CN112334576B - 黄病毒的成熟病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种修改和表达的病毒样颗粒。具体地，将药学上有效剂量的病毒样颗粒施用于哺乳动物时，所述病毒样颗粒能够在哺乳动物中引发免疫应答。所述病毒样颗粒包括黄病毒的M和E结构蛋白的修改形式。此外，所述病毒样颗粒包含基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的序列相对应的氨基酸序列，其中保藏的和内部的位于His的多个位置处的M和E蛋白被不带电荷的残基所取代，且引入其它增强分泌的取代物。

Description

黄病毒的成熟病毒样颗粒

技术领域

本公开涉及结合有一种或多种修饰形式的黄病毒的病毒样颗粒(VLP)或病毒结构蛋白，一种或多种修饰形式在转染细胞中的表达实现了期望的结果。在几个实施方式中公开的VLP优选是黄病毒的完全成熟的VLP。更重要的是，在将药学上有效剂量的表达的VLP施用给哺乳动物后，表达的VLP能够在哺乳动物例如人类受试者中引发免疫应答。本公开还包括含有表达的VLP的药物或疫苗组合物，表达的VLP具有或不具有进一步的修饰，这些进一步的修饰适用于引发受试者对黄病毒的主动免疫。

背景技术

黄病毒包括70多种不同的病毒，其中许多病毒是经节肢动物传播的，并通过蚊子或虱子传播。黄病毒是黄病毒科病毒的一个属。该属包括西尼罗河病毒(WNV)、登革热病毒(DENV)、日本脑炎(JEV)、黄热病病毒(YFV)、寨卡病毒(ZikV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)和其他几种可能引起脑炎或出血性疾病的病毒。登革热是一种蚊传播的疾病，其由登革热病毒引起，已蔓延到大多数热带地区和许多亚热带地区。该疾病是由四种密切相关的病毒引起的：登革热病毒1型(DENV-1)、登革热病毒2型(DENV-2)、登革热病毒3型(DENV-3)和登革热病毒4型(DENV-4)。尽管就全球疾病发病率而言，登革热病毒是最重要的黄病毒，但迄今为止，针对该病毒的疫苗的开发和使用受到了阻碍，这主要是因为与疫苗相关的不良事件的理论风险，这些理论风险包括，例如感染的免疫增强，以及需要同时引发对所有四种登革热血清型的长久保护性免疫

尽管在过去的几十年中为寻找有效的登革热疫苗而进行了大量的研究和开发努力，但是依然没有可靠的疫苗能够在被登革热病毒的所有四种血清型感染后预防登革热。Sanofi Padteur的疫苗在亚洲和拉丁美洲的IIb-III期近期试验表明，一种中等有效的疫苗无法对血清阴性志愿者所患的由DENV-2引起的疾病提供保护(Sabcharoen et al,2012；Capeding et al,2014；Villar et al,2014；Hadinegoro et al,2015)。迫切需要找到一种替代登革热疫苗候选物，该疫苗应能有效对抗DENV-2和其他血清型，并能安全地用于年幼的儿童和血清阴性的儿童。登革病毒样颗粒是潜在的候选疫苗，是通过在昆虫或哺乳动物细胞中表达两种病毒包膜糖蛋白prM和E产生的。这两种糖蛋白被合成为一种多聚蛋白，在特定位点被宿主蛋白酶切割。它们随后结合并组装成与天然病毒颗粒具有结构相似性的病毒样颗粒，尽管病毒样颗粒不包含内部核心结构或病毒基因组(Shang等人，2012)。随后，病毒样颗粒以与登革病毒感染细胞中病毒颗粒相同的方式从宿主细胞中输出，从而在分泌途径中经历翻译后修饰。由于登革热病毒样颗粒的产生并不依赖于主动病毒感染和病毒基因组的细胞内复制，因此可以多种方式修饰表达盒中使用的prM和E基因，以增强输出，细胞外水平和免疫原性的约束比感染的病毒颗粒的修饰的约束小。对病毒包膜蛋白、细胞内和细胞外病毒颗粒亚群的结构，不同类型病毒颗粒的抗原组成以及抗体对登革热病毒感染人群内的包膜蛋白的反应的最新了解对于提高登革热病毒样颗粒作为登革热疫苗的潜力来说是至关重要的。

众所周知，细胞外登革热病毒颗粒是具有不同成熟水平的颗粒的混合物(Junjhon等人，2010)。ER内腔中新组装的未成熟病毒颗粒包含等量的两种包膜糖蛋白，prM和E，它们作为刺突结合在一起，在颗粒表面上包含三对非共价连接的prM-E异二聚体(Zhang et al,2003；Li e al,2008)。在通过分泌途径输出颗粒的过程中，高尔基体的低pH环境诱导prM和E蛋白的构象发生变化(Yu et al,2008；Zheng et al,2014)，导致prM-E二聚体解离和重排的E形成E同源二聚体分子，并允许内切蛋白酶，弗林蛋白酶切割prM(Kuhn et al,2002；Yuet al,2008)。在pr-M连接处切割prM会产生一个99个残基的pr肽，该pr肽在低pH条件下与E二聚体非共价结合，而与膜相关的M蛋白与成熟颗粒中的E二聚体的底面非共价相互作用(Zhang et al,2013)。释放颗粒后，pr肽会从细胞外颗粒上解离，生成表面光滑且传感性增强的成熟颗粒。pr-M裂解连接处弗林蛋白酶识别位点中存在抑制裂解的酸性氨基酸残基，谷氨酸或天冬氨酸，导致prM裂解不完全，从而使得未成熟、部分成熟以及完全成熟的含有M的颗粒在细胞外室内混合(Junjhon et al,2008；2010)。部分成熟的颗粒包含与prM-E异二聚体的E-二聚体共存的E二聚体斑块(Plevka et al,2011；2014)。含有prM的未成熟和部分成熟的病毒颗粒的感染力比成熟的病毒颗粒小，但可以通过适当浓度的抗E抗体或抗prM抗体在体外增强含有prM的未成熟和部分成熟的病毒颗粒对FcRγ白细胞的感染力(Rodenhuis-Zybert et al,2010；Richter et al,2014)。

prM/M和E在未成熟颗粒与成熟颗粒中的排列差异与抗原性的变化有关。未成熟颗粒中的E蛋白(以及部分成熟颗粒的未成熟斑块)与prM结合，使得E分子的某些部分(例如与受体结合的EDIII域(Zhang et al,2003)可能无法随时使用。成熟后，E从prM上解离下来，并随后在成熟颗粒(以及部分成熟颗粒的成熟斑块)上形成E同二聚体，从而产生新的表位，该表位由同一二聚体中的两个E分子的相邻结构域形成以及由不同二聚体中的两个或更多个E分子的相邻结构域形成。依赖于E二聚体的四级结构的表位是强烈中和成熟颗粒的抗体的靶标(Lok，2016)。具体而言，最近描述的很好地保存在登革热病毒的血清型之间的依赖E二聚体的抗原(Dejniratisai et al,2015；Rouvinski et al,2015)可以诱导交叉反应中和抗体，该中和抗体可用于预防几种血清型登革热病毒共同传播的地区出现登革热。另一方面，在单体E蛋白上发现的离散表位(与prM结合的形式)倾向于隐藏在成熟颗粒上，导致较低的靶标利用率，这可能会降低这些抗体在中和成熟病毒颗粒中的活性(Lok，2016)。在尚未完全成熟的登革热病毒样颗粒上缺乏依赖于四级结构的表位，使得这这些颗粒用作疫苗候选物发挥的作用并没有很大。比较未进行或进行广泛(83％)prM裂解产生的VLP的免疫原性，结果显示，在小鼠中不含佐剂的情况下，高度成熟的病毒样颗粒可以更好地诱导病毒感染中和抗体(Suphatrakul et al,2015)。

