WO2011038473A1 - Método, kit, plasmídeo e composição para induzir resposta imune contra virus da dengue baseado em vacinas de dna e vírus quiméricos - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing dengue virus immune response based on DNA vaccines and 17D chimeric viruses in combined or co-administered immunizations. Also within the scope of the present invention are DNA vaccines against the four dengue virus serotypes from the construction of different recombinant plasmids containing the protein E coding gene, or only the domain III sequence of this protein from of each dengue virus serotype (DENV1-4).
  • a vaccine composition consisting of:
  • chimeric viruses comprising the modified 17D yellow fever vaccine virus, by the infectious clone obtaining technology, with the replacement of the sequences encoding the prM and yellow fever proteins by the sequences encoding the virus prM and E proteins dengue from different serotypes;
  • the invention also relates to a kit comprising (a) DNA vaccines against the four dengue virus serotypes from the construction of different recombinant plasmids containing the E protein coding genes from each dengue virus serotype, or only domain III sequences of these proteins, all fused to the sequence encoding the human tissue plasminogen activator signal peptide (t-PA); and, (b) chimeric viruses comprising the modified 17D yellow fever vaccine virus, by the infectious clone obtaining technology, with the replacement of the sequences encoding the prM and E yellow fever proteins by the sequences encoding the prM and E proteins of the dengue virus of different serotypes.
  • t-PA human tissue plasminogen activator signal peptide
  • Dengue is considered one of the main global public health problems among arbovirus diseases due to its importance in terms of morbidity and mortality in the human population, especially in tropical and subtropical regions. Its etiological agent is dengue virus, which is transmitted by the Aedes mosquito, usually Aedes aegypti.
  • Dengue virus belongs to the genus Flavivirus, from the Flaviviridae family. There are 4 types of antigenically and serologically distinct viruses: DENV1, DENV2, DENV3 and DENV4. Despite the primary infection with the dengue induce immunity to the infecting serotype, there is no long-term cross-protection against the other viral serotypes and sequential infections occur with the different dengue viruses.
  • Dengue virus is composed of a viral envelope and a nucleocapsid complexed to an RNA molecule. Its genome is approximately 10,700 nucleotides and consists of a single positive-polarity RNA strand encoding the flaviviral protein precursor polyprotein. This precursor is cleaved by cellular proteases and viral protease generating three structural proteins, C (capsid), prM (pre-membrane) and E (envelope), and seven nonstructural proteins, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5. Translated structural proteins are incorporated into mature infectious virions, while nonstructural proteins are involved in replication and assembly of the virus.
  • Dengue virus protein E (Envelope) is a structural and transmembrane protein, being glycosylated in almost all Flaviviruses. This protein E stands out as the largest glycoprotein component present on the surface of these viruses, having a molecular weight of 55 to 60 kDa, consisting of 493 to 501 amino acids.
  • Protein E is associated with numerous important biological activities. Protein E acts as a binding protein, interacting with receptors present on the cell surface and mediating the fusion of the virus membrane to the host cell membrane. This protein is also related to nucleocapsid dissociation and plays an important role in role in virus virulence. In addition, protein E is a strong immunogen, generating high levels of antibodies in virus-infected patients that can be neutralizing, binding to epitopes that interact with cell receptors and thus preventing the virus from entering host cells ( Chang, 1997; Kinney & Hung, 2001).
  • Protein E is formed by an elongated dimer extending parallel to the virus membrane. Each monomer is composed of three domains: I, II and III. Domain I is central consisting of 120 amino acid residues: 1-51, 133-193, 279-296. Domain II is elongated, comprising the region where the two monomers are linked at various points in the molecule, forming the dimer. Domain II consists of the following amino acid residues: 52-132, 194-280. Domain III is located in the carboxy terminal portion, it is presented as an immunoglobulin, whose function is to bind to cellular receptors, such as DC-SIGN present in immature dendritic cells. Domain III-mediated virus / cell binding promotes viral particle endocytosis. Domain III consists of amino acid residues: 298-394. Epitopes present in this region are capable of inducing type and subtype-specific neutralizing antibody response.
  • the DNA vaccine represents an efficient technology in the development of vaccines for the control of infectious agents.
  • This technique comprises the inoculation of a eukaryotic expression plasmid containing the antigen of of interest, which is synthesized in vivo by cells of the inoculated organism and is presented by histocompatibility complexes I and II (MHC I and II), activating a specific immunity.
  • Endogenous expression of the antigen by host cells appears to simulate a natural viral infection and is capable of generating both a humoral antibody-producing immune response and a cellular response with cytotoxic T-lymphocyte induction.
  • DNA vaccines containing the complete sequence of genes encoding prM and E proteins, and the domain III region of the DENV1-4 virus were able to induce a humoral immune response with Dengue antibodies in murine models.
  • the protective potential of DNA vaccines was evaluated only indirectly (seroneutralization and cellular response) and no direct challenge tests with lethal doses of Dengue virus were performed to evaluate their effectiveness (Chen et al., 2007).
  • Some dengue DNA vaccines have been tested on non-human primates (Aotus and Rhesus) and have provided partial protection assessed by viremia in animals challenged with the Dengue virus (Raviprakash et al. 2000; Putnak et al. 2003; Blair et al., 2006).
  • the present inventors point out that Putnak et al. (2003) constructed a DNA vaccine containing the genes encoding the prM and E proteins from DENV2, observed its immunogenicity in mice and then immunized. Rhesus monkeys. However, several doses of the vaccine were required to induce a short-term protective response. Seven months after immunization, the animals were no longer protected against dengue virus challenges. Thus, we can observe that these studies indicate the need for the use of new strategies to increase the duration of the immune response. More recently it has been shown that combining DNA vaccines with other vaccines can generate more efficient immune responses than the same approaches alone.
  • Patent application WO2008 / 127307 published 23/10/2008, is directed to a method of inducing dengue virus immune response using a dose / booster vaccination methodology. More specifically, WO2008 / 127307 is directed to the administration of a dose of a dengue virus immunogen comprising a DNA vaccine or a tetravalent DNA vaccine or a purified inactivated tetravalent vaccine and a booster dose of a dengue virus immunogen. dengue, comprising a tetravalent attenuated viral vaccine.
  • the document is also directed to the use of adenoviruses containing genes encoding dengue proteins as a booster for a tetravalent vaccine, which may imply low efficiency in inducing dengue immune responses in humans. This is due to the presence in humans of previous immune responses against adenovirus, which may prevent vector adenovirus infection by carrying dengue virus genes, and consequently compromising the efficiency of the dengue virus immune response.
  • the object of the present invention is to provide a method for inducing dengue virus immune response based on DNA vaccines and 17D chimeric viruses in combined or co-administered immunizations.
  • a vaccine composition consisting of (a) DNA vaccines against the four dengue virus serotypes from the construction of different recombinant plasmids containing the E protein encoding genes from each dengue virus serotype, or only sequences corresponding to domain III of these proteins, all fused to the sequence encoding the t-PA signal peptide; and, (b) chimeric viruses comprising the modified 17D yellow fever vaccine virus, whose sequences encoding the prM and E proteins of yellow fever have been replaced by the sequences encoding the dengue virus prM and E proteins of the different serotypes, and a vehicle pharmaceutically acceptable, is included within the scope of the present invention.
  • the invention further provides a kit comprising (a) DNA vaccines against the four dengue virus serotypes from the construction of different recombinant plasmids containing the E protein genes, or only the domain III sequences of these proteins from each dengue virus viral serotype; and, (b) chimeric viruses comprising the modified 17D yellow fever vaccine virus, whose sequences encoding the prM and E yellow fever proteins have been replaced by the sequences encoding the dengue virus prM and E proteins of the different serotypes.
  • Figure 1 is a schematic representation of the plasmids pcTPA, pElD2 and pE2D2.
  • Figure 2 shows immunofluorescence of BHK- Transfected with plasmids pElD2 (A and A '), pE2D2 (B and B ' ) and pcTPA (C and C), where the phase contrast is shown in A, B and C; fluorescence is shown in A ', B'e C (100x A and B increase, 400x C).
  • Figures 3A-3B show the results of the first experiment with pElD2.
  • Figures 3C-3D show the results of the second experiment with pElD2.
  • Figures 4A-4B show the results of the first experiment with pE2D2.
  • Figures 4C-4D show the results of the second experiment with pE2D2.
  • Figures 5A-5D show the results of the third experiment with simultaneous combinations with pElD2, pE2D2, 17D-D2.
  • the present inventors have found in the state of the art that dengue virus envelope (E) protein is a strong immunogen and can generate a protective response with high levels of neutralizing antibodies.
  • the first object of the present invention is to construct dengue DNA vaccines containing the E protein coding genes without the C-terminal hydrophobic region or containing the domain III sequences of these proteins inserted into the plasmid pcTPA which has the signal sequence of the human tissue plasminogen activator (t-PA), an efficient signal peptide already tested in other vaccines.
  • t-PA human tissue plasminogen activator
  • the present invention also aims to establish a method for inducing protective immune response against W 201 dengue virus, based on administration of DNA vaccines and 17D chimeric viruses in combined immunizations in the dose / booster system or co-administration of the two vaccines.
  • the pcTPA plasmid contains a DNA sequence corresponding to the human tissue plasminogen activator (t-PA) signal peptide. There are differences in the size of the t-PA region identified as signal peptide.
  • the article describing t-PA gene cloning and sequencing (Pennica et al., Nature, 301: 214-221, 1983) identifies a 105 base pair region encoding the first 35 amino acids as a signal peptide. .
  • Plasmid pcTPA contains a 69 base pair sequence that corresponds to the first 23 amino acids SEQ ID NO: 8.
  • the sequence corresponding to the t-PA signal peptide was cloned into plasmid pcDNA3 (Invitrogen) using restriction enzyme sites HindIII and EcoRV.
  • HindIII and EcoRV restriction enzyme sites
  • any sequence can be cloned downstream to the EcoRV site using the site of this enzyme which generates blunt-ended fragments and can therefore bind to another also blunt-ended fragment without necessarily having been digested with EcoRV.
