CN101287490A - 对抗登革热病毒感染的疫苗接种 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对抗登革热病毒感染疫苗接种中使用的方法和试剂盒。

Description

对抗登革热病毒感染的疫苗接种

发明背景

本发明涉及对抗登革热病毒感染的疫苗接种。

登革热，一种由4种截然不同的登革热病毒(命名为血清型1-4)引起的疾病，为人类最重要的媒介传播疾病。在世界热带和亚热带地区每年大约1亿人感染登革热病毒(Halstead，″Epidemiology of Dengueand Dengue Hemorrhagic Fever(登革热和登革出血热流行病学)，″CABIPubl.，New York，pp.23-44，1997；Gubler，″Dengue and DengueHemorrhagic Fever(登革热和登革出血热)，″CABI Publ.，New York，pp.1-22，1997)。一种登革热病毒感染导致的严重的和潜在致死形式的疾病，登革热出血热(DHF)，其地理分布和发病率在增加。这些事实已促使全力以赴构建安全和有效的登革热疫苗，但是，尽管作了许多努力，跨越了超过50年，未开发出对抗登革热的市售疫苗。因此世界卫生组织认为对抗登革热疫苗的开发是高优先级的(Chambers等，Vaccine(疫苗)15：1494-1502，1997)。

DHF的发病机理推动着登革热疫苗的设计。DHF是一种免疫病理学疾病，主要发生于如下个体：先经受一种登革热血清型感染，然后暴露于第二种不同的(异源的)血清型。感染登革热4种血清型之一，提供基于中和抗体的对异源血清型的持久免疫力。然而，如果曾经发生的话，感染一种登革热血清型后对其它异源登革热血清型的免疫是短期的(Sabin，Am.J.Trop.Med.Hyg.1：30-50，1952)。一般地，几周或几月后，只有与异源血清型结合但不中和的抗体存在。这些结合但未中和的抗体可增强随后异源登革热病毒血清型的感染，增加严重疾病的风险(Rothman等，Virology 257：1-6，1999)。

对于DHF的免疫发病机制，成功的对抗登革热疫苗必须是安全的，并诱导同时对抗所有4种登革热病毒血清型的长效、交叉中和抗体反应，使其滴度不低至不能保护受试者对抗进一步的感染的水平。从历史观点上说，开发减毒活疫苗候选物的经验努力说明难以在候选疫苗病毒足够的减毒作用(安全性)和免疫原性之间达到平衡。也难以将代表所有4种血清型的疫苗菌株组合成有效的4价混合物，需要多次给药计划来达到对抗所有血清型的血清转化，由于免疫接种计划中各次免疫接种之间存在时间间隔，期间可能会使受试者对免疫病理事件过敏，从而导致不良后果。实际上，试图通过单价的、活登革热疫苗混合物来免疫，显示出在4种病毒株之间显著的相互作用，导致病毒性干扰作用(综述于Saluzzo，Adv.Virus Res.61：420-444，2003)。

已开发出基于遗传工程嵌合黄病毒的对抗登革热病毒疫苗，其中登革热血清型1、2、3或4的两个序列(即编码前膜(prM)和包膜(E)蛋白的序列)插入黄热病17D病毒的全长感染性克隆，替代编码相应黄热病毒蛋白的序列(见，例如，Guirakhoo等，J.Virol.75：7290-7304，2001；Guirakhoo等，Virology 298：146-159，2002)。这些病毒注射入猴体内诱导免疫反应时是高度有效的。然而，初步数据也显示一些人类中的病毒干扰作用，该作用能限制一剂登革热疫苗给药后对抗所有4种血清型的免疫接种。

本发明者发现一种新的、安全的对抗登革热病的免疫接种方法，该方法使得能够诱导对抗登革热血清型1-4的长效的、交叉中和抗体反应，同时避免多剂量登革热疫苗接种计划和初次未平衡的免疫反应相关的潜在风险。本发明的方法使用一种免疫方式，该方式包含在给予第一种黄热疫苗后给予基于嵌合黄病毒的登革热疫苗，使得能够诱导对抗登革热病毒的交叉中和免疫反应，该方式显示出给予登革热疫苗后早期出现(30天内)、长效、对抗四种血清型交叉反应的优点。此外，本发明方法显示出诱导对抗黄热病的保护性免疫反应的另一个优点。

Price等(Am.J.Epid.88：392-397，1968)先前描述了连续的黄病毒免疫接种的方法，该方法包含系列的3次免疫接种(用登革热2型和两种异源病毒(黄热病和日本脑炎))。此外，与本发明不同，接种顺序为先黄热病后登革热2型，无另外的JE免疫接种，不产生交叉保护性免疫力。

Scott等(J.Infect.Dis.148：1055-1060，1983)展示了先用黄热病免疫、随后接种减毒活登革热2型疫苗的受试者对登革热2型有增强的免疫反应，该免疫反应比无先前黄热病免疫力的受试者更持久(持续3年)。增强的反应可能是由于先前的黄热病疫苗接种增强了对登革热2型的(结合，非中和)抗体的产生(Eckels等，J.Immunol.135(6)：4201-4203，1985)。然而，Scott等未展示黄热病疫苗接种后登革热2型疫苗产生对其它3种登革热血清型(1、3或4型)的长效免疫反应。与本发明不同，通过中和试验(唯一指示保护性免疫性的试验)，黄热病后登革热2型未显示产生广泛反应。

近来的论文中，Kanesa-thasan等(Am.J.Trop.Med.Hyg.69(Suppl6)：32-38，2003)发现在很早以前接种过黄热病后接种减毒登革热疫苗的受试者内有增强的异源反应和抗-登革热抗体滴度。这些短期(至30天)抗体反应以包括中和的抗体测定法说明，但作者推断对抗随后登革热感染的保护的证据是不确定的。与本发明不同，作者未能确定地说明之前敏化或接受YF疫苗接种、长期广泛的中和抗体反应，或提供对登革热的交叉反应T细胞反应的证据。

本发明者首次说明了在人体对抗多种登革热血清型的交叉中和免疫性的诱导可实际上由连续给予黄热病和登革热嵌合病毒来产生。

发明概述

本发明提供包含在受试者体内诱导对登革热病毒的长效、交叉中和免疫反应的方法，包含给予受试者：

(i)一剂黄热病毒疫苗，和

(ii)一剂嵌合黄病毒疫苗，该疫苗包含至少一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒包膜蛋白的序列由编码登革热病毒包膜蛋白的序列替代，其中在给予黄热病疫苗后至少30天至10年内给予嵌合黄病毒疫苗。在一个实施例中，登革热包膜序列为改组序列。

一个实施方案中，嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热病毒膜和包膜蛋白的序列替代。在一个实施例中，每个或所有这些登革热序列为改组序列。

具体实施方案中，嵌合黄病毒疫苗在给予黄热病疫苗后30、60或90天后给予受试者。

具体实施方案中，本发明登革热疫苗中使用的嵌合黄病毒由黄热病17D(YF17D)病毒骨架组成。

另一个实施方案中，本发明方法中使用的黄热病毒疫苗包含YF17D株。

另一个实施方案中，本发明方法中使用的嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

另一个实施方案中，本发明方法中使用的嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型2病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

另一个实施方案中，本发明方法中使用的嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型3病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

另一个实施方案中，本发明方法中使用的嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型4病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