此外，通过使用天然病毒核酸序列共表达两种包膜糖蛋白prM和E，可产生登革热病毒样颗粒(Shang et al,2012)。使用天然prM序列产生的登革病毒样颗粒保留了一定数量的prM(Purdy and Chang,2005；Konishi and Fujii,2002；Urakami et al,2017)，prM与未成熟和部分成熟的颗粒的表面上发现的prM-E异二聚体中的E结合。在登革病毒样颗粒的某些设计中，pr-M连接序列已被弗林蛋白酶修饰以消除prM裂解(Konishi et al,2001；Konishi and Fujii,2002；Yamaji,2014)，从而产生完全不成熟病毒样颗粒。用天然prM序列或消除裂解的prM突变产生的未成熟和部分成熟的病毒样颗粒能够诱导prM特异性抗体。与E特异性抗体不同，抗prM抗体通常不会中和病毒的感染性，并且不太能预防登革热。另一方面，抗prM抗体可以促进登革热病毒多种血清型感染带有FcγR的白细胞(Dejniratisaiet al,2010；Smith et al,2016)，并可能导致严重疾病的产生(Katzelnick et al,2017)。登革热疫苗候选物中不含prM是可取的(Dejniratisai et al,2010；Flipse and Smit,2015)，但是在生成基于颗粒的疫苗候选物中很难实现这一点(即通过从prM+E表达盒中删除整个prM编码序列)，因为prM在其在内质网中折叠时还充当E蛋白的伴侣(Konishi andMason,1993；Lorenz et al,2002)。在没有prM的情况下，E蛋白的表达不会导致膜相关颗粒的释放(Konishi and Mason,1993；Allison et al,1995；Hsieh et al,2014)。我们先前的尝试是通过用(prM+E)表达载体中不带电荷的残基(如丙氨酸)取代pr-M连接处的酸性氨基酸来减少细胞外登革热病毒样颗粒上残留的prM量，这使得prM裂解增强但是仍然不完全，所得颗粒可引发抗prM抗体反应，虽然抗体反应降低(Suphatrakul et al,2015)尽管先前的设计减少了抗登革热prM抗体诱导的问题，但仍然存在局限性，因为不能在剩余的未成熟和部分成熟的颗粒中完全形成依赖四级结构的表位(在E二聚体之内和之间)。

在这种登革热病毒样颗粒的设计中，构建了不含pr(M+E)的表达载体，用于生成完全成熟类型的病毒样颗粒，就像细胞外成熟病毒颗粒一样(Kuhn et al,2002)，这种安全成熟类型的病毒样颗粒不含prM的外部pr部分。由于所有的E分子都可能参与E同二聚体的形成，因此这种修饰可以最大程度地在颗粒上形成依赖于四级结构的表位。就像在成熟的病毒颗粒中一样，M的存在允许与E相互作用(Zhang et al,2013)。由于prM的pr部分包含离散的表位，其中已绘制了来自登革热病毒感染者和免疫动物的所有已知抗prM单克隆抗体和天然抗prM抗体(Chan et al,2012；Huang et al,2006,2008；Luo et al,2013；Luo et al,2015；Song et al,2013；Smith et al,2016；Wang et al,2013)，该设计中缺少登革热病毒prM的pr部分也旨在当这种病毒样颗粒用作可用于人中的疫苗时预防诱导抗-prM抗体应答。但是，删除prM的pr部分会导致不良后果的产生，从而影响产量。已知prM，特别是pr部分的一种功能是抑制输出过程中病毒颗粒与细胞内膜的融合(Zheng et al,2010；Zheng etal,2014)。在原本就没有prM的pr部分的情况下，成熟的病毒样颗粒很可能在遇到高尔基体的低pH环境时与宿主细胞膜融合。为最大程度地减少输出过程中酸诱导的成熟病毒样颗粒与高尔基体膜的融合，可用丙氨酸或天冬酰胺酸取代M和E蛋白内的许多保守的和位于内部的组氨酸残基(包括第7位、102位、224位、284位(282位，是针对DENV-3)、336位(334位，是针对DENV-3)、357位(335位，是针对DENV-3)和392位的组氨酸残基)。这是基于以前的发现，即组氨酸可作为pH传感器，酸性条件下组氨酸的质子化使得无论是在输出过程中(导致prM-E异二聚体向E二聚体的转化)，还是与新的病毒感染细胞的内体膜融合的过程中(导致从E二聚体向E三聚体的转化)均可出现E和prM的构象变化(Kampmann et al,2006；Mueller etal,2008；Fritz et al,2008；Fuzo and Degrève,2014；Zheng et al,2014；Chaudhury etal,2015)。在本申请中，多个组氨酸残基同时被取代，因为任何组氨酸残基的单取代都不可能消除融合(Nelson et al,2009；Chaudhury et al,2015)并提高产量(Christian et al,2013)。可以从表面接近的组氨酸残基没有被取代以保留E蛋白的抗原性。E蛋白的其他修饰涉及E二聚体侧面的取代，包括第261位、(259位，针对DENV-3)、263位(261位，针对DENV-3)、317位(315位，针对DENV-3)和398为的非组氨酸残基，以及涉及融合环处的取代，包括第E107位或E108位的残基，以减少E蛋白的融合潜力(Trainor et al,2007；Christian etal,2013；Urakami et al,2017)。然而，这些病毒样颗粒在细胞外水平的表达仍远远不能令人满意。因此，需要对登革热病毒样颗粒，M和E蛋白进行进一步修饰，以使得增加的细胞外病毒样颗粒可以在用这些病毒样颗粒进行疫苗接种的受试者中产生更好或改善的免疫应答。

发明内容

在几个实施方式中，本公开旨在提供成熟的黄病毒样颗粒，其在将所述颗粒以合适的剂量施用于受试者后能够在受试者中诱导或引发主动的免疫应答。对成熟颗粒进行遗传修饰，使得当这些表达的颗粒转运出宿主细胞时，表达的修饰颗粒变得更耐酸诱导的构象变化或融合。

本公开的另一个目的是提供一种嵌合肽或病毒结构蛋白，其包含黄病毒的连接的M和E蛋白的修饰形式。优选地，所公开的嵌合肽中的M蛋白和E蛋白的C末端茎锚结构域的信号序列分别被来自埃及伊蚊的防御素A蛋白和日本脑炎病毒的E蛋白的相应区域取代，从而提高细胞外病毒样颗粒的水平。

本公开的进一步的目的包括提供一种疫苗组合物，其被配置为有效对抗黄病毒感染，或者尤其是登革热病毒感染，其包含上述修饰的和/或嵌合的肽。将具有修饰的肽和/或嵌合体的所公开的疫苗组合物施用或暴露于受试者，并维持合适的一段时间，这将引发暴露的受试者的主动免疫。

本公开完全或部分地实现了前述目的中的至少一个目的，其中，本公开的实施方式之一涉及能够在哺乳动物中引发免疫应答的病毒样颗粒。所述病毒样颗粒或肽优选包含氨基酸序列，该氨基酸序列基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ IDNO.4所示的序列相对应，该序列携带登革热病毒序列的一个或多个人造或人工修饰或修改形式。所述修饰或修改形式可包括登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His，其被SEQ ID NO.1-3中的第7位、336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或者所述修饰或修饰形式可包括登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His，其被SEQ ID NO.4中的第7位、334位、355位和390位氨基酸Ala替换。特别要注意的是，所公开的VLP正在经历修饰或修改形式，包括将登革热病毒M蛋白(不含pr肽)与E蛋白在特定位结合，以在细胞外水平获得更好的表达。

在一些其他实施方式中，所述修改形式还包括用SEQ ID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E207位保守的氨基酸His。

对于其他实施方式，所述修饰还包括以下几种替换的任一一种组合，所述替换包括，分别用SEQ ID NO.1-3中的第261位氨基酸Phe或SEQ ID NO.4中的第259位氨基酸Phe替换登革热病毒序列的第E186位氨基酸Ser或Glu，或登革热病毒序列的第E184位氨基酸Ser，用SEQ ID NO.1-3中的第263位氨基酸Leu或SEQ ID NO.4中的第261位氨基酸Leu替换登革热病毒序列的第E188位氨基酸Arg，或登革热序病毒列的第E186位氨基酸Arg，用SEQ IDNO.2-3中的第317位氨基酸Ser或SEQ ID NO.4中的第315位氨基酸Ser替换登革热病毒序列的第E242位氨基酸Asn或Val，以及用SEQ ID NO.2-3中的第398位氨基酸Gln或SEQ ID NO.4中的第396位氨基酸Gln替换登革热病毒序列的第E323位氨基酸Arg或Lys或登革热病毒序列的第E321位氨基酸Lys。

根据几个实施方式，所述病毒样颗粒来源于黄病毒。更优选地，黄病毒中获取的修改的肽或蛋白质通常是登革热病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒。例如，在一些实施方式中，所公开的嵌合肽中的M蛋白和E蛋白的C末端茎锚结构域的信号序列分别被埃及伊蚊的防御素A蛋白和日本脑炎病毒的E蛋白所取代，以增强细胞外病毒样颗粒的水平。