  • the pcTPA plasmid retains the five restriction enzyme sites downstream of the? CoRV (BstXI, NotI, Xhol, Xbal and Apal) from the multiple cloning site of plasmid pcDNA3, which can also be used for cloning. of new sequences.
  • the DENV2 New Guinea C (NGC) strain (M29095; gi: 323447) was used. This virus was obtained from culture of infected Vero cells. Gene fragments cloned into the pcTPA plasmid were PCR amplified from the total RNA of DENV2 NGC infected summer cells. RNA served as a template for the synthesis of a cDNA containing target regions using specific oligonucleotides.
  • This cDNA then served as a template for PCR amplification of target sequences using other restriction enzyme site-containing oligonucleotides that were used in the cloning.
  • the amplified fragments were resolved on agarose gel and then removed and purified with resins (clean gene).
  • the obtained fragments, as well as the pcTPA plasmid, were digested with specific restriction enzymes and ligated with T4 DNA ligase.
  • Recombinant clones were obtained from Escherichia coli strain DH5-a transformed with these plasmids, confirmed by restriction enzyme digestions and subsequently by sequencing.
  • This vector promotes the expression of recombinant proteins under the control of the human cytomegalovirus (CMV) promoter and contains the sequence encoding the human tissue plasminogen activator (t-PA) signal peptide that directs these proteins to the extracellular medium.
  • CMV human cytomegalovirus
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • BHK-21 cell cultures were transfected with recombinant plasmids using lipofectamine according to the manufacturer's instructions. Expression of recombinant proteins was analyzed by immunofluorescence, as described in Costa SM et al., 2006.
  • E. coli, DH5-a strain transformed with different plasmids and grown in liquid TB medium overnight at 37 ° C.
  • Plasmids were purified on ion exchange columns using the QIAGEN tip 10,000 kit as recommended by the manufacturer, and resuspended in water, quantified on a spectrophotometer and agarose gel. DNA vaccines were stored at -20 ° C until use.
  • the DNA vaccines of the present invention were tested alone for their protective capacity. These tests aimed to analyze the efficiency of recombinant protein expression in vitro, to evaluate the antibody response generated in mice and to perform challenge assays with intracerebral inoculations of lethal doses of the virus. Seroneutralization tests also were performed with Vero cells and the viruses cited above, as described by Cafour et al., 2001. For evaluation of the constructs obtained, groups of male BALB / c mice about four weeks old were immunized with recombinant plasmids and control. Mice were inoculated intramuscularly (im) into the posterior quadriceps with these plasmids diluted in PBS.
  • DNA vaccines of the present invention were tested on combined virus immunizations.
  • the yellow fever infectious cDNA approach developed by Rice et al., 1989, consisting of two plasmids: pYF5'3'IV and pYFM5.2, was used.
  • the yellow fever virus genome was separated into the two plasmids cited previously, given the lack of stability of some viral sequences in high copy number plasmids.
  • These plasmids were digested with specific restriction enzymes and the generated fragments were ligated, reconstituting the complete genome of the yellow fever vaccine virus.
  • monkey testing with this virus has indicated the need for cDNA genetic modification to make the virus more attenuated (Marchevsky et al., 1995).
  • Plasmid pACNR1180 has been described as an ideal plasmid for cloning the swine fever virus genome, the size of which resembles that of the yellow fever virus genome, allowing stability of the cloned genome. In view of these results, the entire genome of the yellow fever virus was cloned into a modified pACNR1180 plasmid (with the removal of some restriction enzyme sites), generating plasmid pYF17D / 14. Plasmid pYF17D / 14 was generated in two steps.
  • plasmid Gl / 2 was used as a template for PCR amplification of different fragments that were inserted into the modified plasmid of pACNR1180, generating plasmid NSK7. Subsequently, plasmid NSK7 was used for cloning the remainder of the 17D vaccine virus genome contained in on plasmid T3 / 27, then generating plasmid pYF17D / 14. All plasmids were propagated in E. coli MC1061 and purified on Qiagen column. For the construction of chimera 17D-D2, the virus DENV2 strain New Guinea was used.
  • a cDNA similar to that described above for cloning in DNA vaccines, was synthesized which contained the dengue virus genome region that goes from the first nucleotide corresponding to the gene encoding the pr protein to the amino acid 205 corresponding sequence of the DNA. protein E. This region was PCR amplified and inserted into plasmid Gl / 2 between the sites for restriction enzymes Apal and NotI, generating plasmid pGl / 2 DEN2.
  • the cDNA containing the complete 17D-D2 genome was constructed by ligating the fragments: NotI / Nsil generated by digestion of plasmid pGl / 2 DEN2 (with the SP6 promoter, the yellow fever 5 'NTR-C region and prM-2 / 3E of DENV2), Nsil / Mlul generated with the digestion of plasmid pYFD / Fll / 12 (encoding the DENV1 E 3 'region and the start of the yellow fever NS1 gene), and MluI / NotI generated with the digestion of plasmid pYF17D / 14 (which contains the rest of the yellow fever genome). All plasmids were propagated in E.
  • coli XL-1 Blue and purified with Concert High Purity System (Invitrogen). The complete plasmid was linearized with XhoI and used for in vitro transcription through the SP6 promoter region. In vitro synthesized RNA was used for viral regeneration by Vero cell electroporation similar to that described in US 6,171,854.
  • mice In addition to inoculations with isolated DNA vaccines, the immune response generated in mice was also analyzed. treated with combined immunizations: dose system (DNA vaccine) and booster (chimeric 17D-D2 virus), and simultaneous immunizations (co-administration) of both types of vaccines.
  • dose system DNA vaccine
  • booster chimeric 17D-D2 virus
  • simultaneous immunizations co-administration of both types of vaccines.
  • BALB / c mice received two doses of DENV2 DNA vaccines as described above and, two weeks after the last dose, were inoculated subcutaneously (sc) or intramuscularly (im) with 4 log10. Chimeric virus PFU (17D-D2).
  • simultaneous immunizations coadministration
  • the two vaccines DNA and 17D-D2 chimera
  • PBS buffered saline
  • the immune response generated with DNA vaccines alone or in conjunction with chimeric virus was assessed by the production of neutralizing antibodies.
  • the animals were bled retroorbitally two weeks after the second DNA dose or two weeks after the last immunization, and at the end of the DENV2 challenge tests.
  • Preimmune serum was obtained the day before the start of immunizations.
  • neutralization assays DENV viruses were incubated with different dilutions of sera from immunized mice and the ability of these viruses to infect Vero cells was evaluated by the formation of lysis plates. From these analyzes it is possible to titrate neutralizing antibody levels.
  • mice immunized with different plasmids alone or in combination with 17D-D2 virus were challenged by intracerebral inoculation of DENV2. (approximately 4.3 log10 PFU, which corresponds to an LD50 of 3.8) 25 days after the last dose of DNA or 10 days after inoculation with the chimeric virus. Prior to challenge the animals were anesthetized with a ketamine-xylazine mixture. Virus titering was done on Vero cells shortly after its inoculation into animals, as described by Caufour et al., 2001. Mice were evaluated daily up to 21 days after morbidity challenge, especially the development of hind limb paralysis. , and mortality. The dying animals were sacrificed, as well as those that survived 21 days after the challenge. Blood from these mice was collected for seroneutralization tests.
  • a new expression plasmid was constructed by inserting the sequence encoding the human tissue plasminogen activator (t-PA) signal peptide SEQ ID NO: 8 into the original plasmid pcDNA3 (Invitrogen). The fragment equivalent to this sequence was PCR amplified using specific primers ( Figure 1).
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • the 69 bp PCR product was digested and cloned into plasmid pcDNA3 between the enzyme sites iJindlII and EcoRV. The sequence was confirmed by sequencing and the recombinant plasmid called pcTPA ( Figure IA).
  • Plasmids Two plasmids (pElD2 and pE2D2) were constructed from the pcTPA plasmid.
  • the plasmid pcTPA is derived from plasmid pcDNA3 (Invitrogen) by the addition of the sequence encoding the human tissue plasminogen activator signal peptide (t-PA) between the restriction enzyme sites (HindiII and EcoRV downstream to the region).
  • human cytomegalovirus-derived promoter contained in plasmid pcDNA3).
  • Plasmid pElD2 was constructed by inserting the sequence encoding 80% of dengue virus viral envelope protein (E), serotype 2 (DENV2), without the C-terminal portion of protein E. This sequence, contained between nucleotides 937 and 2131 of the complete DENV2 genome, New Guinea C (NGC) strain (Genebank: M29095) was PCR amplified using the sense and antisense oligonucleotides, identified below as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, with requirements for the underlined restriction enzymes EcoRV and Xbal respectively:
  • Plasmid pE2D2 was constructed by inserting the domain III coding sequence of DENV2 protein E, contained between nucleotides 1822 and 2131 of the complete DENV2 genome, strain NGC (Genebank: 29095). This sequence was amplified by PCR using the sense and antisense oligonucleotides identified below as SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, with sites for restriction enzymes EcoRV and Xbal underlined, respectively:
  • Plasmids were isolated by the alkaline extraction method, purified on an ion exchange column (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, resuspended in sterile milliQ water and stored at -20 ° C until use.
  • the 17D-D2 chimeric virus was constructed by exchanging the genes encoding the yellow fever vaccine virus membrane (pr) and envelope (E) proteins YF 17DD for the genes encoding the DENV2 strain NGC prM and E proteins . Details of the construction of the 17D-D2 chimeric virus can be found in Cafour et al., 2001.
  • the yellow fever infectious cDNA approach developed by Rice et al. 1989, which consists of two plasmids: pYF5'3'IV and pYFM5.2, was used.
  • the yellow fever virus genome was separated into the two plasmids cited above, given the lack of stability of some viral sequences in high copy number plasmids.
  • These plasmids were digested with specific restriction enzymes and the generated fragments were ligated, reconstituting the complete genome of the yellow fever vaccine virus.
  • monkey testing with this virus has indicated the need for cDNA genetic modification to make the virus more attenuated (Marchevsky et al., 1995).
  • Plasmid pACNR1180 has been described as an ideal plasmid for cloning the swine fever virus genome, the size of which resembles that of the yellow fever virus genome, allowing stability of the cloned genome.
