BRPI0904020A2 - mÉtodo, kit, plasmÍdeo e composiÇço para induzir resposta imune contra vÍrus da dengue baseado em vacinas de dna e vÍrus quimÉricos - Google Patents
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Abstract
MÉTODO, KIT, PLASMÍDEO E COMPOSIÇçO PARA INDUZIR RESPOSTA IMUNE CONTRA VÍRUS DA DENGUE BASEADO EM VACINAS DE DNA E VÍRUS QUIMÉRICOS. A presente invenção se refere a um método para induzir resposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas ou co- administradas. Também estão dentro do escopo da presente invenção, vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentes plasmideos recombinantes contendo o gene que codifica a proteína E, ou somente a seqúência que corresponde ao domínio III desta proteína, a partir de cada sorotipo viral do vírus dengue (DENV1-4). A invenção fornece ainda urna composição vacinal consistindo de (a) vacinas de DNA contra os quatro sorotípos do vírus dengue, (b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinal de febre amarela 17D modificado; e (c) um veículo farmaceuticamente aceitável, está incluído no escopo de proteção.
Description
MÉTODO, KIT, PLASMÍDEO E COMPOSIÇÃO PARA INDUZIR RESPOSTAIMOKE CONTRA VÍRUS DA DENGUE BASEADO EM VACINAS DE DNA EVÍRUS QUIMÉRICOS
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um método para induzirresposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas deDNA e virus quiméricos 17D em imunizações combinadas ou co-administradas. Também estão dentro do escopo da presenteinvenção, vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir da construção de diferentesplasmídeos recombinantes contendo o gene que codifica aproteína E, ou somente a seqüência que corresponde aodomínio III desta proteína, a partir de cada sorotipo viraldo vírus dengue (DENV1-4).
Está incluída no escopo de proteção uma composiçãovacinai consistindo de:
(a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírusdengue a partir da construção de diferentes plasmídeosrecombinantes contendo os genes das proteínas E a partir decada sorotipo viral do vírus dengue, ou somente asseqüências que correspondem ao domínio III destasproteínas, todas fusionadas à seqüência que codifica opeptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecidohumano (t-PA);
(b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai defebre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtençãode clone infeccioso, com a substituição das seqüências quecodificam as proteínas prM e E de febre amarela pelasseqüências que codificam as proteínas prM e E dos vírusdengue dos diferentes sorotipos; e,
(c) um veículo farmaceuticamente aceitável,
A invenção se relaciona também a um kit compreendendo(a) vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírusdengue a partir da construção de diferentes plasmídeosrecombinantes contendo os genes que codificam as proteínasE a partir de cada sorotipo viral do vírus dengue, ousomente as seqüências que correspondem ao domínio IIIdestas proteínas, todas fusionadas à seqüência que codificao peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecidohumano (t-PA); e, (b) vírus quiméricos compreendendo ovírus vacinai de febre amarela 17D modificado, pelatecnologia de obtenção de clone infeccioso, com asubstituição das seqüências que codificam as proteínas prMe E de febre amarela pelas seqüências que codificam asproteínas prM e E dos vírus dengue dos diferentessorotipos.
Fundamentos da Invenção
A dengue é considerada um dos principais problemas desaúde pública mundial, entre as doenças causadas porarbovírus, devido a sua importância em termos de morbidadee mortalidade na população humana, principalmente nasregiões tropicais e subtropicais. Seu agente etiológico é ovírus da dengue que é transmitido pelo mosquito do gêneroAedes, geralmente Aedes aegypti.
O vírus da dengue (DENV) pertence ao gêneroFlavivirus, da família Flaviviridae. Há 4 tipos de vírusantigenicamente e sorologicamente distintos: DENVl, DENV2,DENV3 e DENV4. Apesar da infecção primária pelo vírus dadengue induzir uma imunidade ao sorotipo infectante, não háuma proteção cruzada de longa duração contra os outrossorotipos virais, ocorrendo infecções seqüenciais com osdiferentes virus da dengue.
0 virus da dengue é composto por um envelope viral eum nucleocapsideo complexado a uma molécula de RNA. Seugenoma é de aproximadamente 10.700 nucleotideos econstitui-se de uma fita simples de RNA com polaridadepositiva que codifica a poliproteína precursora dasproteínas flavivirais. Este precursor é clivado porproteases celulares e pela protease viral gerando trêsproteínas estruturais, C (capsídeo), prM (pre-membrana) e E(envelope), e sete proteínas não estruturais, NSl, NS2A,NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS 5. As proteínas estruturaistraduzidas são incorporadas nos vírions infecciososmaduros, enquanto as proteínas não estruturais estãoenvolvidas na replicação e montagem do vírus.
A proteína E (Envelope) do vírus da Dengue é umaproteína estrutural e transmembrana, sendo glicosilada emquase todos Flavivirus. Essa proteína E se destaca como omaior componente glicoprotéico presente na superfíciedesses vírus, possuindo peso molecular de 55 a 60 kDa,constituída de 4 93 a 501 aminoácidos.
A proteína E está associada a numerosas atividadesbiológicas importantes. A proteína E atua como proteínaligante, interagindo com receptores presentes na superfíciecelular e mediando à fusão da membrana do vírus à membranada célula hospedeira. Essa proteína também está relacionadaà dissociação do nucleocapsideo e desempenha um importantepapel na virulência do vírus. Além disso, a proteína E é umforte imunógeno, gerando altos níveis de anticorpos empacientes infectados com o vírus, que podem serneutralizantes, se ligando a epítopos que interagem comreceptores celulares e impedindo, portanto a entrada dovírus nas células do hospedeiro (Chang, 1997; Kinney &Hung, 2001).
A proteína E é formada por um dímero alongado que seestende paralelamente à membrana do vírus. Cada monômero écomposto de três domínios: I, II e III. 0 domínio I écentral constituído de 120 resíduos de aminoácidos: 1-51,133-193, 279-296. O domínio II é alongado, compreende aregião onde os dois monômeros estão ligados em váriospontos na molécula, formando o dímero. O domínio II éconstituído dos seguintes resíduos de aminoácido: 52-132,194-280. O domínio III está localizado na porção carbóxi-terminal, apresenta-se como uma imunoglobulina, cuja funçãoé se ligar a receptores celulares, como por exemplo, DC-SIGN presente nas células dendríticas imaturas. A ligaçãovírus/célula mediada pelo domínio III promove a endocitoseda partícula viral. O domínio III é constituído dosresíduos de aminoácidos: 298-394. Os epítopos presentesnessa região são capazes de induzir resposta de anticorposneutralizantes tipo e subtipo-específico.
Diversas vacinas vêm sendo propostas para o combate àdengue, contudo nenhuma das abordagens sugeridas apresentouas características necessárias para uma vacinação em massa,como segurança e uma resposta imune protetora de longoprazo contra os diferentes sorotipos virais circulantes.Uma das principais dificuldades é construir umprotótipo de vacina contendo componentes que induzam umaimunidade protetora contra os quatro sorotipos de vírus dadengue, sem gerar conseqüências como a febre hemorrágica, eutilizando o menor número possível de doses.