本公开的另一方面涉及一种编码病毒样颗粒或多肽的分离的多核苷酸，当向该受试者施用药学上有效剂量的病毒样颗粒或多肽时，该病毒样颗粒或多肽能够在该受试者中引发免疫应答。具体而言，所述病毒样颗粒或多肽包含黄病毒的M和E结构蛋白的修改形式，其中氨基酸序列基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的序列相对应，其中登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.1-3中的第7位、第336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.4中的第7位、第334位、355位和390位氨基酸Ala替换。改变或修饰或修改的形式应使蛋白质在细胞外水平上更好地表达，从而在使用公开的组合物对受试者进行疫苗接种时能对黄病毒产生更好的免疫。

为了进一步增强细胞外水平表达，公开的颗粒还可以包括用SEQ ID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和282位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E207位保守的氨基酸His。另外，所述修饰或修改形式还包括以下几种替换的任一一种或组合，所述替换包括，分别用SEQ ID NO.1-3中的第261位氨基酸Phe或SEQID NO.4中的第259位氨基酸Phe替换登革热病毒序列的第E186位氨基酸Ser或Glu或登革热病毒序列的第E184位氨基酸Ser，分别用SEQ ID NO.1-3中的第263位氨基酸Leu或SEQ IDNO.4中的第261位氨基酸Leu替换登革热病毒序列的第E188位氨基酸Arg或登革热病毒序列的第E186位氨基酸Arg，用SEQ ID NO.2-3中的第317位氨基酸Ser或SEQ ID NO.4中的第315位氨基酸Ser替换登革热病毒序列的第E242位氨基酸Asn或Val或者登革热病毒序列的第E240位氨基酸Asn，以及用SEQ ID NO.2-3中的第398位氨基酸Gln或SEQ ID NO.4中的第396位氨基酸Gln替换登革热序列的第E323位氨基酸Arg或Lys或登革热病毒序列的第E321位氨基酸Lys。另外，在一些实施方式中，用日本脑炎病毒的对应序列取代E蛋白的远端部(SEQID NO.1-3的第472位-570位，或者SEQ ID NO.4的第470位-568位)。

本公开的另一方面涉及有效抵抗黄病毒例如登革热病毒感染的疫苗组合物。具体而言，所述疫苗组合物包含药学上可接受的佐剂；和修改的黄病毒多肽或病毒样颗粒，其在施用于受试者时具有免疫活性。所述修改的黄病毒多肽具有一种氨基酸序列，其中氨基酸序列基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的序列相对应。所述氨基酸序列包括登革热病毒序列的修改形式或修饰，其中登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.1-3中的第7位、第336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.4中的第7位、第334位、355位和390位氨基酸Ala替换。

对于许多实施方式，所述疫苗组合物中的多肽具有更多的修改形式或修饰，其包括用SEQ ID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E207位保守的氨基酸His。

附图说明

图1显示了源自DENV-1和日本脑炎病毒并标识为SEQ ID NO.1的黄病毒结构蛋白(M和E)的修改的氨基酸序列。

图2显示了源自DENV-2和日本脑炎病毒并标识为SEQ ID NO.2的黄病毒结构蛋白(M和E)的修改的氨基酸序列。

图3显示了源自DENV-3和日本脑炎病毒并标识为SEQ ID NO.4的黄病毒结构蛋白(M和E)的修改的氨基酸序列。

图4显示了源自DENV-4和日本脑炎病毒并标识为SEQ ID NO.3的黄病毒结构蛋白(M和E)的修改的氨基酸序列。

图5显示了修改的核苷酸序列，其编码DENV-1病毒样颗粒的黄病毒结构蛋白(M和E)，并被标识为SEQ ID NO.5。

图6显示了修改的核苷酸序列，其编码DENV-2病毒样颗粒的黄病毒结构蛋白(M和E)，并被标识为SEQ ID NO.6。

图7显示了修改的核苷酸序列，其编码DENV-4病毒样颗粒的黄病毒结构蛋白(M和E)，并被标识为SEQ ID NO.7。

图8显示了修改的核苷酸序列，其编码DENV-3病毒样颗粒的黄病毒结构蛋白(M和E)，并被标识为SEQ ID NO.8。

图9显示了用表达载体转染蚊子细胞后用于表达DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4病毒样颗粒的病毒蛋白E在细胞内的表达，利用小鼠单克隆抗-E抗体、1D10和Cy3缀合的山羊抗小鼠IgG抗体通过间接免疫荧光分析证明E蛋白，用DAPI对细胞核进行染色。

图10显示了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和M和E蛋白的片段的银染色，这些蛋白分别来自纯化的DENV-1成熟病毒样颗粒，该病毒样颗粒通过20％-55％蔗糖逐步梯度离心法纯化，然后进行速率区带离心，其中左侧为蛋白质标记的大小。

图11显示了(a)纯化的DENV-1病毒样颗粒，(b)纯化的DENV-2病毒样颗粒，(c)纯化的DENV-3病毒样颗粒和(d)纯化的DENV-4病毒样颗粒的透射电子显微照片。

图12示出了在第0周和第12周向6只小鼠注射DENV-2病毒样颗粒后的中和抗体反应，即绘制了在不同时间点(第0周，第2周，第4周，第8周，第12周和第20周)获得的小鼠相互50％蚀斑减少中和效价(PRNT₅₀)的图，其中每个点代表一只单独的小鼠，其中线连接了几何平均滴度，误差线表示标准偏差。

图13示出了在第0天第一次注射DENV-2减毒活病毒，在第60天和90天时两次加强注射DENV-2病毒样颗粒，以及在第120天时挑战性地注射DENV-2野生型病毒后的食蟹猕猴中的中和抗体反应，绘制了在不同时间点(第0天，第14天，第30天，第60天，第74天，第90天，第104天，第118天，第134天和第150天)获得的猕猴相互50％蚀斑减少中和效价(PRNT₅₀)的图，图中含有很多点，连接线代表各个猕猴。

具体实施方式

在下文中，将根据优选实施例并通过参考附上的描述和附图来描述本公开。然而，应当理解，参考本发明的优选实施例和附图来进行描述仅是为了促进对各种公开的实施例的讨论，并且可以预见，本领域技术人员可以在不背离所附权利要求的前提下做出各种修改。

除非另有说明，否则本文所用的术语“包括”和“包含”及其语法变体旨在表示“开放式”或“包含性”语言，以使得它们包括叙述的要素，但也允许包含其他未叙述的元素。

如本文所用，短语“在实施例中”在一些实施例中是指但不一定在所有实施例中。

在整个说明书中，本文使用的术语“多肽”是指通过肽键连接在一起但具有比蛋白质低的分子量的氨基酸链。可通过蛋白质的合成或水解获得多肽。很少的多肽可以通过本领域中任何已知的方法连接在一起以形成功能单元。

本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度大于30个核苷酸残基的寡核苷酸。

在整个说明书中，如本文所用的用于描述多肽或肽的术语“部分”或“基本上对应于”是指含有至少70％，或更优选至少80％的连续氨基酸的多肽或肽，其与图1-4中所示的公开的多肽或肽相同。这些多肽虽然可能不具有与公开的多肽或肽完全相同的序列；这些多肽可以保留活性表位，以与相应的抗体反应以引发针对黄病毒的所需免疫反应，并且由于通过比对发现肽中排列的氨基酸序列与公开的序列的相似性达到至少约70％至90％，这些活性表位存在于所述肽上。

如本文所用，“与…对应的位置”以及叙述到，核苷酸或氨基酸位置与诸如序列表中的公开徐凯中的核苷酸或氨基酸对应，指的是使用标准比对算法，与公开的序列进行比对以最大化身份的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以标识相应的残基。

如本文所用，术语“登革热序列”或“登革热病毒序列”是指线性核苷酸或氨基酸序列或登革热病毒的序列，尤指野生型病毒或登革热病毒的野生型，其具有与登革热病毒的任何已知或自然发生的序列对应的位点的核苷酸或氨基酸。在本公开中，术语“登革热序列”或“登革热病毒序列”也可互换使用。

在本公开的说明书和权利要求书中，术语“黄病毒结构蛋白”或“黄病毒肽”或“黄病毒多肽”可互换使用，是指源自黄病毒的任何基于肽的序列，其可被受试者中的免疫系统所识别，刺激受试者中的细胞介导的免疫应答和/或刺激受试者中抗体的产生。