  • Plasmid pYFl7D / 14 was generated in two steps. First, plasmid Gl / 2 was used as a template for PCR amplification of different fragments that were inserted into the modified plasmid of pACNR1180, generating plasmid NSK7. Subsequently, plasmid NSK7 was used to clone the remainder of the 17D vaccine virus genome contained in plasmid T3 / 27, then generating plasmid pYF17D / 14.
  • plasmids were propagated in E. coli MC1061 and purified on Qiagen column.
  • the virus DENV2 strain New Guinea was used for the construction of chimera 17D-D2, the virus DENV2 strain New Guinea was used.
  • a cDNA similar to that described above for cloning in DNA vaccines, was synthesized which contained the region of the dengue virus genome that goes from the first nucleotide corresponding to the gene encoding the prM protein to the sequence corresponding to amino acid 205 of the. protein E. This region was PCR amplified and inserted into plasmid Gl / 2 between the sites for restriction enzymes Apal and NotI, generating plasmid pGl / 2 DEN2.
  • the cDNA containing the complete 17D-D2 genome was constructed from the ligation of the fragments: NotI / Nsil generated by digestion of plasmid pG1 / 2 DEN2 (with the SP6 promoter, the 5 'NTR-C region of yellow fever and DENV2 prM-2 / 3E), Nsil / Mlul generated with the digestion of plasmid pYFD / Fll / 12 (encoding the 3' E region of DENV1 and the start of the NS1 gene of yellow fever), and Mlul / Notl generated by digestion of plasmid pYFl7D / 14 (which contains the remainder of the yellow fever genome). All plasmids were propagated in E.
  • coli XL-1 Blue and purified with Concert High Purity System (Invitrogen). The complete plasmid was linearized with XhoI and used for in vitro transcription through the SP6 promoter region. In vitro synthesized RNA was used for viral regeneration by Vero cell electroporation similar to that described in US 6,171,854.
  • E1 and E2 proteins were detected by immunofluorescence in transfected BHK cells and observed under a fluorescence light microscope using anti-DENV2 ascites fluid (ATCC) and fluorescein-conjugated mouse anti-IgG antibodies (Southern Biotechnology). Only cells transfected with plasmids with plasmids pElD2 and pE2D2 were fluorescent, demonstrating that these constructs are able to mediate dengue virus protein expression in mammalian cells, as shown in Figure 2.
  • Example 5 Immunizations Two independent experiments were performed to test the protective potential of DNA vaccines alone or in conjunction with the 17D-D2 chimeric virus in the dose / booster system using about 4 weeks old BALB / c mice.
  • the plasmids were diluted in PBS (1x final concentration) and animals were inoculated intramuscularly (im) into the posterior quadriceps with 10C ⁇ g / 10C ⁇ L DNA vaccine per animal (5C (g / 5 ° C per paw)).
  • animals were inoculated subcutaneously (sc) into the plantar cushion or intramuscularly (im) in the posterior quadriceps, with 4 log 10 PFU of diluted virus in Ml99 medium (Sigma) or in PBS . Plasmid pcTPA was used as a negative control.
  • a third experiment with simultaneous immunizations (co-administration) of DNA and 17D-D2 vaccines was performed im.
  • the two vaccines were mixed in one solution with PBS.
  • mice mice per group. Then the animals were immunized every two weeks and two weeks after the last immunization the animals were challenged with intracerebral (ic) inoculation of a lethal dose of mouse neuroadapted DENV2 NGC (3.8 LD50). Then, the animals were evaluated daily until the 21st day for morbidity (development of paralysis, especially in the hind limbs) and survival.
  • the immunization schedules are represented in the Figure 3.
  • Tables 1, 2 and 3 show the immunization schedules.
  • Table 1 shows the immunization scheme of the first experiment with prime / boost protocol or individual immunizations.
  • Table 2 shows the immunization scheme of the second experiment with prime / boost protocol or individual immunizations.
  • Table 3 shows the immunization scheme of the third experiment with simultaneous immunization protocol (co-administration).
  • mice immunized with 2 doses of pElD2 + 1 dose of 17D-D2 showed no signs.
  • the group of animals that received only plasmid pElD2 or 17D-D2 virus showed 10% and 20% paralysis, respectively, as shown in Figures 3A and 3B.
  • the pE2D2 vaccine was less protective compared to the pElD2 vaccine. Only 50% of animals immunized with 2 doses of pE2D2 survived the challenge and 70% had morbidity. On the other hand, 100% of Animals immunized with 2 doses of pE2D2 + 1 dose of 17D-D2 survived the challenge and only 10% of these mice showed any clinical signs of disease, as shown in Figures 3A and 3B.
  • 17D-D2 proved to be as efficient as immunizations in the dose / booster system, inducing protection in 100% of the animals, regardless of the 17D-D2 virus (im or sc) route of inoculation, without any clinical signs of disease.
  • results are exemplified in Table 4, with animal sera used in the first dose and boost system immunization experiment. Results demonstrate a significant increase in neutralizing antibody levels in animals receiving combined immunization in the dose / booster system.
  • the present invention was exemplified for DENV2, however the construction of DNA vaccines against the other dengue virus serotypes (DENV 1,3 and 4) follows the same methodology as described herein for DENV2.
  • composition (s) of the present invention may contain an acceptable pharmaceutical carrier. Any pharmaceutical carrier known to those skilled in the art may be used in the composition (s) of the present invention, depending on the mode of administration.
  • the term pharmaceutical carrier refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the DNA vaccine or chimeric virus is administered.
  • Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids, such as water and oil, including those of animal, vegetable or synthetic origin.
  • Pharmaceutical excipients include starch, glucose, fructose, gelatin, malt, rice, flour, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like.
  • the composition (s) of the present invention may contain small amounts of emulsifying agents, or pH buffering agents.
  • a pharmaceutical carrier will depend upon the administration of the vaccine composition.
  • the preferred carrier consists of water, saline, alcohol, fat, wax or buffer solution.
  • mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose and magnesium carbonate may be employed.
  • Agents containing a substance may also be used to protect the antigen from rapid catabolism, such as aluminum hydroxide or mineral oil.
  • the present invention utilized inoculation of the DNA DNA vaccine with two doses of 10 ⁇ g DNA ( ⁇ g per dose administered at two week intervals. Different dose numbers may also be used (such as one, three, four, etc.). with different DNA concentrations (ranging from 0. ⁇ g to 1 g), and administered at varying time intervals (from 1 week to 1 year between each DNA dose).
  • Immunizations of the DNA vaccines of the present invention were performed im via needle injections.
  • Other immunization routes may also be used as for example intradermal, subcutaneous, transcutaneous, intravenous or intraperitoneal route.
  • Such inoculations may be administered with or without needle assistance.
  • needleless inoculation we can cite the use of inoculation by biobalistics (Genegun), Bioejector, pads, etc.
  • DNA vaccines were administered im via syringes with needles and the chimeric virus 17D-D2 was also inoculated with syringes im or sc.
  • DNA vaccines were administered im via syringes with needles and the chimeric virus 17D-D2 was also inoculated with syringes im or sc.
  • other inoculation routes with or without needles may also be used as exemplified above.
  • Immunizations with DNA and 17D-D2 vaccines were administered at two-week intervals in both the dose and booster system and co-administration system. Such inoculations can also be performed at varying time intervals (from 1 week to 5 years), with different doses (one, two, three and etc).
  • concentrations of inoculated DNA vaccines 100 g per dose
  • chimeric viruses 4 log 10 PFU
  • the first immunization (dose) was performed with DNA vaccines while booster was given by chimeric virus immunization. It is also possible to reverse this protocol, with first immunization with chimeric viruses and booster with DNA vaccines administered at varying intervals.
  • the present invention has utilized the gene encoding dengue virus protein E.
  • Other genes of this virus may also be used, such as the sequences encoding the C (capsid), prM (membrane), NS1 (nonstructural 1) and NS3 (nonstructural 3) proteins.
  • the NS1 protein has already been tested in isolated DNA vaccines demonstrating potential protective against dengue virus (Costa et al., 2006, 2007).
  • the novel approach to immunization of the present invention utilizes DNA vaccines and chimeric yellow fever vaccine vaccines with dengue virus genes (17D-D2). It is This approach can also be used with 17D chimeric DNA and DNA vaccines containing genes from other flaviviruses. The approach can also be used with DNA vaccines containing yellow fever genes and 17D vaccine virus.
  • an effective dengue virus vaccine is provided.
  • the invention has also demonstrated a novel method for inducing dengue virus immune response based on DNA vaccines and 17D chimeric viruses in combined immunizations, dose system (DNA vaccine) and booster (chimeric virus) or simultaneous co-administration. of the two vaccine strategies (DNA vaccines and chimeric viruses in one formulation).
  • a vaccine composition and kit comprising DNA vaccines against the four chimeric dengue virus serotypes is also disclosed in the present invention.

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Abstract

A presente invenção se refere a um método para induzir resposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas ou coadministradas. Tambén estão dentro do escopo da presente invenção, vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmídeos recombinantes contendo o gene que codifica a proteina E, ou somente a seqüência que corresponde ao dominio III desta proteína, a partir de cada sorotipo viral do virus dengue (DENV1-4). A invenção fornece ainda uma composição vacinal consistiendo de (a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do virus dengue, (b) virus quiméricos compreendendo o virus vacinal de febre amarella 17D modificado; e (c) um veículo farmaceuticamente aceitável, está incluido no escopo de proteção.

Description

MÉTODO, KIT, PLASMÍDEO E COMPOSIÇÃO PARA INDUZIR RESPOSTA IMUNE CONTRA VÍRUS DA DENGUE BASEADO EM VACINAS DE DNA E VÍRUS QUIMÉRICOS
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um método para induzir resposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas ou co- administradas . Também estão dentro do escopo da presente invenção, vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmídeos recombinantes contendo o gene que codifica a proteína E, ou somente a sequência que corresponde ao domínio III desta proteína, a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue (DENV1-4).