Esforços consideráveis vêm sendo realizados para odesenvolvimento de uma vacina tetravalente atenuada. 0 maispromissor destes candidatos consiste em vírus atenuados porpassagens em cultura de células. Esta vacina está em fasede avaliações clínicas, contudo já foram observadas algumascomplicações. Além disso, existe o risco potencial deinfecções sérias por vírus que possam surgir de reversõesgênicas ou recombinações, tornando difícil formular umavacina viva atenuada multivalente devido à possibilidade deinterferência homóloga ou heteróloga durante a replicaçãoviral (Barrett, 2001; Kinney & Huang, 2001).
Outra estratégia empregada para o desenvolvimento deuma vacina contra o vírus da dengue é a construção dequimeras. Essa tecnologia vem sendo utilizada em diversaspesquisas de vacinas contra Flavivirus, incluindo o vírusda Dengue (Galler et al., 2005).
Apesar dos avanços obtidos até o momento, existe aindaum grande desafio: produzir uma vacina capaz de gerar umaresposta homogênea contra os quatro sorotipos do vírus daDengue.
A vacina de DNA representa uma eficiente tecnologia nodesenvolvimento de vacinas para o controle de agentesinfecciosos. Esta técnica compreende a inoculação de umplasmídeo de expressão eucariótico contendo o antígeno deinteresse, que é sintetizado in vivo pelas células doorganismo inoculado e é apresentado pelos complexos dehistocompatibilidade I e II (MHC I e II), ativando umaimunidade especifica. A expressão endógena do antigenopelas células hospedeiras parece simular uma infecção viralnatural sendo capaz de gerar tanto uma resposta imunehumoral, com produção de anticorpos, como uma respostacelular, com indução de linfócitos T citotóxicos. A induçãodestas duas formas de resposta imune fornece vantagens emcomparação com as vacinas de subunidades, que produzemprincipalmente, ou exclusivamente, uma resposta deanticorpos, e se compara à resposta celular de vacinasvivas atenuadas, sem apresentar o risco de reversão paraforma patogênica do agente infeccioso. Além disso, asvacinas de DNA são estáveis a variações de temperatura, demenor custo para a produção em grande escala, e permitemuma rápida seleção de seqüências a serem avaliadas.
Recentemente, vários grupos têm analisado o uso davacina de DNA no controle de flavivirus. Alguns destesestudos com diferentes virus desta família têm demonstradoa indução de uma resposta imune protetora flavivírus-especifica em camundongos e primatas não humanos após avacinação com plasmídeos codificando as proteínasflavivirais prM e E (Phillpotts et al., 1996; Kochel etal., 1997;; Raviprakash et al, 2000). Algumas análisestambém foram realizadas utilizando vacinas de DNA contendoos genes de proteínas não estruturais de flavivirus como: ovírus da encefalite japonesa, hepatite C e dengue (Lin etal., 1998; Encke et al., 1998; Wu et al., 2003; Costa etal., 2006, 2007).
Estudos recentes demonstraram que vacinas DNA contendo a seqüência completa dos genes quecodificam as proteínas prM e E, e a região do domínio III do vírus DENV1-4, foram capazes de induziruma resposta imune humoral com a presença de anticorpos contra Dengue em modelos murinos.
Entretanto nestes estudos o potencial protetor das vacinas de DNA foi avaliado somente indiretamente(soroneutralização e resposta celular) não sendo realizados testes de desafios diretos com doses letais dovírus da Dengue para avaliar eficácia dessas vacinas (Chen et al., 2007). Algumas vacinas de
DNA contra dengue foram testadas em primatas não humanos(Aotus e Rhesus) e conferiram proteção parcial, avaliadaatravés da viremia nos animais desafiados com o virus daDengue (Raviprakash et al., 2000; Putnak et al., 2003;Blair et al., 2006).
No que se refere ao método de imunização, os presentesinventores destacam que Putnak e colaboradores (2003),construíram uma vacina DNA contendo os genes que codificamas proteínas prM e E a partir do DENV2, observaram aimunogenicidade desta em camundongos e imunizaram emseguida macacos Rhesus. Entretanto, foram necessáriasvárias doses da vacina para a indução de uma respostaprotetora e de curta duração. Sete meses após asimunizações, os animais não se mostraram mais protegidoscontra desafios com o vírus da dengue. Assim, podemosobservar que estes estudos indicam a necessidade dautilização de novas estratégias para aumentar a duração daresposta imune. Mais recentemente tem sido demonstrado quea combinação de vacinas de DNA com outras vacinas podegerar respostas imunes mais eficientes do que as mesmasabordagens isoladamente.O pedido de patente W02008/127307, publicado em23/10/2008, está direcionado para um método de indução deresposta imune contra o virus da dengue usando umametodologia de vacinação de dose/reforço. Maisespecificamente, o documento W02008/127307 está direcionadoà administração de uma dose de um imunógeno do virus dadengue que compreende uma vacina de DNA ou uma vacinatetravalente de DNA ou uma vacina tetravalente inativadapurificada e uma dose reforço de um imunógeno do virus dadengue, compreendendo uma vacina viral tetravalente devirus atenuado. Entretanto, esta estratégia apresenta asdificuldades inerentes à utilização de uma vacinatetravalente de virus dengue atenuado, como por exemplo apossibilidade de interferência de um ou mais virus nareplicação in vivo dos outros virus, levandoconsequentemente a respostas imunes heterogêneas em relaçãoaos diferentes sorotipos virais. Além disso, o documentotambém está direcionado à utilização de adenovirus contendogenes que codificam proteínas de dengue como reforço parauma vacina tetravalente, o que pode implicar em uma baixaeficiência na indução de respostas imunes contra dengue emseres humanos. Tal fato se deve à presença, em sereshumanos, de respostas imunes prévias contra adenovirus, quepodem impedir a infecção com adenovirus vetor carreandogenes do vírus da dengue, e consequentemente comprometendoa eficiência da resposta imune ao vírus da dengue.
Também é conhecido o pedido de patente US20080193477,publicado em 14/08/2008, um método que emprega um regime deimunização compreendendo a administração de uma primeiravacina de febre amarela seguida da administração de umavacina de dengue a base de flavivirus quimérico.Entretanto, outros relatos na literatura demonstraram que aimunização com o virus vacinai da febre amarela podecomprometer a eficiência da resposta imune geradaposteriormente com virus quiméricos de febre amarelacontendo genes do virus da dengue. Neste caso os niveis deanticorpos neutralizantes contra o virus da dengue foramsignificativamente menores em macacos previamente vacinadoscontra febre amarela (Galler et al., 2005). Como aquidiscutido, verificamos que apesar dos esforços que vemsendo desenvolvidos, há ainda uma necessidade para odesenvolvimento de vacinas de DNA mais eficazes e capazesde induzir um aumento da resposta imune, assim como autilização de estratégias vacinais combinadas queincrementem esta resposta imune.
Sumário da Invenção
O objetivo da presente invenção é propiciar um métodopara induzir resposta imune contra virus da dengue baseadoem vacinas de DNA e virus quiméricos 17D em imunizaçõescombinadas ou co-administradas.