一个具体实施方案中，本发明方法中使用的嵌合黄病毒疫苗为单价疫苗或4价疫苗。

另一个实施方案中，本发明方法进一步包含在首剂嵌合黄病毒疫苗后6个月至10年给予加强剂量的上述定义的嵌合黄病毒疫苗。

另一方面，本发明涉及包含如下的试剂盒：

(i)黄热病毒疫苗，和

(ii)嵌合黄病毒疫苗，该疫苗包含至少一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒包膜蛋白的序列由编码登革热病毒包膜蛋白的序列替代。在一个实施例中，登革热包膜序列为改组序列。

一个实施方案中，嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热病毒膜和包膜蛋白的序列替代。在一个实施例中，每个或所有这些登革热序列为改组序列。

本发明试剂盒的一个实施方案中，黄热病毒疫苗包含YF17D株，其中YF17D包含许多用于对抗黄热病的疫苗接种的亚株(包含17D-204、17D-213和17DD)。

另一个实施方案中，嵌合黄病毒由YF17D病毒骨架组成。

本发明试剂盒的另一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含YF17D病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

本发明试剂盒的另一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄YF17D病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型2病毒膜和包膜蛋白序列替代。

本发明试剂盒的另一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄YF17D病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型3病毒膜和包膜蛋白序列替代。

本发明试剂盒的另一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含YF17D病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型4病毒膜和包膜蛋白序列替代。

另一个实施方案中，上述定义的试剂盒进一步包含至少一种加强剂量的上述定义的嵌合黄病毒疫苗。

另一个实施方案中，本发明涉及以上说明的和本发明其它地方的病毒的用途和登革热病毒感染的治疗，以及这些病毒在制备这种目的的药品中的用途。

定义

″交叉中和免疫反应″指包含对抗多个(至多4)不同登革热血清型中和抗体的特殊免疫反应。通过参考空斑减少中和试验(PRNT₅₀)可容易地测定交叉中和免疫反应的诱导。例如，交叉中和免疫反应的诱导可由实施例1所述的PRNT₅₀测定法之一检测。在至少一种这些测定法中检测到的中和抗体滴度至少高于或等于1∶10时，血清样品被认为是是阳性的，表示存在交叉中和抗体。

″长效免疫反应″指如上定义的阳性交叉中和免疫反应，该反应能在人血清中至少6个月被检测到，优选地，至少给予如下定义的嵌合黄病毒疫苗12个月后能被检测到。

″患者″指包括成人和儿童的黄热病幼稚型(naive)个体。

″黄热病幼稚型″个体指超过10年无对抗黄热病疫苗接种记录和/或超过10年无确认的黄热病毒感染的个体。

″黄热病免疫个体″指在本发明框架内，有对抗黄热病疫苗接种记录和/或10年前或更短(如5年或更短，如4、3、2或1年前，或甚至6、5、4、3或2个月前，和任何超过30天前)发生确认的黄热病毒感染的个体。

″嵌合黄病毒″指嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒包膜蛋白的序列由编码登革热病毒包膜蛋白的序列替代。优选地，嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热病毒膜和包膜蛋白的序列替代。黄热病骨架可优选地来自疫苗株，例如YF17D或YF17DD。这些嵌合黄病毒如下更详细地定义，命名为YF/登革热-N，用N区别登革热血清型。

″嵌合黄病毒疫苗″指包含免疫有效量的至少一种上述定义的嵌合黄病毒和药学可接受辅料的免疫原性组合物。

当疫苗包含一种登革热血清型的一种嵌合黄病毒表达蛋白时，嵌合黄病毒疫苗称为″单价″。单价疫苗的实例为包含YF/登革热-1、YF/登革热-2、YF/登革热-3或YF/登革热-4，优选YF/登革热-2的疫苗。

当疫苗包含两种不同登革热血清型嵌合黄病毒表达蛋白时，嵌合黄病毒疫苗称为″两价″。两价疫苗的实例为包含YF/登革热-2和YF/登革热-4，或YF/登革热-2和YF/登革热-3，或YF/登革热-2和YF/登革热-1的疫苗。

当疫苗包含三种不同登革热血清型嵌合黄病毒表达蛋白时，嵌合黄病毒疫苗称为″三价″。三价疫苗的实例为包含YF/登革热-2、YF/登革热-1和YF/登革热-4，或YF/登革热-2、YF/登革热-3和YF/登革热-4的疫苗。

当疫苗包含四种不同登革热血清型嵌合黄病毒表达蛋白时，嵌合黄病毒疫苗称为″四价″。四价疫苗实例为包含YF/登革热-1、YF/登革热-2、YF/登革热-3和YF/登革热-4的疫苗。

″免疫有效量嵌合黄病毒″指在黄热病免疫个体给药后，能诱导如上所定义的交叉中和免疫反应的嵌合黄病毒的量。一般地，嵌合黄病毒免疫有效量包含每血清型、每剂量的感染单位(例如，空斑形成单位或组织培养感染剂量)在10²至10⁷之间的量，例如在10³和10⁶之间，例如10⁴、10⁵或10⁶。

本发明方法的中心优点为能快速和同时诱导对抗四种登革热血清型的中和抗体，从而保护受试者不受登革热侵害，由此避免随后自然暴露于登革热感染后发生登革热出血热的潜在相关风险。直接对抗登革热包膜蛋白的中和抗体被认为是对抗感染的保护性免疫力的主要介导物，因此中和抗体的存在被认为是患者中和免疫力的重要标志(surrogate)。

本发明其它特点和优点在下列发明详述、权利要求和图表中是显而易见的。

附图简述

图1为显示应答疫苗的IFNγ的图片(研究的第31天减去第1天)。两次剂量的ChimeriVax^TM-Den2产生等价的T细胞反应。反应在先前接种黄热病毒疫苗的受试者体内未被抑制。

发明详述

本发明提供使用简单的、两步法在患者体内诱导对四种登革热血清型(1-4)的长效、交叉中和免疫力的方法。目标人群因此特别包含下列有登革热感染风险患者：外国旅行者、流亡者和军事人员，以及登革热流行地区的居民。在此方法中，患者先用一剂(优选一剂，但可能超过一剂(例如，2或3剂))的黄热病毒疫苗(例如，市售的减毒活疫苗；见下文)免疫。在至少30天的合适时间间隔后(该间隔特别产生由黄热病毒疫苗诱导的固有免疫反应静止期)，进行方法的第二步，包括给予一剂嵌合黄病毒疫苗，该疫苗包含一种或多种减毒活嵌合病毒，每种包含黄热病毒骨架，其中一种或多种编码结构蛋白(例如，前膜和包膜蛋白)的序列由编码相应登革热病毒(例如，登革热1、2、3或4)蛋白的序列替代。本发明者展示了这种免疫反应程序产生对抗所有四种登革热血清型的高中和抗体滴度。这些抗体在给予登革热疫苗后保持在高水平超过6个月，甚至超过12个月，显示广泛的登革热免疫力为长效的。由于初次免疫/敏化剂(黄热病疫苗)不能使受试者对DHF敏感，因此如果第二次注射被延迟或未进行，第一次即敏化接种不会使对象易受这种疾病攻击，所以不存在危险。这些结果是意想不到的，因为即使连续感染两种登革热病毒血清型(相互之间在基因序列和抗原性关系上比黄热病与登革热更近缘相关)，不诱导对抗另外两种登革热血清型感染的可靠保护或广泛交叉中和抗体反应。通过在第二步(接种嵌合登革热病毒)后检查黄热病抗体反应，进一步说明了本发明连续疫苗接种方法意想不到的特性。本发明方法进一步描述如下。

