50 역가 1:40를 초래한 반면, IP 접종은 보다 높은 역가 1:320 (및 두 번째 투여 후, 역가는 유사함)를 초래하였는다. 보다 명백한 효과가 첫 번째 및 두 번째 투여 후 다른 구조체의 경우에 관찰되었다. 흥미롭게도, PIV-YF/WN는 IP 경로에서 매우 높은 면역원성을 나타냈다(첫 번째 IP 투여 후 역가 1:320 vs. SC의 경우 1:20, 및 두 번째 투여 후 1:1,280 vs. SC의 경우 1:160). 유사하게, PIV-JE의 면역원성은 상당히 증가하였다(예컨대, 두 번의 IP 투여 후 1:640의 JE-특이적 역가). 따라서 림프 세포 특히 항원-제시 세포(피부 하 조직의 반대쪽에 있는 앱도멘에 풍부하게 존재함)의 향상된 표적화는, PIV 백신 사용을 위한 중요 고려사항이다. 인간에서, 면역 반응의 세기를 증가시키는, 피부 수지상 세포의 효율적인 표적화는 피내 운반에 의해 달성될 수 있으며, 이는 본 발명자들이 인간의 PIV 면역화를 위한 경로로 제한한다.
상기 실험에서, 본 발명자들은 또한 중화항체 반응이 패키징 엔벨럽에 대해 유도되는지 여부에 대해서 결정할 수 있었다(PIV 구조체로 암호화되고, 감염세포에서 분비되는 VLPs에 반응하는 것과 반대). WN-특이적 중화 항체는 ΔC-prM-E 결손 및 이와 같이, VLPs는 암호화하지 않으나, BHK-CprME(WN) 헬퍼 세포에서 WN 엔벨럽으로 패키징되는 것은 포함하고, YF 엔벨럽에서 패키징된 YF d-PIV의 두 번째 성분의 4 log10 FFU로 면역화된 동물로부터의 혈청에서 YF-특이적 중화 활동은 관찰되지 않는 WN d-PIV의 두 번째 성분의 5 log10 FFU로 면역화된 동물에서 PRNT50에 의해 탐지될 수 있었다. YF-특이적 중화 반응이 YF 엔벨럽으로 패키징된 PIV-YF/WN의 두 투여량에 의해 유도될 수 없었고, WN-특이적 반응은 WN 엔벨럽으로 패키징된 PIV-JE의 두 투여량에 의해 유도될 수 없었다. 상기 패키징 엔벨럽에 대항하는 중화 반응의 부재는 일반적인 헬퍼 세포주의 제조에서 다른 PIV 백신 제조, 또는 본 발명에 따라, 같은 벡터에 기초한 다른 재조합 백신으로 한 사람의 면역화를 허용 하였다.
PIV 칵테일
PIVs은 인 비보에서 일회(선택적으로 여러 번, 그러나 제한적으로) 복제를 하기 때문에, 본 발명자들은 상이한 PIV 백신들의 혼합물에서, 혼합물(칵테일)에 있는 각각의 구조체 사이의 간섭 없이 투여될 수 있을 것이라 판단하였다. PIV 백신이 칵테일 제제에서 사용될 수 있는지를 자세히 설명하기 위해서, 마우스 및 햄스터에서 혼합물로 주어진 몇몇 PIV 구조체의 면역 반응은 각각 주어진 같은 구조체와 비교하였다. 유사한 결과를 양 동물 모델에서 얻었다. 마우스 실험의 결과는 표 6에서 보여줬다. 유사한 항-JE 중화 항체 역가를 PIV-JE + PIV-WN 혼합물 또는 PIV-JE 단독 중 하나의 하나 또는 둘의 투여량이 주어진 동물 혈청의 풀에서 관찰하였다(1:20 vs. 1:80 및 1:640 vs. 1:160, for one 및 2 투여량, 각각). 유사하게, PIV-JE + PIV-WN 혼합물 및 PIV-WN 단독에 대항하는 WN-특이적 역가는 유사하다(1:320 vs. 1:640 및 1:5,120 vs. 1:5,120 for 1 및 2 투여량, 각각). 없거나 또는 적은 교차-특이적 반응을 PIV-JE 또는 -WN 둘 중 하나에 의해 유도하였다. 상기 결과를 또한 각각 동물의 혈청에서 PRNT50 역가를 측정하는 것에 의해서 확인하였다. 이와 같이, PIV 백신은 둘 또는 그 이상의 플라비바이러스 병원체에 대항하는 면역원성을 유도하는 칵테일로 효율적으로 주입될 수 있음은 명백하다. 또한, 상술한 바와 같이, 다양한 칵테일들을 비-플라비바이러스 PIV 백신들을 이용하거나 또는 플라비바이러스 PIV 백신과 비-플라비바이러스 PIV 백신을 이용하여 제조할 수 있다.
인 비트로 연구
다른 초기형 PIV는 s-PIVs을 위한 헬퍼 BHK 세포 또는 d-PIVs을 위한 통상적인 베로 세포에서 10 번까지 순차적으로 계대하였다. 각각 계대 이후 수득된 샘플을 면역염색에 의해 베로 세포에서 적정하였다. 구조체는 높은 역가까지 자라고, 전체 바이러스를 복원하는 재조합은 관찰되지 않았다. 예컨대, PIV-WN은 BHK-CprME(WN) 헬퍼 세포(WN 바이러스 C-prM-E 단백질을 발현하는 VEE 리플리콘을 포함)에서 역가 7-8 log10 FFU/ml까지 지속적으로 자랐고, WN d-PIV는 베로 세포에서, 재조합 없이 역가 8 log10 FFU/ml를 초과할 때까지 자랐다.
실시예 2. PIV - TBE
PIV-TBE 백신 후보군은 wt TBE 바이러스 또는 혈청학적으로 가깝게 관련된 란가트(LGT) 바이러스(자연 약독화 바이러스, 예컨대, wt strain TP-21 또는 이들의 실험상 변이체, 스트레인 E5)로부터 전체로서 기초하거나 또는 WN 바이러스, 및 TBE, LGT, 또는 상기 TBE 혈청복합체로부터 다른 혈청학적 관련 플라비바이러스로부터 상기 prM-E 엔벨럽 단백질 유전자와 같은 YF 17D 또는 다른 플라비바이러스로부터의 중추(캡시드 및 비-구조 서열)를 포함하고 있는 키메라 서열에 근거하여 제조될 수 있었다. YF/TBE LAV 후보군은 TBE 또는 관련 바이러스로부터 YF 17D 및 상기 prM-E 유전자로부터 중추에 기초하여 구축될 수 있었다.
PIV-TBE 및 YF/TBE LAV 백신 초기형의 구축은 PIV-WN(Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008)을 위한 적절한 유전 요소의 풀라스미드로의 클로닝에 의하거나, 또는 키메라 LAVs(예컨대, pBSA-AR1, YF/JE LAV의 감염성 클론의 단일-플라스미드 버전; WO 2008/036146)를 위한 플라스미드에 기초하여 역유전 분야의 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 상기 TBE 바이러스 스트레인 Hypr(GenBank 접근번호 U39292)의 prM-E 서열 및 LGT 스트레인 E5(진뱅크 접근번호 AF253420)는 첫째 인간 지놈에서 우선적 코돈 사용에 일치하기 위해서 및 8 nt보다 긴 반복 서열을 제거하여 삽입체(만일 필수적인 것으로 결정된다면, 반복된 nt 서열의 추가적 단축이 실시될 수 있음)의 높은 유전적 안정성을 보증하기 위해서 컴퓨터 코돈-최적화를 하였다. 상기 유전자들을 화학적으로 합성하고 대응되는 prM-E 유전자를 대체하여 플라스미드에서 클로닝 하여 PIV-WN 및 YF/JE LAV를 제조하였다. 결과적으로 제조된 플라스미트를 인 비트로 전사시키고 RNA 전사체로 적합한 세포(키메릭 바이러스의 경우 Vero, 및 PIV의 경우 헬퍼 BHK 세포)을 형질전환시켜 바이러스/PIV 시료를 생성시켰다.
YF/TBE LAV 구조체
상기 TBE Hypr(plasmids p42, p45, 및 p59) 또는 LGT E5(plasmid P43) prM-E 유전자 중 하나를 포함하고 있는 YF/TBE 구조체에서, 상기 C/prM 연결의 두 가지 다른 유형을 첫 번째로 조사하였다(도 6 참조, C/prM 정크션은 오직 서열 목록 1에서만 관찰되고, NS1 부위의 상기 5’UTR-C-prM-E-시작를 커버하는 완전한 5’-말단 서열은 서열 목록 2에서 관찰된다). 상기 p45-유래 YF17D/Hypr 키메라가 prM을 위한 혼합 YF17D/WN 시그널 펩타이드를 포함하고 있음에 반해서, 상기 p42-유래 YF17D/Hypr 키메라는 상기 prM 단백질을 위한 혼합 YF17D/Hypr 시그널 펩타이드를 포함하였다. 상기 이전 키메라 바이러스는 상기 이후 바이러스와 비교하여 0.5 log10배 높은 P0(트랜스펙션 후 즉시) 및 P1(베로 세포에서 다음 계대) 모두에서 7.9 log10 PFU/ml까지 매우 높은 역가를 나타나게 만들었다; 추가적으로 이는 베로 세포에서 상당히 넓은 플라그를 형성하였다(도 6). 이와 같이, prM을 위한 상기 시그널 펩타이드에서 TBE-특이적 잔기의 사용은 WN-특이적 잔기를 포함하고 있는 상기 시그널을 초과하는 중대한 성장 이점을 주었다. 상기 p43-유래 YF17D/LGT 키메라는 p52-유래 바이러스와 같은 prM 시그널을 보유하였다; 이 또한 P0 및 P1 흐름에서 매우 높은 역가(8.1 log10 PFU/ml 까지)를 나타내었고, 넓은 플라그를 형성하였다. p42-유래 바이러스의 파생물은 또한 이전 YF/WN LAV 백신 바이러스의 컨텍스트에서 특정하였던 구체적으로 YF17D-특이적 C 단백질에서 3-a.a. 결손과 같은(PSR, α-헬릭스 I의 시작에서 40-42 잔기; WO 2006/116182) 강력한 약독화 변이를 포함하는 플라스미드 p59로부터 만들어졌다. 기대했던 대로, 상기 모 p42-유래 키메라와 비교하여, 상기 p59 바이러스는 낮은 역가까지(5.6 및 6.5 log10 PFU/ml at P0 및 P1, 각각) 자랐고, 작은 플라그를 형성하였다(분리된 적정 실험에서 결정 및 그림 6 참조). 이러한 초기형 YF/TBE LAV의 성장 정도의 최초 관찰, 및 인 비트로에서 복제와 플라그 형성의 상관관계는 성장 곡선 시험에서 확인하였다(그림 8).
PIV-TBE 구조체
PIV-WN/TBE 변이체를 구축하였고, 패키징된 PIV 샘플은 플라스미드 p39 및 p40에서 유래하였다(그림 7 C/prM 정그션 서열을 나타낸 서열 목록 1 및 NS1 서열의 완전한 5’UTR-ΔC-prM-E-시작을 나타낸 서열 목록 3). 이는 완전한 Hypr 또는 WN prM 시그널을 각각 보유하였다. 양 PIVs 모두는 BHK-CprME(WN) 또는 BHK-C(WN) 헬퍼 세포(Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008)에서 성공적으로 회복하였고, 배양하였다. 상기 p39 변이체의 상기 P0 및 P1 샘플 역가는 p40 변이체와 비교하여 0.2 1.0 log10배 높았다. 추가적으로, p39 변이체로 감염된 베로 세포는 p40과 비교하여 폴리클로날 TBE-특이적 항체를 사용한 면역형광 어쎄이에서 밝게 염색되었는데, 이는 보다 효율적인 복제를 암시하였다(도 7). p40 후보군보다 높은 p39 후보군의 복제 비율은 성장 곡선 실험에서 확인하였다(도 8). 후기 실험에서, 양 후보군 모두 BHK-CprME(WN)과 비교하여, 5일째에 p39 변이체는 ~ 7 log10 PFU/ml 역가까지 도달하여 BHK-C(WN) 헬퍼 세포에서 보다 잘 자라는 것으로 나타났다(최고 역가에 도달하지 않음에 주의). 양 PIV 및 키메라 LAV 백신 후본군 모두의 복제 비율에 prM 시그널이 미치는 영향의 발견 및 가장 효율적인 복제 및 면역원성 구조체를 산출하는 다른 시그널들의 직접 비교의 비교는 우리의 업적의 구분되는 특징이었다. 상술한 바와 같이, 본 발명은 적합한 변이를 가지는 다른 플라비바이러스 시그널을 이용하는 것, C/prM 정크션에서 바이러스 프로테아제 및 스그널라제의 절단의 언커플링 예컨대 prM 시그널에 선행하는 C의 C-말단에서 바이러스 프로테아제 절단 위치의 변이 또는 결손, prM 시그널을 대신하여 강력한 비-플라비바이러스 시그널(예컨대, tPA 시그널 등)의 사용, 그리고 스그널라제의 절단 위치로부터 다운스트림에 있는 서열의 최적화를 포함한다.
본 발명은 또한 wt TBE(Hypr strain) 및 LGT 바이러스(TP21 야생형 스트레인 또는 약독화 E5 스트레인), 및 키메라 YF 17D 틀/prM-E(TBE 또는 LGT)서열에 완전히 기초한 다른 PIV-TBE 변이체를 포함하였다. 적절한 C, C-prM-E 등 상호-보충을 위한 단백질(예컨대, TBE-특이적)을 공급하는 헬퍼 세포는 안정적 DNA 트랜스펙선 또는 예컨대 VEE 스트레인 TC-83에 기초한 알파바이러스 리플리콘 같은 적절한 벡터를 리플리콘에서 리플리콘-포함 세포의 항생제 내성 선택과 함께 사용을 통해서 구축할 수 있었다. 베로 및 BHK21 세포는 본 발명의 연습에서 사용될 수 있다. 상기 전자는 인간 백신 제품의 승인된 기질이다; 다른 세포주도 인간 및/또는 가축 백신 제품에 역시 사용될 수 있었다. s-PIV 구조체에 추가하여, d-PIV 구조체도 제조될 수 있었다. 백신 및 환경을 위한 안전을 추가적으로 확인하기 위하여, 이론적으로 살아 있는 바이러스를 초래할 수 있는 재조합 기회를 최소화하기 위한 코돈 변성 및 5’및 3’CS 요소에서 상보적 변이의 사용을 포함하는 적절한 변형이 이용될 수 있었다. 구축에 뒤따라, 모든 백신 후보군은 인 비트로에서 제조성/안정성 및 인 비트로에서 약독화 및 면역원성/효능성을 TBE 및 YF 백신의 개발 및 품질 조절에 이용되는 허용가능한 임상전 동물 모델에서 평가할 수 있다.
PIV-TBE 및 YF/TBE LAV 구조체의 마우스에서 신경독성 및 신경침투
젊은 성체 마우스(~ 3.5 week-old)가 IC 경로로 신경독성을 측정하거나, 또는 IP 경로로 신경침투를 확인하기 위해서 PIV-TBE 및 YF/TBE LAV 후보군의 단계적 투여량으로 접종되었다. 양 루트를 통해서 PIV-Hypr(p39 및 p40) 변이체의 5 log10FFU를 받은 동물은 허위-접종된 동물과 유사하게(표 7) 생존하였고, 병적 증세를 보이지 않았는데, 이와 같이 PIV-TBE 백신은 완전히 무독성이었다. IP 접종된(5 log10PFU) 모든 동물은 살아있었음에 반해, YF 17D 대조군(1 3 log10 PFU)으로 IC 접종된 마우스는 투여량-의존적 사망률을 나타냈는데, 이는 YF 17D 바이러스는 신경침투성이 아니라는 지식과 일치한다. YF/TBE LAV 초기형 p42, p45, p43, 및 p59의 단계적 IC 투여량(24 log10 PFU)을 받은 모든 동물은 죽었다(빈사 상태의 동물은 인도적으로 안락사함). 이러한 변이체는 예컨대, YF/TBE LAV 후보군 실험을 위한 최소 투여량인 2 log10 PFU 투여량에서 완전한 사망률 및 짧은 AST에 의해 증명되는 것 처럼 YF 17D보다 덜 약독화 된 것으로 나타났다. 상기 PIV-TBE의 비-신경독성 표현형, YF/TVE LAV의 독성 표현형 및 YF 17D의 중간-독성 표현형은 IC 접종 후 마우스의 생존 곡선을 보여주는 도 9에서 또한 설명하고 있다.
상응하는 투여량에서 넓은 AST 값에 의해 증명되는(표 7) 상기 p43(LGT prM-E 유전자) 및 p59(상기 dC2 결손 변이체)는 p42 및 p45 YF/Hypr LAV 구조체에 비해 덜한 신경독성을 나타내는 것은 주목해야 한다. 추가적으로 IP 접종(5 log10 PFU/투여량) 후 p42 및 p45는 부분적 사망률을 나타냄에 반해, p43 및 p59 후보군은 비-신경침투성이었다(표 7; 도 10). 그러나 모든 YF/TBE LAV 구조체는 예컨대, 매우 낮은 IC(LD50 ~ 0.1 PFU) 및 IP(LD50 ≤ 10 PFU) 투여량 모두 마우스에서 균일하게 높은 독성을 나타내는 wt TBE Hypr 바이러스와 같이 wt TBE 바이러스와 비교하여 상당히 약독화 된 점에 주목해야 한다(Wallner et al., J. Gen. Virol. 77:1035-1042, 1996; Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998; Mandl et al., J. Gen. Virol. 78:1049-1057, 1997).
마우스에서 PIV-TBE 및 YF/TBE LAV 구조체의 면역원성/효능성
상기에서 언급한 상기 PIV-TBE 또는 YF/TBE LAV 변이체의 1 또는 2 투여량으로 IP 면역된 마우스에서 TBE-특이적 중화 항체 반응, 또는 인간 포르말린-불활화 TBE 백신 대조군(인간 투여량의 1:30)을 측정하였다. 동물들은 wt Hypr TBE 바이러스의 높은 IP 투여량(500 PFU)으로 챌린지하였다; 챌린지 후 질병률(예컨대, 체중 감량) 및 사명률을 측정하였다.
마우스에서 PIV-TBE 및 YF/TBE LAV 구조체의 면역원성/효능성
