CN102711817A - 基于dna疫苗和嵌合体病毒的诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法、试剂盒、质粒和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于DNA疫苗和嵌合体病毒17D疫苗在联合免疫或者共同施药的免疫诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法。在本发明的范围内还包含抗四种登革热病毒亚型的从不同重组质粒的构建中产生的DNA疫苗，重组质粒包含编码蛋白E或者仅包含对应于这个蛋白的区域III的序列，蛋白E和对应于这个蛋白区域III的序列来自于每个登革热病毒亚型(DENV1-4)。本发明进一步提供一种疫苗组合物，由(a)抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，(b)包含经修饰的黄热病疫苗病毒17D的嵌合体病毒；和(c)药物上可接受的载体，包含在本发明保护范围内。

Description

基于 DNA 疫苗和嵌合体病毒的诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法、试剂盒、质粒和组合物
技术领域
本发明涉及一种基于DNA疫苗和17D嵌合体病毒的联合免疫或共同施药免疫的诱导抗登革热的免疫应答的方法。在本发明的范围内还包括抗四种登革热亚型的DNA疫苗，其来自包含编码蛋白E的序列、或者仅由相应这个蛋白的区域III的序列的不同的重组质粒的构建，蛋白E来自每个登革热病毒亚型(DENV1-4)。
包含在保护范围内的疫苗组合物包含：
(a)抗四个登革热病毒亚型的DNA疫苗，来自构建的从包含蛋白E基因或包含仅对应于该蛋白区域III的序列的不同的重组质粒，蛋白E来自每个登革热病毒亚型，它们都融合到质粒编码人组织纤溶酶原激活子(t-PA)的信号肽的序列中；
(b)包含由感染克隆粘附技术修饰的黄热病疫苗病毒17D的嵌合体病毒，编码来自不同亚型的登革热病毒的编码蛋白prM和E的序列取代黄热病毒的蛋白prM和蛋白E的序列；
(c)药学上可接受的载体，
本发明还涉及试剂盒，包含(a)来自构建的不同重组质粒抗登革热病毒亚型的DNA疫苗，重组质粒包含编码来自不同登革热病毒亚型的E蛋白的基因，或仅相应于该蛋白区域III的序列，所有这些序列融合到编码人组织纤溶酶原激活子(t-PA)的信号肽的序列中；和(b)包含由感染性克隆粘附技术(infectious clone attainment technology)修饰的黄热病毒疫苗病毒17D的嵌合体病毒，由编码不同亚型的登革热病毒的蛋白prM和E编码的序列替代黄热病毒蛋白prM和E的序列。
背景技术
在由虫媒病毒导致的疾病之中，基于在人群中的致病率和死亡率的重要性，登革热被认为是全球主要公共卫生问题之一，尤其是在热带和亚热带地区。它的致病原是登革热病毒，其是由伊蚊属传播的，通常是由埃及伊蚊传播。
登革热病毒(DENV)属于黄病毒属，黄病毒家族。存在4个从抗原学上和病原学上不同的病毒类型：DENV1、DENV2、DENV3、DENV4。即使由登革热病毒导致的原发感染诱导对感染亚型的免疫，然而并不存在抗其它病毒类型的长期交叉保护，导致不同登革热病毒的继发感染。
登革热病毒是由病毒包膜和复合到RNA分子的核壳组成。它的基因组包含大约10，700核苷酸和由具有阳极的单链RNA组成，其编码黄病毒科蛋白的多肽前体。这个前体由细胞蛋白酶切断，由病毒蛋白酶生长三个结构蛋白，C(壳体)、prM(膜前体)、和E(包膜)，和七个非结构蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。该翻译的结构蛋白参与成熟的感染性病毒粒子，其非结构蛋白参与病毒复制和发展。 在绝大多数的黄病毒中，登革热病毒E蛋白(包膜)是被糖基化的结构蛋白和转膜蛋白。这个E蛋白是在这些病毒表面发现的主要糖蛋白成分，具有大约55到60kDa的分子量，由493至501个氨基酸组成。
E蛋白参与大量重要的生物活动。E蛋白作为结合蛋白，与细胞表面的受体结合，介导与宿主细胞膜的病毒膜的融合。这种蛋白还与核包膜相关，在病毒侵入时发挥重要作用。另外，E蛋白是一种强免疫原，在感染病毒的患者体内产生高抗体水平，其可以是中和过程，结合抗原决定簇，其与细胞受体作用，阻止病毒进入宿主细胞(Chang,1997;Kinney & Hung,2001)。
E蛋白是由伸长的平行延伸到病毒膜的二聚体形成。每个单体是由三个域组成：域I、域II和域III。域I是中心部分，由120个氨基酸残基组成：1-51、133-193、279-296。域II是伸长的，包含由分子内部多个点联结的两个单体形成二聚体的区域。区域II包含以下氨基酸残基：52-132、194-280。区域III是位于碳末端的部分，代表免疫球蛋白，它的功能是结合到细胞受体上，比如，存在于未成熟的树状细胞的DC-SIGN。病毒/细胞的结合是通过区域III促进病毒颗粒吞噬作用介导的。区域III包含氨基酸残基：298-394。抗原决定簇在这个区域内能够介导类型和亚类型特异性中和抗体反应。
进行大量的疫苗以对抗登革热，然而，没一个建议的方法代表大量疫苗的所需特性，比如对抗不同的循环病毒亚型的安全和长期的保护免疫反应。
发展疫苗原型的一个主要困难是包含诱导对抗四种登革热病毒亚型的保护性免疫，但不会产生继发后果，例如，出血热以及尽可能使用最低数量或剂量。
在发展减毒的四价疫苗上已经进行了相当的努力。最有希望的这些侯选存在于通过细胞培养途径的减毒病毒。这些疫苗在临床评价阶段。然而，早已注意到一些并发症。而且，存在可从基因回复或重组发生的病毒严重感染的潜在风险，很难去按配方制造多价的活减毒疫苗，因为在病毒复制阶段中存在同源或异源干扰的可能性(Barret,2001;Kinney & Huang,2001)。
另一个用于发展对抗登革热病毒的疫苗的战略是构建嵌合体。这个技术已用于大量的对抗黄病毒的疫苗的研究中，包含登革热病毒(Galler et al., 2005)。
即使目前获得的进展，仍然存在巨大的挑战：生产能够对抗四种登革热病毒亚型的产生同源反应的疫苗。
DNA疫苗在控制感染的试剂的疫苗的发展中代表有效的技术。这个技术包含包含有抗兴趣的抗原的真核表达质粒的接种，其在通过接种的生物体细胞体内合成，通过组织相容性复合物I和II(MHC I和II)表征，激活特异性免疫反应。通过宿主细胞的抗原的内源性表达似乎刺激了天然的病毒感染，能够同时产生具有抗体生成的体液免疫反应，和具有细胞毒性的T淋巴细胞介导的细胞反应。免疫反应的这两个形式的介导主要地或专门地产生抗体应答，并相比于减活疫苗的细胞反应，不具有带来感染原的病原形式的反转的风险，提供了相比于亚株疫苗的优势。另外，DNA疫苗在温度范围内稳定，具有大规模生产的更低成本和允许去经评估的序列的快速选择。
最近，几个研究组已分析了在控制黄病毒方面的DNA疫苗的使用。与这个病毒家族不同的病毒的某些研究显示出在接种编码黄病毒蛋白prM和E的质粒(Phillpotts et al., 1996; Kochel et al., 1997;; Raviprakash et al, 2000)之后鼠类和非人类的灵长类动物中黄病毒特异性的保护免疫反应的引导。某些分析还使用包含黄病毒非结构性蛋白基因的DNA疫苗，例如：日本脑炎、肝炎和登革热病毒(Lin et al., 1998; Encke et al., 1998; Wu et al., 2003; Costa et al., 2006, 2007)。
最近的研究表明，包含编码蛋白prM和E 、DENV1-4病毒域III区域的基因的全序列的DNA疫苗能够在鼠模型中产生对抗登革热的体液免疫反应。然而，在这些研究中DNA疫苗的保护潜力仅是非直接地评估(血清中和试验和细胞反应)，没有实施直接的挑战检测在给予致死剂量的登革热病毒而评估这种疫苗的效力(Chen et al., 2007)。通过经登革热病毒挑战的动物中的病毒血评估，在非人类的灵长类中检测一些对抗登革热的DNA疫苗(Aotus和Rhesus)提供了部分保护(Raviprakash et al., 2000; Putnak et al., 2003; Blair et al., 2006)。
