CN116635521A - 减毒的猪流行性下痢病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开案提供PEDV的C末端截短的刺突蛋白。还提供包括所述刺突蛋白的核酸序列和包含所述刺突蛋白的病毒，以及使用方法。

Description

减毒的猪流行性下痢病毒
背景技术
猪流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea；PED)具有高度传染性且以猪、尤其是乳猪崽的脱水、下痢以及高死亡率为特征。病原体猪流行性下痢病毒(PEDV)是单股正义RNA病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)的α冠状病毒属(Alphacoronavirus)。PEDV具有约28kb的总基因组大小且含有7个开放阅读框架。PEDV感染的症状通常与由传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪δ冠状病毒(PDCoV)引起的感染的症状类似，所述两种病毒也是冠状病毒科的成员，应注意，一般没有观察到PEDV与TGEV之间的交叉保护，其总体病毒核苷酸序列有至多约60％类似。
PED可能是在1970年前后于欧洲首次观察到，且随后，所述致病性病毒得以表征(参见例如M.Pensaert等人,《病毒学文件(Arch.Virol)》,第58卷,第243-247页,1978；和D.Chasey等人,《兽医科学研究(Res.Vet Sci)》,第25卷,第255-256页,1978)。在北美洲，PEDV直至2013年才鉴别出来，此时开始大规模爆发，且导致养猪业出现严重经济损失。病毒在数天内出现在多个广泛分布的母猪群中，且其已扩散到至少32个国家。生产商预计未处理的新生猪崽可能会出现高达100％损失。提出的管控感染的建议包括实施严格的生物安保和/或有意使整个猪群暴露于PEDV以获得免疫。
在1970年代和1980年代期间，PEDV在欧洲若干个国家引起大规模流行；但自1990年代起，PED在欧洲已变得罕见，仅偶然有爆发。这一经典PEDV病毒株随后扩散至亚洲国家，例如日本、中国、韩国等。自2010年起，已报道在中国出现严重PED流行性爆发且自这些爆发所回收的PEDV在基因上不同于经典PEDV病毒株。在美国出现的初始PED爆发与在中国观察到的PED爆发具有类似的临床表现。序列分析揭露，原始的美国PEDV(下文称为美国PEDV原型病毒株)在基因上与2011-2102年间在中国流行的一些PEDV最为类似。2014年1月，在美国猪群中鉴别出PEDV变异病毒株，相较于美国PEDV原型病毒株，所述PEDV变异病毒株在刺突蛋白基因中具有插入和缺失(insertions and deletions；INDEL)。这一变异病毒株命名为U.S.PEDV S-INDEL变异病毒株。PED在美国爆发之后，已报道在加拿大、墨西哥、韩国和日本检测到美国原型样PEDV；已报道在韩国、日本、德国、比利时、法国和葡萄牙检测到U.S.S-INDEL变异型样PEDV。另外，也在中国台湾检测到美国原型样PEDV。当前，PEDV仍为全球养猪业的重大威胁。仍特别需要针对PEDV的减毒活疫苗，尤其是当经口施用时可能有效的疫苗。
发明内容
在一个方面中，本发明提供一种猪流行性下痢病毒(PEDV)的C末端截短的刺突蛋白，其缺乏SEQ ID NO:1(YEVFEKVHVQ)或包含SEQ ID NO:1的序列且包含与SEQ ID NO:2至少90％一致的氨基酸序列或其C末端截短的变异体，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1200个氨基酸长。
根据这一方面的不同实施例，所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白可以是至少1250个氨基酸长，或至少1300个氨基酸长，或至少1370个氨基酸长。
根据这一方面的不同实施例，所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白可与SEQ ID NO:2至少95％一致，或与SEQ ID NO:2至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％一致或100％一致)。在某些实施例中，SEQ ID NO:2和与其至少90％一致(也就是说，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致)的序列之间不同的氨基酸是保守取代物。
在第二方面中，公开一种核酸序列，所述核酸序列包含编码根据本发明第一方面的任何实施例的PEDV的C截短的刺突蛋白的聚核苷酸序列。
在第三方面中，本公开案提供一种病毒，其包含根据本发明第一方面的任何实施例的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，或所述病毒包含根据本发明第二方面的任何实施例的核酸序列。
在第四方面中，本发明提供一种包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在第五方面中，本发明提供包含根据本发明第四方面的氨基酸序列的PEDV。
在第六方面中，本发明提供一种PEDV的C末端截短的刺突蛋白，其中所述C末端截短的刺突蛋白与SEQ ID NO:3至少90％一致，前提是这一PEDV的C末端截短的刺突蛋白包含SEQ ID NO:4。在这一第五方面的不同实施例中，所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白可与SEQID NO:3至少95％一致，或与SEQ ID NO:3至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％一致或100％一致)。在某些实施例中，SEQ ID NO:2和与其至少90％一致(也就是说，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致)的序列之间不同的氨基酸是保守取代物。
在第七方面中，本发明提供一种包含ORF-2和ORF 3的PEDV，前提是所述病毒在所述ORF2/ORF3中包含第一缺失，其中所述第一缺失是SEQ ID NO:6的缺失或包含SEQ ID NO:6的核酸序列的缺失，前提是所述病毒表达包含SEQ ID NO:3或与其至少90％一致的序列的氨基酸序列，其另一限制条件为，所述SEQ ID NO:3的C末端氨基酸是QPLAL(SEQ ID NO:4)。
根据此第七方面中的某些实施例，本发明的PEDV进一步在所述ORF-3中包含第二缺失，其中所述第二缺失是SEQ ID NO:7的缺失或包含SEQ ID NO:7的核酸序列的缺失。在某些实施例中，第一缺失与第二缺失不同。
在某些实施例中，所述PEDV包含编码E、M和N蛋白质的野生型ORF。在某些实施例中，本发明的PEDV缺乏由ORF-3表达的功能蛋白。
在某些实施例中，所述病毒具有根据SEQ ID NO:10或与其至少90％一致的序列的基因组。
在一些实施例中，所述病毒是来源于PEDV病毒株DJ。
在第八方面中，本发明提供一种疫苗，其中所述疫苗包含根据本发明第三方面、第五方面和/或第七方面的任何实施例的病毒。
在这一第八方面的某些实施例中，所述病毒是减毒病毒。
在第九方面中，本发明提供一种预防猪动物感染PEDV的方法，其包含向所述猪施用根据本发明第八方面的任何实施例的疫苗。
在某些实施例中，所述疫苗是经口施用。
在某些实施例中，所述猪动物是母猪，其中所述疫苗是在分娩之前约28-42天施用且其中另外，所述疫苗是在分娩之前约17-21天施用。在某些实施例中，第一次疫苗接种和/或第二次疫苗接种是经口施用。
在第十方面中，本发明提供保护猪崽免于感染PEDV的方法，其包含向所述猪崽施用来自用根据本发明第八方面的任何实施例的疫苗进行疫苗接种的母猪的初乳，其中所述母猪是在分娩之前约28-42天(例如35天)进行疫苗接种且其中另外，所述疫苗是在分娩之前约7-21天(例如14天)施用。在某些实施例中，第一次疫苗接种和/或第二次疫苗接种是经口施用。
在某些实施例中，所述猪崽是至少3天大。在其它实施例中，所述猪崽是至少五天大。
附图说明
图1是连续传代的病毒的核酸的电泳图。
图2是5次连续传代的病毒的核酸的电泳图。
图3是在分娩时经疫苗接种的母猪体内抗PEDV抗体水平的图解说明。
图4是用来自经疫苗接种的母猪的初乳饲喂的3-5天大猪崽体内抗PEDV抗体水平的图解说明。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，提供以下定义：
如应用于参考数字的术语“约”指的是所述值的参考数字±10。
术语“佐剂”指的是增强疫苗的有效性且可添加至包括免疫药剂的调配物中的化合物。佐剂提供增强的免疫反应，甚至在仅施用单次剂量的疫苗之后还如此。佐剂可包括例如胞壁酰基二肽、吡啶、氢氧化铝、溴化二甲基二(十八烷基)铵(dimethyldioctadecylammonium bromide；DDA)、油类、水包油型乳液、皂素、细胞因子和所属领域中已知的其它物质。适合佐剂的实例描述于美国专利申请公开案第US2004/0213817A1号中。“有佐剂”指的是并入佐剂或与佐剂组合的组合物。
如本文所使用，“减毒”PEDV指的是能够在易感宿主中感染和/或复制，但对于易感宿主无致病性或致病性较弱的PEDV。举例来说，相较于相关领域分离的病毒株，减毒病毒不会引起可观察/可检测的临床表达，或引起较少的临床表达或较少的严重临床表达，或展现病毒复制效率和/或感染性降低。PEDV感染的临床表达可包括不限于临床下痢、呕吐、嗜睡、体质衰弱和脱水。
术语“保守取代”指的是一个氨基酸经具有类似特性的另一个氨基酸置换。所属领域的技术人员将进一步了解，引起所编码的蛋白质氨基酸序列的修饰的核酸序列的改变可对所得到的蛋白质的三维结构具有极小(如果有的话)影响。举例来说，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可经编码例如甘氨酸的另一个疏水性较低的残基，或例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的疏水性较高的残基的密码子取代。类似地，预期使一个带负电残基取代另一个残基，例如天冬氨酸取代谷氨酸；或一个带正电残基取代另一个残基，例如赖氨酸取代精氨酸的变化还可以产生具有大体上相同的功能活性的蛋白质。
以下六组各自含有互为典型保守取代的氨基酸：[1]丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；[2]天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；[3]天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；[4]精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；[5]异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和[6]苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(参见例如美国专利公开案20100291549)。
“抗原决定基”是具有免疫活性的抗原决定子，也就是说，在施用宿主后，其能够引起体液型(B细胞)和/或细胞型(T细胞)免疫反应。其是在分子层面上具有抗原性的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原性抗原决定基。在动物中，大部分抗原将同时呈现若干个或甚至许多个抗原决定子。这类多肽还可以适合作为免疫原性多肽且可如另外所描述来鉴别抗原决定基。
如本文所使用，术语“免疫原性片段”指的是多肽或多肽片段，或编码其的核苷酸序列，其包含等位基因特异性模体、抗原决定基或其它序列，由此使所述多肽或所述片段将结合MHC分子且诱导针对作为免疫原性多肽或免疫片段来源的抗原的细胞毒性T淋巴球(“CTL”)反应，和/或B细胞反应(例如产生抗体)，和/或T辅助淋巴球反应，和/或延迟型过敏(DTH)反应。DTH反应是一种免疫反应，在所述免疫反应中，T细胞依赖性巨噬细胞活化和发炎引起组织损伤。针对抗原皮下注射的DTH反应通常用作细胞介导的免疫的分析。
术语“诱导免疫保护性反应”意思是一种(体液型和/或细胞型)免疫反应，相较于健康对照，其减少或消除受感染个体的一种或多种疾病症状，也就是说，临床征象、病变、组织中的细菌分泌和细菌复制。优选地，相较于对照，所述症状减少具有统计学显著性。
“药学上可接受的载体”意思是在所属领域中用于制造和施用疫苗的任何常规的药学上可接受的载体、媒剂或赋形剂。药学上可接受的载体典型地为无毒的惰性固体或液体载体。
术语“猪(Porcine)”和“猪(swine)”在本文中可互换使用且指作为猪科成员的任何动物，例如猪(pig)。
如本文所使用，“易感”宿主指的是可被PEDV感染的细胞或动物。当引入易感动物时，减毒PEDV还可以诱导针对PEDV或其抗原的免疫反应，且由此使动物具有针对PEDV感染的免疫力。
“治疗有效量”指的是将在接受抗原或疫苗的个体体内诱导免疫反应的抗原或疫苗的量，所述量足以预防或减少由例如感染病毒或细菌的病原体所引起的疾病的征象或症状，包括不良健康影响或其并发症。可以诱导体液免疫性或细胞介导的免疫性、或体液和细胞介导的免疫性两者。动物针对疫苗的免疫原性反应可以例如通过测量抗体效价、淋巴球增殖分析间接评估，或通过监测在用野生型病毒株攻击之后的征象和症状直接评估。由疫苗赋予的保护性免疫可以通过测量例如临床征象的减少来评估，所述临床征象例如个体的死亡率、发病率、温度数、总体身体状况以及总体健康状况和性能。疫苗的治疗有效量可以取决于所用特定佐剂、所用特定抗原或个体的状况而改变，且可以由所属领域的技术人员确定。
“治疗”指的是预防这一术语所适用的病症、病况或疾病，或预防或减少这类病症、病况或疾病的一种或多种症状。
术语“疫苗”指的是一种抗原制剂，其用于产生针对疾病的免疫力，以便预防或改善感染的影响。疫苗典型地使用免疫有效量的免疫原与有效增强经疫苗接种的个体针对免疫原的免疫反应的佐剂的组合来制备。
PEDV是具有约28kb的正义单股RNA基因组的包膜病毒，具有5'帽和3'聚腺苷酸化尾。(Pensaert和De Bouck P.1978)。所述基因组包含5'非翻译区(UTR)、3'UTR和至少七个开放阅读框架(ORF)，所述ORF编码四种结构蛋白(刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N))和三种非结构蛋白(复制酶1a和1b以及ORF3)；这些ORF在基因组上按以下次序布置：5'-复制酶(1a/1b)-ORF2(又称为S)-ORF3-E-M-N-3'(Oldham J.1972；和Bridgen等人,1993)。最先表征的三个突然出现的北美PEDV基因组序列，即Minnesota MN(GenBank：KF468752.1)、Iowa IA1(GenBank：KF468753.1)和Iowa IA2(GenBank：KF468754.1)，具有28,038个核苷酸(nt)的相同大小，不包括聚腺苷尾，且与原型PEDV CV777病毒株(GenBank：AF353511.1)共有基因组组织。这三个北美PEDV序列共有99.8至99.9％核苷酸一致性。确切地说，病毒株MN和IA2在整个基因组内仅具有11个核苷酸差异。
出于本申请案的目的，所述序列是以DNA型式提供。所属领域的一般技术人员可毫无困难地将这些序列翻译成包含病毒基因组的RNA序列。
本发明人意外地发现，在ORF-2/ORF-3的区域中具有第一缺失的PEDV产生减毒且具有免疫原性(也就是说，针对野生型PED产生保护性反应)的病毒。在某些实施例中，第一缺失包含SEQ ID NO:6。这一序列开始于ORF-2且跨越包括ORF-3起始密码子在内的ORF3的近端部分。第一缺失不仅仅限于SEQ ID NO:6且可包括在SEQ ID NO:6上游或下游的序列。然而，应注意，由于由ORF2编码的刺突蛋白是PED的主要免疫原，因此第一缺失不可延伸至SEQ ID NO:6的上游以免损害所述刺突蛋白。
因此，本发明提供刺突蛋白的片段。刺突蛋白的片段缺乏SEQ ID NO:1。所述片段可进一步在C末端截短，但其应当一般为至少1200个氨基酸长，优选地为至少1300个氨基酸长，且更优选地为至少1370个氨基酸长。在某些实施例中，所述刺突蛋白的片段包含SEQ IDNO:2，或与其至少90％(或至少95％、96％、97％、98％)一致的序列。优选地，在与SEQ IDNO:2至少90％一致的序列和SEQ ID NO:2本身之间不同的氨基酸是保守取代。
所属领域的一般技术人员可了解，第一缺失引起ORF-2的框移且因此改变野生型刺突蛋白的C末端氨基酸序列。根据本发明的刺突蛋白片段缺乏SEQ ID NO:1。实际上，在最优选实施例中，刺突蛋白片段以QPLAL(SEQ ID NO:4)结束。
在一组最优选实施例中，本文所描述的刺突蛋白片段包含SEQ ID NO:3，或与其至少90％一致的序列，前提是SEQ ID NO:4存在于所述刺突蛋白片段的C末端或与SEQ ID NO:3至少90％一致的序列。所述序列一致性可较高(例如至少95％、96％、97％、98％或99％)且不同氨基酸是保守取代。
获得根据本发明的多肽的技术是所属领域中众所周知的。举例来说，可使用基因工程改造技术和重组DNA表达系统。
在另一方面中，本发明提供一种核酸序列，其编码根据以上描述的任何实施例的刺突蛋白片段。编码根据本发明第一方面的任何实施例的氨基酸序列的核酸分子还可以插入载体(例如重组载体)中，例如一种或多种非病毒载体和/或病毒载体中。非病毒载体可包括例如质粒载体(例如与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容)。示范性载体可包括例如PCR-ii、PCR3和pcDNA3.1(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.)的Invitrogen)、pBSii(加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla,Calif.)的Stratagene)、pet15(威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.)的Novagen)、pGEX(新泽西州皮斯卡塔威(Piscataway,N.J.)的PharmaciaBiotech)、pEGFp-n2(加利福尼亚州帕罗奥图(Palo Alto,Calif.)的Clontech)、pET1((Bluebacii，Invitrogen))、pDSR-α(PCT公开案第WO 90/14363号)和pFASTBACdual(纽约州格兰德岛(Grand island,NY)的Gibco-BRL)，以及Bluescript质粒衍生物(高拷贝数的基于COLe1的噬菌质粒，加利福尼亚州拉霍亚的Stratagene Cloning Systems)、设计用于克隆TAQ扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如TOPOTM TA试剂盒，/>质粒衍生物，加利福尼亚州喀斯巴德(Carlsbad,Calif.)的Invitrogen)。还可以使用细菌载体，包括例如志贺杆菌(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin；BCG)和链球菌(Streptococcus)(参见例如WO 88/6626；WO90/0594；WO 91/13157；WO 92/1796；和WO 92/21376)。载体可使用所属领域的技术人员广泛可用的标准重组技术构建。许多其它非病毒质粒表达载体和系统是所属领域中已知的且都可以使用。
