BRPI0714721A2 - construÇço de vacinas de vÍrus recombinante por inserÇço direta mediada por transpàson de determinantes imunolàgicos estranhos em proteÍnas de vÍrus vetorial - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇçO DE VACINAS DE VÍRUS RECOMBINANTE POR INSERÇçO DIRETA MEDIADA POR TRANSPàSON DE DETERMINANTES IMUNOLàGICOS ESTRANHOS EM PROTEÍNAS DE VÍRUS VETORIAL. A presente invenção fornece vetores virais, tais como vetores de flavivírus quiméricos, incluindo peptídeos estranhos nas proteínas alvo dos valores, métodos de fazer e usar estes vetores, e composições incluindo os vetores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRU- ÇÃO DE VACINAS DE VÍRUS RECOMBINANTE POR INSERÇÃO DIRETA MEDIADA POR TRANSPÓSON DE DETERMINANTES IMUNOLÓGICOS ESTRANHOS EM PROTEÍNAS DE VÍRUS VETORIAL".

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se à construção de vacinas de vírus re- combinante por inserção direta mediada por transpóson de determinantes imunológicos estranhos em proteínas de vírus vetorial e composições cor- respondentes e métodos. Antecedentes da Invenção

Vacinação é uma das maiores realizações da medicina, e tem poupado milhões de pessoas dos efeitos de doenças devastadoras. Antes das vacinas tornarem-se extensamente usadas, as doenças infecciosas ma- taram milhares de crianças e adultos a cada ano só nos Estados Unidos, e tantos mais em todo o mundo. Vacinação é usada amplamente para impedir ou tratar infecção por bactérias, vírus, e outros patógenos. Vários métodos diferentes são usados em vacinação, incluindo a administração de patógeno morto, patógeno com vida atenuada, e subunidades de patógeno inativo. No caso de infecção viral, vacinas vivas foram observadas conferir respostas imunes protetoras mais potentes e duráveis.

Vacinas com vida atenuada foram desenvolvidas contra flaviví- rus, que são vírus de RNA de filamento positivo, envelopado, pequeno que são em geral transmitidos por mosquitos e carrapatos infetados. O gênero Flavivirus da família Fiaviviridae inclui aproximadamente 70 vírus, muitos destes, tais como vírus da febre amarela (YF), dengue (DEN), encefalite ja- ponesa (JE), e encefalite de carrapato (TBE), são patógenos humanos prin- cipais (rev. em Burke e Monath, Fields Virology, 4â Ed.: 1043-1126, 2001).

Métodos diferentes foram usados no desenvolvimento de vaci- nas contra flavivírus. No caso do vírus da febre amarela, por exemplo, duas vacinas (17D da febre amarela e a vacina neurotrópica francesa) foram de- senvolvidas por passagem serial (Monath, "Yellow Fever", Em Plotkin e O- renstein, Vaccines, 3â ed., Saunders, Filadélfia, págs. 815-879, 1999). Outro método para atenuação dos flavivírus para o uso em vacinação envolve a construção de flavivírus quiméricos, que incluem componentes de dois (ou mais) flavivírus diferentes. Entender como tais quimeras são construídas re- quer uma explanação da estrutura do genoma do flavivírus.

Proteínas de Flavivírus são produzidas por translação de uma

estrutura de leitura aberta simples, longa para gerar uma poliproteína, que é seguida por uma série complexa de clivagens proteolíticas pós- translacionais da poliproteína por uma combinação de proteases hospedei- ras e virais para gerar proteínas virais maduras (Amberg et al., J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae," Em Virology, Fields (ed.), Corvo- Lippincott, Nova Iorque, 1995, Volume I, pág., 937). As proteínas estruturas virais são dispostas na poliproteína na ordem C-prM-E, onde "C" é capsídeo, "prM" é um precursor da membrana ligada ao envelope viral (M), e Έ" é a proteína de envelope. Estas proteínas estão presentes na região N-terminal da poliproteína, enquanto as proteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5) estão localizadas na região C-terminal da polipro- teína.

Os flavivírus quiméricos foram feitos que incluem proteínas es- truturais e não-estruturais de flavivírus diferentes. Por exemplo, a assim- chamada tecnologia de ChimeriVax™ emprega o capsídeo do vírus 17D da febre amarela e proteínas não-estruturais para liberar as proteínas envelo- padas (prM e E) de outros flavivírus (vide, por exemplo, Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999). Esta tecnologia foi usada para desenvolver os candidatos de vacina contra o vírus da dengue, encefalite japonesa (JE), Nilo Ocidental (WN), e encefalite de St. Louis (SLE) (vide, por exemplo, Pu- gachev et al., em New Generation Vaccines, 3ã ed., Levine et al., eds., Mar- eei Dekker, Nova Iorque, Basel, págs. 559-571, 2004; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 74:5477-5485, 2000; Arroyo et al., Trends Mol. Med. 7:350-354, 2001; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004; e Pugachev et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 71:639-645, 2004).

Vacinas com base em ChimeriVax™ foram mostradas ter propri- edades favoráveis com respeito às propriedades, tais como replicação em células do substrato, baixa neurovirulência em modelos murinos, atenuação alta em modelos de macaco, estabilidade genética e fenotípica alta in vitro e in vivo, replicação ineficiente em mosquitos (que é importante para impedir a expansão descontrolada na natureza), e a indução de imunidade protetora robusta em camundongos, macacos, e seres humanos seguindo administra- ção de uma dose simples, sem efeitos colaterais sérios pós-imunização. De fato, o vírus da vacina ChimeriVax™-JE, contendo os genes prM-E do vírus de JE de SA14-14-2 (vacina de JE com vida atenuada usada na China), foi de forma bem-sucedida testada em experimentações pré-clínicas e clínicas de Fase I e Il (Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003). Similarmente, experimentações clínicas de Fase I bem sucedidas foram conduzidas com um canditado de vacina de ChimeriVax™-WN contendo seqüências de prM-E de um vírus do Nilo Oci- dental (cepa de NY99), com três alterações de aminoácidos específicos in- corporadas na proteína E para aumentar a atenuação (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507,2004).

Outros métodos para atenuação, tais como mutagênese de flavi- vírus, incluindo flavivírus quiméricos, foram empreendidos. Estes métodos incluem, por exemplo, a introdução de substituições na proteína de envelo- pe, deleções dentro da região 3'-não-transladada, e deleções na proteína do capsídeo. (Vide as referências a seguir para exemplos de tais mutações: Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998; Durbin et al., AJTMH 65:405-413, 2001; Pletnev, Virology 282:288- 300, 2001; Markoff et al., J. Virol. 76:3318-3328, 2002; Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002; Whitehead et al., J. Virol. 77:1653-1657, 2003; Pletnev et al., Virology 314:190-195, 2003; Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567- 582, 2003; Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003; Patente U. S. No. 6.184.024 B1; WO 02/095075; WO 03/059384; WO 03/092592; WO 03/103571; WO 2004/045529; e WO 2006/044857). Em outro método, a pro- teína de envelope E de ChimeriVax™-JE foi sondada para sítios de inserção permissivos usando um transpóson. De acordo com este método, um trans- póson inserido em um vírus mutante viável é substituído com um peptídeo estranho desejado (vide, por exemplo, WO 02/102828).

Mason e outros recentemente publicaram um novo método para a construção de vacinas de flavivírus (RepIiVax) com base em partículas vi- rais pseudoinfecciosas (PIV) (Mason et ai., Virology 351:432-443, 2006). Em PIVs de flavivírus (até aqui descrito para vírus de YF 17D e WN), o gene da proteína do capsídeo é deletado, com a exceção da seqüência sinal de cicli- zação de 5' que ocupa -20 códons N-terminais de C. PIVs são propagadas em células nas quais a proteína C é provida in trans. O posterior é necessá- rio para empacotamento de PIV nas partículas da progênie viral (PIV). PIVs empacotadas nos sobrenadantes da cultura celular são colhidas e usadas como uma vacina de replicação de ciclo simples que induz uma resposta de anticorpo potente, devido à secreção de partículas virais vazias, como tam- bém um arsenal quase completo de respostas de células Τ. A robustez deste método é em parte devido à habilidade dos flavivírus (por exemplo, YF 17D), e desse modo PIVs, para infetar células dendríticas e ativar múltiplas vias de TLR, intensificando a resposta imune (Palmer et al., J. Gen. Virol. 88:148- 156, 2007; Querec et al., J.E.M. 203:413-424, 2006).

Além de serem usados como vacinas contra infecção por flaviví- rus, os flavivírus, tais como flavivírus quiméricos, foram propostos para o uso como vetores para a liberação de outros antígenos de não-flavivírus. Em um exemplo de um tal uso, um método racional para inserção de peptídeos es- tranhos na proteína de envelope E do vírus de YF17D foi descrito, com base no conhecimento da estrutura terciária da partícula de flavivírus, como solu- cionado por microscopia de crioelétrons e ajustando a estrutura de raio X conhecida do dímero da proteína E no mapa de densidade de elétrons (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995; Kuhn et al., Cell 108:717-725, 2002). A estrutura tridimensional do trímero da proteína E em sua conformação pós- fusão foi também resolvida (Modis et al., Nature 427:313-319, 2004; Bressa- nelli et al., EMBO J. 23:728-738, 2004). Galler e outros examinaram as es- truturas 3D do dímero e trímero da proteína E e concluíram que a alça fg do domínio de dimerização Il deveria ser exposta ao solvente nas conforma- ções do dímero e trímero. Eles usaram esta alça para inserir epítopos humo- rais de malária e células T na proteína E do vírus de YF17D e restabelece- ram alguns mutantes viáveis (Bonaldo et al., J. Virol. 79:8602-8613, 2005; Bonaldo et al., J. Mol. Biol. 315:873-885, 2002; WO 02/072835). Porém, o uso deste método não assegura que um sítio selecionado seja permissi- vo/ótimo para a inserção de cada peptídeo estranho desejado em termos de replicação viral eficiente (como comprovado por alguns dados de Galler et al.), imunogenicidade, e estabilidade. Também, este método não é aplicável às proteínas virais para as quais as estruturas 3D são desconhecidas (por exemplo, prM/M, NS1, e a maioria das outras proteínas de NS de flavivírus).

Em outros métodos, proteínas/peptídeos imunogênicos estra- nhos podem ser expressados dentro dos vetores de flavivírus se inseridos intergenicalmente na ORF viral. Por exemplo, Andino e outros tentaram ex- pressar um antitumor de epítopo de CTL antitumor de 8 aminoácidos flan- queado por sítios virais de clivagem de NS2B/NS3 protease em várias locali- zações dentro da poliproteína do vírus YF 17D, por exemplo, a junção de NS2B/NSI (McAIIister et al., J. Virol. 74:9197-9205, 2000). Outros usaram o sítio de NS2B/NSI para expressar um epítopo de células T imunodominante do vírus influenza (Barba-Spaeth et al., J. Exp. Med. 202:1179-1184, 2005). Tao et al. expressaram um epítopo de CTL de 10 aminoácidos do parasita da malária na junção de NS2B-NS3 em vírus de YF 17D, e demonstraram proteção boa de camundongos do desafio de parasitas (Tao et al., J. Exp. Med. 201:201-209, 2005). Recentemente, foi expressado peptídeo de M2e de influenza na junção de E/NS1 (U. S. No. 60/900.672), e Bredenbeek et al. também teve sucesso expressando o precursor da glicoproteína do vírus Lassa na junção de E/NS1 (Bredenbeek et al., Virology 345:299-304, 2006). Outras junções gênicas podem também ser usadas. Em outros métodos, antígenos estranhos foram expressados bicistronicamente (por exemplo, na 3'UTR). Em outros métodos, replicons de flavivírus de ciclo simples foram desenvolvidos como candidatos recombinantes de vacina contra vários pa- tógenos, e o potencial imunogênico dos replicons recombinantes foi demons- trado (Jones et ai., Virology 331:247-259, 2005; Molenkamp et al., J. Virol. 77:1644-1648, 2003; Westaway et al., Adv. Virus. Res. 59:99-140, 2003;

Herd et al., Virology 319:237-248, 2004; Harvey et al., J. Virol. 77:7796-7803, 2003; Anraku et al., J. Virol. 76:3791-3799, 2002; Varnavski et al., J. Virol. 74:4394-4403, 2000). Em um replicon, os genes prM e E da proteína de en- velope ou os genes C-prM-E são deletados. Portanto, ele pode replicar-se dentro das células mas não pode gerar progênie viral (consequentemente replicação de ciclo simples). Ele pode ser empacotado nas partículas virais quando os genes prM-E ou C-prM-E forem fornecidos in trans. Antígenos estranhos de interesse são apropriadamente inseridos no lugar da deleção. Como no caso de RepIiVax, seguindo vacinação, um ciclo simples de repli- cação segue, sem outra expansão para célula/tecidos circunvizinhos, resul- tando em resposta imune contra antígeno heterólogo expresso. Alternativa- mente, imunização pode ser alcançada por inoculação de replicon na forma de DNA ou RNA descoberto. Em outros métodos, imunógenos estranhos podem ser expressados em PIVs de RepIiVax, por exemplo, no lugar do ge- ne C deletado (Mason et al., Virology 351:432-443, 2006). ANTECEDENTES SOBRE INFLUENZA. Imunógenos de infIuenza foram usados nesta aplicação como antígenos modelos. Vírus influenza é uma causa principal de doença das vias respiratórias agudas mundialmente. Sur- tos anuais são responsáveis por mais de 100.000 hospitalizações e 20.000 a 40.000 mortes só nos EUA (Brammer et al., MMWR Surveill. Summ. 51:1-10, 2002: Lui et al., Am. J. Public Health 77:712-6, 1987; Simonsen, Vaccine 17:S3-10, 1999; Thompson et al., JAMA 289:179-186, 2003). Aproximada- mente 20% das crianças e 5% dos adultos no mundo ficaram doentes devido à influenza anualmente (Nicholson et al., Lancet 362:1733-1745, 2003). His- toricamente, três subtipos do vírus influenza A circulam nas populações hu- manas, H1N1, H2N2, e H3N2. Desde 1968, H1N1 e H3N2 circularam quase exclusivamente (Hilleman, Vaccine 20:3068-3087, 2002; Nicholson et al., Lancet 362:1733-1745, 2003; Palese et al., J. Clin. Invest. 110:9-13, 2002). Vírus influenza Β, no qual há apenas um subtipo reconhecido, também circu- la em seres humanos, mas em geral causa uma doença mais moderada que o vírus influenza A. Vacinas inativadas correntes contêm três componentes, com base nas cepas de influenza A e influenza B H1N1 e H3N2 seleciona- das (Palese et al., J. Clin. Invest. 110:9-13, 2002). Pandêmicos periódicos, tais como o pandêmico de H1N1 de 1918, podem matar milhões de pessoas. Os peritos de influenza concordam que outro pandêmico de influenza é ine- vitável e pode ser iminente (Webby e Webster, Science 302:1519-1522, 2003). O surto atual de influenza aviária de H5N1 - o maior sob registro, causado por uma cepa altamente letal para seres humanos - tem o potencial (através de mutação e/ou reagrupamento genético) de se tornar uma cepa pandêmica, com conseqüências devastadoras. Outra situação alarmante surgiu em 2003 nos Países Baixos, onde um surto de influenza aviária de H7N7 pequeno mas altamente patogênico ocorreu em trabalhadores de in- dústrias avículas. Outros subtipos que apresentam uma ameaça pandêmica é o vírus H9 e H6. Embora menos virulento que o vírus de H5 e H7, ambos propagaram-se de pássaros aquáticos para aves durante os últimos 10 a- nos. Também, foram detectados vírus de H9N2 em porcos e seres humanos (Webby e Webster, Science 302:1519-1522, 2003). Ainda apesar da quanti- dade grande de atenção recebida por vírus aviários nos últimos anos, os vírus tradicionais do subtipo H1, H2, e H3 continuam representando uma preocupação, porque cepas altamente virulentas podem surgir devido à in- trodução de novas cepas antigenicamente distantes. Por exemplo, vírus de H2 está na categoria de alto risco, porque eles eram os agentes causativos do pandêmico de influenza "asiática" de 1957 e continua circulando em pa- tos selvagens e domésticos.

