ITRM20130458A1 - Vaccino genetico anti-dengue virus basato sugli ectodomini della proteina envelope - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione: ?Vaccino genetico anti-dengue virus basato sugli ectodomini della proteina dell?involucro?
DESCRIZIONE
La presente invenzione fa riferimento al campo dell?ingegneria genetica e della virologia.
In particolare, si riferisce ad un vaccino genetico per il virus dengue o per qualsiasi virus appartenente al genere dei Flavivirus, pi? in particolare ad un vaccino basato su ectodomini della proteina dell?involucro (envelope protein) E, pi? in particolare basato sul dominio DIII del virus dengue o di altri Flavivirus.
SFONDO DELL?INVENZIONE
Il virus dengue ? un virus a RNA a polarit? positiva che appartiene al genere Flavivirus della famiglia Flaviviridae. Il virus dengue ? ampiamente diffuso nelle regioni tropicali e semitropicali del mondo ed ? trasmesso agli uomini da vettori zanzare. Si stima che esso provochi ogni anno pi? di 50 milioni di casi di febbre dengue (DF), 500.000 casi di febbre emorragica da dengue (DHF) e 25.000 morti, con 2,5 miliardi di persone a rischio (Guzman, M.G. et al., Nature Rev. Microbiol., 8, S7-S16, 2010). Attualmente non c?? ancora un vaccino approvato per l?uso contro il dengue; un vaccino chimerico attenuato (live vaccine) denguefebbre gialla ? stato sottoposto a sperimentazione clinica di fase III (Guy, B. et al., Vaccine, 29, 7229?7241, 2011), ma non ? riuscito a fornire protezione completa contro tutti e quattro i sierotipi di dengue allo stesso tempo (Sabchareon A., et al., Lancet, 380, 1559-1567, 2012). Un altro vaccino basato su DNA ? stato sottoposto a sperimentazione clinica di fase I (Beckett C.G., et al., Vaccine, 29, 960-968, 2011).
Il genoma del dengue codifica per tre proteine strutturali, C (capside), pr-M (membrana) e E (involucro), e sette proteine non-strutturali, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5, che includono una RNA polimerasi RNA-dipendente e una proteasi coinvolta nel processamento della lunga poliproteina virale, prodotta in seguito alla traduzione continua del genoma di RNA virale (Chambers, T. J. et al., Ann. Rev. Microbiol. 44, 649-688, 1990; Bollati, M. et al., Antiviral Res.87, 125-148, 2010).
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La proteina C incapsida il genoma di RNA, mentre le proteine M (ottenuta da taglio del precursore pr-M) ed E sono associate alla membrana dell?involucro e contribuiscono all?ingresso del virus nella cellula.
La proteina E costituisce il principale componente dell?involucro virale. Si tratta di una glicoproteina associata alla membrana che contiene due domini trans-membrana ed un ectodominio composto da tre sotto-domini (I, II, III) ed una regione di connessione (stem). Il dominio II (E-DII) ? responsabile dell?omodimerizzazione della proteina E; il dominio III (E-DIII) pu? ripiegarsi indipendentemente in una struttura di tipo immunoglobulinico ed ? coinvolto nel legame al recettore. La maggior parte degli anticorpi neutralizzanti anti-dengue ? rivolta contro E-DIII, che viene pertanto considerato un promettente bersaglio per la vaccinazione (Guzman M.G. et al., Expert Rev. Vaccines, 9, 137-147, 2010).
Sono noti quattro sierotipi di virus dengue (da "DENV 1" a "DENV 4"), che condividono tra di loro un?identit? di residui amminoacidici approssimativamente del 60%-74% nella proteina E ed inducono anticorpi cross-reagenti (Heinz, F.X. & Stiasny, K., Vaccine, 30, 4301-4306, 2012). Tuttavia, anticorpi neutralizzanti diretti contro proteine strutturali di un sierotipo di dengue forniscono solo una protezione limitata contro gli altri sierotipi e, in aggiunta, sembrano predisporre a forme pi? gravi di dengue (DHF) in seguito a re-infezione da parte di un altro sierotipo (Guzman, M.G. et al., Front. in Dengue Virus Res., Hanley, K.A. & Weaver, S.C. Eds., Caister Academic Press, Norfolk, U.K., 79-101, 2010). Infatti, il riconoscimento delle particelle virali da parte di anticorpi cross-reagenti, ma non neutralizzanti, pu? portare ad un aumentato ingresso di virus non completamente neutralizzati, mediato dal recettore Fc, in monociti, macrofagi e cellule dendritiche, che rappresentano i principali bersagli delle infezioni da dengue nell?uomo, provocando cos? il fenomeno conosciuto come intensificazione dell?infezione anticorpo-dipendente (ADE) (Heinz, F.X. & Stiasny, K., Vaccine, 30, 4301?4306, 2012; Halstead, S.B. et al., Lancet Infect. Dis., 10, 712-722, 2010). Ci? ? critico nello sviluppo di un vaccino per dengue, in quanto un immunogeno che non generi anticorpi completamente neutralizzanti verso tutti e quattro i sierotipi potrebbe contribuire alla malattia, piuttosto che prevenire l?infezione.
Vaccini sperimentali anti-dengue in modelli animali hanno sfruttato l?immunizzazione genetica con plasmidi o virus che esprimevano varie forme ricombinanti del dominio DIII della proteina dell?involucro del dengue E (E-DIII) (Mota, J. et al., Vaccine, 23, 3469-3476, 2005; Khanam, S., et al., Vaccine, 24, 6513-6525, 2006; Ramanathan, M.P. et al., Vaccine, 27, 6444-6453, 2009; Azevedo, A.S. et al., PLoSOne 6(7): e20528, 2011). Tuttavia, questi costrutti inducono solo una risposta immunitaria debole, con bassi titoli neutralizzanti nei sieri degli animali immunizzati.
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Vaccini tetravalenti per il dengue basati sul dominio III dell?involucro sono gi? stati descritti, per esempio nella seguente letteratura brevettuale.
WO2008152652 e WO2007034507 descrivono proteine ricombinanti basate sul dominio III dell?involucro in cui i domini DIII dei quattro sierotipi di virus dengue sono collegati da ponti (linkers) penta-glicinici. In WO2008152652 il costrutto pu? in aggiunta comprendere un peptide di secrezione proveniente da S. cerevisiae.
WO2010057159 e US2010291144 descrivono vaccini a DNA comprendenti costrutti con una sequenza consenso DIII, la quale pu? in aggiunta includere una sequenza guida (leader) derivata da IgG o IgE.
US6455509 descrive un vettore di espressione plasmidico eucariotico che include almeno una parte (92%) del gene dell?involucro e, facoltativamente, il gene preM del virus dengue.
In EP2484376, il DIII pu? essere fuso con la sequenza che codifica il peptide segnale dell?attivatore tissutale del plasminogeno umano (t-PA).
La fusione del DIII con un dominio eterologo non ? descritta n? prevista in nessuno dei documenti sopra citati.
US2009074781 descrive un vaccino anti-dengue attivo contro diversi sierotipi virali, che comprendente un peptide progettato sulla base dei domini DIII dei 4 sierotipi. Il costrutto non comprende ulteriori componenti.
US2013071419 descrive un vaccino comprendente una sequenza codificante il DIII fusa con una sequenza che codifica per la regione p28 della proteina c3d del complemento. Pu? essere somministrata una composizione tetravalente.
In WO2012045063 ? descritto un vaccino tetravalente per il dengue comprendente un polipeptide per il dominio DIII; la proteina di fusione pu? ulteriormente includere un polipeptide adiuvante.
Vi ? ancora il bisogno di un vaccino a DNA efficiente e specifico per il virus dengue. In particolare, vi ? un forte bisogno di un vaccino attivo contro tutti e quattro i sierotipi del virus dengue. Pi? in particolare, si sta ancora ricercando un vaccino basato sui domini della proteina dell?involucro, specialmente basato sul dominio DIII, dotato di aumentata immunogenicit? e induzione di elevati titoli di anticorpi neutralizzanti contro tutti e quattro i sierotipi.