Está incluída no escopo de proteção uma composição vacinai consistindo de:
(a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmídeos recombinantes contendo os genes das proteínas E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue, ou somente as sequências que correspondem ao domínio III destas proteínas, todas fusionadas à sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) ;
(b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtenção de clone infeccioso, com a substituição das sequências que codificam as proteínas prM e E de febre amarela pelas sequências que codificam as proteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos; e,
(c) um veiculo farmaceuticamente aceitável,
A invenção se relaciona também a um kit compreendendo (a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmídeos recombinantes contendo os genes que codificam as proteínas E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue, ou somente as sequências que correspondem ao domínio III destas proteínas, todas fusionadas à sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) ; e, (b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtenção de clone infeccioso, com a substituição das sequências que codificam as proteínas prM e E de febre amarela pelas sequências que codificam as proteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos .
Fundamentos da Invenção
A dengue é considerada um dos principais problemas de saúde pública mundial, entre as doenças causadas por arbovírus, devido a sua importância em termos de morbidade e mortalidade na população humana, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais. Seu agente etiológico é o vírus da dengue que é transmitido pelo mosquito do género Aedes, geralmente Aedes aegypti.
0 vírus da dengue (DENV) pertence ao género Flavivirus, da família Flaviviridae . Há 4 tipos de vírus antigenicamente e sorologicamente distintos: DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4. Apesar da infecção primária pelo vírus da dengue induzir uma imunidade ao sorotipo infectante, não há uma proteção cruzada de longa duração contra os outros sorotipos virais, ocorrendo infecções sequenciais com os diferentes virus da dengue.
O virus da dengue é composto por um envelope virai e um nucleocapsideo complexado a uma molécula de RNA. Seu genoma é de aproximadamente 10.700 nucleotideos e constitui-se de uma fita simples de RNA com polaridade positiva que codifica a poliproteina precursora das proteínas flavivirais. Este precursor é clivado por proteases celulares e pela protease virai gerando três proteínas estruturais, C (capsídeo) , prM (pre-membrana) e E (envelope) , e sete proteínas não estruturais, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. As proteínas estruturais traduzidas são incorporadas nos vírions infecciosos maduros, enquanto as proteínas não estruturais estão envolvidas na replicação e montagem do vírus.
A proteína E (Envelope) do vírus da Dengue é uma proteína estrutural e transmembrana, sendo glicosilada em quase todos Flavivirus. Essa proteína E se destaca como o maior componente glicoprotéico presente na superfície desses vírus, possuindo peso molecular de 55 a 60 kDa, constituída de 493 a 501 aminoácidos.
A proteína E está associada a numerosas atividades biológicas importantes. A proteína E atua como proteína ligante, interagindo com receptores presentes na superfície celular e mediando à fusão da membrana do vírus à membrana da célula hospedeira. Essa proteína também está relacionada à dissociação do nucleocapsideo e desempenha um importante papel na virulência do vírus. Além disso, a proteína E é um forte imunógeno, gerando altos níveis de anticorpos em pacientes infectados com o vírus, que podem ser neutralizantes, se ligando a epítopos que interagem com receptores celulares e impedindo, portanto a entrada do vírus nas células do hospedeiro (Chang, 1997; Kinney & Hung, 2001) .
A proteína E é formada por um dímero alongado que se estende paralelamente à membrana do vírus. Cada monômero é composto de três domínios: I, II e III. O domínio I é central constituído de 120 resíduos de aminoácidos: 1-51, 133-193, 279-296. 0 domínio II é alongado, compreende a região onde os dois monômeros estão ligados em vários pontos na molécula, formando o dímero. O domínio II é constituído dos seguintes resíduos de aminoácido: 52-132, 194-280. O domínio III está localizado na porção carbóxi- terminal, apresenta-se como uma imunoglobulina, cuja função é se ligar a receptores celulares, como por exemplo, DC- SIGN presente nas células dendríticas imaturas. A ligação vírus/célula mediada pelo domínio III promove a endocitose da partícula virai. 0 domínio III é constituído dos resíduos de aminoácidos: 298-394. Os epítopos presentes nessa região são capazes de induzir resposta de anticorpos neutralizantes tipo e subtipo-específico .
Diversas vacinas vêm sendo propostas para o combate à dengue, contudo nenhuma das abordagens sugeridas apresentou as características necessárias para uma vacinação em massa, como segurança e uma resposta imune protetora de longo prazo contra os diferentes sorotipos virais circulantes. Uma das principais dificuldades é construir um protótipo de vacina contendo componentes que induzam uma imunidade protetora contra os quatro sorotipos de virus da dengue, sem gerar consequências como a febre hemorrágica, e utilizando o menor número possível de doses.
Esforços consideráveis vêm sendo realizados para o desenvolvimento de uma vacina tetravalente atenuada. O mais promissor destes candidatos consiste em vírus atenuados por passagens em cultura de células. Esta vacina está em fase de avaliações clínicas, contudo já foram observadas algumas complicações. Além disso, existe o risco potencial de infecções sérias por vírus que possam surgir de reversões gênicas ou recombinações, tornando difícil formular uma vacina viva atenuada multivalente devido à possibilidade de interferência homóloga ou heteróloga durante a replicação virai (Barrett, 2001; Kinney & Huang, 2001) .
Outra estratégia empregada para o desenvolvimento de uma vacina contra o vírus da dengue é a construção de quimeras. Essa tecnologia vem sendo utilizada em diversas pesquisas de vacinas contra Flavivirus, incluindo o vírus da Dengue (Galier et al., 2005).
Apesar dos avanços obtidos até o momento, existe ainda um grande desafio: produzir uma vacina capaz de gerar uma resposta homogénea contra os quatro sorotipos do vírus da Dengue.
A vacina de DNA representa uma eficiente tecnologia no desenvolvimento de vacinas para o controle de agentes infecciosos. Esta técnica compreende a inoculação de um plasmídeo de expressão eucariótico contendo o antígeno de interesse, que é sintetizado in vivo pelas células do organismo inoculado e é apresentado pelos complexos de histocompatibilidade I e II (MHC I e II) , ativando uma imunidade especifica. A expressão endógena do antigeno pelas células hospedeiras parece simular uma infecção virai natural sendo capaz de gerar tanto uma resposta imune humoral, com produção de anticorpos, como uma resposta celular, com indução de linfócitos T citotóxicos. A indução destas duas formas de resposta imune fornece vantagens em comparação com as vacinas de subunidades, que produzem principalmente, ou exclusivamente, uma resposta de anticorpos, e se compara à resposta celular de vacinas vivas atenuadas, sem apresentar o risco de reversão para forma patogênica do agente infeccioso. Além disso, as vacinas de DNA são estáveis a variações de temperatura, de menor custo para a produção em grande escala, e permitem uma rápida seleção de sequências a serem avaliadas.
Recentemente, vários grupos têm analisado o uso da vacina de DNA no controle de flavivirus. Alguns destes estudos com diferentes vírus desta família têm demonstrado a indução de uma resposta imune protetora flavivírus- específica em camundongos e primatas não humanos após a vacinação com plasmídeos codificando as proteínas flavivirais prM e E (Phillpotts et al., 1996; Kochel et al., 1997;; Raviprakash et al, 2000). Algumas análises também foram realizadas utilizando vacinas de DNA contendo os genes de proteínas não estruturais de flavivirus como: o vírus da encefalite japonesa, hepatite C e dengue (Lin et al., 1998; Encke et al., 1998; Wu et al., 2003; Costa et al. , 2006, 2007) .
Estudos recentes demonstraram que vacinas DNA contendo a sequência completa dos genes que codificam as proteínas prM e E, e a região do domínio III do vírus DENVl-4, foram capazes de induzir uma resposta imune humoral com a presença de anticorpos contra Dengue em modelos murinos. Entretanto nestes estudos o potencial protetor das vacinas de DNA foi avaliado somente indiretamente (soroneutralização e resposta celular) não sendo realizados testes de desafios diretos com doses letais do vírus da Dengue para avaliar eficácia dessas vacinas (Chen et al., 2007). Algumas vacinas de DNA contra dengue foram testadas em primatas não humanos (Aotus e Rhesus) e conferiram proteção, parcial, avaliada através da viremia nos animais desafiados com o vírus da Dengue (Raviprakash et al., 2000; Putnak et al., 2003; Blair et al. , 2006) .
No que se refere ao método de imunização, os presentes inventores destacam que Putnak e colaboradores (2003) , construíram uma vacina DNA contendo os genes que codificam as proteínas prM e E a partir do DENV2, observaram a imunogenicidade desta em camundongos e imunizaram em seguida macacos Rhesus. Entretanto, foram necessárias várias doses da vacina para a indução de uma resposta protetora e de curta duração. Sete meses após as imunizações, os animais não se mostraram mais protegidos contra desafios com o vírus da dengue. Assim, podemos observar que estes estudos indicam a necessidade da utilização de novas estratégias para aumentar a duração da resposta imune. Mais recentemente tem sido demonstrado que a combinação de vacinas de DNA com outras vacinas pode gerar respostas imunes mais eficientes do que as mesmas abordagens isoladamente. O pedido de patente WO2008/127307, publicado em 23/10/2008, está direcionado para um método de indução de resposta imune contra o vírus da dengue usando uma metodologia de vacinação de dose/reforço. Mais especificamente, o documento WO2008/127307 está direcionado à administração de uma dose de um imunógeno do virus da dengue que compreende uma vacina de DNA ou uma vacina tetravalente de DNA ou uma vacina tetravalente inativada purificada e uma dose reforço de um imunógeno do vírus da dengue, compreendendo uma vacina virai tetravalente de vírus atenuado. Entretanto, esta estratégia apresenta as dificuldades inerentes à utilização de uma vacina tetravalente de vírus dengue atenuado, como por exemplo a possibilidade de interferência de um ou mais vírus na replicação in vivo dos outros vírus, levando consequentemente a respostas imunes heterogéneas em relação aos diferentes sorotipos virais. Além disso, o documento também está direcionado à utilização de adenovírus contendo genes que codificam proteínas de dengue como reforço para uma vacina tetravalente, o que pode implicar em uma baixa eficiência na indução de respostas imunes contra dengue em seres humanos. Tal fato se deve à presença, em seres humanos, de respostas imunes prévias contra adenovírus, que podem impedir a infecção com adenovírus vetor carreando genes do vírus da dengue, e consequentemente comprometendo a eficiência da resposta imune ao vírus da dengue.