在本公开中选择的黄病毒作为模板或原始结构或肽序列结构以修饰成所公开的肽或蛋白质可以来源于登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和/或寨卡病毒。在一些实施方式中，源自一种病毒类型的蛋白质的一部分或区域可以被另一种病毒类型的相应或相似区域替换或取代。例如，登革热病毒起源的M蛋白的信号序列被去除并被源自埃及伊蚊的防御素A蛋白的相应区域取代。在其他实施方式中可以看到类似的修饰，其中源自登革热病毒的E蛋白的C末端茎锚结构域被来自日本脑炎病毒的E蛋白的相应区域替换。此类修饰涉及将一种病毒类型的蛋白质的一个区域移动或替换为另一种病毒类型的蛋白质，目的是在细胞外水平上提高表达的所公开的肽或蛋白质的产量。根据几个优选的实施方式，所公开的肽一开始或天然地从黄病毒中获得，这里的黄病毒指的是登革热病毒。登革热病毒可以是包括亚型I至IV的登革热病毒1，包括亚型亚洲I，亚洲II，世界，美国和美国/亚洲的登革热病毒2，包括亚型I至IV的登革热病毒3，以及包括亚型I至III的登革热病毒4。通常，登革热病毒结构蛋白由衣壳蛋白、前体膜(prM)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白组成。对于更多的实施方式，公开的蛋白或肽是成熟的病毒样颗粒，其由两种那些结构蛋白构成，即，M蛋白和E蛋白。登革热病毒结构蛋白还可包含对应于起始密码子的氨基酸和对应于M序列的氨基末端的信号序列。

具体而言，本公开的一些实施方式提供了一种成熟的病毒样颗粒，其包含黄病毒的M和E结构蛋白的修改形式，其中多个氨基酸的天然存在的结构发生了改变。这些结构蛋白可以通过使用本领域中任何已知的方法通过一组选定的宿主细胞或动物来表达。所公开的一种或多种黄病毒结构蛋白可以用于受试者免疫，只要它们自发地组装成具有活性表位的颗粒结构以与抗体结合以启动免疫过程即可。例如，当培养表达编码登革热病毒M和E蛋白基因的真核细胞时，这些蛋白由细胞产生并组装成病毒样颗粒，然后可以从细胞培养基中收集病毒样颗粒。或者，还可使用化学合成方法，以产生与黄病毒结构蛋白M和E相同或几乎相同的目的结构蛋白。优选地，按照有意暴露保持表位以在受试者中产生预期的免疫反应的方式将所创建或表达的M和E蛋白结合、连接、附接或保持。

黄病毒，特别是登革热病毒的M和E区的修改形式，氨基酸序列由SEQ ID NO.1-4表示。已经标识出各种黄病毒(例如登革病毒1-4型)的病毒结构蛋白，并可以在各种公共数据库(如GenBank数据库)中获得所述病毒的结构蛋白。例如，登革热病毒1型(West Pac株和16007株)：登录号U88535和AF180817.1，登革热病毒2型(S1株疫苗和16681株)：登录号M19197和U87411.1，登革热病毒3型(新加坡菌株8120/95和16562株)：登录号AY766104和KU725665.1和登革热病毒4型(ThD4_0476_97株和H-241株)：登录号Y618988.1和U18433.1。可以从数据库中获得关于包膜蛋白的信息，包括黄病毒的序列氨基酸排列，黄病毒例如登革热病毒。通过使用这些数据库中的序列比对功能，本领域技术人员应能够识别出SEQID.NO.1-4的实质长度，其被并入较大的肽的长得多的序列中或被发现于相对较小的肽的较短序列中的SEQ ID.NO.1-4的部分片段。这些更长或更短序列的任何修饰或修改形式与公开的SEQ ID NO.1-4密切相关将不会背离本发明的范围，只要这样的修饰可以导致受试者中的更好或改善的诱导的免疫应答，以抵抗黄病毒或登革热病毒。重要的是要注意，通过公开的序列表达的肽没有prM的pr部分。

因此，SEQ ID.NO.1-4所示的公开的多肽制备成或生产成包括至少一个氨基酸交替，优选在第7位氨基酸和第398位氨基酸之间，或在黄病毒的氨基酸序列或其片段与SEQID NO.1-4比对时的任何上述位置所确定的位置之间。更具体地，包含至少一个氨基酸交替或修饰的区域可以优选在SEQ ID NO.1-4的第7位氨基酸和第398位氨基酸之间。在一些实施方式中，表达的肽的一些实施方式通常可以包含起始密码子Met和信号肽，接着是登革热病毒1，登革热病毒2，登革热病毒3或登革热病毒4的M和E。起始密码子、信号区、肽M和肽E优选依次串联排列。在一些实施方式，E蛋白的远端部分被日本脑炎病毒的相应序列取代或掺入。当前公开的蛋白、肽或病毒样颗粒能够在哺乳动物或受试者中引起免疫应答，其包含基本与基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的序列对应的氨基酸序列。公开的氨基酸携带理想的修饰。在许多实施方式中，修饰的形式包含基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的M和E序列对应的氨基酸序列，其中登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His被SEQ IDNO.1-3中的第7位、336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或者登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.4中的第7位、334位、355位和390位氨基酸Ala替换。

在一些实施方式中，所述修改的形式还包括用SEQ ID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His。另外，公开的序列上的修饰的形式或修改还包括以下几种替换的任一一种或组合，所述替换包括，分别用SEQ ID NO.1-3中的第261位氨基酸Phe或SEQID NO.4中的第259位氨基酸Phe替换登革热病毒序列的第E186位氨基酸Ser或Glu，或登革热病毒序列的第E184位氨基酸Ser，分别用SEQ ID NO.1-3中的第263位氨基酸Leu或SEQ IDNO.4中的第261位氨基酸Leu替换登革热病毒序列的第E188位氨基酸Arg，或登革热序病毒列的第E186位氨基酸Arg，用SEQ ID NO.2-3中的第317位氨基酸Ser或SEQ ID NO.4中的第315位氨基酸Ser替换登革热病毒序列的第E242位氨基酸Asn或Val或登革热病毒序列的第E240位氨基酸Asn，或者用SEQ ID NO.2-3中的第398位氨基酸Gln或SEQ ID NO.4中的第396位氨基酸Gln替换登革热病毒序列的第E323位氨基酸Arg或Lys或登革热病毒序列的第E321位氨基酸Lys。

除了在该区域中包含至少一个氨基酸改变以外，包含在病毒样颗粒中的黄病毒结构蛋白可以是天然存在的病毒结构蛋白或其修改蛋白。在多个实施方式中，修改的蛋白与包括M和E蛋白的天然存在的病毒结构蛋白的氨基酸序列一致性达到至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％。在更多的实施方式中，修改的蛋白是突变体，其具有潜在至多10％的对应于SEQ ID NO.1-4的序列的氨基酸缺失、取代和/或添加至天然存在的病毒结构蛋白，该天然存在的病毒结构蛋白包括M和包膜区。序列一致性可以通过常规方法确定。

修改的黄病毒结构蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1-4任一所示的氨基酸序列的一致性达到至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％。同样，修改的黄病毒结构蛋白可以是突变体，其中基于具有由SEQ ID NO.1-4任一所示的氨基酸序列的黄病毒结构蛋白，最多缺失、取代和/或添加10％的氨基酸。

本公开的第二方面涉及一种分离的多核苷酸或核酸分子，其包含编码SEQ IDNO.1-4所示的带有或不带有修饰的病毒样颗粒的核苷酸序列。优选地，编码病毒样颗粒或多肽的分离的多核苷酸能够在向受试者施用药学上有效剂量的病毒样颗粒或多肽后在受试者中引发免疫应答。公开的多核苷酸编码的病毒样颗粒、肽或多肽包括黄病毒的M和E结构蛋白的修饰形式，其中所述修饰形式的核苷酸序列基本上与SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，或SEQ ID NO.8所示的序列相对应，或者氨基酸序列基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的序列相对应，其中登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.1-3中的第7位、第336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.4中的第7位、第334位、355位和390位氨基酸Ala替换。

根据公开的核酸分子的若干实施方式，其也可编码以下修饰，用SEQ ID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和282位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E207位保守的氨基酸His。类似地，对于更多实施方式，公开的核酸分子中所编码的修饰还包括以下几种替换的任一一种故意组合，所述替换包括，分别用SEQID NO.1-3中的第261位氨基酸Phe或SEQ ID NO.4中的第259位氨基酸Phe替换登革热病毒序列的第E186位氨基酸Ser或Glu，或登革热病毒序列的第E184位氨基酸Ser，分别用SEQ IDNO.1-3中的第263位氨基酸Leu或SEQ ID NO.4中的第261位氨基酸Leu替换登革热病毒序列的第E188位氨基酸Arg，或登革热病毒序列的第E186位氨基酸Arg，用SEQ ID NO.2-3中的第317位氨基酸Ser或SEQ ID NO.4中的第315位氨基酸Ser替换登革热病毒序列的第E242位氨基酸Asn或Val或者登革热病毒序列的第E240位氨基酸Asn，以及用SEQ ID NO.2-3中的第398位氨基酸Gln或SEQ ID NO.4中的第396位氨基酸Gln替换登革热序列的第E323位氨基酸Arg或Lys或登革热病毒序列的第E321位氨基酸Lys。