黄热病毒疫苗

如上述说明的，发明方法的第一步包含给予受试者一剂黄热病毒疫苗。这种可用于发明的疫苗实例包含减毒活疫苗，例如那些衍生自YF 17D株的，其最初从野生型Asibi株减毒获得(Smithburn等，″YellowFever Vaccination(黄热病疫苗接种)，″World Health Organization(世界卫士组织)，p.238，1956；Freestone，in Plotkin等(eds.)，Vaccines，2^ndedition(疫苗，第二版)，W.B.Saunders，Philadelphia，U.S.A.，1995)。衍生后可用于本发明的YF17D株的实例为YF17D-204(YF-

Sanofi-Pasteur，Swiftwater，PA，USA；

Sanofi-Pasteur，Marcy-L′Etoile，France；ARILVAX^TM，Chiron，Speke，Liverpool，UK；Berna Biotech，Bern，Switzerland；YF17D-204France(X15067，X15062)；YF17D-204，234US(Rice等，Science229：726-733，1985))，而其它可使用的这种株的实例与YF17DD株(GenBank登记号U17066)、YF17D-213(GenBank登记号U17067)和黄热病毒17DD株(Galler等，Vaccines(疫苗)16(9/10)：1024-1028，1998)紧密相关。除这些株之外，任何其它发现的人类(例如人类患者)可接受的减毒黄热病毒疫苗株，可用于本发明。

本发明使用的黄热病毒疫苗可市售获得(见以上)或可使用本领域技术人员已知方法制备。在这种方法的一个实施例中，鸡胚以固定传代水平的病毒接种，然后冷冻干燥从离心的匀浆上清液分离的病毒。在另一个方法中，黄热病株生长于培养的鸡胚成纤维细胞(见，例如，Freire等，Vaccine 23(19)：2501-2512，2005)或其它生产病毒疫苗的培养细胞如Vero细胞中。黄热病毒疫苗一般在使用前以冻干形式储存。当需要给予时，疫苗在含水溶液例如0.4％氯化钠溶液中重建(一般地，约0.5mL)，然后在如三角肌皮下注射给予。其它由本领域技术人员决定是合适的给予模式(例如，肌肉或皮内注射，或使用传输病毒至皮肤表皮层的方法经皮给予)也可使用。疫苗可以例如每剂量2-5(例如，3或4)log₁₀空斑形成单位(PFU)的剂量范围给予。所有市售的疫苗按生产商建议使用。在一个实施方案中，本发明方法的第一步包含给予一剂Stamaril^TM或一剂YF-

本发明方法也可调整后用于黄热病免疫受试者。在这种病例中，方法只包括第二步，包含给予一剂如下定义的嵌合黄病毒疫苗。所述方法也包含在本发明范围内。

嵌合黄病毒疫苗

本发明免疫方法的第二步包含给予一剂如上述定义的嵌合黄病毒疫苗。为了清晰的缘故，在如下描述中，本发明只限定在相关于嵌合黄病毒的用途，其中嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热病毒膜和包膜蛋白的序列替代。发明也包含其它嵌合体的用途，例如其中只有一种黄热病疫苗株的蛋白(例如，包膜蛋白)被替代的嵌合体，或其中所有三种结构蛋白被替代的嵌合体。

可用于本发明的嵌合病毒包含那些如上所描述的基于人类黄热病疫苗株YF17D(例如YF17D-204、YF17D-213或YF 17DD)的嵌合病毒。在这些病毒中，黄热病毒的前膜和包膜蛋白被登革热病毒(血清型1、2、3或4)的前膜和包膜蛋白替代。在本发明一个实施方案中，嵌合病毒包含YF17D-204骨架，其中编码黄热病毒前膜和包膜蛋白的序列由编码野生型登革热血清型1、2、3和/或4前膜和包膜蛋白的序列替代，例如，由编码登革热1病毒PUO-359、登革热2病毒PUO-218、登革热3病毒PaH-881/88或登革热4病毒1228前膜和包膜蛋白的序列。提供了这些的构建详图和相关的嵌合病毒构造，例如，在如下出版物：WO 98/37911；WO 01/39802；Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999；WO 03/103571；WO 2004/045529；美国专利号6,696,281；美国专利号6,184,024；美国专利号6,676,936；美国专利号6,497,884；Guirakhoo等，J.Virology 75：7290-7304，2001；Guirakhoo等，Virology298：146-159，2002；和Caufour等，Virus Res.79(1-2)：1-14，2001。作为可用于本发明的一个嵌合黄病毒的具体实例，我们记录了下列嵌合黄病毒，根据布达佩斯条约该病毒存放于美国弗吉利亚州Manassas的美国标准培养物保藏中心(ATCC)，存放日期为1998年1月6日：嵌合黄热病17D/登革热2型病毒(YF/DEN-2；ATCC检索号ATCC VR-2593)。

用于本发明方法的嵌合黄病毒可任选地包含登革热病毒序列减弱的突变。例如，登革热序列可包含包膜氨基酸204(登革热血清型1、2和4)或202(登革热血清型3)的缺失或替代，在野生型病毒为赖氨酸。在这种替代的一个实施例中，这个位点的赖氨酸由精氨酸替代。在其它实施例中，一种或多种其它氨基酸在氨基酸200-208(或这些氨基酸的组合)区间是变异的，具体实例包含如下：登革热-1的202(K)位点；登革热-2的202(E)位点；登革热-3的200(K)位点；和登革热-4的200(K)、202(K)和203(K)位点。这些残基可被例如精氨酸替代。这些变异详细描述于WO 03/103571，其内容通过引用结合于本文。

除上述的嵌合体之外，其它包含结构蛋白(包含来自不止一种(2、3或4)登革热病毒血清型的抗原决定簇)的嵌合体可用于本发明。在一个实施例中，嵌合体可使用改组(shuffling)技术制备，该技术包含断裂、再结合和选择已改组序列的循环(见，如Locher等，DNA CellBiol.24(4)：256-263，2005)。这样，在这种情况下，编码所需亚型登革热血清型(或所有登革热血清型)包膜和/或前膜蛋白的序列可以这种方法产生改组的包膜和/或前膜序列，然后用于替代本文所描述的相应黄热病毒骨架序列(例如，YF17D)。这种嵌合YF/Denl-4改组体(shu用ant)(假设改组序列包含所有四种血清型的抗原决定簇)可通过例如，用嵌合RNA转录物转染Vero细胞株，并从前述(Guirakhoo等，J。Virol。75(16)：7290-7304，2001)和本文任何地方提及的上清液回收活病毒而生产。这些改组嵌合体可用于本发明疫苗接种方法，该方法包含黄热病(例如，YF17D)疫苗接种后给予改组嵌合体，或用于本文其它任何地方描述的组合方法。