상기에서 언급한 상기 PIV-TBE 또는 YF/TBE LAV 변이체의 1 또는 2 투여량으로 IP 면역된 마우스에서 TBE-특이적 중화 항체 반응 또는 인간 포르말린-불활화 TBE 백신 대조군(인간 투여량의 1:20 ; 1 또는 2 투여량), 또는 YF 17D 및 허위 대조군은 20일째 wt TBE Hypr 바이러스에 대하여 PRNT50로 측정하였다. [역가는 각자 혈청에서, 또는 대부분의 경우 2 동물로부터 혈청 풀에서, 또는 YF 17D 및 허위 소극 대조군을 위한 4 동물로부터 혈청 풀에서 결정하였다.] 각 그룹을 위한 GMTs뿐만 아니라 각각의 테스트 표본에서 역가는 표 8에서 제공하였다. 테스트 샘플에서 역가는 예컨대, PIVs으로 면역된 그룹에서, 동물에서 면역 반응의 높은 균일성을 나타내는 것과 같이 각각 그룹의 범위에서는 유사하였다. 예상대로, TBE-특이적 중화 항체는 소극적 대조 그룹에서 탐지되지 않았다(YF 17D 및 Mock; GMTs < 1:10); 따라서, 상기 그룹의 동물은 wt Hypr TBE 바이러스의 높은 IP 투여량의 면역화 이후 21일째에 챌린지으로부터 보호되지 않았다. 부분 관찰로부터 사망률(후기-챌린지 9 일째; 관찰은 계속됨)은 표 8에서 제공하였고, 챌린지 이후 질병률의 지표인 평균 체중의 변동은 도 11에서 나타냈다. 2 투여량(GMT 1:1,496) 이후 특별하게 높은 중화 항체는 사백신 대조군에서 탐지되었다; 2-투여량 그룹의 동물은 완전히 보호되어서 사망률 또는 체중 감소는 존재하지 않았다(그러나 1-투여량 그룹에서는 나타나지 않음). PIV-Hypr p39의 1 및 2 투여량 모두 받은 동물들은 매우 높은 항체 역가를 가졌고(GMTs 1:665 및 1:10,584), 강력히 보호되었는데, 강력한 보호 면역원성은 s-PIV-TBE 결손 백신에 의해서 유도될 수 있다. YF/Hypr p42 키메라(표 7)로 면역되어 살아남은 상기 두 가지 동물들 또한 높은 항체 역가(GMT 1:6,085)를 가졌고, 보호되었다(표 8; 도 11). 흥미롭게도, PIV-Hypr p40 및 YF/Hypr p45는 면역원성이 낮다(각각, 1 및 2 투여량, 및 1:68에서 GMTs 1:15 및 1:153). 상기에서 언급된 것과 같이, 높게 면역화 된 TBE-특이적 시그널 서열을 포함하고 있는 PIV-Hypr p39 및 YF/Hypr p42 구조체에 반해 이들은 시그널에 prM을 위한 WN-특이적 서열을 보유하였다. 상기 논의와 일치하게, 이러한 결과는 본 실험의 인 비보에서 현저하게 다른 면역 반응을 초래하는 높은-수준 복제/VLP 분비를 위해서 예컨대, 상기 TBE-특이적 시그널와 같이 올바른 prM 시그널 선택의 중요성을 설명하였다. YF/LGT p43 및 YF/Hypr dC2 p59 키메라의 면역원성은 비교적 낮은데, 이는 이종 엔벨럽(LGT, TBE 바이러스 챌린지와는 구별됨)의 사용 및 dC2 결손의 높은 약독화 효과 각각 때문에 예견된 것이었다.
실시예 3. 외래 유전자 발현
하기에서 언급하고 있는 재조합 PIV 구조체의 예시에서, 관심 있는 유전자는 코돈 최적화(예컨대, 백신접종의 타겟 숙주에서 효율적으로 발현을 위해) 및 삽입체의 안정성(≥ 8 nt long; 필요하다면 반복된 부분의 단축이 실시될 수 있음)을 높이기 위해 반복되는 nt 서열의 제거 후 화학적으로 합성하였다. 상기 유전자는 분자생물학 분야에서 주지된 표준 방법을 사용하여 PIV-WN 벡터 플라스미드로 클론하고, 패키징된 PIVs은 뒤따르는 인 비트로 전사 및 적절한 헬퍼(for s-PIVs) 또는 보통 세포(for d-PIVs)에의 트랜스펙션에 의해 회복하였다.
WN s-PIV 및 d-PIV에서 광견병 바이러스 G 단백질의 발현
랍도바이러스과 광견병 바이러스는 중요한 인간 및 가축 병원체이다. 몇몇의 백신(사백신)이 사용 가능함에도 불구하고, 개선된 백신이 여전이 인간 및 구축 사용에 모두 필요하다(예컨대, 저가 노출전 예방 백신). 광견병 바이러스 당단백 G는 바이러스의 세포내로의 출입을 담당하고, 이는 주요 면역원이다. 가축 백신을 개발하려는 목적으로 이는 다른 벡터에서 발현하였다(예컨대, Pastoret 및 Brochier, Epidemio. Infect. 116:235-240, 1996 Li et al., Virology 356:147-154, 2006).
전체 길이 광견병 바이러스 G 단백질(오리지날 파스퇴르 바이러스 분리, 진뱅크 접근번호 NC_001542)은 코돈-최적화하였고, 화학적 합성을 하였으며, 및 PIV-WN 벡터에서 ΔC, ΔprM-E 및 ΔC-prM-E 인접한 곳에 삽입하였다(도 12). 상기 구조체의 서열은 서열 목록 4에서 제공하였다. 상기 구조체의 일반적인 디자인은 도 13에서 나타냈다. 자체 시그널 펩타이드를 포함하는 상기 전체 G 단백질은 ΔC 결손(ΔC 및 ΔC-prM-E 컨스트릭트)과 함께 또는 그렇지 않게(prM-E) WN C 단백질로부터 하부 틀 및 상기 prM 시그널로부터 소수의 잔기에 삽입하였다. 수족구병 바이러스(FMDV) 2A 오토프로테아제는 번역 중 바이러스 폴리프로팀으로부터 G의 C-말단의 절단을 제공하기 위해서, G의 막통과 C-말단 앵커로부터 하부에 위치하였다. 상기 FMDV 2A 요소는 ΔC 구조체에서 prM 및 prM-E-NS1-5 유전자를 위한 WN-특이적 시그널 또는 ΔprM-E 및 ΔC-prM-E 구조체에서 NS1 및 NS1-5 유전자를 위한 시그널에 뒤따랐다.
패키징된 WN(ΔC)-광견병 G, WN(ΔprME)-광견병 G, 및 WN(ΔCprME)-광견병 G PIVs는 PIV 벡터 결손과 상보적인 헬퍼 BHK 세포의 트랜스펙션에 의해 생산하였다[상호 보충을 위한 WN 바이러스 구조물 단백질 발현하는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(스트레인 TC-83)를 포함하는]. 광견병 G 단백질의 효율적인 복제 및 발현은 BHK 세포 뿐만 아니라 BHK-C(WN) 및/또는 BHK-C-prM-E(WN) 헬퍼 세포의 트랜스펙션/감염 및 항-광견병 G 모노클로날 항체(RabG-Mab)를 사용한 면역 염색 및 면역 형광 어쎄이(IFA)(도 14)에 의한 3 구조체에서 설명하였다. 역가는 Mab 또는 항-WN 바이러스 폴리클로날 항체로 면역 염색에 의해 베로 세포에서 결정하였다. 인 비트로 RNA 전사로 트랜스펙션 이후 BHK-CprME(WN) 세포에서 상기 구조체의 성장 곡선은 하기 도 14에서 나타냈다.
중요하게, 거의 동일한 역가를 상기 삽입체의 유전적 안정성의 최초 증거인 RabG-Mab 및 WN-항체 염색에 의해 발견하였다. 변형되었으나, 투과성이 없는 PIV-감염 베로 세포에서, 강한 막 염색을 RabG-Mab에 의해 발견한 것은 생산물이 효율적으로 세포 표면으로 운반된 것을 설명하였다(도 15)). 후자는 발현된 G의 높은 면역원성을 위한 중요 전제 조건으로 알려졌다. 각각의 패키징된 PIVs은 헬퍼 BHK 세포의 감염에 뒤따라 확산될 수 있었으나, 도 16에서 WN(ΔC)-광견명 G PIV가 보여주는 것과 같이 보통 세포에서는 확산될 수 없었다. 원시 BHK 세포에서 확산이 없는 사실은 만약 PIV 감염 세포에 의해 생산된다면, 재조합 RNA 지놈은 G 단백질을 포함하는 막 포낭으로 비-특이적으로 패키징될 수 없다는 것을 설명하였다. VSV G 단백질(Rolls et al., Cell 79:497- 506, 1994)을 발현하는 샘리키 산림 바이러스(SFV) 리플리콘의 비특이적 패키징의 이전 관찰과는 대조적으로, 동일한 결과를 다른 랍도바이러스인 소낭성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질에서 얻었다. 상기 후자는 소망하는 안전성 특징을 보유하고 있다. [택일적으로, 일부 비-특이적 패키징은 인 비보에서 PIV의 제한된 확산을 초래하며, 이는 항-광견병 면역 반응을 증가시킨다. 상기 PIV가 안전하다는 것이 입증된 것을 고려하면, 상기 후자는 또한 유익한 특징을 갖는다고 할 수 있다]. 3 PIVs에서 광견병 G 삽입체의 안정성은 높거나 또는 낮은 MOI(0.1 또는 0.001 FFU/cell)에서 헬퍼 BHK-CprME(WN) 세포에서 연속 계대에 의해 설명하였다. 각각의 계대에서, 세포 상층액을 총 PIV 역가를 결정하기 위해서 항-WN 폴리클로날 항체, 또는 G 유전자를 포함하는 입자의 역가를 결정하기 위해서 항-광견병 G 모노클로날 항체로 면역 염색을 이용하여 통상 세포(예컨대, 베로 세포)에서 수확하고, 여과하였다(MOI 0.1의 설명은 도 17; MOI 0.001에서 유사한 결과를 얻음). 6 계대에서 삽입체-포함 PIV의 삽입체 안정성을 지표하는 역가가 감소하기 시작했음에 반해, 상기 WN(ΔC)-광견병 G PIV는 5 계대 동안 안정적이었다. 이는 예상될 수 있는데, 왜냐하면 이러한 구조체에서, 대형 G 유전자 삽입체(~ 1500 nt)는 작은 ΔC 결손(~ 200 nt)과 결합하여, 재조합 RNA 유전자의 전체 크기를 증가시키기 때문이다. 대조적으로, WN(ΔprME)-광견병 G, 및 WN(ΔCprME)-광견병 G PIVs에서, 상기 삽입체는 보다 큰 결손과 결합한다(~ 2000 nt). 그러므로, 이러한 구조체는 모든 10 계대 챌린지동안 상기 삽입체를 안정적으로 유지하였다(도 17)). 게다가, 일부 계대에서 8 log10 FFU/ml 역가이거나 또는 이보다 높은 모든 세 가지 PIVs를 위해 획득한 것을 도 17에서 볼 수 있었고, 추가적으로 PIVs은 높은 수율로 쉽게 배양된다는 것을 설명하였다.
인 비보에서 각각 접종이 뒤따르는데, 상기 WN(ΔC)-광견병 G s-PIV는 T-세포 반응 뿐만 아니라, 광견병 및 WN 바이러스에 대한 강력한 중화 항체 면역 반응을 유도할 것으로 기대되었다. 상기 WN(ΔprME)-광견병 G 및 WN(ΔCprME)-광견병 G PIVs은 오직 광견병에 대한 체액 면역 반응을 유도할 것인데, 왜냐하면 이들은 WN prM-E를 암호화하지 않기 때문이었다. WN(ΔC)-광견병 G s-PIV 구조체는 d-PIV 제제에서 WN(ΔprME)-광견병 G와 함께 또한 접종될 수 있으며(도 12), 이는 발현된 G 단백질의 투여량을 증가시키며, 제한적 확산에 의하여 두 병원체에 대한 개선된 면역을 나타내도록 한다. 확산의 예시에서, s-PIV 샘플, WN(ΔprME)-광견병 G, 및 d-PIV 샘플, WN(ΔprME)-광견병 G + WN(ΔC) PIV (후자는 광견병 G 단백질을 암호화하지 않음)의 베로에서 여과 결과는 도 18에서 나타냈다. s-PIV로 원시 베로 세포의 감염은 RabG-Mab에서 오직 개개의 세포만 염색할 수 있었다(또는 세포 분할에 의한 작은 클러스터). 대조적으로, 뒤따르는 두 가지 PIV 타입에 감염된 생산물인 d-PIV 샘플(도 18, 우측 패널)에 의한 감염에서 넓은 포커스가 관찰되었다.
만약 C-prM-E를 인 트랜스 방식으로 공급하는 헬퍼 지놈과 함께 접종된다면, 상기 WN(ΔCprME)-광견병 G 구조체는 d-PIV 제제에서 또한 사용될 수 있다(도 12). 예컨대, 이는 상호-보충적인 것으로 알려진 예컨대, NS1,NS3, 또는 NS5와 같은 NS 단백질 중 하나를 견손한 WN 바이러스 지놈일 수 있다(Khromykh et al., J. Virol. 73:10272-10280, 1999; Khromykh et al., J. Virol. 74:3253-3263, 2000). 본 발명자들은 WN-ΔNS1 지놈(서열목록 4에서 제공하는 서열)을 구축하였고, WN(ΔprME)-광견병 G 또는 WN(ΔCprME)-광견병 G에 상호-감염 및 인 비트로에서 확산의 증거를 면역염색을 통해 획득하였다. 이러한 d-PIVs의 경우, 광견병 G 단백질은 또한 항-광견병 면역 반응의 증가를 초래하는 발현된 광견병 G 단백질의 양을 증가시키기 위해서 예컨대, WN-ΔNS1 지놈과 같은 헬퍼 지놈에 삽입되고, 발현될 수 있었다. 어떤 dPIV 버전과 함께, 하나의 면역원은 하나의 병원체(예컨대, 광견병 G)에서 다른 것은 두 번째 병원체에서 유래할 수 있어, 백신의 3 중 항원 특이성을 초래할 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 다른 예시에서, NS1 결손은 NS3 및/또는 NS5 결손/변이를 대체하거나 이들과 함께 사용할 수 있었다.
WN s-PIV 및 d-PIV에서 RSV F 단백질의 발현
파라믹소비리다에과에 속하는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 전 세게 유아의 심각한 기관지 질병을 유발하는 주요 원인이다(Collins 및 Crowe, 호흡기 세포융합 바이러스 및 Metapneumovirus, In: Knipe et al. Eds., Fields Virology, 5th ed., Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams 및 Wilkins, 2007:1601-1646). 상기 바이러스의 융합 단백질 F는 안전한 발달 및 효과적인 백신을 위한 주요 바이러스 항원이다. 이전에 관찰되는 예방 접종 이후 RSV 감염의 악화를 회피하기 위해서, F에 대응하는 균형 있는 Th1/Th2가 필요한데, 이는 높은-친밀도 항체의 유도(Delgado et al., Nat. Med. 15:34-41, 2009)를 위한 전제 조건인 F를 강력한 바이러스-기반 벡터에 운반함으로써 획득할 수 있는 향상된 TLR 자극에 의해 달성될 수 있었다. 본 발명자들은 인 비보에서 독감 항원(WO 2008/036146)에 대한 강력하고 균형 있는 Th1/Th2 반응을 유도하는 황열병 바이러스-기반 키메라 LAV 벡터의 능력에 대해 이미 설명하였다. 본 발명에서, 황열병 바이러스-기반 키메라 LAVs 및 PIV 벡터는 모두 최상의 면역 반응 프로파일을 유도하기 위한 RSV F를 운반하기 위해 사용하였다. 여기서 언급하고 있는 다른 LAVs 및 PIV 벡터도 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
바이러스 A2 스트레인의 전체-길이 RSV F 단백질(GenBank 접근번호 P03420)은 상기 언급한 것과 같이 코돈 최적화하였고, 합성하였으며, 및 광견병 G 단백질을 위한 도 12 및 13에서 보여주는 삽입 방법으로 분자생물학적 표준 방법을 이용하여 PIV-WN s-PIV 및 d-PIV를 위한 플라스미드로 클론하였다. 삽입 및 주변 유전 요소의 서열 추출은 서열목록 5에서 제공하였다. WN(ΔC)-RSV F, WN(ΔprME)- RSV F, 및 WN(ΔCprME)- RSV F PIV를 발생하는 인 비트로 RNA 전사는 헬퍼 BHK-CprME(WN) 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용하였다. RSV F 단백질의 효율적을 복제 및 발현은 트랜스펙트된 세포를 항-RSV F Mab로 면역염색하여 처음 입증하였고, 도 19에 WN(ΔprME)- RSV F 구조체에 대한 예가 기재되어 있다. 트랜스펙트된 세포의 상층액에서 패키징된 PIVs의 존재(타이터 7 log10 FFU/ml)는 면역염색으로 베로 세포에서 적정에 의해 결정하였다. 추가적으로, 변형된 전체 길이 F 단백질 유전자를 포함하는 유사한 구조체가 사용될 수 있다. 구체적으로, F의 본래 시그널 펩타이드 N-말단은 광견병 바이러스 G 단백질의 하나와 함께 변형된 F 단백질로 교체하였다. 상기 변형은 이종 시그널의 사용이 F 단백질 합성 및/또는 PIVs의 복제 비율을 증가할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 의도에서 사용하였다.
플랫폼 개발 연구에 사용한 PIV 초기형 구조체
구조체 유전적 제제 팩키지 인
PIV-WN wt NY99 WN 바이러스 WN 엔벨럽; BHK-CprME(WN) 또는 BHK-C(WN) 헬퍼 세포 (Mason et al., Virology 2006, 351:432-43; Widman et al., Vaccine 2008, 26:2762-71)
PIV-YF/WN 엔벨럽 (VLP): wt WN NY99
백본: YF 17D		 YF 17D 엔벨럽; BHK-CprME(YF) 헬퍼 세포 (Widman et al., Adv Virus Res. 2008, 72:77-126)
PIV-WN/JE 엔벨럽 (VLP): wt JE Nakayama
백본: wt WN NY99 		JE 또는 WN 엔벨럽; BHK-C(WN) 또는 BHK-CprME(WN) 헬퍼 세포 (Ishikawa et al., Vaccine 2008, 26:2772-8)
PIV-YF YF 17D YF 17D 엔벨럽; BHK-CprME(YF) 또는 BHK-C(YF) 헬퍼 세포 (Mason et al., Virology 2006, 351:432-43)
안전성 : 영아 마우스 신경독성1
구조체 투여량
(log10)		 사망률(%) AST (days)2
PIV-YF 1 - 4 0/10 (0%) na
PIV-WN 2 - 5 0/10 (0%) na
PIV-WN/JE 1 - 4 0/11 (0%) na
PIV-YF/WN 1 - 4 0/10-11 (0%) na