Também é conhecido o pedido de patente US20080193477 , publicado em 14/08/2008, um método que emprega um regime de imunização compreendendo a administração de uma primeira vacina de febre amarela seguida da administração de uma vacina de dengue a base de flavivirus quimérico. Entretanto, outros relatos na literatura demonstraram que a imunização com o vírus vacinai da febre amarela pode comprometer a eficiência da resposta imune gerada posteriormente com vírus quiméricos de febre amarela contendo genes do vírus da dengue. Neste caso os níveis de anticorpos neutralizantes contra o vírus da dengue foram significativamente menores em macacos previamente vacinados contra febre amarela (Galier et al., 2005). Como aqui discutido, verificamos que apesar dos esforços que vem sendo desenvolvidos, há ainda uma necessidade para o desenvolvimento de vacinas de DNA mais eficazes e capazes de induzir um aumento da resposta imune, assim como a utilização de estratégias vacinais combinadas que incrementem esta resposta imune.
Sumário da Invenção
O objetivo da presente invenção é propiciar um método para induzir resposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas ou co-administradas .
Também é um objetivo da invenção fornecer uma composição de vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmídeos recombinantes contendo os genes que codificam as proteínas E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue (DENV1-4), ou somente as sequências que correspondem ao domínio III destas proteínas, todas fusionadas à sequência que codifica o peptídeo sinal do t-PA. Uma composição vacinai consistindo de (a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do virus dengue a partir da construção de diferentes plasmideos recombinantes contendo os genes que codificam as proteínas E a partir de cada sorotipo virai do virus dengue, ou somente as sequências que correspondem ao domínio III destas proteínas, todas fusionadas à sequência que codifica o peptídeo sinal do t- PA; e, (b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela 17D modificado, cujas sequências que codificam as proteínas prM e E de febre amarela foram substituídas pelas sequências que codificam as proteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos, e um veículo farmaceuticamente aceitável, está incluída no objetivo da presente invenção.
A invenção apresenta ainda um kit compreendendo (a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmideos recombinantes contendo os genes das proteínas E, ou somente as sequências que correspondem ao domínio III destas proteínas a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue; e, (b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela 17D modificado, cujas sequências que codificam as proteínas prM e E de febre amarela foram substituídas pelas sequências que codificam as proteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos.
Breve Descrição da Figuras
A Figura 1 é uma representação esquemática dos plasmideos pcTPA, pElD2 e pE2D2.
A Figura 2 mostra a imunofluorescência de células BHK- 21 transfectadas com os plasmídeos pElD2 (A e A'), pE2D2 (B e B') e pcTPA (C e C), onde o contraste de fase é mostrado em A, B e C; a fluorescência é mostrado em A', B'e C (aumento de lOOOx A e B, 400x C) .
As Figuras 3A-3B mostram os resultados do primeiro experimento com pElD2.
As Figuras 3C-3D mostram os resultados do segundo experimento com pElD2.
As Figuras 4A-4B mostram os resultados do primeiro experimento com pE2D2.
As Figuras 4C-4D mostram os resultados do segundo experimento com pE2D2.
As Figuras 5A-5D mostram os resultados do terceiro experimento com combinações simultâneas com pElD2, pE2D2, 17D-D2.
Descrição Detalhada da Invenção
Os presentes inventores encontraram no estado da arte que a proteína do envelope (E) do vírus da dengue é um forte imunógeno, podendo gerar uma resposta protetora com altos níveis de anticorpos neutralizantes . Sendo assim, o primeiro objetivo da presente invenção é construir vacinas de DNA contra dengue contendo os genes que codificam as proteínas E, sem a região hidrofóbica C-terminal, ou contendo as sequências dos domínios III destas proteínas, inseridos no plasmídio pcTPA, que possui a sequência sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) , um eficiente peptídeo sinal já testado em outras vacinas. A presente invenção também tem como objetivo estabelecer um método para induzir resposta imune protetora contra os W 201 vírus da dengue, baseada na administração de vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas no sistema de dose/reforço ou co-administração das duas vacinas.
O plasmídeo pcTPA contém uma sequência de DNA correspondente ao peptídeo sinal do gene do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) . Existem diferenças no tamanho da região do t-PA identificada como peptídeo sinal. O artigo que descreve a clonagem e o sequenciamento do gene do t-PA (Pennica et al., Nature, 301:214-221, 1983) identifica uma região de 105 pares de bases, que codifica os primeiros 35 aminoácidos, como peptídeo sinal. O plasmídeo pcTPA contém uma sequência de 69 pares de bases que corresponde aos primeiros 23 aminoácidos SEQ ID NO: 8. A sequência correspondente ao peptídeo sinal do t-PA foi clonada no plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen) utilizando os sítios das enzimas de restrição HindlII e EcoRV. Deste modo, qualquer sequência pode ser clonada a jusante ao sítio ÊcoRV, utilizando o sítio desta enzima que gera fragmentos de ponta cega, podendo, portanto, se ligar a outro fragmento também de ponta cega, sem necessariamente ter sido digerido com ÊcoRV. Além deste sítio, o plasmídeo pcTPA conserva os cinco sítios de enzimas de restrição a jusante ao da £coRV (BstXI, NotI, Xhol, Xbal e Apal) , oriundos do sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo pcDNA3, que também podem ser utilizados para clonagens de novas sequências .
Para a construção dos diferentes plasmídeos recombinantes, contendo a sequência que codifica a proteína E sem a sua porção hidrofóbica C-terminal (E80%) - SEQ ID NO: 6 -, ou somente a sequência que corresponde ao domínio III - SEQ ID NO: 7 - desta proteína, foi utilizada a linhagem de DENV2 Nova Guiné C (NGC) (M29095; gi:323447). Esse vírus foi obtido a partir de cultura de células Vero infectadas. Os fragmentos do gene E clonados no plasmídeo pcTPA foram amplificados por PCR a partir do RNA total de células vero infectadas com DENV2 NGC. O RNA serviu como molde para a síntese de um cDNA contendo as regiões alvo, utilizando oligonucleotídeos específicos. Este cDNA serviu então como molde para a amplificação por PCR das sequências alvo, utilizando outros oligonucleotídeos contendo sítios de enzimas de restrições que foram usadas nas clonagens. Os fragmentos amplificados foram resolvidos em gel de agarose e em seguida retirados e purificados com resinas (gene clean) . Os fragmentos obtidos, assim como o plasmídeo pcTPA, foram digeridos com enzimas de restrições específicas e ligados com T4 DNA ligase. Os clones recombinantes foram obtidos em Escherichia coli, cepa DH5- a, transformada com estes plasmídeos, confirmados por digestões com enzimas de restrição e posteriormente por sequenciamento .
Para avaliar a capacidade dos plasmídeos recombinantes, obtidos conforme descrito acima, de mediarem a expressão das proteínas E, sem a região hidrofóbica na porção C-terminal (E80%) ou somente o seu domínio III (dom III), foram realizados ensaios de análise da expressão in vitro destas proteínas utilizando células BHK-21 transfectadas com os diferentes plasmídeos. Os plasmídeos recombinantes foram obtidos a partir do plasmídeo pcTPA, que foi construído a partir do plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen) . Esse vetor promove a expressão das proteínas recombinantes sob o controle do promotor do citomegalovirus humano (CMV) e contém a sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) , que direciona estas proteínas para o meio extracelular .
Para avaliar a produção das proteínas de interesse, culturas de células BHK-21 foram transfectadas com os plasmídeos recombinantes, utilizando lipofectamina, de acordo com as instruções do fabricante. A expressão das proteínas recombinantes foi analisada por imunofluorescência, conforme descrito em Costa SM et al., 2006 Para a produção em grande escala dos plasmídeos recombinantes e controle, foram utilizadas bactérias E. coli, cepa DH5-a, transformadas com os diferentes plasmídeos e cultivadas em meio TB líquido, durante a noite a 37°C. Os plasmídeos foram purificados em colunas de troca iônica, utilizando o kit QIAGEN tip 10.000 conforme recomendação do fabricante, e ressuspensos em água, quantificados em espectrofotômetro e gel de agarose. As vacinas de DNA foram armazenadas a -20°C até sua utilização .
As vacinas de DNA da presente invenção foram testadas isoladamente quanto à sua capacidade protetora. Esses testes tiveram por finalidade analisar a eficiência da expressão das proteínas recombinantes in vitro, avaliar a resposta de anticorpos gerada em camundongos e realizar ensaios de desafios com inoculações intracerebrais de doses letais do vírus. Os testes de soroneutralização também foram realizados com células Vero e com os vírus citados anteriormente, conforme descrito por Cafour et al., 2001. Para a avaliação das construções obtidas, grupos de camundongos BALB/c machos com cerca de quatro semanas de idade foram imunizados com os plasmídeos recombinantes e controle. Os camundongos foram inoculados por via intramuscular (im) nos quadrícepes posteriores com estes plasmídeos diluídos em PBS. Em cada inoculação foram injetados 100μg de DNA por animal (50yg por pata) . Na nova abordagem de imunização da presente invenção, ou seja, o sistema de dose (vacina de DNA) e reforço (vírus quimérico) ou imunizações simultâneas (co-administração) , as vacinas de DNA da presente invenção foram testadas em imunizações combinadas com vírus quimérico (17D-D2). Esta quimera foi construída a partir do vírus vacinai da febre amarela YF 17D, com a substituição dos genes que codificam as proteínas prM e E deste vírus pelos genes prM e E de DENV2, cepa NGC, SEQ ID NO: 9. Vale ressaltar que os testes dessa nova abordagem de imunização foram iniciados com a construção das vacinas de DNA de DENV2 e a realização de um teste de desafio que demonstrou a capacidade protetora destas vacinas, principalmente quando se utilizou a sequência que codifica o gene E sem a sua porção hidrofóbica C-terminal.