上述嵌合病毒可使用本领域标准方法制备。例如，病毒基因相关RNA分子可导入原代细胞、鸡胚，或二倍体细胞系，从中(或其上清液)可纯化子代病毒。其它可用来生产该病毒的方法使用异倍体细胞，例如Vero细胞(Yasumura等，Nihon Rinsho 21：1201-1215，1963)。在这种方法的一个实施例中，病毒基因组对应的核酸分子(例如，RNA分子)导入异倍体细胞，从培养细胞的培养基中收获病毒，用核酸酶处理获得的病毒(例如，降解DNA和RNA两者的内切核酸酶，例如Benzonase^TM；美国专利号5,173,418)，浓缩核酸酶处理过的病毒(例如，通过使用具有分子量截值(如500kDa)的过滤器超滤)，制备浓缩后的病毒用于疫苗接种目的。这种方法的细节提供于WO 03/060088A2，其通过引用结合于本文。另外，生产嵌合病毒的方法描述于上述引用的文件中，为构建嵌合病毒构造的参考。

本发明方法中使用的嵌合病毒的制备可使用本领域标准方法实现。多种用于疫苗制备的药学可接受溶液是已知的，且容易由本领域技术人员调整后用于本发明(见，例如，Remington′s PharmaceuticalSciences(18^th edition)，ed.A.Gennaro，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。在两个具体的实施例中，病毒在含7.5％乳糖和2.5％人血清白蛋白的伊格尔(氏)盐最低必需培养基(MEME)或含10％山梨醇的MEME中制备。然而，嵌合黄病毒可简单地在生理学可接受溶液例如无菌盐或无菌缓冲盐中稀释。在另一个实施例中，病毒可给予和制备，例如，以黄热病17D疫苗相同的方式，例如，以感染的鸡胚组织的澄清悬液或从感染嵌合病毒的细胞培养物获得的液体。

本发明嵌合黄病毒疫苗通常地以冰冻液体组合物形式或冻干产品形式储存。为此目的，嵌合黄病毒可以通常用缓冲水溶液(包含冷冻保护化合物如糖醇和稳定剂)的稀释剂混合。使用前，冻干产品与药学可接受稀释剂或赋形剂(例如4％NaCl无菌溶液)混合以重建液体可注射嵌合黄病毒疫苗。

本发明方法中，嵌合黄病毒疫苗可为单价、两价、三价或四价疫苗。

在一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗为单价疫苗，其中嵌合病毒包含YF17D-204骨架，其中编码黄热病毒前膜和包膜蛋白的序列由编码登革热2病毒PUO-218前膜和包膜蛋白的序列替代。

另一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗为四价疫苗，即疫苗包含四种登革热(1-4)病毒血清型嵌合病毒表达抗原。在一个具体实施方案中，这种四价疫苗优选包含四种嵌合黄病毒，相应由YF17D-204骨架组成，其中编码黄热病毒前膜和包膜蛋白序列由编码登革热1病毒PUO-359(YF/登革热1)、登革热2病毒PUO-218(YF/登革热2)、登革热3病毒PaH-881/88(YF/登革热3)或登革热4病毒1228(YF/登革热4)前膜和包膜蛋白序列替代。这种具体的四价疫苗在如下实施例2中命名为ChimeriVax^TM-DEN四价。

适合用于本发明方法的四价嵌合黄病毒疫苗的实例也详细描述于WO 03/101397，其内容通过引用结合于本文。多价疫苗可通过组合单个单价登革热疫苗获得。

本发明嵌合病毒可使用本领域已知的方法给予。例如，病毒可制备为每血清型在剂量容积为0.1至1.0mL中含有10²至10⁷(例如，含有10³至10⁶，例如10⁴、10⁵或10⁶)感染单位(例如，空斑形成单位或组织培养感染剂量)的无菌水溶液，通过例如皮下、肌内或皮内途径给予。在一个实施方案中，嵌合黄病毒疫苗为优选地每血清型每剂量包含10⁵pfu的单价、两价、三价或四价疫苗，并皮下给予。另外，因为黄病毒可通过粘膜途径感染人类宿主，例如口腔途径(Gresikova等，″Tick-borne Encephalitis(蜱媒脑炎)，″In The Arboviruses，Ecology andEpidemiology，Monath(ed.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1988，Volume IV，177-203)，通过粘膜(例如，口腔)途径给予也是预期的。

任选地，本领域技术人员已知的辅料可用于本发明使用病毒的给予中。用来增加嵌合黄病毒免疫原性的辅料包含，例如toll样受体(TLRs)的激动剂和拮抗剂。

免疫接种方法

如上说明，发明通常包括给予黄热病疫苗株(例如，YF17D株，如上说明)，随后给予一种或多种嵌合黄病毒，其中每个的黄热病毒前膜和包膜蛋白被登革热病毒(血清型1、2、3或4)相应的蛋白替代。黄热病毒疫苗使用标准方法给予(例如，通过皮下、肌内或皮内注射，或通过使用传输病毒至表面皮肤的装置经皮给予)，剂量范围在例如每剂量2-5(例如，3或4)log₁₀空斑形成单位(PFU)，剂量容量一般地为皮下注射约0.5mL，皮内注射0.1mL，或经皮给药0.002-0.02mL。

为提供充足的时间给黄热病疫苗诱导的固有免疫反应静止期，在至少30天和10年之间，特别在30天和5年之间，例如在30天和1-3年之间，优选地，在给予黄热病疫苗后30、60或90天，使用标准方法和剂量范围从每血清型每剂量10²至10⁷，例如，从10³至10⁶，例如10⁴、10⁵或10⁶感染单位(以pfu或组织培养感染剂量表示)给予嵌合黄病毒疫苗。另外，在给予二、三或四价制剂(见如下)的病例中，通常，这种疫苗中的每个嵌合体的量是相同的，尽管使用不同量的每个嵌合体也包含在本发明中。

本发明方法可因此包含，例如，在第0天给予黄热病毒疫苗和在第30天(或在更迟的时间，如上述说明的)给予YF/登革热-1、YF/登革热-2、YF/登革热-3和/或YF/登革热-4嵌合体。嵌合体可以单价疫苗(即，只包含一种如下嵌合病毒的疫苗：YF/登革热-1、YF/登革热-2、YF/登革热-3或YF/登革热-4)、两价制剂(例如，包含两种上述列出的嵌合体的疫苗，例如，优选地包含YF/登革热-2和YF/登革热-4，或YF/登革热-2和YF/登革热-3，或YF/登革热-2和YF/登革热-1)、三价疫苗(例如，包含三种上述列出的嵌合体的疫苗，包含YF/登革热-2、YF/登革热-1和YF/登革热-4，或YF/登革热-2、YF/登革热-3和YF/登革热-4的疫苗)或四价疫苗给予。

本发明方法在仅一剂嵌合黄病毒疫苗后导致四种登革热血清型的血清转化(即，诱导中和免疫反应)。尽管嵌合黄病毒疫苗的增加剂量不是达到所需血清转化和长效、交叉中和免疫反应必需的，给予加强剂量嵌合黄病毒疫苗是本发明预期的。本发明嵌合疫苗的加强剂量可能是维持长时间的交叉中和免疫反应所必需的，可在首剂登革热嵌合疫苗后的6个月和5-10年之间给予，例如，在首剂登革热嵌合疫苗后6个月、1年、2年、3年、4年或5年，或甚至10年。加强的嵌合黄病毒疫苗可不同于或优选地相同于首次给予的嵌合黄病毒疫苗。以上本发明方法中所给予的嵌合黄病毒疫苗的相关描述对嵌合黄病毒疫苗激发剂已作必要的修正。激发剂因此可为单价、两价、三价或四价疫苗，相对于疫苗中的登革热血清型。这样，本发明方法的实施例可包含给予一剂黄热病疫苗，随后是一剂单价嵌合黄病毒疫苗(登革热1、2、3或4，优选地，登革热2)，随后给予(i)与初次给予的嵌合体(优选地为血清型4)相同或不同血清型的单价嵌合黄病毒疫苗，(ii)两价嵌合黄病毒疫苗，该疫苗可包含或不包含与初次嵌合体相同的血清型(例如，优选地登革热1和2后登革热3和4)，(iii)三价嵌合黄病毒疫苗，该疫苗可包含或不包含与初次嵌合体相同的血清型，或(iv)四价嵌合黄病毒疫苗。考虑其抗原组成，激发剂嵌合黄病毒疫苗优选地相同于首次嵌合黄病毒疫苗。