Também é um objetivo da invenção fornecer umacomposição de vacinas de DNA contra os quatro sorotipos dovirus dengue a partir da construção de diferentesplasmideos recombinantes contendo os genes que codificam asproteínas E a partir de cada sorotipo viral do vírus dengue(DENV1-4), ou somente as seqüências que correspondem aodomínio III destas proteínas, todas fusionadas à seqüênciaque codifica o peptídeo sinal do t-PA.Uma composição vacinai consistindo de (a) vacinas deDNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue a partir daconstrução de diferentes plasmídeos recombinantes contendoos genes que codificam as proteínas E a partir de cadasorotipo viral do vírus dengue, ou somente as seqüênciasque correspondem ao domínio III destas proteínas, todasfusionadas à seqüência que codifica o peptídeo sinal do t-PA; e, (b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinaide febre amarela 17D modificado, cujas seqüências quecodificam as proteínas prM e E de febre amarela foramsubstituídas pelas seqüências que codificam as proteínasprM e E dos vírus dengue dos diferentes sorotipos, e umveículo farmaceuticamente aceitável, está incluída noobjetivo da presente invenção.
A invenção apresenta ainda um kit compreendendo (a)vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus dengue apartir da construção de diferentes plasmídeos recombinantescontendo os genes das proteínas E, ou somente as seqüênciasque correspondem ao domínio III destas proteínas a partire cada sorotipo viral do vírus dengue; e, (b) vírusquiméricos compreendendo o vírus vacinai de febre amarela17D modificado, cujas seqüências que codificam as proteínasprM e E de febre amarela foram substituídas pelasseqüências que codificam as proteínas prM e E dos vírusdengue dos diferentes sorotipos.Breve Descrição da Figuras
A Figura 1 é uma representação esquemática dosplasmídeos pcTPA, pElD2 e pE2D2.
A Figura 2 mostra a imunofluorescência de células BHK-21 transfectadas com os plasmídeos pElD2 (A e A'), pE2D2 (Be B') e pcTPA (C e C'), onde o contraste de fase é mostradoem A, Be C; a fluorescência é mostrado em A', B'e C'(aumento de IOOOx AeB, 400x C).
As Figuras 3A-3B mostram os resultados do primeiroexperimento com pElD2.
As Figuras 3C-3D mostram os resultados do segundoexperimento com pElD2.
As Figuras 4A-4B mostram os resultados do primeiroexperimento com pE2D2.
As Figuras 4C-4D mostram os resultados do segundoexperimento com pE2D2.
As Figuras 5A-5D mostram os resultados do terceiroexperimento com combinações simultâneas com pElD2, pE2D2,17D-D2.
Descrição Detalhada da Invenção
Os presentes inventores encontraram no estado da arteque a proteína do envelope (E) do vírus da dengue é umforte imunógeno, podendo gerar uma resposta protetora comaltos níveis de anticorpos neutralizantes. Sendo assim, oprimeiro objetivo da presente invenção é construir vacinasde DNA contra dengue contendo os genes que codificam asproteínas E, sem a região hidrofóbica C-terminal, oucontendo as seqüências dos domínios III destas proteínas,inseridos no plasmídio pcTPA, que possui a seqüência sinaldo ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA), umeficiente peptídeo sinal já testado em outras vacinas. Apresente invenção também tem como objetivo estabelecer ummétodo para induzir resposta imune protetora contra osvirus da dengue, baseada na administração de vacinas de DNAe virus quiméricos 17D em imunizações combinadas no sistemade dose/reforço ou co-administração das duas vacinas.
0 plasmideo pcTPA contém uma seqüência de DNAcorrespondente ao peptideo sinal do gene do ativador deplasminogênio de tecido humano (t-PA). Existem diferençasno tamanho da região do t-PA identificada como peptideosinal. 0 artigo que descreve a clonagem e o sequenciamentodo gene do t-PA (Pennica et ai., Nature, 301:214-221, 1983)identifica uma região de 105 pares de bases, que codificaos primeiros 35 aminoácidos, como peptideo sinal. 0plasmideo pcTPA contém uma seqüência de 69 pares de basesque corresponde aos primeiros 23 aminoácidos SEQ ID NO:8. Aseqüência correspondente ao peptideo sinal do t-PA foiclonada no plasmideo pcDNA3 (Invitrogen) utilizando ossitios das enzimas de restrição HindIII e EcoRV. Destemodo, qualquer seqüência pode ser clonada a jusante aositio EcoRV, utilizando o sitio desta enzima que gerafragmentos de ponta cega, podendo, portanto, se ligar aoutro fragmento também de ponta cega, sem necessariamenteter sido digerido com EcoRV. Além deste sitio, o plasmideopcTPA conserva os cinco sitios de enzimas de restrição ajusante ao da EcoRV (BstXIr Not I, XhoIr XbaI e ApaI),oriundos do sitio múltiplo de clonagem do plasmideo pcDNA3,que também podem ser utilizados para clonagens de novasseqüências.
Para a construção dos diferentes plasmideosrecombinantes, contendo a seqüência que codifica a proteínaE sem a sua porção hidrofóbica C-terminal (E80%) - SEQ IDNO:6 -, ou somente a seqüência que corresponde ao domínioIII - SEQ ID NO:7 - desta proteína, foi utilizada alinhagem de DENV2 Nova Guiné C (NGC) (M29095; gi:323447).Esse vírus foi obtido a partir de cultura de células Veroinfectadas. Os fragmentos do gene E clonados no plasmídeopcTPA foram amplificados por PCR a partir do RNA total decélulas vero infectadas com DENV2 NGC. O RNA serviu comomolde para a síntese de um cDNA contendo as regiões alvo,utilizando oligonucleotídeos específicos. Este cDNA serviuentão como molde para a amplificação por PCR das seqüênciasalvo, utilizando outros oligonucleotídeos contendo sítiosde enzimas de restrições que foram usadas nas clonagens. Osfragmentos amplificados foram resolvidos em gel de agarosee em seguida retirados e purificados com resinas (geneclean). Os fragmentos obtidos, assim como o plasmídeopcTPA, foram digeridos com enzimas de restriçõesespecíficas e ligados com T4 DNA ligase. Os clonesrecombinantes foram obtidos em Escherichia coli, cepa DH5-a, transformada com estes plasmídeos, confirmados pordigestões com enzimas de restrição e posteriormente porsequenciamento.
Para avaliar a capacidade dos plasmídeosrecombinantes, obtidos conforme descrito acima, de mediarema expressão das proteínas E, sem a região hidrofóbica naporção C-terminal (E80%) ou somente o seu domínio III (domIII), foram realizados ensaios de análise da expressão invitro destas proteínas utilizando células BHK-21transfectadas com os diferentes plasmídeos. Os plasmídeosrecombinantes foram obtidos a partir do plasmídeo pcTPA,que foi construído a partir do plasmídeo pcDNA3(Invitrogen). Esse vetor promove a expressão das proteínasrecombinantes sob o controle do promotor do citomegalovírushumano (CMV) e contém a seqüência que codifica o peptídeosinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA),que direciona estas proteínas para o meio extracelular.