WN d-PIV 1 4 0/10-11 (0%) na
YF d-PIV 1 - 4 0/10 (0%) na
YF17D 2
1
0
-1		 10/10 (100%)
10/10 (100%)
9/10 (90%)
3/10 (30%)		 7.6
9.3
9.9
9.6
YF/JE 4
3
2
1		 9/11 (82%)
7/10 (70%)
3/11 (27%)
0/11 (0%)		 9.7
12.3
12
na
YF/WN 3
0-2		 2/11 (18%)
0/10-11 (0%)		 12.5
na
1단일 투여, IC 접종, ICR 5-일령 마우스, 단계적 로그 투여량의 투여.
2사망한 마우스에 대한 AST; na, 적용할 수 없음
마우스에서의 PIV 고면역원성 및 효능성1
그룹 투여량 PRNT
20 일		 PRNT
34 일		 추가 챌린지 후 사망률 (%)
PIV-WN 105 640 1280 0/8 (0%)
106 1280 2560 1/8 (12.5%)
106 +105 2560 2560 0/6 (0%)
YF/WN 대조군 104 1280 2560 1/8 (12.5%)
PIV-WN/JE 104 10 20 N/D
105 20 20 N/D
105+105 20 160 N/D
YF/JE 대조군 104 160 320 N/D
PIV-YF 104 <10 <10 8/8 (100%)
105 <10 <10 5/7 (71%)
105+105 10 10 2/5 (40%)
YF17D 대조군 104 640 1280 0/7 (0%)
Mock 대조군 WN challenge Diluent N/D 0 7/7 (100%)
YF challenge Diluent N/D 0 8/8 (100%)
1IP 면역화(선택한 그룹에서 d0 프라임, 및 d21 부스트); d35 챌린지: wt WN NY99, 3 log10 PFU IP, 270 LD50; wt YF 아시비, 3 log10PFU IC, 500 LD50; N/D, 미결정.
PIV는 햄스터에서 면역원성이 있고, 챌린지에 대하여 방어한다1
그룹 투여량(s) PRNT
38 일		 이후-챌린지
사망률 질병률 바이러스 혈증 최고점 (log)
PIV-WN 105 320 0/5 (0%) 0/5 (0%) 2.3
106 640 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1.8
106+105 1280 0/5 (0%) 0/5 (0%) <1.3
YF/WN 대조군 104 ≥2560 0/5 (0%) 0/5 (0%) <1.3
PIV-WN/JE 104 20 2/5 (40%) 2/5 (40%) 2.2
105+105 40 0/5 (0%) 0/5 (0%) <1.3
YF/JE 대조군 104 2560 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1.3
PIV-YF 104 <10 1/3 (33%) 3/3 (100%) 8.3
105 <10 1/5 (20%) 4/5 (80%) 8.3
105+105 20 0/4 (0%) 0/4 (0%) 2.5
YF17D 대조군 104 ≥2560 0/4 (0%) 0/4 (0%) <1.3
Mock 대조군 WN challenge 희석액 <10 3/4 (75%) 4/4 (100%) 4.0
YF 챌린지 희석액 <10 1/4 (25%) 4/4 (100%) 8.4
JE 챌린지 희석액 <10 2/5 (40%) 2/5 (40%) 3.0
1시리안 햄스터, SC 접종(선택된 그룹에서 d0, 및 d21); 챌린지 (d39): wt WN NY385/99 6 log10 PFU IP, wt JE 나카야마 5.8 log10PFU IC, 또는 햄스터-적용 YF 아시비 7 log10 PFU IP(McArthur et al., J. Virol. 77:1462-1468, 2003; McArthur et al., Virus Res. 110:65-71, 2005).
PIV에 의한 햄스터 면역화: SC 및 IP 경로의 비교
접종원 PRNT 20-21 일 부스트
(log10)		 PRNT 34-38 일
SC IP SC IP
PIV-WN 40 320 5 1280 1280
PIV-YF/WN 10 320 5 160 1280
PIV-WN/JE 10 80 5 40 640
PIV-YF <10 10 5 20 80
PIV 칵테일에 대한 면역 반응(마우스)1
그룹 투여량 PRNT 20 일 PRNT 34 일
Anti-JE Anti-WN Anti-JE Anti-WN
PIV-WN/JE + RV-WN 105 +105 20 320 640 5120
PIV-WN/JE alone 105 80 <10 160 20
PIV-WN alone 105 <10 640 <10 5120
Mock - <10 <10 <10 <10
1C57/BL6 마우스, 0 및 21 일 IP 주입; 혈청 풀 PRNT 역가.
성체 ICR 마우스에서 PIV-TBE 및 YF/TBE 백신 구조체의 신경독성(IC 접종) 및 신경침투(IP 접종)
구조체 신경독성 (IC route) 신경침투 (IP route)
투여량(s)
(log10)		 사망률
(%)		 AST,
days1		 투여량(s)
(log10)		 사망률
(%)		 AST,
days1
PIV-Hypr p39 5 0/7 (0%) na 5 0/16 (0%) na
PIV-Hypr p40 5 0/6 (0%) na 5 0/16 (0%) na
YF/Hypr p42 4
3
2		 8/8 (100%)
8/8 (100%)
8/8 (100%)		 6.3
6.4
7.4		 5 6/8 (75%) 13.3
YF/LGT p43 4
3
2		 8/8 (100%)
8/8 (100%)
8/8 (100%)		 7.9
7.6
8.4		 5 0/8 (0%) na
YF/Hypr p45 4
3
2		 8/8 (100%)
8/8 (100%)
8/8 (100%)		 6.1
6.6
6.8		 5 5/8 (62.5%) 11.2
YF/Hypr dC2 p59 4
3
2		 8/8 (100%)
8/8 (100%)
8/8 (100%)		 6.6
7.4
8.1		 5 0/8 (0%) na
YF 17D 3
2
1		 8/8 (100%)
7/8 (87.5%)
4/8 (50%)		 9
9.6
10		 5 0/8 (0%) na
Mock (diluent) none 0/8 (0%) na none 0/8 (0%) na
1사망한 마우스의 AST
마우스에서 IP 면역화된 중화 항체 역가(PRNT50)(wt TBE 바이러스 Hypr에 대하여 결정됨) 및 챌린지로부터 보호(챌린지 이후 관찰 9 일째)
면역원 투여량(s), log10 PRNT50 역가, 각각. 샘플1 PRNT50 GMT 챌린지 이후 9일째사망률 (%)2
PIV-Hypr p39, 1 투여 5 1746 (2) 665 0/8 (0%)
1187 (2)
164 (2)
574 (2)
PIV-Hypr p39, 2 투여 5+5 16229 (2) 10,584 0/8 (0%)
12928 (2)
12927 (2)
4627 (2)
PIV-Hypr p40, 1 투여 5 <10 (2) 15 6/8 (75%)
<10 (2)
18 (2)
33 (2)
PIV-Hypr p40, 2 투여 5+5 169 (2) 153 1/8 (12.5%)
638 (2)
26 (2)
192 (2)
YF/Hypr p42 5 9210 (1) 6,085 0/2 (0%)
4020 (1)
YF/LGT p43 5 123 (2) 64 1/8 (12.5%)
32 (2)
96 (2)
45 (2)
YF/Hypr p45 5 292 (2) 68 0/3 (0%)
16 (1)
YF/Hypr dC2 p59 5 194 (2) 68 0/8 (0%)
93 (2)
45 (2)
26 (2)
인간 TBE 사백신, 1 투여 (인간 투여량의 1/20) 1/20 19 (2) 12 1/8 (12.5%)
<10 (2)
13 (2)
<10 (2)
인간 TBE 사백신, 2 투여 (각각 인간 투여량의 1/20) 1/20+1/20 3435 (2) 1,496 0/6 (0%)
1267 (2)
770 (2)
YF 17D 대조군 5 <10 (4)
11 (4)		 <10 5/8 (62.5%)
모크 none <10 (4)
<10 (4)		 <10 4/8 (50%)
1괄호속 숫자는 각각 테스트한 혈청풀 샘플에서 마우스의 숫자이다..
29일째 사망률이 기재 되어 있다.
키메라 TBE LAV 후보군의 약독화에 사용될 수 있는 공지된 약독화 E 단백질 변이의 예
잔기 도메인 코멘트 약독화 대상 참조문헌
N52R II 융합 활성화에 필요한 힌지 운동에 관여하는 추측되는 DI- DII 힌지 JE, YF Hasegawa et al, 1992, Schlesinger et al, 1996
E84K II conserved, E in TBE, K/R in others, attenuated by passage in Ixodes ricinus ticks, DII contains flavivirus cross reactive epitopes TBE Labuda et al, 1994
E85K II conserved, E in TBE, K/R in others, attenuation obtained as plaque variants in Vero cells, DII contains flavivirus cross reactive epitopes JE Wu et al, 1997
H104K II within highly conserved fusion peptide (aa 98-113), H in TBE, G in others TBE Rey et al, 1995
L107F II within highly conserved fusion peptide (aa 98-113), L in all flaviviruses, F in attenuated JE TBE, JE, WN Rey et al, 1995, Arroyo et al, 1999, 2004
T123K II DI- DII hinge, T in TBE, A in KFD TBE Holzmann et al, 1997
K126E II DI- DII hinge, K in TBE, E in D-2 DEN2 Bray, 98
K136E II DI- DII hinge, K in TBE 및 JE, E in D-2 JE
N154L(Y) I glycosylation site, packed with conserved H 104, involved in fusion. DEN2, DEN4, YF Guirakhoo et al, 1993, Pletnev et al, 1993, Kawano et al, 1993, Jennings et al, 1994
K171E I external edge of DI, involved in fusion TBE M및l, 1989, Holzmann, 1997
I173T external edge of DI, involved in fusion YF Chambers 및 Nickells 2001
D181Y DI- DII hinge TBE Holzmann et al, 1997
K204R Lining Hydrophobic pocket, involve in fusion DEN1, DEN3 Guirakhoo et al, 2004
P272S II highly conserved, junction of one the of 2 alpha helices JE Cecilia et al, 1991
G308N III cell attachment, DKT in TBE, EGS in KFD, T-X in others, change to N produced glycosylation site in LI 및 reduced virulence, N-X-T/S glycosylation motif LI Jiang et al, 1993, Gao et al, 1994
S310K III putative cell attachment, change from E to G in JE reduced virulence JE Jiang et al, 1993, Gao et al, 1994, Wu et al, 1997
K311E III highly conserved, putative cell attachment TBE, YF Rey et al, 1995, Jennings, 1994
T333L III putative cell attachment YF, LGT Raynman et al, 1998
G334K III putative cell attachment YF Chambers 및 Nickells, 2001
S335K III putative cell attachment JE Wu et al, 1997
K336D III putative cell attachment JE Cecilia 및 Gould, 1991
P337D III putative cell attachment JE Cecilia 및 Gould, 1991
G368R III putative cell attachment TBE, JE Holzman et al 1997,
Hasegawa et al 1992
Y384H III change to H attenuated TBE, putative cell attachment, -3 position to deleted RGD in TBE TBE Holzmann et al, 1990
V385R III conserved, -2 position to deleted RGD in TBE, putative cell attachment D2 Hiramatsu et al, 1996,
Lobigs, 1990
G386R III highly conserved, -1 position to deleted RGD in TBE, putative cell attachment D2, MVE Hiramatsu, 1996, Lobigs et al, 1990
E387R III conserved, +2 position to deleted RGD in TBE, putative cell attachment D2, MVE Hiramatsu, 1996, Lobigs et al, 1990
F403K none highly conserved, C-terminal region not included in crystal structure sE D-2, D-4 Kawano et al, 1993, Bray et al, 1998
H438Y None highly conserved, C-terminal region not included in crystal structure sE LGT Campbell 및 Pletnev 2000
H496R none highly conserved, C-terminal region not included in crystal structure sE TBE Gritsun et al, 2001
참조 : Hasegawa et al., Virology 191(1):158-165; Schlesinger et al., J. Gen. Virol. 1996, 77 ( Pt 6):1277-1285, 1996; Labuda et al., Virus Res. 31(3):305-315, 1994; Wu et al., Virus Res. 51(2):173-181, 1997; Holzmann et al., J. Gen. Virol. 78 (Pt 1):31-37, 1997; Bray et al., J. Virol. 72(2):1647-1651, 1998; Guirakhoo et al., Virology 194(1):219-223, 1993; Pletnev et al., J. Virol. 67(8):4956-4963, 1993; Kawano et al., J. Virol. 67(11):6567-6575, 1993; Jennings et al., J. Infect. Dis. 169(3):512-518, 1994; M및l et al., J. Virol. 63(2):564-571, 1989; Chambers et al., J. Virol. 75(22):10912-10922, 2001; Cecilia et al., Virology 181(1):70-77, 1991; Jiang et al., J. Gen. Virol. 74 (Pt 5):931-935, 1993; Gao et al., J. Gen. Virol. 75 (Pt 3):609-614, 1994; Holzmann et al., J. Virol. 64(10):5156-5159, 1990; Hiramatsu et al., Virology 224(2):437-445, 1996; Lobigs et al., Virology 176(2):587-595, 1990; Campbell et al., Virology 269(1):225-237, 2000; Gritsun et al., J. Gen. Virol. 82(Pt 7):1667-1675, 2001.
Figure 112010066542064-pct00001