关于免疫方法，本发明人强调，Putnak et al (2003)发展出一种包含其从DENV2中编码蛋白prM和E的基因的DNA疫苗，在鼠类和进一步免疫的猕猴类中观察它的免疫原性。在免疫后的七个月，动物显示出不再对抗登革热病毒的保护。这样，我们可以注意到到这些研究表明增加免疫反应的长度的新策略的需要。并且最近，有迹象表明DNA疫苗结合其它疫苗比相同的单独施药能够产生更有效的免疫反应。
专利申请WO2008/127307，出版于10/23/2008，指出对抗登革热病毒的免疫应答方法使用初始免疫/加强免疫方法。而且特别地，WO2008/127307指出包含DNA疫苗或4-价DNA疫苗纯化灭活的疫苗和后续登革热病毒免疫原剂量的加强免疫的登革热病毒免疫原的施药包含4-价灭活的登革热病毒疫苗，比如，例如在其它病毒的体内复制中，一个或多个病毒干扰的可能性，如此导致不同病毒亚型的异种免疫反应。另外，文献还指出包含编码登革热蛋白的基因的腺病毒的使用作为4价疫苗的加强剂，其可能意味着介导在人体内对抗登革热免疫反应的低效价。这个现象是由于在人体内的对抗腺病毒的在先免疫反应的存在，其可以阻止携带登革热病毒基因的载体腺病毒的感染，继而影响对抗登革热病毒的免疫应答的效力。
于 08/14/2008出版的专利申请US20080193477，一种采用包含在嵌合体黄病毒为基础的登革热疫苗后的第一黄热疫苗的施药的免疫方案。然而，在文献中的其它报导显示，黄热疫苗病毒的免疫方法可以影响由包含登革热病毒基因的黄热嵌合体病毒的免疫继而产生的免疫应答的效力。在这种情况下，在猴群中对抗登革热病毒的中和抗体水平比在先接种抗黄热病毒的猴群中显著下降(Galler et al., 2005)。如在这里讨论的，我们确信不论已作出的努力，仍然有必要发展更有效的DNA疫苗，能够介导增强的免疫应答，以及使用提高这些免疫应答的联合疫苗策略的使用的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA和嵌合体病毒17D疫苗联合给药或共同给药的免疫作用的抗登革热病毒的介导免疫应答的方法。
本发明的目的还在于提供抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗组合物，来自包含编码来自登革热病毒的每个病毒亚型(DENV1-4)的E蛋白的基因的不同的重组质粒的构建的四种登革热病毒，或仅仅是相应于这些蛋白的域III的序列，所有这些序列融合到编码信号肽t-PA的序列中。
在本发明的目的中包含疫苗的组分：由(a)来自不同重组质粒的构建的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，不同的重组质粒包含编码来自登革热病毒的每个病毒亚型的E蛋白的基因，或仅是相应于这些蛋白的区域III的序列，所有的这些序列融合到编码信号肽t-PA的序列；以及(b)嵌合体病毒，包含修饰的黄热疫苗病毒17D，其序列编码黄热蛋白prM和E，被编码不同的病毒亚型的登革热病毒蛋白prM和E的序列所替代，药学上可接受的载体组成。
本发明进一步提供试剂盒：包含(a)来自从构建的包含E蛋白基因，或仅包含相应于每个登革热病毒亚型的这些蛋白的区域III的序列的不同的重组质粒的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗；以及(b)嵌合体病毒，包含经修饰的黄热疫苗病毒17D，其由编码不同亚型的登革热病毒蛋白prM和E的序列替代编码黄热病毒蛋白prM和E的序列。
附图说明
图1是显示质粒pcTPA, pE1D2 and pE2D2的图；
图2是显示由质粒pE1D2(A和A`)、pE2D2(B和B`)和pcTPA(C和C`)转染的细胞BHK-21的免疫荧光图，其中状态对照显示在A、B和C中，荧光显示在A`、B`和C`中(1000×A 和B, 400 ×C的增加)；
图3A-3B是显示pE1D2的第一次试验的结果图；
图3C- 3D是显示pE1D2的第二次试验的结果图；
图4A-4B是显示pE2D2的第一次试验的结果图；
图4C-4D是显示pE2D2的第二次试验的结果图；
图5A-5D是显示pE1D2, pE2D2, 17D-D2的同时联合的第三次试验的结果图。
具体实施方式
本发明者发现在目前发展水平中登革热病毒包膜蛋白(E)是一种强免疫原，能够产生高水平的中和抗体的保护性应答。如此，本发明的第一个目标是发展抗登革热病毒的DNA疫苗，其包含编码蛋白E的没有疏水性C末端区域，或包含插入到质粒pcTPA的这些蛋白区域III的序列，其具有人体组织血浆酶原活动子(t-PA)的信号序列。本发明还具有建立介导抗登革热病毒的保护性免疫应答的方法的目的，基于在初免/加强免疫系统中或两种疫苗联合给药的DNA疫苗和嵌合体病毒17D疫苗的联合免疫。
质粒pcTPA包含相应于人体组织血浆酶原活动子基因的信号肽(t-PA)的DNA序列。作为信号肽被识别的t-PA区域具有不同的大小。描述t-PA基因的克隆和测序的文献(Pennica et al., Nature, 301:214-221, 1983)识别105个碱基配对的区域，其编码第一个35个氨基酸，作为信号肽。质粒pcTPA包含69个碱基对序列，其相应于第一个23个氨基酸SEQ ID NO：8。对应于t-PA的信号肽的序列在质粒pcDNA3(Invitrogen)中使用限制性内切酶HindIII和EcoRV位点克隆。这样，在EcoRV位点下游的任何序列将被克隆，使用这个酶的位点，其产生盲端片段；然而，结合到另一个片段上，也是一个盲端，不必需要经EcoRV消化。另外在这个位点，质粒pcTPA在EcoRV的下游保有五个限制性酶位点(BstXI, NotI, XhoI, XbaI 和ApaI)，从质粒pcDNA3多克隆位点，其还可用于新序列的克隆。
为了不同重组质粒的构建，包含编码没有其疏水C末端部分(E80%)-SEQ ID NO：6-的蛋白E的序列，或仅有对应于这个蛋白的区域III-SEQ ID NO：7—的序列，使用New Guinea C (NGC) DENV2 (M29095; gi:323447)的谱系。这种病毒从受感染的Vero细胞培养中获取。在质粒pcTPA中克隆的基因E片段从受DENV2 NGC感染的Vero细胞的总DNA中经PCR放大。RNA作为合成包含靶区域的cDNA的模板，使用特异性寡核苷酸。该cDNA接着作为靶序列经PCR放大的模板，使用其它寡核苷酸包含了克隆中使用的限制性内要酶的位点。经放大的片段在琼脂凝胶电泳中分辨，进一步收集，经树脂纯化(基因清洁(gene clean))。获取的片段，如质粒pcTPA，经特异性限制性内切酶消化，结合T4 DNA连接酶。重组克隆在大肠杆菌DH5-α菌株中获取，经这些质粒转染，由限制性内切酶消化，进一步地经测序列确认。
为了评价如上所述获取的重组质粒的能力，介导没有C末端部分的疏水区域(E80%)，或它的区域III(域III)的蛋白E的表达，在体外使用经不同质粒转染的BHK-21细胞实施表达分析检测这些蛋白。重组质粒从质粒pcTPA中获取，其由质粒pcDNA3(Invitrogen)中构建。这种载体在人细胞巨化病毒(CMV)启动子下促进重组蛋白的表达，包含编码人体组织血浆酶原的信号肽(t-PA)的序列，其将这些蛋白引入到细胞外空间。为了评价所感兴趣的蛋白的生产，BHK-21细胞培养经重组质粒转染，使用脂质体转染法(lipofectamine)，根据制造商的说明指导。重组蛋白的表达是经免疫荧光法分析，如Costa SM et al., 2006中所描述。为了重组质粒的大规模生产和控制，大肠杆菌，使用菌株DH5-α(E. coli bacteria, strain DH5-α)经不同的质粒转染，在液体TB培养基中培养，37℃过夜。质粒在阳离子交换柱中使用由制造商推荐的QIAGEN tip 10.000试剂盒经纯化，在水中悬浮，在分光光度计和琼脂凝胶电泳中定量。DNA疫苗储存在-20℃，直至使用。