本发明因此也涉及在受试者诱导对登革热病毒长效的，交叉中和免疫反应的组合物，包含连续给予(i)黄热病毒疫苗和(ii)嵌合黄病毒疫苗，其中嵌合黄热病疫苗在给予黄热病毒疫苗后至少30天和至多10年内给予。

本发明也包含试剂盒，该试剂盒包含黄热病毒疫苗和/或一种或多种嵌合黄病毒疫苗，如本文所描述。本发明试剂盒也可包含本文描述的疫苗接种方法中使用试剂盒的说明书。这些说明书包含，例如，关于疫苗给予剂量的说明和/或关于疫苗给予时间的信息。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用结合于本文，如单个出版物或专利申请均特别地和单独地指明通过引用结合一样。

本发明部分地基于如下实施例中描述的实验结果。

实施例

在如下说明的实施例中，所描述实验和临床研究显示了预先对黄热病毒的免疫力对后来用嵌合YF/登革热-2疫苗(实施例1)或四价疫苗(YF/登革热-1、YF/登革热-2、YF/登革热-3和YF/登革热-4)(实施例2)接种的影响。这些研究包括对中和抗体、血清转化、病毒血症和T细胞反应的分析。

实施例1：ChimeriVax ^TM -Den2

市售YF17D疫苗(YF-

)购自Aventis-Pasteur，Swiftwater，PA。ChirneriVax^TM-DEN2为活的、减毒的基因工程病毒，其中编码YF17D疫苗病毒两种结构蛋白(prM和E)的序列被DEN2病毒(PUO-218株，分离自泰国曼谷的一例典型登革热病例)的相应序列替代。使用循环克隆的脱氧核糖核酸(cDNA)完成嵌合病毒基因组的基因构建。全长cDNA转录为核糖核酸(RNA)，RNA用于转染细胞培养物，该培养物生产活病毒(Guirakhoo等，J.Virol.75：7290-7304，2001)。

疫苗病毒在现行药品生产质量管理规范(cGMP)下生产。根据食品和药品管理局(FDA)哺乳细胞培养物衍生产品指南，病毒生长于来自细胞银行的Vero(非洲绿猴)细胞中，该细胞经外源因子测试证明无污染。从含有疫苗病毒的Vero细胞培养物中获得上清液，通过过滤掉细胞碎片而澄清，以核酸酶(

)处理消化从宿主细胞得到的核酸分子。核酸酶处理过的大体积量(bulk)病毒然后通过超滤浓缩，以渗滤法纯化。与人血清白蛋白(HSA)USP(2.5％)和乳糖USP(7.5％)一起制备疫苗。疫苗通过体外和体内试验证明无菌、无支原体、无逆转录病毒[通过产物增强逆转录酶(PERT)]、无外来病毒。最终疫苗小瓶检测无菌、效价、鉴别、pH、性状、渗透压、HAS、乳糖、内毒素、安全性(小鼠和豚鼠中改进的一般安全性)，和小鼠神经毒性。

猴的临床前研究显示在以剂量范围2-5log₁₀PFU接种后，ChimeriVax^TM-DEN2为高度免疫原性和较好地耐受的(Guirakhoo等，J.Virol.74(12)：5477-5485，2000)。猴疫苗接种后第一周内发生了低度病毒血症，与黄热病17D疫苗诱导的相似。单次皮下注射2log₁₀PFU疫苗(最小试验剂量)15-30天后诱导了中和抗体，该抗体保护受试者免受野生型DEN2病毒的攻击。

单价ChimeriVax ^TM -DEN2疫苗临床研究

进行了随机、双盲、单中心门诊病人研究。筛选后，符合条件的黄热病(YF)幼稚型受试者随机以低或高剂量ChimeriVax^TM-DEN2(3.0或5.0log₁₀空斑形成单位)或YF-

单次疫苗接种。也有一开放组，其中在YF-免疫型受试者中评价对高剂量ChimeriVax^TM-DEN2疫苗接种的抗体反应。在第1-11、21和31天跟踪受试者的抗体反应和安全性评估，在疫苗接种后6和12个月评估抗体反应持久性。

筛选后，42名符合条件的YF幼稚型受试者随机均分成3个组(高或低剂量ChimeriVax^TM-DEN2或YF-

)。在第1、14天，受试者接受单次皮下(SC)ChimeriVax^TM-DEN2(高或低剂量)或YF-

疫苗接种。另外14名对YF免疫的受试者(给予登革热嵌合疫苗前，从前次YF疫苗接种完成后6个月至5年的时间段内)接受高剂量的ChimeriVax^TM-DEN2。受试者在第2-11、21和31天返回门诊。在1-31天的特定时间点进行安全性评估。在第1天(疫苗接种前)和31天测量对同源疫苗株和野生型DEN2株的抗体反应、对YF17D和DEN 1-4原型株的中和抗体。研究在治疗阶段完成后揭盲，受试者在疫苗接种后6和12个月评估抗体反应的持久性。

测定了对代表四种登革热血清型的不同株的中和抗体产生水平≥1∶10的受试者比例。分析了在接受高剂量ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型和YF幼稚型组中预先YF免疫对DEN2血清转化率的影响。在疫苗接种后直至12个月的多个时间间隔内，测量每个治疗组中和对所有四种登革热血清型的几何平均中和抗体滴度。

病毒血症

循环于血液中的病毒(病毒血症)是测量研究中使用的不同减毒活疫苗复制的量度标准。病毒血症通过Vero细胞的空斑测定法来测定。在疫苗接种后11天内发生病毒血症的受试者数量(截至检查当天)于表1中显示。在一个或多个研究日中，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF幼稚型受试者发生病毒血症的数量多于接种YF-

的受试者：ChimeriVax^TM-DEN2 5.0log₁₀PFU组中有8例(57％)，ChimeriVax^TM-DEN2 3.0log₁₀PFU组中有9例(64％)，相比之下YF-

组中仅2例(14％)。与YF幼稚型受试者相比，数量稍多的YF-免疫型受试者在接种ChimeriVax^TM-DEN25.0log₁₀PFU后发生了病毒血症(YF-免疫型受试者的11/14[79％]对比YF幼稚型受试者的8/14[57％])，但差异无统计学显著性(p＝0.4724)。多数受试者在5-7天发生病毒血症。定量病毒血症检测(平均峰、平均持续时间、AUC)也是YF免疫组高，但也无统计学显著性差异，并且重要地是未观察到对安全性曲线图的影响。