La secrezione altamente inefficiente del dominio DIII quando espresso da solo in cellule di mammifero porta ad una scarsa risposta anticorpale anti-DIII in seguito ad immunizzazione
?
genetica. Per questo vi ? ancora il bisogno di un sistema per aumentare la secrezione del DIII e di conseguenza migliorare la risposta anticorpale.
Gli inventori della presente invenzione hanno scoperto che quando un qualsiasi dominio della proteina dell?involucro E di tutti e quattro i sierotipi del virus dengue, in particolare uno qualsiasi degli ectodomini DI, DII o DIII, viene fuso con almeno un dominio carbossiterminale di una regione costante di un?immunoglobulina, preferibilmente un dominio dimerizzante, per esempio il dominio CH3 dell?immunoglobulina G ( ?CH3) o il dominio CH4 dell?immunoglobulina E (?CH4), le proteine di fusione che si ottengono sono dotate di un?alta efficienza di secrezione. Questo consente un?aumentata biodisponibilit? e quindi infine una maggiore immunogenicit? di dette proteine di fusione, con riferimento allo stato dell?arte. I nuovi costrutti genetici della presente invenzione, che codificano le proteine di fusione sopra descritte, possono pertanto essere usati per immunizzare mammiferi efficacemente, grazie all?efficiente espressione dell?antigene ed alla conseguente stimolazione della risposta immune. ? di grande importanza che in seguito a somministrazione di detti costrutti ad un soggetto che ha bisogno di immunizzazione si generano titoli elevati di anticorpi neutralizzanti contro tutti e quattro i sierotipi di virus dengue: la presente invenzione fornisce quindi un vaccino tetravalente.
In aggiunta, quando il dominio della proteina dell?involucro incluso in detto costrutto genetico ? il DIII, questo pu? essere il DIII di un qualsiasi virus appartenente al genere Flavivirus.
RIASSUNTO DELL?INVENZIONE
E? un oggetto della presente invenzione un costrutto genetico comprendente una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida (leader) di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante un qualsiasi dominio della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detto dominio carbossiterminale permetta la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica ottenuta.
In una forma di realizzazione preferita, detto dominio della proteina dell?involucro E ? uno qualsiasi degli ectodomini DI, DII e DIII. In una forma di realizzazione pi? preferita esso ? DIII.
Quando il dominio della proteina dell?involucro incluso in detto costrutto genetico ? DIII, pu? essere il DIII di qualsiasi virus appartenente al genere Flavivirus.
Quindi, in una forma di realizzazione alternativa dell?invenzione, il costrutto genetico comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una
?
sequenza nucleotidica codificante il dominio DIII della proteina dell?involucro E di un virus appartenente al genere Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini, ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detto dominio carbossiterminale permetta la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica.
Quando detto dominio carbossiterminale ? dalla regione costante di un?immunoglobulina, detta immunoglobulina pu? essere di origine umana, murina o di altro animale. In una forma di realizzazione preferita, detto dominio carbossiterminale ? scelto dal gruppo che consiste dei domini da una qualsiasi sottoclasse immunoglobulinica.
Il costrutto dell?invenzione pu? facoltativamente ulteriormente comprendere una sequenza nucleotidica che codifica per un marcatore (tag), detta sequenza essendo preferibilmente inclusa tra la sequenza codificante il dominio della proteina E e la sequenza codificante uno o pi? domini carbossiterminali.
? un oggetto preferito della presente invenzione un costrutto genetico comprendente una sequenza polinucleotidica scelta dal gruppo che consiste di: SEQ ID N: 1, 2, 3 e 4.
N. 1)
Sec
E-DIII
SV5
hCH3
?
N.2) Sec E-DIII SV5 hCH3
N.3) Sec E-DIII SV5 hCH3
?
N. 4)
Sec
E-DIII
SV5
hCH3
in cui Sec ? il dominio di secrezione, E-DIII ? il dominio E-DIII, SV5 ? il marcatore (tag) esemplificativo SV5 e hCH3 ? il dominio hCH3 della IgG.
In una forma di realizzazione preferita, detto costrutto non contiene alcun tipo di marcatore (tag).
La proteina codificata da un qualsiasi costrutto genetico secondo l?invenzione ? anch?essa nell?ambito della presente invenzione. Detta proteina viene qui anche definita come ?proteina di fusione? o ?proteina chimerica?.
In particolare, una proteina comprendente una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID N. 5, 6, 7 e 8, codificate rispettivamente dalle sequenze geniche SEQ ID NO.1, 2, 3 e 4, ? un oggetto preferito della presente invenzione.
Sec
E-DIII
?
hCH3
Sec
E-DIII
SV5
hCH3
Sec
E-DIII
SV5
hCH3
Sec
E-DIII
SV5
hCH3
in cui Sec ? il dominio di secrezione, E-DIII ? il dominio E-DIII, SV5 ? il marcatore (tag) esemplificativo SV5 e hCH3 ? il dominio hCH3 delle IgG.
In una forma di realizzazione preferita, detto costrutto non contiene alcun tipo di marcatore (tag).
I vettori e i mezzi di veicolazione (delivery) dei costrutti genetici dell?invenzione rientrano nell?ambito della presente invenzione.
?
Gli anticorpi generati contro qualsiasi proteina codificata da un costrutto genetico secondo l?invenzione sono ulteriori oggetti della presente invenzione.
I costrutti genetici dell?invenzione, le proteine codificate da detti costrutti genetici e gli anticorpi indotti da detti costrutti possono essere usati come medicamenti.
In particolare, i costrutti genetici dell?invenzione e le proteine codificate da detti costrutti genetici possono essere usati come un medicamento per la prevenzione delle infezioni da dengue, in particolare di tutti e quattro i sierotipi.
In un?altra realizzazione dell?invenzione, essi possono essere usati come un medicamento per la prevenzione di infezioni di qualsiasi virus appartenente al genere Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini e che il costrutto genetico comprenda una sequenza codificante il dominio DIII di detto virus.
Un vaccino comprendente almeno un costrutto genetico dell?invenzione o almeno una proteina codificata da detto costrutto genetico, a condizione che detto costrutto genetico o proteina induca anticorpi cross-neutralizzanti, e vettori (carriers), eccipienti e facoltativamente adiuvanti farmaceuticamente accettabili ? anch?esso un oggetto della presente invenzione.
DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE
Definizioni
Nel contesto della presente invenzione, ?DIII? ? il dominio DIII della proteina dell?involucro E del virus dengue o di qualsiasi virus appartenente al genere Flavivirus la cui proteina dell?involucro sia suddivisa in tre sottodomini. Nella presente invenzione ?DIII?, ?E-DIII? e ?dominio III? sono usati come sinonimi.
Una ?proteina di fusione? ? una proteina creata mediante l?unione di due o pi? geni che in origine codificavano per proteine distinte. Vi si riferisce qui anche con il termine di ?proteina chimerica?.
Un ?costrutto genetico? ? un?unit? funzionale necessaria per l?espressione di un gene. ? caratterizzato da una sequenza nucleotidica e pu? essere una sequenza DNA o RNA.
Un ?peptide guida di secrezione? ? una breve sequenza peptidica, solitamente presente all?estremit? N-terminale di una proteina, necessaria per la secrezione della proteina o polipeptide collegato.
Figure
?
Figura 1. a: Rappresentazione schematica del dominio E-DIII ricombinante con il marcatore SV5, isolato o combinato con il dominio ?CH3 umano; sec: segnale di secrezione. b: Analisi in Western blotting di sopranatanti di colture cellulari (S) o di estratti cellulari (E) da cellule HEK-293 trasfettate con vettori esprimenti l?E-DIII dei sierotipi indicati, fusi o non fusi con il dominio CH3. c: Analisi in Western blotting di sopranatanti di colture cellulari da cellule trasfettate con vettori codificanti le chimere E-DIII- ?CH3 dei sierotipi indicati, dove la sequenza DIII ? o la sequenza virale originale (V) o quella sottoposta ad ottimizzazione dei codoni (O). Le proteine contenenti E-DIII sono state rivelate con anticorpi anti-SV5.