Para avaliar a produção das proteínas de interesse,culturas de células BHK-21 foram transfectadas com osplasmídeos recombinantes, utilizando lipofectamina, deacordo com as instruções do fabricante. A expressão dasproteínas recombinantes foi analisada porimunofluorescência, conforme descrito em Costa SM et al.,2006 Para a produção em grande escala dos plasmídeosrecombinantes e controle, foram utilizadas bactérias E.coli, cepa DH5-a, transformadas com os diferentesplasmídeos e cultivadas em meio TB líquido, durante a noitea 37°C. Os plasmídeos foram purificados em colunas de trocaiônica, utilizando o kit QIAGEN tip 10.000 conformerecomendação do fabricante, e ressuspensos em água,quantificados em espectrofotômetro e gel de agarose. Asvacinas de DNA foram armazenadas a -20°C até suautilização.
As vacinas de DNA da presente invenção foram testadasisoladamente quanto à sua capacidade protetora. Essestestes tiveram por finalidade analisar a eficiência daexpressão das proteínas recombinantes in vitro, avaliar aresposta de anticorpos gerada em camundongos e realizarensaios de desafios com inoculações intracerebrais de dosesletais do vírus. Os testes de soroneutralização tambémforam realizados com células Vero e com os vírus citadosanteriormente, conforme descrito por Cafour et al., 2001.Para a avaliação das construções obtidas, grupos decamundongos BALB/c machos com cerca de quatro semanas deidade foram imunizados com os plasmídeos recombinantes econtrole. Os camundongos foram inoculados por viaintramuscular (im) nos quadrícepes posteriores com estesplasmídeos diluídos em PBS. Em cada inoculação foraminjetados IOOpg de DNA por animal (50pg por pata). Na novaabordagem de imunização da presente invenção, ou seja, osistema de dose (vacina de DNA) e reforço (vírus quimérico)ou imunizações simultâneas (co-administração), as vacinasde DNA da presente invenção foram testadas em imunizaçõescombinadas com vírus quimérico (17D-D2). Esta quimera foiconstruída a partir do vírus vacinai da febre amarela YF17D, com a substituição dos genes que codificam asproteínas prM e E deste vírus pelos genes prM e E de DENV2,cepa NGC, SEQ ID NO: 9. Vale ressaltar que os testes dessanova abordagem de imunização foram iniciados com aconstrução das vacinas de DNA de DENV2 e a realização de umteste de desafio que demonstrou a capacidade protetoradestas vacinas, principalmente quando se utilizou aseqüência que codifica o gene E sem a sua porçãohidrofóbica C-terminal.
Para a construção da quimera 17D-D2, foi utilizada aabordagem do cDNA infeccioso de febre amarela, desenvolvidopor Rice et al., 1989, que consiste em dois plasmídeos:pYF5'3'IV e pYFM5.2. Nesta abordagem o genoma do vírus defebre amarela foi separado nos dois plasmídeos citadosanteriormente, dada a falta de estabilidade de algumasseqüências virais em plasmideos de alto número de cópias.Estes plasmideos foram digeridos com enzimas de restriçõesespecificas e os fragmentos gerados foram ligados,reconstituindo o genoma completo do virus vacinai de febreamarela. Entretanto, testes em macacos com este virusindicaram a necessidade de modificações genéticas do cDNApara tornar o virus mais atenuado (Marchevsky et al.,1995). Tais modificações foram realizadas por Galler eFreire, (US 6.171.854) e resultaram em novas versões dosplasmideos pYF5'3'IV e pYFM5.2, denominados Gl/2 e T3/27,respectivamente. Posteriormente, foi utilizado o plasmídeopACNR1180 (Ruggli et al., 1996) que possui uma origem dereplicação (P15A), que limita o número de replicações desteplasmideo, reduzindo assim o número de cópias do DNAplasmidial em bactérias. O plasmideo pACNR1180 foi descritocomo um plasmideo ideal para clonagem do genoma do virus defebre suina, cujo tamanho se assemelha ao do genoma dovirus da febre amarela, permitindo a estabilidade do genomaclonado. Tendo em vista estes resultados, o genoma inteirodo virus de febre amarela foi clonado em um plasmideomodificado do pACNR1180 (com a retirada de alguns sítios deenzimas de restrição), gerando o plasmídeo pYF17D/14. 0plasmídeo pYF17D/14 foi gerado em duas etapas. Primeiro oplasmídeo Gl/2 foi utilizado como molde para amplificaçãopor PCR de diferentes fragmentos que foram inseridos noplasmídeo modificado do pACNR1180, gerando o plasmídeoNSK7. Posteriormente, o plasmídeo NSK7 foi utilizado para aclonagem do restante do genoma do vírus vacinai 17D contidono plasmídeo T3/27, gerando então o plasmídeo pYF17D/14.Todos os plasmídeos foram propagados em E. coli MC1061 epurificados em coluna Qiagen. Para a construção da quimera17D-D2 foi utilizado o virus DENV2 cepa Nova Guiné. Foisintetizado um cDNA, de modo semelhante ao descritoanteriormente para as clonagens nas vacinas de DNA, quecontinha a região do genoma do virus da dengue que vai doprimeiro nucleotideo correspondente ao gene que codifica aproteína prM até a seqüência correspondente ao aminoácido205 da proteína E. Esta região foi amplificada por PCR einserida no plasmídeo Gl/2 entre os sítios para as enzimasde restrição ApaI e NotI, gerando o plasmídeo pGl/2 DEN2. 0c DNA contendo o genoma completo 17D-D2 foi construído apartir da ligação dos fragmentos: NotI/Nsil gerado comdigestão do plasmídeo pGl/2 DEN 2 (com o promotor SP6, aregião 5' NTR-C de febre amarela e prM-2/3E de DENV2),Nsil/Mlul gerado com a digestão do plasmídeo pYFD/Fll/12(codificando a região 3' de E de DENVl e o início do geneNSl de febre amarela), e Mlul/Notl gerado com a digestãodo plasmídeo pYF17D/14 (que contém o restante do genoma defebre amarela). Todos os plasmídeos foram propagados em E.coli XL-I Blue e purificados com Concert High Purity System(Invitrogen). 0 plasmídeo completo foi linearizado com XhoIe utilizado para a transcrição in vitro, através da regiãopromotora SP6. 0 RNA sintetizado in vitro foi utilizadopara a regeneração viral por eletroporação de células Verode modo similar ao descrito no documento US 6,171,854.
Além das inoculações com as vacinas de DNA isoladas,foi analisada também a resposta imune gerada em camundongostratados com imunizações combinadas: sistema de dose(vacina de DNA) e reforço (virus quimérico 17D-D2), eimunizações simultâneas (co-administração) dos dois tiposde vacinas. No sistema de dose/reforço, camundongos BALB/creceberam duas doses das vacinas de DNA de DENV2, comodescrito acima, e, duas semanas após a última dose, foraminoculados por via subcutânea (sc) ou intramuscular (im)com 4 IoglO PFU de virus quimérico (17D-D2). Nasimunizações simultâneas (co-administração) as duas vacinas(DNA e quimera 17D-D2) foram misturadas em solução salinatamponada (PBS) e inoculadas por via im, em duas doses comintervalo de duas semanas.
A resposta imune gerada com as vacinas de DNAisoladamente ou em conjunto com virus quimérico foiavaliada pela produção de anticorpos neutralizantes.
Os animais foram sangrados por via retro-orbital duassemanas após a segunda dose de DNA ou duas semanas após aúltima imunização, e ao final dos testes de desafio comDENV2. 0 soro pré-imune foi obtido no dia anterior aoinicio das imunizações. Nos ensaios de neutralização, osvirus DENV foram incubados com diferentes diluições dossoros dos camundongos imunizados e posteriormente foiavaliada a capacidade destes virus infectar células Vero,através da formação das placas de Iise. A partir dessasanálises é possível titular os níveis de anticorposneutralizantes.