A estratégia atual para prevenção e controle da doença de influ- enza é vacinação anual contra as cepas virais prováveis de ser circulantes naquele ano. A maioria das vacinas de influenza licenciadas são produzidas em ovos de galinha embrionados e consistem em virions inteiros inativados ou subunidades virais parcialmente purificadas (vacinas "divididas"). Estas vacinas são 70 a 90% eficazes em adultos saudáveis normais (Beyer et al., Vaccine 20:1340-1353, 2002). Porém, eficácia contra doença é pior no anci- ão. Vacinas intranasais vivas, atenuadas também fabricadas em ovos em- brionados, estão disponíveis nos EUA e na antiga União Soviética (Treanor et al., Em: New Generation Vaccines, 3ã edição. Editado por Levine, Μ. M.

Nova Iorque, Basel: Mareei Dekker; págs. 537-557, 2004). A vacina dos EUA (Flumist®) não é aprovada para o uso em crianças abaixo de 5 ou para pes- soas com mais de 55 anos de idade, as populações alvo principais para va- cinação de influenza. Porque as principais proteínas de hemaglutinina de influenza e de neuraminidase reconhecidas pelo sistema imune estão alte- rando continuamente por mutação e reagrupamento, a composição da vaci- na tem que ser alterada anualmente para refletir as características antigêni- cas das cepas virais então circulantes. Desse modo, as vacinas atuais de- vem ser preparadas a cada ano, logo antes da estação da influenza, e não podem ser armazenadas para o uso no caso de um pandêmico. Além disso, o uso de ovos embrionados para fabricação é muito ineficiente. Apenas 1 a 2 doses humanas de vacina inativada de cada ovo são produzidas. Uma pro- visão suficiente de ovos livres de patógeno é uma limitação da fabricação atual para vacinas convencionais. Até mesmo durante períodos interpandê- micos, 6 meses são tipicamente requeridos para produzir quantidades sufici- entes de vacinas de influenza anuais (Gerdil, Vaccine 21:1776-1779, 2003). Há vários esforços de desenvolvimento em andamento para fabricar vacinas de influenza em cultura de células. Porém, há também vários desafios asso- ciados a este método, em particular o uso de linhagens celulares não- aprovadas. Se ovos ou culturas celulares forem usados para produção da vacina, métodos de genética reversa ou reagrupamento genético devem ser empregados para converter a cepa viral circulante nova para a qual uma va- cina é desejada em uma cepa de produção que replica para titulação sufici- ente para fabricação. Todos estes atributos associados às vacinas de influ- enza convencionais são inaceitáveis em face a um pandêmico de influenza. O desenvolvimento de novas vacinas de influenza com base em

hemaglutinina recombinante (HA) ou HA liberada por vetores de adenovírus ou alfavírus melhorou a eficiência de fabricação, mas não focaliza o proble- ma da tendência genética anual e o requerimento de reconstruir a vacina a cada ano.

Em resumo, os desafios a seguir com as vacinas de influenza atuais são reconhecidos: 1. Baixa eficácia no caso de pareamento fraco da vacina e cepa

viral; faixa de idade limitada para vacinas vivas adaptadas ao frio.

2. Requerimento para fazer novas vacinas anualmente para tra- tar das alterações antigênicas no vírus.

3. Baixos rendimentos da vacina de fabricação.

4. Tempo para construção dos vírus de reagrupamento apropri-

ados para fabricação.

5. Capacidade de fabricação insuficiente para satisfazer as de- mandas de um pandêmico.

6. Preocupações de biossegurança durante a fabricação em

grande escala dos vírus patogênicos inativados.

7. Reações adversas nas vacinas alérgicas a produtos de ovo, ou devido à atenuação insuficiente no caso de algumas vacinas vivas virais adaptadas ao frio (Treanor et al., Em: New Generation Vaccines, 31 edição. Editado por Levine, Μ. M. Nova Iorque, Basel: Mareei Dekker; págs. 537-

557,2004).

O 'santo gral' para vacinologia de influenza seria um produto simples que suscite imunidade protetora vasta, de longa duração contra to- das as cepas de influenza, e possa ser fabricado em rendimento alto e baixo custo, e armazenado.

Todas vacinas de influenza convencionais eficazes suscitam an-

ticorpos neutralizantes de vírus contra HA, que correntemente representa o correlato de proteção imune. Porém, a antigenicidade de HA altera anual- mente. Nos últimos anos, outras proteínas do vírus influenza chamaram a atenção como alvos de vacina. A proteína M2, e em particular, o ectodomí-

nio M2 (M2e), é altamente conservada entre o vírus influenza A. Mostrado na figura 9A está o alinhamento das seqüências de M2e humanos e aviárias e mais prematuras e as mais recentes (de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html). Não só é o domínio de M2e dos vírus influenza humanas conservados entre eles, as seqüências de M2e do vírus aviário são também estritamente alinhadas. O nível mais alto de conservação da seqüência reside na porção N-terminal de M2e. É desse modo extremamente notável que tem sido mostrado que os 13 aminoácidos N-terminais do peptídeo de M2e (sombreados no alinhamento) são primari- amente responsáveis pela indução de anticorpos protetores (Liu et a!., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35:141-146, 2003; Liu et al., Immunol. Lett. 93:131- 136, 2004; Liu et al., Microbes. Infect. 7:171-177, 2005). Isto deu origem ao conceito, e esperança, de uma vacina do vírus influenza A universal.

M2e representa a porção externa de 23 aminoácidos de M2, uma proteína de superfície secundária do vírus. Embora não proeminente em virions de influenza, M2 é expressado abundantemente na superfície de células infetadas pelo vírus. Porém, durante a infecção do vírus influenza normal, ou sob imunização com vacinas convencionais, há uma resposta de anticorpo muito pequena a M2 ou determinante de M2e. Não obstante, um anticorpo monoclonal de neutralização de não-vírus direcionado contra a proteína de M2 foi mostrado ser protetor em um modelo de camundongo letal de influenza sob transferência passiva (Fan et al., Vaccine 22:2993- 3003, 2004; Mozdzanowska et al., Vaccine 21:2616-2626, 2003; Treanor et al., J. Virol. 64:1375-1377, 1990). Com base nestes resultados, há interesse considerável em M2 e seu domínio de M2e altamente conservado como um componente de vacina de influenza A por vários desenvolvedores de vacina.

Anticorpos para M2 ou M2e não neutralizam o vírus mas, do contrário, reduzem a replicação eficiente do vírus suficientemente para pro- teger contra doença sintomática. Acredita-se que o mecanismo de proteção suscitado por M2 envolva citotoxicidade celular dependente de anticorpo mediada por célula de NK (ADCC). Anticorpos contra o ectodomínio de M2e (predominantemente da subclasse de lgG2a) reconhecem o epítopo exibido em células infetadas por vírus, que predestina a eliminação das células infe- tadas por células de NK (Jegerlehner et al., J. Immunol. 172:5598-1605, 2004). Porque a imunidade suscitada por M2 não é esterilizante, a replica- ção limitada do vírus é permitida seguindo infecção, que serve para estimu- lar uma resposta imune de anti-influenza de espectro vasto. Teoricamente, isto poderia levar a uma memória imunológica mais longa, mais forte e pro- teção melhor de encontros subsequentes com o mesmo vírus ou cepas hete- rólogas (Treanor et al., Em: New Generation Vaccines, 3ã edição. Editado por Levine, Μ. M. New York, Basel: Mareei Dekker; págs. 537-557, 2004).

Walter Fiers e outros (Ghent University, Bélgica) foram entre os primeiros a demonstrar o potencial de vacinas com base em M2e. Eles fundi- ram geneticamente o determinante de M2e à proteína de núcleo do vírus da hepatite B, que quando expressado em bactérias, resultou em apresentação de M2e na superfície das partículas de núcleo do vírus da hepatite B (HBc) (Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004; Neirynck et al., Nat. Med. 5:1157-1163, 1999). Estas partículas de HBc-M2e foram mostradas ser imu- nogênicas em camundongos e furões, e protetoras em um modelo de desa- fio do vírus influenza em cada espécie.

Outro domínio conservado do vírus influenza é o sítio de cliva- gem de maturação da proteína precursora de HA, HA0. Seu nível alto de conservação (Macken et al., Em: Osterhaus, A. D. M. E., Cox, N., e Hamp- son A. W. eds., Options for the control of influenza IV. Elsevier Science, Amsterdã, Países Baixos, pág., 103-106, 2001) é devido a duas restrições funcionais. Primeiro, a seqüência tem que permanecer um substrato ade- quado para proteases hospedeiras que liberam as duas subunidades de HA maduras, HA1 e HA2. Segundo, o término N de HA2 contém o peptídeo de fusão que é crucial para a infecção (Lamb e Krug, Em: Fields Virology. Quar- ta edição. Editado por Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., et al. Fila- délfia: Lippincott Williams e Wilkins; págs. 1043-1126, 2001). O peptídeo de fusão é conservado em ambos vírus influenza A e B. Em um recente relató- rio, Bianchi e outros (Bianchi et al., J. Virol. 79:7380-7388, 2005) demonstra- ram que um peptídeo de clivagem de HA0 conjugado do vírus influenza B suscitou imunidade protetora em camundongos contra desafio letal com li- nhagens do vírus influenza B antigenicamente distantes. Notavelmente, um peptídeo de A/H3/HA0 conjugado também protegeu camundongos imuniza- dos do desafio de influenza B. Arg estritamente conservado na posição -1 (o último resíduo de HA1 precedendo o ponto de clivagem), e os resíduos de Phe +3 e +9 (os 3Q e 9Q resíduos de HA2) foram críticos para ligação de anti- corpos monoclonais. Desse modo, a porção C-terminal conservada do pep- tídeo parece ser responsável pela proteção, sugerindo a possibilidade de fazer uma vacina universal do vírus influenza humana tipo AeB com base no domínio de clivagem HA0. O alinhamento das seqüências de HA0 humana (H1, H2, H3, e B) e todas disponíveis de HA0 de influenza aviária (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html) resultou nas sequên- cias de consenso (região crítica para ligação de anticorpo e imunogenicidade está sombreada) mostradas na figura 9B.

Recentemente, um banco de dados em linha inclusivo (The I- ummune Epitope Database and Analysis Resources (IEDB)) tornou-se dis- ponível que captura vários dados de epítopo (www.immuneepitope.org). Esta base de dados foi compreensivamente analisada e muitos epítopos de influ- enza de proteção cruzada, que também podem ser adequados para a cons- trução de vacinas universais, foram identificados (Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 104:246-251, 2007 e tabelas suplementares). Epítopos promisso- res tanto de células BeT foram identificados (incluindo o epítopo protetor de HA de influenza de H3N2 usamos abaixo). A maioria dos epítopos de células B são conformacionais e desse modo são de tamanho considerável. Porém, deveria ser possível identificar sítios permissivos para tais epítopos mais longos, por exemplo, em proteínas segregadas dos vírus de ChimeriVax, pelo método de inserção aleatória direta descrito neste pedido de patente. Alguns sítios altamente permissivos que foram encontrados para inserções mais curtas podem ser permissivos para inserções longas (por exemplo, em proteína de prM de ChimeriVax-JE, vide abaixo).