表1.病毒血症简要检测

^aPFU＝空斑形成单位，测量于Vero细胞

^b曲线下面积

^cYF幼稚型与YF免疫受试者的ChimeriVax^TM-DEN25.0log^TM配对比较

中和抗体

三种不同的登革热2型野生型株(16681，JAH和PR-159)，以及同源疫苗株(ChimeriVax^TM-DEN2)，用于中和试验。异源登革热血清型1(16007)、3(16562)和4(1036)的野生型株也用来检测中和抗体反应的幅度。检测了受试者血清转化(表示第1天和第30天之间中和抗体滴度至少高于或等于1∶10)的比例。另外，检测了几何平均中和抗体滴度。

用于CVD2、PR-159和JAH的空斑减少中和试验(PRNT₅₀)，包含如下步骤：

连续两倍稀释热灭活的血清，与等体积病毒混合至30-50pfu/孔。血清-病毒混合物在4℃孵育18+/-2小时，然后加入12-孔培养板的Vero单层细胞中。孵育60+/-10分钟后，单层用含0.84％羧甲基纤维素的生长培养基覆盖。平板然后在5％CO₂下于37℃孵育3-5天。

单层用7.4％福尔马林固定，然后用2.5％脱脂奶粉的PBS-吐温20溶液(加0.5％Triton X-100)封闭和透化。抗-登革热2一抗(3H5，1∶5000)孵育60+/-10分钟，随后是羊抗鼠IgG碱性磷酸酯酶(1∶500)。孵育60+/-10分钟后，加入底物(含有0.36mM左旋咪唑的BCIP-NBT)。发生充分的染色后终止反应。

计数空斑，检测PRNT₅₀滴度。PRNT₅₀滴度定义为空斑计数等于或少于阴性对照空斑计数的50％的首次血清稀释(度)。当如此检测的中和抗体滴度为至少高于或等于1∶10时，认为血清是阳性的，表示存在中和抗体。

对其它株，在另一个实验室依据以下Russell等描述的方法(J.Immunol.99：285-290，1967)进行了PRNT₅₀测定。使用LLC-MK2空斑测定单层覆盖技术测定空斑计数。解冻血清，稀释，在恒温箱中于56℃热灭活30分钟。制备系列4倍稀释的血清(1∶5、1∶10、1∶40、1∶160和1∶640)。等体积稀释登革热病毒至含约40-60pfu，加入至每个血清稀释管。在37℃孵育60分钟后，从每管中取0.2mL，接种到装在6孔板中一式三份的3孔汇合LLC-MK2上。每孔在37℃孵育90分钟，然后单层用4mL的1％羧甲基纤维素/Earle′s改进培养基覆盖。平板在37℃于5％CO₂下孵育7天。然后计数空斑，使用对数概率纸检测PRNT₅₀。绘制在每个稀释水平的空斑减少百分比来测定50％减少滴度：使用15％和85％之间的空斑减少点。结果以稀释(度)的倒数表示。当如此检测的中和抗体滴度为至少高于或等于1∶10时，认为血清是阳性的，表示中和抗体存在。

疫苗接种后30天的反应

在第31天，在所有接种ChimeriVax^TM-DEN2组中对抗登革热2型病毒的血清转化率高。在以高或低剂量接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF幼稚型受试者中观察到对异源DEN血清型1、3和4的低血清转化率。在5.0和3.0log₁₀PFU剂量组，对DEN1血清转化率分别为23％和23％(表2)；对DEN3分别为15％和23％；对DEN4分别为0％和0％。相对地，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者100％对所有异源的DEN血清型血清转化。

在YF幼稚型受试者中，ChimeriVax^TM-DEN2疫苗诱导非常低的对异源血清型1、3和4的交叉中和抗体滴度(表3)。对于受试者体内在第31天对抗异源的登革热血清型的几何平均中和抗体滴度，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者显著高于YF幼稚型受试者。对DEN1，接种5.0log₁₀PFU ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者和接种5.0或3.0log₁₀PFU ChimeriVax^TM-DEN2的YF幼稚型受试者的几何平均抗体滴度分别为79对10和12(p＜0.0001)。相似地，对DEN3，滴度为73对13和12(p＜0.0001)(表3)。没有YF幼稚型受试者对DEN4血清转化。在YF-免疫型受试者中对DEN4的几何平均中和抗体滴度为57。

表2.第31天治疗组血清转化率(％)

表3.第31天治疗组几何平均抗体滴度

疫苗接种后6个月的反应

疫苗接种后6个月的反应列于下表4和5。在6个月，在以高或低剂量接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF幼稚型受试者中观察到低的对异源的DEN血清型1、3和4的血清阳性率。在5.0和3.0log₁₀PFU剂量组对DEN1的血清转化率分别为23％和31％(表4)；对DEN3分别为15％和23％；对DEN4分别为8％和8％。相对地，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者100％对DEN1和3血清阳性，64％对DEN4血清阳性。

在YF幼稚型受试者中，ChimeriVax^TM-DEN2疫苗诱导低的对异源血清型1、3和4的交叉反应中和抗体滴度(表5)。在6个月时，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者的对抗异源的登革热血清型几何平均中和抗体滴度高于YF幼稚型受试者。对DEN1，接种5.0log₁₀PFU ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者和接种5.0或3.0log₁₀PFU ChimeriVax^TM-DEN2的YF幼稚型受试者的几何平均抗体滴度分别为285对＜10和14。相似地，对DEN3，滴度为268对＜10和＜10(表5)。

表4.各治疗组血清阳性比例(％)，6个月

表5.各治疗组几何平均抗体滴度，6个月

疫苗接种后1年的反应

在第12个月，在接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫组对抗登革热2型病毒血清阳性率最高。当两种DEN2株PR-159和JAH被考虑时，这是特别明显的。这两种株来自Americas，属于两种截然不同的变异体组(distinct variant groups)(分别为America I和II)。

在以高或低的剂量ChimeriVax^TM-DEN2接种的YF幼稚型受试者中，观察到低的对异源的DEN血清型1、3和4的血清阳性率。在5.0和3.0log₁₀PFU剂量组，对DEN1血清转化率分别为23％和31％(表6)；对DEN3分别为8％和23％；对DEN4分别为8％和0％。相对地，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者100％对DEN 1和3血清阳性，29％对DEN4血清阳性。

YF幼稚型受试者中，ChimeriVax^TM-DEN2疫苗诱导低的对DEN2株JaH和PR-159和对异源血清型1、3和4的交叉反应中和抗体滴度(表7)。在第12个月，接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者中对抗异源登革热血清型的几何平均中和抗体滴度显著高于YF幼稚型受试者。对DEN1，接种5.0log₁₀PFU ChimeriVax^TM-DEN2的YF-免疫型受试者和接种5.0或3.0log₁₀PFU ChimeriVax^TM-DEN2的YF幼稚型受试者的几何平均抗体滴度分别为89对10和13(p＜0.0001)。相似地，对DEN3，滴度为72对＜10和＜10(p＜0.0001)(表7)。