重要的是要注意，多核苷酸的多个变体可以用于编码修饰的蛋白或肽，因为单个氨基酸可以由一个以上的核苷酸密码子编码。编码SEQ ID NO.1-4所示蛋白的变体的示例性实施例如SEQ ID NO.5-8一样在图5-8中示出。更重要的是，对于一些实施方式，本公开提供了一种核酸分子，其通过具有由SEQ ID NO.5-8中任一个表示的核苷酸序列的核酸分子进一步修改。所述修改的核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID No.5-8中任一所示的核苷酸序列的序列一致性达到至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％。同样，修改的核酸分子可以是突变体，其中基于具有由SEQ ID Nos.5-8的任一个表示的核苷酸序列的核酸分子，最多缺失、取代和/或添加10％的氨基酸。

本公开的其他实施方式包含表达载体，其包含上述核酸分子。载体任选地包含与公开的核酸分子可操作连接的表达控制序列。具体而言，本公开提供了黄病毒结构蛋白M和E的表达载体，该表达载体带有编码SEQ ID NO.1-4所示蛋白质变体的核苷酸序列，其具有上述的氨基酸替换。表达载体所携带的核苷酸序列可以是SEQ ID No.5-8中的任一一个。

本公开的第三方面提供了一种组合物或疫苗组合物，其包含在本申请的第一方面中提供的病毒样颗粒和/或在本发明的第二方面中提供的核酸分子。具体地，疫苗组合物包含药学上可接受的佐剂；多肽或病毒样颗粒，在将其施用于受试者时具有免疫活性，且包含基本上与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4所示的序列对应的氨基酸序列。每个公开的序列都结合有一种或多种登革热病毒序列的修改形式或修饰，其中登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.1-3中的第7位、336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或者登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.4中的第7位、334位、355位和390位氨基酸Ala替换。

对于公开的疫苗组合物的更多的实施方式，所述修改的形式或修饰还包括用SEQID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和282位氨基酸Asn替换登革热病毒序列的E27位、E149位和E207位保守的氨基酸His。

在公开的疫苗组合物的若干个更多的实施方式中，所述修改的形式或修饰还包括以下几种替换的任一一种或组合，所述替换包括，分别用SEQ ID NO.1-3中的第261位氨基酸Phe或SEQ ID NO.4中的第259位氨基酸Phe替换登革热病毒序列的第E186位氨基酸Ser或Glu，或登革热病毒序列的第E184位氨基酸Ser，分别用SEQ ID NO.1-3中的第263位氨基酸Leu或SEQ ID NO.4中的第261位氨基酸Leu替换登革热病毒序列的第E188位氨基酸Arg，或登革热序病毒列的第E186位氨基酸Arg，用SEQ ID NO.2-3中的第317位氨基酸Ser或SEQ IDNO.4中的第315位氨基酸Ser替换登革热病毒序列的第E242位氨基酸Asn或Val或登革热病毒序列的第E240位氨基酸Asn，以及用SEQ ID NO.2-3中的第398位氨基酸Gln或SEQ IDNO.4中的第396位氨基酸Gln替换登革热病毒序列的第E323位氨基酸Arg或Lys或登革热病毒序列的第E321位氨基酸Lys。

此外，药学上可接受的载体和/或佐剂可以是但不限于AddaVax(InvivoGen)。本公开的药物组合物除了包含佐剂或载体外还包含单一活性成分或两种或更多种活性成分的组合，只要它们不违背本公开的目的即可。在多种活性成分的组合中，考虑到它们的治疗效果和安全性，可以在不同的实施方式中适当地改变所公开的组合物中各个成分的含量或浓度。本文所用的术语“组合”是指同时将单一实体或剂量的两种或多种活性成分施用于受试者，或将这些活性成分作为单独实体同时或依次给予受试者，而没有特定的时间限制，其中优选同时进行这种施用可在体内提供两种组分的治疗有效水平。

本公开的第四方面提供了产生抗黄病毒的抗体或产生包含抗黄病毒的中和抗体的抗血清的方法，该方法包括使受试者与本申请第一方面提供的病毒样颗粒接触，和/或与本发明的第二方面提供的核酸分子接触，通过这种接触引起免疫应答。受试者可以是哺乳动物，例如人。通过向哺乳动物施用治疗有效剂量的产生的抗体，通过公开的方法产生的抗体可以用于对感染了其他受试者或哺乳动物的黄病毒引起的病原体产生被动免疫。所施用的抗体对感染哺乳动物或受试者的黄病毒有效，从而预防或治愈黄病毒感染或任何由黄病毒引起的疾病症状。

可以使用一种或多种常规已知技术进一步使从本公开内容中不同于人的其他哺乳动物产生的抗体经历人源化过程。因此，在更多的实施方式中，该方面提供的方法还包括：将非人类哺乳动物产生的抗体人源化的步骤。可将获得的抗体或人源化抗体给予人类受试者，以预防或根除黄病毒感染，治疗或减轻受试者中黄病毒感染引起的任何疾病状态或症状。此外，根据所公开的方法产生的抗体可以用于体外选择来自免疫细胞例如源自患者的B细胞和T细胞的亚群。随后将选择的亚群免疫细胞重新给予患者以增强抗黄病毒感染的免疫力。

进一步的实施方式涉及包含通过常规方式可获得的公开的抗体的抗血清。具体地，从免疫的非人类动物中采集血样，并对血液进行处理以获得抗血清，即其血液中的含抗体的液体成分。非人类哺乳动物优选选自以下组，组中包括大鼠、小鼠、仓鼠、猪、兔、马、驴、山羊、绵羊、豚鼠、羊驼和非人类灵长类动物。

本公开的第五方方面阐述了一种治疗患有由黄病毒感染例如登革热引起的疾病或病症的受试者的方法。优选地，将第一方面提供的病毒样颗粒，第二方面提供的核苷酸分子或第三方面提供的组合物施用于受试者。通过向受试者施用上述修改的病毒样颗粒，编码修改的病毒样颗粒或疫苗组合物的核苷酸分子，可以在受试者中诱导或增强或建立针对黄病毒的免疫应答或免疫力。因此，通过建立的免疫力可以有效地预防或根除由黄病毒感染，例如登革热感染引起的任何疾病状况。就这一点而言，可以将病毒样颗粒、核苷酸分子或组合物具体施用于患者的受累器官或全身施用于受试者的总体免疫系统，从而增强了对黄病毒感染的总体抵抗力。优选地，由黄病毒引起的疾病状态或症状可以是登革热、登革热病、登革出血热和严重登革热。

在治疗黄病毒感染的方法的其他实施方式中，所述病毒样颗粒也可以用于免疫治疗。病毒样颗粒可以离体应用于源自患者的细胞或人细胞系，随后将其施用于患者。

本公开的第六方面提供了一种生产在第一方面中提供的病毒样颗粒的方法，该方法包括：利用编码该病毒样颗粒的基因培养表达该病毒样颗粒的细胞；并从细胞培养物中回收病毒样颗粒。各种宿主-载体系统可用于生产病毒样颗粒的公开的方法。真核细胞可用于本申请第四方面中提供的方法。真核细胞的例子包括但不限于昆虫细胞(例如C6/36，Sf9细胞，高五细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母)和哺乳动物细胞(例如CHO细胞，人胚肾293F细胞)。用于本申请的第二方面提供的方法的载体包含编码待表达的病毒样颗粒的核酸分子。可以使用常规方法(例如脂质转染、电穿孔)用载体转染细胞。技术人员可以选择培养基。转染后，可以选择稳定产生转染细胞的蛋白质的克隆，并且可以在细胞中产生病毒样颗粒并将其释放到培养基中。可以从培养基中回收病毒样颗粒，并使用超速离心法和/或色谱法进行纯化。重要的是要注意，表达和回收的蛋白或颗粒是成熟的病毒样颗粒，成熟的病毒样颗粒不能在正在施用回收的蛋白的受试者中复制，因此可以安全地用作疫苗组合物。