Figure 112010066542064-pct00002
Figure 112010066542064-pct00003
Figure 112010066542064-pct00004

Figure 112010066542064-pct00005

Figure 112010066542064-pct00006

Figure 112010066542064-pct00007

Figure 112010066542064-pct00008

Figure 112010066542064-pct00009

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Figure 112010066542064-pct00018

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Figure 112010066542064-pct00021

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Figure 112010066542064-pct00024

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Figure 112010066542064-pct00029

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Figure 112010066542064-pct00031

Figure 112010066542064-pct00032

Figure 112010066542064-pct00033

Figure 112010066542064-pct00034

Figure 112010066542064-pct00035

Figure 112010066542064-pct00036

다른 구현예
본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허출원 문헌 및 특허 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 각각의 공개문헌, 특허출원 문헌 및 특허 문헌은 특정적으로 그리고 개별적으로 참조로 삽입된다.
본 발명의 범위 및 기술적 사상에서 벗어나지 않는 범위에서 본 발명의 상기 바이러스, 벡터, 조성물 및 방법의 다양한 변형 및 변용이 당업자에게 명백하다. 본 발명은 특정 구현예와 연관되어 설명되어 있지만, 본 발명은 그러한 구현예들에 과도하게 제한되지 않는다는 것은 명확하다. 본 발명의 구현을 위한 서술된 방식들의 다양한 변형들(의학, 의약 또는 관련 기술분야의 당업자에 명백한 변형들)은 본 발명의 범위에 속한다. 본 명세서에서, "a" 및 "the"와 같은 단수형의 사용은, 다르게 언급되지 않는 한, 대응되는 복수형을 배제하는 것은 아니다. 이와 유사하게, 복수형의 사용은 대응되는 단수형을 배제하는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예들은 하기의 특허청구범위에 속하는 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> SANOFI PASTEUR BIOLOGICS CO. et al.
<120> Replication-Deficient Flavivirus Vaccines and Vaccine Vectors
<130> 06132/133WO2
<140> PCT/US09/001666
<141> 2009-03-16
<150> US 61/092,814
<151> 2008-08-29
<150> US 61/069,451
<151> 2008-03-14
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Yellow Fever Virus
<400> 1
Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Tick-borne Encephalitis Virus
<400> 2
Gly Met Leu Gly Met Thr Ile Ala
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Synthetic
<400> 3
Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile Leu Gly Met Leu Gly
1 5 10 15
Met Thr Ile Ala
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Tick-borne Encephalitis Virus
<400> 4
Gly Gly Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Ile Gly Met Leu Gly
1 5 10 15
Met Thr Ile Ala
20
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 5
Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Borrelia afzelli
<400> 6
Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Synthetic
<400> 7
Phe Thr Leu Glu Gly Lys Leu Thr Ala
1 5
<210> 8
<211> 273
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 8
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys
65 70 75 80
Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln
85 90 95
Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys
100 105 110
Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr
165 170 175
Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser
180 185 190
Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala
195 200 205
Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu
225 230 235 240
Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu
245 250 255
Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu
260 265 270
Lys
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Synthetic
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X is Glu or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X is Met or Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X is Lys, Thr or Gly
<400> 9
Leu Pro Gly Xaa Xaa Xaa Val Leu
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Synthetic
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X is Asn, Ser, or Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X is Val, or Thr
<400> 10
Gly Thr Ser Asp Lys Xaa Asn Gly Ser Gly Xaa
1 5 10
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> Synthetic
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Asn, His, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Ser, Pro, Leu, Ala, or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Lys or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Val or Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is Ser or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is Val or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is Glu or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa is Asn or Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa is Asp or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa is Ser or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Xaa is Ser or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa is Ala, Gln, or Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa is Ala or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> Xaa is Ala, Lys, or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa is Asn or Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Ser or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa is Gly, Asn, or Lys
<400> 11
Xaa Ile Xaa Xaa Ser Gly Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Asp Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Ala Thr Lys Lys Thr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Thr
20 25 30
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> Synthetic
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Asn or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is Lys or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is Ser, Asn, Lys, or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa is Thr or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is Thr or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa is Asp or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa is Ile or Leu
<400> 12
Ser Xaa Gly Thr Xaa Leu Glu Gly Xaa Ala Val Glu Ile Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Xaa Glu Xaa Lys Asn
20
<210> 13
<211> 154
<212> PRT
<213> Rhipicephalus appendiculatus
<400> 13
Met Lys Ala Phe Phe Val Leu Ser Leu Leu Ser Thr Ala Ala Leu Thr
1 5 10 15
Asn Ala Ala Arg Ala Gly Arg Leu Gly Ser Asp Leu Asp Thr Phe Gly
20 25 30
Arg Val His Gly Asn Leu Tyr Ala Gly Ile Glu Arg Ala Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Tyr Pro Gly Leu Thr Ala Ser Ile Gly Gly Glu Val Gly Ala Arg
50 55 60
Leu Gly Gly Arg Ala Gly Val Gly Val Ser Ser Tyr Gly Tyr Gly Tyr
65 70 75 80
Pro Ser Trp Gly Tyr Pro Tyr Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr
85 90 95
Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Asp Gln Gly Phe Gly Ser Ala Tyr Gly Gly
100 105 110
Tyr Pro Gly Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly Tyr Gly Gly Gly
115 120 125
Tyr Gly Gly Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Pro
130 135 140
Asn Val Arg Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala
145 150
<210> 14
<211> 184
<212> PRT
<213> Ixodes scapularis
<400> 14
Met Arg Thr Ala Phe Thr Cys Ala Leu Leu Ala Ile Ser Phe Leu Gly
1 5 10 15
Ser Pro Cys Ser Ser Ser Glu Asp Gly Leu Glu Gln Asp Thr Ile Val
20 25 30
Glu Thr Thr Thr Gln Asn Leu Tyr Glu Arg His Tyr Arg Asn His Ser
35 40 45
Gly Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Asn Ser Ser His Ala Glu Ala Val
50 55 60
Tyr Asn Cys Thr Leu Asn His Leu Pro Pro Val Val Asn Ala Thr Trp
65 70 75 80
Glu Gly Ile Arg His Arg Ile Asn Lys Thr Ile Pro Gln Phe Val Lys
85 90 95
Leu Ile Cys Asn Phe Thr Val Ala Met Pro Gln Glu Phe Tyr Leu Val
100 105 110
Tyr Met Gly Ser Asp Gly Asn Ser Asp Phe Glu Glu Asp Lys Glu Ser
115 120 125
Thr Gly Thr Asp Glu Asp Ser Asn Thr Gly Ser Ser Ala Ala Ala Lys
130 135 140
Val Thr Glu Ala Leu Ile Ile Glu Ala Glu Glu Asn Cys Thr Ala His
145 150 155 160
Ile Thr Gly Trp Thr Thr Glu Thr Pro Thr Thr Leu Glu Pro Thr Thr
165 170 175
Glu Ser Gln Phe Glu Ala Ile Pro
180
<210> 15
<211> 177
<212> PRT
<213> Ixodes scapularis
<400> 15
Met Arg Thr Ala Leu Thr Cys Ala Leu Leu Ala Ile Ser Phe Leu Gly
1 5 10 15
Ser Pro Cys Ser Ser Ser Glu Gly Gly Leu Glu Lys Asp Ser Arg Val
20 25 30
Glu Thr Thr Thr Gln Asn Leu Tyr Glu Arg Tyr Tyr Arg Lys His Pro
35 40 45
Gly Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Asn Ser Ser His Ala Glu Ala Val
50 55 60
Tyr Asn Cys Thr Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ser Val Asn Thr Thr Trp
65 70 75 80
Glu Gly Ile Arg His Arg Ile Asn Lys Thr Ile Pro Glu Phe Val Asn
85 90 95
Leu Ile Cys Asn Phe Thr Val Ala Met Pro Asp Gln Phe Tyr Leu Val
100 105 110
Tyr Met Gly Ser Asn Gly Asn Ser Tyr Ser Glu Glu Asp Glu Asp Gly
115 120 125
Lys Thr Gly Ser Ser Ala Ala Val Gln Val Thr Glu Gln Leu Ile Ile
130 135 140
Gln Ala Glu Glu Asn Cys Thr Ala His Ile Thr Gly Trp Thr Thr Glu
145 150 155 160
Ala Pro Thr Thr Leu Glu Pro Thr Thr Glu Thr Gln Phe Glu Ala Ile
165 170 175
Ser
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 16
Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly
1 5 10 15
Phe Leu Glu
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 17
Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly
1 5 10 15
Phe Leu Glu Gly Ser Gly Cys
20
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Influenza B virus
<400> 18
Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile
1 5 10 15
Arg Gly Ser
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 19
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 20
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
20
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 21
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
20
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 22
Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn
1 5
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 23
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 24
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> Influenza B virus
<400> 25
Met Leu Glu Pro Phe Gln
1 5
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> Influenza B virus
<400> 26
Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Ser Gly Cys
1 5 10
<210> 27
<211> 24
<212> PRT
<213> Avian Influenza A virus Subtype H5N1
<400> 27
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
20
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 28
Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile Leu
1 5 10 15
Gly Met Leu Gly Met Thr Ile Ala Ala Thr Val Arg
20 25
<210> 29
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 29
aggaaacgcc gttcccatga tgttctgact gtgcaattcc taattttggg catgctgggc 60
atgacaatcg cagctacggt tcgc 84
<210> 30
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 30
tcctttgcgg caagggtact acaagactga cacgttaagg attaaaaccc gtacgacccg 60
tactgttagc gtcgatgcca agcg 84
<210> 31
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 31
Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile Leu
1 5 10 15
Gly Met Leu Ala Cys Val Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25
<210> 32
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 32
aggaaacgcc gttcccatga tgttctgact gtgcaattcc taattttggg catgctggct 60
tgtgtcggag cagctaccgt gcga 84
<210> 33
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
tcctttgcgg caagggtact acaagactga cacgttaagg attaaaaccc gtacgaccga 60
acacagcctc gtcgatggca cgct 84
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 34
Gln Lys Lys Arg Gly Gly Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Ile
1 5 10 15
Gly Met Leu Gly Met Thr Ile Ala Ala Thr Val Arg
20 25
<210> 35
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 35
caaaagaaac gggggggaac agactggatg agctggctgc tcgtaatcgg catgctgggc 60
atgacaatcg cagctacggt tcgc 84
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<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 36
gttttctttg cccccccttg tctgacctac tcgaccgacg agcattagcc gtacgacccg 60
tactgttagc gtcgatgcca agcg 84
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 37
Gln Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val Met Ile Gly Met
1 5 10 15
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20 25
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<220>
<223> Synthetic Construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Construct
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 40
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1 5 10 15
Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys
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Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser Ser
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Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile Leu
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<210> 41
<211> 2500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 41
agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60
acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120
gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg 180
ctccttgtca aacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaccttc 240
aagaggtgtt caaggattta tctttttctt tttgttcaac attttgactg gaaaaaagat 300
cacagcccac ctaaagaggt tgtggaaaat gctggaccca agacaaggct tggctgttct 360
aaggaaagtc aagagagtgg tggccagttt gatgagagga ttgtcctcaa ggaaacgccg 420
ttcccatgat gttctgactg tgcaattcct aattttgggc atgctgggca tgacaatcgc 480
agctacggtt cgcaaggaaa gagacggcag tacggtcata cgcgcggaag gtaaggatgc 540
cgctacccaa gtgagagtgg aaaatggtac ctgcgtcatt ctggccaccg acatgggctc 600
ttggtgtgat gatagccttt cttatgagtg cgtaaccata gatcaaggtg aggaacctgt 660
tgacgttgat tgcttctgcc gaaacgtgga tggggtgtat ctcgaatatg gacggtgtgg 720
taaacaagaa ggaagcagaa ccagacgctc agtgcttata ccctcccacg ctcaaggaga 780
gctgaccgga cggggacata aatggttgga gggcgactca ctccgaacac atttgacccg 840
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gctcacgctg gagtctgtgg ttactcgcgt ggcagtgctg gtggtgctcc tctgtcttgc 960
ccctgtctac gcgtccaggt gtactcattt ggaaaacaga gattttgtca ccggcaccca 1020
ggggacgact cgggtaaccc tggtgcttga actgggtggt tgcgttacta ttaccgctga 1080
gggcaaaccc tctatggatg tgtggctgga tgcaatctat caggagaatc ccgcacaaac 1140
cagggaatat tgccttcacg caaagctgtc cgatacaaag gtcgcggcta ggtgcccaac 1200
aatgggaccg gccaccctgg cggaggaaca tcagggaggt acagtgtgca aacgggacca 1260
gagtgataga ggctggggta atcactgcgg cctgttcggc aaaggaagta ttgtcgcttg 1320
cgtcaaggca gcctgtgagg ccaaaaagaa ggctactggg cacgtctatg acgccaacaa 1380
gatcgtttat acagtgaaag tggaaccaca cacaggggat tacgtggcgg ccaacgagac 1440
tcattccggt cgcaaaacgg ccagcttcac cgtgtcatcc gaaaagacca tcctcactat 1500
gggggagtat ggcgacgttt ctctgctctg ccgggtggct agcggagtcg acctggccca 1560
gacagtcatc ctggaactgg ataaaacagt tgagcatctg cctaccgctt ggcaggtgca 1620
cagggattgg tttaacgacc ttgccctgcc atggaaacat gaaggagcga gaaactggaa 1680
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tctgggtgat cagaccggcg ttctccttaa agctctcgct ggcgtaccag ttgcccacat 1800
cgaaggaacg aagtaccacc tgaagtcagg ccatgtaact tgcgaggtgg gcctggagaa 1860
gttgaaaatg aaaggtctta cgtacacaat gtgtgacaag accaagttca catggaagag 1920
ggcccccaca gatagcggcc acgatactgt ggtgatggag gtgacctttt ctggaacaaa 1980
accctgcaga atacccgtgc gggctgtagc tcacggatct cccgatgtca atgttgctat 2040
gctgattaca cctaacccta ccatcgagaa taacggtggt ggttttattg agatgcagct 2100
tccgccaggc gataacatca tctacgtggg cgaactctct taccagtggt ttcagaaagg 2160
gagttcaatt gggcgggtct tccaaaaaac gaagaaggga atcgaacgat tgacggttat 2220
cggcgagcac gcatgggatt ttggttccgc agggggattc ctgtcttcta ttggtaaggc 2280
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gtccatgtca ttcctcttgg ccggcgtgct tgtactggcc atgacactgg gcgttggcgc 2460
cgatcaagga tgcgccatca actttggcaa gagagagctc 2500
<210> 42
<211> 2496
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 42
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<210> 43
<211> 793
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 43
Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val
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Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser
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Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile
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Leu Gly Met Leu Ala Cys Val Gly Ala Ala Thr Val Arg Lys Glu Arg
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Asp Gly Ser Thr Val Ile Arg Ala Glu Gly Lys Asp Ala Ala Thr Gln
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Val Arg Val Glu Asn Gly Thr Cys Val Ile Leu Ala Thr Asp Met Gly
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Arg Arg Ser Val Leu Ile Pro Ser His Ala Gln Gly Glu Leu Thr Gly
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Arg Gly His Lys Trp Leu Glu Gly Asp Ser Leu Arg Thr His Leu Thr
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Arg Val Glu Gly Trp Val Trp Lys Asn Arg Leu Leu Ala Leu Ala Met
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<210> 44
<211> 2500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 44
agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60
acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120
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gatcgtttat acagtgaaag tggaaccaca cacaggggat tacgtggcgg ccaacgagac 1440
tcattccggt cgcaaaacgg ccagcttcac cgtgtcatcc gaaaagacca tcctcactat 1500
gggggagtat ggcgacgttt ctctgctctg ccgggtggct agcggagtcg acctggccca 1560
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cggcgagcac gcatgggatt ttggttccgc agggggattc ctgtcttcta ttggtaaggc 2280
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<211> 2500
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 45
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Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 47