表6.各治疗组血清阳性比例(％)，12个月

表7.各治疗组几何平均抗体滴度，12个月

黄热病抗体反应

意外地，接种ChimeriVax^TM-DEN2的14名YF免疫型受试者中，只有2名(14％)有YF抗体增强。这就是说，在ChimeriVax^TM疫苗接种后预先存在的YF免疫力加强了对登革热血清型1-4的反应的同时，交互加强的情况并未出现(即，ChimeriVax^TM-DEN2未加强对黄热病毒的抗体)。这种结果出乎意料，因为在接受ChimeriVax^TM-DEN2(共享黄热病和登革热包膜蛋白之间的抗原决定簇)的黄热病免疫患者中，根据扩大的对登革热抗体的反应的机理，人们预期在接种ChimeriVax^TM-D2后会出现黄热病抗体加强。结果说明对黄热病毒交叉保护免疫反应的不可预期性，并构成了本发明的新颖性。

T细胞反应

T细胞反应通过响应在培养物上清液中病毒抗原的IFNγ产生来评价。受试者用灭活的病毒细胞溶解物筛选，该溶解物显示产生对疫苗的主要的CD4+T细胞反应，但也产生一些CD8+细胞(Mangada等，J.Immunol.Methods 284：89-97，2004)。

材料和实验方法

在第1天和第31天，通过用灭活病毒抗原激发培养物中的PBMC并测量PBMC产生的IFNγ的产量来评价T细胞反应。在第1和31天用Vacutainer细胞制剂管(CPT，BDBiosciences)收集全血，送至Acambis公司以分离和深低温保藏PBMC。细胞在RPMI 1640中洗涤，深低温保藏于热灭活的含10％DMSO的人AB血清(SeraCare，Oceanside CA)，储存于液氮中，临试验前融化。为测量IFNγ产量，PBMC与3种不同的戊二醛灭活病毒抗原：(1)ChimeriVax^TM-DEN2病毒(生长于Vero细胞)，(2)登革热2PUO218株病毒(野生型登革热2病毒，生长于C6/36细胞)，和(3)YF病毒(生长于Vero细胞)，用96-孔平底板以1.5x 10⁵细胞/孔于37℃下培养7天。对照由灭活的假-感染Vero或C6/36细胞组成。以1∶100(15)浓度加入灭活的病毒抗原或对照细胞抗原。也以1μg/ml ConA激发PBMC作为试验阳性对照。通过ELISA，使用在第7天收集的培养物上清液检测IFNγ的产量。

IFNγELISA

根据生产商说明书，通过间接ELISA测定法分析培养物上清液IFNγ含量(OptEIA^TM人IFNγ试剂盒，BDBiosciences-Pharmingen，Cat#555142)。

IFNγ细胞因子产量

通过检测对灭活病毒抗原的反应，在研究的第1天和第31天(疫苗接种前和疫苗接种后第30天)对比IFNγ细胞因子的产量。测试了给予的疫苗(ChimeriVax^TM-DEN2)、母代野生型登革热-2病毒(PUO218)和给予的对照病毒(YF-

)。生长于Vero细胞的ChimeriVax^TM-DEN2在0天时有很低的背景，而生长于C6/36细胞的登革热-2病毒在一些受试者中产生反应。然而，在四个疫苗组每组中所有这些抗原都使IFNγ的产量增加。灭活的YF-

在任何受试者中免疫原性都不是非常强，但其确实在第31天相对第1天显示出增加，特别是在YF接种的受试者中。

使用第31天和第1天的值之间的差值进行疫苗接种组之间的比较(图1)。所有组都对每个灭活的抗原响应。接受10³或10⁵PFUChimeriVax^TM-DEN2疫苗的受试者有等价的IFNγ水平。在IFNγELISA测定中，接种ChimeriVax^TM-Den2的受试者比接种YF的受试者的反应稍高(无显著性)(图1)。

YF预先免疫的受试者反应者数量上和平均IFNγ水平上有所增加(图1)。表8总结了显示作为总体的分数的反应者数的结果。约65％接种ChimeriVax^TM-DEN2和YF的受试者对作为试验抗原给予的疫苗有阳性IFNγ反应，而约90％接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF预先免疫受试者有阳性反应(表8)。

表8.对疫苗反应的受试者数(基于IFNγ反应)

免疫接种组    YF         CVD2       Den2PUO218

CVD210³       2/14       9/14       8/14

CVD210⁵       1/14       9/14       7/14

YF 10⁵        3/14       9/14       4/14

YF-CVD210⁵    0/14       13/14      7/14

阳性反应定义为5倍背景，或在第30天≥50pg/ml(如果第1天低于10pg/ml(低于灵敏度))。

本研究结果显示大约65％接种ChimeriVax^TM-DEN2和YF的受试者对作为试验抗原给予的疫苗有阳性T细胞反应，而～90％接种ChimeriVax^TM-DEN2的YF预先免疫受试者有阳性反应(通过IFNγ反应限定)。ChimeriVax^TM-DEN2疫苗病毒激发的IFNγ产量为最大。

此临床试验中的T细胞反应与中和抗体反应的一致之处在于所有剂量的疫苗都激发了相似的T细胞免疫反应，并且对黄热病毒的预先免疫力未抑制对ChimeriVax^TM-DEN2的T细胞反应。两剂ChimeriVax^TM-DEN2(10³和10⁵pfu)的IFNγ反应实质上相同。对ChimeriVax^TM-DEN2的IFNγ反应未被预先黄热病毒疫苗接种所降低，甚至有更多数量的反应者，提示在YF预先免疫受试者有增强T细胞免疫力的趋势。

用于测定法的灭活抗原鉴别了最强的反应者，但未明确产生免疫反应的特异性蛋白。由于使用了灭活登革热抗原，所以可能主要检测出CD4+反应。

实施例2：四价登革热疫苗

研究设计和方法

在本实施例中，我们评价了人类受试者在给予黄热病17D疫苗后给予四种(4)嵌合黄热病毒(每种包含互不相同的登革热血清型的膜和包膜蛋白(ChimeriVax^TM-DEN四价))连续免疫的免疫反应。研究的第一阶段为评价包含血清型DEN 1、2、3和4的四价ChimeriVax^TM-DEN疫苗较之于黄热病(YF)疫苗(YF-

)和安慰剂的安全性、耐受性和免疫原性。试验第二阶段评价连续给予YF-

/四价ChimeriVax^TM-DEN较之于以5-9个月间隔的两剂四价ChimeriVax^TM-DEN的安全性和免疫原性。

研究包含首次疫苗接种前3-21天的筛选期、首次疫苗接种后1个月的双盲治疗期、第二个3-21天的筛选期(在首次疫苗接种后，30天的开放标签治疗期开始之前5-9个月)。计划在第12个月随访。

在研究的第一阶段，三组33名健康成人男性和女性受试者接受四价ChimeriVax^TM-DEN(组1)、YF-

(组2)或安慰剂(YF-

稀释剂-组3)，共99名受试者。

在进行任何试验相关程序前，受试者签署知情同意书。在筛选期间，通过病史、体检、重要体征、临床化学、血液学和血清学(包括女性受试者的血清妊娠检查)，和尿液分析的尿样来评估合格性。在第1天，受试者在三角肌区域接受双盲皮下疫苗接种，然后在第3、5、7、9、11、13、15、17、19和21天到门诊进行不良事件(AE)检查并收集测病毒血症的血液样品。另外，在第5、9、11和15天，受试者提供血液样品用于临床实验室评估。在第11和31天，和第5-9个月，受试者提供血液样品用于抗体分析。

在第5-9个月，评估连续的合格性，记录中间时期的医疗史。合格的受试者在三角肌区域接受第二次皮下疫苗接种(四价ChimeriVax^TM-DEN疫苗)。受试者在第2、4、6、8、10、12、14、16、18和20天后到门诊进行AE检查并收集测病毒血症的血样。第二次疫苗接种后第10和30天获得抗体检测血样。