Para a construção da quimera 17D-D2, foi utilizada a abordagem do cDNA infeccioso de febre amarela, desenvolvido por Rice et al., 1989, que consiste em dois plasmídeos: pYF5'3'IV e pYFM5.2. Nesta abordagem o genoma do vírus de febre amarela foi separado nos dois plasmídeos citados anteriormente, dada a falta de estabilidade de algumas sequências virais em plasmideos de alto número de cópias. Estes plasmideos foram digeridos com enzimas de restrições especificas e os fragmentos gerados foram ligados, reconstituindo o genoma completo do vírus vacinai de febre amarela. Entretanto, testes em macacos com este vírus indicaram a necessidade de modificações genéticas do cDNA para tornar o vírus mais atenuado (Marchevsky et al., 1995) . Tais modificações foram realizadas por Galier e Freire (US 6.171.854) e resultaram em novas versões dos plasmideos pYF5' 3'IV e pYFM5.2, denominados Gl/2 e T3/27, respectivamente. Posteriormente, foi utilizado o plasmideo pACNR1180 (Ruggli et al . , 1996) que possui uma origem de replicação (P15A) , que limita o número de replicações deste plasmideo, reduzindo assim o número de cópias do DNA plasmidial em bactérias. O plasmideo pACNR1180 foi descrito como um plasmideo ideal para clonagem do genoma do vírus de febre suína, cujo tamanho se assemelha ao do genoma do vírus da febre amarela, permitindo a estabilidade do genoma clonado. Tendo em vista estes resultados, o genoma inteiro do vírus de febre amarela foi clonado em um plasmideo modificado do pACNR1180 (com a retirada de alguns sítios de enzimas de restrição), gerando o plasmideo pYF17D/14. 0 plasmideo pYF17D/14 foi gerado em duas etapas. Primeiro o plasmideo Gl/2 foi utilizado como molde para amplificação por PCR de diferentes fragmentos que foram inseridos no plasmideo modificado do pACNR1180, gerando o plasmideo NSK7. Posteriormente, o plasmideo NSK7 foi utilizado para a clonagem do restante do genoma do vírus vacinai 17D contido no plasmideo T3/27, gerando então o plasmideo pYF17D/14. Todos os plasmideos foram propagados em E. coli MC1061 e purificados em coluna Qiagen. Para a construção da quimera 17D-D2 foi utilizado o vírus DENV2 cepa Nova Guiné. Foi sintetizado um cDNA, de modo semelhante ao descrito anteriormente para as clonagens nas vacinas de DNA, que continha a região do genoma do vírus da dengue que vai do primeiro nucleotídeo correspondente ao gene que codifica a proteína pr até a sequência correspondente ao aminoácido 205 da proteína E. Esta região foi amplificada por PCR e inserida no plasmideo Gl/2 entre os sítios para as enzimas de restrição Apal e NotI, gerando o plasmideo pGl/2 DEN2. O cDNA contendo o genoma completo 17D-D2 foi construído a partir da ligação dos fragmentos: NotI/Nsil gerado com digestão do plasmideo pGl/2 DEN2 (com o promotor SP6, a região 5' NTR-C de febre amarela e prM-2/3E de DENV2 ) , Nsil/Mlul gerado com a digestão do plasmideo pYFD/Fll/12 (codificando a região 3' de E de DENV1 e o início do gene NS1 de febre amarela) , e MluI/NotI gerado com a digestão do plasmideo pYF17D/14 (que contém o restante do genoma de febre amarela) . Todos os plasmideos foram propagados em E. coli XL-1 Blue e purificados com Concert High Purity System (Invitrogen) . O plasmideo completo foi linearizado com Xhol e utilizado para a transcrição in vitro, através da região promotora SP6. 0 RNA sintetizado in vitro foi utilizado para a regeneração virai por eletroporação de células Vero de modo similar ao descrito no documento US 6,171,854.
Além das inoculações com as vacinas de DNA isoladas, foi analisada também a resposta imune gerada em camundongos tratados com imunizações combinadas: sistema de dose (vacina de DNA) e reforço (vírus quimérico 17D-D2) , e imunizações simultâneas (co-administração) dos dois tipos de vacinas. No sistema de dose/reforço, camundongos BALB/c receberam duas doses das vacinas de DNA de DENV2, como descrito acima, e, duas semanas após a última dose, foram inoculados por via subcutânea (sc) ou intramuscular (im) com 4 loglO PFU de vírus quimérico (17D-D2) . Nas imunizações simultâneas (co-administração) as duas vacinas (DNA e quimera 17D-D2) foram misturadas em solução salina tamponada (PBS) e inoculadas por via im, em duas doses com intervalo de duas semanas.
A resposta imune gerada com as vacinas de DNA isoladamente ou em conjunto com vírus quimérico foi avaliada pela produção de anticorpos neutralizantes.
Os animais foram sangrados por via retro-orbital duas semanas após a segunda dose de DNA ou duas semanas após a última imunização, e ao final dos testes de desafio com DENV2. O soro pré-imune foi obtido no dia anterior ao início das imunizações. Nos ensaios de neutralização, os vírus DENV foram incubados com diferentes diluições dos soros dos camundongos imunizados e posteriormente foi avaliada a capacidade destes vírus infectar células Vero, através da formação das placas de lise. A partir dessas análises é possível titular os níveis de anticorpos neutralizantes .
Os camundongos BALB/c imunizados com os diferentes plasmídeos isoladamente ou em combinação com o vírus 17D-D2 foram desafiados por inoculação intracerebral de DENV2 (aproximadamente 4.3 loglO PFU, que corresponde a uma LD50 de 3,8), 25 dias após a última dose de DNA ou 10 dias após a inoculação com o virus quimérico. Antes do desafio os animais foram anestesiados com uma mistura de ketamine- xylazine. A titulação do virus foi feita em células Vero logo após a sua inoculação nos animais, como descrito por Caufour et al., 2001. Os camundongos foram avaliados diariamente até 21 dias após o desafio quanto à morbidade, principalmente o desenvolvimento de paralisia nos membros posteriores, e mortalidade. Os animais moribundos foram sacrificados, assim como os que sobreviveram 21 dias após o desafio. O sangue destes camundongos foi coletado, para os testes de soroneutralização.
A invenção será, agora, descrita através de exemplos. Os exemplos seguintes são ilustrativos da invenção e representam as modalidades preferidas, aqueles habilitados no estado da arte sabem ou são capazes de encontrar, usando nada mais que experimentação rotineira, como empregar outros materiais e técnicas apropriadas.
Exemplo 1 - Construção do vetor de expressão pcTPA:
Um novo plasmideo de expressão foi construido inserindo a sequência que codifica o peptídeo sinal do do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) - SEQ ID NO:8 no plasmideo original pcDNA3 ( Invitrogen) . O fragmento equivalente a esta sequência foi amplificado por PCR, utilizando iniciadores específicos (Figura 1) .
Abaixo apresentamos os oligonucleotídeos usados para a reação de amplificação por PCR. Os sítios de restrição Hind III e £coRV estão sublinhados, respectivamente. SEQ ID ΝΟ:1 - Oligonucleotíodeo senso (TPA1)
5' GGGGAAGCTTATGGATGCAATGAAGAGG3'
SEQ ID NO: 2 - Oligonucleotídeo antisenso (TPA2 )
5' GGGGATATCGCTGGGCGAAACGAAGAC3'
O produto de PCR, contendo 69 pb, foi digerido e clonado no plasmideo pcDNA3 entre os sítios das enzimas iJindlII e EcoRV. A sequência foi confirmada por sequenciamento e o plasmideo recombinante denominado de pcTPA (Figura IA) .
Exemplo 2 - Construção de pElD2 e pE2D2
Foram construídos dois plasmídeos (pElD2 e pE2D2) a partir do plasmideo pcTPA. O plasmideo pcTPA é derivado do plasmideo pcDNA3 (Invitrogen) com a adição da sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) , entre os sítios das enzimas de restrição (HindiII e EcoRV, a jusante à região promotora derivada do citomegalovirus humano, contido no plasmideo pcDNA3) .
O plasmideo pElD2 foi construído com a inserção da sequência que codifica 80% da proteína do envelope virai (E) do vírus da dengue, sorotipo 2 (DENV2), sem a porção C- terminal da proteína E. Esta sequência, contida entre os nucleotídeos 937 e 2131 do genoma completo do DENV2, cepa Nova Guiné C (NGC) (Genebank: M29095) foi amplificada por PCR, utilizando os oligonucleotídeos senso e antisenso, identificados abaixo como SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, com os sitos para as enzimas de restrição EcoRV e Xbal sublinhados, respectivamente:
SEQ ID NO: 3 - 5 ' GGGGGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3 ' SEQ ID NO:4 - 5 ' GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3 '
Em seguida foi feita a clonagem da sequência no plasmideo pcTPA entre os sítios das enzimas de restrição EcoRV e Xbal, no mesmo quadro aberto de leitura da sequência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando o plasmideo pElD2 conforme figura 1B.
O plasmideo pE2D2 foi construído com a inserção da sequência que codifica o domínio III da proteína E de DENV2, contida entre os nucleotídeos 1822 e 2131 do genoma completo de DENV2, cepa NGC (Genebank: 29095) . Esta sequência foi amplificada por PCR, utilizando os oligonucleotídeos senso e antisenso, identificados abaixo como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, com os sitos para as enzimas de restrição EcoRV e Xbal sublinhados, respectivamente:
SEQ ID NO: 5 - 5 ' GGGGGATATCGGAATGTCATACTCTATG3 '
SEQ ID NO: 4 - 5 ' GGGGTC AGATTACGATAGAACTTCCTTTC3 '
Em seguida foi feita a clonagem da sequência no plasmideo pcTPA entre os sítios das enzimas de restrição EcoRV e Xbal, no mesmo quadro aberto de leitura da sequência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando o plasmideo pE2D2 conforme figura 1C.
Todas as clonagens foram confirmadas por sequenciamento. A bactéria Escherichia coli, cepa DH5-oc, foi utilizada para as clonagens e produção dos plasmídeos em pequena e grande escala.
Os plasmídeos foram isolados pelo método de extração alcalina, purificados em coluna de troca iônica (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, ressuspensos em água miliQ estéril e estocados a -20°C até a sua utilização.