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Met Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Ser Phe Leu Leu Ala Gly Val Leu
755 760 765
Val Leu Ala Met Thr Leu Gly Val Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile
770 775 780
Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu
785 790
<210> 50
<211> 2491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 50
agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60
acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120
gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg 180
ctccttgtca aacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaggtgt 240
tcaaggattt atctttttct ttttgttcaa cattttgact ggaaaaaaga tcacagccca 300
cctaaagagg ttgtggaaaa tgctggaccc aagacaaggc ttggctgttc taaggaaagt 360
caagagagtg gtggccagtt tgatgagagg attgtcctca aggaaacgcc gttcccatga 420
tgttctgact gtgcaattcc taattttggg catgctgggc atgacaatcg cagctacggt 480
tcgcaaggaa agagacggca gtacggtcat acgcgcggaa ggtaaggatg ccgctaccca 540
agtgagagtg gaaaatggta cctgcgtcat tctggccacc gacatgggct cttggtgtga 600
tgatagcctt tcttatgagt gcgtaaccat agatcaaggt gaggaacctg ttgacgttga 660
ttgcttctgc cgaaacgtgg atggggtgta tctcgaatat ggacggtgtg gtaaacaaga 720
aggaagcaga accagacgct cagtgcttat accctcccac gctcaaggag agctgaccgg 780
acggggacat aaatggttgg agggcgactc actccgaaca catttgaccc gcgtcgaggg 840
ctgggtctgg aaaaatcggc tgttggccct cgctatggtg acagtcgttt ggctcacgct 900
ggagtctgtg gttactcgcg tggcagtgct ggtggtgctc ctctgtcttg cccctgtcta 960
cgcgtccagg tgtactcatt tggaaaacag agattttgtc accggcaccc aggggacgac 1020
tcgggtaacc ctggtgcttg aactgggtgg ttgcgttact attaccgctg agggcaaacc 1080
ctctatggat gtgtggctgg atgcaatcta tcaggagaat cccgcacaaa ccagggaata 1140
ttgccttcac gcaaagctgt ccgatacaaa ggtcgcggct aggtgcccaa caatgggacc 1200
ggccaccctg gcggaggaac atcagggagg tacagtgtgc aaacgggacc agagtgatag 1260
aggctggggt aatcactgcg gcctgttcgg caaaggaagt attgtcgctt gcgtcaaggc 1320
agcctgtgag gccaaaaaga aggctactgg gcacgtctat gacgccaaca agatcgttta 1380
tacagtgaaa gtggaaccac acacagggga ttacgtggcg gccaacgaga ctcattccgg 1440
tcgcaaaacg gccagcttca ccgtgtcatc cgaaaagacc atcctcacta tgggggagta 1500
tggcgacgtt tctctgctct gccgggtggc tagcggagtc gacctggccc agacagtcat 1560
cctggaactg gataaaacag ttgagcatct gcctaccgct tggcaggtgc acagggattg 1620
gtttaacgac cttgccctgc catggaaaca tgaaggagcg agaaactgga ataatgcaga 1680
gcgactcgta gaattcggtg cccctcatgc cgtgaagatg gacgtctaca atctgggtga 1740
tcagaccggc gttctcctta aagctctcgc tggcgtacca gttgcccaca tcgaaggaac 1800
gaagtaccac ctgaagtcag gccatgtaac ttgcgaggtg ggcctggaga agttgaaaat 1860
gaaaggtctt acgtacacaa tgtgtgacaa gaccaagttc acatggaaga gggcccccac 1920
agatagcggc cacgatactg tggtgatgga ggtgaccttt tctggaacaa aaccctgcag 1980
aatacccgtg cgggctgtag ctcacggatc tcccgatgtc aatgttgcta tgctgattac 2040
acctaaccct accatcgaga ataacggtgg tggttttatt gagatgcagc ttccgccagg 2100
cgataacatc atctacgtgg gcgaactctc ttaccagtgg tttcagaaag ggagttcaat 2160
tgggcgggtc ttccaaaaaa cgaagaaggg aatcgaacga ttgacggtta tcggcgagca 2220
cgcatgggat tttggttccg cagggggatt cctgtcttct attggtaagg cactgcatac 2280
cgtgctgggg ggcgcattca attctatttt cgggggcgtg gggttcctgc ctaaactcct 2340
gctgggagta gccctggcct ggttgggact gaatatgcgg aatccgacga tgtccatgtc 2400
attcctcttg gccggcgtgc ttgtactggc catgacactg ggcgttggcg ccgatcaagg 2460
atgcgccatc aactttggca agagagagct c 2491
<210> 51
<211> 2491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 51
tcatttagga cacacgatta actccacgta accagacgtt tagctcaacg atccgttatt 60
tgtgtaaacc taattaaaat tagcaagcaa ctcgctaatc gtctcttgac tggtcttgta 120
cagaccagca tttcgagtcc ctttttggga cccgcagtta taccatgctg ctcctcaagc 180
gaggaacagt ttgttttatt ttgttttttg ttttgtttaa cctttgtctg gacctccaca 240
agttcctaaa tagaaaaaga aaaacaagtt gtaaaactga ccttttttct agtgtcgggt 300
ggatttctcc aacacctttt acgacctggg ttctgttccg aaccgacaag attcctttca 360
gttctctcac caccggtcaa actactctcc taacaggagt tcctttgcgg caagggtact 420
acaagactga cacgttaagg attaaaaccc gtacgacccg tactgttagc gtcgatgcca 480
agcgttcctt tctctgccgt catgccagta tgcgcgcctt ccattcctac ggcgatgggt 540
tcactctcac cttttaccat ggacgcagta agaccggtgg ctgtacccga gaaccacact 600
actatcggaa agaatactca cgcattggta tctagttcca ctccttggac aactgcaact 660
aacgaagacg gctttgcacc taccccacat agagcttata cctgccacac catttgttct 720
tccttcgtct tggtctgcga gtcacgaata tgggagggtg cgagttcctc tcgactggcc 780
tgcccctgta tttaccaacc tcccgctgag tgaggcttgt gtaaactggg cgcagctccc 840
gacccagacc tttttagccg acaaccggga gcgataccac tgtcagcaaa ccgagtgcga 900
cctcagacac caatgagcgc accgtcacga ccaccacgag gagacagaac ggggacagat 960
gcgcaggtcc acatgagtaa accttttgtc tctaaaacag tggccgtggg tcccctgctg 1020
agcccattgg gaccacgaac ttgacccacc aacgcaatga taatggcgac tcccgtttgg 1080
gagataccta cacaccgacc tacgttagat agtcctctta gggcgtgttt ggtcccttat 1140
aacggaagtg cgtttcgaca ggctatgttt ccagcgccga tccacgggtt gttaccctgg 1200
ccggtgggac cgcctccttg tagtccctcc atgtcacacg tttgccctgg tctcactatc 1260
tccgacccca ttagtgacgc cggacaagcc gtttccttca taacagcgaa cgcagttccg 1320
tcggacactc cggtttttct tccgatgacc cgtgcagata ctgcggttgt tctagcaaat 1380
atgtcacttt caccttggtg tgtgtcccct aatgcaccgc cggttgctct gagtaaggcc 1440
agcgttttgc cggtcgaagt ggcacagtag gcttttctgg taggagtgat accccctcat 1500
accgctgcaa agagacgaga cggcccaccg atcgcctcag ctggaccggg tctgtcagta 1560
ggaccttgac ctattttgtc aactcgtaga cggatggcga accgtccacg tgtccctaac 1620
caaattgctg gaacgggacg gtacctttgt acttcctcgc tctttgacct tattacgtct 1680
cgctgagcat cttaagccac ggggagtacg gcacttctac ctgcagatgt tagacccact 1740
agtctggccg caagaggaat ttcgagagcg accgcatggt caacgggtgt agcttccttg 1800
cttcatggtg gacttcagtc cggtacattg aacgctccac ccggacctct tcaactttta 1860
ctttccagaa tgcatgtgtt acacactgtt ctggttcaag tgtaccttct cccgggggtg 1920
tctatcgccg gtgctatgac accactacct ccactggaaa agaccttgtt ttgggacgtc 1980
ttatgggcac gcccgacatc gagtgcctag agggctacag ttacaacgat acgactaatg 2040
tggattggga tggtagctct tattgccacc accaaaataa ctctacgtcg aaggcggtcc 2100
gctattgtag tagatgcacc cgcttgagag aatggtcacc aaagtctttc cctcaagtta 2160
acccgcccag aaggtttttt gcttcttccc ttagcttgct aactgccaat agccgctcgt 2220
gcgtacccta aaaccaaggc gtccccctaa ggacagaaga taaccattcc gtgacgtatg 2280
gcacgacccc ccgcgtaagt taagataaaa gcccccgcac cccaaggacg gatttgagga 2340
cgaccctcat cgggaccgga ccaaccctga cttatacgcc ttaggctgct acaggtacag 2400
taaggagaac cggccgcacg aacatgaccg gtactgtgac ccgcaaccgc ggctagttcc 2460
tacgcggtag ttgaaaccgt tctctctcga g 2491
<210> 52
<211> 730
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 52
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Ser Ser Lys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu
35 40 45
Leu Val Ile Gly Met Leu Gly Met Thr Ile Ala Ala Thr Val Arg Lys
50 55 60
Glu Arg Asp Gly Ser Thr Val Ile Arg Ala Glu Gly Lys Asp Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gln Val Arg Val Glu Asn Gly Thr Cys Val Ile Leu Ala Thr Asp
85 90 95
Met Gly Ser Trp Cys Asp Asp Ser Leu Ser Tyr Glu Cys Val Thr Ile
100 105 110
Asp Gln Gly Glu Glu Pro Val Asp Val Asp Cys Phe Cys Arg Asn Val
115 120 125
Asp Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Gly Arg Cys Gly Lys Gln Glu Gly Ser
130 135 140
Arg Thr Arg Arg Ser Val Leu Ile Pro Ser His Ala Gln Gly Glu Leu
145 150 155 160
Thr Gly Arg Gly His Lys Trp Leu Glu Gly Asp Ser Leu Arg Thr His
165 170 175
Leu Thr Arg Val Glu Gly Trp Val Trp Lys Asn Arg Leu Leu Ala Leu
180 185 190
Ala Met Val Thr Val Val Trp Leu Thr Leu Glu Ser Val Val Thr Arg
195 200 205
Val Ala Val Leu Val Val Leu Leu Cys Leu Ala Pro Val Tyr Ala Ser
210 215 220
Arg Cys Thr His Leu Glu Asn Arg Asp Phe Val Thr Gly Thr Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Arg Val Thr Leu Val Leu Glu Leu Gly Gly Cys Val Thr Ile
245 250 255
Thr Ala Glu Gly Lys Pro Ser Met Asp Val Trp Leu Asp Ala Ile Tyr
260 265 270
Gln Glu Asn Pro Ala Gln Thr Arg Glu Tyr Cys Leu His Ala Lys Leu
275 280 285
Ser Asp Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met Gly Pro Ala Thr
290 295 300
Leu Ala Glu Glu His Gln Gly Gly Thr Val Cys Lys Arg Asp Gln Ser
305 310 315 320
Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile
325 330 335
Val Ala Cys Val Lys Ala Ala Cys Glu Ala Lys Lys Lys Ala Thr Gly
340 345 350
His Val Tyr Asp Ala Asn Lys Ile Val Tyr Thr Val Lys Val Glu Pro
355 360 365
His Thr Gly Asp Tyr Val Ala Ala Asn Glu Thr His Ser Gly Arg Lys
370 375 380
Thr Ala Ser Phe Thr Val Ser Ser Glu Lys Thr Ile Leu Thr Met Gly
385 390 395 400
Glu Tyr Gly Asp Val Ser Leu Leu Cys Arg Val Ala Ser Gly Val Asp
405 410 415
Leu Ala Gln Thr Val Ile Leu Glu Leu Asp Lys Thr Val Glu His Leu
420 425 430
Pro Thr Ala Trp Gln Val His Arg Asp Trp Phe Asn Asp Leu Ala Leu
435 440 445
Pro Trp Lys His Glu Gly Ala Arg Asn Trp Asn Asn Ala Glu Arg Leu
450 455 460
Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn Leu
465 470 475 480
Gly Asp Gln Thr Gly Val Leu Leu Lys Ala Leu Ala Gly Val Pro Val
485 490 495
Ala His Ile Glu Gly Thr Lys Tyr His Leu Lys Ser Gly His Val Thr
500 505 510
Cys Glu Val Gly Leu Glu Lys Leu Lys Met Lys Gly Leu Thr Tyr Thr
515 520 525
Met Cys Asp Lys Thr Lys Phe Thr Trp Lys Arg Ala Pro Thr Asp Ser
530 535 540
Gly His Asp Thr Val Val Met Glu Val Thr Phe Ser Gly Thr Lys Pro
545 550 555 560
Cys Arg Ile Pro Val Arg Ala Val Ala His Gly Ser Pro Asp Val Asn
565 570 575
Val Ala Met Leu Ile Thr Pro Asn Pro Thr Ile Glu Asn Asn Gly Gly
580 585 590
Gly Phe Ile Glu Met Gln Leu Pro Pro Gly Asp Asn Ile Ile Tyr Val
595 600 605
Gly Glu Leu Ser Tyr Gln Trp Phe Gln Lys Gly Ser Ser Ile Gly Arg
610 615 620
Val Phe Gln Lys Thr Lys Lys Gly Ile Glu Arg Leu Thr Val Ile Gly
625 630 635 640
Glu His Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ala Gly Gly Phe Leu Ser Ser Ile
645 650 655
Gly Lys Ala Leu His Thr Val Leu Gly Gly Ala Phe Asn Ser Ile Phe
660 665 670
Gly Gly Val Gly Phe Leu Pro Lys Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Ala
675 680 685
Trp Leu Gly Leu Asn Met Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Ser Phe Leu
690 695 700
Leu Ala Gly Val Leu Val Leu Ala Met Thr Leu Gly Val Gly Ala Asp
705 710 715 720
Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Ser Arg Gln
725 730
<210> 53
<211> 2286
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 53
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaagc ggagctccaa acaaaagaaa cgggggggaa cagactggat gagctggctg 240
ctcgtaatcg gcatgctggg catgacaatc gcagctacgg ttcgcaagga aagagacggc 300
agtacggtca tacgcgcgga aggtaaggat gccgctaccc aagtgagagt ggaaaatggt 360
acctgcgtca ttctggccac cgacatgggc tcttggtgtg atgatagcct ttcttatgag 420
tgcgtaacca tagatcaagg tgaggaacct gttgacgttg attgcttctg ccgaaacgtg 480
gatggggtgt atctcgaata tggacggtgt ggtaaacaag aaggaagcag aaccagacgc 540
tcagtgctta taccctccca cgctcaagga gagctgaccg gacggggaca taaatggttg 600
gagggcgact cactccgaac acatttgacc cgcgtcgagg gctgggtctg gaaaaatcgg 660
ctgttggccc tcgctatggt gacagtcgtt tggctcacgc tggagtctgt ggttactcgc 720
gtggcagtgc tggtggtgct cctctgtctt gcccctgtct acgcgtccag gtgtactcat 780
ttggaaaaca gagattttgt caccggcacc caggggacga ctcgggtaac cctggtgctt 840
gaactgggtg gttgcgttac tattaccgct gagggcaaac cctctatgga tgtgtggctg 900
gatgcaatct atcaggagaa tcccgcacaa accagggaat attgccttca cgcaaagctg 960
tccgatacaa aggtcgcggc taggtgccca acaatgggac cggccaccct ggcggaggaa 1020
catcagggag gtacagtgtg caaacgggac cagagtgata gaggctgggg taatcactgc 1080
ggcctgttcg gcaaaggaag tattgtcgct tgcgtcaagg cagcctgtga ggccaaaaag 1140
aaggctactg ggcacgtcta tgacgccaac aagatcgttt atacagtgaa agtggaacca 1200
cacacagggg attacgtggc ggccaacgag actcattccg gtcgcaaaac ggccagcttc 1260
accgtgtcat ccgaaaagac catcctcact atgggggagt atggcgacgt ttctctgctc 1320
tgccgggtgg ctagcggagt cgacctggcc cagacagtca tcctggaact ggataaaaca 1380
gttgagcatc tgcctaccgc ttggcaggtg cacagggatt ggtttaacga ccttgccctg 1440
ccatggaaac atgaaggagc gagaaactgg aataatgcag agcgactcgt agaattcggt 1500
gcccctcatg ccgtgaagat ggacgtctac aatctgggtg atcagaccgg cgttctcctt 1560
aaagctctcg ctggcgtacc agttgcccac atcgaaggaa cgaagtacca cctgaagtca 1620
ggccatgtaa cttgcgaggt gggcctggag aagttgaaaa tgaaaggtct tacgtacaca 1680
atgtgtgaca agaccaagtt cacatggaag agggccccca cagatagcgg ccacgatact 1740
gtggtgatgg aggtgacctt ttctggaaca aaaccctgca gaatacccgt gcgggctgta 1800
gctcacggat ctcccgatgt caatgttgct atgctgatta cacctaaccc taccatcgag 1860
aataacggtg gtggttttat tgagatgcag cttccgccag gcgataacat catctacgtg 1920
ggcgaactct cttaccagtg gtttcagaaa gggagttcaa ttgggcgggt cttccaaaaa 1980
acgaagaagg gaatcgaacg attgacggtt atcggcgagc acgcatggga ttttggttcc 2040
gcagggggat tcctgtcttc tattggtaag gcactgcata ccgtgctggg gggcgcattc 2100
aattctattt tcgggggcgt ggggttcctg cctaaactcc tgctgggagt agccctggcc 2160
tggttgggac tgaatatgcg gaatccgacg atgtccatgt cattcctctt ggccggcgtg 2220
cttgtactgg ccatgacact gggcgttggc gccgacactg ggtgtgccat agacatcagc 2280
cggcaa 2286
<210> 54
<211> 2286
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattcg cctcgaggtt tgttttcttt gccccccctt gtctgaccta ctcgaccgac 240
gagcattagc cgtacgaccc gtactgttag cgtcgatgcc aagcgttcct ttctctgccg 300
tcatgccagt atgcgcgcct tccattccta cggcgatggg ttcactctca ccttttacca 360
tggacgcagt aagaccggtg gctgtacccg agaaccacac tactatcgga aagaatactc 420
acgcattggt atctagttcc actccttgga caactgcaac taacgaagac ggctttgcac 480
ctaccccaca tagagcttat acctgccaca ccatttgttc ttccttcgtc ttggtctgcg 540
agtcacgaat atgggagggt gcgagttcct ctcgactggc ctgcccctgt atttaccaac 600
ctcccgctga gtgaggcttg tgtaaactgg gcgcagctcc cgacccagac ctttttagcc 660
gacaaccggg agcgatacca ctgtcagcaa accgagtgcg acctcagaca ccaatgagcg 720
caccgtcacg accaccacga ggagacagaa cggggacaga tgcgcaggtc cacatgagta 780
aaccttttgt ctctaaaaca gtggccgtgg gtcccctgct gagcccattg ggaccacgaa 840
cttgacccac caacgcaatg ataatggcga ctcccgtttg ggagatacct acacaccgac 900
ctacgttaga tagtcctctt agggcgtgtt tggtccctta taacggaagt gcgtttcgac 960
aggctatgtt tccagcgccg atccacgggt tgttaccctg gccggtggga ccgcctcctt 1020
gtagtccctc catgtcacac gtttgccctg gtctcactat ctccgacccc attagtgacg 1080
ccggacaagc cgtttccttc ataacagcga acgcagttcc gtcggacact ccggtttttc 1140
ttccgatgac ccgtgcagat actgcggttg ttctagcaaa tatgtcactt tcaccttggt 1200
gtgtgtcccc taatgcaccg ccggttgctc tgagtaaggc cagcgttttg ccggtcgaag 1260
tggcacagta ggcttttctg gtaggagtga taccccctca taccgctgca aagagacgag 1320
acggcccacc gatcgcctca gctggaccgg gtctgtcagt aggaccttga cctattttgt 1380
caactcgtag acggatggcg aaccgtccac gtgtccctaa ccaaattgct ggaacgggac 1440
ggtacctttg tacttcctcg ctctttgacc ttattacgtc tcgctgagca tcttaagcca 1500
cggggagtac ggcacttcta cctgcagatg ttagacccac tagtctggcc gcaagaggaa 1560
tttcgagagc gaccgcatgg tcaacgggtg tagcttcctt gcttcatggt ggacttcagt 1620
ccggtacatt gaacgctcca cccggacctc ttcaactttt actttccaga atgcatgtgt 1680
tacacactgt tctggttcaa gtgtaccttc tcccgggggt gtctatcgcc ggtgctatga 1740
caccactacc tccactggaa aagaccttgt tttgggacgt cttatgggca cgcccgacat 1800
cgagtgccta gagggctaca gttacaacga tacgactaat gtggattggg atggtagctc 1860
ttattgccac caccaaaata actctacgtc gaaggcggtc cgctattgta gtagatgcac 1920
ccgcttgaga gaatggtcac caaagtcttt ccctcaagtt aacccgccca gaaggttttt 1980
tgcttcttcc cttagcttgc taactgccaa tagccgctcg tgcgtaccct aaaaccaagg 2040
cgtcccccta aggacagaag ataaccattc cgtgacgtat ggcacgaccc cccgcgtaag 2100
ttaagataaa agcccccgca ccccaaggac ggatttgagg acgaccctca tcgggaccgg 2160
accaaccctg acttatacgc cttaggctgc tacaggtaca gtaaggagaa ccggccgcac 2220
gaacatgacc ggtactgtga cccgcaaccg cggctgtgac ccacacggta tctgtagtcg 2280
gccgtt 2286
<210> 55
<211> 727
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 55
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Ser Ser Lys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val Met
35 40 45
Ile Gly Met Leu Ala Cys Val Gly Ala Ala Thr Val Arg Lys Glu Arg
50 55 60
Asp Gly Ser Thr Val Ile Arg Ala Glu Gly Lys Asp Ala Ala Thr Gln
65 70 75 80
Val Arg Val Glu Asn Gly Thr Cys Val Ile Leu Ala Thr Asp Met Gly
85 90 95
Ser Trp Cys Asp Asp Ser Leu Ser Tyr Glu Cys Val Thr Ile Asp Gln
100 105 110
Gly Glu Glu Pro Val Asp Val Asp Cys Phe Cys Arg Asn Val Asp Gly
115 120 125
Val Tyr Leu Glu Tyr Gly Arg Cys Gly Lys Gln Glu Gly Ser Arg Thr
130 135 140
Arg Arg Ser Val Leu Ile Pro Ser His Ala Gln Gly Glu Leu Thr Gly
145 150 155 160
Arg Gly His Lys Trp Leu Glu Gly Asp Ser Leu Arg Thr His Leu Thr
165 170 175
Arg Val Glu Gly Trp Val Trp Lys Asn Arg Leu Leu Ala Leu Ala Met
180 185 190
Val Thr Val Val Trp Leu Thr Leu Glu Ser Val Val Thr Arg Val Ala
195 200 205
Val Leu Val Val Leu Leu Cys Leu Ala Pro Val Tyr Ala Ser Arg Cys
210 215 220
Thr His Leu Glu Asn Arg Asp Phe Val Thr Gly Thr Gln Gly Thr Thr
225 230 235 240
Arg Val Thr Leu Val Leu Glu Leu Gly Gly Cys Val Thr Ile Thr Ala
245 250 255
Glu Gly Lys Pro Ser Met Asp Val Trp Leu Asp Ala Ile Tyr Gln Glu
260 265 270
Asn Pro Ala Gln Thr Arg Glu Tyr Cys Leu His Ala Lys Leu Ser Asp
275 280 285
Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met Gly Pro Ala Thr Leu Ala
290 295 300
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325 330 335
Cys Val Lys Ala Ala Cys Glu Ala Lys Lys Lys Ala Thr Gly His Val
340 345 350
Tyr Asp Ala Asn Lys Ile Val Tyr Thr Val Lys Val Glu Pro His Thr
355 360 365
Gly Asp Tyr Val Ala Ala Asn Glu Thr His Ser Gly Arg Lys Thr Ala
370 375 380
Ser Phe Thr Val Ser Ser Glu Lys Thr Ile Leu Thr Met Gly Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Asp Val Ser Leu Leu Cys Arg Val Ala Ser Gly Val Asp Leu Ala
405 410 415
Gln Thr Val Ile Leu Glu Leu Asp Lys Thr Val Glu His Leu Pro Thr
420 425 430
Ala Trp Gln Val His Arg Asp Trp Phe Asn Asp Leu Ala Leu Pro Trp
435 440 445
Lys His Glu Gly Ala Arg Asn Trp Asn Asn Ala Glu Arg Leu Val Glu
450 455 460
Phe Gly Ala Pro Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn Leu Gly Asp Gln
465 470 475 480
Thr Gly Val Leu Leu Lys Ala Leu Ala Gly Val Pro Val Ala His Ile
485 490 495
Glu Gly Thr Lys Tyr His Leu Lys Ser Gly His Val Thr Cys Glu Val
500 505 510