本发明的DNA疫苗在分离基础上检测其保护性能力。这些检测易于分析重组蛋白在体外表达的效力，评价在鼠类中产生的抗体应答，并实施致死剂量的病毒的大脑内接种的挑战性检测。血清中和检测如同Cafour et al., 2001中所述用前述的病毒在Vero细胞中实施。
为了评估获取的构建，大约四个星期大的雄BALB/C鼠群经重组质粒组和对照组免疫。鼠在后腿四头肌部位经过肌肉内(im)途径用溶解在PBS中的这些质粒接种。在每个接种中，每个动物注射100µg的DNA(每条腿50µg)。在这个发明的新免疫方法中，例如，初免疫(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒)系统或同时免疫(共同施药)，本发明的DNA疫苗在嵌合体病毒(17D-D2)中联合免疫。这种嵌合体是由黄热疫苗病毒YF 17D用DENV2菌株NGC，SEQ ID NO：9的prM和E的基因取代编码prM和E蛋白的基因而构建成的。值得强调的是，这种新免疫方法是从DENV2 DNA疫苗的构建开始，并且挑战性检测其是实施这些疫苗的保护性能力的介导，尤其是当序列编码没有疏水C末端部分的E基因时。
为了嵌合体17D-D2的构建，使用Rice et al., 1989开发的黄热感染cDNA方法，其由两个质粒组成：pYF5’3’IV和pYFM5.2。在这个方法中，考虑到在高复制数量质粒中一些病毒序列缺乏稳定性，黄热病毒基因组在前述两种方法中分离。这些质粒经特异性限制内切酶消化，产生的片段结合，重新组成黄热病疫苗病毒全基因组。然而，为获取更减毒的病毒(Marchevsky et al., 1995)，在猴子中用这个病毒的检测表明需要对于cDNA进行基因修饰。如此的修饰通过Galler 和Freire (US 6,171,854)的方法实施，导致质粒pYF5’3’IV 和pYFM5.2的新版本，分别命名为G1/2 和T3/27。随后，使用质粒pACNR1180 (Ruggli et al., 1996)，其具有限制这个质粒的复制数量的复制源(P15A)，从而减少在细菌中质粒DNA的拷贝数量。质粒pACNR1180在克隆猪瘟病毒基因组时被认为是理想的质粒，其大小类似于黄热病毒基因组，保证克隆基因组的稳定性，黄热病毒的全基因组在经修饰的pACNR1180质粒中克隆(去除某些限制性内切酶位点)，产生pYF17D/14质粒。质粒pYF17D/14分两步骤产生：首先，质粒G1/2用作插入经修饰的pACNR1180质粒的不同片段经PCR放大的模板，产生质粒NSK7。然后，质粒NSK7用于克隆包含在质粒T3/27中的疫苗病毒17D基因组的剩余部分，产生质粒pYF17D/14。所有质粒在E. coli MC1061中繁殖，经Qiagen柱纯化。为构建嵌合体17D-D2，使用DENV2病毒，New Guinea菌株。cDNA以与前述DNA疫苗克隆类似的方法合成，包含登革热病毒基因组区域，其从相应与编码蛋白prM的基因的第一个核苷开始到对应于蛋白E的氨基酸205的序列。这个区域经PCR放大，插入质粒G1/2的限制性酶ApaI和NotI的酶切位点之间，产生质粒pG1/2 DEN2。包含17D-D2全基因组的cDNA是从片段的结合而构建的：由质粒pG1/2 DEN2的消化而产生的NotI/NsiI(启动子SP6，黄热病毒区域5`NTR-C和DENV2 prM-2/3E)、由质粒pYFD/F11/12的消化而产生的NsiI/M1uI(编码DENV1的E蛋白的3`区域和黄热病毒基因NS1的启始序列)，由质粒pYF17D/14的消化而产生的M1uI/NotI(其包含了黄热病毒基因组的剩余部分)。所有这些质粒在E. coli XL-1 BLUE中繁殖，经Concert High Purity System(Invitrogen)纯化。全质粒经XhoI线性化，通过启动子区域SP6用于体外转录。在体外合成的RNA以与US6，171，854中所述的相类似方法经Vero细胞的电穿孔法用于病毒再生。
除用分离的DNA疫苗接种以外，还分析了鼠经联合免疫的免疫应答：初免(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒17D-D2)系统，和两种疫苗类型的同时免疫(共同施药)。在初免/加强免疫的系统中，BALB/c鼠如前所述的在最后剂量的两个星期后受到DNA和DENV2疫苗的两种剂量，它们经皮下(sc)或肌肉(im)途径给予4 log10 PFU的嵌合体病毒(17D-D2)的接种。在这个同时免疫法(共同免疫法)中，这两种疫苗(DNA和嵌合体17D-D2)在缓冲盐溶液(PBS)中混合，经im途径接种，在两周内分为两种剂量给药。
由DNA疫苗单独地或与嵌合体病毒一起产生的免疫应答通过产生抗体和中和抗体来进行评价。
在第二种DNA剂量的两周后或者在最后免疫之后的两周通过后眼球途径对于动物的取血。在免疫开始之前的那天获取预免疫血清。在这个中和检测中，DENV病毒在经过受免疫鼠血清的不同稀释液中培养，然后，这些病毒感染Vero细胞的能力通过溶解板(lysis plate)的形式进行评估。从这些分析中，滴定中和抗体的水平是可能的。
BALB/c鼠经过不同质粒单独地或者与病毒17D-D2联合免疫是通过DENV2大脑内接种来挑战的(大约4.3 log10 PFU，相应于3.8的LD50)，在最后的DNA疫苗免疫后25天或者在嵌合体病毒接种后10天。在挑战之前，动物经氯胺酮-赛拉嗪的混合物麻痹。病毒的滴定如Caufour et al, 2001中所述的，在动物内接种后很快通过在Vero细胞内实施。鼠的测评是在病态的挑战之后直至21天每天检测，尤其是在后腿的瘫痪和致死率的发展方面。垂死的动物与在挑战试验后21天后存活的那些动物一起被处死。为了血清中和检测而收集这些动物的血。
本发明现将通过实施例进行阐明。以下实施例是用于解释本发明，并代表优选方式，使用不多于常规性试验，本领域技术人员知晓或者能够发现如何使用其它合适的材料和技术。
实施例1-表达载体pcTPA的构建
新的表达质粒通过将编码人组织血浆酶原活动子(t-PA)-SEQ ID NO：8的信号肽的序列插入到原始质粒pcDNA3(Invitrogen)中而构建。这个序列的片段使用特异性启动子(图1)经PCR放大。
以下是用于经PCR放大反应的寡核苷酸。限制酶切位点Hind III和EcoRV各自具有下划线。
SEQ ID NO:1 -正义核苷酸链 (TPA1)
5’GGGGAAGCTTATGGATGCAATGAAGAGG3’
SEQ ID NO:2 -反义核苷酸链 (TPA2)
5’GGGGATATCGCTGGGCGAAACGAAGAC3’
PCR产物，包含69个pb，经消化，并在质粒pcDNA2内的Hind III和EcoRV酶切位点之间克隆。这个序列通过测序确认，重组质粒命名为pcTPA(图1A)。
实施例2-pE1D2和pE2D2的构建
两个质粒(pE1D2和pE2D2)从pcTPA质粒中构建。质粒pcTPA是从附加有编码人体组织血浆酶原活动子(t-PA)的信号肽的序列的质粒pcDNA3(Invitrogen)中构建的，在限制性酶切位点(包含在质粒pcDNA3中的从人细胞巨化病毒中的启动子区域的下游的Hind III e EcoRV)。
质粒pE1D2是由插入编码登革热病毒亚型2(DENV2)的病毒核包膜蛋白(E)不具备蛋白E的C末端部分的80%的序列构建的。这个序列，包含了DENV2全基因组的核苷酸937和2131之间的核苷酸，New Guinea C (NGC) 菌株 (Genebank: M29095)经PCR放大，使用正义和反义寡核苷酸链，如下SEQ ID NO:3 and SEQ ID NO:4中所述的，分别具有下划线的限制酶切位点EcoRV 和XbaI：
SEQ ID NO:3 - 5´GGGGGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3´