在第三方面中，本发明提供一种载体，其包含根据本发明第二方面的核酸序列。已成功用于将核酸引入宿主的各种病毒载体尤其包括反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒。病毒载体可使用所属领域的技术人员广泛可用的标准重组技术构建。参见例如《分子克隆实验指南(Molecular cloning:a laboratory manual)》(Sambrook和Russell:2000,Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN:0879695773)；和《现代分子生物学实验指南(Current protocols in molecular biology)》(Ausubel等人,1988+更新,Greene Publishing Assoc.,纽约(New York)；ISBN:0471625949)。
在某些实施例中，载体是病毒载体，且病毒是PEDV。
因此，本发明提供一种PEDV，其包含以上描述的第一缺失和/或刺突蛋白片段。我们可了解，第一缺失包括在ORF-3上的起始密码子，由此除去所述ORF。因此，本发明的PEDV缺乏由野生型ORF-3表达的功能蛋白。
然而，归因于所述缺失，产生新ORF，称为“新ORF”或“新产生的ORF”等。自NCBI网站公开获得的ORF Finder软件对这种新ORF(SEQ ID NO:9)进行的概念性翻译揭露，SEQ IDNO:5是这种新ORF的表达产物。因此，在另一方面中，本发明提供一种PEDV，其表达SEQ IDNO:5的氨基酸序列且在某些实施例中，包含SEQ ID NO:9的ORF。
以上描述的蛋白质和/或核酸序列一致性方法适用于本文所描述的所有蛋白质和/或核酸。用于评估序列一致性和/或相似性的多序列比较算法和程序是所属领域中已知的。对于序列比较，典型地一个序列充当参照序列(例如本文所公开的序列)，以供与测试序列相比较。序列比较算法接着基于程序参数来计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。
两个氨基酸或两个核酸序列的一致性百分比可例如通过使用计算机程序GAP比较序列信息来测定，所述计算机程序GAP是Genetics Computer Group(GCG；威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))Wisconsin软件包10.0版程序，GAP(Devereux等人(1984),《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》12:387-95)。在计算一致性百分比时，典型地以在序列之间得到最大匹配的方式比对所比较的序列。GAP程序的优选默认参数包括：(1)用于核苷酸的一元比较矩阵的GCG实施方案(对于一致性，含有值1且对于非一致性含有值0)，以及如《多肽序列和结构图谱(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)》,Schwartz和Dayhoff编,National Biomedical Research Foundation,第353-358页(1979)中所描述的Gribskov和Burgess((1986)《核酸研究》14:6745)的加权氨基酸比较矩阵或其它类似的比较矩阵；(2)每个空位的罚分为8且氨基酸序列每个空位中的每个符号的额外罚分为2，或每个空位的罚分为50且核苷酸序列每个空位中的每个符号的额外罚分为3；(3)末端空位无罚分；和(4)较长空位无最大罚分。
序列一致性和/或相似性还可以通过使用Smith和Waterman,1981,《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482的局部序列一致性算法；Needleman和Wunsch,1970,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443的序列一致性比对算法；Pearson和Lipman,1988,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)》85:2444的搜索相似性方法；这些算法的计算机化实施方案(Wisconsin遗传学软件包中的BESTFIT、FASTA和TFASTA；Genetics ComputerGroup,威斯康星州麦迪逊科学大道575号(575Science Dr.))来测定。
有用算法的另一实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式逐对比对来产生一组相关序列的多序列比对。其还可以绘制显示用于产生比对的丛集关系的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle,1987,《分子进化杂志(J.Mol.Evol.)》35:351-360的渐进式比对方法的简化形式；所述方法类似于Higgins和Sharp,1989,CABIOS 5:151-153所描述的方法。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权的末端空位。
有用算法的另一实例是以下中描述的BLAST算法：Altschul等人,1990,《分子生物学杂志》215:403-410；Altschul等人,1997,《核酸研究》25:3389-3402；和Karin等人,1993,《美国国家科学院院刊》90:5873-5787。特别有用的BLAST程序是自Altschul等人,1996,《酶学方法(Methods in Enzymology)》266:460-480获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，其中大部分设定成默认值。可调参数是使用以下值设定：重叠间隔＝1、重叠分数＝0.125、字阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值且由程序本身根据特定序列的组成和用于搜索所关注序列的特定数据库的组成来确定；不过，所述值可经调整以增加灵敏度。
另一种有用算法是如Altschul等人,1993,《核酸研究》25:3389-3402所报道的带空位BLAST。带空位BLAST使用BLOSUM-62取代分数；设定为9的阈值T参数；用于触发无空位的延伸部分的两次命中法(two-hit method)，加入空位长度k，代价为10+k；Xu设定为16，且Xg在数据库搜索阶段设定为40，且在算法输出阶段设定为67。带空位的比对是通过对应于约22个位的分数触发。
在某些实施例中，根据本发明的病毒还在序列中包含第二缺失作为野生型ORF 3的一部分。优选地，此第二缺失包含SEQ ID NO:7(或由其组成)。
在某些优选实施例中，提供PEDV，其中所述病毒包含由SEQ ID NO:6组成的第一缺失和由SEQ ID NO:7组成的第二缺失。在一组更优选的实施例中，所述病毒的基因组序列包含SEQ ID NO:10或与其具有90％(例如95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高百分比)一致性的序列。优选地，不同核苷酸不会在所表达的氨基酸序列中产生显著(或任何)变化且为密码子优化的结果。本发明PEDV的E、M和N蛋白质的氨基酸序列优选地相较于野生型病毒没有改变，所述野生型病毒可属于基因型1或基因型2。PEDV基因型1的非限制性实例是CV777(Genbank寄存编号AF353511)，且基因型2的非限制性实例是DJ病毒株以及AJ1102病毒株(Genbank寄存编号JX188454)。基因型2病毒株的额外非限制性实例包括病毒株CH/ZJCS03/2012、CH/JXZS03/2014、CH/JXFX01/2014、CH/JXJJ08/2015、CH/JXGZ04/2015、CH/JXJA89/2015、CH/JXDX119/2016、CH/JXJGS11/2016、CH/JXWN13/2016、CH/JXJJ18/2017、CH/JXNC38/2017、CH/JX/01、CH/JX-1/2013、CH/JX-2/2013、AH2012、GD-B、BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011、AJ1102、GD-A、CH/GDGZ/2012、CH/ZJCX-1/2012、CH/FJZZ-9/2012。基因型2是2010年至2020年间中国和相邻国家在所述领域的主要基因型。根据本发明的病毒可由这些和其它亲本病毒株，通过传代培养或通过利用基因工程改造技术引入以上描述的突变得到。在其它实施例中，以上描述的病毒可通过细胞传代培养进一步减毒。因此，在其它实施例中，所述进一步减毒的病毒是基因组序列包含SEQ ID NO:10或与其90％一致的序列的病毒的子代。
本发明优选地包括疫苗组合物，其包含本发明的减毒活变异型PEDV和药学上可接受的载体。如本文所使用，表述“本发明的减毒活PEDV”涵盖任何减毒活PEDV病毒株，其包括本文所述的一种或多种变异。药学上可接受的载体可以是例如水、稳定剂、防腐剂、培养基或缓冲液。包含本发明的减毒PEDV的疫苗调配物可以悬浮液形式或以冻干形式或以冷冻形式制备。如果冷冻，那么可添加甘油或其它类似试剂以在冷冻时增强稳定性。一般来说，减毒活疫苗的优势包括感染物的所有相关免疫原性决定子以其天然形式呈现给宿主免疫系统，和由于免疫药剂能够在经疫苗接种的宿主中倍增而需要相对较少量的所述药剂。
使用于活疫苗的病毒减毒以使其致病性不足以大体上伤害经疫苗接种的目标动物可通过已知程序，优选地包括连续传代实现。以下参考文献提供用于冠状病毒减毒的各种通用方法，且适合使可用于实施本发明的任何病毒株减毒或进一步减毒：B.Neuman等人,《病毒学杂志(Journal of Virology)》,第79卷,第15号,第9665-9676页,2005；J.Netland等人,《病毒学(Virology)》,第399(1)卷,第120-128页,2010；Y-P Huang等人,“在受精卵减毒传代之后感染性支气管炎病毒分离株在基因组3'7.3kb的序列变化(Sequence changesof infectious bronchitis virus isolates in the 3'7.3kb of the genome afterattenuating passage in embryonated eggs)”,《禽类病理学(Avian Pathology)》,第36(1)卷,(摘要),2007；和S.Hingley等人,《病毒学》,第200(1)卷1994,第1-10页；参见美国专利第3,914,408号；以及Ortego等人,《病毒学》,第308(1)卷,第13-22页,2003。
本发明中需要的额外经基因工程改造的疫苗是通过所属领域中已知的技术制造。这类技术包括但不限于重组DNA的进一步操纵、重组蛋白质的氨基酸序列的修饰或取代等。
基于重组DNA技术的经基因工程改造的疫苗是例如通过鉴别编码负责在猪体内诱导较强免疫或保护性反应的蛋白质(例如来源于M、GP2、GP3、GP4或GP5的蛋白质等)的病毒基因的替代性部分来制备。病毒蛋白质基因的各种亚型或分离株可经历DNA改组方法。所得异质嵌合病毒蛋白质可广泛用于保护性次单位疫苗中。或者，可将这类嵌合病毒基因或免疫显性片段克隆至标准蛋白质表达载体，例如杆状病毒载体中，并用于感染适当宿主细胞(参见例如O'Reilly等人,“杆状病毒表达载体实验室手册(Baculovirus ExpressionVectors:A Lab Manual)”,Freeman&Co.,1992)。培养宿主细胞，由此表达所需疫苗蛋白质，所述蛋白质可纯化至所需程度且调配成适合疫苗产物。
如果克隆保持任何非所需的天然致病能力，那么还可以正确定出病毒基因组中引起任何残余毒力的核苷酸序列且通过例如定点突变诱发对病毒进行基因工程改造而使其变成无毒的。定点突变诱发能够进行一个或多个核苷酸的添加、缺失或变化(参见例如Zoller等人,DNA 3:479-488,1984)。合成含有所需突变的寡核苷酸且将其与单股病毒DNA的一部分黏接。使用由所述程序产生的杂交分子对细菌进行转化。接着，使用经分离的含有适当突变的双股DNA，通过将其与全长DNA的限制性片段连接，随后转染至适合细胞培养物中来产生所述全长DNA。基因组连接至适于转移的载体中可通过所属领域的一般技术人员已知的任何标准技术实现。将载体转染至宿主细胞中以产生病毒子代可使用任何常规方法进行，例如磷酸钙或DEAE-聚葡萄糖介导的转染、电穿孔、原生质粒融合和其它众所周知技术(例如Sambrook等人,“分子克隆实验指南”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。接着，所克隆的病毒展现所需突变。或者，可合成含有适当突变的两种寡核苷酸。可黏接这些寡核苷酸以形成双股DNA，所述双股DNA可插入病毒DNA中以产生全长DNA。
将免疫有效量的本发明疫苗施用需要防止病毒感染的猪。接种猪的免疫有效量或免疫原性量可通过常规测试容易地确定或容易地滴定。有效量是针对疫苗的免疫反应足以保护暴露于PEDV的猪的量。优选地，保护猪达到病毒疾病的一种或所有不良生理学症状或影响显著减少、改善或得到完全预防的程度。
本发明的疫苗可遵循公认的惯例调配以包括动物可接受的载体，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，且还可以经调配以促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张性添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它适合疫苗媒剂和添加剂，包括特别适用于调配经改进活疫苗的媒剂和添加剂，是所属领域的技术人员已知或显而易知的。参见例如《雷明顿氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Science)》,第18版,1990,Mack Publishing，其以引用的方式并入本文中。
根据本发明的疫苗可以通过多种方式施用，包括不限于经口、皮下、肌肉内、皮内、静脉内等。
调配用于黏膜施用(经口、鼻内、经直肠)的本发明的疫苗可用黏膜黏附剂，例如壳聚糖调配。
调配成通过注射或输注施用的本发明的疫苗可进一步包含一种或多种额外免疫调节组分，例如佐剂或细胞因子等。可用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(蒙大拿州汉米尔顿(Hamilton,Mont.)的Ribi公司)；明矾；矿物凝胶，例如氢氧化铝凝胶；水包油型乳液、油包水型乳液，例如弗氏完全和不完全佐剂(Freund'scompleteand incomplete adjuvants)；嵌段共聚物(乔治亚州亚特兰大(Atlanta,Ga.)的CytRx)；QS-21(马萨诸塞州剑桥(Cambridge Mass.)的Cambridge Biotech公司)；SAF-M(加利福尼亚州爱莫利维尔(Emeryville Calif.)的Chiron)；佐剂；皂素、Quil A或其它皂素级分；单磷酰基脂质A；离子性多糖；以及阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂。可用于本发明疫苗中的水包油型乳液的非限制性实例包括经改进的/>62和/>1/2调配物。经改进的/>62是一种水包油型乳液，其含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)85清洁剂(ICI Surfactants)、0.7％(v/v)/>80清洁剂(ICI Surfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇以及0.5％(v/v)卵磷脂。经改进的SEAM 1/2是一种水包油型乳液，其包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)/>85清洁剂、0.7％(v/v)/>80清洁剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A以及50μg/ml胆固醇。可包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素、干扰素或其它已知的细胞因子。
额外佐剂系统允许组合T辅助细胞与B细胞抗原决定基，产生一种或多种类型的共价T-B抗原决定基连接结构，其可另外进行脂质化，例如WO2006/084319、WO2004/014957和WO2004/014956中所述。
在本发明的某些实施例中，ORFI PEDV蛋白质、或其它PEDV蛋白质或其片段用5％调配，如下文中所论述。
优选的佐剂可以于缓冲溶液中的2ML剂量提供，所述缓冲溶液进一步包含约5％(v/v)(氢氧化铝凝胶)和约25％(v/v)最终浓度的 大体上描述于美国专利第5,084,269号中且提供溶解于轻质油中的脱油卵磷脂(优选为大豆卵磷脂)，接着将其分散于抗原的水溶液或悬浮液中呈水包油型乳液形式。AMPHIGEN已根据美国专利第6,814,971号(参见其第8-9列)的方案改进，由此提供用于本发明的最终有佐剂疫苗组合物中的所谓“20％ AMPHIGEN”组分。因此，10％卵磷脂和90％载体油(/>宾夕法尼亚州卡恩斯市(Karns City,PA)的Penreco)的储备混合物用0.63％磷酸盐缓冲生理食盐水溶液以1:4稀释，由此将卵磷脂和组分分别减少至2％和18％(也就是说，其初始浓度的20％)。向组合物中添加80和/>80表面活性剂，其中代表性且优选的最终量为5.6％(v/v)/>80和2.4％(v/v)/>80，其中Span最初提供于储备/>组分中且/>最初自缓冲生理食盐水组分提供，由此使生理食盐水和/>组分的混合物产生最终所需的表面活性剂浓度。/>/卵磷脂与生理食盐水溶液的混合物可使用美国纽约州哈帕克市(Hauppauge,N.Y.,USA)的Charles Ross and Son的405型In-Line Slim乳化设备获得。