Gly Leu Glu Lys Leu Lys Met Lys Gly Leu Thr Tyr Thr Met Cys Asp
515 520 525
Lys Thr Lys Phe Thr Trp Lys Arg Ala Pro Thr Asp Ser Gly His Asp
530 535 540
Thr Val Val Met Glu Val Thr Phe Ser Gly Thr Lys Pro Cys Arg Ile
545 550 555 560
Pro Val Arg Ala Val Ala His Gly Ser Pro Asp Val Asn Val Ala Met
565 570 575
Leu Ile Thr Pro Asn Pro Thr Ile Glu Asn Asn Gly Gly Gly Phe Ile
580 585 590
Glu Met Gln Leu Pro Pro Gly Asp Asn Ile Ile Tyr Val Gly Glu Leu
595 600 605
Ser Tyr Gln Trp Phe Gln Lys Gly Ser Ser Ile Gly Arg Val Phe Gln
610 615 620
Lys Thr Lys Lys Gly Ile Glu Arg Leu Thr Val Ile Gly Glu His Ala
625 630 635 640
Trp Asp Phe Gly Ser Ala Gly Gly Phe Leu Ser Ser Ile Gly Lys Ala
645 650 655
Leu His Thr Val Leu Gly Gly Ala Phe Asn Ser Ile Phe Gly Gly Val
660 665 670
Gly Phe Leu Pro Lys Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Ala Trp Leu Gly
675 680 685
Leu Asn Met Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Ser Phe Leu Leu Ala Gly
690 695 700
Val Leu Val Leu Ala Met Thr Leu Gly Val Gly Ala Asp Thr Gly Cys
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Ala Ile Asp Ile Ser Arg Gln
725
<210> 56
<211> 2280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 56
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
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<211> 2280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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<211> 635
<212> PRT
<213> Artificial Seqeunce
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 58
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Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Gln
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Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val Ile Val Pro Gln Ala
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Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp Val Ala
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Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Gly Gln Leu Val
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Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile
385 390 395 400
Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His
405 410 415
Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp Gly Asn
420 425 430
Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His Met Glu
435 440 445
Leu Leu Val Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala Asp Pro
450 455 460
Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val
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Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala
500 505 510
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<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 59
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<210> 60
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 61
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Gln
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Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val Ile Val Pro Gln Ala
35 40 45
Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu Cys Phe Gly Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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450 455 460
Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val
465 470 475 480
His Leu Pro Asp Val His Glu Arg Ile Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu
485 490 495
Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala
500 505 510
Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Trp Arg Arg Val Asn Arg
515 520 525
Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser
530 535 540
Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser Tyr Lys
545 550 555 560
Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
565 570 575
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val
580 585 590
Met Ile Gly Leu Ile Ala Cys Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn Phe
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Ile Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg Ala
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Met Asp Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro
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<211> 4000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 62
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<210> 63
<211> 4000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 63
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acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240
gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300
tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagtttcaa gaaggaacta 360
gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaagc aaaagaagcg agggggcaag 420
actggtatag ctgtgatcgt tcctcaggct cttttgtttg tacccttgct ggtatttccc 480
ctttgctttg gtaaatttcc tatctatacc atccctgata agctcgggcc ttggagtccc 540
attgatattc accatttgag ctgcccaaac aacctcgtcg ttgaggatga agggtgcact 600
aatctttctg gattttccta catggagttg aaagtgggct atatttcagc cattaagatg 660
aacggcttta cttgtacagg agtcgtgacc gaagccgaga catatacaaa tttcgtggga 720
tacgtcacca ccaccttcaa gagaaaacac ttccgcccaa cgcctgacgc ttgtcgggcc 780
gcttacaact ggaagatggc aggagatcct cgatatgaag aatctctgca caacccgtat 840
cctgattacc attggctgcg gacagtcaag actaccaagg agagtctggt cattatatca 900
ccaagcgtgg ccgatcttga tccttatgat agatccctgc acagtagggt ttttcctggc 960
gggaattgta gcggtgttgc agtatcaagt acctactgct ccactaacca cgactacact 1020
atatggatgc ctgagaaccc tcgactcggt atgagttgcg acatttttac gaactcacgg 1080
ggcaagcggg catctaaggg gtctgaaaca tgcgggtttg ttgatgagcg ggggttgtat 1140
aaatctctta aaggcgcctg taagctgaaa ctctgtggcg tactggggct gcgcctgatg 1200
gacggcacat gggtggctat gcagacaagc aatgaaacaa agtggtgtcc ccctggtcag 1260
ctggttaatc tgcacgactt taggtctgac gaaatcgagc accttgtggt ggaggaactg 1320
gtgaagaaac gcgaagagtg cctggacgca cttgagagta ttatgaccac caaatccgtt 1380
tccttcagaa gactgagcca cctgcgaaag ctggtgccag ggttcgggaa ggcttatact 1440
attttcaaca agactcttat ggaggcggat gcccattata agtcagttag gacttggaat 1500
gagataattc cctccaaagg atgtctgaga gtcggtggga gatgccaccc ccatgtcaat 1560
ggggtgttct ttaacggaat catcctggga cctgacggga acgtgctgat tcccgagatg 1620
caatcttccc ttctgcagca acacatggaa ctcctggtgt cttcagtgat acccctgatg 1680
cacccactgg ccgaccccag cactgtgttc aaaaatggcg atgaggccga agactttgtg 1740
gaagttcacc tgcccgatgt acacgaaagg atatctggag tagacctggg ccttcctaat 1800
tggggtaagt acgtgctcct gagtgcgggt gccttgaccg ctttgatgct gatcattttt 1860
ctgatgacct gctggcggag ggtgaatcgc tccgagccga cacagcacaa tctcagaggg 1920
acaggccggg aagtaagtgt gactccgcaa tctggcaaga ttattagtag ttgggagagt 1980
tacaagtctg gaggagagac tgggttgaat tttgatctgc tcaaacttgc aggcgatgta 2040
gaatcaaatc ctggacccgc ccgggacagg tccatagctc tcacgtttct cgcagttgga 2100
ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg cacgctgaca ctgggtgtgc catagacatc 2160
agccggcaag agctgagatg tggaagtgga gtgttcatac 2200
<210> 66
<211> 2200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 66
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattct cccgatacaa ctcggactag ctgccgttcc ccggttatgc taaacacaac 240
cgagagaacc gcaagaagtc caagtgtcgt taacgaggct gggctcgtca cgacctagct 300
acctctccac acttgtttgt ttgtcgctac tttgtggaag actcaaagtt cttccttgat 360
ccctggaact ggtcacgata gttagccgcc tcgagtttcg ttttcttcgc tcccccgttc 420
tgaccatatc gacactagca aggagtccga gaaaacaaac atgggaacga ccataaaggg 480
gaaacgaaac catttaaagg atagatatgg tagggactat tcgagcccgg aacctcaggg 540
taactataag tggtaaactc gacgggtttg ttggagcagc aactcctact tcccacgtga 600
ttagaaagac ctaaaaggat gtacctcaac tttcacccga tataaagtcg gtaattctac 660
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ggactaatgg taaccgacgc ctgtcagttc tgatggttcc tctcagacca gtaatatagt 900
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cccttaacat cgccacaacg tcatagttca tggatgacga ggtgattggt gctgatgtga 1020
tatacctacg gactcttggg agctgagcca tactcaacgc tgtaaaaatg cttgagtgcc 1080
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ctgccgtgta cccaccgata cgtctgttcg ttactttgtt tcaccacagg gggaccagtc 1260
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ctctattaag ggaggtttcc tacagactct cagccaccct ctacggtggg ggtacagtta 1560
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cttcaagtgg acgggctaca tgtgctttcc tatagacctc atctggaccc ggaaggatta 1800
accccattca tgcacgagga ctcacgccca cggaactggc gaaactacga ctagtaaaaa 1860
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<211> 868
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 67
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Ala Met Leu Ser Leu Ile Asp Gly Lys Gly Pro Ile Arg Phe Val Leu
35 40 45
Ala Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala Ile Ala Pro Thr Arg Ala
50 55 60
Val Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gln Thr Ala Met Lys His
65 70 75 80
Leu Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala Ile Asn
85 90 95
Arg Arg Ser Ser Lys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala
100 105 110
Val Met Ile Gly Leu Ile Ala Ser Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn
115 120 125
Phe Gln Gly Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp
130 135 140
Val Ile Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg
145 150 155 160
Ala Met Asp Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys
165 170 175
Pro Val Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys
180 185 190
Thr Lys Ser Ala Val Tyr Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg
195 200 205
His Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu
210 215 220
Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala
225 230 235 240
Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly
245 250 255
Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr
260 265 270
Met Gln Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala
275 280 285
Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly
290 295 300
Val Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys
305 310 315 320
Val Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met
325 330 335
Asn Met Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu
340 345 350
Ala Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Ala Met Gly
355 360 365
Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln
370 375 380
Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
385 390 395 400
Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile
405 410 415
Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe
420 425 430
Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln
435 440 445
Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro
450 455 460
Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys
465 470 475 480
Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val
485 490 495
Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn
500 505 510
Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr
515 520 525
Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala
530 535 540
Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile
545 550 555 560
Pro Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu
565 570 575
Lys Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr
580 585 590
Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr
595 600 605
Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly
610 615 620
Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr
625 630 635 640
Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr
645 650 655
Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser
660 665 670
Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His
675 680 685
Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly
690 695 700
Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser
705 710 715 720
Val Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe
725 730 735
Gly Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln
740 745 750
Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp
755 760 765
Arg Ser Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe
770 775 780
Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly Ile His Arg Gly Pro Ala
785 790 795 800
Thr Arg Thr Thr Thr Glu Ser Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys
805 810 815
Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Gln Thr Asp Ser Gly Cys
820 825 830
Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Gln Arg His Asp Glu Lys Thr Leu
835 840 845
Val Gln Ser Gln Val Asn Ala Tyr Asn Ala Asp Met Ile Asp Pro Phe
850 855 860
Gln Leu Gly Leu
865
<210> 68
<211> 2700
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 68
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gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaaac aaaagaaaag aggaggaaag 420
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<211> 2700
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 69
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cccttccgac aggtagttca caagcctcct cgtaaggcga gtgacaagcc tccgtacagg 2340
acctattgcg ttcctaacga cccccgagag gacaacacct acccgtagtt acgagcactg 2400
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cacgtcagtg ttcacttacg aatattacga ctatactaac tgggaaaagt caacccggaa 2700
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 70
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Ala Met Leu Ser Leu Ile Asp Gly Lys Gly Pro Ile Arg Phe Val Leu
35 40 45
Ala Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala Ile Ala Pro Thr Arg Ala
50 55 60
Val Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gln Thr Ala Met Lys His
65 70 75 80
Leu Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala Ile Asn
85 90 95
Arg Arg Ser Ser Lys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Glu Leu Leu Ile Leu
100 105 110
Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr Ala Val Thr Phe Cys Phe
115 120 125
Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser
130 135 140
Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr
145 150 155 160
Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn
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Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr
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Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys
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Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser
245 250 255
Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys
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Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr
290 295 300
Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile
305 310 315 320
Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu
325 330 335
Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro
340 345 350
Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn
355 360 365
Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val
370 375 380
Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu
385 390 395 400
Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp
405 410 415
Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr
420 425 430
Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr
435 440 445
Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys
450 455 460
Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr
465 470 475 480
Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys
485 490 495
Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val
500 505 510
Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys
515 520 525
Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly
530 535 540
Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp Thr Val Ser Val Gly Asn
545 550 555 560
Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys
565 570 575
Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp
580 585 590
Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser
595 600 605
Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala
610 615 620
Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile
625 630 635 640
Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys
645 650 655
Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly
660 665 670
Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
675 680 685
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala
690 695 700
Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser Val Asn
705 710 715 720
Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Ser Arg Gln
725 730
<210> 71
<211> 2298
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 71
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
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ggacttaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240
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tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagtttcaa gaaggaacta 360
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ttgctaatcc tcaaagcaaa tgcaattacc acaatcctca ctgcagtcac attttgtttt 480
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ggctatctta gtgctctgag aactggttgg tataccagtg ttataactat agaattaagt 600
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ttagataaat ataaaaatgc tgtaacagaa ttgcagttgc tcatgcaaag cacaccacca 720
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ttgttaccta ttgtgaacaa gcaaagctgc agcatatcaa atatagaaac tgtgatagag 1080
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gtaactacac ctgtaagcac ttacatgtta actaatagtg aattattgtc attaatcaat 1200
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<210> 72
<211> 2298
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 72
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<210> 73