Os camundongos BALB/c imunizados com os diferentesplasmídeos isoladamente ou em combinação com o vírus 17D-D2foram desafiados por inoculação intracerebral de DENV2(aproximadamente 4.3 IoglO PFU, que corresponde a uma LD50de 3,8), 25 dias após a última dose de DNA ou 10 dias apósa inoculação com o virus quimérico. Antes do desafio osanimais foram anestesiados com uma mistura de ketamine-xylazine. A titulação do virus foi feita em células Verologo após a sua inoculação nos animais, como descrito porCaufour et al., 2001. Os camundongos foram avaliadosdiariamente até 21 dias após o desafio quanto à morbidade,principalmente o desenvolvimento de paralisia nos membrosposteriores, e mortalidade. Os animais moribundos foramsacrificados, assim como os que sobreviveram 21 dias após odesafio. 0 sangue destes camundongos foi coletado, para ostestes de soroneutralização.
A invenção será, agora, descrita através de exemplos.Os exemplos seguintes são ilustrativos da invenção erepresentam as modalidades preferidas, aqueles habilitadosno estado da arte sabem ou são capazes de encontrar, usandonada mais que experimentação rotineira, como empregaroutros materiais e técnicas apropriadas.
Exemplo 1 - Construção do vetor de expressão pcTPÂ:
Um novo plasmideo de expressão foi construídoinserindo a seqüência que codifica o peptideo sinal do doativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) - SEQ IDNO:8 no plasmideo original pcDNA3 (Invitrogen). 0 fragmentoequivalente a esta seqüência foi amplificado por PCR,utilizando iniciadores específicos (Figura 1) .
Abaixo apresentamos os oligonucleotídeos usados para areação de amplificação por PCR. Os sítios de restrição HindIII e EcoRV estão sublinhados, respectivamente.SEQ ID NO:1 - Oligonucleotíodeo senso (TPAl)5' GGGGAAGCT TAT GGAT GCAAT G AAGAGG 3'SEQ ID NO:2 - Oligonucleotídeo antisensò(TPA2)5'GGGGATATCGCTGGGCGAAACGAAGAC3'
0 produto de PCR, contendo 69 pb, foi digerido eclonado no plasmideo pcDNA3 entre os sítios das enzimasHindIII e EcoRV. A seqüência foi confirmada porsequenciamento e o plasmideo recombinante denominado depcTPA (Figura IA).
Exemplo 2 - Construção de pElD2 e pE2D2
Foram construídos dois plasmídeos (pElD2 e pE2D2) apartir do plasmideo pcTPA. 0 plasmideo pcTPA é derivado doplasmideo pcDNA3 (Invitrogen) com a adição da seqüência quecodifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio detecido humano (t-PA), entre os sítios das enzimas derestrição (HindIII e EcoRV, a jusante à região promotoraderivada do citomegalovirus humano,contido no plasmideopcDNA3).
0 plasmideo pElD2 foi construído com a inserção daseqüência que codifica 80% da proteína do envelope viral(E) do vírus da dengue, sorotipo 2 (DENV2), sem a porção C-terminal da proteína E. Esta seqüência, contida entre osnucleotídeos 937 e 2131 do genoma completo do DENV2, cepaNova Guiné C (NGC) (Genebank: M29095) foi amplificada porPCR, utilizando os oligonucleotídeos senso e antisensò,identificados abaixo como SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, com ossitos para as enzimas de restrição EcoRV e XbaIsublinhados, respectivamente:
SEQ ID NO:3 - 5'GGGGGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3'SEQ ID NO:4 - 5'GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3'
Em seguida foi feita a clonagem da seqüência noplasmídeo pcTPA entre os sítios das enzimas de restriçãoEcoRV e XbaIr no mesmo quadro aberto de leitura daseqüência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando oplasmídeo pElD2 conforme figura IB.
0 plasmídeo pE2D2 foi construído com a inserção daseqüência que codifica o domínio III da proteína E deDENV2, contida entre os nucleotídeos 1822 e 2131 do genomacompleto de DENV2, cepa NGC (Genebank: M29095). Estaseqüência foi amplificada por PCRr utilizando osoligonucleotídeos senso e antisenso, identificados abaixocomo SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, com os sitos para asenzimas de restrição EcoRV e XbaI sublinhados,respectivamente:
SEQ ID NO:5 - 5'GGGGGATATCGGAATGTCATACTCTATG3'SEQ ID NO:4 - 5'GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3'
Em seguida foi feita a clonagem da seqüência noplasmídeo pcTPA entre os sítios das enzimas de restriçãoEcoRV e Xbalr no mesmo quadro aberto de leitura daseqüência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando oplasmídeo pE2D2 conforme figura IC.
Todas as clonagens foram confirmadas porsequenciamento. A bactéria Eseheriehia colif cepa DH5-<x,foi utilizada para as clonagens e produção dos plasmídeosem pequena e grande escala.
Os plasmídeos foram isolados pelo método de extraçãoalcalina, purificados em coluna de troca iônica (Qiagen) deacordo com as instruções do fabricante, ressuspensos emágua miliQ estéril e estocados a -20°C até a suautilização.
Exemplo 3 - Virus quimérico 17D-D2
0 vírus quimérico 17D-D2 foi construído trocando-se osgenes que codificam as proteínas de membrana (prM) e doenvelope (E) do vírus vacinai da febre amarela YF 17DDpelos genes que codificam as proteínas prM e E de DENV2,cepa NGC. Detalhes da construção do vírus quimérico 17D-D2podem ser encontrados em Cafour et al., 2001.