SEQ ID NO:4 - 5´GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3´
进一步地，根据图1B，在质粒pcTPA中序列的克隆是在限制性酶切位点EcoRV 和XbaI之间进行的，在编码信号肽t-PA的序列的相同的开放阅读框，产生质粒pE1D2。
质粒pE2D2经插入编码DENV2蛋白E的区域III的序列构建，包含在DENV2 NGC菌株的(Genebank: M29095)全基因组的核苷酸1822和2131之间的核苷酸。这个序列使用如下所示的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的正义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链经PCR技术放大，限制酶切位点EcoRV和XbaI各自具有下划线：
SEQ ID NO:5 - 5´GGGGGATATCGGAATGTCATACTCTATG3´
SEQ ID NO: 6- 5´GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3´
进一步地，质粒pcTPA中的序列的克隆是在限制性酶切位点EcoRV和XbaI之间实施，在编码信号肽t-PA的序列的相同的开放阅读框内，产生如图1C所示的质粒pE2D2。
每个克隆产物经测定序列确认。大肠杆菌，DH5-α菌株，用于小规模和大规模的质粒的克隆和生产。
质粒根据制造商的说明指示，通过碱性提取方法分离，经交换柱(Qiagen)纯化，悬浮在无菌miliQ水中，储存在-20℃，直至使用。
实施例3-嵌合体病毒17D-D2
嵌合体病毒17D-D2是通过将编码DENV2，NGC菌株的蛋白prM和蛋白E的基因取代编码黄热病疫苗病毒YF17DD的膜蛋白(prM)和核包膜蛋白(E)的基因而构建的。嵌合体病毒17D-D2构建的细节可在Cafour et al., 2001找到。
为了嵌合体17D-D2的构建，使用Rice et al., 1989发展的黄热病感染性cDNA方法，其由两个质粒组成：pYF5`3`IV和pYFM5.2。在这个方法中，考虑到大拷贝量的质粒中某些病毒的序列稳定性的缺乏，黄热病毒基因分离在两个前述的质粒中。这些质粒经特异性限制性内切酶消化，产生结合的片段，重新组成黄热疫苗病毒全基因组。然而，在猴群的这个病毒的检测表明，为获取更减毒的病毒(Marchevsky et al., 1995)，需要对于cDNA的基因进行修饰。这样的修饰经Galler和Freire(US6,171,854)所揭示的方法，导致质粒pYF5’3’IV and pYFM5.2的新版本，分别命名为G1/2和T3/27。质粒pACNR1180 (Ruggli et al., 1996)其具有限制这个质粒的复制数量的复制源(p15A)，从而减少在细菌中的质粒DNA的拷贝数量，而使用该质粒。质粒pACNR1180被描述为一种克隆猪瘟病毒基因组的理想的质粒，其大小类似于黄热病毒基因组，保证了克隆的基因组的稳定性。基于这些结果，黄热病毒全基因组在经修饰的pACNR1180质粒中克隆(某些限制性酶切位点经去除)，产生质粒pYF17D/14。质粒pYF17D/14通过两个步骤产生：首先，质粒G1/2用作为插入在经修饰的质粒pACNR1180的不同片段的经PCR技术放大的模板，产生质粒NSK7。进一步地，质粒NSK7用于克隆包含在质粒T3/27中的疫苗病毒17D基因组的其余部分，然后，产生了质粒pYF17D/14。所有在E.coli MC1061中繁殖的质粒经Qiagen柱纯化。为构建嵌合体17D-D2，使用DENV2病毒，New Guinea菌株。cDNA在与前述的DNA疫苗克隆相似的方法合成，包含登革热病毒基因组区域，其从对应于编码蛋白prM的基因的第一个核苷酸至对应于蛋白E的氨基酸205的序列。这个区域经PCR技术放大，插入质粒G1/2的两个限制性酶切位点ApaI和NotI之间，产生质粒pG1/2 DEN2。包含17D-D2全基因组的cDNA从片段的结合中构建：由质粒pG1/2 DEN2的消化中产生的NotI/NsiI(具有启动子SP6，黄热病毒5’ NTR-C区域和DENV2 prM-2/3E)，经质粒pYFD/F11/12消化产生的NsiI/M1uI(编码从DENV1中的蛋白E的3’区域和黄热病毒基因NS1的初始)，经质粒pYF17D/14的消化中产生的M1uI/NotI(其包含黄热病毒基因组的其余部分)。所有质粒在E. coli XL-1 BLUE中繁殖，经Concert High Purity 系统(Invitrogen)纯化。整个质粒沿袭XhoI，通过启动子区域SP6用于体外转录。体外合成的RNA以US 6.171.854的文献中所述的类似的方法通过Vero细胞的电穿孔法用于病毒再生。
实施例4-重组蛋白的表达的评估
亚洲大颊幼鼠的肾脏(BHK-21)在体外经不同质粒转染，从而评估重组蛋白的表达，根据制造商的说明指示使用脂质体(Invitrogen)转染法。在转染的BHK细胞中的蛋白E1和蛋白E2的表达通过免疫荧光检测法检测，使用抗DENV2腹腔液体(ATCC)和鼠抗IgG的抗体经荧光素(Southern biotechnology)共轭后在荧光光学显微镜下观察。根据图2，仅有经质粒pE1D2和pE2D2转染的细胞显示荧光，表明这些构建的质粒是能够介导登革热病毒蛋白在哺乳动物细胞中的表达。
实施例5-免疫作用
为检测DNA疫苗单独或者与嵌合体病毒17D-D2一起在初免/加强免疫系统中的保护性能力，使用大约四个星期大的BALB/c鼠进行两个独立的试验。
经DNA疫苗免疫作用的，质粒稀释在PBS中(1×最终浓度)中，动物经肌肉途径(im)接种，在后腿四头肌上以100µg/100µL的DNA疫苗接种每个动物(50µg/50µL 每个腿)。用嵌合体病毒17D-D2进行免疫作用，动物经皮下途径(sc)在足垫上接种，或者经肌肉途径(im)在后腿四头肌接种溶解在培养基M199(Sigma)或者PBS中的4 log10 PFU的病毒。质粒pcTPA用于阴性控制。
第三个试验是实施DNA疫苗和17D-D2疫苗经im途径同时免疫(共同施药)。在这个情况下，两种疫苗混合在PBS的单个溶液中。
动物分组(每组10个鼠)。然后动物每两个星期接受免疫，在最后一次免疫的两个星期后，动物经脑内途径(ic)接受致死剂量的DENV 2 NGC(3.8 LD50)接种的挑战，在鼠中神经适应。进一步地，动物在病态和存活的第21天前每天接受评估(瘫痪的发展，尤其是后腿的瘫痪)。
免疫时间表如图3中所呈现。以下的表1、表2和表3显示免疫时间表。
表1显示初免和加强免疫方案的第一次试验或者单独免疫的免疫时间表。
Figure 476847DEST_PATH_IMAGE001
表2显示初免和加强免疫方案的第二次试验或者单独免疫的免疫时间表。
Figure 925015DEST_PATH_IMAGE002
表3显示同时免疫方案(共同施药)的第三次试验的免疫时间表。
Figure 843161DEST_PATH_IMAGE003
保护力的结果-第一次试验
在第一次试验中，未经免疫的动物组经DENV2挑战或者那些接受对照组质粒(pcTPA)挑战的第七天和第八天之间检测到疾病的临床信号。在挑战后的第十三天，这些鼠的100%已经瘫痪或者死亡。另一方面，仅有pE1D2的2个剂量、pE1D2的2个剂量+17D-D2的1个剂量或者17D-D2的2个剂量接种的动物，100%在挑战中存活下来。
关于临床信号的出现，仅有经2个剂量的pE1D2+1个剂量的17D-D2免疫的鼠的组未显示任何信号。
仅接受质粒pE1D2或者病毒17D-D2的动物组，如图3A和图3B所示，分别存在10%和20%的瘫痪。
疫苗pE2D2已显示出提供相比于疫苗pE1D2较低的保护力。经2个剂量的pE2D2免疫的动物中仅50%在挑战中存活，70%具有病态。另一方面，如图3A和图3B中所示，经2个剂量的pE2D2+1个剂量的17D-D免疫的动物，100%在挑战中存活，仅有10%的这些鼠具有疾病的任何临床信号。
保护力的结果-第二次试验