Figura 2. a: Schema del saggio ELISA per valutare la risposta immunitaria dei topi immunizzati con E-DIII- ?CH3. Sono state usate piastre ricoperte con streptavidina per catturare le chimere biotinilate E-DIII- ?CH4-BAP e i sieri dei topi sono stati saggiati a diverse diluizioni per valutarne i titoli anti-DIII; sec: segnale di secrezione; BAP: peptide accettore di biotina. In b ? mostrata la risposta dei topi immunizzati con E-DIII- ?CH3 dei sierotipi indicati, alla diluizione di 1:2000, contro i corrispondenti E-DIII- ?CH4, confrontata con l?attivit? di un siero preimmune (PI), alla stessa diluizione contro gli stessi antigeni.
Figura 3. a: Schema delle chimere E-DIII- ?CH4-GPI espresse sulla superficie cellulare usate negli esperimenti di citofluorimetria; sec: segnale di secrezione; GPI: sequenza di ancoraggio del glicosil-fosfatidil-inositolo. b: Analisi al FACS di cellule Sp2/0 che esprimono sulla superficie proteine E-DIII- ?CH4-GPI dei sierotipi indicati. Ogni linea cellulare ? stata saggiata con i sieri dei topi immunizzati contro i diversi sierotipi e con siero preimmune (PI). ? evidente come i sieri dei topi immunizzati contro ciascun sierotipo cross-reagiscano efficacemente con i DIII degli altri sierotipi.
Figura 4. a: Schema dell?ectodominio completo della proteina Env fuso al dominio transmembrana (TM) dell?allele A2 dell?MHC-I ? umano; sec: segnale di secrezione. b: Analisi al FACS di cellule HEK293 trasfettate transientemente che esprimono sulla superficie l?E-DIII-?CH4-GPI del sierotipo 3 ( ?DIII-GPI) o l?ectodominio Env del sierotipo 3 (m3E), oppure trasfettate fittiziamente (mock); le cellule sono state saggiate con siero anti-DIII del sierotipo 3 (anti-3DIII) o con siero preimmune (PI).
Figura 5. Saggio di neutralizzazione mediante riduzione di placche (Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT). Cellule Vero sono state infettate con virus dengue del sierotipo 2 (DENV-2) e trattate con siero di topo immunizzato con l?E-DIII del sierotipo corrispondente. Il risultato di un saggio tipico per il sierotipo 2 ? riportato in a, dove la riduzione delle placche nelle cellule trattate con siero anti-E-DIII (a destra) ? apprezzabile per confronto con le cellule trattate con siero preimmune (al centro); sulla sinistra ci sono le cellule non infettate.
?
In b ? indicato il livello di neutralizzazione rispetto al siero preimmune di otto sieri individuali da topi anti-E-DIII del sierotipo 2.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
E? un oggetto della presente invenzione un costrutto genetico che comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante un qualsiasi dominio della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detti domini carbossiterminali permettano la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica.
Il dominio carbossiterminale dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detti domini permettano la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica, viene anche qui definito come ?dominio carbossiterminale?.
Il peptide guida di secrezione compreso in detto costrutto pu? essere uno dei peptidi guida di secrezione noti nell?arte. Un peptide adatto ha la seguente sequenza amminoacidica: MGWSLILLFLVAVATGVHS (SEQ ID N. 9), codificata dalla seguente sequenza nucleotidica:
Quando il dominio della proteina E ? il DIII, ? preferibilmente il DIII di uno dei seguenti ceppi di virus dengue: DENV1 ceppo Nauru Island, DENV2 ceppo NGC, DENV3 ceppo 3H87 e DENV4 ceppo Dominica.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la sequenza nucleotidica codificante un qualsiasi dominio della proteina dell?involucro E del virus dengue ? una sequenza nucleotidica che codifica per il dominio III.
In una forma di realizzazione pi? preferita, detta sequenza nucleotidica ? scelta dal gruppo che consiste di:
?
e
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie codifica per un dominio carbossiterminale dalla regione costante di un?immunoglobulina, detta immunoglobulina essendo di origine umana, murina o di altro animale. In una forma di realizzazione pi? preferita, detto dominio carbossiterminale ? scelto dal gruppo che consiste dei domini
e C ??da qualsiasi sottoclasse immunoglobulinica.
?
Tutte le sequenze nucleotidiche e amminoacidiche di detti domini sono note nell?arte, pertanto dette sequenze non sono riportate nella presente descrizione.
Per esempio, il dominio ?CH3 umano ha la seguente sequenza amminoacidica:
Tra la sequenza del dominio della proteina E e la sequenza del uno o pi? domini carbossiterminali, per esempio tra i domini DIII e CH3, si pu? inserire un marcatore (tag) per facilitare la rilevazione delle proteine ricombinanti ottenute. Marcatori adatti sono, per esempio, SV5, FLAG, c-myc, HA, His6, HSV, T7, che sono tutti marcatori noti nell?arte. Un marcatore preferito ? il SV5, la cui sequenza amminoacidica ?
16).
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, il costrutto genetico comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio III della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina.
In una realizzazione pi? preferita, il costrutto genetico comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio III della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante il dominio ?CH3 dell?immunoglobulina G (costrutto E-DIII-?CH3).
In un?altra forma di realizzazione preferita, il costrutto genetico comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio III della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante il dominio ?CH4 dell?immunoglobulina E (costrutto E-DIII- ?CH4).
In una forma di realizzazione alternativa, il costrutto genetico comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio III della proteina dell?involucro ?E? di un qualsiasi virus appartenente al genere Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini, ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detti domini carbossiterminali permettano la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica.
I frammenti di DNA che codificano il DIII virale dell?invenzione sono preferibilmente codonottimizzati allo scopo di migliorarne l?espressione in cellule di mammifero. L?ottimizzazione
?
dei codoni viene ottenuta con metodi noti nell?arte per la sintesi chimica di determinate sequenze di DNA (Jestin, J.L. & Kempf, A., J. Mol. Evol., 69, 452-457, 2009, Wang, P.G. et al., PLoSOne 4(12): e8325, 2009).
La sintesi e l?assemblaggio dei costrutti genetici dell?invenzione possono essere condotti secondo metodi noti nell?arte (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press). I metodi e i protocolli idonei per da usare per la costruzione di un costrutto specifico secondo la presente invenzione possono essere scelti da un esperto nel ramo secondo la comune conoscenza nel settore tecnico.
In una realizzazione preferita, il costrutto genetico comprende una sequenza polinucleotidica scelta dal gruppo che consiste di: SEQ ID N.1, 2, 3 e 4.
I vettori di espressione che comprendono un costrutto secondo la presente invenzione rientrano nell?ambito della presente invenzione. Vettori adatti sono disponibili sul mercato. Pi? in dettaglio, i costrutti genetici della presente invenzione possono essere inseriti in qualunque vettore di espressione in grado di sostenere espressione in cellule di mammifero.
Vettori esemplificativi sono pcDNA3 (Life Technologies) e pVAX (Life Technologies).
La persona esperta sa come inserire il costrutto dell?invenzione nel vettore di espressione desiderato utilizzando i siti di restrizione appropriati; per esempio il costrutto genetico pu? essere inserito nei siti di restrizione HindIII/EcoRI di un vettore di espressione.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, il costrutto genetico dell?invenzione viene introdotto in una cellula ospite. La cellula ospite pu? essere una cellula procariotica o eucariotica. Preferibilmente ? una cellula di mammifero. Quando la cellula ospite ? una cellula procariotica, si dovrebbe usare un vettore di espressione procariotico adeguato. Il costrutto pu? essere introdotto in una cellula ospite mediante trasfezione con qualunque procedura idonea per l?ingresso in una cellula, per esempio metodi biologici o fisici, in modo che la cellula ospite possa esprimere le molecole della presente invenzione.