疫苗组合物还可以包括LV(储备物中约2％氢氧化铝含量)作为额外佐剂组分(可获自美国新泽西州的Reheis和美国ChemTrade Logistics)。在使用0.63％ PBS进一步稀释的情况下，最终疫苗组合物每2ML剂量含有以下组成量；5％(v/v)LV；25％(v/v)“20％ AMPHIGEN”，也就是说，其进一步进行4倍稀释)；和0.01％(w/v)硫柳汞(merthiolate)。
所属领域中应理解，可改变组分的添加次序以提供等效的最终疫苗组合物。举例来说，可制备病毒于缓冲液中的适当稀释液。接着，可以在共混合的情况下添加适量LV(约2％氢氧化铝含量)储备溶液，以便允许实际最终产物中所需的5％(v/v)/>LV浓度。一经制备，就将这一中间储备物与适量的“20％AMPHIGEN”储备液(如上文大体上描述，且已含有必要量的/>80和/>80)组合，由此再次获得具有25％(v/v)“20％ AMPHIGEN”的最终产物。最后，可添加适量的10％硫柳汞。
本发明的疫苗组合物允许改变所有成分，由此使抗原的总剂量相较于上述抗原剂量优选可改变100倍(更高或更低)，且最优选改变10倍或更低倍数(更高或更低)。类似地，表面活性剂浓度(不论Tween抑或Span)可彼此独立地改变至多10倍，或其可完全缺失，且用适当浓度的类似物质替代，这是所属领域中充分理解的。
最终产物中的浓度可首先通过使用可获自许多其它制造商(也就是说，/>Brenntag；丹麦(Denmark))的等效物质，或通过使用产品系列的额外变化，例如CG、HPA或HS而变化。使用LV作为实例，其最终有用浓度包括0％至20％，其中2-12％更优选且4-8％最优选，类似地，虽然/>的最终浓度(以“20％ AMPHIGEN”的百分比表示)优选为25％，但这一量可以在5-50％、优选地20-30％间变化且最优选为约24-26％。
本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物可进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(参见例如《雷明顿：药学实践与技术(Remington:The Science andpractice of Pharmacy)》,2005Lippincott Williams)，其呈冻干调配物或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对接受者无毒，且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如汞((邻羧基苯基)硫基)乙基钠盐氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)、/>或
本发明的疫苗，无论调配成通过注射施用抑或施用黏膜表面(经口、鼻内、经直肠等)，都可以任选地经调配用于持续释放本发明的病毒、感染性DNA分子、质粒或病毒载体。这类持续释放调配物的实例包括病毒、感染性DNA分子、质粒或病毒载体与生物兼容性聚合物的复合物的组合，所述生物兼容性聚合物例如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、玻糖醛酸、胶原蛋白等。药物递送媒剂中可降解聚合物的结构、选择和使用已评述于若干出版物中，包括A.Domb等人,1992,《先进技术聚合物(Polymers for AdvancedTechnologies)》3:279-292，所述文献以引用的方式并入本文中。关于在医药调配物中选择和使用聚合物的额外指导可见于所属领域中已知的文本中，例如M.Chasin和R.Langer(编),1990,“作为药物递送系统的可生物降解聚合物(Biodegradable Polymers as DrugDelivery Systems)”,《药物与制药科学(Drugs and the Pharmaceutical Sciences)》,第45卷,M.Dekker,纽约，所述文献还以引用的方式并入本文中。替代地或另外，病毒、质粒或病毒载体可经历微囊封以改进施用和功效。用于微囊封抗原的方法是所属领域中众所周知的，且包括例如以下文献中所描述的技术：美国专利第3,137,631号；美国专利第3,959,457号；美国专利第4,205,060号；美国专利第4,606,940号；美国专利第4,744,933号；美国专利第5,132,117号；和国际专利公开案WO 95/28227，所述文献都以引用的方式并入本文中。
脂质体还可以用于实现病毒、质粒、病毒蛋白质或病毒载体的持续释放。关于如何制备和使用脂质体调配物的详情尤其可见于美国专利第4,016,100号；美国专利第4,452,747号；美国专利第4,921,706号；美国专利第4,927,637号；美国专利第4,944,948号；美国专利第5,008,050号；以及美国专利第5,009,956号中，所述文献都以引用的方式并入本文中。
上述疫苗中任一种的有效量可以通过常规方式确定，初始为低剂量的病毒、病毒蛋白质质粒或病毒载体，且接着增加剂量，同时监测效果。可在单次施用疫苗之后或在多次施用疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最优选剂量时，可考虑已知因素。这些因素包括动物的物种、体型、年龄以及一般状况、动物体内其它药物的存在等。实际剂量优选是在考虑其它动物研究的结果之后选择。
检测是否已达成适当免疫反应的一种方法是在疫苗接种之后测定动物体内的血清转化和抗体效价。疫苗接种的时机和增强免疫的次数(如果存在)优选由医生或兽医基于所有相关因素的分析来确定，其中一些因素已于上文描述。
本发明的病毒、蛋白质、感染性核苷酸分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以考虑可由所属领域的一般技术人员确定的因素，例如打算疫苗接种的动物的体重，使用已知技术确定。本发明疫苗中本发明病毒的剂量优选在约101pfu至约109pfu(空斑形成单位)范围内，更优选在约102pfu至约108pfu范围内，且最优选在约103pfu至约107pfu范围内。本发明疫苗中本发明质粒的剂量优选在约0.1μg至约100mg范围内，更优选在约1μg至约10mg范围内，甚至更优选在约10μg至约1mg范围内。本发明疫苗中本发明感染性DNA分子的剂量优选在约0.1μg至约100mg范围内，更优选在约1μg至约10mg范围内，甚至更优选在约10μg至约1mg范围内。本发明疫苗中本发明病毒载体的剂量优选在约101pfu至约109pfu范围内，更优选在约102pfu至约108pfu范围内，且甚至更优选在约103pfu至约107pfu范围内。适合剂量大小在约0.5ml至约10ml范围内，且更优选在约1ml至约5ml范围内。
如可以通过标准方法所确定，根据本发明实践的病毒蛋白或肽疫苗(例如上文所论述的刺突蛋白片段)的适合剂量范围一般为每剂1至50微克或更高剂量，其中佐剂的量是通过公认的关于各种这类物质的方法测定。在关于猪疫苗接种的本发明的一个优选实例中，动物的最优选年龄目标在约1天与21天之间，在断奶之前，还可以相应地执行其它预定的疫苗接种，例如针对猪肺炎霉浆菌(Mycoplasma hyopneumoniae)的疫苗接种。另外，育种母猪的优选疫苗接种时程包括类似剂量，和每年再疫苗接种时程。
给药
优选临床指标是在分娩前育种母猪与新母猪的治疗、控制和预防，随后为猪崽的疫苗接种。在一个代表性实例(适用于母猪与新母猪)中，使用两次2ML剂量的疫苗，不过，当然，实际剂量体积与疫苗如何调配有关，其中还考虑动物体型，实际给药量范围为0.1ML至5ML。单次剂量的疫苗接种也是适当的。
第一次剂量可早在育种前至分娩前5周施用，且第二次剂量优选在分娩前约1-3周施用。如所属领域中所公认的，疫苗剂量优选使病毒物质的量对应于在约106与108之间、更优选在约107与107.5之间的TCID50(组织培养物感染性剂量)，且可进一步改变。增强免疫的剂量可在任何后续分娩之前两周至四周给予。肌肉内疫苗接种(所有剂量)是优选的，不过，还可以皮下给予一次或多次剂量。经口施用也是优选的。如通过计划或天然感染所实现，疫苗接种还可以有效地用于初始动物和非初始动物。
在另一个优选实例中，母猪或新母猪在分娩前约8周且接着在分娩前2周经历肌肉内或经口疫苗接种。在这些条件下，在经疫苗接种的PEDV阴性母猪中可展示保护性免疫反应，因为其产生具有中和活性的抗体(通过血清样品中的荧光焦点中和效价测量)，且这些抗体被动地转移至其猪崽。本发明的方案还适用于治疗已呈血清反应阳性的母猪和新母猪以及猪崽和公猪。还可以给予增强免疫的疫苗接种且这些疫苗接种可以通过相同或不同施用途径进行。虽然在任何后续分娩之前对母猪进行再疫苗接种是优选的，但本发明的疫苗组合物仍然可以通过抗体的持续被动转移而为猪崽提供保护，即使所述母猪仅在前一次分娩时进行疫苗接种。
应注意，猪崽接着可早在生命第1天进行疫苗接种。举例来说，猪崽可在第1天进行疫苗接种，在3周龄时施用或不施用增强免疫的剂量，尤其是亲本母猪虽然在育种前已进行疫苗接种，但在分娩前未进行疫苗接种时。如果亲本母猪先前由于天然或计划感染而不为初始动物，那么猪崽疫苗接种还可以是有效的。当母亲先前既没有暴露于病毒，也没有在分娩前进行疫苗接种时，对猪崽疫苗接种也可以是有效的。公猪(典型地出于育种目的而饲养)应每6个月进行一次疫苗接种。剂量的变化刚好在所属领域的实务范围内。应注意，本发明的疫苗可安全用于怀孕动物(所有三月期)和新生猪。本发明的疫苗减毒至甚至对于包括新生猪在内的最敏感动物也是可接受的安全水平(也就是说，无死亡、新生猪仅有短暂的轻度临床征象或正常征象)。当然，就保护猪群免于发生PEDV流行和持续低水平PEDV发生率的观点看，持续母猪疫苗接种计划非常重要。应了解，经PEDV MLV免疫的母猪或新母猪将免疫力被动地转移至猪崽，包括PEDV特异性IgA，由此将保护猪崽免于发生PEDV相关疾病和死亡。另外，一般来说，经PEDV MLV免疫的猪在其粪便中的脱落PEDV的量和/或持续时间将减少，或将受到保护而免于脱落PEDV，且另外，经PEDV MLV免疫的猪受到保护而不会因PEDV导致体重减轻和无法增加体重，且此外，PEDV MLV将有助于停止或控制PEDV传播周期。
还应该注意，用本发明疫苗进行疫苗接种的动物对于人类消费也是实时安全的，而无任何显著的屠宰延迟，例如21天或更短时间。
当提供用于治疗时，在检测到实际感染征象后，提供有效量的疫苗。适用于治疗现有感染的剂量包括每次剂量在约106与约109TCID50或更高之间的病毒(疫苗释放的最低免疫剂量)。如果施用组合物可为接受者所耐受，那么所述组合物称为“药学上可接受的”。如果施用量是生理学上显著的，那么将这类组合物称为以“治疗或预防有效量”施用。
至少一种本发明疫苗或免疫组合物可以通过达成预定目的的任何方式，使用如本文所描述的医药组合物施用。举例来说，这类组合物的施用途径可以是肠胃外、经口、口鼻、鼻内、气管内、表面、皮下、肌肉内、经皮、皮内、腹膜内、眼内和静脉内施用。在本发明的一个实施例中，所述组合物是通过肌肉内施用。肠胃外施用可以是弹丸注射或随时间逐渐灌注。可使用任何适合装置施用所述组合物，包括注射器、滴管、无针注射装置、贴片等。选用的途径和装置将取决于佐剂的组成、抗原和个体，且这是所属领域的技术人员众所周知的。优选为经口或者皮下施用。经口投药可以是直接施用、通过水或通过饲料(固体或液体饲料)施用。当以液体形式提供时，疫苗可经冻干和复原，或以糊状物提供，以便直接添加至饲料中(混入饲料或顶部追加)或以其它方式添加至水或液体饲料中。
在另一方面中，本发明的蛋白质、核酸序列和病毒将使所属领域的一般技术人员能够区别先前感染的动物与用以上描述的疫苗进行疫苗接种的动物。举例来说，可制备出结合根据本发明的截短的S蛋白片段(例如通过靶向SEQ ID NO:4)但不结合野生型S蛋白的抗体。还可以制备出针对由新ORF表达的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)的抗体。制备抗体的方法是所属领域中众所周知的且所属领域的一般技术人员将不必参与过多实验，即制备出适于本发明的多克隆抗体或单克隆抗体。还可以制备出根据本发明的经分离的蛋白质。举例来说，SEQ ID NO:5与来自测试动物的血液样品的抗体反应将表明动物经疫苗接种。
在其它实施例中，来自测试动物的样品中根据本发明的病毒的存在可使用靶向第一缺失或第二缺失的引物检测。举例来说，如果引物设计成扩增第一缺失内的区域，那么不存在PCR反应产物可指示样品中根据本发明的病毒的存在。
本公开案还提供以下项目：
项目1.一种猪流行性下痢(PED)病毒的C末端截短的刺突蛋白，其缺乏SEQ IDNO:1(YEVFEKVHVQ)或包含SEQ ID NO:1的序列且包含与SEQ ID NO:2至少90％一致的氨基酸序列或其C末端截短的变异体，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1200个氨基酸长。
项目2.根据项目1的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1250个氨基酸长。
项目3.根据项目1的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1300个氨基酸长。
项目4.根据项目1的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1370个氨基酸长。
项目5.根据项目1至4中任一项的C末端截短的刺突蛋白，其包含与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列。
项目6.根据项目1至4中任一项的C末端截短的刺突蛋白，其包含与SEQ ID NO:2至少99％一致的氨基酸序列。
项目7.根据项目4至6中任一项的C末端截短的刺突蛋白，其是SEQ ID NO:2的保守取代变异体。
项目8.一种核酸序列，其编码根据项目1至7中任一项的C末端截短的刺突蛋白。
项目9.一种病毒，其包含根据权利要求1至7中任一项的C末端截短的刺突蛋白或如项目8的核酸序列。
项目10.一种氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:3或与其至少90％一致的序列，前提是所述SEQ ID NO:3的C末端氨基酸是QPLAL(SEQ ID NO:4)。
项目11.根据项目10的氨基酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:3至少95％一致。
项目12.根据项目10的氨基酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:3至少99％一致。
项目13.根据项目10至12中任一项的氨基酸序列，其是SEQ ID NO:3的保守取代变异体。
项目14.一种核酸序列，其编码根据项目10至13中任一项的氨基酸序列。
项目15.一种病毒，其具有包含ORF的基因组，所述ORF编码根据项目10至13中任一项的氨基酸序列。
项目16.一种包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
项目17.一种病毒，其具有包含ORF的基因组，所述ORF包含编码根据项目16的氨基酸序列的ORF。
项目18.根据项目9、15、17中任一项的病毒，其是PEDV。
项目19.一种包含ORF-2和ORF 3的PEDV，前提是所述病毒在所述ORF2/ORF3中包含第一缺失，其中所述第一缺失是SEQ ID NO:6的缺失或包含SEQ ID NO:6的核酸序列的缺失，前提是所述病毒表达包含SEQ ID NO:3或与其至少90％一致的序列的氨基酸序列，其另一限制条件为，所述SEQ ID NO:3的C末端氨基酸是QPLAL(SEQ ID NO:4)。
项目20.根据项目20的PEDV，其进一步在所述ORF-3中包含第二缺失，其中所述第二缺失是SEQ ID NO:7的缺失或包含SEQ ID NO:7的核酸序列的缺失。
项目21.根据项目19或20的PEDV，其中所述病毒包含编码E、M和N蛋白质的野生型ORF。
项目22.根据项目19至21中任一项的PEDV，其中所述第一缺失与所述第二缺失不同。
项目23.根据项目18至22中任一项的PEDV，其缺乏由ORF-3表达的功能蛋白。
项目24.根据项目18至23中任一项的PEDV，其具有根据SEQ ID NO:10或与其至少90％一致的序列的基因组。
项目25.根据项目18至24中任一项的PEDV，其是来源于选自由以下组成的群组的PEDV病毒株：病毒株DJ、AJ1102、CH/ZJCS03/2012、CH/JXZS03/2014、CH/JXFX01/2014、CH/JXJJ08/2015、CH/JXGZ04/2015、CH/JXJA89/2015、CH/JXDX119/2016、CH/JXJGS11/2016、CH/JXWN13/2016、CH/JXJJ18/2017、CH/JXNC38/2017、CH/JX/01、CH/JX-1/2013、CH/JX-2/2013、AH2012、GD-B、BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011、AJ1102、GD-A、CH/GDGZ/2012、CH/ZJCX-1/2012、CH/FJZZ-9/2012。
项目26.根据项目18至24的PEDV，其是来源于PED病毒株DJ。
项目27.一种另外的减毒PEDV，其是根据权利要求24的亲本PEDV的子代。
项目28.根据权利要求27所述的另外的减毒PEDV，其中所述亲本PEDV具有根据SEQID NO:10的基因组。
项目29.一种疫苗，其包含根据项目18至26中任一项的PEDV或根据项目27或28的另外的减毒PEDV。
项目30.根据项目29的疫苗，其中根据项目18至26中任一项的PEDV是减毒的。
项目31.一种预防猪动物感染PEDV的方法，其包含向所述猪施用根据项目29或30的疫苗。
项目32.根据项目31的方法，其中所述疫苗是经口施用。
项目33.根据项目31或32的方法，其中所述猪动物是母猪，其中所述疫苗是在分娩之前约28-42天第一次施用且其中另外，所述疫苗是在分娩之前约7-21天第二次施用。
项目34.一种保护猪崽免于感染PEDV的方法，其包含向所述猪崽施用来自用根据项目29的疫苗进行疫苗接种的母猪的初乳。
项目35.根据项目34的方法，其中所述第一次疫苗接种和/或所述第二次疫苗接种是经口进行的。
项目36.根据项目34或35的方法，其中所述猪崽是至少3天大。
项目37.根据项目36的方法，其中所述猪崽是至少五天大。
项目38.根据项目34至37中任一项所述的方法，其中所述母猪是距分娩约35天进行疫苗接种。
项目39.根据项目34至38中任一项所述的方法，其中所述母猪是距分娩约14天进行疫苗接种。
以下实例是作为示范性实施例呈现，但不应将其视为限制本发明的范围。本发明的许多改变、变化、修改以及其它用途和应用对于所属领域的技术人员将为显而易知的。