<211> 667
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 73
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1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Gln
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Lys Lys Arg Gly Gly Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr
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Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu
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Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val
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Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu
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Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu
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245 250 255
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Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu
275 280 285
Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn
290 295 300
Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln
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Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val
325 330 335
Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu
340 345 350
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355 360 365
Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser
370 375 380
Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg
385 390 395 400
Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn
405 410 415
Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met
420 425 430
Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala
435 440 445
Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn
450 455 460
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Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn
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Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser
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Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro
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Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly
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Cys Ala Ile Asp Ile Ser Arg Gln Glu Leu Arg
660 665
<210> 74
<211> 2097
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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<210> 75
<211> 2097
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 75
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aatgtattac atttacgacc atttaggtgg tgtttatagt actattgatg atattaatat 1800
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 76
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Gln
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Lys Lys Arg Gly Gly Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr
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Thr Ile Leu Thr Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile
50 55 60
Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr
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Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln
305 310 315 320
Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val
325 330 335
Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu
340 345 350
His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile
355 360 365
Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser
370 375 380
Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg
385 390 395 400
Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn
405 410 415
Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met
420 425 430
Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala
435 440 445
Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn
450 455 460
Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn
465 470 475 480
Lys Gly Met Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn
485 490 495
Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn
500 505 510
Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile
515 520 525
Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys
530 535 540
Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn
545 550 555 560
Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser
565 570 575
Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro
580 585 590
Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe
595 600 605
Ser Asn Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
610 615 620
Pro Gly Pro Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val Met Ile Gly Leu Ile
625 630 635 640
Ala Cys Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Val Met
645 650 655
Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp Val Ile Thr Ile Pro Thr
660 665 670
Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg Ala Met Asp Val Gly Tyr
675 680 685
Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Val Leu Ser Ala Gly
690 695 700
Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Thr Lys Ser Ala Val Tyr
705 710 715 720
Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg His Ser Arg Arg Ser Arg
725 730 735
Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn Lys
740 745 750
Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys
755 760 765
Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ala
770 775 780
Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val Val Phe
785 790 795 800
Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu
805 810 815
Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser Gly Ala Thr Trp
820 825 830
Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr Ile Met Ser Lys
835 840 845
Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met Glu Ala Ala Asn
850 855 860
Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr Val Ser Asp Leu
865 870 875 880
Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Ala Met Gly Glu Ala His Asn Asp Lys
885 890 895
Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val Val Asp Arg Gly
900 905 910
Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys
915 920 925
Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Leu Lys
930 935 940
Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly Pro Thr Thr
945 950 955 960
Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly Ala Thr Gln Ala
965 970 975
Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu
980 985 990
Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile
995 1000 1005
Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr Lys Thr Phe
1010 1015 1020
Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro Trp Ser
1025 1030 1035
Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met Glu
1040 1045 1050
Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly
1055 1060 1065
Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro
1070 1075 1080
Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu
1085 1090 1095
Lys Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr
1100 1105 1110
Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala
1115 1120 1125
Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly
1130 1135 1140
Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
1145 1150 1155
Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe
1160 1165 1170
Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu
1175 1180 1185
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln
1190 1195 1200
Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys
1205 1210 1215
Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu
1220 1225 1230
Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe Thr
1235 1240 1245
Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg
1250 1255 1260
Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Leu Gly
1265 1270 1275
Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile
1280 1285 1290
Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser
1295 1300 1305
Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Ser Arg
1310 1315 1320
Gln Glu Leu Arg
1325
<210> 77
<211> 4100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 77
gatcctaata cgactcacta tagagtagtt cgcctgtgtg agctgacaaa cttagtagtg 60
tttgtgagga ttaacaacaa ttaacacagt gcgagctgtt tcttagcacg aagatctcga 120
tgtctaagaa accaggaggg cccggcaaga gccgggctgt caatatgcta aaacgcggaa 180
tgccccgcgt gttgtccttg attggactta agcaaaagaa gcgagggggc gagttgctaa 240
tcctcaaagc aaatgcaatt accacaatcc tcactgcagt cacattttgt tttgcttctg 300
gtcaaaacat cactgaagaa ttttatcaat caacatgcag tgcagttagc aaaggctatc 360
ttagtgctct gagaactggt tggtatacca gtgttataac tatagaatta agtaatatca 420
aggaaaataa gtgtaatgga acagatgcta aggtaaaatt gataaaacaa gaattagata 480
aatataaaaa tgctgtaaca gaattgcagt tgctcatgca aagcacacca ccaacaaaca 540
atcgagccag aagagaacta ccaaggttta tgaattatac actcaacaat gccaaaaaaa 600
ccaatgtaac attaagcaag aaaaggaaaa gaagatttct tggttttttg ttaggtgttg 660
gatctgcaat cgccagtggc gttgctgtat ctaaggtcct gcacctagaa ggggaagtga 720
acaagatcaa aagtgctcta ctatccacaa acaaggctgt agtcagctta tcaaatggag 780
ttagtgtctt aaccagcaaa gtgttagacc tcaaaaacta tatagataaa caattgttac 840
ctattgtgaa caagcaaagc tgcagcatat caaatataga aactgtgata gagttccaac 900
aaaagaacaa cagactacta gagattacca gggaatttag tgttaatgca ggtgtaacta 960
cacctgtaag cacttacatg ttaactaata gtgaattatt gtcattaatc aatgatatgc 1020
ctataacaaa tgatcagaaa aagttaatgt ccaacaatgt tcaaatagtt agacagcaaa 1080
gttactctat catgtccata ataaaagagg aagtcttagc atatgtagta caattaccac 1140
tatatggtgt tatagataca ccctgttgga aactacacac atcccctcta tgtacaacca 1200
acacaaaaga agggtccaac atctgtttaa caagaactga cagaggatgg tactgtgaca 1260
atgcaggatc agtatctttc ttcccacaag ctgaaacatg taaagttcaa tcaaatcgag 1320
tattttgtga cacaatgaac agtttaacat taccaagtga aataaatctc tgcaatgttg 1380
acatattcaa ccccaaatat gattgtaaaa ttatgacttc aaaaacagat gtaagcagct 1440
ccgttatcac atctctagga gccattgtgt catgctatgg caaaactaaa tgtacagcat 1500
ccaataaaaa tcgtggaatc ataaagacat tttctaacgg gtgcgattat gtatcaaata 1560
aagggatgga cactgtgtct gtaggtaaca cattatatta tgtaaataag caagaaggta 1620
aaagtctcta tgtaaaaggt gaaccaataa taaatttcta tgacccatta gtattcccct 1680
ctgatgaatt tgatgcatca atatctcaag tcaacgagaa gattaaccag agcctagcat 1740
ttattcgtaa atccgatgaa ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc accacaaata 1800
tcatgataac tactataatt atagtgatta tagtaatatt gttatcatta attgctgttg 1860
gactgctctt atactgtaag gccagaagca caccagtcac actaagcaaa gatcaactga 1920
gtggtataaa taatattgca tttagtaaca attttgatct gctcaaactt gcaggcgatg 1980
tagaatcaaa tcctggaccc ggaggaaaga ccggtattgc agtcatgatt ggcctgatcg 2040
cctgcgtagg agcagttacc ctctctaact tccaagggaa ggtgatgatg acggtaaatg 2100
ctactgacgt cacagatgtc atcacgattc caacagctgc tggaaagaac ctatgcattg 2160
tcagagcaat ggatgtggga tacatgtgcg atgatactat cacttatgaa tgcccagtgc 2220
tgtcggctgg taatgatcca gaagacatcg actgttggtg cacaaagtca gcagtctacg 2280
tcaggtatgg aagatgcacc aagacacgcc actcaagacg cagtcggagg tcactgacag 2340
tgcagacaca cggagaaagc actctagcga acaagaaggg ggcttggatg gacagcacca 2400
aggccacaag gtatttggta aaaacagaat catggatctt gaggaaccct ggatatgccc 2460
tggtggcagc cgtcattggt tggatgcttg ggagcaacac catgcagaga gttgtgtttg 2520
tcgtgctatt gcttttggtg gccccagctt acagctttaa ctgccttgga atgagcaaca 2580
gagacttctt ggaaggagtg tctggagcaa catgggtgga tttggttctc gaaggcgaca 2640
gctgcgtgac tatcatgtct aaggacaagc ctaccatcga tgtgaagatg atgaatatgg 2700
aggcggccaa cctggcagag gtccgcagtt attgctattt ggctaccgtc agcgatctct 2760
ccaccaaagc tgcgtgcccg gccatgggag aagctcacaa tgacaaacgt gctgacccag 2820
cttttgtgtg cagacaagga gtggtggaca ggggctgggg caacggctgc ggactatttg 2880
gcaaaggaag cattgacaca tgcgccaaat ttgcctgctc taccaaggca ataggaagaa 2940
ccattttgaa agagaatatc aagtacgaag tggccatttt tgtccatgga ccaactactg 3000
tggagtcgca cggaaactac tccacacagg ttggagccac tcaggcaggg agattcagca 3060
tcactcctgc ggcgccttca tacacactaa agcttggaga atatggagag gtgacagtgg 3120
actgtgaacc acggtcaggg attgacacca atgcatacta cgtgatgact gttggaacaa 3180
agacgttctt ggtccatcgt gagtggttca tggacctcaa cctcccttgg agcagtgctg 3240
gaagtactgt gtggaggaac agagagacgt taatggagtt tgaggaacca cacgccacga 3300
agcagtctgt gatagcattg ggctcacaag agggagctct gcatcaagct ttggctggag 3360
ccattcctgt ggaattttca agcaacactg tcaagttgac gtcgggtcat ttgaagtgta 3420
gagtgaagat ggaaaaattg cagttgaagg gaacaaccta tggcgtctgt tcaaaggctt 3480
tcaagtttct tgggactccc gcagacacag gtcacggcac tgtggtgttg gaattgcagt 3540
acactggcac ggatggacct tgcaaagttc ctatctcgtc agtggcttca ttgaacgacc 3600
taacgccagt gggcagattg gtcactgtca acccttttgt ttcagtggcc acggccaacg 3660
ctaaggtcct gattgaattg gaaccaccct ttggagactc atacatagtg gtgggcagag 3720
gagaacaaca gatcaatcac cactggcaca agtctggaag cagcattggc aaagccttta 3780
caaccaccct caaaggagcg cagagactag ccgctctagg agacacagct tgggactttg 3840
gatcagttgg aggggtgttc acctcagttg ggaaggctgt ccatcaagtg ttcggaggag 3900
cattccgctc actgttcgga ggcatgtcct ggataacgca aggattgctg ggggctctcc 3960
tgttgtggat gggcatcaat gctcgtgaca ggtccatagc tctcacgttt ctcgcagttg 4020
gaggagttct gctcttcctc tccgtgaacg tgcacgctga cactgggtgt gccatagaca 4080
tcagccggca agagctgaga 4100
<210> 78
<211> 4100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 78
ctaggattat gctgagtgat atctcatcaa gcggacacac tcgactgttt gaatcatcac 60
aaacactcct aattgttgtt aattgtgtca cgctcgacaa agaatcgtgc ttctagagct 120
acagattctt tggtcctccc gggccgttct cggcccgaca gttatacgat tttgcgcctt 180
acggggcgca caacaggaac taacctgaat tcgttttctt cgctcccccg ctcaacgatt 240
aggagtttcg tttacgttaa tggtgttagg agtgacgtca gtgtaaaaca aaacgaagac 300
cagttttgta gtgacttctt aaaatagtta gttgtacgtc acgtcaatcg tttccgatag 360
aatcacgaga ctcttgacca accatatggt cacaatattg atatcttaat tcattatagt 420
tccttttatt cacattacct tgtctacgat tccattttaa ctattttgtt cttaatctat 480
ttatattttt acgacattgt cttaacgtca acgagtacgt ttcgtgtggt ggttgtttgt 540
tagctcggtc ttctcttgat ggttccaaat acttaatatg tgagttgtta cggttttttt 600
ggttacattg taattcgttc ttttcctttt cttctaaaga accaaaaaac aatccacaac 660
ctagacgtta gcggtcaccg caacgacata gattccagga cgtggatctt ccccttcact 720
tgttctagtt ttcacgagat gataggtgtt tgttccgaca tcagtcgaat agtttacctc 780
aatcacagaa ttggtcgttt cacaatctgg agtttttgat atatctattt gttaacaatg 840
gataacactt gttcgtttcg acgtcgtata gtttatatct ttgacactat ctcaaggttg 900
ttttcttgtt gtctgatgat ctctaatggt cccttaaatc acaattacgt ccacattgat 960
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caatgagata gtacaggtat tattttctcc ttcagaatcg tatacatcat gttaatggtg 1140
atataccaca atatctatgt gggacaacct ttgatgtgtg taggggagat acatgttggt 1200
tgtgttttct tcccaggttg tagacaaatt gttcttgact gtctcctacc atgacactgt 1260
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ataaaacact gtgttacttg tcaaattgta atggttcact ttatttagag acgttacaac 1380
tgtataagtt ggggtttata ctaacatttt aatactgaag tttttgtcta cattcgtcga 1440
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gactacttaa actacgtagt tatagagttc agttgctctt ctaattggtc tcggatcgta 1740
aataagcatt taggctactt aataatgtat tacatttacg accatttagg tggtgtttat 1800
agtactattg atgatattaa tatcactaat atcattataa caatagtaat taacgacaac 1860
ctgacgagaa tatgacattc cggtcttcgt gtggtcagtg tgattcgttt ctagttgact 1920
caccatattt attataacgt aaatcattgt taaaactaga cgagtttgaa cgtccgctac 1980
atcttagttt aggacctggg cctcctttct ggccataacg tcagtactaa ccggactagc 2040
ggacgcatcc tcgtcaatgg gagagattga aggttccctt ccactactac tgccatttac 2100
gatgactgca gtgtctacag tagtgctaag gttgtcgacg acctttcttg gatacgtaac 2160
agtctcgtta cctacaccct atgtacacgc tactatgata gtgaatactt acgggtcacg 2220
acagccgacc attactaggt cttctgtagc tgacaaccac gtgtttcagt cgtcagatgc 2280
agtccatacc ttctacgtgg ttctgtgcgg tgagttctgc gtcagcctcc agtgactgtc 2340
acgtctgtgt gcctctttcg tgagatcgct tgttcttccc ccgaacctac ctgtcgtggt 2400
tccggtgttc cataaaccat ttttgtctta gtacctagaa ctccttggga cctatacggg 2460
accaccgtcg gcagtaacca acctacgaac cctcgttgtg gtacgtctct caacacaaac 2520
agcacgataa cgaaaaccac cggggtcgaa tgtcgaaatt gacggaacct tactcgttgt 2580
ctctgaagaa ccttcctcac agacctcgtt gtacccacct aaaccaagag cttccgctgt 2640
cgacgcactg atagtacaga ttcctgttcg gatggtagct acacttctac tacttatacc 2700
tccgccggtt ggaccgtctc caggcgtcaa taacgataaa ccgatggcag tcgctagaga 2760
ggtggtttcg acgcacgggc cggtaccctc ttcgagtgtt actgtttgca cgactgggtc 2820
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cgtttccttc gtaactgtgt acgcggttta aacggacgag atggttccgt tatccttctt 2940
ggtaaaactt tctcttatag ttcatgcttc accggtaaaa acaggtacct ggttgatgac 3000
acctcagcgt gcctttgatg aggtgtgtcc aacctcggtg agtccgtccc tctaagtcgt 3060
agtgaggacg ccgcggaagt atgtgtgatt tcgaacctct tatacctctc cactgtcacc 3120
tgacacttgg tgccagtccc taactgtggt tacgtatgat gcactactga caaccttgtt 3180
tctgcaagaa ccaggtagca ctcaccaagt acctggagtt ggagggaacc tcgtcacgac 3240
cttcatgaca cacctccttg tctctctgca attacctcaa actccttggt gtgcggtgct 3300
tcgtcagaca ctatcgtaac ccgagtgttc tccctcgaga cgtagttcga aaccgacctc 3360
ggtaaggaca ccttaaaagt tcgttgtgac agttcaactg cagcccagta aacttcacat 3420
ctcacttcta cctttttaac gtcaacttcc cttgttggat accgcagaca agtttccgaa 3480
agttcaaaga accctgaggg cgtctgtgtc cagtgccgtg acaccacaac cttaacgtca 3540
tgtgaccgtg cctacctgga acgtttcaag gatagagcag tcaccgaagt aacttgctgg 3600
attgcggtca cccgtctaac cagtgacagt tgggaaaaca aagtcaccgg tgccggttgc 3660
gattccagga ctaacttaac cttggtggga aacctctgag tatgtatcac cacccgtctc 3720
ctcttgttgt ctagttagtg gtgaccgtgt tcagaccttc gtcgtaaccg tttcggaaat 3780
gttggtggga gtttcctcgc gtctctgatc ggcgagatcc tctgtgtcga accctgaaac 3840
ctagtcaacc tccccacaag tggagtcaac ccttccgaca ggtagttcac aagcctcctc 3900
gtaaggcgag tgacaagcct ccgtacagga cctattgcgt tcctaacgac ccccgagagg 3960
acaacaccta cccgtagtta cgagcactgt ccaggtatcg agagtgcaaa gagcgtcaac 4020
ctcctcaaga cgagaaggag aggcacttgc acgtgcgact gtgacccaca cggtatctgt 4080
agtcggccgt tctcgactct 4100