Vários métodos de vacina de subunidade de M2e estão sendo procurados, incluindo conjugados de peptídeo e partículas de apresentação de epítopo. Porém, estes métodos requerem adjuvantes poderosos para re- forçar a imunogenicidade destes imunógenos fracos. Isto é particularmente crítico no caso de M2e (e provavelmente HA0). Por causa do mecanismo proposto de proteção (ADCC), níveis altos de anticorpos específicos são re- queridos para eficácia. Supõe-se que IgG normal sérica compita com IgG específica (anti-M2e) para os receptores de Fc em células de NK que são os mediadores principais de proteção. Desse modo, métodos alternativos para vacinas de influenza pandêmicas universais necessitam ser explorados. A descrição acima da significação médica de influenza, a necessidade por uma vacina de influenza universal melhorada, e a disponibilidade de epíto- pos/antígenos apropriados do vírus influenza fornecem um exemplo de um patógeno importante para o qual uma vacina nova pode ser criada usando os métodos descritos neste pedido de patente. Métodos descritos neste pe- dido de patente podem ser igualmente aplicáveis para a construção de vaci- nas novas/melhoradas contra outros patógenos, como descritos abaixo. Sumário da Invenção

A invenção provê métodos para gerar genomas virais que inclu- em uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam um ou mais peptídeos heterólogos. Estes métodos incluem as etapas de: (i) fornecer um ou mais genes virais alvos (em, por exemplo, um ou mais vetores ponte ou no contexto de um genoma viral intacto); (ii) submeter o gene viral alvo à mutagênese para fortuitamente inserir sítios de inserção; e (iii) ligar uma mo- lécula de ácido nucléico que codifica um peptídeo heterólogo nos sítios alea- tórios de mutagênese do gene viral alvo. Os métodos podem também incluir as etapas de (iv) transfeccionar as células com bibliotecas de ácido nucléico genômico para iniciar replicação do vírus, seguido por (v) selecionar recom- binantes viáveis do vírus (replicando eficientemente) que permite apresenta- ção eficiente do peptídeo inserido. Quando realizados no contexto de um ou mais vetores ponte, os métodos podem também incluir a etapa de introduzir o gene viral alvo incluindo a biblioteca de molécula de ácido nucléico que codifica o peptídeo heterólogo no genoma viral do qual o gene viral alvo foi derivado, no lugar do gene viral correspondente desprovido da inserção. Os métodos da invenção também incluem gerar vetores virais

dos genomas virais mediante introdução dos genomas virais nas células (por exemplo, células Vero), como também isolar os vetores virais das células ou os sobrenadantes dos mesmos. Além disso, os genes virais alvos submeti- dos aos métodos da invenção podem ser obtidos dos vírus que foram sub- metidos a este método antes (ou que têm inserções introduzidas através de outros meios), ou vírus desprovidos de inserções.

Os métodos da invenção podem também incluir submeter dois

ou mais vetores ponte (por exemplo, 2, 3, 4, ou mais), incluindo dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou mais) genes virais alvos, à mutagênese, e introduzir dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou mais) genes virais alvos, incluindo mo- léculas de ácido nucléico que codificam um ou mais peptídeos heterólogos, no genoma viral, no lugar dos genes virais correspondentes desprovidos de inserções.

A etapa de mutagênese dos métodos da invenção pode envolver introdução de um ou mais transiniciadores nos genes virais alvos através de mutagênese de transpóson, ou simultânea ou seqüencialmente. Tais transi- niciadores podem ser removidos por digestão de endonuclease e as molécu- las de ácido nucléico que codificam peptídeos heterólogos podem ser depois introduzidas nos genes virais alvos através de ligação nos sítios de digestão de endonuclease de restrição. Também, os métodos da invenção podem envolver a geração de bibliotecas de genes virais alvos mutados. Os genomas virais submetidos aos métodos da invenção podem

ser genomas de flavivírus, tais como flavivírus quimérico, por exemplo, um flavivírus quimérico que inclui as proteínas de capsídeo e não-estruturais de um primeiro flavivírus e as proteínas de pré-membrana e de envelope de um segundo flavivírus diferente. Em um tal exemplo, o primeiro e segundo flavi- vírus podem independentemente ser selecionados, por exemplo, do grupo que consiste em encefalite japonesa, Dengue-1, Dengue-2, Dengue-3, Den- gue-4, febre amarela, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ocidental, Kunjin, encefalite de Rocio, Ilhéus, encefalite de carrapato, encefalite da Europa Central, encefalite siberiana, encefalite russa da prima- vera-verão, doença de Kyasanur Florest, febre hemorrágica de Omsk, doen- ça de Louping, vírus de Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, e Hypr. Além disso, os genomas de flavivírus intactos podem ser submetidos à presente invenção (por exemplo, genomas do vírus da febre amarela, tais como YF17D).

Os genes virais alvos que temas dos métodos da invenção po- dem ser, por exemplo, selecionados do grupo que consiste em genes que codificam proteínas de envelope, capsídeo, pré-membrana, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e de NS5.

Os peptídeos heterólogos introduzidos nos genomas virais, de acordo com os métodos da invenção, podem incluir um ou mais epítopos de vacina (por exemplo, um epítopo de células B e/ou um epítopo de células T). Os epítopos podem ser derivados de um antígeno de um patógeno viral, bacteriano, ou parasitário. Por exemplo, os epítopos podem ser derivados de um vírus influenza (por exemplo, um vírus influenza humana ou aviária). No caso de epítopos do vírus influenza, os peptídeos heterólogos podem incluir, por exemplo, peptídeos de M2e de influenza ou peptídeos incluindo um sítio de clivagem da proteína precursora de hemaglutinina de influenza (HA0). Em outros exemplos, os epítopos são derivados de antígenos associados ao tumor, ou alergênios. Exemplos adicionais de fontes (por exemplo, patóge- nos) das quais peptídeos heterólogos podem ser obtidos, como outros e- xemplos de tais peptídeos e epítopos, são fornecidos abaixo. A invenção também inclui genomas virais gerados por quaisquer

dos métodos descritos aqui, ou os complementos dos mesmos. Também, a invenção inclui vetores virais codificados por tais genomas virais, composi- ções farmacêuticas incluindo tais vetores virais e um veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável, e métodos de liberar peptídeos para pacientes, envolvendo administrar aos pacientes tais composições farmacêuticas. Em um exemplo de tais métodos, o peptídeo é um antígeno e a administração é realizada para induzir uma resposta imune a um patógeno ou tumor do qual o antígeno é derivado.

A invenção também inclui vetores de flavivírus incluindo um ou mais peptídeos heterólogos inseridos dentro de uma ou mais proteínas sele- cionadas do grupo que consiste em proteínas de capsídeo, pré-membrana, envelope, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e de NS5, se ou não pro- duzidas pelos métodos descritos aqui. Os flavivírus podem ser, por exemplo, vírus da febre amarela (por exemplo, YF17D) ou flavivírus quiméricos (por exemplo, flavivírus quiméricos incluindo as proteínas de capsídeo e não- estruturais de um primeiro flavivírus e as proteínas de pré-membrana e de envelope de um segundo flavivírus diferente). O primeiro e segundo flaviví- rus das quimeras podem ser independentemente selecionados do grupo que consiste em encefalite japonesa, Dengue-1, Dengue-2, Dengue-3, Dengue- 4, febre amarela, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ocidental, Kunjin, encefalite de Rocio, Ilhéus, encefalite de carrapatos, ence- falite da Europa Central, encefalite siberiana, encefalite russa da primavera- verão, doença de Kyasanur Florest, febre hemorrágica de Omsk, doença de Louping, vírus de Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, e Hypr.

A invenção também inclui moléculas de ácido nucléico que cor- respondem aos genomas dos vetores de flavivírus descritos acima e em ou- tro lugar aqui, ou os complementos dos mesmos; composições farmacêuti- cas incluindo tais vetores virais e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; como também métodos de liberar peptídeos para pacientes medi- ante administração de tais composições. Em um exemplo de tais métodos, o peptídeo é um antígeno e a administração é realizada para induzir uma res- posta imune a um patógeno ou tumor do qual o antígeno é derivado.

Em um exemplo específico, a invenção inclui vetores de flaviví- rus como descritos aqui que incluem uma inserção de um peptídeo heterólo- go entre os aminoácidos 236 e 237 da proteína 1 não-estrutural (NS1). Um exemplo adicional, que pode existir sozinho ou em combinação com outras inserções (por exemplo, o NS1 inserem), é um vetor incluindo inserção de um peptídeo heterólogo na região amino-terminal da proteína de pré- membrana do vetor. Esta inserção pode ser localizada, por exemplo, na po- sição -4, -2, ou -1 que precedem o sítio de clivagem de capsídeo/pré- membrana, ou posição 26 da proteína de pré-membrana (ou uma combina- ção das mesmas). Também, as inserções de pré-membrana podem incluir, opcionalmente, um sítio de clivagem proteolítico que facilita a remoção do peptídeo da proteína de pré-membrana. Exemplos específicos de peptídeos que podem ser incluídos nos vetores da invenção incluem peptídeo de M2e de influenza (por exemplo, humana ou aviária) ou um peptídeo incluindo um sítio de clivagem da proteí- na precursora de hemaglutinina de influenza (por exemplo, humana ou influ- enza) (HA0). Estas seqüências podem ser de ocorrência natural ou de con- senso. Exemplos adicionais são fornecidos abaixo e em outro lugar aqui. Também, os vetores podem incluir mais de um peptídeo heterólogo, por e- xemplo, os peptídeos de M2e de influenza humana e aviária. Além disso, os vetores da invenção podem incluir uma ou mais segundas adaptações do sítio, como descritas aqui, que podem fornecer propriedades melhoradas ao vetor (por exemplo, características de crescimento melhoradas).

A invenção também inclui moléculas de ácido nucléico que cor- respondem aos genomas dos vetores de flavivírus descritos aqui, ou os complementos dos mesmos. Também, a invenção inclui composições far- macêuticas incluindo os vetores virais. As composições podem, opcional- mente, incluir um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitá- veis. Também, as composições podem opcionalmente incluir um adjuvante (por exemplo, um composto de alumínio, tal como alume). As composições podem também ser em forma liofilizada. Também inclusos na invenção são métodos de liberar peptídeos

a sujeitos (por exemplo, pacientes, tais como pacientes humanos, ou ani- mais, tais como animais domésticos ou gado) que envolvem administração das composições descritas aqui. Em um exemplo, os métodos são realiza- dos para induzir uma resposta imune a um patógeno ou tumor do qual o an- tígeno é derivado. Em outros exemplos, os métodos envolvem administração de uma vacina de subunidade. Nestes exemplos, o vetor de flavivírus e a vacina de subunidade podem ser coadministrados, o vetor de flavivírus pode ser administrado como uma dose preparatória e a vacina de subunidade po- de ser administrada como uma dose de reforço, ou a vacina de subunidade pode ser administrada como uma dose preparatória e o vetor de flavivírus pode ser administrado como uma dose de reforço. A vacina de subunidade pode incluir, por exemplo, partículas de núcleo do vírus da hepatite B inclu- indo uma fusão de um peptídeo heterólogo (por exemplo, um peptídeo de M2e de influenza ou um peptídeo incluindo um sítio de clivagem da proteína precursora de hemaglutinina de influenza (HA0)) à proteína de núcleo de ví- rus da hepatite B. Estes peptídeos podem ser seqüências de ocorrência na- tural ou de consenso, como descritas aqui.

A invenção também inclui métodos de fazer vetores como des- critos aqui, envolvendo inserção das seqüências que codificam os peptídeos de interesse em sítios identificados como sendo permissivos para tais inser- ções (usando, por exemplo, os métodos descritos aqui). Estes vetores po- dem ser vetores de flavivírus (por exemplo, vetores de febre amarela ou fla- vivírus quimérico como descrito aqui (por exemplo, ChimeriVax™-JE ou ChimeriVax™-WN)). Sítios exemplares para inserção incluem NS1-236 e posições -4, -2, ou -1 que precedem o sítio de clivagem de capsídeo/pré- membrana, ou posição 26 da proteína de pré-membrana. Também, a invenção inclui métodos de fazer composições far-

macêuticas, por exemplo, misturando quaisquer dos vetores descritos aqui com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitável, um ou mais adju- vantes, e/ou um ou mais agentes ativos adicionais (por exemplo, uma vacina de subunidade).

A invenção também inclui uso de todos os vetores virais, molé-

culas de ácido nucléico, e peptídeos descritos aqui na preparação de medi- camentos para o uso nos métodos profilácticos e terapêuticos descritos aqui.

A invenção fornece várias vantagens. Por exemplo, vírus de va- cina viva (por exemplo, ChimeriVax™, vírus da febre amarela, ou outros ví- rus de vacina viva), como usados na invenção, fornecem benefícios signifi- cativos com respeito à liberação das moléculas pequenas de antígeno de polipeptídeo (por exemplo, peptídeos do sítio de clivagem de M2e de influ- enza ou HA0). As vantagens de usar vetores vivos, tais como vetores com base em flavivírus, incluem (i) expansão da massa antigênica seguindo ino- culação da vacina; (ii) a falta de necessidade por um adjuvante; (iii) a intensa estimulação de respostas imunes inatas e adaptáveis (YF17D, por exemplo, é o imunógeno conhecido mais poderoso); (iv) a possibilidade de uma apre- sentação de antígeno mais favorável devido, por exemplo, à habilidade de ChimeriVax™ (YF17D) infetar células de apresentação de antígeno, tais co- mo células dendríticas e macrófagos; (v) a possibilidade de obter uma vacina de dose única que fornece imunidade de vida longa; (vi) os envelopes dos vírus de vacina de ChimeriVax™ são facilmente trocáveis, dando uma esco- lha de vacinas recombinantes diferentes, algumas destas são mais apropria- das que as outras em áreas geográficas diferentes (para fazer vacinas duais incluindo contra um flavivírus endêmico, ou para evitar imunidade de antive- tor em uma população) ou para uso seqüencial; (vii) a possibilidade de modi- ficar vetores de flavivírus de vida completa em replicons de replicação de ciclo simples empacotado, ou PIVs descritos acima a fim de eliminar a chan- ce de eventos adversos ou minimizar o efeito da imunidade de antivetor du- rante o uso seqüencial; (viii) a possibilidade para combinar epítopos inseri- dos usando o método de mutagênese aleatória direta descrita aqui com ou- tros antígenos expressados de forma intergênica, ou bicistronicamente, ou no lugar das deleções em replicons ou PIVs para obter uma resposta imune mais robusta contra um patógeno (se os epítopos e outros antígenos ex- pressos pertencerem ao mesmo patógeno) ou dois ou mais patógenos (se os epítopos e outros antígenos expressos pertencerem a patógenos diferen- tes), e (ix) o baixo custo de fabricação.