以下实施例旨在进一步说明本发明，而无意将本发明限制于其中描述的具体实施方式。

实施例1

黄病毒结构蛋白的表达

在本实验中，将登革热病毒1-4型和日本脑炎病毒包膜糖蛋白作为病毒结构蛋白。在所使用的登革热病毒结构蛋白中，通过本领域已知的一种或多种方法引入了至少一种修饰或修改形式。更具体地说，登革热病毒序列的第M7位、E261位、E282位和E317位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.1-3中的第7位、336位、357位和392位氨基酸Ala替换，或者登革热病毒序列的第M7位、E259位、E280位和E315位保守的氨基酸His被SEQ ID NO.4中的第7位、334位、355位和390位氨基酸Ala替换。在进行的实验的另外的实施例中，修改形式还包括用SEQID NO.1-3中的第102位、224位和284位氨基酸Asn替换登革热病毒序列或野生型的E27位、E149位和E209位保守的氨基酸His，或者用SEQ ID NO.4中的第102位、224位和282位氨基酸Asn替换登革热病毒序列或野生型的E27位、E149位和E207位保守的氨基酸His。在进行的实验的另外的实施例中，更多的修饰还包括以下几种替换的任一一种或组合，所述替换包括，分别用SEQ ID NO.1-3中的第261位氨基酸Phe或SEQ ID NO.4中的第259位氨基酸Phe替换登革热病毒序列的第E186位氨基酸Ser或Glu，或登革热病毒序列或野生型的第E184位氨基酸Ser，分别用SEQ ID NO.1-3中的第263位氨基酸Leu或SEQ ID NO.4中的第261位氨基酸Leu替换登革热病毒序列的第E188位氨基酸Arg，或登革热序病毒列的第E186位氨基酸Arg，用SEQ ID NO.2-3中的第317位氨基酸Ser或SEQ ID NO.4中的第315位氨基酸Ser替换登革热病毒序列的第E242位氨基酸Asn或Val或登革热病毒序列的第E240位氨基酸Asn，用SEQID NO.2-3中的第398位氨基酸Gln或SEQ ID NO.4中的第396位氨基酸Gln替换登革热病毒序列的第E323位氨基酸Arg或Lys，或登革热病毒序列或野生型的第E321位氨基酸Lys。下表1列出了本实验中研究的修改的病毒结构蛋白的一些实施方式。

为了在昆虫细胞中表达一种或多种修饰的病毒结构蛋白，将M-E表达载体转染至C6/36或Sf9细胞。转染后，通过使用特异性结合E蛋白的抗登革病毒单克隆抗体(克隆1D10)和与Cy3偶联的山羊抗小鼠Ig抗体作为二抗，通过间接免疫荧光法检查细胞内E的表达。结果如图9所示。

在捕获ELISA中评估了E蛋白的细胞外水平。收集转染细胞的培养基，并以登革热病毒单克隆抗体为一抗，以辣根过氧化物酶偶联的兔抗小鼠IgG抗体为二抗，检测E蛋白的表达。结果示于下表2。

实施例2

利用稳定表达黄病毒结构蛋白的细胞制备病毒样颗粒

使用实施例1中使用的黄病毒M和E结构蛋白的表达载体。按照与实施例1相同的方式，将载体转染至C6/36或Sf9细胞。在产生稳定表达转染子的过程中，将载体转染到细胞中，并使用杀稻瘟菌素选择重组转染的细胞。通过间接免疫荧光和斑点印迹免疫分析法，使用鼠类单克隆抗体1D10，基于登革病毒E蛋白在细胞内和细胞外的表达，选择抗药性转染子的克隆。具有高水平细胞外E蛋白表达的转染克隆被扩增。浓缩细胞培养基，然后如前所述在蔗糖梯度和/或酒石酸钾-甘油梯度中通过超速离心进行纯化(Charoensri et al,2014)。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染评估了病毒样颗粒制剂中两种包膜蛋白E和M的存在。结果如图10所示。

使用乙酸铀酰和透射电子显微镜通过阴性染色进行形态学评估。结果如图11所示。在纯化的颗粒性组分中，观察到通常为圆形的颗粒，这些颗粒的尺寸和大小有一些变化，正如没有核结构的病毒样颗粒所显示的那样。

实施例3

小鼠抗登革热病毒的抗体

在该实施例中使用在实施例2中获得的纯化的登革病毒样颗粒。在第0和8周通过皮下注射含有角鲨烯水包油佐剂(AddaVax，InvivoGen)的20％甘油-NTE缓冲液(12mM Tris[pH 8.0]，1mM EDTA和120mM NaCl)中的1μg DENV-2病毒样颗粒来免疫六只小鼠。通过使用原型DENV-2 16681株测定用于中和抗体至DENV-2的血清。通过在Vero细胞上进行蚀斑减少中和试验(PRNT)检测免疫的小鼠血清中的抗-DENV中和抗体。终点效价计算为所测试的最高血清稀释度，可将蚀斑形成单位的数量减少至少50％(PRNT50)。结果如图12所示。病毒样颗粒能够在免疫小鼠中诱导高水平的中和抗体。

实施例4

猴子抗登革热病毒的抗体

在该实施例中使用在实施例2中获得的纯化的登革热病毒样颗粒。在第0天用单价减毒登革热病毒免疫六只食蟹猕猴。在第60天和第90天两次通过皮下注射含有角鲨烯水包油佐剂(AddaVax，InvivoGen)的20％甘油-NTE缓冲液(12mM Tris[pH 8.0]，1mM EDTA和120mM NaCl)中的10μg病毒样颗粒来增强它们的免疫力。然后在第120天，再用DENV-2野生型病毒攻击猕猴。通过蚀斑减少中和试验(PRNT)，使用DENV-2原型16681株和Vero细胞，测定中和抗体至DENV-2的血清。终点效价计算为所测试的最高血清稀释度，可将蚀斑形成单位的数量减少至少50％(PRNT₅₀)。结果如图13所示。病毒样颗粒能够在减毒活病毒引发的猕猴中诱导高水平的中和抗体至DENV-2，并在受到DENV-2野生型病毒攻击后使其免受感染。

实施例5

制备包含登革热病毒样颗粒的药物组合物

根据实施例2制备登革病毒样颗粒。为了制备作为疫苗组合物的药物组合物，将10μg纯化的病毒样颗粒与0.1ml含有12mM Tris(pH 8.0)，1mM EDTA和120mM NaCI的0.1mlNTE缓冲液混合。

应当理解，本公开可以以其他特定形式来体现，并且不限于上述实施例。然而，所公开的概念的修改和等同物，例如本领域技术人员容易想到那些修改和等同物，旨在包括在所附权利要求的范围内。

参考文献

Allison SL,Stadler K,Mandl CW,Kunz C,Heinz FX.Synthesis and secretionof recombinant tick-borne encephalitis virus protein e in soluble andparticulate form.J Virol 1995；69:5816-20.

Capeding MR,Tran NH,Hadinegoro SR,Ismail HI,Chotpitayasunondh T,ChuaMN,et al.Clinical efficacy and safety of a novel tetravalent dengue vaccinein healthy children in Asia:a phase 3,randomised,observer-masked,placebo-controlled trial.Lancet 2014；384:1358–65.

Chan,A.H.,Tan,H.C.,Chow,A.Y.,Lim,A.P.,Lok,S.M.,Moreland,N.J.,et al.Ahuman prM antibody that recognizes a novel cryptic epitope on dengue Eglycoprotein.PLoS ONE 2012；7:e33451.

Charoensri N,Suphatrakul A,Sriburi R,Yasanga T,Junjhon J,Keelapang P,et al.An optimized expression vector for improving the yield of dengue virus-like particles from transfected insect cells.J Virol Methods 2014:205:116-23.

Chaudhury S,Ripoll DR,Wallqvist A.Structure-based pKa predictionprovides a thermodynamic basis for the role of histidines in pH-inducedconformational transitions in dengue virus.Biochem Biophys Rep 2015；4:375–85.

Christian EA,Kahle KM,Mattia K,Puffer BA,Pfaff JM,Miller A,etal.Atomic-level functional model of dengue virus envelope proteininfectivity.Proc Natl Acad Sci(USA)2013；110:18662–7.

Dejnirattisai W,Jumnainsong A,Onsirisakul N,Fitton P,Vasanawathana S,Limpitikul W,et al.Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infectionin humans.Science 2010；328:745–8.

Dejnirattisai W,Wongwiwat W,Supasa S,Zhang XK,Dai XH,Rouvinsky A,etal.A new class of highly potent,broadly neutralizing antibodies isolated fromviremic patients infected with dengue virus.Nat Immunol 2015；16:170-7.