Exemplo 3 - Virus quimérico 17D-D2
O vírus quimérico 17D-D2 foi construído trocando-se os genes que codificam as proteínas de membrana (pr ) e do envelope (E) do vírus vacinai da febre amarela YF 17DD pelos genes que codificam as proteínas prM e E de DENV2, cepa NGC. Detalhes da construção do vírus quimérico 17D-D2 podem ser encontrados em Cafour et al., 2001.
Para a construção da quiméra 17D-D2, foi utilizada a abordagem do cDNA infeccioso de febre amarela, desenvolvido por Rice et al., 1989, que consiste em dois plasmídeos: pYF5'3'IV e pYFM5.2. Nesta abordagem o genoma do vírus de febre amarela foi separado nos dois plasmídeos citados anteriormente, dada a falta de estabilidade de algumas sequências virais em plasmídeos de alto número de cópias. Estes plasmídeos foram digeridos com enzimas de restrições específicas e os fragmentos gerados foram ligados, reconstituindo o genoma completo do vírus vacinai de febre amarela. Entretanto, testes em macacos com este vírus indicaram a necessidade de modificações genéticas do cDNA para tornar o vírus mais atenuado (Marchevsky et al., 1995) . Tais modificações foram realizadas por Galier e Freire (US 6,171,854) e resultaram em novas versões dos plasmídeos pYF5'3'IV e pYFM5.2, denominados Gl/2 e T3/27, respectivamente. Posteriormente, foi utilizado o plasmídeo pACNR1180 (Ruggli et al., 1996) que possui uma origem de replicação (P15A), que limita o número de replicações deste plasmídeo, reduzindo assim o número de cópias do DNA plasmidial em bactérias. O plasmídeo pACNR1180 foi descrito como um plasmídeo ideal para clonagem do genoma do vírus de febre suína, cujo tamanho se assemelha ao do genoma do vírus da febre amarela, permitindo a estabilidade do genoma clonado. Tendo em vista estes resultados, o genoma inteiro do vírus de febre amarela foi clonado em um plasmídeo modificado do pACNR1180 (com a retirada de alguns sítios de enzimas de restrição), gerando o plasmídeo pYF17D/14. O plasmídeo pYFl7D/14 foi gerado em duas etapas. Primeiro o plasmídeo Gl/2 foi utilizado como molde para amplificação por PCR de diferentes fragmentos que foram inseridos no plasmídeo modificado do pACNR1180, gerando o plasmídeo NSK7. Posteriormente, o plasmídeo NSK7 foi utilizado para a clonagem do restante do genoma do vírus vacinai 17D contido no plasmídeo T3/27, gerando então o plasmídeo pYF17D/14. Todos os plasmídeos foram propagados em E. coli MC1061 e purificados em coluna Qiagen. Para a construção da quimera 17D-D2 foi utilizado o vírus DENV2 cepa Nova Guiné. Foi sintetizado um cDNA, de modo semelhante ao descrito anteriormente para as clonagens nas vacinas de DNA, que continha a região do genoma do vírus da dengue que vai do primeiro nucleotídeo correspondente ao gene que codifica a proteína prM até a sequência correspondente ao aminoácido 205 da proteína E. Esta região foi amplificada por PCR e inserida no plasmídeo Gl/2 entre os sítios para as enzimas de restrição Apal e NotI, gerando o plasmídeo pGl/2 DEN2. O cDNA contendo o genoma completo 17D-D2 foi construído a partir da ligação dos fragmentos: NotI/Nsil gerado com digestão do plasmídeo pGl/2 DEN2 (com o promotor SP6, a região 5' NTR-C de febre amarela e prM-2/3E de DENV2) , Nsil/Mlul gerado com a digestão do plasmideo pYFD/Fll/12 (codificando a região 3' de E de DENV1 e o inicio do gene NS1 de febre amarela) , e Mlul/Notl gerado com a digestão do plasmideo pYFl7D/14 (que contém o restante do genoma de febre amarela) . Todos os plasmideos foram propagados em E. coli XL-1 Blue e purificados com Concert High Purity System ( Invitrogen) . O plasmideo completo foi linearizado com Xhol e utilizado para a transcrição in vitro, através da região promotora SP6. O RNA sintetizado in vitro foi utilizado para a regeneração virai por eletroporação de células Vero de modo similar ao descrito no documento US 6,171,854.
Exemplo 4 - Avaliação da expressão das proteínas recombinai,tas
A expressão das proteínas recombinantes foi avaliada in vitro em células de rim de hamster neonatos (BHK-21) transfectadas com os diferentes plasmideos, utilizando lipofectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A expressão das proteínas El e E2 foi detectada por imunofluorescência nas células BHK transfectadas e observadas em microscópio óptico de fluorescência utilizando fluido ascítico anti-DENV2 (ATCC) e anticorpos anti-IgG de camundongo conjugados a fluoresceína (Southern Biotechnology) . Somente as células transfectadas com os plasmideos com os plasmideos pElD2 e pE2D2 se mostraram fluorescentes, demonstrando que estas construções são capazes de mediar a expressão das proteínas do vírus da dengue em células de mamíferos, conforme Figura 2.
Exemplo 5 - Imunizações Foram realizados dois experimentos independentes para testar o potencial protetor das vacinas de DNA isoladamente ou em conjunto com o vírus quimérico 17D-D2 no sistema de dose/reforço, utilizando camundongos BALB/c com cerca de 4 semanas de idade .
Para as imunizações com as vacinas de DNA, os plasmídeos foram diluídos em PBS (concentração final lx) e os animais foram inoculados por via intramuscular (im) nos quadrícepes posteriores com 10C^g/10C^L da vacina de DNA por animal (5C^g/5C^L por pata) . Para as imunizações com o vírus quimérico 17D-D2, os animais foram inoculados por via subcutânea (sc) no coxim plantar ou intramuscular (im) nos quadrícepes posteriores, com 4 log 10 PFU de vírus diluído em meio Ml99 (Sigma) ou em PBS. O plasmídeo pcTPA foi utilizado como controle negativo.
Foi realizado um terceiro experimento com imunizações simultâneas (co-administração) de vacinas de DNA e 17D-D2 por via im. Neste caso, as duas vacinas foram misturadas em uma só solução com PBS.
Os animais foram separados em grupos (10 camundongos por grupo) . Em seguida os animais foram imunizados a cada duas semanas e duas semanas após a última imunização os animais foram desafiados com inoculação por via intracerebral (ic) de uma dose letal de DENV2 NGC (3,8 LD50) , neuroadaptado a camundongos. Em seguida, os animais foram avaliados diariamente até o 21° dia quanto à morbidade (desenvolvimento de paralisia, principalmente nos membros posteriores) e sobrevivência.
Os cronogramas das imunizações estão representados na Figura 3. As Tabelas 1, 2 e 3 a seguir mostram os esquemas de imunização.
A Tabela 1 mostra o esquema de imunização do primeiro experimento com protocolo de dose e reforço (prime/boost) ou imunizações individuais.
TABELA 1
Figure imgf000027_0001
A Tabela 2 mostra o esquema de imunização do segundo experimento com protocolo de dose e reforço (prime/boost) ou imunizações individuais.
TABELA 2
Grupos Imunização
1 pElD2 (2 doses im)
2 pElD2 (2 doses im) + 17D-D2 (1 dose sc)
3 pE2D2 (2 doses im)
4 pE2D2 (2 doses im) + 17D-D2 (1 dose sc)
5 17D-D2 (2 doses sc)
6 17D-D2 (2 doses im)
7 Não imunizado e somente desafiado com DENV2 A Tabela 3 mostra o esquema de imunização do terceiro experimento com protocolo de imunização simultânea (co- administração) .
TABELA 3
Figure imgf000028_0001
Resultados de Proteção - Primeiro Experimento
No primeiro experimento os sinais clínicos da doença foram detectados entre o sétimo e o oitavo dia após o desafio com DENV2 nos grupos dos animais não imunizados ou aqueles que receberam o plasmídeo controle (pcTPA) . Treze dias após o desafio, 100% destes camundongos apresentaram paralisia ou morte. Por outro lado, 100% dos animais vacinados com somente 2 doses de pElD2, 2 doses de pElD2 + 1 dose de 17D-D2, ou 2 doses de 17D-D2, sobreviveram ao desafio.
Quanto ao aparecimento de sinais clínicos, somente o grupo de camundongos imunizados com 2 doses de pElD2 + 1 dose de 17D-D2 não apresentou qualquer sinal.
0 grupo de animais que recebeu somente o plasmídeo pElD2 ou o vírus 17D-D2 apresentou 10% e 20% de paralisia, respectivamente, conforme mostrado nas Figuras 3A e 3B.
A vacina pE2D2 se mostrou menos protetora quando comparada à vacina pElD2. Somente 50% dos animais imunizados com 2 doses de pE2D2 sobreviveram ao desafio e 70% apresentaram morbidade. Por outro lado, 100% dos animais imunizados com 2 doses de pE2D2 + 1 dose de 17D-D2 sobreviveram ao desafio e somente 10% destes camundongos apresentaram algum sinal clinico da doença, conforme mostrado nas Figuras 3A e 3B.
Resultados de Proteção - Segundo Experimento
No segundo experimento as proporções de sobrevivência e morbidade nos grupos de animais imunizados com os plasmideos pElD2 e pE2D2 isoladamente ou no sistema de dose e reforço (vacina de DNA + 17D-D2) foram semelhantes aos dados obtidos no primeiro experimento. Mais uma vez a imunização no sistema de dose e reforço se mostrou mais eficiente gerando 100% de proteção, conforme Figuras 3C, 3D, 4C e 4D.
Resultados de Proteção - Terceiro Experimento
As imunizações simultâneas pElD2 + 17D-D2 e pE2D2 +
17D-D2 se mostraram tão eficientes quanto as imunizações no sistema dose/reforço, induzindo proteção em 100% dos animais, independente da via de inoculação do vírus 17D-D2 (im ou sc) , sem o aparecimento de qualquer sinal clínico da doença.
Nenhuma das vacinas administradas isoladamente (vacina de DNA ou quimera 17D-D2) induziu proteção sem o desenvolvimento de paralisia em nenhum dos animais testados (Figuras 5) .