Vantagens adicionais fornecidas pela invenção referem-se ao fato de que os vetores de flavivírus quiméricos da invenção são suficiente- mente atenuados para estar seguros, e ainda podem induzir imunidade pro- tetora ao flavivírus do qual as proteínas nas quimeras são derivadas e, em particular, os peptídeos inseridos nas quimeras. Segurança adicional vem do fato que alguns dos vetores usados na invenção são quiméricos, desse mo- do eliminando a possibilidade da reversão para o tipo selvagem. Uma vanta- gem adicional dos vetores usados na invenção é que os flavivírus replicam- se no citoplasma das células, de forma que a estratégia de replicação viral não envolve integração do genoma viral na célula hospedeira, fornecendo uma medida de segurança importante. Além disso, como é debatido também abaixo, um vetor simples da invenção pode ser usado para liberar epítopos múltiplos de um antígeno simples, ou epítopos derivados de mais de um an- tígeno.

Uma vantagem adicional é que o método de inserção aleatória direta descrito aqui pode resultar na identificação de sítios amplamente per- missivos em proteínas virais que podem ser usadas para diretamente inserir vários outros epítopos (como exemplificado abaixo para uma localização de inserção em NS1), como também inserções mais longas. Uma vantagem adicional é que alguns sítios de inserção observados altamente permissivos em um flavivírus podem ser igualmente permissivos em outros flavivírus de- vido à conservação da estrutura/função em proteínas de flavivírus diferentes. Uma vantagem adicional é os flavivírus recombinantes carregando um epí- topo podem ser usados como um intensificador para, por exemplo, uma va- cina de subunidade, ou um componente sinergístico em uma vacina mistu- rada composta, por exemplo, de uma subunidade ou componente de vacina morta administrado junto com o componente viral recombinante resultando em uma intensificação significativa da resposta imune (como exemplificado abaixo para vírus A25 misturado junto com vacina de subunidade de ACAM- influenza A). Também, o método de inserção aleatória descrito pode ser a- plicado a qualquer genoma de flavivírus (ou flavivírus defeituoso) que foi re- arranjado, por exemplo, tal como em um vírus de TBE modificado em que os genes da proteína estrutural foram transferidos para a extremidade 3' do ge- noma e expressado após NS5 sob o controle de um elemento IRES (Orlinger et al., J Virol. 80:12197-208, 2006).

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada, os desenhos, e as reivindicações a seguir. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 é uma ilustração esquemática da construção dos vírus de ChimeriVax™-JE-influenza por inserção aleatória mediada por transpó- son de um peptídeo de M2e de consenso em prM viral, E, e/ou glicoproteí- nas de NS1. Os genes C e NS2A-NS5 podem também ser alvejados para inserção de peptídeos estranhos (por exemplo, epítopos de células T) usan- do o método ilustrado nesta figura. Figura 2 é uma ilustração esquemática da construção de biblio- tecas de plasmídeo de ChimeriVax™-JE-influenza contendo um peptídeo de M2e fortuitamente inserido em prM/M, E, e genes de NS1.

Figura 3 mostra a expressão de um epítopo protetor de M2d de consenso do vírus de influenza A dentro da proteína de NS1 do vírus de ChimeriVax™-JE, como revelado por tingimento de placas virais com anti- corpos. Placas virais em cavidades de 35 mm foram tingidas no dia 4 pós- infecção com anticorpos policlonais de anti-JE (A) ou um anticorpo monoclo- nal de anti-M2e (B). Placas virais M2e-positivas em uma placa de Petri de 100 mm (contendo várias centenas de placas virais) foram tingidas com um anticorpo monoclonal de anti-M2e (C).

Figura 4 é uma tabela e uma fotografia exibindo os resultados de uma análise das titulações dos clones virais de ChimeriVax™-JE-NS1/M2e purificados selecionados (matérias-primas no nível de P2 após a última eta- pa de purificação) determinou o tingimento com anticorpos policlonais de MAb ou JE de M2e (tabela na esquerda; clones com as titulações mais altas estão em negrito), e um exemplo de tingimento para um dos clones (fotogra- fia à direita). Os resultados demonstram a pureza dos clones e fornecem uma evidência de estabilidade genética alta. Figura 5 é uma ilustração esquemática da localização exata no

gene de NS1 do vírus de vetor de ChimeriVax™-JE, e seqüências nt e a.a. da inserção de M2e identificadas por sequenciação dos clones virais A11- A92, incluindo clone A25 usado nos experimentos descritos abaixo. A inser- ção inteira de 105 nt é realçada. O peptídeo de M2e com resíduos de GG de flanqueamento em ambos os lados (adicionados para flexibilidade) está den- tro da caixa. O sítio de restrição de BstBI (TTCGAA) está sublinhado. Devido à ação de um transpóson, dois resíduos de aminoácido virais que precedem a inserção (SV) foram duplicados no término da inserção (duplamente subli- nhado).

Figura 6A é uma ilustração esquemática do clone A25 do vírus

de ChimeriVax™-JE-NS1/M2e mostrando a localização da inserção de M2e no genoma de vírus, figura 6B é uma fotografia exibindo o tingimento das placas do vírus A25 passado 10 vezes em células Vero com anticorpos es- pecíficos para M2e e JE, demonstrando estabilidade extremamente alta da inserção, figura 6C é um gráfico das curvas de crescimento do vírus A25 nas passagens P2 e P12 quando comparado aos vírus de vetor de Chimeri- Vax™-JE. Painel D é um exemplo da imunofluorescência de células infeta- das com vírus A25 ou vetor de ChimeriVax-JE e tingidas com anticorpos de anti-JE ou de anti-M2e, também ilustrando expressão eficiente do epítopo de M2e pelo vírus A25.

Figura 7 é um gráfico que mostra IgG total M2e-específico no dia 54: valores de OD450 de ELISA para fundo geral serialmente diluídos de soros de camundongo dos grupos imunizados 2 e 3 na Tabela 5.

Figura 8 é um gráfico de curvas de sobrevivência para camun- dongos imunizados mostrados na Tabela 5 seguindo desafio de IN no dia 55 com 20 LD50 do vírus influenza de A/PR/8/34 de camundongo adaptado. Figura 9 é uma ilustração esquemática de alinhamentos dos epí-

topos de M2e (A) e HA0 (B) universais do vírus influenza A. As partes mais essenciais das seqüências (por exemplo, para ligação de anticorpo) estão sombreadas.

Figura 10 é um exemplo de um constructo de multiantígenos que pode ser criado usando o método de inserção aleatória descrito aqui: Um replicon de ChimeriVax-JE que expressa múltiplos imunógenos do vírus in- fluenza A como uma vacina pandêmica de multimecanismo, por exemplo, expressando NA ou HA no lugar dos genes de prM-E, epítopo de M2e fortui- tamente inserido em, por exemplo, NS1, um epítopo de células T imunodo- minantes em, por exemplo, NS3, e um/uns imunógeno(s) adicional(is) inseri- do^) em um (ou mais) dos sítios intergênicos. A 2A autoprotease (de EMCV ou FMDV) clivará NA do resto da poliproteína. Alternativamente, um elemen- to de IRES pode ser usado em vez de 2A autoprotease para reiniciar a trans- lação das proteínas de NS. Uma variedade de elementos (por exemplo, 2A autoprotease, ubiquitina, IRES, AUG autônomo para gene NA, ou sítio de clivagem de protease viral) pode ser usada para produzir o término N de NA no sítio circulado. Similarmente, um constructo da vacina contra vários pató- genos pode ser criada usando antígenos derivados de patógenos diferentes.

Figura 11 é um exemplo de placa de Petri tingida com anticorpo de M2e de células Vero transfeccionadas com biblioteca de RNA de Chime- riVax-JE/NS1-M2e e imediatamente revestidas com ágar, para eliminar competição entre os clones virais. O RNA para transfecção foi sintetizado em modelo de DNA ligado in vitro obtido por ligação da biblioteca de genes de NS1-M2e do plasmídeo pUC-AR03-rM2e no vetor de parada pBSA-AR3.

Figura 12 mostra a expressão com sucesso do peptídeo de M2e na proteína E do vírus de ChimeriVax-JE: focos de mutantes de inserção tingidos com MAb de M2e. (A) Uma variante com a inserção contendo M2e de 35-a.a original tingida no dia 6 (experimento 2). (B e C) Variantes com M2e de 17-a.a. e M2e de 17-a.a. flanqueada com 2 resíduos Gly, respecti- vamente, tingidas no dia 4 (experimento 3).

Figura 13 mostra epítopos de M2e aviário + M2e humano inseri- dos em tandem no sítio de inserção de NS1-236 de ChimeriVax-JE. Tama- nho total da inserção 56 a.a. (A) Representação esquemática do epítopo de M2e aviário adicionado ao vírus A25. (B) Seqüências exatas das duas vari- antes do vírus: painel superior mostra a seqüência do vírus M2e huma- no/M2e aviário construído usando códons nativos na inserção de M2e aviá- rio (M2e humano está sublinhado; M2e aviário está sublinhado com linha pontilhada);

painel do fundo mostra o mesmo, exceto que os códons de M2e aviário fo- ram alterados para degenerar os códons para estabilidade genética mais alta. (C) Placas de vírus de M2e humano/M2e aviário tingidas com anticor- pos de JE e M2e.

Figura 14 mostra que vírus de ChimeriVax-JE tolera epítopo de célula T/B de HAtag (H3 de influenza) no sítio de inserção de NS1-236 iden- tificado usando o epítopo de M2e. (A) A seqüência inserida do vírus viável é restabelecida. (B) Placas do vírus em células Vero são tingidas com 12CA5 de MAb de anti-HAtag.

Figura 15 mostra modos diferentes da expressão do epítopo es- tranho em prM de flavivírus, E, e proteínas de NS1. Figura 16 mostra variantes de inserção de ChimeriVax-JE com M2e na proteína de prM. (A) Exemplos de placas de clones M1, M2, M3, M6, e M8, comparados a ChimeriVax-JE, determinados em um experimento. (B) Curvas de crescimento dos clones de prM-M2e vs. vetor de ChimeriVax-JE.

Figura 17 é uma ilustração esquemática das seqüências dos

clones de ChimeriVax-JE com inserções de M2e em prM. Os sítios de cliva- gem de sinalase mais prováveis e possíveis prognosticados por programa em linha SignaIP 3.0 são mostrados.

Figura 18 mostra análogo de ChimeriVax-WN02 do vírus A25 (ChimeriVax-JE/M2eNS1-236): construção e placas produzidas no dia 6 sob revestimento de agarose e tingidas com MAb de M2e.

Figura 19 mostra vírus de ChimeriVax-WN02/A25 e de Chimeri- Vax-WN02/A25adapt. (A) Placas de linhagens virais purificadas em placa no dia 5 produzidas sob revestimento de metilcelulose, comparadas com o vírus de protótipo A25 e ChimeriVax-WN02. (B) Curvas de crescimento nas célu- las Vero, MOI 0.001. Descrição Detalhada

A invenção fornece métodos de gerar vetores virais que incluem peptídeos heterólogos, vetores virais incluindo tais peptídeos, métodos de liberar estes peptídeos por administração dos vetores virais a fim de, por e- xemplo, induzir uma resposta imune a um patógeno do qual um peptídeo introduzido é derivado, e composições incluindo os vetores virais. Detalhes destes vetores virais, peptídeos, métodos, e composições são fornecidos abaixo.

Uma característica central da invenção diz respeito à construção

de vacinas recombinantes vivas por inserção aleatória de peptídeo(s) imu- nogênico(s) de uma gama extensiva de organismos patogênicos nas proteí- nas de vírus de vacina viva atenuada para expressão eficiente de tais peptí- deos em células infetadas e apresentação para o sistema imune, com o pro- pósito de induzir imunidade forte de longa duração contra patógenos alvos. Para apresentação eficiente, peptídeos estranhos representando, por exem- plo, epítopos de células B, são inseridos fortuitamente nas proteínas virais, tais como proteínas que são segregadas sozinhas de células infetadas (por exemplo, NS1 e a parte amino-terminal de prM dos flavivírus) ou na partícula viral (proteínas de envelope de M e E dos flavivírus) para estimular as res- postas fortes do anticorpo de anti-peptídeo. Peptídeos, tais como peptídeos incluindo epítopos de células T1 podem ser inseridos fortuitamente nas prote- ínas virais não-estruturais que são sintetizadas dentro das células infetadas levando à apresentação dos peptídeos estranhos ao sistema imune por meio do complexo l/ll de MHC1 para induzir imunidade celular forte. Inserções nas proteínas estruturais podem também conduzir à apresentação mediada por MHC eficiente.

Como é explicado também abaixo, a maneira aleatória de inser- ção nos genes virais de acordo com a presente invenção permite seleção da maioria do(s) variante(s) de vírus recombinante competente de replicação, fornecendo a imunogenicidade mais alta do peptídeo inserido (ótima confor- mação de peptídeo) e a estabilidade mais alta de expressão. Também como descrito abaixo, os sistemas de inserção mediados por transpóson comerci- almente disponíveis incluindo, por exemplo, transiniciadores removíveis, po- dem ser usados como ferramentas para a construção de recombinantes da presente invenção. O método da presente invenção é descrito abaixo em detalhes na seção de exemplos experimentais. Brevemente, nestes exem- plos, um epítopo de células B de consenso M2e da proteína de M2 do vírus influenza (também contendo um epítopo de células T), que é altamente con- servado entre as cepas de influenza do tipo A, foi inserido nos genes NS1, prM/M, e E do vírus da vacina de ChimeriVax™-JE. Múltiplos clones do vírus expressando o peptídeo de M2e dentro das proteínas de NS1, prM, e E, re- conhecíveis através dos anticorpos de anti-M2e, foram observados, e alguns foram purificados e também caracterizados in vitro/in vivo. Além disso, como debatido também abaixo, uma inserção de NS1 foi transferida do contexto de ChimeriVax™-JE para ChimeriVax™-WN. Um elemento dos métodos da invenção é o fato que um trans-

póson é usado apenas para fortuitamente inserir um ou mais sítios de restri- ção em um gene desejado (ou genes). Depois, um fragmento de DNA que codifica um peptídeo estranho desejado é incorporado no gene no sítio de restrição. Uma biblioteca de genes mutantes pode ser incorporada em se- guida em um genoma viral completo (cDNA de um vírus de RNA), seguido por transfecção de células e colhendo progênie viral heterogênea. O vírus "seleciona" para si mesmo que localizações de inserção são mais apropria- das, não interferindo com sua viabilidade e replicação eficiente. Um número suficientemente alto de clones de vírus mutante é rapidamente selecionado e depois testado para antigenicidade alta usando anticorpos específicos para o peptídeo inserido, imunogenicidade alta (conformação de peptídeo apro- priada e apresentação às células imunes) imunizando animais e medindo respostas imunes de anti-peptídeo e/ou proteção de desafio, e estabilidade genética, por exemplo, monitorando a presença e expressão do peptídeo durante passagens múltiplas do vírus mutante in vitro ou in vivo, e sequenci- ação do genoma para revelar qualquer adaptação que possa ser valiosa pa- ra um fenótipo biológico do vírus de vacina recombinante (por exemplo, ren- dimento mais alto durante a fabricação, estabilidade genética mais alta, e imunogenicidade mais alta). Como resultado, a "melhor" variante do vírus de vacina é identificada. Este método de "deixar-o vírus-decidir" desse modo fornece benefícios substanciais.