实例
实例1–PEDV疫苗的安全性
使来自中国南部的属于G2a组的有毒大流行性PEDV病毒株PEDV-DJ在Vero细胞中连续繁殖至多57代。对不同代病毒的ORF2-ORF3区测序以监测毒力相关突变和遗传稳定性。测序时使用的引物是：
ORF3 24655-F：5'-TCA TTA CTA GTG TTC TGC TGC ATT TC-3'(SEQ ID NO:11)；
ORF3 25541-R：5'-CAC AGA TTA ACC AAT TGG ACG AAG GT-3'(SEQ ID NO:12)；
连续传代的病毒的电泳图提供于图1中。不同代细胞适应性PEDV病毒株的ORF2-ORF3区。在P49处(箭头)标识出在ORF2-ORF3区中具有较大片段缺失的突变体。
为验证疫苗病毒株的安全性，对5-7天大的乳猪崽经口接种PEDV疫苗病毒株(107TCID50/猪)。评估临床征象(总体行为、食欲)，特别是消化系统的临床表达。对粪便形态评分，并对接种后死亡/存活猪崽的数量进行计数。
两组猪崽都存活。用根据本发明的PEDV进行疫苗接种的猪崽与未进行疫苗接种的猪崽的小肠无明显可见的差异。相比之下，接种有毒PEDV病毒株的猪崽的小肠扩张且积累有黄色流体，并由于绒毛萎缩而具有薄透明壁。
根据以下标准评估粪便坚实度分数：1分-正常粪便(固体)；2分-糊状半固体；3分-淡黄色的水样。未进行疫苗接种的猪崽与用本发明的PEDV病毒株进行疫苗接种的猪崽的粪便坚实度分数之间未发现差异。
实例2–毒力无回复
对5-7天龄的乳猪崽经口接种107TCID50的PEDV疫苗病毒株。评估临床征象(总体精神状态、食欲)，特别是消化系统的临床表达。对粪便形态评分，并对死亡/存活动物的数量进行计数以全面地评估病毒株的安全性。在接种后3天，对感染猪崽实施安乐死。收集小肠以及小肠内容物并作为抗原用于接种下一轮猪崽。重复这一接种模式5次以完成毒力回复研究。使用来自每一轮接种的临床样品分离疫苗病毒株，并对每轮接种的疫苗病毒株的基因标记物区域测序。使用两个标准，即遗传稳定性和猪崽的发病率，评估疫苗病毒株的毒力。
图2是5次连续传代的病毒的核酸的电泳图，展示所述病毒在遗传上稳定。在实验结束时，所有猪崽均存活。
这些动物研究揭露，基于每一代猪崽的临床征象和存活率，疫苗病毒株的毒力已明显降低，同时ORF2-ORF3区中的基因标记物在5次传代之后于猪崽中保持稳定。总体来说，PEDV疫苗病毒株在表型和基因型方面都稳定。
实例3–免疫原性
分别在分娩之前60天和14天，对六只初始母猪经口免疫接种和增强免疫。每剂疫苗含有1×105TCID50/ml根据实例1的病毒。用102TCID50/ml PEDV TM病毒株经口攻击5-7天龄的来自母猪的猪崽，并在攻击之后10天观察临床症状和死亡/存活情况。
此外，收集来自母猪(第一次免疫接种当天和分娩时)和乳猪崽(在5-7天龄和攻击后10天)的血清样品并通过ELISA(IDEXX PEDV-IgA ELISA试剂盒)和SN分析(经验证的自建分析)进行评估。
经免疫母猪所产猪崽的存活率是100％，而来自阴性对照的猪崽在攻击之后无一存活。经免疫母猪和猪崽在攻击之后是干净且精力充沛的，并主动地吸食乳汁，且无下痢的临床征象。
图3显示在免疫前一天和分娩当天(第二次免疫之后14天)母猪的PEDV抗体水平。母猪C因免疫失败而排除在进一步分析之外，母猪D是用仅PBS代替PEDV抗原进行经口免疫的对照母猪。在其余六只母猪中，抗体水平达到保护性效价。
图4显示3-5天大的乳猪崽体内的抗体水平。这些是母体的抗体经如上文所描述预先进行疫苗接种的母亲的初乳转移至猪崽。
综合来说，这些数据显示，对分娩前母猪经口施用根据本发明的病毒足以将保护性免疫转移至乳猪崽以保护所述猪崽抵御有毒病毒株PEDV的攻击。
本说明书中所引用的所有公开案，即专利公开案和非专利公开案都指示熟习本发明所属领域的技术者的技能水平。所有这些公开案都以引用的方式完全并入本文中，其引用程度如同特定且个别地指示每一个别公开案是以引用的方式并入一般。
尽管本文中已参考特定实施例描述本发明，但应理解，这些实施例仅仅说明本发明的原理和应用。因此，应理解，在不脱离如由所附权利要求书所界定的本发明的精神和范围的情况下，可对示例性实施例作出许多修改且可设计出其它布置。
序列表
<110> 硕腾服务有限责任公司
RUAN, Xiaosai
LIU, Can
LI, Haiyan
YU, Hongxin
<120> 减毒的猪流行性下痢病毒
<130> ZP000356
<160> 12
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<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 刺突蛋白的片段
<400> 1
Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val His Val Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 1376
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PEDV刺突蛋白的片段
<400> 2
Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
50 55 60
Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
65 70 75 80
Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser
85 90 95
Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala
100 105 110
Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
115 120 125
Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr
130 135 140
Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
145 150 155 160
His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
165 170 175
Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val
180 185 190
Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr
195 200 205
Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys
260 265 270
Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg
305 310 315 320
Phe Asn Ile Asn Asp Ile Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val
325 330 335
Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser
340 345 350
Ser Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ile Gln
355 360 365
Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val
370 375 380
Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile
385 390 395 400
Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu
405 410 415
Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp
420 425 430
Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp
435 440 445
Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys
450 455 460
Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu
465 470 475 480
Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu
485 490 495
Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe
500 505 510
Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn
515 520 525
Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val
530 535 540
Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr
580 585 590
Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu
595 600 605
Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys
610 615 620
Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp
625 630 635 640
Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Gly
645 650 655
Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala
660 665 670
Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn
675 680 685
Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu
690 695 700
Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu
705 710 715 720
Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr
725 730 735
His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser
740 745 750
Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln
755 760 765
Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile
770 775 780
Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr
785 790 795 800
Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn
805 810 815
Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr
820 825 830
Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val
835 840 845
Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile
850 855 860
Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val
865 870 875 880
Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe
885 890 895
Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr
900 905 910
Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp
915 920 925
Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val
930 935 940
Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly
945 950 955 960
Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr
965 970 975
Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu
980 985 990
Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly
995 1000 1005
Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln
1010 1015 1020
Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val
1025 1030 1035
Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr
1040 1045 1050
Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp
1055 1060 1065
Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val
1070 1075 1080
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys
1100 1105 1110
Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln
1115 1120 1125
Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu
1130 1135 1140
Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu
1145 1150 1155
Val Pro Gly Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys
1160 1165 1170
Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val
1175 1180 1185
Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe
1190 1195 1200
Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser
1205 1210 1215
Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu
1220 1225 1230
Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val
1235 1240 1245
Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr
1250 1255 1260
Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn
1265 1270 1275
Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu
1280 1285 1290
Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn
1295 1300 1305
Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr
1310 1315 1320
Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu
1325 1330 1335
Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly
1340 1345 1350
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys
1355 1360 1365
Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro
1370 1375
<210> 3
<211> 1379
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PEDV的突变刺突蛋白
<400> 3
Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
50 55 60
Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
65 70 75 80
Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser
85 90 95
Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala
100 105 110
Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
115 120 125
Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr
130 135 140
Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
145 150 155 160
His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
165 170 175
Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val
180 185 190
Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr
195 200 205
Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys
260 265 270
Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg
305 310 315 320
Phe Asn Ile Asn Asp Ile Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val
325 330 335
Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser
340 345 350
Ser Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ile Gln
355 360 365
Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val
370 375 380
Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile
385 390 395 400
Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu
405 410 415
Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp
420 425 430
Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp
435 440 445
Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys
450 455 460
Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu
465 470 475 480
Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu
485 490 495
Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe
500 505 510
Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn
515 520 525
Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val
530 535 540
Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr
580 585 590
Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu
595 600 605
Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys
610 615 620
Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp
625 630 635 640
Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Gly
645 650 655
Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala
660 665 670
Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn
675 680 685
Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu
690 695 700
Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu
705 710 715 720
Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr
725 730 735
His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser
740 745 750
Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln
755 760 765
Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile
770 775 780
Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr
785 790 795 800
Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn
805 810 815
Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr
820 825 830
Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val
835 840 845
Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile
850 855 860
Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val
865 870 875 880
Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe
885 890 895
Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr
900 905 910
Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp
915 920 925
Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val
930 935 940
Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly
945 950 955 960
Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr
965 970 975
Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu
980 985 990
Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly
995 1000 1005
Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln
1010 1015 1020
Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val
1025 1030 1035
Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr
1040 1045 1050
Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp
1055 1060 1065
Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val
1070 1075 1080
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys
1100 1105 1110
Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln
1115 1120 1125
Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu
1130 1135 1140
Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu
1145 1150 1155
Val Pro Gly Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys
1160 1165 1170
Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val
1175 1180 1185
Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe
1190 1195 1200
Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser
1205 1210 1215
Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu
1220 1225 1230
Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val
1235 1240 1245
Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr
1250 1255 1260
Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Lys
1265 1270 1275
Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu
1280 1285 1290
Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn
1295 1300 1305
Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr
1310 1315 1320
Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu
1325 1330 1335
Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly
1340 1345 1350
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys
1355 1360 1365
Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Leu Ala Leu
1370 1375
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PEDV的突变刺突蛋白的片段
<400> 4
Gln Pro Leu Ala Leu
1 5
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 新形成的ORF表达的肽
<400> 5
Met Arg Ser Leu Leu Phe Leu Ile Leu Arg His Phe Leu Ser Ser Met
1 5 10 15
Val Lys Gln Leu Ile Met Thr Ala Asn Pro Leu
20 25
<210> 6
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PEDV的ORF-2/ORF-3缺失的肽
<400> 6
acgaagtttt tgaaaaggtc cacgtgcagt gatgtttctt ggactttttc aatacacgat 60
tgacacagtt ttcaaagatg tctcaaagtc tgctaacttg tctttggatg ctgtccaaga 120
gttggagctc aatgtagttc caattagaca agcttcaaat gtgacgggtt ttcttttcac 180
cagtgttttt atctacttct ttgcactgtt taaagcgtct tctttgaggc gcaattatat 240
tatgttggca gcgcgttttg ctgtcattgt tctttattgc ccacttttat attattgtgg 300
tgcattttta gatgcaacta ttatttgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg 360
cttttactcc 370
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PEDV的ORF-3中缺失的片段
<400> 7
gttggcatta ctaatgctgc attcta 26
<210> 8
<211> 1386
<212> PRT
<213> 猪流行性下痢病毒
<400> 8
Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
50 55 60
Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
65 70 75 80
Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser
85 90 95
Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala
100 105 110
Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
115 120 125
Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr
130 135 140
Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
145 150 155 160
His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
165 170 175
Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val
180 185 190
Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr
195 200 205
Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys
260 265 270
Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg
305 310 315 320
Phe Asn Ile Asn Asp Ile Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val
325 330 335
Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser
340 345 350
Ser Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ile Gln
355 360 365
Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val
370 375 380
Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile
385 390 395 400
Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu
405 410 415
Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp
420 425 430
Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp
435 440 445
Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys
450 455 460
Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu
465 470 475 480
Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu
485 490 495
Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe
500 505 510
Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn
515 520 525
Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val
530 535 540
Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr
580 585 590
Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu
595 600 605
Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys
610 615 620
Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp
625 630 635 640
Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Gly
645 650 655
Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala
660 665 670
Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn
675 680 685
Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu
690 695 700
Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu
705 710 715 720
Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr
725 730 735
His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser
740 745 750
Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln
755 760 765
Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile
770 775 780
Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr
785 790 795 800
Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn
805 810 815
Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr
820 825 830
Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val
835 840 845
Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile
850 855 860
Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val
865 870 875 880
Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe
885 890 895
Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr
900 905 910
Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp
915 920 925
Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val
930 935 940
Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly
945 950 955 960
Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr
965 970 975
Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu
980 985 990
Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly
995 1000 1005
Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln
1010 1015 1020
Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val
1025 1030 1035
Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr
1040 1045 1050
Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp
1055 1060 1065
Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val
1070 1075 1080
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys
1100 1105 1110
Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln
1115 1120 1125
Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu
1130 1135 1140
Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu
1145 1150 1155
Val Pro Gly Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys
1160 1165 1170
Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val
1175 1180 1185
Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe
1190 1195 1200
Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser
1205 1210 1215
Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu
1220 1225 1230
Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val
1235 1240 1245
Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr
1250 1255 1260
Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn
1265 1270 1275
Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu
1280 1285 1290
Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn
1295 1300 1305
Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr
1310 1315 1320
Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu
1325 1330 1335
Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly
1340 1345 1350
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys
1355 1360 1365
Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val
1370 1375 1380
His Val Gln
1385
<210> 9
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 由于PEDV突变形成的新Orf
<400> 9
atgcgctctt tattattttt aatactacga cactttcttt cctcaatggt aaagcagctt 60
attatgacgg caaatccatt gtga 84
<210> 10
<211> 27642
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突变PEDV病毒的全基因组
<400> 10
acttaaagag attttctatc tatggatagt tagctctttt tctagactct tgtctactca 60
attcaactaa acgaaatttt gtccttccgg ccgcatgtcc atgctgctgg aagctgacgt 120
ggaatttcat taggtttgct taagtagcca tcgcaagtgc tgtgctgtcc tctagttcct 180
ggttggcgtt ccgtcgcctt ctacatacta gacaaacagc catcctccgg ttccgtctgg 240
gggttgcgtg gataactagt tccgtctagt ttgaaaccag taactgtcgg ctatggctag 300
caaccaagtc acattggctt ttgccaatga tgcagaaatt tcagcttttg gcttttgcac 360
tgctagtgaa gccgtctcat actattctga ggccgccgct agtggattta tgcaatgccg 420
tttcgtgtcc ttcgatctcg ctgacactgt tgagggattg cttcccgaag actatgtcat 480
ggtggtggtc ggcactacca agcttagtgc gtatgtggac acttttggta gccgccccag 540
aaacatttgt ggttggctgt tattttctaa ctgtaattac ttcctcgaag agttagagct 600
cacttttggt cgtcgtggtg gtaacatcgt gccagttgac caatacatgt gtggcgctga 660
cgggaaacct gttcttcagg aatccgagtg ggagtataca gacttttttg ctgactccga 720
agacggtcaa ctcaacattg ctgggatcac ttatgtgaag gcctggattg tagagcgatc 780
ggacgtctct tatgcgagtc agaatttaac atctattaag tctattactt actgttcaac 840
ctatgagcat acttttcctg atggtactgc catgaaggtt gcacgtactc caaagattaa 900
gaagactgtt gtcttgtctg agccacttgc tactatctac agggaaattg gttctccttt 960
tgtggataat gggagcgatg ctcgttctat cattaagaga ccagtgttcc tccacgcttt 1020
tgttaagtgt aagtgtggta gttatcattg gactgttggt gattggactt cctatgtctc 1080
cacttgctgt ggctttaagt gtaagccagt ccttgtggct tcatgctctg ctacgcctgg 1140
ttctgttgtg gttacgcgcg ctggtgctgg cactggtgtt aagtattaca acaacatgtt 1200
cctgcgccat gtggcagaca ttgatgggtt ggcattctgg cgaattctta aggtgcagtc 1260
caaagacgac ctcgcttgct ctggtaaatt ccttgaacac catgaggaag gtttcacaga 1320
tccttgctac tttttgaatg actcgagcat tgctactaag ctcaagtttg acatccttag 1380
tggcaagttt tctgatgaag tcaaacaagc tatctttgct ggtcatgttg ttgttggcag 1440
tgcgctcgtt gacattgttg acgatgcact gggacagcct tggtttatac gtaagcttgg 1500
tgaccttgca agtgcagctt gggagcagct taaggctgtc gttagaggcc ttaacctcct 1560
gtctgatgag gtcgtgctct ttggcaaaag acttagctgt gccactctta gtatcgttaa 1620
cggtgttttt gagtttatcg ccgaagtgcc agagaagttg gctgcggctg ttacagtttt 1680
tgtcaacttc ttgaatgagc tttttgagtc tgcctgtgac tgcttaaagg tcggaggtaa 1740
aacctttaac aaggttggct cctatgttct ttttgacaac gcattggtta agcttgtcaa 1800
ggcaaaagtt cgcggcccac gacaggcagg tgtttgtgaa gttcgttaca caagccttgt 1860
tattgggagt actaccaagg tggtttccaa gcgcgttgaa aatgccaatg tgaatctcgt 1920
cgtcgttgac gaggatgtga ccttcaacac cactggtcgt acagttgttg ttgacggact 1980
tgcattcttc gagagtgacg ggttttacag acatcttgct gatgctgacg ttgtcattga 2040
acatcctgtt tataagtctg cttgtgagct caagccagtt tttgagtgtg acccaatacc 2100
tgattttcct atgcctgtgg ccgctagtgt tgcagagctt tgtgtgcaaa ctgatctgtt 2160
gcttaaaaat tacaacactc cttataaaac ttacagctgc gttgtgagag gtgataagtg 2220
ttgtatcact tgcaccttac atttcacagc accaagttat atggaggctg ctgctaattt 2280
tgtagacctc tgtaccaaga acattggtac tgctggtttt catgagtttt acattatggc 2340
ccatgaacaa caggatcttc aagggttcgt aaccacttgt tgcacgatgt caggttttga 2400
gtgttttatg cctataatcc cacagtgtcc agcagtgctt gaagagattg atggtggtag 2460
catctggcgc tcttttatca ctggtcttaa tacaatgtgg gatttttgca agcatcttaa 2520
agtcagcttt ggactagatg gcattgttgt cactgtagca cgcaaattta aacgacttgg 2580
tgctctcttg gcagaaatgt ataacactta cctttcaact gtggtggaaa acttggtact 2640
ggccggtgtt agcttcaagt attatgccac cagtgtccca aaaattgttt tgggcggttg 2700
ttttcacagt gttaaaagcg ttctagcaag tgccttccag attcctgtcc aggcaggcgt 2760
tgagaagttt aaagtcttcc ttaactgtgt tcaccctgtt gtaccacgcg tcattgaaac 2820
ttcttttgtg gaattagaag agacgacatt taaaccacca gcactcaatg gtagtattgc 2880
tattgttgat ggctttgctt tctattatga tggaacacta tactatccca ccgatggtaa 2940
tagtgttgtg cctatctgtt ttaagaagaa gggtggtggt gatgtcaaat tctctgatga 3000
agtctctgtt agaaccattg acccagttta taaggtctcc cttgaatttg agttcgagtc 3060
tgagactatt atggctgtgc ttaataaggc tgttggtaat cgtatcaagg ttacaggtgg 3120
ttgggacgat gttgttgagt atatcaacgt tgccattgag gttcttaaag atcacatcga 3180
tgtgcctaag tactacatct atgatgagga aggtggcacc gatcctaatc tgcccgtaat 3240
ggtttctcag tggccgttga atgatgacac gatctcacag gatctgcttg atgttgaagt 3300
tgttactgat gcgccagttg atttcgaggg tgatgaagta gactcctctg accctgataa 3360
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ttccacagtt actaaagatc cttttgcttt tgactttgca agctatggag gacttaaggt 3540
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tggcatcgtt gatgaccctg caatggagct ttttagtgct ggtagagttg gtccaatggt 3660
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accgttccca tatggtgctt gtgctcagtg tgctcaagtt ttgatgcaca cttttaaaag 3900
tattgttggc accggcatct tttgtcgaga tactactact ctctccttgg attctttggt 3960
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tgtaccaagt gctaattggg attcacatta tggttttgat aaggctggtg agttccacat 5400
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aatacgcttt acacctatag gtggccctgt ttgtgatgat gttgttgctg gttatgctaa 6480
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catttcatct ggtaatgttt tcctaggtgt tgtgggtgta accatgcgag gtgctttgtt 9540
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accgggtgaa tcttttaata tcttggcgtg ctatgatggt tctgcagctg gtgtttacgg 9660
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tgcaagggta atgttcaggt tgataatggt tcaagcatta atcgcaggca attggatgtt 16860