在第二次试验中，经质粒pE1D2和 pE2D2单独或者在初免和加强免疫系统(DNA疫苗+17D-D2)免疫的动物组中存活率和发病率类似于在第一次试验中获得的数据。根据图3C、图3D、图4C和图4D中所示，初免和加强免疫系统中的免疫作用再次显示更有效的100%的保护力。
保护力的结果-第三次试验
pE1D2 + 17D-D2 和pE2D2 + 17D-D2的同时免疫作用已显示出与在初免/加强免疫系统中的免疫同样有效，产生动物的100%保护力，不论病毒17D-D2的接种途径(im 或者sc)，未出现疾病的任何临床信号。
没有一种单独给药的疫苗(DNA疫苗或者嵌合体17D-D2疫苗)在任何受试动物中(图5)诱导出不发展瘫痪的保护力。
血清中和检测的结果
为检测受试疫苗所产生的中和抗体的水平，在DNA疫苗和/或嵌合体病毒疫苗进行免疫(在经DENV挑战之前)作用后两个星期后和经DENV2挑战后21天，收集动物血清。在血清中和检测试验中，DENV2病毒在受免疫鼠的血清的不同溶液中培养，然后通过溶解板(lysis plate)的形式进一步地评估这些病毒感染Vero细胞的能力。中和抗体滴定是通过溶解板(PRNT50)50%的减少来进行计算。
在初免和加强免疫系统中的第一次免疫试验中使用动物血清的结果如表4所示。结果表明，接受初免/加强免疫系统中的联合免疫的动物中和抗体的水平显著增加。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
以DENV2作为本发明的例证，然而，抗其它的登革热病毒亚型(DENV1、3和4)DNA疫苗的构建，按照与此处所述的DENV2的相同的方法学。
本发明的组分(多个)可以包含可接受的药物载体。根据施药途径，本领域技术人员已知的任何药物载体可以用作为本发明的组分。
术语药物载体是指与施药的DNA疫苗或者嵌合体病毒一起的稀释液、辅料、赋形剂或者载体。这些药物载体可以是无菌液体，比如水或者油，包含动物、植物或者合成来源的那些液体。药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、果糖、明胶、麦芽、米、面粉、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、云母、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。本发明的组分(多个)，如果需要，可以包含少量的乳化剂或者pH缓冲剂。
药物载体的存在将根据疫苗组分的施药不同而不同。例如，肠胃外投药，比如皮下注射，优选的载体选自水、盐溶液、乙醇、脂肪、蜡或者缓冲溶液。口服给药，可使用甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、云母、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。
试剂还包含意欲保护快速分解抗原的物质，比如使用氢氧化铝或者矿物油。
本发明使用经im途径接种DNA疫苗，2个剂量的DNA，每个剂量100µg，两个星期分开给药。不同剂量(比如一个剂量、三个、四个等)可以使用不同的DNA浓度(从0,1µg 到1 g)，而且经不同时间间隔施药(每个剂之间间隔一个星期至一年)。
本发明的DNA疫苗的免疫作用是经im途径通过针注射的方式实施。其它免疫途径还可以使用，比如，通过皮层内的、皮下的、经皮的、经静脉的或者腹腔进入的途径。比如接种可以在有针的帮助下或者无针的帮助下施药。作为接种的一个实施例不使用针，我们可以提及通过生物弹道技术(bioballistics(Genegun)), 生物排出术(Bioejector)、粘合剂(垫)等等。
本发明的新免疫方法，例如初免(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒17D-D2)系统或者同时免疫(共同施药)，DNA疫苗通过有针的注射器经im途径施药，嵌合体病毒17D-D2还经im或者sc途径用注射器接种。其它途径，有针或无针，如前所例证，也可以使用在这个方法中。DNA疫苗和17D-D2疫苗的免疫在初免和加强免疫的系统和共同施药时都可以以两个星期间隔给药。这样的接种还可以以不同的时间间隔实施(从1个星期到5年)，以不同的剂量(一个、两个、三个等等剂量)。接种的DNA疫苗的浓度(每个剂量100µg)，嵌合体病毒(4 log10 PFU)的浓度，也还可以根据适当的方案变化。
本发明的初免和加强免疫的系统中，当加强免疫用嵌合体病毒进行免疫施药时，第一次免疫(剂量)用DNA疫苗实施。倒转这个方案也是可能的，使用嵌合体病毒进行第一次免疫，就用DNA疫苗加强免疫，以不同的时间间隔施药。
本发明使用编码登革热病毒的蛋白E的基因。还可以使用这个病毒的其它基因，比如编码蛋白C(核衣壳)、蛋白prM(膜)、蛋白NS1(非结构区域1)和蛋白NS3(非结构区域)的序列。蛋白NS1早已在分离的DNA疫苗的检测中显示抗登革热病毒的保护性能力(Costa et al.,2006, 2007)。
本发明的新免疫方法使用DNA疫苗和具有登革热病毒基因(17D-D2)的黄热病疫苗嵌合体病毒。这个方法还使用DNA疫苗和包含其它黄病毒基因的疫苗嵌合体病毒17D。该方法还可以使用包含黄热病毒基因和疫苗病毒17D的DNA疫苗。
这样，根据本发明的，提供一种抗登革热病毒的有效疫苗。此外，本发明还提供一种在初免(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒)系统或者两种疫苗(相同剂型的DNA疫苗和嵌合体病毒疫苗)同时共同施药的疫苗策略中，诱导基于DNA和嵌合体病毒17D疫苗联合免疫的抗登革热病毒免疫应答的新方法。包含抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗和嵌合体病毒的疫苗组合物和试剂盒也使用在本发明中。
参考文献
[1] Barrett AD. Current status of flavivirus vaccines. Ann N Y Acad Sci. 2001, 951: 262-71
[2] Blair PJ, Kochel TJ, Raviprakash K, Guevara C, Salazar M, Wu SJ, Olson JG, Porter KR. Evaluation of immunity and protective efficacy of a dengue-3 pre-membrane and envelope DNA vaccine in Aotus nancymae monkeys. Vaccine. 2006, 24:1427-32.
[3] Caufour, P.S., Motta, M.C.A., Yamamura, A.M.Y., Vazquez, S., Ferreira, I.I., Jabor, A.V., Bonaldo, M.C., Freire, M.S. & Galler, R. Construction, characterization and immunogenicity of recombinant yellow fever 17D-dengue type 2 viruses. Virus Res., 2001 79:1-14).
[4] Chang GJ. Molecular biology of dengue viruses. In: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever, Gubler,D.J.; Kuno,G.(eds), CAB International Publisher, 1997, pp. 175-198.
[5] Chen S, Yu M, Jiang T, Deng Y, Qin C, Qin E. Induction of tetravalent protective immunity against four dengue serotypes by the tandem domain III of the envelope protein.