O princípio do método de inserção aleatória, que provê uma ba- se para a presente invenção, é ilustrado na figura 1. Neste exemplo, o peptí- deo de M2e de influenza A foi introduzido nas proteínas de prM/M e E estru- turais e na proteína de NS1 não-estrutural. As proteínas estruturais são libe- radas da célula como parte da partícula viral (a parte N-terminal de prM pode ser também segregada), NS1 é transportado para a superfície das células infetadas, e uma fração deste se separa e circula extracelularmente. Apre- sentação extracelular é uma condição prévia para resposta de anticorpo for- te. Usando proteína de NS1 para apresentar M2e é desse modo particular- mente interessante, porque o peptídeo é liberado à superfície da célula, imi- tando a situação natural com M2 do vírus influenza, que pode ser importante para alguns aspectos de imunidade mediada por M2; enquanto apresenta- ção da proteína de prM e E podem conduzir a uma resposta imune mais alta, uma vez que cópias múltiplas do peptídeo serão apresentadas na superfície de partículas virais que são presumidas ser imunógenos mais fortes.

Um sítio de restrição (por exemplo, um sítio de Pmel) é primeiro fortuitamente incorporado nos genes alvos subclonados (predominantemen- te um sítio por cada molécula de gene, embora esta freqüência possa ser alterada, conforme desejado, por exemplo, por ciclos adicionais de mutagê- nese) usando, por exemplo, um kit comercialmente disponível, tal como um kit de mutagênese mediada por Tn7 de GPS-LS de New England Biolabs (Beverly, MA). A porção de transiniciador do transpóson é depois removida por digestão de endonuclease de restrição (por exemplo, Pmel), e é substitu- ída com uma inserção de DNA de M2e, resultando na geração de uma bi- blioteca de plasmídeo de gene mutante. O fundo geral das moléculas do ge- ne mutado é ligado no cDNA de comprimento total de ChimeriVax™-JE. O modelo de DNA é transcrito in vitro, seguido por transfecção das células com as transcrições de RNA. Clones individuais do vírus da progênie viável são isolados e testados para a presença do peptídeo de M2e, imunogenicidade, e estabilidade genética. Outros detalhes deste exemplo são descritos na se- ção de exemplos experimentais, abaixo.

Em uma variação dos métodos descritos acima, mutagênese acontece no contexto de um genoma viral inteiro, intacto (por exemplo, um cDNA de comprimento total de um vírus contendo RNA clonado em um plasmídeo, ou molécula genômica completa de um vírus de DNA), ou um fragmento de DNA abrangendo vários genes virais, que é seguido por resta- belecimento dos mutantes de inserção viável. Em um tal exemplo, o vírus não só "seleciona" a(s) localização(ões) mais apropriada(s) para a inserção de peptídeos estranhos dentro de uma proteína alvo específica, ele também seleciona a proteína alvo mais apropriada codificada dentro do genoma intei- ro ou um fragmento grande do genoma. Em outra variação, genes apropria- dos de outros organismos vetoriais, tais como bactérias (por exemplo, sal- monela, etc.), podem ser similarmente submetidos à mutagênese de inser- ção aleatória seguido por seleção daquelas variantes recombinantes do or- ganismo que podem ser usadas como vacinas. Em outra variação dos métodos descritos aqui, mais de um transpóson é usado, seqüencial ou simultaneamente, para mutagenizar o mesmo gene alvo para fortuitamente inserir mais de um peptídeo imunogê- nico diferente, seguido por seleção de clones virais viáveis que carregam determinantes antigênicos estranhos diferentes de um patógeno (por exem- plo, para aumentar imunogenicidade/capacidade de proteção), ou vários pa- tógenos (por exemplo, para criar vacina combinatória). O método de inser- ção aleatória pode também ser combinado em um organismo de vírus/vetor com outras plataformas de expressão, por exemplo, descritas acima (por exemplo, McAIIister et al., J. Virol. 74:9197-205, 2000; Bredenbeek et al., Virology 345:299-304, 2006) para gerar candidatos de vacina que expres- sam vários antígenos de um patógeno ou de patógenos diferentes. Também, proteínas adicionalmente expressas podem ser moléculas imunoestimulan- tes, por exemplo, várias citocinas conhecidas que estimulam ramificações apropriadas da resposta imune resultando em imunogenicidade/eficácia au- mentada de uma vacina recombinante. Além disso, o método pode ser usa- do para identificar sítios de inserção amplamente permissivos (por exemplo, NS1-236 e a região N-terminal de prM (por exemplo, aminoácidos 1-5)). Re- combinantes promissores selecionados podem ser também usados como vacinas per se, ou em combinação com outras vacinas (por exemplo, subu- nidade ou mortas, ou outra viva) como iniciadores ou intensificadores (se componentes diferentes forem seqüencialmente aplicados), ou como com- ponentes sinergísticos de vacina (se componentes diferentes forem simulta- neamente inoculados). Características dos métodos descritos aqui a observar incluem

as seguintes: (i) o uso de gene de resistência antibiótica clivável (junto com inserção de epítopo) para facilitar a geração de bibliotecas de plasmídeo (figura 2); (ii) introdução de um códon de parada ou mudança estrutural no gene alvo do clone de plasmídeo de comprimento total (cDNA viral) para mi- nimizar as chances de surgimento de vírus sem inserção (figura 2); (iii) tra- tamento de bibliotecas de plasmídeo contendo inserções aleatórias com en- zima de Pmel para eliminar qualquer modelos de DNA sem inserção, ou fa- zendo diluições seriais de células transfeccionadas ou RNA usados para transfecção para minimizar a competição dos mutantes de inserção com ví- rus sem inserção (seção de expressão da proteína E); e (iv) isolamento fácil dos clones virais contendo inserção usando purificação em placa combinada com imunotingimento de monocamadas de célula. Vetores Virais

Vírus quiméricos que podem ser usados na invenção podem ser com base em vírus de ChimeriVax™ que, como descrito acima, consistem em um primeiro flavivírus (isto é, um flavivírus da cadeia principal) em que uma proteína estrutural (ou proteínas) foram substituídas com uma proteína estrutural correspondente (ou proteínas) de um segundo vírus. Por exemplo, as quimeras podem consistir em um primeiro flavivírus em que as proteínas prM e E foram substituídas com as proteínas prM e E de um segundo flaviví- rus.

Os vírus quiméricos que são usados na invenção podem ser fei-

tos de qualquer combinação de vírus. Exemplos de flavivírus particulares que podem ser usados na invenção, como primeiro ou segundo vírus, inclu- em flavivírus de mosquito, tais como encefalite japonesa, Dengue (sorotipos 1-4), febre amarela, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ocidental, Kunjin, encefalite de Rocio, e vírus de Ilhéus; flavivírus de carra- pato, tais como encefalite da Europa Central, encefalite siberiana, encefalite russa da primavera-verão, doença de Kyasanur Florest, febre hemorrágica de Omsk, doença de Louping, vírus de Powassan, Negishi, Absettarov, Han- salova, Apoi, e Hypr; como também vírus do gênero Hepacivirus (por exem- pio, vírus da Hepatite C).

Um exemplo específico de um tipo de vírus quimérico que pode ser usado na invenção é a cepa humana de vacina do vírus da febre amare- la, YF17D em que as proteínas prM e E foram substituídas com proteínas prM e E de outros flavivírus, tais como vírus da encefalite japonesa, vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da encefalite de Murray Valley, um vírus da Dengue, ou quaisquer outros flavivírus, tais como um daqueles listados acima. Por exemplo, o flavivírus quimérico a seguir que foi depositado junto à American Type Culture Colection (ATCC) em Manassas, Virgínia, EUA sob a condição do Tratado de Budapeste e concedida em uma data de depósito de 6 de janeiro de 1998, pode ser usado na invenção: Vírus Quimérico da Febre Amarela 17D/Encefalite Japonesa SA14-14-2 (YF/JE A1.3; número de acesso da ATCC ATCC VR-2594) e Vírus Quimérico da Febre Amarela 17D/Dengue Tipo 2 (YF/DEN-2; número de acesso da ATCC ATCC VR-2593).

Detalhes de fazer vírus quiméricos que podem ser usados na invenção são fornecidos, por exemplo, nas patentes U. S. Nos. 6.962.708 e 6.696.281; Pedidos de Patente Internacionais WO 98/37911 e WO 01/39802; e Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999, cada um destes é incorpo- rado aqui por referência em sua totalidade. Além disso, estes vírus quiméri- cos podem incluir mutações atenuadas, tais como aquelas descritas acima e nas referências citadas aqui (também vide, por exemplo, WO 2003/103571; WO 2005/082020; WO 2004/045529; WO 2006/044857; WO 2006/116182). Informação de seqüência para vírus que podem ser usados para fazer os vírus da presente invenção é fornecida, por exemplo, na patente U. S. No. 6.962.708 (também vide, por exemplo, Números de acesso do GenBank NP_041726; CAA27332; AAK11279; P17763; nota: estas seqüências são exemplares apenas; numerosas outras seqüências de flavivírus são conhe- cidas na técnica e podem ser usadas na invenção). Exemplos adicionais in- cluem número de acesso do GenBank NC_002031, que é fornecido aqui como Apêndice de Seqüência 3 (YF17D), número de acesso do GenBank AF315119, que é fornecido aqui como Apêndice de Seqüência 4 (JE-SA-14- 14-2), e número de acesso do GenBank AF196835, que é fornecido aqui como Apêndice de Seqüência 5 (vírus do Nilo Ocidental). Esta informação de seqüência é exemplar apenas, e há muitas outras seqüências de flaviví- rus que podem ser usadas na presente invenção. Também, estas seqüên- cias podem incluir mutações como descritas aqui (e nas referências citadas), ser compreendidas dentro das quimeras como descritas aqui (e nas referên- cias citadas), e/ou incluir inserções como descritas aqui.

Entre as vantagens de usar as vacinas de ChimeriVax™ como vetores neste método, uma vantagem principal é que as proteínas de enve- lope (que são determinantes antigênicos principais de imunidade contra fla- vivírus, e neste caso, imunidade de antivetor) podem ser facilmente trocadas permitindo a construção de várias vacinas diferentes usando a mesma ca- deia principal de YF17D que pode ser aplicada seqüencialmente para o mesmo indivíduo. Além disso, vacinas de inserção de ChimeriVax™ recom- binantes diferentes podem ser determinadas para ser mais apropriadas para o uso em regiões geográficas específicas em que os flavivírus diferentes são endêmicos, como vacinas duais contra um flavivírus endêmico e outro pató- geno alvejado. Por exemplo, vacina de ChimeriVax™-JE-influenza pode ser mais apropriada na Ásia onde JE é endêmica, para proteger tanto de JE e influenza, vacina de YF17D-influenza pode ser mais apropriada na África e América do Sul, onde YF é endêmica, ChimeriVax™-WN-influenza pode ser mais apropriada para as partes norte-americanas e da Europa e o Oriente Médio, em que vírus de WN é endêmico, e ChimeriVax™-dengue-influenza pode ser mais apropriada ao longo dos trópicos onde o vírus da dengue está presente.

Além de flavivírus quimérico, outros flavivírus podem ser usados, tais como flavivírus não-quiméricos, como vetores de acordo com a presente invenção. Exemplos de tais vírus que podem ser usados na invenção inclu- em vacinas vivas, atenuadas, tais como YF17D e aquelas derivadas da cepa de YF17D que foi obtida originalmente por atenuação da cepa de Asibi do tipo selvagem ("Yellow Fever Vaccination", World Health Organization, pág. 238, 1956; Freestone, em Plotkin et al. (eds.), Vaccines, 2- edição, W. B. Saunders, Philadelphia, U.S.A., 1995). Um exemplo de uma cepa de YF17D da qual os vírus que podem ser usados na invenção podem ser derivados é YF17D-204 (YF-VAX®, Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA; Stamaril®, Sa- nofi-Pasteur, Marcy-L1EtoiIe, França; ARILVAX™, Chiron, Speke, Liverpool, UK; FLAVIMUN®, Berna Biotech, Bern, Suíça; YF17D-204 França (X15067, X15062); YF17D-204, 234 US (Rice et al., Science 229:726-733, 1985)), en- quanto outros exemplos de tais cepas que podem ser usadas são a cepa de YF17DD estritamente relacionada (Acesso do GenBank No. U 17066), YF17D-213 (Acesso do GenBank No. U17067), e cepas de 17DD do vírus da febre amarela descritas por Galler et al., Vaccines 16(9/10): 1024-1028, 1998. Além destas cepas, quaisquer outras cepas de vacina do vírus da fe- bre amarela observadas ser aceitaveImente atenuadas em seres humanos, tais como pacientes humanos, podem ser usadas na invenção.

Além de flavivírus quiméricos e flavivírus intactos, tais como ví- rus da febre amarela (por exemplo, vacina de YF 17D), os métodos da in- venção podem também ser usados com outros vírus de vacina viva atenua- da de não-flavivírus (vírus contendo RNA e DNA). Exemplos de tais vírus de vacina incluem aqueles para sarampo, rubéola, encefalomielite eqüina vene- zuelana (VEE), mononegaviruses (rhabdoviruses, vírus da parainfluenza, etc.), e cepas de vírus de DNA atenuado (por exemplo, vírus da vaccínia, vacina antivariólica, etc.).