Para a construção da quiméra 17D-D2, foi utilizada aabordagem do cDNA infeccioso de febre amarela, desenvolvidopor Rice et al., 1989, que consiste em dois plasmídeos:pYF5'3'IV e pYFM5.2. Nesta abordagem o genoma do vírus defebre amarela foi separado nos dois plasmídeos citadosanteriormente, dada a falta de estabilidade de algumasseqüências virais em plasmídeos de alto número de cópias.Estes plasmídeos foram digeridos com enzimas de restriçõesespecíficas e os fragmentos gerados foram ligados,reconstituindo o genoma completo do vírus vacinai de febreamarela. Entretanto, testes em macacos com este vírusindicaram a necessidade de modificações genéticas do cDNApara tornar o vírus mais atenuado (Marchevsky et al.,1995). Tais modificações foram realizadas por Galler eFreire (ÜS 6,171,854) e resultaram em novas versões dosplasmídeos pYF5'3'IV e pYFM5.2, denominados Gl/2 e T3/27,respectivamente. Posteriormente, foi utilizado o plasmídeoPACNR1180 (Ruggli et al., 1996) que possui uma origem dereplicação (P15A), que limita o número de replicações desteplasmídeo, reduzindo assim o número de cópias do DNAplasmidial em bactérias. O plasmídeo pACNR1180 foi descritocomo um plasmideo ideal para clonagem do genoma do vírus defebre suína, cujo tamanho se assemelha ao do genoma dovírus da febre amarela, permitindo a estabilidade do genomaclonado. Tendo em vista estes resultados, o genoma inteirodo vírus de febre amarela foi clonado em um plasmídeomodificado do pACNR1180 (com a retirada de alguns sítios deenzimas de restrição), gerando o plasmídeo pYF17D/14. 0plasmídeo pYF17D/14 foi gerado em duas etapas. Primeiro oplasmídeo Gl/2 foi utilizado como molde para amplificaçãopor PCR de diferentes fragmentos que foram inseridos noplasmídeo modificado do pACNR1180, gerando o plasmídeoNSK7. Posteriormente, o plasmídeo NSK7 foi utilizado para aclonagem do restante do genoma do vírus vacinai 17D contidono plasmídeo T3/27, gerando então o plasmídeo pYF17D/14.Todos os plasmídeos foram propagados em E. coli MC1061 epurificados em coluna Qiagen. Para a construção da quimera17D-D2 foi utilizado o vírus DENV2 cepa Nova Guiné. Foisintetizado um cDNA, de modo semelhante ao descritoanteriormente para as clonagens nas vacinas de DNA, quecontinha a região do genoma do vírus da dengue que vai doprimeiro nucleotídeo correspondente ao gene que codifica aproteína prM até a seqüência correspondente ao aminoácido205 da proteína E. Esta região foi amplificada por PCR einserida no plasmídeo Gl/2 entre os sítios para as enzimasde restrição ApaI e NotIr gerando o plasmídeo pGl/2 DEN2. 0cDNA contendo o genoma completo 17D-D2 foi construído apartir da ligação dos fragmentos: NotI/NsiI gerado comdigestão do plasmídeo pGl/2 DEN2 (com o promotor SP6, aregião 5' NTR-C de febre amarela e prM-2/3E de DENV2),Nsil/MluI gerado com a digestão do plasmideo pYFD/Fll/12(codificando a região 3' de E de DENVl e o inicio do geneNSl de febre amarela), e Mlul/Notl gerado com a digestãodo plasmideo pYF17D/14 (que contém o restante do genoma defebre amarela). Todos os plasmideos foram propagados em E.coli XL-I Blue e purificados com Concert High Purity System(Invitrogen). O plasmideo completo foi linearizado com XhoIe utilizado para a transcrição in vitro, através da regiãopromotora SP6. O RNA sintetizado in vitro foi utilizadopara a regeneração viral por eletroporação de células Verode modo similar ao descrito no documento US 6,171,854.Exemplo 4 - Avaliação da expressão das proteínasrecombinantes
A expressão das proteínas recombinantes foi avaliadain vitro em células de rim de hamster neonatos (BHK-21)transfectadas com os diferentes plasmideos, utilizandolipofectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções dofabricante. A expressão das proteínas El e E2 foi detectadapor imunofluorescência nas células BHK transfectadas eobservadas em microscópio óptico de fluorescênciautilizando fluido ascítico anti-DENV2 (ATCC) e anticorposanti-IgG de camundongo conjugados a fluoresceína (SouthernBiotechnology). Somente as células transfectadas com osplasmideos com os plasmideos PE1D2 e PE2D2 se mostraramfluorescentes, demonstrando que estas construções sãocapazes de mediar a expressão das proteínas do vírus dadengue em células de mamíferos, conforme Figura 2Exemplo 5 - ImunizaçõesForam realizados dois experimentos independentes paratestar o potencial protetor das vacinas de DNA isoladamenteou em conjunto com o vírus quimérico 17D-D2 no sistema dedose/reforço, utilizando camundongos BALB/c com cerca de 4semanas de idade.
Para as imunizações com as vacinas de DNA, osplasmídeos foram diluídos em PBS (concentração final lx) eos animais foram inoculados por via intramuscular (im) nosquadrícepes posteriores com 100μ9/100μΙ, da vacina de DNApor animal (δΟμς/δΟμΙ, por pata) . Para as imunizações com ovírus quimérico 17D-D2, os animais foram inoculados por viasubcutânea (sc) no coxim plantar ou intramuscular (im) nosquadrícepes posteriores, com 4 Iog 10 PFU de vírus diluídoem meio Ml 99 (Sigma) ou em PBS. 0 plasmídeo pcTPA foiutilizado como controle negativo.
Foi realizado um terceiro experimento com imunizaçõessimultâneas (co-administração) de vacinas de DNA e 17D-D2por via im. Neste caso, as duas vacinas foram misturadas emuma só solução com PBS.
°s animais foram separados em grupos (10 camundongospor grupo). Em seguida os animais foram imunizados a cadaduas semanas e duas semanas após a última imunização osanimais foram desafiados com inoculação por viaintracerebral (ic) de uma dose letal de DENV2 NGC (3,8LD50), neuroadaptado a camundongos. Em seguida, os animaisforam avaliados diariamente até o 21° dia quanto àmorbidade (desenvolvimento de paralisia, principalmente nosmembros posteriores) e sobrevivência.
Os cronogramas das imunizações estão representados naFigura 3. As Tabelas 1, 2 e 3 a seguir mostram os esquemasde imunização.
A Tabela 1 mostra o esquema de imunização do primeiroexperimento com protocolo de dose e reforço (prime/boost)ou imunizações individuais.
TABELft 1
<table>table see original document page 27</column></row><table>
A Tabela 2 mostra o esquema de imunização do segundoexperimento com protocolo de dose e reforço (prime/boost)ou imunizações individuais.<table>table see original document page 28</column></row><table>
A Tabela 3 mostra o esquema de imunização do terceiroexperimento com protocolo de imunização simultânea (co-administração) .<table>table see original document page 28</column></row><table>
Resultados de Proteção - Primeiro Experimento
5 No primeiro experimento os sinais clínicos da doença
foram detectados entre o sétimo e o oitavo dia após odesafio com DENV2 nos grupos dos animais não imunizados ouaqueles que receberam o plasmídeo controle (pcTPA). Trezedias após o desafio, 100% destes camundongos apresentaram10 paralisia ou morte. Por outro lado, 100% dos animaisvacinados com somente 2 doses de pElD2, 2 doses de pElD2 +1 dose de 17D-D2, ou 2 doses de 17D-D2, sobreviveram aodesafio.
Quanto ao aparecimento de sinais clínicos, somente ogrupo de camundongos imunizados com 2 doses de pElD2 + 1dose de 17D-D2 não apresentou qualquer sinal.
0 grupo de animais que recebeu somente o plasmideopElD2 ou o virus 17D-D2 apresentou 10% e 20% de paralisia,respectivamente, conforme mostrado nas Figuras 3A e 3B.
A vacina pE2D2 se mostrou menos protetora quandocomparada à vacina pElD2. Somente 50% dos animaisimunizados com 2 doses de pE2D2 sobreviveram ao desafio e70% apresentaram morbidade. Por outro lado, 100% dosanimais imunizados com 2 doses de pE2D2 + 1 dose de 17D-D2sobreviveram ao desafio e somente 10% destes camundongosapresentaram algum sinal clinico da doença, conformemostrado nas Figuras 3A e 3B.Resultados de Proteção - Segundo Experimento
No segundo experimento as proporções de sobrevivênciae morbidade nos grupos de animais imunizados com osplasmídeos pElD2 e pE2D2 isoladamente ou no sistema de dosee reforço (vacina de DNA + 17D-D2) foram semelhantes aosdados obtidos no primeiro experimento. Mais uma vez aimunização no sistema de dose e reforço se mostrou maiseficiente gerando 100% de proteção, conforme Figuras 3C,3D, 4C e 4D.