Flipse J,Smit JM.The complexity of a dengue vaccine:a review of thehuman antibody response.PLoS Negl Trop Dis 2015；9:e0003749.

Fritz R,Stiasny K,Heinz FX.Identification of specific histidines aspH sensors in flavivirus membrane fusion.J Cell Biol 2008；183:353-61.

Fuzo CA,Degrève L.The pH dependence of flavivirus envelope proteinstructure:insights from molecular dynamics simulations,J BiomolecularStructure Dynamics 2014；32:1563-74.

Hadinegoro SR,Arredondo-Garcia JL,Capeding MR,Deseda C,Chotpitayasunondh T,Dietze R,et al.Efficacy and long-term safety of a denguevaccine in regions of endemic disease.N Engl J Med 2015；373:1195–206.

Hsieh SC,Tsai WY,Nerurkar VR,Wang WK.Characterization of theectodomain of the envelope protein of dengue virus type 4:expression,membraneassociation,secretion and particle formation in the absence of precursormembrane protein.PLoS ONE 2014；9:e100641.

Huang KJ,Yang YC,Lin YS,Huang JH,Liu HS,Yeh TM,et al.The dual-specific binding of dengue virus and target cells for the antibody-dependentenhancement of dengue virus infection.J Immunol 2006；176:2825–32.

Huang KJ,Cheng YT,Lin YS,Huang JH,Liu HS,Yeh TM,et al.Anti-prMantibody as an autoantibody in dengue virus infection.Am J Infect Dis 2008；4:59-67.

Junjhon J,Lausumpao M,Supasa S,Noisakran S,Songjaeng A,Saraithong P,et al.Differential modulation of prM cleavage,extracellular particledistribution,and virus infectivity by conserved residues at nonfurinconsensus positions of the dengue pr-M junction.J Virol 2008；82:10776-91.

Junjhon J,Edwards TJ,Utaipat U,Bowman VD,Holdaway HA,Zhang W,etal.Influence of pr-M cleavage on the heterogeneity of extracellular denguevirus particles.J Virol 2010；84:8353-8.

Kampmann T,Mueller DS,Mark AE,Young PR,Kobe B.The role of histidineresidues in low pH-mediated viral membrane fusion.Structure 2006；14:1481-7.

Katzelnick LC,Gresh L,Halloran ME,Mercado JC,Kuan G,Gordon A,etal.Antibody-dependent enhancement of severe dengue disease in humans.Science2017；358:929–32.

Konishi E,Fujii A,Mason PM.Generation and characterization of amammalian cell line continuously expressing Japanese encephalitis virussubviral particles.J Virol 2001；75:2204-12.

Konishi E,Fujii A.Dengue type 2 virus subviral extracellularparticles produced by a stably transfected mammalian cell line and theirevaluation for a subunit vaccine.Vaccine 2002；20:1058-67.

Konishi E,Mason PW.Proper maturation of the Japanese encephalitisvirus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembraneprotein.J Virol 1993；67:1672–5.

Kuhn RJ,Zhang W,Rossmann MG,Pletnev SV,CorverJ,Lenches E,etal.Structure of dengue virus:implications for flavivirus organization,maturation,and fusion.Cell 2002；108:717–25.

Li L,Lok SM,Yu IM,Zhang Y,Kuhn RJ,Chen J,et al.The flavivirusprecursor membrane-envelope protein complex:structure and maturation.Science2008；319:1830–4.

Lok SM.The interplay of dengue virus morphological diversity andhuman antibodies.Tr Microbiol 2016；24:284-93.

Lorenz IC,Allison SL,Heinz FX,Helenius A.Folding and dimerization oftick-borne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmicreticulum.J Virol 2002；76:5480-91.

Luo YY,Feng JJ,Zhou JM,Yu ZZ,Fang DY,Yan HJ,et al.Identification of anovel infection-enhancing epitope on dengue prM using a dengue cross-reactingmonoclonal antibody.BMC Microbiology 2013；13:194.

Luo Y,Guo X,Yan H,Fang D,Zeng G,Zhou J,et al.Comprehensive mappinginfection-enhancing epitopes of dengue pr protein using polyclonal antibodyagainst prM.Appl Microbiol Biotechnol 2015；99:5917–27.

Mueller DS,Kampmann T,Yennamalli R,Young PR,Kobe B,Mark AE.Histidineprotonation and the activation of viral fusion proteins.Biochem Soc T 2008；36:43-5.

Nelson S,Poddar S,Lin T-Y,Pierson TC.Protonation of individualhistidine residues is not required for the pH-dependent entry of West Nilevirus:evaluation of the“histidine switch”hypothesis.J Virol 2009；83:12631-5.

Plevka P,Battisti AJ,Junjhon J,Winkler DC,Holdaway HA,Keelapang P,etal.Maturation of flaviviruses starts from one or more icosahedrallyindependent nucleation centers.EMBO Reports 2011；12:602–6.

Plevka P,Battisti AJ,Sheng J,Rossmann MG.Mechanism for maturation-related reorganization of flavivirus glycoproteins.J Structural Biol 2014；185:27–31.

Purdy DE,Chang GJJ.Secretion of noninfectious dengue virus-likeparticles and identification of amino acids in the stem region involved inintracellular retention of envelope protein.Virology 2005；333:239-50.

Richter MK,da Silva Voorham JM,Torres Pedraza S,Hoornweg TE,van dePol DP,Rodenhuis-Zybert IA,et al.Immature dengue virus is infectious in humanimmature dendritic cells via interaction with the receptor molecule DC-SIGN.PLoS One 2014；9:e98785.

Rodenhuis-Zybert IA,van der Schaar HM,da Silva Voorham JM,van derEnde-Metselaar H,Lei HY,Wilschut J,et al.Immature dengue virus:a veiledpathogen？PLoS Pathog 2010；6:e1000718.

Rouvinski A,Guardado-Calvo P,Barba-Spaeth G,Duquerroy S,Vaney MC,Kikuti C,et al.Recognition determinants of broadly neutralizing humanantibodies against dengue viruses.Nature 2015；520:109-13.

Sabchareon A,Wallace D,Sirivichayakul C,Limkittikul K,ChanthavanichP,Suvannadabba S,et al.Protective efficacy of the recombinant,live-attenuated,CYD tetravalent dengue vaccine in Thai schoolchildren:arandomised,controlled phase 2b trial.Lancet 2012；380:1559–67.

Suphatrakul A,Yasanga T,Keelapang P,Sriburi R,Roytrakul T,Pulmanausahakul R,et al.Generation and preclinical immunogenicity study ofdengue type 2 virus-like particles derived from stably transfected mosquitocells.Vaccine 2015；33:5613-22.

Shang W,Liu J,Yang J,Hu Z,Rao X.Dengue virus-like particles:construction and application.Appl Micrbiol Biotechnol 2012；94:36-46.

Smith SA,Nivarthi UK,de Alwis R,Kose N,Sapparapu G,Bombardi R,etal.Dengue virus prM-specific human monoclonal antibodies with virusreplication enhancing properties recognize a single immunodominant antigenicsite.J Virol 2016；90:780–9.

Song KY,Zhao H,Li SH,Li XF,Deng YQ,Wang HJ,et al.Identification andcharacterization of a linearized B-cell epitope on the pr protein of denguevirus.J Gen Virol 2013；94:1510–6.

Trainor NB,Crill WD,Roberson JA,Chang GJ.Mutation analysis of thefusion domain region of St.Louis encephalitis virus envelope protein.Virology2007；360:398-406.

Urakami A,Ngwe Tun MM,Moi ML,Sakurai A,Ishikawa M,Kuno S,et al.Anenvelope-modified tetravalent dengue virus-like-particle vaccine hasimplications for flavivirus vaccine design.J Virol 2017；91:e01181-17.doi:10.1128/JVI.01181-17.

Villar L,Dayan GH,Arredondo-Garcia JL,Rivera DM,Cunha R,Deseda C,etal.Efficacy of a tetravalent dengue vaccine in children in Latin America.NEngl J Med 2015；372:113–23.

Wang Z,Li L,Pennington JG,Sheng J,Yap ML,Plevka P,et al.Obstructionof dengue virus maturation by fab fragments of the 2H2 antibody.J Virol 2013；87:8909-15.

Yamaji H.Suitability and perspectives on using recombinant insectcells for the production of virus-like particles.Appl Microbiol Biotechnol2014；98:1963-70.

Yu IM,Zhang W,Holdaway HA,Li L,Kostyuchenko VA,Chipman PR,etal.Structure of the immature dengue virus at low pH primes proteolyticmaturation.Science 2008；319:1834-7.