Também, além dos vírus vivos, como debatido acima, replicons empacotados que expressam peptídeos estranhos em proteínas de cadeia principal de replicon (por exemplo, NS1 e outras proteínas de NS, como também C) podem ser usados na invenção. Este método pode ser usado, por exemplo, em casos em que pode ser desejável aumentar a segurança ou minimizar imunidade de antivector (neutralizando a resposta do anticorpo contra as proteínas de envelope) para usar o mesmo vetor para fazer vaci- nas diferentes que podem ser aplicadas ao mesmo indivíduo, ou expressar vários antígenos no mesmo constructo de replicon. Uma ilustração de tal construção é dada na figura 10. Tecnologia para a construção de replicons de ciclo simples é bem estabelecida, e o potencial imunogênico dos repli- cons foi demonstrado (Jones et al., Virology 331:247-259, 2005; Molenkamp et al., J. Virol. 77:1644-1648, 2003; Westaway et al., Adv. Virus. Res. 59:99- 140, 2003). Em um exemplo de um tal replicon, a maioria dos genes de pro- teína de envelope prM e E é deletada. Portanto, eles podem replicar dentro das células, mas não podem gerar progênie de vírus (consequentemente replicação de ciclo simples). Eles podem ser empacotados em partículas virais quando os genes de prM-E forem fornecidos in trans. Ainda, quando as células forem infetadas por tais replicons empacotados (por exemplo, se- guindo vacinação), um ciclo simples de replicação segue, sem outra propa- gação para célula/tecidos circunvizinhos. Peptídeos imunológicos fortuita- mente inseridos podem também ser combinados com outros antígenos no contexto de PIVs (por exemplo, Mason et al., Virology 351:432-443, 2006) e qualquer outro constructo de vacina de vírus defeituosa, vírus de vetor intei- ros, vírus rearranjados (por exemplo, Orlinger et al., J. Virol. 80:12197- 12208, 2006), e por meio da expressão de antígenos adicionais intergenica- mente, bicistronicamente, no lugar de deleções de PIV, etc.

Epítopos protetores de patógenos diferentes podem ser combi- nados em um vírus que resulta em vacinas triplas, quádruplas, etc. Também, uma variante de ChimeriVax™ que contém o envelope de um flavivírus não- endêmico pode ser usada para evitar o risco de imunidade de antivetor natu- ral em uma população que do contrário poderia limitar a eficácia da vacina- ção em uma certa área geográfica (por exemplo, vetor de ChimeriVax™-JE pode ser usado no U. S. onde JE não estiver presente).

Também, a invenção inclui vírus, tais como flavivírus (por exem- plo, vírus da febre amarela, tais como YF17D, e flavivírus quiméricos, tais como aqueles descritos aqui), que incluem inserções de um ou mais peptí- deos heterólogos, como descritos aqui, em uma proteína selecionada do grupo que consiste em proteínas C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5, se ou não feitos pelos métodos descritos aqui. Métodos des- critos aqui nos exemplos experimentais para inserções em prM, E, e NS1 ensinam uma pessoa precisamente experiente na técnica de ciência como para mutagenizar as outras proteínas de flavivírus (C e NS2A-NS5), como também proteínas de outros vírus de vetor, bactérias, etc. Porque as proteí- nas de flavivírus C e NS2A-NS5 são expressadas predominantemente de forma intracelular (com a exceção de C, que é também uma parte da partícu- la viral), estas proteínas podem ser muito apropriadas para inserir epítopos imunológicos estranhos de células T; porém epítopos de células B podem ser inseridos também, como alguma resposta de anticorpo é gerada in vivo contra a maior parte, se não todas, das proteínas virais intracelulares. Peptídeos Heterólogos Os vetores virais da invenção podem ser usados para liberar qualquer peptídeo ou proteína de valor profiláctico ou terapêutico. Por e- xemplo, os vetores da invenção podem ser usados na indução de uma res- posta imune (profiláctica ou terapêutica) para qualquer antígeno com base em proteína que esteja inserido em uma proteína viral, tal como proteínas de envelope, pré-membrana, capsídeo, e não-estruturais de um flavivírus.

Os vetores da invenção podem cada incluir um epítopo simples. Alternativamente, epítopos múltiplos podem ser inseridos nos vetores, ou em um sítio simples (por exemplo, como um politopo em que os epítopos dife- rentes podem ser separados por um Iigante flexível, tal como uma extensão de poliglicina de aminoácidos), em sítios diferentes, ou em qualquer combi- nação dos mesmos. Os epítopos diferentes podem ser derivados de uma espécie simples de patógeno, ou podem ser derivados de espécies diferen- tes e/ou gêneros diferentes. Os vetores podem incluir peptídeos múltiplos, por exemplo, cópias múltiplas de peptídeos como listados aqui ou combina- ções de peptídeos tais como aqueles listados aqui. Como um exemplo, os vetores podem incluir os peptídeos de M2e humanos e aviários (e/ou se- qüências de consenso dos mesmos).

Antígenos que podem ser usados na invenção podem ser deri- vados, por exemplo, de agentes infecciosos tais como vírus, bactérias, e pa- rasitas. Um exemplo específico de um tal agente infeccioso é vírus influenza, incluindo aqueles que infetam seres humanos (por exemplo, cepas A, B, e C), como também vírus influenza aviária. Exemplos de antígenos de vírus influenza incluem aqueles derivados de hemaglutinina (HA; por exemplo, qualquer um de H1-H16, ou subunidades dos mesmos) (ou subunidades de HA HA1 e HA2), neuraminidase (NA; por exemplo, qualquer um de N1-N9), M2, M1, nucleoproteína (NP), e proteínas B. Por exemplo, peptídeos incluin- do o sítio de clivagem da proteína precursora de hemaglutinina (HA0) (NIP- SIQSRGLFGAIAGFIE para cepas de A/H1, NVPEKQTRGIFGAIAGFIE para cepas de A/H3, e PAKLLKERGFFGAIAGFLE para cepas de influenza B) ou M2e (SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD) pode ser usado. Outros exemplos de peptídeos que sejam conservados em influenza podem ser usados na invenção e incluem: peptídeo de NBe conservado para influenza B (seqüên- cia de consenso MNNATFNYTNVNPISHIRGS); o domínio extracelular da proteína de BM2 de influenza B (MLEPFQ de consenso); e o peptídeo de M2e da influenza aviária de H5N1 (MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD).

Outros exemplos de peptídeos de influenza que podem ser usados na in- venção, como também proteínas das quais tais peptídeos podem ser deriva- dos (por exemplo, através de fragmentação) são descritos em US 2002/0165176, US 2003/0175290, US 2004/0055024, US 2004/0116664, US 2004/0219170, US 2004/0223976, US 2005/0042229, US 2005/0003349, US 2005/0009008, US 2005/0186621, patente U. S. No. 4.752.473, patente U. S. No. 5.374.717, U. S. 6.169.175, patente U. S. No. 6.720.409, patente U. S. No. 6.750.325, patente U. S. No. 6.872.395, WO 93/15763, WO 94/06468, WO 94/17826, WO 96/10631, WO 99/07839, WO 99/58658, WO 02/14478, WO 2003/102165, WO 2004/053091, WO 2005/055957, e os Apêndices de Seqüência 1 e 2 inclusos (e referências citadas nestes), os conteúdos destes são incorporados aqui por referência. Também, epítopos de células TeB imunológicos/protetores conservados de influenza podem ser selecionados da base de dados de www.immuneepitope.org em que muitos epítopos de proteção cruzada promissores foram identificados recentemente (Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 104:246-251, 2007 e tabelas suplementares), incluindo um epítopo de HA do vírus de H3N2 que foi usado como descrito abaixo. A invenção pode empregar qualquer peptídeo do recurso de IEDB em-linha pode ser usado, por exemplo, epítopos do vírus influenza incluindo epítopos de células BeT conservados descritos em Bui et al., supra. Epítopos protetores de outros patógenos humanos/veterinários,

tais como parasitas (por exemplo, malária), outros vírus patogênicos (por exemplo, vírus do papiloma humano (HPV), vírus do herpes simples (HSV), vírus da imunodeficiência humana (HIV; por exemplo, gag), e vírus da hepa- tite C (HCV)), e bactérias (por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, Clostri- dium difficile e Helicobacter pylori) podem também ser incluídos nos vetores da invenção. Vários epítopos apropriados destes e outros patógenos podem ser facilmente encontrados na literatura. Por exemplo, epítopos/peptídeos de proteção cruzada da proteína L2 de papilomavírus que induz anticorpos de neutralização cruzada vastos que protegem de genótipos de HPV diferentes foram identificados por Schiller e outros, tais como aminoácidos 1-88, ou a- minoácidos 1-200, ou aminoácidos 17-36 da proteína L2, por exemplo, do vírus de HPV16 (WO 2006/083984 A1; QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV). E- xemplos de patógenos adicionais, como também antígenos e epítopos des- tes patógenos que podem ser usados na invenção são fornecidos em WO 2004/053091, WO 03/102165, WO 02/14478, e US 2003/0185854, os conte- údos destes são incorporados aqui por referência. Exemplos adicionais de patógenos dos quais antígenos podem

ser obtidos são listados na Tabela 1, exemplos abaixo, e específicos de tais antígenos incluem aqueles listados na Tabela 2. Além disso, exemplos es- pecíficos de epítopos que podem ser inseridos nos vetores da invenção são fornecidos na Tabela 3. Como é observado na Tabela 3, epítopos que são usados nos vetores da invenção podem ser epítopos de células B (isto é, epítopos neutralizantes) ou epítopos de células T (isto é, epítopos auxiliares T e específicos para células T citotóxicos).

Os vetores da invenção podem ser usados para liberar antíge- nos além de antígenos derivados de patógenos. Por exemplo, os vetores podem ser usados para liberar antígenos associados ao tumor para o uso em métodos imunoterapêuticos contra câncer. Numerosos antígenos asso- ciados ao tumor são conhecidos na técnica e podem ser administrados de acordo com a invenção. Exemplos de cânceres (e antígenos associados ao tumor correspondentes) são como segue: melanoma (proteína de NY-ESO-1 (especificamente epítopo de CTL localizado nas posições de aminoácido 157-165), CAMEL, MART 1, gp100, proteínas relacionadas à tirosina TRP1 e 2, e MUC1); adenocarcinoma (proteína de ErbB2); câncer colorretal (17-1 A, 791Tgp72, e antígeno carcinoembriônico); câncer de próstata (PSA1 e PSA3). Proteína de choque térmico (hsp110) pode também ser usada como um tal antígeno.

Em outro exemplo da invenção, proteínas exógenas que codifi- cam um/uns epítopo(s) de um antígeno indutor de alergia, ao qual uma res- posta imune é desejada, podem ser usadas. Além disso, os vetores da in- venção podem incluir Iigantes que são usados para alvejar os vetores para liberar peptídeos, tais como antígenos, às células particulares (por exemplo, células que incluem receptores para os ligantes) em sujeitos paa quem os vetores administraram-se.

O tamanho do peptídeo ou proteína que é inserida nos vetores da invenção pode variar em comprimento, por exemplo, de 3-1000 aminoá- cidos em comprimento, por exemplo, de 5-500, 10-100, 20-55, 25-45, ou 35- 40 aminoácidos em comprimento, como pode ser determinado para ser a- propriado por aqueles versados na técnica. Como debatido em outro lugar aqui, as inserções de pré-membrana amino-terminais descritas aqui forne- cem a possibilidade de inserções mais longas (vide abaixo). Também, os peptídeos observados aqui podem incluir seqüências adicionais ou podem ser reduzidos em comprimento, também como pode ser determinado para ser apropriado por aqueles versados na técnica. Os peptídeos listados aqui podem estar presentes nos vetores da invenção como mostrados aqui, ou podem ser modificados, por exemplo, por substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoá- cidos). Além disso, os peptídeos podem estar presentes nos vetores no con- texto de peptídeos maiores.

A invenção também inclui a identificação e uso de sítios de in- serção amplamente permissivos tais como, por exemplo, NS1-236 ao qual múltiplos peptídeos diferentes podem ser inseridos, como mostrado no con- texto de duas quimeras diferentes (vide abaixo). Sítios amplamente permis- sivos adicionais incluem a região amino-terminal de prM dos vírus quiméri- cos incluindo ChimeriVax™-JE e ChimeriVax™-WN (vide abaixo). Inserções podem ser feitas em tais vírus em qualquer uma ou mais das posições 1-50, por exemplo, 1-25, 1-15, 1-10, ou 1-5.

Além disso, a invenção inclui a identificação e uso de segundas adaptações de sítio que são obtidas, por exemplo, pela cultura de célula (por exemplo, Vero). Tais adaptações podem fornecer benefícios tais como repli- cação aumentada, etc. Exemplos específicos de tais adaptações que podem ser usadas em outros contextos abaixo são descritos nos exemplos experi- mentais.

Produção e Administração

Os vírus descritos acima podem ser feitos usando métodos pa- drão na técnica. Por exemplo, uma molécula de RNA que corresponde ao genoma de um vírus pode ser introduzida em células primárias, embriões de galinha, ou linhagens celulares diplóides das quais (ou os sobrenadantes destas) vírus de progênie podem ser depois purificados. Outros métodos que podem ser usados para produzir os vírus empregam células heteroplóides, tais como células Vero (Yasumura et al., Nihon Rinsho 21:1201-1215, 1963). Em um exemplo de tais métodos, uma molécula de ácido nucléico (por e- xemplo, uma molécula de RNA) correspondendo ao genoma de um vírus é introduzida nas células heteroplóides, o vírus é colhido do meio em que as células foram cultivadas, o vírus colhido é tratado com uma nuclease (por exemplo, uma endonuclease que degrada DNA e RNA, tais como Benzona- se™; patente U. S. No. 5.173.418), o vírus tratado com nuclease é concen- trado (por exemplo, pelo uso de ultrafiltração usando um filtro tendo um corte de peso molecular de, por exemplo, 500 kDa), e o vírus concentrado é for- mulado para o propósito de vacinação. Detalhes deste método são forneci- dos em WO 03/060088 A2 que é incorporado aqui por referência. Também, métodos para produzir vírus quiméricos são descritos nos documentos cita- dos acima em referência à construção de construções de vírus quiméricos.