Una cellula ospite trasfettata con un vettore di espressione che comprende il costrutto genetico dell?invenzione ? anch?essa nell?ambito della presente invenzione.
Quando si trasfetta una cellula ospite con il costrutto dell?invenzione, la corrispondente proteina di fusione viene espressa. Un antigene correttamente conformato ? cos? ottenuto e secreto.
?
Per indurre una risposta anticorpale in seguito ad immunizzazione genetica ? necessario che l?antigene sia ben espresso e secreto dalle cellule dell?ospite, allo scopo di produrre una disponibilit? significativa di antigene per una stimolazione efficace delle cellule B.
La secrezione da cellule di mammifero di domini della proteina dell?involucro, in particolare di domini DIII, con il dominio ingegnerizzato contenente solo un peptide di secrezione amminoterminale ? estremamente inefficiente e di conseguenza non in grado di indurre risposte anticorpali contro il dominio ingegnerizzato.
Il costrutto dell?invenzione risolve il problema dell?inefficienza della secrezione, fornendo una proteina di fusione comprendente un qualsiasi dominio della proteina dell?involucro E che viene efficientemente secreta da cellule di mammifero, soprattutto grazie alla presenza di uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie.
Una secrezione particolarmente efficiente ? stata ottenuta con una proteina di fusione comprendente il DIII fuso con il dominio CH3 delle IgG.
Pertanto il costrutto della presente invenzione codifica una proteina ricombinante ingegnerizzata che consiste (dall?estremit? N alla C) di tre elementi essenziali:
i) un peptide guida di secrezione per consentire la secrezione da cellule di mammifero (sec);
ii) la sequenza antigenica con i codoni ottimizzati di un qualsiasi dominio della proteina E, e
iii) uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie.
Quest?ultima caratteristica ? la pi? importante, in quanto gli inventori della presente invenzione hanno scoperto che il dominio carbossiterminale dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie rende il dominio della proteina E idoneo alla secrezione (secretable).
Le proteine codificate dai costrutti genetici dell?invenzione rientrano nell?ambito della presente invenzione.
In una realizzazione preferita, detta proteina comprende la sequenza amminoacidica del dominio III della proteina dell?involucro E del virus dengue. In una realizzazione pi? preferita, detta sequenza amminoacidica ? scelta dal gruppo che consiste di:
?
In una realizzazione pi? preferita, la proteina comprende una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID N. 5, 6, 7 e 8. Detta proteina ? codificata, per esempio, dai polinucleotidi di SEQ ID N.1, 2, 3 e 4.
Dette proteine si possono ottenere tramite un costrutto genetico secondo l?invenzione per mezzo di metodi noti nell?arte.
Gli anticorpi generati contro il dominio della proteina E codificato da un qualsiasi costrutto genetico secondo l?invenzione sono un ulteriore oggetto della presente invenzione. Detti anticorpi si possono ottenere in seguito ad immunizzazione partendo dai costrutti dell?invenzione o dalle proteine di fusione codificate secondo metodi note nell?arte.
Detti anticorpi si possono usare, per esempio, per immunoterapia umorale passiva per la prevenzione o il trattamento di infezioni da virus dengue o da altri Flavivirus.
La veicolazione ad un soggetto di un costrutto genetico secondo l?invenzione, comprendente la sequenza di un qualsiasi dominio della proteina E, induce elevati titoli anticorpali nei confronti di detto dominio.
?
In particolare, la veicolazione ad un soggetto di un costrutto genetico comprendente la sequenza DIII del virus dengue induce elevati titoli anticorpali anti-DIII per tutti i sierotipi virali.
Questi anticorpi riconoscono il DIII sia quando espresso da solo, sia quando espresso come parte dell?ectodominio completo della proteina E in tutti e quattro i sierotipi.
I sieri dei soggetti vaccinati con i detti costrutti genetici mostrano elevati titoli di attivit? neutralizzante nei confronti dell?infettivit? virale.
Cosa pi? importante, i costrutti secondo l?invenzione sono efficienti nell?indurre risposte neutralizzanti nei confronti di qualsiasi dei quattro sierotipi di virus dengue.
In particolare, la vaccinazione di un soggetto con i quattro costrutti di SEQ ID N. 1, 2, 3 e 4 (vaccino tetravalente) induce anticorpi neutralizzanti verso tutti e quattro i sierotipi con attivit? comparabile.
Il costrutto genetico secondo l?invenzione pu? essere impiegato come un medicamento.
In aggiunta, la proteina codificata da detto costrutto pu? essere impiegata come un medicamento.
In particolare, detto costrutto o proteina possono essere impiegati come un medicamento per la prevenzione delle infezioni da dengue di tutti e quattro i sierotipi.
In un?altra realizzazione, pu? essere usato come un medicamento per la prevenzione di infezioni di qualsiasi virus appartenente al genere dei Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini e che detto costrutto genetico comprenda una sequenza nucleotidica codificante il dominio DIII di detto virus.
Il costrutto pu? essere somministrato da solo o in combinazione con altri agenti terapeutici per aumentarne l?antigenicit?, per esempio adiuvanti.
Rientra nell?ambito della presente invenzione anche un vaccino contro qualsiasi dei quattro sierotipi del virus dengue comprendente almeno un costrutto genetico secondo l?invenzione o almeno una proteina codificata da detto costrutto genetico, a condizione che detto costrutto genetico o proteina induca anticorpi cross-neutralizzanti, e vettori, eccipienti e facoltativamente adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
In una realizzazione preferita, detto vaccino comprende almeno quattro costrutti, ciascuno comprendente una sequenza nucleotidica codificante il dominio III di un sierotipo differente di dengue.
?
E? un ulteriore oggetto della presente invenzione un vaccino contro qualsiasi virus appartenente al genere dei Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini, comprendente almeno un costrutto genetico secondo l?invenzione o almeno una proteina codificata da detto costrutto genetico, in cui la sequenza nucleotidica codificante qualunque dominio della proteina dell?involucro E codifichi il dominio DIII, a condizione che detto costrutto genetico o proteina induca anticorpi crossneutralizzanti, e vettori, eccipienti e facoltativamente adiuvanti farmaceuticamente accettabili. Detto vaccino pu? essere usato per la prevenzione di infezioni da qualsiasi virus appartenente al genere dei Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini. Esempi di detto virus sono il virus delle febbre emorragica dengue, il virus West Nile, il virus dell?encefalite Tick-borne, il virus dell?encefalite giapponese, il virus delle febbre gialla, il virus della malattia della foresta Kyasanur, il virus delle febbre emorragica Omsk, il virus dell?encefalite St. Louis, il virus Powassan, il virus dell?encefalite Murray Valley.
In una realizzazione preferita, detto vaccino genetico comprende un costrutto comprendente una sequenza nucleotidica che codifica il dominio DIII e una sequenza nucleotidica che codifica per il dominio CH3 delle IgG.
In una realizzazione preferita, il vaccino comprende almeno un costrutto comprendente una sequenza polinucleotidica scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID N.1, 2, 3 e 4.
In una realizzazione pi? preferita, il vaccino comprende quattro costrutti, uno comprendente la sequenza polinucleotidica di SEQ ID N.1, uno comprendente la sequenza polinucleotidica di SEQ ID N. 2, uno comprendente la sequenza polinucleotidica di SEQ ID N. 3 e uno comprendente la sequenza polinucleotidica di SEQ ID N.4. Questa realizzazione del vaccino viene anche qui chiamata formulazione tetravalente.
Nel contesto della presente invenzione, per anticorpi cross-neutralizzanti si intende anticorpi in grado di neutralizzare completamente tutti e quattro i sierotipi del virus dengue.