所有受试者在初次疫苗接种后12个月返回门诊(第二次疫苗接种后3-7个月)进行抗体检测。研究设计见表9和10。

表9.第一天给予的处理

表10.第5-9个月给予的处理

组	ChimeriVaxTM-DEN四价log10TCID50/剂	N
			1	～4每组份	33
2	-	33
			3	-	33

每种血清型准确的四价ChimeriVax^TM-DEN剂量通过TCID₅₀测定法检测为3.7/3.1/3.8/3.2TCID₅₀(分别对应血清型1、2、3和4)。

评价免疫反应的标准如下：

免疫原性的首要终点为在第31天对登革热血清型1-4的血清转化率，使用如实施例1所述进行的恒量(constant)-病毒、血清-稀释50％空斑-减少中和检测(PRNT₅₀)。这种分析定义了对所有四种登革热血清型和对单个血清型的血清转化率。处于基线的血清阴性(＜1∶10)的受试者需要PRNT₅₀滴度≥1∶10来达到血清转化标准。

第二终点包括首次疫苗接种后5-9个月和首次疫苗接种后12个月(即第二次，加强疫苗接种后3-7个月)对各登革热血清型的几何平均中和抗体滴度和血清转化率的分析。比较接受(a)单剂量ChimeriVax^TM-DEN四价；(b)两剂ChimeriVax^TM-DEN四价，或(c)一剂黄热病17D疫苗(YF-

)，然后5-9个月后给予一剂ChimeriVax^TM-DEN四价的受试者的这些血清学反应。

结果

评价研究对象在不同免疫方式后对所有四种登革热血清型的免疫反应幅度。免疫人类受试者对抗登革热病毒疾病的目标是尽可能达到广泛的交叉中和抗体反应。所有受试者(在基线为登革热和黄热病幼稚型)在第二研究治疗剂量后30天的免疫反应见表11(对抗野生型株结果)。

54名受试者(在基线为登革热和黄热病幼稚型)在第1天接受单剂量的ChimeriVax^TM-DEN四价，或在第1天接受安慰剂，然后在5-9个月接受单剂量的ChimeriVax^TM-DEN四价。这些组接受活疫苗30天后的中和抗体反应合并后列于表11的最右栏。少数接受单剂量ChimeriVax^TM-DEN四价接种的受试者有对3或4登革热血清型的交叉反应免疫反应。只有43％和17％的接受单剂量ChimeriVax^TM-DEN四价的受试者分别产生对至少3或4登革热血清型的中和抗体。

27名受试者(在基线为登革热和黄热病幼稚型)在第1天和5-9个月接受两剂ChimeriVax^TM-DEN四价(组1)。中和抗体反应见表11。组1的中和抗体反应幅度比只接受单剂ChimeriVax^TM-DEN四价的受试者高。55.6％和40.7％接受两剂ChimeriVax^TM-DEN四价的受试者分别产生对3或4登革热血清型的中和抗体。

26名受试者(在基线为登革热和黄热病幼稚型)在第1天接受黄热病疫苗(YF-)，随后在第5-9个月接受单剂量的ChimeriVax^TM-DEN四价(组2)。组2中的中和抗体反应见表11。组2中的中和抗体反应幅度高于接受无论一剂ChimeriVax^TM-DEN四价或两剂被5-9个月分开的ChimeriVax^TM-DEN四价的受试者。92％和65％接受连续黄热病疫苗和ChimeriVax^TM-DEN四价疫苗免疫的受试者分别产生对至少3或4登革热血清型的中和抗体。

结果清楚地显示连续免疫方式(其中黄热病疫苗先于ChimeriVax^TM-DEN四价疫苗给予)所致的对登革热更强的免疫反应(对登革热血清型广泛的交叉反应)，高于单独的单剂或两剂试验的ChimeriVax^TM-DEN四价疫苗所致反应。

尽管为清晰理解的目的，通过说明和实施例相当详细地描述了以上发明，很明显的是本领域普通技术人员根据本发明技术可在不偏离附加的权利要求的精神或范围内作某些改变和改进。以上所有引用文献通过引用结合于本文。

Claims (24)

1.一种在受试者体内诱导对登革热病毒长效、交叉中和免疫反应的方法，该方法包含给予受试者：

(i)一剂黄热病毒疫苗，和

(ii)一剂嵌合黄病毒疫苗，该疫苗包含至少一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒包膜蛋白的序列由编码登革热病毒包膜蛋白的序列替代，

其中嵌合黄病毒疫苗在给予黄热病疫苗后至少30天至10年内给予。

2.权利要求1的方法，其中嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

3.权利要求1或2的方法，其中登革热包膜和/或登革热膜蛋白为改组蛋白。

4.权利要求1的方法，其中嵌合黄病毒疫苗在给予黄热病疫苗后30、60或90天给予受试者。

5.权利要求1的方法，其中嵌合黄病毒包含YF17D病毒骨架。

6.权利要求1的方法，其中黄热病毒疫苗包含YF17D疫苗株17D-204、17D-213或17DD。

7.权利要求1的方法，其中一种嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

8.权利要求1的方法，其中一种嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型2病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

9.权利要求1的方法，其中一种嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型3病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

10.权利要求1的方法，其中一种嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型4病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

11.权利要求1的方法，其中嵌合黄病毒疫苗为单价疫苗。

12.权利要求1的方法，其中嵌合黄病毒疫苗为4价疫苗。

13.权利要求1的方法，该方法进一步包含在首剂嵌合黄病毒疫苗后6个月至10年，给予如权利要求1的(ii)中所定义的加强剂量嵌合黄病毒疫苗。

14.一种试剂盒，该试剂盒包含：

(i)黄热病毒疫苗，和

(ii)嵌合黄病毒疫苗，该疫苗包含至少一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒包膜蛋白的序列由编码登革热病毒包膜蛋白的序列替代。

15.权利要求14的试剂盒，其中嵌合黄病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

16.权利要求14或权利要求15的试剂盒，其中登革热包膜和/或登革热膜蛋白为改组蛋白。

17.权利要求14的试剂盒，其中黄热病毒疫苗包含YF17D株。

18.权利要求14的试剂盒，其中嵌合黄病毒包含YF17D病毒骨架。

19.权利要求14的试剂盒，其中嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

20.权利要求14的试剂盒，其中嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型2病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

21.权利要求14的试剂盒，其中嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型3病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

22.权利要求14的试剂盒，其中嵌合黄病毒疫苗包含一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒膜和包膜蛋白的序列由编码登革热血清型4病毒膜和包膜蛋白的序列替代。

23.权利要求14的试剂盒，该试剂盒进一步包含至少一种加强剂量的嵌合黄病毒疫苗。

24.疫苗(i)和(ii)在受试者体内诱导对登革热病毒长效、交叉中和免疫反应的用途，

(i)一剂黄热病毒疫苗，和(ii)一剂嵌合黄病毒疫苗，该疫苗包含至少一种嵌合黄病毒，该病毒包含黄热病毒骨架，其中编码黄热病毒包膜蛋白的序列由编码登革热病毒包膜蛋白的序列替代，

其中嵌合黄病毒疫苗在给予黄热病疫苗后至少30天至10年内给予。

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