DNA Cell Biol. 2007, 26:361-7.
[6] Costa SM, Paes MV, Barreto DF, Pinhao AT, Barth OM, Queiroz JL, Armoa GR, Freire MS & Alves AMB. Protection against dengue type 2 virus induced in mice immunized with a DNA plasmid encoding the non-structural 1 (NS1) gene fused to the tissue plasminogen activator signal sequence. Vaccine 2006, 24: 195-105.
[7] Costa S.M., Azevedo A.S., Paes M.V., Sarges F.S., Freire M.S. & Alves A.M. DNA vaccines against dengue virus based on the ns1 gene: the influence of different signal sequences on the protein expression and its correlation to the immune response elicited in mice. Virology 2007, 358:413-423.
[8] Encke J, zu Putlitz J, Geissler M, Wands JR. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in a murine model. J. Immunol. 1998, 161: 4917-23.
[9] Galler R, Marchevsky RS, Caride E, Almeida LF, Yamamura AM, Jabor AV, Motta MC, Bonaldo MC, Coutinho ES, Freire MS. Attenuation and immunogenicity of recombinant yellow fever 17D-dengue type 2 virus for rhesus monkeys. Braz J Med Biol Res. 2005, 38:1835-46.
[10] Kinney RM & Huang CY-H Development of new vaccines against dengue fever and japanese encefalitis. Intervirology 2001, 44: 176-197.
[11] Kochel T., Wu S.-J., Raviprakash K., Hobart P., Hoffman S., Porter K. & Hayes, C. Inoculation of plasmids expressing the dengue-2 envelope gene elicit neutralizing antibodies in mice. Vaccine 1997, 15: 547-552.
[12] Lin YL, Chen LK, Liao CL, Yeh CT, Ma SH, Chen JL, Huang YL, Chen SS, Chiang HY. DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice. J Virol. 1998, 72: 191-200.
[13] Marchevsky RS, Mariano J, Ferreira VS, Almeida E, Cerqueira MJ, Carvalho R, Pissurno JW, Travassos da Rosa APA, Simões MC, Santos CND, Ferreira II, Muylaert IR, Mann GF, Rice CM and Galler R. Phenotypic analysis of yellow fever virus derived from complementary DNA. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1995, 52:75-80.
[14] Phillpotts RJ, Venugopal K, Brooks T. Immunisation with DNA polynucleotides protects mice against lethal challenge with St. Louis encephalitis virus. Arch Virol. 1996, 141:743-749.
[15] Pennica D, Holmes WE, Kohr WJ, Harkins RN, Vehar GA, Ward CA, Bennett WF, Yelverton E, Seeburg PH, Heyneker HL, Goeddel DV, Collen D. Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. coli. Nature 1983,301:214-21.
[16] Putnak R, Fuller J, VanderZanden L, Innis BL, Vaughn DW. Am J Trop Med Hyg. Vaccination of rhesus macaques against dengue-2 virus with a plasmid DNA vaccine encoding the viral pre-membrane and envelope genes. 2003, 68:469-76.
[17] Raviprakash K., Porter K.R., Kochel T.J, Ewing D., Simmons M., Phillips I, Murphy G.S., Weiss W.R. & Hayes C.G. Dengue virus type 1 DNA vaccine induces protective immune responses in rhesus macaques. J. Gen. Virol. 2000, 81: 1569-1667.
[18] Rice CM, Grakoui A, Galler R, Chambers TJ. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1989, 1:285-96.
[19] Ruggli N; Tratschin J-D.; Mittelholzer C; Hofmann MA. Nucleotide sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and Transcription of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA. 1996, J. Virol. 70:3478-3487.
[20] Wu SF, Liao CL, Lin YL, Yeh CT, Chen LK, Huang YF, Chou HY, Huang JL, Shaio MF & Sytwu HK. Evaluation of protective efficacy and immune mechanisms of using a non-structural protein NS1 in DNA vaccine against dengue 2 virus in mice. Vaccine 2003, 21, 3919-3929.