Il costrutto genetico nel vaccino pu? essere sotto forma di puro (naked) DNA o RNA.
Si possono usare diverse modalit? di veicolazione (delivery) del costrutto, inclusi vettori virali (per esempio, il virus adeno-associato (AAV)).
La preparazione di vaccini a DNA avviene nel contesto delle conoscenze generali. Si pu? fare riferimento a Saltzman W. M., Shen H., Brandsma J.L. eds. (2006) DNA Vaccines. Methods and Protocols.2<nd >Edition. Totowa, NJ, Humana Press.
?
Il vaccino pu? essere sotto forma di una preparazione per somministrazione intradermica, intramuscolare, intraperitoneale, parenterale, endovenosa, sottocutanea, intranasale o orale, ma altre forme sono ugualmente adeguate.
La somministrazione ? generalmente ottenuta mediante iniezione.
Le dosi di vaccino possono essere determinate correttamente da un medico, tenendo in considerazione il tipo di forma di dosaggio, il metodo di somministrazione, l?et? del paziente, il peso, ecc. Questa attivit? rientra nelle normali attivit? di una persona esperta nell?arte.
Un vaccino secondo l?invenzione pu? essere usato per l?immunizzazione di un soggetto animale. Pertanto anche il vaccino dell?invenzione per uso veterinario ? un oggetto della presente invenzione.
A questo proposito, un elenco esemplificativo di infezioni virali che possono essere trattate con la presente invenzione ?: virus dell?encefalite giapponese, virus della malattia della foresta Kyasanur, virus Louping-ill, virus dell?encefalite Murray Valley, virus della febbre emorragica Omsk, virus dell?encefalite St. Louis, virus dell?encefalite Tick-borne, virus Wesselsbron, virus West Nile, virus della febbre gialla.
Viene inoltre fornito un metodo per immunizzare un soggetto contro l?infezione da virus dengue di qualsiasi dei quattro sierotipi comprendente la somministrazione del costrutto genetico dell?invenzione ad un soggetto.
Viene altres? fornito un metodo per immunizzare un soggetto contro infezioni da Flavivirus comprendente la somministrazione del costrutto genetico dell?invenzione, in cui detto costrutto genetico comprende una sequenza nucleotidica codificante il DIII, ad un soggetto.
Detto soggetto ? un animale, preferibilmente un mammifero, pi? preferibilmente ? un umano.
La presente invenzione sar? ora ulteriormente descritta per mezzo dei seguenti esempi nonlimitanti.
ESEMPI
Materiali e Metodi
Costrutti con l?E-DIII ricombinante
Le sequenze codificanti l?ectodominio dell?involucro e il dominio E-DIII del virus dengue (DENV) sono state ottenute dai ceppi DENV1 Nauru Island (numero d?accesso GenBank U88535.1), DENV2 New Guinea C (NGC, numero d?accesso GenBank AF038403), DENV3 3H87 (numero d?accesso GenBank M93130) e DENV4 Dominica (numero d?accesso GenBank AF326573.1).
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Le sequenze E-DIII dei sierotipi 1, 2, 3 e 4 di virus dengue sono state prodotte come geni sintetici da GenScript (Piscataway, NJ, USA). Le sequenze E-DIII dei sierotipi DENV 2, 3 e 4 sono state ulteriormente ottimizzate nei codoni, per migliorarne l?espressione in cellule di mammifero.
I frammenti codificanti l?E-DIII da ciascun sierotipo sono stati inseriti in vettori pcDNA3 (Life Technologies) che contenevano gi? sequenze codificanti un segnale di secrezione da immunoglobuline murine (sec) e il marcatore SV5, oppure sec, SV5 e il dominio CH3 delle IgG umane ( ?CH3), per generare rispettivamente i pCDNA3-sec-E-DIII-SV5 e pCDNA3-sec-E-DIII-SV5- ?CH3, che sono stati utilizzati per la vaccinazione dei topi.
Per valutare la presenza di anticorpi anti-E-DIII nei sieri dei topi vaccinati, il dominio E-DIII di ciascun sierotipo ? stato ingegnerizzato aggiungendo al C-terminale il dominio CH4 delle IgE umane ( ?CH4) fuso o con il segnale di ancoraggio GPI (per produrre una proteina di membrana E-DIII- ?CH4-GPI) o con la sequenza per il BAP (Biotin Acceptor Peptide, peptide accettore di biotina, per ottenere una molecola E-DIII- ?CH4 secreta e biotinilata). Per costruire i vettori codificanti le molecole E-DIII- ?CH4-GPI, frammenti HindIII-KpnI dai quattro pCDNA3-sec-E-DIII-SV5- ?CH3, contenenti le sequenze codificanti il sec-E-DIII, sono stati inseriti nel vettore pCDNA3- ?mSIP/ ?EMPD-GPI (Poggianella M. et al., J. Immunol., 177, 3597-3605, 2006), per generare il plasmide pCDNA3-sec-E-DIII- ?CH4-GPI. Per produrre vettori esprimenti molecole E-DIII- ?CH4 secrete e biotinilate, frammenti HindIII-Bsu36I dai quattro plasmidi pCDNA3-sec-E-DIII- ?CH4-GPI sono stati tagliati ed inseriti nei siti corrispondenti del vettore bigenico pCDNA3-sec-SV5-Cys ?CH3CH4-BAP-BirA precedentemente descritto (Predonzani A. et al., BMC Biotechnology 8:41, 2008), per ottenere i vettori pCDNA3-E-DIII- ?CH4-BAP-BirA, che esprimono alla stesso tempo le molecole E-DIII- ?CH4-BAP e la biotina ligasi BirA, la quale biotinila efficacemente proteine marcate con il BAP.
Per saggiare se gli anticorpi anti-E-DIII leghino l?ectodominio dell?involucro espresso sulle membrane cellulari, l?ectodominio ? stato combinato con il dominio trans-membrana esogeno dell?allele A2 dell?MHC-I ? umano. Per questo scopo gli ectodomini completi (composti dai domini DI, DII e DIII) dell?involucro dei quattro sierotipi sono stati sintetizzati ed inseriti in vettori pcDNA3 (pcDNA3-Env). La sequenza codificante il dominio trans-membrana dell?MHC-I ? (TMD) ? stata amplificata usando come stampo il pcDNA-BAP-MHC-I ? (Petris G. et al., PLoS ONE, 6(8): e23712, 2011) con gli oligonucleotidi 5'-CCG GAA TTC GGA GCC GTC TTC CCA GCC-3' (SEQ ID N.21) and 5'-ATA GGG CCC TTA ACC TTC ATT TTT AAA GAT-3' (SEQ ID N. 22). Il frammento amplificato ? stato ligato nei siti EcoRI e Apal dei quattro
?
vettori pCDNA3-Env, generando i costrutti finali pCDNA3-Env-TMD.
Linee cellulari e ceppi di virus dengue
Le linee cellulari HEK293 e HEK293T/17 da American Type Culture Collection (Rockville, MD, n. CRL-1573 e CRL-11268, rispettivamente) sono state coltivate in ?Dulbecco's modified Eagle's medium? (DMEM, Life Technologies, Paisley, UK) supplementato con 10% di siero fetale bovino inattivato al calore (FCS, Life Technologies), 50 ?g/ml di gentamicina (Life Technologies) e 2 mM di L-glutammina (Sigma). Per selezionare i cloni stabilmente trasfettati di HEK293, sono stati aggiunti 0,4 mg/ml di G418 (Geneticin, Life Technologies).
Le cellule BHK-21 sono state coltivate in terreno DMEM supplementato con 10% di FCS inattivato al calore, 50 ?g/ml di gentamicina e 2 mM di L-glutammina.
Le cellule Vero sono state mantenute in terreno DMEM supplementato con 10% di FCS inattivato al calore, 50 ?g/ml di gentamicina, 2 mM di L-glutammina e 4,5 g/l di glucosio.