Resultados de Soroneutralização
Para a detecção dos níveis de anticorpos neutralizantes gerados com as vacinas testadas, os soros dos animais foram coletados duas semanas após a imunização com as vacinas de DNA e/ou vírus quimérico (antes do desafio com DENV) e 21 dias após o desafio com DENV2. Nos ensaios de soroneutralização, os vírus DENV2 foram incubados com diferentes diluições dos soros dos camundongos imunizados e posteriormente foi avaliada a capacidade destes vírus infectar células Vero, através da formação das placas de lise. O título de anticorpos neutralizantes foi calculado a partir da redução de 50% das placas de lise (PRNT50) .
Os resultados estão exemplificados na tabela 4, com os soros dos animais utilizados no primeiro experimento de imunização no sistema de dose e reforço. Os resultados demonstram um aumento significativo dos níveis de anticorpos neutralizantes nos animais que receberam a imunização combinada no sistema de dose/reforço.
TABELA 4
Títulos de anticorpos neutralizantes (PRNT50)
2 doses pElD2
2 doses da
Animais 2 doses pElD2 + + reforço 17D- vacina
reforço 17D-D2 D2 + desafio pElD2
DENV2
1 1:73 >1: 640 >1:640
2 1: 60 >1: 640 >1: 640
3 1:8 1:240 >1: 640
4 1:24 1:33 1:120
5 ND 1:160 >1:640
6 1:40 ND >1: 640
7 1:47 1:448 >1: 640
8 ND 1:533 >1:640 9 1:86 >1: 640 >1:640
10 1:25 1:320 >1: 640
Controle negativo
pcTPA
Controle Positivo - soro de ^ . r . n
macaco imune >1:640
A presente invenção foi exemplificada para DENV2, entretanto a construção de vacinas de DNA contra os demais sorotipos do virus dengue (DENV 1,3 e 4), obedece a mesma metodologia aqui descrita para o DENV2.
A(s) composição (ões) da presente invenção podem conter um veículo farmacêeutico aceitável. Qualquer veículo farmacêutico conhecido daqueles especialistas na arte pode ser usado na (s) composição (ões) da presente invenção, dependendo do modo de administração.
O termo veículo farmacêutico se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou um veículo com o qual a vacina de DNA ou o vírus quimérico é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleo, incluindo aqueles de origem animal, vegetal ou sintética. Excipientes farmacêuticos incluem amido, glucose, frutose, gelatina, malte, arroz, farinha, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A(s) composição (ões) da presente invenção, se desejado, podem conter quantidades pequenas de agentes emulsificantes, ou agentes tamponadores de pH.
A presença de um veículo farmacêutico dependerá da administração da composição vacina. Por exemplo, para a administração parenteral, tal como uma injeção subcutânea, o veículo preferido consiste de água, solução salina, álcool, gorduras, ceras ou solução tampão. Para administração oral, podem ser empregados, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glucose, sucrose e carbonato de magnésio.
Também podem ser usados agentes contendo uma substância para proteger o antígeno de rápido catabolismo, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral.
A presente invenção utilizou inoculação das vacinas de DNA por via im com duas doses DNA, com 10(^g por dose, administradas em intervalo de duas semanas. Também podem ser utilizados números diferentes de doses (como uma, três, quatro, etc) com concentrações diferentes de DNA (variando de 0. ^g até lg) , e administradas em intervalos de tempo variados (de 1 semana até 1 ano entre cada dose de DNA) .
As imunizações das vacinas de DNA da presente invenção foram realizadas por via im através de injeções com agulha. Outras vias de imunização também podem ser utilizadas como por exemplo por via intradérmica, subcutânea, transcutânea, intravenosa ou intraperitoneal . Tais inoculações podem ser administradas com ou sem auxílio de agulha. Como exemplo de inoculação sem agulhas, podemos citar a utilização de inoculação por biobalística {Genegun) , Bioejector, adesivos (pads) , etc.
Na nova abordagem de imunização da presente invenção, ou seja, o sistema de dose (vacina de DNA) e reforço (vírus quimérico 17D-D2) ou imunizações simultâneas (co- administração) , as vacinas de DNA foram administradas por via im através de seringas com agulhas e o vírus quimérico 17D-D2 foi inoculado também com seringas por via im ou sc. Para esta abordagen também poderão ser utilizadas outras vias de inoculação com ou sem agulhas conforme exemplificado acima. As imunizações com vacinas de DNA e 17D-D2 foram administradas em intervalos de duas semanas, tanto no sistema de dose e reforço quanto de co- administração . Tais inoculações também podem ser realizadas com intervalos de tempo variados (de 1 semana até 5 anos), com diferentes doses (uma, duas, três e etc) . As concentrações das vacinas de DNA inoculadas (100 g por dose) assim como dos vírus quiméricos (4 log 10 PFU) também podem variar conforme adequação do protocolo.
No sistema de dose e reforço da presente invenção, a primeira imunização (dose) foi realizada com vacinas de DNA enquanto que o reforço foi dado pela imunização com vírus quimérico. Também é possível inverter este protocolo, com a primeira imunização com vírus quiméricos e o reforço com vacinas de DNA, administradas em intervalos variados.
A presente invenção utilizou o gene que codifica a proteína E do vírus da dengue. Também podem ser utilizados outros genes deste vírus, tais como as sequências que codificam as proteínas C (capsídeo) , prM (membrana) , NS1 (não-estrutural 1) e NS3 (não-estrutural 3) . A proteína NS1 já foi testada em vacinas de DNA isoladas demonstrando potencial protetor contra o vírus da dengue (Costa et al. ,2006, 2007) .
A nova abordagem de imunização da presente invenção utiliza vacinas de DNA e vírus quimérico vacinai de febre amarela com genes do vírus da dengue (17D-D2) . Esta abordagem também pode ser utilizada com vacinas de DNA e vírus quimérico vacinai 17D contendo genes de outros flavivírus. A abordagem também pode ser usada com vacinas de DNA contendo genes de febre amarela e vírus vacinai 17D.
Assim, de acordo com a presente invenção é fornecida uma vacina efetiva contra o vírus dengue. Adicionalmente, a invenção também demonstrou um novo método para induzir resposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas, no sistema de dose (vacina de DNA) e reforço (vírus quimérico) ou co-administração simultânea das duas estratégias vacinais (vacinas de DNA e vírus quiméricos em uma mesma formulação) . Uma composição vacinai e um kit compreendendo vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue vírus quiméricos também é apresentado na presente invenção. Referências
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Claims

1 WO 2011/038473 PCT/BR2010/000323 REIVINDICAÇÕES
1. Método para induzir resposta imune contra virus da dengue caracterizado por compreender a administração a um paciente de vacinas de DNA e virus quiméricos 17D.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pela administração ao paciente ser efetuada em imunizações combinadas, no sistema de dose (vacinas de DNA) e reforço (virus quiméricos) ou co-administração simultânea das duas estratégias vacinais (vacinas de DNA e virus quiméricos em uma mesma formulação) .
3. Composição vacinai contra o virus dengue caracterizado por compreender:
(a) Vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do virus dengue a partir da construção de diferentes plasmideos recombinantes contendo os genes que codificam as proteínas E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue, ou somente as sequências que correspondem aos domínios III destas proteínas, todas fusionadas à sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) ;
(b) Vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtenção de clone infeccioso, com a substituição das sequências que codificam as proteínas prM e E de febre amarela pelas sequências que codificam as proteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos; e,
(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3 caracterizado a vacina de DNA por compreender: 2
WO 2011/038473 PCT/BR2010/000323
- plasmideo pEl construído com a inserção da sequência que codifica 80% da proteína do envelope virai (E) do vírus da dengue, sem a porção C-terminal da proteína E do vírus da dengue.
5. Composição de acordo com a reivindicação 3 caracterizado a vacina de DNA por compreender:
um plasmideo pE2 construído com a inserção da sequência que codifica o domínio III da proteína E do vírus da dengue, contida entre os nucleotídeos 1822 e 2125 do genoma completo do vírus da dengue.
6. Kit caracterizado por compreender:
(a) Vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmídeos recombinantes contendo os genes que codificam as proteínas E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue, ou somente as sequências que correspondem aos domínios III destas proteínas, todas fusionadas à sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) ; e,
(b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtenção de clone infeccioso, com a substituição das sequências que codificam as proteínas prM e E de febre amarela pelas sequências que codificam as proteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos.
7. Plasmideo recombinante contendo o gene da proteína E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue fusionado à sequência que codifica o peptídeo sinal do t-PA caracterizado por ser construído com a inserção da 3
WO 2011/038473 PCT/BR2010/000323 sequência que codifica 80% da proteína do envelope virai (E) do vírus da dengue sem a porção C-terminal da proteína E, onde a dita sequência é amplificada utilizando os oligonucleotídeos senso e antisenso, identificados como SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e em seguida efetuada a clonagem da sequência no plasmídeo pcTPA entre os sítios das enzimas de restrição EcoRV e Xball no mesmo quadro aberto de leitura da sequência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando o plasmídeo recombinante .
8. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por a sequência que codifica 80% da proteína do envelope virai (E) do vírus da dengue estar contida entre os nucleotídeos 937 e 213125 do genoma completo do DENV2, cepa Nova Guiné C (NGC) (Genebank: M29095) .
9. Plasmídeo recombinante contendo o gene da proteína
E a partir de cada sorotipo virai do vírus dengue fusionado à sequência que codifica o peptídeo sinal do t-PA caracterizado por ser construído com a inserção da sequência que codifica o domínio III da proteína E do vírus da dengue, onde a dita sequência é amplificada utilizando os oligonucleotídeos senso e antisenso, identificados como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: , entre os sítios para as enzimas de restrição EcoRV e Xbal e em seguida realizada a clonagem da sequência no plasmídeo pcTPA entre os sítios das enzimas de restrição EcoRV e Xbal, no mesmo quadro aberto de leitura da sequência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando o plasmídeo recombinante.
10. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por a sequência que codifica o domínio III da 4
WO 2011/038473 PCT/BR2010/000323 proteína E do vírus da dengue estar contida entre os nucleotídeos 1822 e 213125 do genoma completo de DENV2, cepa NGC (Genebank: M29095) .
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