Resultados de Proteção - Terceiro ExperdLmentoAs imunizações simultâneas pElD2 + 17D-D2 e pE2D2 +17D-D2 se mostraram tão eficientes quanto as imunizações nosistema dose/reforço, induzindo proteção em 100% dosanimais, independente da via de inoculação do virus 17D-D2(im ou sc), sem o aparecimento de qualquer sinal clinico dadoença.Nenhuma das vacinas administradas isoladamente (vacinade DNA ou quimera 17D-D2) induziu proteção sem odesenvolvimento de paralisia em nenhum dos animais testados(Figuras 5).
Resultados de Soroneutralização
Para a detecção dos níveis de anticorposneutralizantes gerados com as vacinas testadas, os sorosdos animais foram coletados duas semanas após a imunizaçãocom as vacinas de DNA e/ou vírus quimérico (antes dodesafio com DENV) e 21 dias após o desafio com DENV2. Nosensaios de soroneutralização, os vírus DENV2 foramincubados com diferentes diluições dos soros doscamundongos imunizados e posteriormente foi avaliada acapacidade destes vírus infectar células Vero, através daformação das placas de Iise. O título de anticorposneutralizantes foi calculado a partir da redução de 50% dasplacas de Iise (PRNT50) .
Os resultados estão exemplificados na tabela 4, com ossoros dos animais utilizados no primeiro experimento deimunização no sistema de dose e reforço. Os resultadosdemonstram um aumento significativo dos níveis deanticorpos neutralizantes nos animais que receberam aimunização combinada no sistema de dose/reforço.
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A presente invenção foi exemplificada para DENV2,entretanto a construção de vacinas de DNA contra os demaissorotipos do virus dengue (DENV 1,3 e 4), obedece a mesmametodologia aqui descrita para o DENV2.
A(s) composição(ões) da presente invenção podem conterum veiculo farmacêeutico aceitável. Qualquer veiculofarmacêutico conhecido daqueles especialistas na arte podeser usado na(s) composição(ões) da presente invenção,dependendo do modo de administração.
O termo veiculo farmacêutico se refere a um diluente,adjuvante, excipiente, ou um veiculo com o qual a vacina deDNA ou o virus quimérico é administrado. Esses veículosfarmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água eóleo, incluindo aqueles de origem animal, vegetal ousintética. Excipientes farmacêuticos incluem amido,glucose, frutose, gelatina, malte, arroz, farinha, sílicagel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco,cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol,propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A(s)composição(ões) da presente invenção, se desejado, podemconter quantidades pequenas de agentes emulsificantes, ouagentes tamponadores de pH.
A presença de um veiculo farmacêutico dependerá daadministração da composição vacina. Por exemplo, para aadministração parenteral, tal como uma injeção subcutânea,o veiculo preferido consiste de água, solução salina,álcool, gorduras, ceras ou solução tampão. Paraadministração oral, podem ser empregados, manitol, lactose,amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco,celulose, glucose, sucrose e carbonato de magnésio.
Também podem ser usados agentes contendo umasubstância para proteger o antigeno de rápido catabolismo,tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral.
A presente invenção utilizou inoculação das vacinas deDNA por via im com duas doses DNA, com IOC^g por dose,administradas em intervalo de duas semanas. Também podemser utilizados números diferentes de doses (como uma, três,quatro, etc) com concentrações diferentes de DNA (variandode O.^g até lg), e administradas em intervalos de tempovariados (de 1 semana até 1 ano entre cada dose de DNA) .
As imunizações das vacinas de DNA da presente invençãoforam realizadas por via im através de injeções com agulha.Outras vias de imunização também podem ser utilizadas comopor exemplo por via intradérmica, subcutânea, transcutânea,intravenosa ou intraperitoneal. Tais inoculações podem seradministradas com ou sem auxilio de agulha. Como exemplo deinoculação sem agulhas, podemos citar a utilização deinoculação por biobalistica {Genegun), Bioejector, adesivos(pads), etc.
Na nova abordagem de imunização da presente invenção,ou seja, o sistema de dose (vacina de DNA) e reforço (virusquimérico 17D-D2) ou imunizações simultâneas (co-administração), as vacinas de DNA foram administradas porvia im através de seringas com agulhas e o virus quimérico17D-D2 foi inoculado também com seringas por via im ou sc.Para esta abordagen também poderão ser utilizadas outrasvias de inoculação com ou sem agulhas conformeexemplificado acima. As imunizações com vacinas de DNA e17D-D2 foram administradas em intervalos de duas semanas,tanto no sistema de dose e reforço quanto de co-administração. Tais inoculações também podem ser realizadascom intervalos de tempo variados (de 1 semana até 5 anos),com diferentes doses (uma, duas, três e etc) . Asconcentrações das vacinas de DNA inoculadas (100 μg pordose) assim como dos virus quiméricos (4 Iog 10 PFU) tambémpodem variar conforme adequação do protocolo.
No sistema de dose e reforço da presente invenção, aprimeira imunização (dose) foi realizada com vacinas de DNAenquanto que o reforço foi dado pela imunização com virusquimérico. Também é possível inverter este protocolo, com aprimeira imunização com virus quiméricos e o reforço comvacinas de DNA, administradas em intervalos variados.
A presente invenção utilizou o gene que codifica aproteína E do vírus da dengue. Também podem ser utilizadosoutros genes deste vírus, tais como as seqüências quecodificam as proteínas C (capsídeo), prM (membrana), NSl(não-estrutural 1) e NS3 (não-estrutural 3). A proteína NSljá foi testada em vacinas de DNA isoladas demonstrandopotencial protetor contra o vírus da dengue (Costa etal.,2006, 2007).
A nova abordagem de imunização da presente invençãoutiliza vacinas de DNA e vírus quimérico vacinai de febreamarela com genes do vírus da dengue (17D-D2). Estaabordagem também pode ser utilizada com vacinas de DNA evírus quimérico vacinai 17D contendo genes de outrosfIavivírus. A abordagem também pode ser usada com vacinasde DNA contendo genes de febre amarela e vírus vacinai 17D.
Assim, de acordo com a presente invenção é fornecida uma vacina efetiva contra o vírus dengue. Adicionalmente, ainvenção também demonstrou um novo método para induzirresposta imune contra vírus da dengue baseado em vacinas deDNA e vírus quiméricos 17D em imunizações combinadas, nosistema de dose (vacina de DNA) e reforço (vírus quimérico)ou co-administração simultânea das duas estratégiasvacinais (vacinas de DNA e vírus quiméricos em uma mesmaformulação). Uma composição vacinai e um kit compreendendovacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírus denguevírus quiméricos também é apresentado na presente invenção.