Le cellule Sp2/0 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 (Life Technologies) supplementato con 10% di FCS inattivato al calore, 50 ?g/ml di gentamicina, 2 mM di L-glutammina e 1 mM di sodio piruvato; i cloni stabilmente trasfettati di Sp2/0 sono stati cresciuti in terreno selettivo contenente 0,4 mg/ml di Geneticin.
I ceppi DENV1 Hawaii A, DENV2 NGC, DENV3 TC3 e DENV4 TC25 sono stati usati per il saggio di neutralizzazione mediante riduzione di placche. Tutti i ceppi DENV sono stati propagati in cellule BHK21 cells, coltivate in DMEM supplementato con 2% FCS inattivato al calore, 50 ?g/ml gentamicina, 2 mM L-glutammina e mantenute a 36?C e 5% CO2.
Rilevazione dell?espressione di molecole di dengue ricombinanti in cellule trasfettate HEK 293 e Sp2/0
Le trasfezioni transienti di cellule HEK293T/17 e le trasfezioni stabili di cellule HEK293 sono state condotte essenzialmente come descritto da Sambrook et al., utilizzando rispettivamente plasmidi circolari o linearizzati.
Le cellule HEK 293T/17 sono state seminate in piastre da sei pozzetti ad una densit? di 5x105 cellule/pozzetto e trasfettate con il metodo standard del calcio fosfato, utilizzando tra 2,5 e 5 ?g di plasmidi. 24 h dopo la trasfezione il terreno di coltura ? stato rimpiazzato con terreno senza siero, o con terreno senza siero supplementato con 100 ?M biotin (Sigma) per produrre proteine biotinilate in vivo, secondo il metodo descritto (Predonzani A. et al., BMC Biotechnology 8:41, 2008), e 48 h dopo la trasfezione sono stati raccolti gli estratti cellulari e i sopranatanti delle cellule trasfettate transientemente. Per rimuovere la biotina libera, i sopranatanti contenenti molecole biotinilate sono stati estesamente dializzati contro PBS
?
dopo la raccolta. Gli estratti cellulari sono stati preparati a 4?C in 100 ?l di tampone di lisi TNN (100 mM Tris-HCl, pH 8, 250 mM NaCl, 0,5% NP-40), supplementato con una miscela di inibitori di proteasi (Protease Inhibitor Cocktail, PIC, Sigma) secondo le istruzioni del produttore. L?espressione e la secrezione delle molecole di dengue ricombinanti sono state confermate per Western blotting.
Per studiare mediante un saggio ELISA la risposta immune generata nei topi dai vaccini a DNA, sono state espresse in cellule HEK293 trasfettate stabilmente molecole ricombinanti E-DIII biotinilate, fuse con il ?CH4 umano, o l?ectodominio ricombinante dell?involucro biotinilato. Sono state trasfettate 107 cellule HEK 293 con 15 ?g di DNA mediante la tecnica del calcio fosfato. I cloni stabili sono stati selezionati per coltura in terreno contenente 0,4 mg/ml di G418 e la secrezione delle proteine biotinilate ? stata confermata con Western blotting. I sopranatanti delle cellule trasfettate stabilmente sono stati raccolti dopo 72 h di coltura in terreno senza siero supplementato con biotina e dializzati contro PBS.
Per studiare mediante un saggio citofluorimetrico la risposta immune generata nei topi dai vaccini a DNA, le molecole ricombinanti E-DIII, fuse con il ?CH4 umano, sono state espresse mediante l?ancoraggio a GPI sulla superficie di cellule Sp2/0 trasfettate stabilmente. Le trasfezioni sono state effettuate per elettroporazione, come descritto in precedenza (Bestagno M. et al., Biochemistry, 40, 10686-10692, 2001). I cloni sono stati analizzati con anticorpi di capra anti-IgE umane marcati con FITC (KPL, Gaithersburg, MD, USA) in un citofluorimetro FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) con il programma CellQuest.
Campioni dei lisati cellulari e dei sopranatanti sono stati separati in gel SDS-PAGE al 10% in condizioni riducenti, quindi trasferiti su membrana di difluoruro di polivinilidene (Millipore). Le membrane sono state saturate per 1 h con latte al 5% in PBST (PBS supplementato con 0,1% Tween-20), saggiate per 1h a temperatura ambiente con anticorpi monoclonali anti-SV5 (Life Technologies) e dopo lavaggi con PBST incubate per 1h a temperatura ambiente con anticorpi di capra anti-IgG murine marcati con HRP (Jackson Immunoresearch, Newmarket, UK); in alternativa, dopo la saturazione le membrane sono state incubate con anticorpi di capra anti-IgE umane marcati con HRP (KPL). I segnali sono stati visualizzati con ECL (Pierce, Rockford, IL, USA).
Vaccinazione di topi Balb/c
Topi Balb/c femmina di 5-6 settimane, sono stati acquistati da Harlan (Milano, Italia) e sono stati mantenuti nello stabulario dell?ICGEB (Trieste, Italia). Tutte le procedure su animali sono state condotte secondo le linee guida istituzionali e nel rispetto delle normative
?
nazionali e internazionali.
Quattro gruppi di 10 topi femmine Balb/c sono stati vaccinati con ciascun vaccino antidengue monovalente a DNA utilizzando la somministrazione mediante Gene Gun (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), come descritto in precedenza (Cesco-Gaspere M. et al., Scand. J. Immunol., 68, 58-66, 2008). Un gruppo di topi non-immunizzati ? stato inoltre impiegato come controllo negativo e un gruppo di topi ? stato vaccinato con tutti e quattro i sierotipi. Gli animali sono stati immunizzati tre volte a intervalli di quindici giorni con 1 ?g di DNA per i vaccini monovalenti o 2 ?g di DNA (0,5 ?g ciascuno) per i vaccini tetravalenti e campioni di sangue sono stati prelevati al 45? e 60? giorno, per mezzo di puntura sotto-mandibolare. I campioni di siero sono stati raccolti e conservati a -20?C fino al momento dell?uso.
Saggi anticorpali (analisi anti-E-DIII)
I sieri dei topi sono stati analizzati per la presenza di anticorpi anti-E-DIII in ELISA e in citometria a flusso.
In ELISA, la specificit? e la cross-reattivit? dei sieri dei topi immunizzati con E-DIII per ciascun sierotipo di virus dengue sono state confermate utilizzando l?E-DIII biotinilato in vivo come antigene di rivestimento. MaxiSorp Nunc Immuno-Plates (Nunc, Roskilde, Danimarca) sono state rivestite con 100 ?l/pozzetto di avidina diluita a 5 ?g/ml in tampone 50mM Na2CO3/NaHCO3 pH 9,5 e incubate per una notte a 4?C. Dopo tre lavaggi con tampone PBST (0,05% Tween 20 in PBS pH 7,4) e saturazione con 100 ?l/pozzetto di BSA all?1% in PBS (PBS-BSA) per 1 h e 30 min a temperatura ambiente, l?antigene E-DIII biotinilato, dializzato (100?l/well), diluito in PBS, ? stato incubato per una notte a 4?C. Le piastre sono state quindi lavate tre volte con tampone PBST e i sieri dei topi immunizzati sono stati aggiunti a diluizioni da 1:1000 a 1:10.000 in PBS-BSA. Dopo 2 h di incubazione a temperatura ambiente, le piastre sono state lavate tre volte e sono stati aggiunti 100 ?l/pozzetto di anticorpi di capra anti-IgG murine, specifici per la catena ?, coniugati con HRP (Jackson ImmunoResearch) (1:20.000 in PBS-BSA) e incubati per 1 h. Il coniugato legato ? stato rivelato con il substrato TMB (Sigma) e le piastre incubate a temperatura ambiente per 5 min. La reazione ? stata arrestata mediante aggiunta di 1N H2SO4 e la densit? ottica ? stata misurata a 450 nm (OD450).