SEQUENCE LISTING
<110> 奥斯瓦道.克鲁兹基金会
<120> 基于DNA疫苗和嵌合体病毒的诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法、试剂盒、质粒和组合物
<130> P1844
<140> PCT/BR2010/000323
<141> 2010-08-01
<150> BRPI0904020-0
<151> 2009-10-01
<160> 9
<170> 专利版本3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人（现代人的学名）（初级正义链t-PA）
<400> 1
ggggaagctt atggatgcaa tgaagagg 28
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人（现代人的学名）（初级反义链t-PA）
<400> 2
ggggatatcg ctgggcgaaa cgaagac 27
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 登革热Ⅱ型病毒（初级正义链E80%）
<400> 3
gggggatatc atgcgttgca taggaatatc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 登革热Ⅱ型病毒（初级反义链E80%）
<400> 4
ggggtctaga ttacgataga acttcctttc 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 登革热Ⅱ型病毒（初级正义链III E域）
<400> 5
gggggatatc ggaatgtcat actctatg 28
<210> 6
<211> 1203
<212> DNA
<213> 登革热Ⅱ型病毒（E80%）
<400> 6
atgcgttgca taggaatatc aaatagagac tttgtagaag gggtttcagg aggaagctgg 60
gttgacatag tcttagaaca tggaagctgt gtgacgacga tggcaaaaaa caaaccaaca 120
ttggattttg aactgataga aacagaagcc aaacaacctg ccactctaag gaagtactgt 180
atagaggcaa agctgaccaa cacaacaaca gattctcgct gcccaacaca aggagaaccc 240
agcctaaatg aagagcagga caaaaggttc gtctgcaaac actccatggt ggacagagga 300
tggggaaatg gatgtggact atttggaaaa ggaggcattg tgacctgtgc tatgttcaca 360
tgcaaaaaga acatgaaagg aaaagtcgtg caaccagaaa acttggaata caccattgtg 420
ataacacctc actcagggga agagcatgca gtcggaaatg acacaggaaa acatggcaag 480
gaaatcaaaa taacaccaca gagttccatc acagaagcag agttgacagg ctatggcact 540
gtcacgatgg agtgctctcc gagaacgggc ctcgacttca atgagatggt gttgctgcaa 600
atggaaaata aagcttggct ggtgcacagg caatggttcc tagacctgcc gttgccatgg 660
ctgcccggag cggacacaca aggatcaaat tggatacaga aagagacatt ggtcactttc 720
aaaaatcccc atgcgaagaa acaggatgtt gttgttttgg gatcccaaga aggggccatg 780
cacacagcac tcacaggggc cacagaaatc cagatgtcat caggaaactt actgttcaca 840
ggacatctca agtgcaggct gaggatggac aaactacagc tcaaaggaat gtcatactct 900
atgtgcacag gaaagtttaa agttgtgaag gaaatagcag aaacacaaca tggaacaata 960
gttatcagag tacaatatga aggggacggt tctccatgta agatcccttt tgagataatg 1020
gatttggaaa aaagacatgt tttaggtcgc ctgattacag tcaacccaat cgtaacagaa 1080
aaagatagcc cagtcaacat agaagcagaa cctccattcg gagacagcta catcatcata 1140
ggagtagagc cgggacaatt gaagctcaac tggtttaaga aaggaagttc tatcgtaatc 1200
tag 1203
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> 登革热Ⅱ型病毒（III E域）
<400> 7
ggaatgtcat actctatgtg cacaggaaag tttaaagttg tgaaggaaat agcagaaaca 60
caacatggaa caatagttat cagagtacaa tatgaagggg acggttctcc atgtaagatc 120
ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga catgttttag gtcgcctgat tacagtcaac 180
ccaatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc aacatagaag cagaacctcc attcggagac 240
agctacatca tcataggagt agagccggga caattgaagc tcaactggtt taagaaagga 300
agttctatcg taatctag 318
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人（信号肽t-PA）
<400> 8
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccagc 69
<210> 9
<211> 1983
<212> DNA
<213> 登革热病毒（prM/E）
<400> 9
ttccatttaa ccacacgtaa cggagaacca cacatgatcg tcagtagaca agagaaaggg 60
aaaagtcttc tgtttaaaac agaggatggt gtgaacatgt gtaccctcat ggccatggac 120
cttggtgaat tgtgtgaaga tacaatcacg tacaagtgtc cttttctcaa gcagaatgaa 180
ccagaagaca tagattgttg gtgcaactct acgtccacat gggtaactta tgggacgtgt 240
accaccacag gagaacacag aagagaaaaa agatcagtgg cactcgttcc acatgtggga 300
atgggactgg agacacgaac tgaaacatgg atgtcatcag aaggggcctg gaaacatgcc 360
cagagaattg aaacttggat cttgagacat ccaggcttta ccataatggc agcaatcctg 420
gcatacacca taggaacgac acatttccaa agagccctga ttttcatctt actgacagct 480
gtcgctcctt caatgacaat gcgttgcata ggaatatcaa atagagactt tgtagaaggg 540
gtttcaggag gaagctgggt tgacatagtc ttagaacatg gaagctgtgt gacgacgatg 600
gcaaaaaaca aaccaacatt ggattttgaa ctgatagaaa cagaagccaa acaacctgcc 660
actctaagga agtactgtat agaggcaaag ctgaccaaca caacaacaga ttctcgctgc 720
ccaacacaag gagaacccag cctaaatgaa gagcaggaca aaaggttcgt ctgcaaacac 780
tccatggtgg acagaggatg gggaaatgga tgtggactat ttggaaaagg aggcattgtg 840
acctgtgcta tgttcacatg caaaaagaac atgaaaggaa aagtcgtgca accagaaaac 900
ttggaataca ccattgtgat aacacctcac tcaggggaag agcatgcagt cggaaatgac 960
acaggaaaac atggcaagga aatcaaaata acaccacaga gttccatcac agaagcagag 1020
ttgacaggct atggcactgt cacgatggag tgctctccga gaacgggcct cgacttcaat 1080
gagatggtgt tgctgcaaat ggaaaataaa gcttggctgg tgcacaggca atggttccta 1140
gacctgccgt tgccatggct gcccggagcg gacacacaag gatcaaattg gatacagaaa 1200
gagacattgg tcactttcaa aaatccccat gcgaagaaac aggatgttgt tgttttggga 1260
tcccaagaag gggccatgca cacagcactc acaggggcca cagaaatcca gatgtcatca 1320
ggaaacttac tgttcacagg acatctcaag tgcaggctga ggatggacaa actacagctc 1380
aaaggaatgt catactctat gtgcacagga aagtttaaag ttgtgaagga aatagcagaa 1440
acacaacatg gaacaatagt tatcagagta caatatgaag gggacggttc tccatgtaag 1500
atcccttttg agataatgga tttggaaaaa agacatgttt taggtcgcct gattacagtc 1560
aacccaatcg taacagaaaa agatagccca gtcaacatag aagcagaacc tccattcgga 1620
gacagctaca tcatcatagg agtagagccg ggacaattga agctcaactg gtttaagaaa 1680
ggaagttcta tcggccaaat gattgagaca acaatgaggg gagcgaagag aatggccatt 1740
ttaggtgaca cagcttggga ttttggatcc ctgggaggag tgtttacatc tataggaaag 1800
gctctccacc aagttttcgg agcaatctat ggggctgcct tcagtggggt ctcatggatt 1860
atgaaaatcc tcataggagt cattatcaca tggataggaa tgaattcacg cagcacctca 1920
ctgtctgtgt cactagtatt ggtgggagtc gtgacgctgt atttgggagt tatggtgcag 1980
gcc 1983

Claims (10)