Os vetores da invenção são administrados em quantidades e usando métodos que podem ser determinados facilmente por pessoas ver- sados na técnica. No caso de vetores com base em flavivírus quimérico e vírus da febre amarela, os vetores podem ser administrados e formulados, por exemplo, da mesma maneira que a vacina de febre amarela 17D, por exemplo, como uma suspensão clarificada de tecido de embrião de galinha infetado, ou um fluido colhido das culturas de células infetadas com o vírus quimérico da febre amarela. Os vetores da invenção podem desse modo ser formulados como soluções aquosas estéreis contendo entre 100 e 1.000.000 unidades infecciosas (por exemplo, unidades formadoras de placa ou doses infecciosas de cultura de tecido) em um volume de dose de 0,1 a 1,0 ml, a ser administrado, por exemplo, por vias intraperitoneais, intramusculares, subcutâneas, ou intradérmicas (vide, por exemplo, WO 2004/0120964 para detalhes relativos aos métodos de vacinação intradérmica). Além disso, por- que flavivírus podem ser capazes de infetar o hospedeiro humano por meio das vias mucosas, tais como a via oral (Gresikova et al., "Tick-borne Ence- phalitis", Em The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton1 Flórida, 1988, Volume IV, 177-203), os vetores po- dem ser administrados por uma via mucosa. Quando usados nos métodos de imunização, os vetores podem

ser administrados como um agente profiláctico primário em adultos ou crian- ças em risco de infecção por um patógeno particular. Os vetores podem também ser usados como agentes secundários para tratar pacientes infeta- dos estimulando uma resposta imune contra o patógeno do qual o antígeno de peptídeo é derivado. Por exemplo, um recombinante expressando epíto- pos de proteínas E6/E7, ou proteínas E6/E7 inteiras, de HPV pode ser usado como uma vacina terapêutica de HPV.

Para aplicações de vacina, opcionalmente, os adjuvantes para que são conhecidos àqueles versados na técnica podem ser usados. Adju- vantes que podem ser usados para intensificar a imunogenicidade dos veto- res quiméricos incluem, por exemplo, formulações lipossomais, adjuvantes sintéticos, tais como (por exemplo, QS21), dipeptídeo de muramila, lipídio de monofosforila A, ou polifosfazina. Embora estes adjuvantes sejam tipicamen- te usados para intensificar respostas imunes a vacinas inativadas, eles po- dem também ser usados com vacinas vivas. No caso de um vetor quimérico liberado por meio de uma via mucosa, por exemplo, oralmente, adjuvantes mucosos tais como a toxina termolábil de E. coli (LT) ou derivações mutan- tes de LT podem ser usados como adjuvantes. Além disso, genes que codi- ficam citocinas tendo atividades adjuvantes podem ser inseridos nos vetores. Desse modo, genes que codificam citocinas, tais como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, ou IL-5, podem ser inseridos junto com genes de antígeno estranhos para produzir uma vacina que resulta em respostas imunes intensificadas, ou modular imunidade mais especificamente direcionada para respostas ce- lulares, humorais, ou mucosas. Alternativamente, citocinas podem ser libe- radas, simultânea ou seqüencialmente, separadamente de um vírus de vaci- na recombinante por meios que são bem conhecidos (por exemplo, inocula- ção direta, DNA descoberto, em um vetor viral, etc.)·

Os vírus da invenção podem ser usados em combinação com outros métodos de vacinação. Por exemplo, os vírus podem ser administra- dos em combinação com vacinas de subunidade incluindo os mesmos antí- genos ou diferentes. Os métodos de combinação da invenção podem incluir co-administração do vírus da invenção com outras formas do antígeno (por exemplo, formas de subunidade ou veículos de liberação incluindo proteína de núcleo da hepatite (por exemplo, partículas de núcleo da hepatite B con- tendo peptídeo de M2e na superfície produzida em E. coli (HBc-M2e; Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004))). Alternativamente, os vetores da pre- sente invenção podem ser usados em combinação com outros métodos (tais como métodos de subunidade ou de HBc) em uma estratégia de iniciador- reforço, com os vetores da invenção ou com os outros métodos sendo usa- dos como o iniciador, seguido por uso do outro método como o reforço, ou o contrário. Também, a invenção inclui estratégias de iniciador-reforço empre- gando os vetores da presente invenção como agente iniciador e reforçador.

Além das aplicações de vacina, como aqueles versados na téc- nica podem entender facilmente, os vetores da invenção podem ser usados nos métodos de terapia de gene para introduzir produtos de gene terapêuti- cos nas células de um paciente e em terapia de câncer. Também, vírus re- combinantes, por exemplo, flavivírus quiméricos ou intactos descritos aqui, contendo um epítopo imunológico podem ser usados em regimes de inicia- dor/reforço para intensificar a eficácia das vacinas de subunidade ou mortas de organismo inteiro, similarmente aos replicons de alfavírus recombinante (US 2005/0208020 A1). Ademais, alguns de nossos resultados abaixo tam- bém demonstram um efeito sinergístico forte entre um flavivírus contendo um epítopo estranho (por exemplo, ChimeriVax-JE/NS1-M2e) e uma vacina de subunidade (por exemplo, HBc-M2e) quando os dois são misturados e inoculados simultaneamente. O último pode resultar em formulações de va- cina combinadas novas, eficientes não requerendo adjuvantes e fornecendo características desejáveis novas, por exemplo, mudança de Th1 sobre a resposta imune. Além disso, epítopos estranhos podem ser expressados na superfície de partículas virais (em prM-E) como descrito aqui, porém em vez de usar vírus recombinante como uma vacina viva, eles podem ser inativa- dos, por exemplo, usando formalina, e usados como uma vacina morta. Tal método pode ser particularmente aplicável se o vírus de vetor for um vírus do tipo selvagem que pode ser patogênico para seres humanos/animais. Exemplos Experimentais

Os exemplos experimentais a seguir mostram a inserção das seqüências de M2e em ChimeriVax™-JE, como também um epítopo de HA. Seqüências foram também inseridas em um constructo de ChimeriVax™- WN. Os métodos descritos neste exemplo podem também ser usados com outros vírus, tais como outros flavivírus quiméricos e vetores com base em vírus (por exemplo, replicons e PIVs), como também outros organismos de vetor, como descritos acima, para inserir as seqüências em outras proteínas, e inserir outros peptídeos. A cepa de vacina viva atenuada de febre amarela 17D (YF17D) foi usada em seres humanos durante os últimos 60 anos, teve um registro de segurança excelente, e forneceu imunidade duradoura após administração de uma dose simples. Como é acima observado, Chimeri- Vax™-JE é uma cepa de vacina recombinante viva atenuada em que os ge- nes que codificam certas proteínas estruturais (PrME) de YF17D foram subs- tituídos com os genes correspondentes do vírus de encefalite japonesa ge- neticamente atenuadas (JE) SA14-14-2. Capsídeo e todos os genes não- estruturais (NS) responsáveis pela replicação intracelular desta quimera são derivados da cepa de vacina de YF17D. Similarmente, ChimeriVax™-WN é uma cepa de vacina recombinante viva atenuada em que os genes que codi- ficam proteínas PrM e E de YF17D foram substituídos com os genes corres- pondentes de uma cepa do vírus do Nilo Ocidental. Um exemplo de uma tal quimera emprega a seqüência da cepa do vírus do Nilo Ocidental NY99- influenza 382-99 (GenBank Acesso Número AF196835). Em um outro e- xemplo, aqui referido como ChimeriVax™-WN02, na seqüência de envelope de NY99-influenza 382-99, Iisina na posição 107 é substituída com fenilala- nina, alanina na posição 316 é substituída com valina, e Iisina na posição 440 é substituída com arginina.

Esta seção descreve as etapas de construção do plasmídeo que

estão ilustradas nas figura 2. Construção começou com um constructo de plasmídeo simples de pBSA contendo o cDNA inteiro do vírus de Chimeri- Vax™-JE, com base em um vetor de número de cópia baixo de pBeloBad 1. Este plasmídeo foi reconstruído ajuntando as porções de cDNA específicas para ChimeriVax™-JE (junto com um promotor de SP6) dos plasmídeos YFM5'3'SA14-14-2 e YF5.2SA14-14-2 (os dois plasmídeos originais para ChimeriVax™-JE) em um vetor de número de cópia baixo pBeloBad 1 (New England Biolabs, Beverly, MA). O plasmídeo contém vários sítios de restri- ção únicos que são convenientes para subclonagem do gene (mostrado a- cima o genoma de vírus no diagrama de plasmídeo à direita em cima na fi- gura 2). Sítios de restrição adicionais, Sphl, Nsil, e Eagl, usados para sub- clonagem dos genes de prM, E, e NS1, foram introduzidos no plasmídeo de pBSA através de mutagênese dirigida silenciosa (Etapas 1-3 na figura 2).

Os três genes alvos foram subclonados em um vetor de plasmí- deo de pUC18 (Etapa 6) e os plasmídeos resultantes foram mutados fortui- tamente usando um transpóson de Tn7 (Etapa 7). E. coli transformado foi crescido na presença de cloranfenicol (um gene de resistência de cloranfeni- col é codificado por um transiniciador removível do transpóson), e três biblio- tecas de plasmídeo mutadas representadas por números grandes de colô- nias bacterianas foram preparadas. Durante a preparação das bibliotecas de plasmídeo mutante, o número de colônias em cada biblioteca foi pelo menos 3 vezes mais alto que o número de nucleotídeos na seqüência de DNA mu- tada, para assegurar que uma inserção estranha de interesse (codificando um peptídeo tal como M2e) seja subseqüentemente incorporado após cada nucleotídeo de gene alvo. Os números de colônias em cada biblioteca estão mostrados nas figura 2. Bibliotecas de gene de prM, E, e NS1 mutados fo- ram subclonados em um vetor de pUC18 (Etapa 8), e os transiniciadores foram removidos por digestão de Pmel e re-ligação (Etapa 9), deixando para trás apenas uma inserção aleatória de 15 nucleotídeos contendo um único sítio de Pmel em cada molécula de gene. Para facilitar a inserção de M2e, um cassete de Smal-Smal contendo M2e e um gene de resistência à cana- micina foi primeiro montado (Etapas 4-5). O gene de Kanr pode ser removido deste cassete por digestão nos sítios de BstBI flanqueadores engenheira- dos. O cassete foi inserido nos sítios de Pmel nas bibliotecas da Etapa 9, com seleção de bibliotecas contendo M2e novas que são alcançadas culti- vando as bactérias na presença de Kan (Etapa 12). A seqüência de consen- so de M2e de influenza A humana nativa, SLLTEVETPIRNEWG- CRCNDSSD, usada na construção foi modificada em que os dois resíduos Cys foram alterados para Ser para evitar qualquer ligação em ponte de S-S indesejada, que não afeta a antigenicidade/imunogenicidade do peptídeo e dois resíduos Gly foram adicionados em ambos os lados para flexibilidade (GGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGG). O gene Kanr foi depois removido das bibliotecas de genes resultantes contendo inserções de M2e aleatórias através de digestão com BstBI (Etapa 13).

Em um método (Método A na figura 2), para produzir bibliotecas de cDNA de modelo de ChimeriVax™-JE-influenza com M2e inserido fortui- tamente nos genes virais prM, E, e NS1, bibliotecas de genes mutantes da Etapa 9 (contendo sítios de Pmel aleatórios) são clonadas nos plasmídeos de pBSA modificados das Etapas 1-3. Porém, quando primeiro foi tentado inserir o cassete de M2e/Kanr na biblioteca de pBSA-AR3-rPmel da Etapa 10, o número de clones bacterianos na biblioteca de pBSA-AR3-rM2e/Kan resultante, crescidos na presença de Kan, foi baixo (Etapa 11). Todavia, este método permite construção rápida de bibliotecas contendo qualquer epítopo imunogênico (por exemplo, de parasita de malária, TB, patógenos virais, etc.).

Em outro método (Método B), uma modificação de códon de pa- rada/mudança estrutural foi introduzida primeiro nos genes prM, E, e NIS1 subclonados (Etapa 14), e os genes modificados, contendo mutações letais para o vírus, foram introduzidos nos plasmídeos de pBSA-AR1-3 (Etapa 1 5). Isto foi feito para eliminar a possibilidade de surgimento de vírus não- mutante de ChimeriVax™-JE seguindo transfecção das células devido à presença de uma proporção de modelo não-mutante contaminante em uma biblioteca de modelo de ChimeriVax™-JE-influenza final. As bibliotecas fi- nais do modelo de comprimento total para vírus de ChimeriVax™-JE- influenza foram obtidas substituindo os fragmentos de gene alvos nas biblio- tecas da Etapa 15 com aqueles contendo inserções de M2e aleatórias da Etapa 13 (Etapa 16).

Para produzir vírus de ChimeriVax™-JE-influenza fortuitamente com a seqüência de M2e de consenso inserida em NS1, a biblioteca de plasmídeo de pBSA-AR3-rM2e foi Iinearizada com Xhol (um sítio de Xhol fica localizado no término de cDNA viral) e transcrita in vitro com SP6 RNA polimerase (um promotor de SP6 fica localizado a montante do cDNA viral), seguido por transfecção das células Vero. Progênie do vírus foi colhida quando um efeito citopático foi primeiro detectável ou pronunciado, nos dias 3-6 pós-transfecção. Titulações virais nas amostras colhidas foram determi- nadas através de ensaio de placa (revestimento de metilcelulose) com fingi- mento de monocamadas fixas em metanol usando fluido acsítico de anti-JE hiperimune de camundongo (ATCC) para detectar todas as placas, ou um anticorpo monoclonal comercialmente disponível (Mab) 14C2 contra epítopo de M2e de influenza foi usado para detectar apenas as placas expressando peptídeo de M2e reconhecível pelo Mab. Titulações gerais foram mais de 7 Iogio pfu/ml. Placas M2e-positivas foram facilmente detectáveis e represen- tadas até 0,4% das placas totais (Figs. 3A e 3B). Algumas destas placas M2e-positivas foram tão grandes quanto as placas M2e-negativas, indicando replicação eficiente de vírus. A maioria das placas totais foram M2e- negativas, que poderia ser porque a inserção em algumas das localizações aleatórias em NS1 é instável, resultando no surgimento do vírus de Chimeri- Vax™-JE não-mutante logo após a transfecção. Alternativamente, a inserção pode estar presente mas inacessível aos anticorpos.