gtgcgtatgt ttttggctaa aaatcctagg tggtcaaagg ctgtttttat ttctccttat 16920
aacagccaga attatgttgc cagccgcatg ctaggtttac aaattcagac agttgactca 16980
tcccagggta gtgagtatga ctatgtcatt tacacacaaa cttcagatac tgcccatgcc 17040
tgtaatgtta acaggtttaa tgttgccatc acaagggcca agaaaggcat attatgtata 17100
atgtgcgata ggtccctttt tgatgtgctt aaattctttg agcttaaatt gtctgatttg 17160
caggctaatg agggttgtgg tctttttaaa gactgtagca gaggtgatga tctgttgcca 17220
ccatctcacg ctaacacctt catgtcttta gcggacaatt ttaagactga tcaagatctt 17280
gctgttcaaa taggtgttaa tggacccatt aaatatgagc atgttatctc gtttatgggt 17340
ttccgttttg atatcaacat acccaaccat catactctct tttgcacacg cgactttgcc 17400
atgcgcaatg ttagaggttg gttgggtttt gacgttgaag gagcacatgt tgttggctct 17460
aacgtcggta caaatgtccc attgcaatta gggttttcta acggtgttga ttttgttgtc 17520
agacctgaag gttgcgttgt aactgagtct ggtgactaca ttaaacccgt cagagctcgt 17580
gctccaccag gggaacaatt cgcacacctt ttgcctctac ttaaacgcgg ccaaccatgg 17640
gatgttgttc gcaaacgtat agtgcagatg tgtagtgact acctggccaa cctatcagac 17700
atactaattt ttgtgttgtg ggctggtggt ttggagttga caactatgcg ttattttgtc 17760
aagattggac caagtaagag ttgtgattgt ggtaaggttg ctacttgtta caatagtgcg 17820
ctgcatacgt actgttgttt caaacatgcc cttggttgtg attatctgta taacccatac 17880
tgtattgata tacagcagtg gggatacaag ggatcactta gccttaacca ccatgagcat 17940
tgtaatgtac atagaaacga gcacgtggct tctggtgatg ccataatgac tcgttgtctg 18000
gccatacatg attgctttgt caagaacgtt gactggtcca tcacataccc atttattggt 18060
aatgaggctg ttattaataa gagcggccga attgtgcaat cacataccat gcggtcagtt 18120
cttaagttat acaatccgaa agccatatat gatattggca atcctaaggg catcagatgt 18180
gcagtaacgg atgctaagtg gttttgcttt gacaagaatc ctactaattc taatgtcaag 18240
acattggagt atgactatat aacacatggc caatttgatg ggttgtgctt gttttggaat 18300
tgtaatgtgg acatgtatcc agaattttct gtggtctgtc gttttgacac tcgctgtagg 18360
tcaccactca acttggaggg ttgtaatggt ggttcactgt atgttaataa tcatgcattc 18420
catacaccgg cttttgacaa gcgtgctttt gctaagttga agccaatgcc atttttcttt 18480
tatgatgata ctgagtgtga caagttacag gactccataa actatgttcc tcttagggct 18540
agtaactgca ttactaaatg taatgttggt ggagctgtct gtagtaagca ttgtgctatg 18600
tatcatagct atgttaatgc ttacaacact tttacgtcgg cgggctttac tatttgggtg 18660
cctacttcgt ttgacaccta taatctgtgg cagacattta gtaacaattt gcaaggtctt 18720
gagaacattg ctttcaatgt cgtaaagaaa ggatcttttg ttggtgccga aggtgaactt 18780
cctgtagctg tggttaatga caaagtgctc gttagagatg gtactgttga tactcttgtt 18840
tttacaaaca agacatcact acccactaac gtagcttttg agttgtatgc caagcgtaag 18900
gtaggactca ccccacccat tacgatccta cgtaacttgg gtgtagtttg tacatctaag 18960
tgtgtcattt gggactatga agccgaacgt ccacttacta cttttacaaa ggatgtttgt 19020
aaatataccg actttgaggg tgacgtctgt acactctttg ataacagcat tgttggttca 19080
ttagagcgat tctctatgac ccaaaatgct gtgcttatgt cacttacagc cgttaaaaag 19140
cttactggca taaagttaac ttatggttat cttaatggtg tcccagttaa cacacatgaa 19200
gataaacctt ttacttggta tatttacact aggaagaacg gcaaattcga ggactatcct 19260
gatggctatt ttacccaagg tagaacaacc gctgatttta gccctcgtag cgacatggaa 19320
aaggacttcc taagtatgga tatgggtctg tttattaaca agtacggact tgaagattac 19380
ggctttgagc acgttgtgta tggtgatgtt tcaaaaacca cccttggtgg tttacatcta 19440
ctaatttcgc aggtgcgtct gtcctgtatg ggtgtgctta aaatagacga gtttgtgtct 19500
agtaatgata gcacgttaaa gtcctgtact gttacatatg ctgataaccc tagtagtaag 19560
atggtttgca cgtatatgga tctcctgctt gacgattttg tcagcattct taaatcgttg 19620
gatttgggcg ttgtatctaa agttcatgaa gttatggtcg attgtaaaat gtggaggtgg 19680
atgttgtggt gtaaggatca taaactccag acattttatc cgcaacttca ggccagtgaa 19740
tggaagtgtg gttattccat gccttctatt tacaagatac aacgtatgtg tttagaacct 19800
tgcaatctct acaactatgg tgctggtatt aagttacctg atggcattat gtttaacgta 19860
gttaaataca cacagctttg tcaatatctc aatagcacca caatgtgtgt accccatcac 19920
atgcgtgtgc tacatcttgg tgctggctcc gacaagggtg ttgcacctgg cacggctgtc 19980
ttacgacgtt ggttgccact ggatgccatt atagttgaca atgatagtgt ggattacgtt 20040
agcgatgctg attatagtgt tacaggagat tgctctacct tatacctgtc agataagttt 20100
gatttagtta tatctgatat gtatgatggt aagattaaaa gttgtgatgg ggagaacgtg 20160
tctaaagaag gcttctttcc ctatattaat ggtgtcatca ccgaaaagtt ggcacttggt 20220
ggtactgtag ctattaaggt gacggagttt agttggaata agaagttgta tgaactcatt 20280
cagaagtttg agtattggac aatgttctgt accagtgtta acacgtcatc gtcagaggca 20340
tttttaattg gtgttcacta tttaggtgat tttgcaagtg gcgctgtgat tgacggcaac 20400
actatgcatg ccaattatat cttctggcgt aattccacaa ttatgactat gtcttacaat 20460
agtgtacttg atttaagcaa gttcaattgt aagcataagg ctacagttgt cattaattta 20520
aaagattcat ccattagtga tgttgtgtta ggtttgttga agaatggtaa gttgctagtg 20580
cgtaataatg acgccatttg tggtttttct aatcatttgg tcaacgtaaa caaatgaagt 20640
ctttaaccta cttctggttg ttcttaccag tactttcaac acttagccta ccacaagatg 20700
tcaccaggtg ctcagctaac actaatttta ggcggttctt ttcaaaattt aatgttcagg 20760
cgcctgcagt tgttgtactg ggcggttatc tacctattgg tgaaaaccag ggtgtcaatt 20820
caacttggta ctgtgctggc caacatccaa ctgctagtgg cgttcatggt atctttgtta 20880
gccatattag aggtggtcat ggctttgaga ttggcatttc gcaagagcct tttgacccta 20940
gtggttacca gctttattta cataaggcta ctaacggtaa cactaatgct actgcgcgac 21000
tgcgcatttg ccagtttcct agcattaaaa cattgggccc cactgctaat aatgatgtta 21060
caacaggtcg taattgccta tttaacaaag ccatcccagc gcatatgagt gaacatagtg 21120
ttgtcggcat aacatgggat aatgatcgtg tcactgtctt ttctgacaag atctattatt 21180
tttattttaa aaatgattgg tcccgtgttg cgacaaagtg ttacaacagt ggaggttgtg 21240
ctatgcaata tgtttacgaa cccacctatt acatgcttaa tgttactagt gctggtgagg 21300
atggtatttc ttatcaaccc tgtacagcta attgcattgg ttatgctgcc aatgtatttg 21360
ctactgagcc caatggccac ataccagaag gttttagttt taataattgg tttcttttgt 21420
ccaatgattc cactttggtg catggtaagg tggtttccaa ccaaccattg ttggtcaatt 21480
gtcttttggc cattcctaag atttatggac taggccaatt tttctccttt aatcaaacga 21540
tcgatggtgt ttgtaatgga gctgctgtgc agcgtgcacc agaggctctg aggtttaata 21600
ttaatgacat ctctgtcatt cttgctgaag gctcaattgt acttcatact gctttaggaa 21660
caaatttttc ttttgtttgc agtaattcct cagatcctca cttagccacc ttcgccatac 21720
ctctgggtgc tatccaagta ccctattatt gttttcttaa agtggatact tacaactcca 21780
ctgtttataa attcttggct gttttacctc ctaccgtcag ggaaattgtc atcaccaagt 21840
atggtgatgt ttatgtcaat gggtttggct atttgcatct cggtttgttg gacgctgtca 21900
caattaattt cactggtcat ggcactgacg atgacgtttc aggtttctgg accatagcat 21960
cgactaattt tgttgatgca cttatcgaag ttcaaggaac tgccattcag cgtattcttt 22020
attgtgatga tcctgttagc caactcaagt gttctcaggt tgcttttgac cttgacgatg 22080
gtttctaccc tatttcttct agaaaccttc tgagtcatga acagccaatt tcttttgtta 22140
ctttgccatc atttaatgat cattcttttg ttaacattac tgtctctgcg tcctttggtg 22200
gtcatagtgg tgccaacctt attgcatctg acactactat caatgggttt agttctttct 22260
gtgttgacac tagacaattt accatttcac tgttttataa cgttacaaac agttatggtt 22320
atgtgtctaa atcacaggac agtaattgcc ctttcacctt gcaatctgtt aatgattacc 22380
tgtcttttag taaattttgt gtttccacca gccttttggc tagtgcctgt accatagatc 22440
tttttggtta ccctgagttt ggtagtggtg ttaagtttac gtccctttac tttcaattca 22500
caaagggtga gttgattact ggcacgccta aaccacttga aggtgtcacg gacgtttctt 22560
ttatgactct ggatgtgtgt accgagtata ctatctatgg ctttaaaggt gagggtatca 22620
ttacccttac aaattctagc tttttggcag gtgtttatta cacatctgat tctggacagt 22680
tgttagcctt taagaatgtc actagtggtg ctgtttattc tgttacgcca tgttcttttt 22740
cagagcaggc tgcatatgtt gatgatgata tagtgggtgt tatttctagt ttgtctagct 22800
ccacttttaa cagtactagg gagttgcctg gtttcttcta ccattctaat gatggctcta 22860
attgtacaga gcctgtgttg gtgtatagta acataggcgt ttgtaaatct ggcagtattg 22920
gctacgtccc atctcagtct ggccaagtca agattgcacc cacggttact gggaatatta 22980
gtattcccac caactttagt atgagtatta ggacagaata tttacagctt tacaacacgc 23040
ctgttagtgt tgattgtgcc acatatgttt gtaatggtaa ctctcgttgt aaacaattac 23100
tcacccagta cactgcagca tgtaagacca tagagtcagc attacaactc agcgctaggc 23160
ttgagtctgt tgaagttaac tctatgctta ctatttctga agaggctcta cagttagcta 23220
ccatcagttc gtttaatggt gatggatata attttactaa tgtgctgggt gtttctgtgt 23280
atgatcctgc aagtggcagg gtggtacaaa aaaggtcttt tattgaagac ctgcttttta 23340
ataaagtggt tactaatggc cttggtactg ttgatgaaga ctataagcgc tgttctaatg 23400
gtcgctctgt ggcagatcta gtctgtgcac agtattactc tggtgtcatg gtactacctg 23460
gtgttgttga cgctgagaag cttcacatgt atagtgcgtc tctcatcggt ggtatggtgc 23520
taggaggttt tacttctgca gcggcattgc cttttagcta tgctgttcaa gctagactca 23580
attatcttgc tctacagacg gatgttctac agcggaacca gcaattgctt gctgagtctt 23640
ttaactctgc tattggtaat ataacttcag cctttgagag tgttaaagag gctattagtc 23700
aaacttccaa gggtttgaac actgtggctc atgcgcttac taaggttcaa gaggttgtta 23760