Il titolo di IgG anti-dengue ? stato determinato come il reciproco della pi? alta diluizione del siero alla quale l?OD450 fosse almeno dieci volte pi? alta di quella del siero non immune.
Risposte immuni specifiche e cross-reattive contro l?E-DIII sono state analizzate su trasfettanti stabili in Sp2/0 di E-DIII mediante citofluorimetria in un citometro a flusso FACSCalibur, utilizzando i sieri anti-E-DIII (1:1000), seguiti da anticorpi di capra anti-IgG
?
murine (1:1000) coniugati con Alexa488 (Jackson ImmunoResearch).
Saggio di neutralizzazione mediante riduzione di placche (Plaque reduction neutralization test, PRNT)
Il PRNT ? stato condotto su cellule Vero in piastre da 24 pozzetti, secondo le procedure descritte in ?Guidelines for plaque reduction neutralization testing of human antibodies to dengue virus? (World Health Organization, Ginevra, Svizzera, 2007).
Il giorno precedente al saggio di neutralizzazione, le cellule sono state seminate ad una densit? di 160.000 cellule/pozzetto.
I campioni di siero di topo decomplementati (30 min a 56?C) sono stati diluiti in serie (da 1:12,5 a 1:400) in terreno DMEM senza siero, quindi ? stato aggiunto un volume uguale di virus dengue contenente 50 PFU/reazione. La reazione di neutralizzazione ? stata condotta in un volume finale di 60 ?l e incubato per 1 h 30 min a 36?C.
Dopo lavaggi con terreno DMEM senza siero, le cellule Vero sono state infettate in duplicato con 25 ?l di miscela di neutralizzazione per 1h a 36?C, dopo di che l?inoculo virale ? stato rimosso e le cellule ricoperte con 1 ml di DMEM supplementato con 2% di FCS e 3% di carbossimetilcellulosa (Sigma). Le piastre sono state incubate a 36?C per 8-10 giorni, a seconda del sierotipo. Dopo questo periodo, le cellule sono state lavate due volte con soluzione di PBS, fissate per 1 h con paraformaldeide (Sigma) al 3,7% e colorate con 1% di cristal violetto per 20 min. Le placche sono state contate e la percentuale di riduzione del numero di placche ? stata calcolata come [(numero medio di placche nei pozzetti di controllo con siero preimmune ? numero medio di placche nei pozzetti in esame)/ numero medio di placche nei pozzetti di controllo con siero preimmune] x 100. Il titolo di anticorpi neutralizzanti ? stato espresso come la pi? alta diluizione di siero che desse una riduzione del 50% nel numero di placche (PRNT50).
Risultati
Esempio 1 ? Secrezione dei costrutti DIII
Per indurre una risposta anticorpale in seguito ad immunizzazione genetica ? necessario che l?antigene sia efficientemente espresso e secreto dalle cellule di mammifero dell?ospite, per un?efficace stimolazione delle cellule B.
Abbiamo pertanto realizzato diversi costrutti genetici con le sequenze di E-DIII dai quattro sierotipi di dengue (dall?aminoacido 298 al 416, o dal 296 al 414 per il sierotipo 3, della proteina dell?involucro virale). Ogni E-DIII ? stato anche dotato, al suo N-terminale, di una sequenza codificante un peptide guida di secrezione, per permettere la traslocazione nel
?
reticolo endoplasmatico e nella via di secrezione, e al C-terminale del dominio dimerizzante ?CH3 dalla catena pesante delle IgG (Figura 1a). Per facilitare la rilevazione, ? stato anche incluso un marcatore (tag) di 11 aminoacidi, SV5.
L?espressione degli E-DIII ricombinanti, con o senza il dominio dimerizzante ?CH3, ? stata inizialmente valutata per trasfezione in cellule HEK293. Come mostrato in Fig. 1b, in assenza del dominio ?CH3, i DIII dei quattro sierotipi non venivano secreti. Al contrario, una volta fusi con il dominio ?CH3, si ? ottenuta attiva secrezione in tutti i casi. Abbiamo pertanto adottato il formato DIII-CH3 come antigene di elezione da usare nelle immunizzazioni con DNA plasmidico.
Poich? era stata osservata un?importante eterogeneit? nei livelli di espressione tra i quattro sierotipi, le sequenze DIII dei sierotipi 2, 3 e 4 sono state ulteriormente sottoposte ad ottimizzazione dei codoni per massimizzarne l?efficienza di espressione in cellule di mammifero (Wang, P.G. et al., PLoSOne 4(12): e8325, 2009). Si sono in effetti osservate grandi differenze nell?efficienza di secrezione di DIII-CH3 tra le versioni ottimizzate e non ottimizzate di sequenza E-DIII: le versioni codon-ottimizzate hanno infatti mostrato livelli di espressione alti e comparabili per tutti i sierotipi (Figura 1c).
Esempio 2 ? Le immunizzazioni con pistole geniche (gene-gun) inducono una risposta anticorpale specifica per il DIII
Gruppi di 10 animali per ogni sierotipo sono stati immunizzati con somministrazione mediante pistole geniche dei costrutti plasmidici DIII-CH3, con un totale di tre inoculi ad intervalli di 15 giorni. La presenza di anticorpi anti-DIII nei sieri dei topi ? stata quindi valutata in ELISA, usando proteine ricombinanti DIII mono-biotinilate in vivo (fuse con il dominio ?CH4 umano, per valutare con precisione la risposta anti-DIII) secrete da cellule di mammifero, catturate su piastre ricoperte di streptavidina (illustrate schematicamente nella figura 2a). Come mostrato nella figura 2b, sono stati generati elevati titoli anticorpali per ogni sierotipo. I sieri sono stati saggiati in piastre che contenevano quantit? comparabili di proteina DIII ricombinante. Per tutti i quattro sierotipi i titoli anticorpali (espressi come la pi? alta diluizione in grado di dare un segnale almeno dieci volte pi? alto di quello del siero negativo) erano intorno a 1:4000 (Tabella 1). Nella stessa tabella si vede anche che i sieri dei topi immunizzati con plasmidi che esprimevano l?E-DIII senza il CH3 avevano titoli anticorpali molto pi? bassi.
?
Tabella 1. Titoli dei sieri dei topi immunizzati contro E-DIII (prima colonna) o E-DIII- ?CH3 (seconda colonna) di ciascun sierotipo, saggiati in ELISA sull?E-DIII-?CH4 corrispondente. Il titolo ? calcolato come la diluizione del siero alla quale l?OD450 risulta almeno dieci volte pi? alta di quella del siero pre-immune alla stessa diluizione.
I sieri sono stati successivamente analizzati in citofluorimetria su cloni trasfettanti stabili di Sp2/0 che esponevano i domini DIII espressi sulla membrana di superficie cellulare mediante ancoraggio a GPI (Figura 3a). Come atteso, questi anticorpi reagivano altrettanto bene con il DIII esposto sulla membrana ed erano in grado di cross-reagire con i domini DIII di altri sierotipi (Figura 3b), indicando che l?immunizzazione genetica ? in grado di indurre anticorpi cross-reattivi.
? ancora pi? importante che gli anticorpi generati erano in grado di riconoscere i diversi DIII anche quando espressi come parte dell?ectodominio ?E? completo (contenente anche i domini di E DI e DII, Figura 4a). Per tutti e quattro i sierotipi, la reattivit? nei confronti dell?ectodominio ?E? era comparabile a quella contro il solo DIII, come mostrato per il sierotipo 3 nella figura 4b. Questi risultati indicavano che la maggior parte della risposta anticorpale era diretta verso gli epitopi del DIII bene esposti nell?ectodominio dell?involucro completo. Inoltre si ? dimostrato che questi anticorpi sono prevalentemente diretti contro epitopi conformazionali, in quanto i sieri positivi in ELISA e FACS su proteine ricombinanti con il DIII o l?ectodominio ?E? nativi non erano reattivi in Western blotting su proteine denaturate.