Zhang Y,Corver J,Chipman PR,Zhang W,Plevnev SV,Sedlak D,etal.Structures of immature flavivirus particles.EMBO J 2003；22:2604–13.

Zhang X,Ge P,Yu X,Brannan JM,Bi G,Zhang Q,et al.Cryo-EM structure ofthe mature dengue virus at 3.5-A resolution.Nat Struct Mol Biol 2013；20:105-10.

Zheng A,Umashankar M,Kielian M.In vitro and in vivo studies identifyimportant features of dengue virus pr-E protein interactions.PLoS Pathogens2010；6:e1001157.

Zheng A,Yuan F,Kleinfelter LM,Kielian M.Atoggle switch controls thelow pH-triggered rearrangement and maturation of the dengue virus envelopeproteins.Nat Comm 2014；5:3877.

序列表

<110> 清迈大学

国家科学技术发展机构

<120> 黄病毒的成熟病毒样颗粒

<130> CMU-P001WO

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

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aacatcgagg ctgagcctcc tttcggtgag tcctacatcg tgatcggtgc tggtgagaag 1380

gctctgaagc tgtcctggtt caagaagggt tccaccctgg gtaaggcttt ctccaccacc 1440

ctgaagggtg ctcagcgcct ggctgctctg ggtgacaccg cttgggactt cggttccatc 1500

ggtggtgtgt tcaactccat cggtaaggct gtgcaccagg tgttcggtgg tgctttccgc 1560

accctgttcg gtggtatgtc ctggatcacc cagggtctga tgggtgctct gctgctgtgg 1620

atgggtgtga acgctcgcga ccgctccatc gctctggctt tcctggctac cggtggtgtg 1680

ctggtgttcc tggctaccaa cgtgcacgct 1710

<210> 6

<211> 1710

<212> DNA

<213> Dengue virus

<400> 6

tccgtggctc tggtgcctgc tgtgggtatg ggtctggaga cccgcaccga gacctggatg 60

tcctccgagg gtgcttggaa gcacgctcag cgcatcgaga cctggatcct gcgccaccct 120

ggtttcacca tcatggctgc tatcctggct tacaccatcg gaaccaccca cttccagcgc 180

gtgctgatct tcatcctgct gaccgctgtg gctccttcca tgaccatgcg ctgcatcggt 240

atctccaacc gcgacttcgt ggagggtgtg tccggtggtt cctgggtgga catcgtgctg 300

gagaacggtt cctgcgtgac caccatggct aagaacaagc ctaccctgga cttcgagctg 360

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accaacacca ccaccgagtc ccgctgccct acccagggtg agccttccct gaaggaggag 480

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aagcaggagt ccaactggat ccagaaggag accctggtga ccttcaagtc ccctcacgct 960

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ggtgctaccg agatccagat gtcctccggt aacctgctgt tcaccggtgc cctgaagtgc 1080

cgcctgcgca tggacaagct gcagctgaag ggtatgtcct actccatgtg caccggtaag 1140

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ctgaagggtg ctcagcgcct ggctgctctg ggtgacaccg cttgggactt cggttccatc 1500

ggtggtgtgt tcaactccat cggtaaggct gtgcaccagg tgttcggtgg tgctttccgc 1560

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atgggtgtga acgctcgcga ccgctccatc gctctggctt tcctggctac cggtggtgtg 1680

ctggtgttcc tggctaccaa cgtgcacgct 1710

<210> 7

<211> 1710

<212> DNA

<213> Dengue virus

<400> 7

agcgtggctc tgacccctgc ttccggtatg ggtctggaga cccgcgctga gacctggatg 60

tcctccgagg gtgcttggaa gcacgctcag cgcgtggagt cctggatcct gcgcaaccct 120

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aacatcgagc tggagcctcc tttcggtgac tcctacatcg tgatcggtgt gggtaactcc 1380

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ggtggtgtgt tcaactccat cggtaaggct gtgcaccagg tgttcggtgg tgctttccgc 1560

accctgttcg gtggtatgtc ctggatcacc cagggtctga tgggtgctct gctgctgtgg 1620

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ctggtgttcc tggctaccaa cgtgcacgct 1710

<210> 8

<211> 1707

<212> DNA

<213> Dengue virus

<400> 8

tccgtggctc tggctcctgc tgtgggtatg ggtctggaca cccgcaccca gacctggatg 60

tccgctgagg gtgcttggcg tcaggtggag aaggtggaga cctgggctct gcgccaccct 120

ggtttcacca tcctggctct gttcctggct cactacatcg gcacctccct gacccagaag 180

gtggtgatct tcatcctgct gatgctggtg accccttcca tgaccatgcg ctgcgtgggt 240

gtgggtaacc gcgacttcgt ggagggtctg tccggtgcta cctgggtgga cgtggtgctg 300

gagaacggtg gttgcgtgac caccatggct aagaacaagc ctaccctgga catcgagctg 360

cagaagaccg aggctaccca gctggctacc ctgcgcaagc tgtgcatcga gggtaagatc 420

accaacatca ccaccgactc ccgctgccct acccagggtg aggctgctct gcctgaggag 480

caggaccaga actacgtgtg caagcacacc tacgtggacc gcggttgggg taacggttgc 540

ggtctgttcg gtaagggttc cctggtgacc tgcgctaagt tccagtgcct ggagcctatc 600

gagggtaagg tggtgcagta cgagaacctg aagtacaccg tgatcatcac cgtgcacacc 660

ggtgaccaga accaggtggg taacgagacc cagggtgtga ccgtggagat cacccctcag 720

gcttccacca ccgaggctat cctgcctgag tacggcaccc tgggtctgga gtgcttccct 780

ctgaccggtc tggacttcaa cgagatgatc ctgctgacca tgaagaacaa ggcttggatg 840

gtgaaccgcc agtggttctt cgacctgcct ctgccttgga cctccggtgc taccaccgag 900

acccctacct ggaaccgcaa ggagctgctg gtgaccttca agtccgctca cgctaagaag 960

caggaggtgg tggtgctggg ttcccaggag ggtgctatgg ctaccgctct gaccggtgct 1020

accgagatcc agaactccgg tggcacctcc atcttcgctg gtgctctgaa gtgccgcctg 1080

aagatggaca agctggagct gaagggtatg tcctacgcta tgtgcaccaa caccttcgtg 1140

ctgaagaagg aggtgtccga gacccaggct ggcaccatcc tgatccaggt ggagtacaag 1200

ggtgaggacg tgccttgcaa gatccctttc tccaccgagg acggtcaggg taaggctcac 1260

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gaggctgagc ctcctttcgg tgagtccaac atcgtgatcg gtatcggtga caacgctctg 1380

aagatcaact ggtacaagaa gggttccacc ctgggtaagg ccttctccac caccctgaag 1440

ggtgctcagc gcctggctgc tctgggtgac accgcttggg acttcggttc catcggtggt 1500

gtgttcaact ccatcggtaa ggctgtgcac caggtgttcg gtggtgcttt ccgcaccctg 1560

ttcggtggta tgtcctggat cacccagggt ctgatgggtg ctctgctgct gtggatgggt 1620

gtgaacgctc gcgaccgctc catcgctctg gctttcctgg ctaccggtgg tgtgctggtg 1680

ttcctggcta ccaacgtgca cgcttaa 1707

Claims (4)

1.一种能够在哺乳动物中引发免疫应答的病毒样颗粒，其包含黄病毒的M和E结构蛋白的修改形式；所述修改形式由SEQ ID NO.2所示的重组组合M和E序列的氨基酸序列组成。

2.一种编码病毒样颗粒或多肽的分离的多核苷酸，当向受试者施用药学上有效剂量的病毒样颗粒或多肽时，所述病毒样颗粒或多肽能够在该受试者中引发免疫应答，所述病毒样颗粒或多肽包含黄病毒的M和E结构蛋白的修改形式，所述修改形式由SEQ ID NO.2所示的重组组合M和E序列的氨基酸序列组成，所述修改形式为由SEQ ID NO.6所示的多核苷酸编码的氨基酸序列。

3.一种疫苗组合物，其特征在于，包含：药学上可接受的佐剂；和多肽或病毒样颗粒，所述多肽或病毒样颗粒是黄病毒的M和E结构蛋白的修改形式，并且在施用于受试者时具有免疫活性，所述多肽或病毒样颗粒具有一种氨基酸序列，其中氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，包含药学上可接受的佐剂；和氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示的如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

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