actcgcaggg tgcagctttg actcaactta ccgtacagct gcaacacaac ttccaagcca 23820
tttctagttc tattgatgac atttactctc gactggacat tctttcagcc gatgttcagg 23880
ttgaccgtct catcaccggc agattatcag cacttaatgc ttttgttgct caaaccctca 23940
ctaagtatac tgaggttcag gctagcagga agctagcaca gcaaaaggtt aatgagtgcg 24000
ttaaatcgca atctcagcgt tatggttttt gtggtggtga tggcgagcac attttctctc 24060
tggtacaggc agcacctcag ggcctgctgt ttttacatac agtacttgta ccgggtgact 24120
ttgtagatgt tattgccatc gctggcttat gcgttaacga tgaaattgcc ttgactctac 24180
gtgagcctgg cttagtcttg tttacgcatg aacttcaaaa tcatactgcg acggaatatt 24240
ttgtttcatc gcgacgtatg tttgaaccta gaaaacctac cgttagtgat tttgttcaaa 24300
ttgagagttg tgtggtcacc tatgtcaatt tgactagaga ccaactacca gatgtaatcc 24360
cagattacat cgatgttaac aaaacacttg atgagatttt agcttctctg cccaatagaa 24420
ctggtccaag tcttccttta gatgttttta atgccactta tcttaagctc actggtgaaa 24480
ttgcagattt agagcagcgt tcagagtctc tccgtaatac tacagaggag ctccaaagtc 24540
ttatatataa tatcaacaac acactagttg accttgagtg gctcaaccga gttgagacat 24600
atatcaagtg gccgtggtgg gtttggttga ttattttcat tgttctcatc tttgttgtgt 24660
cattactagt gttctgctgc atttccactg gttgttgtgg atgctgcggc tgctgctgtg 24720
cttgtttttc aggttgttgt aggggtccta gacttcaacc tttggcgcta taaaaatgcg 24780
ctctttatta tttttaatac tacgacactt tctttcctca atggtaaagc agcttattat 24840
gacggcaaat ccattgtgat tctagaaggt ggtgaccatt acatcacttt tggcaactct 24900
tttgttgctt tcgttagtag cattgacttg tatctagcta tacgtgggcg gcaagaagcc 24960
gacctacagc tgttgcgaac tgttgagctt cttgatggca agaagcttta tgtcttttcg 25020
caacatcaaa ttctcaattc aactagacga gtatgctaca attagtgaat gataatggtc 25080
tagtagttaa tgttatactt tggcttttcg tactcttttt cctgcttatt ataagcatta 25140
ctttcgtcca attggttaat ctgtgcttca cttgtcaccg gttgtgtaat agcgcagttt 25200
acacacctat agggcgtttg tatagagttt ataagtctta catgcaaata gaccccctcc 25260
ccagtactgt tattgacgta taaacgaaat atgtctaacg gttctattcc cgttgatgag 25320
gtgattcaac accttagaaa ctggaatttc acatggaata tcatactgac gatactactt 25380
gtagtgcttc agtatggcca ttacaagtac tctgcgttct tgtatggtgt caagatggct 25440
attctatgga tactttggcc tcttgtgtta gcactgtcac tttttgatgc atgggctagc 25500
tttcaggtca attgggtctt ttttgctttc agcatcctta tggcttgcat cactcttatg 25560
ctgtggataa tgtactttgt caatagcatt cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg 25620
tctttcaatc ctgaaacaga cgcgcttctc actacttctg tgatgggccg acaggtctgc 25680
attccagtgc ttggagcacc aactggtgta acgctaacac tccttagtgg tacattgctt 25740
gtagagggct ataaggttgc tactggcgta caggtaagtc aattacctaa tttcgtcaca 25800
gtcgccaagg ccactacaac aattgtctac ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca 25860
tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg tccaaacacg gcgactactc agctgtgagt 25920
aatccgagtt cggttctcac agatagtgag aaagtgcttc atttagtcta aacagaaact 25980
ttatggcttc tgtcagtttt caggatcgtg gccgcaaacg ggtgccatta tccctctatg 26040
cccctcttag ggttactaat gacaaacccc tttctaaggt acttgcaaat aatgctgtac 26100
ccactaataa aggaaataag gaccagcaaa ttggatactg gaatgagcaa attcgctggc 26160
gcatgcgccg tggtgagcga attgaacaac cttccaattg gcatttctac tacctcggaa 26220
caggacctca cgccgacctc cgctatagga ctcgtactga gggtgttttc tgggttgcta 26280
aagaaggcgc aaagactgaa cccactaacc tgggtgtcag aaaggcgtct gaaaagccta 26340
tcattccaaa tttctctcaa cagcttccca gcgtagttga gattgttgaa cctaacacac 26400
ctcctacttc acgtgcaaat tcacgtagca ggagtcgtgg taatggcaac aacaggtcca 26460
gatctccaag taacaacaga ggcaacaacc agtcccgcgg taattcacag aatcgtggaa 26520
ataaccaggg tcgtggagct tctcagaaca gaggaggcaa taataataac aataacaagt 26580
ctcgtaacca gtccaagaac agaaaccagt caaatgaccg tggtggtgta acatcacgcg 26640
atgatctggt ggctgctgtc aaggatgccc ttaaatcttt gggtattggc gaaaaccctg 26700
acaagcttaa gcaacagcag aagcccaaac aggaaaggtc tgacagcagc ggcaaaaata 26760
cacctaagaa gaacaaatcc agagccactt cgaaagaacg tgacctcaaa gacatcccag 26820
agtggaggag aattcccaag ggcgaaaata gcgtagcagc ttgcttcgga cccaggggag 26880
gcttcaaaaa ttttggagat gcggactttg tcgaaaaagg tgttgatgcc tcaggctatg 26940
ctcagatcgc cagtttagca ccaaatgttg cagcattgct ctttggtggt aatgtggctg 27000
ttcgtgagct agcggactct tacgagatta catataatta taaaatgact gtgccaaagt 27060
ctgatccaaa tgtagagctt cttgtttcac aggtggatgc atttaaaact gggaatgcaa 27120
aaccccagag aaagaaggaa aagaagaaca agcgtgaaac cacgcagcag ctgaatgaag 27180
aggccatcta cgatgatgtg ggtgtgccat ctgatgtgac tcatgcctat ttggaatggg 27240
acacagctgt tgatggtggt gacacggccg ttgaaattat caacgagatc ttcgacacag 27300
gaaattaaac aatgtttgac tggcttaccc tggctatgtc ccagggtagt gccattacac 27360
tgttattact gagtgttttt ctagcgactt ggctgctggg ctatggcttt gccctctaac 27420
tagcggtctt ggtcttgcac acaacggtaa gccagtggta atgtcagtgc aagaaggata 27480
ttaccatagc actgtcatga ggggaacgca gtaccttttc atctaaacct ttgcacgagt 27540
aatcaaagat ccgcttgacg agcctatatg gaagagcgtg ccaggtattt gacttaagga 27600
ctgttagtaa ctgaagacct gacggtgttg atatggatac ac 27642
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 11
tcattactag tgttctgctg catttc 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 12
cacagattaa ccaattggac gaaggt 26

Claims (39)

1.一种PEDV的C末端截短的刺突蛋白，其缺乏SEQ ID NO:1(YEVFEKVHVQ)或包含SEQ IDNO:1的序列，并且包含与SEQ ID NO:2至少90％一致的氨基酸序列或其C末端截短的变体，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1200个氨基酸长。
2.根据权利要求1所述的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1250个氨基酸长。
3.根据权利要求1所述的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1300个氨基酸长。
4.根据权利要求1所述的PEDV的C末端截短的刺突蛋白，前提是所述PEDV的C末端截短的刺突蛋白是至少1370个氨基酸长。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的C末端截短的刺突蛋白，其包含与SEQ IDNO:2至少95％一致的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的C末端截短的刺突蛋白，其包含与SEQ IDNO:2至少99％一致的氨基酸序列。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的C末端截短的刺突蛋白，其是SEQ ID NO:2的保守取代的变体。
8.一种核酸序列，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的C末端截短的刺突蛋白。
9.一种病毒，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的C末端截短的刺突蛋白或根据权利要求8所述的核酸序列。
10.一种氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:3或与其至少90％一致的序列，前提是所述SEQID NO:3的C末端氨基酸是QPLAL(SEQ ID NO:4)。
11.根据权利要求10所述的氨基酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:3至少95％一致。
12.根据权利要求10所述的氨基酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:3至少99％一致。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的氨基酸序列，其是SEQ ID NO:3的保守取代的变体。
14.一种核酸序列，其编码根据权利要求10至13中任一项所述的氨基酸序列。
15.一种病毒，其具有包含ORF的基因组，所述ORF编码根据权利要求10至13中任一项所述的氨基酸序列。
16.一种包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
17.一种病毒，其具有包含ORF的基因组，所述ORF编码根据权利要求16所述的氨基酸序列。
18.根据权利要求9、15、17中任一项所述的病毒，其是PEDV。
19.一种包含ORF-2和ORF 3的PEDV，前提是所述病毒在所述ORF2/ORF3中包含第一缺失，其中所述第一缺失是SEQ ID NO:6的缺失或包含SEQ ID NO:6的核酸序列的缺失，前提是所述病毒表达包含SEQ ID NO:3或与其至少90％一致的序列的氨基酸序列，其进一步的前提是，所述SEQ ID NO:3的C末端氨基酸是QPLAL(SEQ ID NO:4)。
20.根据权利要求20所述的PEDV，其进一步在所述ORF-3中包含第二缺失，其中所述第二缺失是SEQ ID NO:7的缺失或包含SEQ ID NO:7的核酸序列的缺失。
21.根据权利要求19或20所述的PEDV，其中所述病毒包含编码E、M和N蛋白质的野生型ORF。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的PEDV，其中所述第一缺失与所述第二缺失不同。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的PEDV，其缺乏由ORF-3表达的功能蛋白。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的PEDV，其具有根据SEQ ID NO:10或与其至少90％一致的序列的基因组。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的PEDV，其是来源于选自由以下组成的群组的PEDV病毒株：病毒株DJ、AJ1102、CH/ZJCS03/2012、CH/JXZS03/2014、CH/JXFX01/2014、CH/JXJJ08/2015、CH/JXGZ04/2015、CH/JXJA89/2015、CH/JXDX119/2016、CH/JXJGS11/2016、CH/JXWN13/2016、CH/JXJJ18/2017、CH/JXNC38/2017、CH/JX/01、CH/JX-1/2013、CH/JX-2/2013、AH2012、GD-B、BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011、AJ1102、GD-A、CH/GDGZ/2012、CH/ZJCX-1/2012、CH/FJZZ-9/2012。
26.根据权利要求18至24所述的PEDV，其是来源于PED病毒株DJ。
27.一种另外的减毒PEDV，其是根据权利要求24所述的亲本PEDV的子代。
28.根据权利要求27所述的另外的减毒PEDV，其中所述亲本PEDV具有根据SEQ ID NO:10的基因组。
29.一种疫苗，其包含根据权利要求18至26中任一项所述的PEDV，或根据权利要求27或权利要求28所述的另外的减毒PEDV。
30.根据权利要求29所述的疫苗，其中根据权利要求18至26中任一项所述的PEDV是减毒的。
31.一种预防猪动物感染PEDV的方法，其包含向所述猪施用根据权利要求29或30所述的疫苗。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述疫苗是经口施用。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述猪动物是母猪，其中所述疫苗在分娩之前约28-42天第一次施用且其中另外，所述疫苗在分娩之前约7-21天第二次施用。
34.一种保护猪崽免于感染PEDV的方法，其包含向所述猪崽施用来自用根据权利要求29或30所述的疫苗进行疫苗接种的母猪的初乳。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一次疫苗接种和/或所述第二次疫苗接种是经口进行的。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述猪崽是至少3天大。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述猪崽是至少五天大。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述母猪是在距分娩约35天进行疫苗接种。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述母猪是在距分娩约14天进行疫苗接种。
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