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<110> Fundação Oswaldo Cruz
<120> MÉTODO, KIT, PLASMÍDEO E COMPOSIÇÃO PARA INDUZIR RESPOSTA IMUNECONTRA VÍRUS DA DENGUE BASEADO VACINAS DE DNA E VÍRUS QUIMÉRICOS
<130> P1692
<160> 9
<170> Patentin version 3.5
<210> 1<211> 28<212> DNA
<213> Homo sapiens Cprimer senso t-PA)<400> 1
ggggaagctt atggatgcaa tgaagagg 28
<210> 2<211> 27<212> DNA
<213> Homo sapiens (primer antisenso t-PA)<400> 2
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<210> 3<211> 30<212> DNA
<213> Vírus dengue sorotipo 2 (primer senso E80%)<400> 3
gggggatatc atgcgttgca taggaatatc 30
<210> 4<211> 30<212> DNA
<213> Virus dengue sorotipo 2 (primer antisenso E80%)<400> 4
ggggtctaga ttacgataga acttcctttc
<210> 5<211> 28<212> DNA
<213> Vírus dengue sorotipo 2 (primer senso domínio Iii E)<400> 5
gggggatatc ggaatgtcat actctatg
<210> 6<211> 1203<212> DNA
<213> Vírus dengue sorotipo 2 (E80%)<400> 6
atgcgttgca taggaatatc aaatagagac tttgtagaag gggtttcagg aggaagctgg 60
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<210> 7<211> 318<212> DNA
<213> vírus dengue sorotipo 2 (domiii Ε)<400> 7
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<210> 8<211> 69<212> DNA
<213> Homo sapiens (peptídeo sinal t-PA)<400> 8
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<210> 9<211> 1983<212> DNA
<213> Vírus dengue (prM/E)<400> 9
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tcccaagaag gggccatgca cacagcactc acaggggcca cagaaatcca gatgtcatca 1320
ggaaacttac tgttcacagg acatctcaag tgcaggctga ggatggacaa actacagctc 1380
aaaggaatgt catactctat gtgcacagga aagtttaaag ttgtgaagga aatagcagaa 1440
acacaacatg gaacaatagt tatcagagta caatatgaag gggacggttc tccatgtaag 1500
atcccttttg agataatgga tttggaaaaa agacatgttt taggtcgcct gattacagtc 1560
aacccaatcg taacagaaaa agatagccca gtcaacatag aagcagaacc tccattcgga 1620
gacagctaca tcatcatagg agtagagccg ggacaattga agctcaactg gtttaagaaa 1680
ggaagttcta tcggccaaat gattgagaca acaatgaggg gagcgaagag aatggccatt 1740
ttaggtgaca cagcttggga ttttggatcc ctgggaggag tgtttacatc tataggaaag 1800
gctctccacc aagttttcgg agcaatctat ggggctgcct tcagtggggt ctcatggatt 1860
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atgaaaatcc tcataggagt cattatcaca tggataggaa tgaattcacg cagcacctca 1920
ctgtctgtgt cactagtatt ggtgggagtc gtgacgctgt atttgggagt tatggtgcag 1980
9CC 1983
Página 4
Claims (10)
1. Método para induzir resposta imune contra vírus dadengue caracterizado por compreender a administração a umpaciente de vacinas de DNA e vírus quiméricos 17D.
2. Método de acordo com a reivindicação 1caracterizado pela administração ao paciente ser efetuadaem imunizações combinadas, no sistema de dose (vacinas deDNA) e reforço (vírus quiméricos) ou co-administraçãosimultânea das duas estratégias vacinais (vacinas de DNA evírus quiméricos em uma mesma formulação).
3. Composição vacinai contra o vírus denguecaracterizado por compreender:(a) Vacinas de DNA contra os quatro sorotipos dovírus dengue a partir da construção de diferentesplasmídeos recombinantes contendo os genes que codificam asproteínas E a partir de cada sorotipo viral do vírusdengue, ou somente as seqüências que correspondem aosdomínios III destas proteínas, todas fusionadas à seqüênciaque codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogêniode tecido humano (t-PA);(b) Vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai defebre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtençãode clone infeccioso, com a substituição das seqüências quecodificam as proteínas prM e E de febre amarela pelasseqüências que codificam as proteínas prM e E dos vírusdengue dos diferentes sorotipos; e,(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3caracterizado a vacina de DNA por compreender:- plasmideo pEl construído com a inserção da seqüênciaque codifica 80% da proteína do envelope viral (E) do vírusda dengue, sem a porção C-terminal da proteína E do vírusda dengue.
5. Composição de acordo com a reivindicação 3caracterizado a vacina de DNA por compreender:- um plasmideo pE2 construído com a inserção daseqüência que codifica o domínio III da proteína E do vírusda dengue, contida entre os nucleotídeos 1822 e 2125 dogenoma completo do vírus da dengue.
6. Kit caracterizado por compreender:(a) Vacinas de DNA contra os quatro sorotipos do vírusdengue a partir da construção de diferentes plasmídeosrecombinantes contendo os genes que codificam as proteínas15 E a partir de cada sorotipo viral do vírus dengue, ousomente as seqüências que correspondem aos domínios IIIdestas proteínas, todas fusionadas à seqüência quecodifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio detecido humano (t-PA); e,(b) vírus quiméricos compreendendo o vírus vacinai defebre amarela 17D modificado, pela tecnologia de obtençãode clone infeccioso, com a substituição das seqüências quecodificam as proteínas prM e E de febre amarela pelasseqüências que codificam as proteínas prM e E dos vírusdengue dos diferentes sorotipos.
7. Plasmideo recombinante contendo o gene da proteínaE a partir de cada sorotipo viral do vírus dengue fusionadoà seqüência que codifica o peptídeo sinal do t-PAcaracterizado por ser construído com a inserção daseqüência que codifica 80% da proteína do envelope viral(E) do vírus da dengue sem a porção C-terminal da proteínaE, onde a dita seqüência é amplificada utilizando osoligonucleotídeos senso e antisenso, identificados como SEQID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e em seguida efetuada a clonagem daseqüência no plasmídeo pcTPA entre os sítios das enzimas derestrição EcoRV e XbaIl no mesmo quadro aberto de leiturada seqüência que codifica o peptídeo sinal t-PA, gerando oplasmídeo recombinante.
8. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 7caracterizado por a seqüência que codifica 80% da proteínado envelope viral (E) do vírus da dengue estar contidaentre os nucleotídeos 937 e 213125 do genoma completo doDENV2, cepa Nova Guiné C (NGC) (Genebank: M29095).
9. Plasmídeo recombinante contendo o gene da proteínaE a partir de cada sorotipo viral do vírus dengue fusionadoà seqüência que codifica o peptídeo sinal do t-PAcaracterizado por ser construído com a inserção daseqüência que codifica o domínio III da proteína E do vírusda dengue, onde a dita seqüência é amplificada utilizandoos oligonucleotídeos senso e antisenso, identificados comoSEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:4, entre os sítios para as enzimasde restrição £coRV e XbaI e em seguida realizada a clonagemda seqüência no plasmídeo pcTPA entre os sítios das enzimasde restrição £coRV e Xbalr no mesmo quadro aberto deleitura da seqüência que codifica o peptídeo sinal t-PA,gerando o plasmídeo recombinante.
10. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 9caracterizado por a seqüência que codifica o domínio III daproteína -E do vírus da dengue estar contida entre osnucleotídeos 1822 e 213125 do genoma completo de DENV2,cepa NGC (Genebank: M29095).
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