Esempio 3 ? Gli anticorpi anti-DIII hanno attivit? neutralizzante del virus
L?attivit? neutralizzante dei sieri specifici per i singoli sierotipi ? stata valutata attraverso un saggio di neutralizzazione mediante riduzione di placche (PRNT) in cellule Vero per ciascun sierotipo virale. La figura 5a mostra un esempio rappresentativo di piastre con placche di virus dengue del sierotipo 2 (DENV-2), trattate con siero di topo pre-immune (al centro) o con siero di topo anti-2DIII (a destra).
?
? stata determinata l?attivit? neutralizzante dei sieri di ciascun gruppo di animali nei confronti del sierotipo omologo di dengue. Come esemplificato nella figura 5b per il sierotipo 2 e riassunto nella tabella 2 per tutti i sierotipi, in ogni gruppo tutti gli animali mostravano alti titoli neutralizzanti (calcolati come la diluizione in grado di produrre il 50% di riduzione), che risultavano pi? alti di 1:400 per i primi tre gruppi e di 1:200 per gli animali immunizzati contro il sierotipo 4. Anche se si rilevava qualche variabilit? dei titoli neutralizzanti tra i differenti sierotipi, risultavano comunque pi? alti di quanto fosse stato precedentemente descritto, cosa che indicava come tutti e quattro i costrutti siano stati efficienti nell?indurre una risposta neutralizzante contro il sierotipo omologo di dengue.
Titoli?PRNT?dei?sieri?di?topi?immunizzati? con?vaccini?monovalenti
Tabella 2. Titolazione in saggio di neutralizzazione mediante riduzione di placche (PRNT) dei sieri di topi immunizzati contro E-DIII- ?CH3 di ciascun sierotipo, saggiati sui corrispondenti sierotipi di virus dengue. Il titolo ? calcolato come la diluizione che produce una riduzione del 50% nel numero di placche rispetto al siero pre-immune alla stessa diluizione.
Esempio 4 ? Anticorpi neutralizzanti di una formulazione tetravalente
Una formulazione tetravalente contenente i quattro costrutti genetici sierotipo-specifici ? stata usata per vaccinare un gruppo di animali. La quantit? totale di DNA per cartuccia ? stata portata a 2 ?g. Dopo tre immunizzazioni, i sieri degli animali vaccinati sono stati saggiati in ELISA e PRNT.
Come per i costrutti individuali, il vaccino tetravalente ? stato in grado di indurre titoli anticorpali totali (misurati in ELISA, tabella 3) e attivit? neutralizzante (PRNT, tabella 4) contro tutti e quattro i sierotipi con titoli comparabili a quelli individuali e, cosa pi? importante, simili per i quattro sierotipi.
?
Titoli?ELISA?dei?sieri?di?topi?immunizzati?
con?vaccino?tetravalente
Tabella 3. Titoli dei sieri dei topi immunizzati con il vaccino tetravalente, saggiati in ELISA su
E-DIII-?CH4 di ciascun sierotipo. Il titolo ? calcolato come la diluizione che d? una OD45010
volte pi? alta del siero pre-immune alla stessa diluizione.
Titoli?PRNT?dei?sieri?di?topi?immunizzati? con?vaccino?tetravalente
Tabella 4. Titoli in saggio di neutralizzazione mediante riduzione di placche (PRNT) dei sieri
dei topi immunizzati con il vaccino tetravalente, saggiati su ciascun sierotipo di virus dengue.
Il titolo ? calcolato come la diluizione che produce una riduzione del 50% nel numero di
placche rispetto al siero pre-immune alla stessa diluizione.
La presente invenzione fornisce applicazione industriale per la fabbricazione di un vaccino
contro i virus Flaviviridae, in particolare il virus dengue. In quest?ultimo caso, il vaccino pu?
neutralizzare tutti e quattro i sierotipi con attivit? comparabile.
?
Claims (22)
- RIVENDICAZIONI 1. Un costrutto genetico comprendente una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante qualsiasi dominio della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina, o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detto dominio carbossiterminale permetta la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica ottenuta.
- 2. Il costrutto genetico secondo la rivendicazione 1, in cui detto dominio della proteina dell?involucro E ? uno qualsiasi dei domini DI, DII e DIII, preferibilmente DIII.
- 3. Il costrutto genetico secondo la rivendicazione 2, in cui detto dominio DIII ? scelto dal gruppo che consiste di:
- 4. Un costrutto genetico comprendente una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio DIII della proteina dell?involucro E di un virus appartenente al genere Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini, ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina o da altre proteine associate alla membrana o secretorie, a condizione che detto dominio carbossiterminale permetta la secrezione e preferibilmente la dimerizzazione della proteina chimerica ottenuta.
- 5. Il costrutto genetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto dominio carbossiterminale ? scelto dal gruppo che consiste dei dominidi qualsiasi sottoclasse immunoglobulinica.
- 6. Il costrutto genetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 che comprende ulteriormente una sequenza nucleotidica codificante per un marcatore.
- 7. Il costrutto genetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, che comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio III della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini carbossiterminali dalle regioni costanti di un?immunoglobulina.
- 8. Il costrutto genetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, che comprende una sequenza nucleotidica codificante un peptide guida di secrezione, una sequenza nucleotidica codificante il dominio III della proteina dell?involucro E del virus dengue ed una sequenza nucleotidica codificante uno o pi? domini ?CH3 da immunoglobulina G.
- 9. Il costrutto genetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, che comprende una sequenza polinucleotidica scelta dal gruppo che consiste di: SEQ ID N. 1, 2, 3 e 4.
- 10. Il costrutto genetico secondo la rivendicazione 9, in cui detta sequenza polinucleotidica non contiene un marcatore.
- 11. Un vettore di espressione comprendente il costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10.
- 12. Una cellula ospite comprendente il costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9 o il vettore di espressione della rivendicazione 11.
- 13. Una proteina codificata dal costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10.
- 14. La proteina secondo la rivendicazione 13 comprendente una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID N.5, 6, 7 e 8.
- 15. Una proteina codificata dal costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6.
- 16. Anticorpi generati contro la proteina di una qualsiasi delle rivendicazioni 13-14 o rivendicazione 15.
- 17. Il costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10 o la proteina di una qualsiasi delle rivendicazioni 13-14 o rivendicazione 15 o gli anticorpi della rivendicazione 16 per uso come un medicamento.
- 18. Il costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10 o la proteina della rivendicazione 13 o 14, o gli anticorpi della rivendicazione 16 quando dipendente da una qualsiasi delle rivendicazioni 13 o 14 per uso come un medicamento per la prevenzione di infezioni da dengue di qualsiasi dei quattro sierotipi.
- 19. Il costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 o la proteina della rivendicazione 15 o gli anticorpi della rivendicazione 16 quando dipendente dalla rivendicazione 15 per uso come un medicamento per la prevenzione di infezioni da un virus appartenente al genere dei Flavivirus.
- 20. Un vaccino contro qualsiasi dei quattro sierotipi di virus dengue che comprende almeno un costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10 o almeno una proteina delle rivendicazioni 13-14, a condizione che detto costrutto genetico o ? proteina induca anticorpi cross-neutralizzanti, e vettori, eccipienti e facoltativamente adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
- 21. Il vaccino secondo la rivendicazione 20 che comprende almeno un costrutto comprendente la sequenza polinucleotidica scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID
- 22. Un vaccino contro un virus appartenente al genere Flavivirus, a condizione che la proteina dell?involucro di detto virus sia suddivisa in tre sottodomini, che comprende almeno un costrutto genetico di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 o almeno una proteina della rivendicazione 15, a condizione che detto costrutto genetico o proteina induca anticorpi cross-neutralizzanti, e vettori, eccipienti e facoltativamente adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
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| IT000458A ITRM20130458A1 (it) | 2013-08-05 | 2013-08-05 | Vaccino genetico anti-dengue virus basato sugli ectodomini della proteina envelope |
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Patent Citations (1)
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Also Published As
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