1.诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法，其特征在于，包括给患者DNA疫苗和17D嵌合体病毒的施药。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过给患者联合施药，在初免(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒)系统或者两个疫苗(以相同形式的DNA疫苗和嵌合体病毒疫苗)的同时共同施药的免疫策略。
3.抗登革热病毒的疫苗组合物，其特征在于，包含：
(a)从包含编码蛋白E的基因或仅包含对应于这些蛋白的区域III的序列的不同重组质粒的构建中产生的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，蛋白E来自每个登革热病毒亚型，它们都融合到编码人组织血浆酶原活动子(t-PA)的信号肽的序列中；
(b)嵌合体病毒包含经感染性克隆粘附技术修饰的黄热病疫苗病毒17D，由编码登革热病毒不同亚型的蛋白prM和蛋白E的序列取代编码黄热病毒蛋白prM和蛋白E的序列；以及
(c)药物上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述DNA疫苗包含：
-质粒pE1，由插入编码来自登革热病毒病毒性包膜(E)蛋白80%的序列构建，不具有登革热病毒蛋白E的C末端部分。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述DNA疫苗包含：
-质粒pE2，由插入编码登革热病毒蛋白E的包含登革热病毒全基因组的核苷酸1822和2125之间的区域III的序列构建。
6.试剂盒，其特征在于，包含：
(a)来自包含编码每个登革热病毒亚型的蛋白E的基因或包含仅对应于这些蛋白区域III的序列的不同重组质粒的构建的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，它们的序列都融合到编码人组织血浆酶原活动子的信号肽(t-PA)的序列中；以及
(b)嵌合体病毒包含经感染性克隆粘附技术修饰的黄热疫苗病毒17D，由编码不同亚型的登革热病毒的蛋白prM和蛋白E的序列取代编码黄热病毒蛋白prM和蛋白E的序列。
7.重组质粒，包含蛋白E基因，并且来自每个登革热病毒亚型的蛋白E基因的序列融合到编码t-PA信号肽的序列，其特征在于，由插入每个登革热病毒的没有蛋白E的C末端部分的病毒性包膜(E)的蛋白的80%的序列构建，其中这样的序列是使用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的正义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链放大的，然后介导在质粒pcTPA在编码信号肽t-PA的序列的相同的开放式阅读框内的限制性酶EcoRV和XbaII的酶切位点之间的序列的克隆，从而产生重组质粒。
8.根据权利要求7所述的质粒，其特征在于，编码登革热病毒的病毒性包膜蛋白(E)的80%的序列，该病毒包膜蛋白(E)的序列包含在DENV2,New Guinea C(NGC)菌株的全基因组的核苷酸937和213125之间(Genebank:M29095)。
9.重组质粒，包含蛋白E基因，并且来自每个登革热病毒亚型的蛋白E基因的序列融合到编码t-PA信号肽的序列，其特征在于，由插入编码登革热病毒蛋白E的区域III的序列构建的，其中这样的序列是使用如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4所示的正义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链放大的，在限制性酶EcoRV和XbaI酶切位点之间的，进一步地克隆在限制性酶EcoRV和XbaI酶切位点之间的序列，在编码信号肽t-PA的序列的开放阅读框内，从而生成重组质粒。
10.根据权利要求9所述的质粒，其特征在于，编码登革热病毒蛋白E的区域II的序列，包含在DENV2， NGC菌株 (Genebank: M29095)的全基因组的核苷酸1822和213125之间。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637086A (zh) * 2013-03-15 2021-11-12 武田疫苗股份有限公司 用于疫苗中的登革热病毒嵌合式构建物的组合物及方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014204892A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof
ITRM20130458A1 (it) 2013-08-05 2015-02-05 Internat Ct For Genetic En Gineering And Vaccino genetico anti-dengue virus basato sugli ectodomini della proteina envelope
CN106999568A (zh) * 2014-12-22 2017-08-01 默沙东公司 登革病毒疫苗组合物及其使用方法
US11464815B2 (en) 2018-09-05 2022-10-11 Takeda Vaccines, Inc. Dengue vaccine unit dose and administration thereof
CA3111332A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 Takeda Vaccines, Inc. Dengue vaccine unit dose and administration thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101287490A (zh) * 2005-08-10 2008-10-15 阿坎姆比斯公司 对抗登革热病毒感染的疫苗接种
WO2008127307A2 (en) * 2006-11-09 2008-10-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using prime-boost approach

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6455509B1 (en) * 1996-06-04 2002-09-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Dengue nucleic acid vaccines that induce neutralizing antibodies
US6962708B1 (en) * 1997-02-28 2005-11-08 Acambis, Inc. Chimeric flavivirus vaccines
BRPI9701774B8 (pt) 1997-04-11 2015-09-29 Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela.
US6881723B1 (en) * 1998-11-05 2005-04-19 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid constructs
EP1572941A4 (en) * 2002-02-26 2009-03-18 Maxygen Inc NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES
US20080193477A1 (en) 2005-08-10 2008-08-14 Acambis Inc. Vaccination Against Dengue Virus Infection
CU23586A1 (es) * 2005-11-22 2010-10-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus
US8835620B2 (en) * 2008-01-11 2014-09-16 Vgx Pharmaceuticals, Llc Vaccines against multiple subtypes of dengue virus

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101287490A (zh) * 2005-08-10 2008-10-15 阿坎姆比斯公司 对抗登革热病毒感染的疫苗接种
WO2008127307A2 (en) * 2006-11-09 2008-10-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using prime-boost approach

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. GUIRAKHOO等: "Recombinant Chimeric Yellow Fever-Dengue Type 2 Virus Is Immunogenic and Protective in Nonhuman Primates", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, 30 June 2000 (2000-06-30) *
GUIRAKHOO F ET.AL: "Safety and efficacy of chimerical yellow fever-dengue virus tetravalent vaccine formulations in nonhuman primates", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, 1 May 2004 (2004-05-01), pages 4761 - 4775, XP 002426475, DOI: doi:10.1128/JVI.78.9.4761-4775.2004 *
KANAKATTE RAVIPRAKESH ET.AL: "Advances in dengue vaccine development", <HUMAN VACCINE>, 31 August 2009 (2009-08-31), pages 520 - 527 *
MONIKA SIMMONS ET.AL: "Characterization of antibody responses to combinations of a dengue virus type2 DNA vaccine and two dengue virus type 2 protein vaccines in rhesus macaques", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, 31 October 2006 (2006-10-31), pages 9577 - 9585, XP 002588919, DOI: doi:10.1128/JVI.00284-06 *
S.M.COSTA ET.AL: "DNA vaccines against dengue virus based on the ns1 gene: the influence of different signal sequences on the protein expression and its correlation to the immune response elicited in mice", <VIROLOGY>, 3 October 2006 (2006-10-03), pages 413 - 423 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637086A (zh) * 2013-03-15 2021-11-12 武田疫苗股份有限公司 用于疫苗中的登革热病毒嵌合式构建物的组合物及方法

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