Claims (50)

  1. 웨스트 나일 바이러스 지놈을 포함하는 복제-결손성 가감염성(pseudoinfectious) 플라비바이러스로서, 상기 웨스트 나일 바이러스 지놈은 (i) 캡시드(C) 단백질의 26 내지 100 번째 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 또는 그 이상의 결손; (ii) 전-막(prM) 단백질, 엔벨럽(E) 단백질, 또는 prM 단백질 및 E 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 결손; 및 (iii) 상기 prM 단백질, E 단백질, 또는 prM 단백질 및 E 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 결손을 대체하거나 이와 조합하여 삽입되는 이종 면역원을 암호화하는 서열을 포함하고, 상기 이종 면역원은 광견병 바이러스(rabies virus), 독감 바이러스(influenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV:　respiratory syncytial virus) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV:　human immunodeficiency virus)로 구성된 군으로부터 선택된 병원체 유래인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 이종 면역원은 광견병 바이러스 G 단백질인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 이종 면역원은 M2, 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)로 구성된 군으로부터 선택된 독감 바이러스 항원, 또는 이들의 면역원성 조각(immunogenic fragment)인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 이종 면역원은 gag, env, tat, nef, gp120, 및 gp160으로 구성된 군으로부터 선택되는 코돈-최적화 HIV 단백질 또는 이들의 면역원성 조각(immunogenic fragment)인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 이종 면역원은 RSV F 단백질 또는 이의 면역원성 조각인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스는 복수의 이종 면역원을 포함하는 것인 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 지놈은 상기 지놈의 플라비바이러스와 같거나 또는 다른 플라비바이러스로부터 유래한 전-막(prM) 및 엔벨럽(E) 서열을 포함한 입자 내에서 패키징 된 것을 특징으로 하는 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 복제-결손성 가감염성 플라비바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 환자에게 투여하는 경우 상기 환자의 플라비바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 삭제
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