Várias técnicas podem ser usadas para isolar os clones de vírus positivos individuais. Foi combinada a purificação de placa com fingimento de MAb (ensaio de imunofoco). Neste ensaio, células Vero infectadas são revestidas com diluições seriais de vírus com agarose. No dia 5, agarose é removida e a monocamada da célula (por exemplo, em uma placa de Petri; figura 3C) é fixada com metanol e tingida com um MAb. O agarose é depois alinhado com a placa de Petri e as porções do gel que correspondem à pla- ca M2e-positiva são colhidas e geladas. Alternativamente, monocamadas de célula foram tingidas por Mab sem fixação de metanol. As células nas placas positivas foram raspadas cuidadosamente do plástico e congeladas. Aproxi- madamente 80 clones virais candidatos foram isolados usando este proce- dimento, e sendo também purificados por um a dois ciclos adicionais de puri- ficação de placa. Foi usado outro método de diluição terminal combinada de vírus, colhendo os sobrenadantes celulares, e tingindo as monocamadas de célula em placas de 96 cavidades com o MAb para identificar cavidades po- sitivas para possível diluição mais alta (idealmente infetados com uma partí- cuia viral positiva simples). Este método resultou em 37 clones candidatos. Análise também demonstrou que um destes parece ser um clone puro, en- quanto o resto ainda é misturado com vírus M2e-negativo.

Um número suficientemente grande de clones M2e-positivos (por exemplo, 50-100) pode ser testado em seguida para imunogenicidade e eficácia de proteção (incluindo proteção a longo prazo) contra desafio com vírus influenza do tipo selvagem em camundongos (e/ou furões) usando mo- delos animais disponíveis e métodos para medir as titulações de anticorpo de anti-M2e em soros de camundongo (por exemplo, ELISA usando um pep- tídeo de M2e sintético para medir anticorpos de IgG/lgM total ou de lgG1/lgG2 isotípicos) como também atividade em um teste de ADCC in vitro. Estabilidade genética pode ser avaliada por passagem serial de vírus na cul- tura celular (ou in vivo), seguido por ensaio de imunofoco e/ou sequencia- ção.

Em desenvolvimentos adicionais, seguindo a última das 3-4 eta- pas de purificação de placas a partir do vírus colhido após transfecção, ma- térias-primas virais de 13 clones foram produzidas através de duas passa- gens de amplificação em células Vero. Estes amostras amplificadas foram designadas matérias-primas virais de pesquisa de P2 (passagem 2 após purificação). Titulações das matérias-primas foram determinadas estar na faixa de 2,6x106-1,0x107 pfu/mL. Importantemente, tingimento com Mab de M2e e HIAF DE JE produziram titulações quase idênticas (figura 4), indican- do que as matérias-primas virais eram puras. Além disso, este resultado foi a primeira evidência da estabilidade genética dos vírus recombinantes. Se os vírus não fossem puros ou estáveis, o vírus de ChimeriVax™-JE não- mutante superaria os recombinantes expressando M2e, que claramente não foi o caso. Além disso, tingimento de M2e eficiente das placas virais foi ob- servado tanto com fixação de metanol de células (detectando proteína intra- celular e de superfície) e sem fixação de metanol (detectando apenas prote- ína de superfície). Desse modo, a proteína de NS1 contendo peptídeo de M2e, como esperado, foi transportada normalmente para a superfície das células infetadas e mais provavelmente também segregadas. NS1 portanto permitiu apresentação de superfície/extracelular eficiente do epítopo, que é altamente desejável para a indução da resposta do anticorpo de anti-M2e robusta in vivo.

O gene de NS1 dos 13 clones (Α11-A92 na figura 4) foi sequen- ciado para determinar as localizações de sua inserção de M2e. Surpreen- dentemente, a inserção dos 35 aminoácidos foi observada estar localizada exatamente no mesmo sítio em todos os 13 clones, na metade C-terminal da proteína de NS1, após o nucleotídeo 3190 do genoma do vírus de Chimeri- Vax™-JE, entre os resíduos virais de aminoácido de NS1 236 e 237. A se- qüência exata do nucleotídeo de NS1 inserido e circunvizinho e resíduos de aminoácido é mostrada na figura 5.

A explanação mais provável para a inserção estando presente na mesma localização em todos os 13 clones é que os clones foram isolados por placa do vírus colhido até 6 dias após transfecção das células Vero, quando CPE foi observado. Competição entre as variantes iniciais diferentes (tendo inserções em localizações diferentes) ocorreu durante replicação do vírus antes da colheita, e uma variante pode ter ficado dominante na popula- ção viral. Portanto, os 13 clones escolhidos representaram uma variante de inserção.

Para superar o problema de competição entre as variantes, clo- nes adicionais podem ser preparados mediante captura na placa feita imedi- atamente após a transfecção (por exemplo, para encontrar um candidato de vacina mais imunogênico, se necessário). Neste método posterior, células Vero são transfeccionadas com em RNA sintetizado in vitro e imediatamente revestidas com agarose, seguido tingimento das células com anticorpo de M2e e colhendo os clones positivos da agarose. Foi tentado isto usando transcrições de RNA para transfecção produzida ou transcrevendo in vitro a biblioteca de plasmídeo de pBSA-AR3 (figura 2), ou por ligação in vitro da biblioteca dos genes de NS1-M2e de pUC-AR03-rM2e do plasmídeo (que foi observada ser mais representativa que a biblioteca de pBSA-AR3) no vetor de parada de pBSA-AR3 (figura 2). Agarose sobreposta foi removida no dia 4-5, e a monocamada celular foi tingida com MAb de M2e. Múltiplos focos virais positivos foram observados de tamanhos variados. Um exemplo de uma placa de Petri tingido de células Vero transfeccionadas com RNA obtido usando a etapa de ligação de DNA in vitro é mostrada na figura 11. As por- ções da agarose que corresponde às várias placas positivas maiores foram colhidas e depois também purificadas por ciclos adicionais de purificação de placa. De forma interessante, quando as variantes novas foram sequencia- das, elas tiveram a mesma localização de inserção de M2e como no vírus A25. Isto identifica NS1-236 como um sítio altamente permissivo na proteína de NS1, que rendeu mutantes de inserção altamente de modo eficiente re- plicativos, produzindo as placas maiores. Não obstante, julgado pelos tama- nhos variáveis dos focos na figura 11, parece claro que a inserção de M2e intercalou em localizações diferentes dentro de NS1. Algumas variantes me- nos eficientemente replicativas, formando placas intermediárias ou peque- nas, podem ser de valor prático.

Foi também usado o sítio de restrição de BstBI localizado ao término da inserção de M2e do clone de A25 (figura 5) para adicionar um segundo epítopo protetor de influenza nesta localização de NS1. Por exem- plo, foi incorporado o epítopo de M2e de influenza aviária de H5N1 flanque- ado com Iigadores de 2xGly para flexibilidade (como mostrado esquemati- camente na figura 13A), e foi obtido vírus viável. Desse modo, o mutante de inserção posterior contém um tandem de M2e de influenza humana seguido por M2e de influenza aviária. Este vírus poderia ser uma vacina universal capaz de proteger a população de cepas tanto de influenza humana A como de influenza aviária. Nesta construção, o gene de NS1 com inserção de M2e humano do vírus A25 foi clonado primeiro no clone infeccioso de Chimeri- Vax-JE por meio de genética reversa. Seqüências de M2e aviário foram de- pois adicionadas clonando no sítio de BstBI um fragmento de DNA bifilamen- tar composto de dois oligonucleotídeos fosforilados anelados. Duas versões do vírus de M2ehumano/M2eaViário foram construídas, um com a seqüência de M2e nativa de influenza de H5N1 (exceto que o penúltimo Cys foi alterado para Ser; a seqüência mostrada no painel superior da figura 13B), e o outro em que os códons de H5N1 nativos foram substituídos com códons degene- rados para minimizar a similaridade de seqüência de nucleotídeos com a seqüência de M2e humano a montante (seqüência mostrada no painel do fundo da figura 13B). O último foi feito a fim de reduzir as chances de re- combinação homóloga no vírus recombinante, entre seqüências de M2e hu- mano e de M2e aviário, que deveriam resultar em estabilidade genética mais alta do vírus. Placas de vírus construídas foram tingidas com anticorpos es- pecíficos de JE e M2e (Fig 13C). Tamanho da placa foi um pouco reduzido comparado ao vírus A25 de origem. Titulações do vírus P1 colhido imedia- tamente após a transfecção foram razoavelmente altas (~ 5 Iogi0 pfu/ml). Embora os vírus não fossem passados também nas células Vero, titulações mais altas podem ser esperadas em P2 e passagens subsequentes, como as titulações em P2 são usualmente mais altas para os constructos de Chi- meriVax como comparado à P1. Este experimento claramente demonstra que inserções mais longas (neste caso 56 aminoácidos em comprimento junto com os poucos resíduos extra do transpóson) podem ser incorporadas em um sítio de inserção identificado usando uma inserção mais curta (o epí- topo de M2e de 35 aminoácidos no vírus A25). A localização da inserção de NS1-236 tolera inserções de pelo menos 56 aminoácidos. Outra conclusão importante é que a adição da seqüência de M2e aviário à seqüência de M2e humano alterou a seqüência inserida geral (e possivelmente a estrutura) na localização de NS1-236 em comparação ao vírus A25. Esta foi a primeira evidência experimental da permissividade vasta deste sítio de inserção.

Além disso, o epítopo de influenza A de HA0 pode ser combina-

do com M2e em uma forma tandem similar. Outros epítopos do vírus influen- za, tais como epítopos neutralizadores de vírus da proteína de HA, ou epíto- pos de CTL podem ser inseridos sozinhos ou em várias combinações nesta localização (ou por analogia em algumas outras localizações em NS1 ou em outras proteínas virais), incluindo junto com M2e.

Para também demonstrar a permissividade vasta do sítio de in- serção de NS1-236, o epítopo protetor linear de SKAFSNCYPYDVPDYASL do vírus de influenza de H3 (também referido como epítopo de HAtag), que pode fornecer proteção contra várias cepas de influenza H3 (Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 104:246-251, 2007), foi engenheirado após o resíduo de NS1-236, e vírus recombinante foi gerado usando o método padrão de dois plasmídeos. O epítopo foi flanqueado através de dois resíduos de Gly em ambos os lados para flexibilidade, e seu resíduo de Cys foi alterado para Ser. A seqüência inserida do vírus viável restabelecido é mostrada na figura 17A. Placas do vírus (células Vero) foram tingidas com 12CA5 de MAb de anti-HAtag (figura 14B). Desse modo, o sítio de inserção de NS1-136 encon- trado por inserção aleatória do epítopo de M2e é permissivo para epítopos (por exemplo, HAtag) tendo seqüência totalmente diferente. Similar à inser- ção de M2e, este outro exemplo não só demonstra a inserção de um epítopo de células B, mas também um epítopo de células T, uma vez que HAtag re- presenta um epítopo de vírus influenza tanto de células B como também de células T (Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 104:246-251, 2007). Estabilidade genética, e cinética de crescimento em cultura de célula de vírus de chimerivax™-JE-NS1/M2E O gene de NS1 do vírus do Clone A25 (figura 6, painel A), que

tinha a titulação mais alta de 7 Iogi0 pfu/mL na passagem 2 (P2; a matéria- prima viral de pesquisa produzida seguindo 3 ciclos de purificação em placa e duas passagens de amplificação), foi usado para outra caracterização bio- lógica. A expressão eficiente de M2e é ilustrada adicionalmente na figura 6D por imunofluorescência de células infetadas com A25 que especificamente foram tingidas com MAb de M2e (como também anticorpos de JE).

Para determinar se o vírus é geneticamente estável in vitro, ele foi passado 10 vezes, para o nível de P12, em um MOI estimado de 0,001 pfu/mL em células Vero certificadas para produção de vacina. Quando o ví- rus de P12 foi tingido em um ensaio de imunofoco com Mab de M2e ou HIAF DE JE1 todas as placas tingidas com anticorpos e renderam a mesma titula- ção de 8 Iog10 pfu/mL (figura 6B). Isto demonstrou que o vírus na passagem 12 estavelmente manteve sua inserção.

Alguma adaptação de célula Vero ocorreu durante as passagens uma vez que o vírus ficou progressivamente mais citopático, e as placas no nível de P12 foram maiores que as placas do vírus em P2. O diâmetro médio das placas do vírus de P12 foi comparável ao do vírus de vetor de Chimeri- Vax™-JE. Quando o genoma total do vírus de P12 foi sequenciado, oito alte- rações de nucleotídeo foram detectadas (Tabela 4). Quatro alterações resul- taram nas substituições de aminoácido: Val para Ala na proteína E no resí- duo E-357, Met para Val em NS4B-95, e 2 substituições imediatamente a montante do peptídeo de M2e (Ser para Leu em NS1-235, e Phe para Leu no resíduo 1ins). Algumas das adaptações posteriores deveriam ter sido res- ponsáveis pelo tamanho de placa aumentado e replicação de vírus melhor (vide abaixo). Nenhuma destas alterações são reversões de marcadores de atenuação na vacina de ChimeriVax™-JE. (Mutações em três outros clones, A11, A79, e A88, que foram também passados para P12 e sequenciados, e foram observados estavelmente manter a inserção de M2e, são também mostradas na Tabela 4).

Cinética de crescimento do clone de A25 em P2 e níveis de P12 foi comparada ao vírus de vetor parental de ChimeriVax™-JE em células Vero. O resultado de um experimento representativo (MOI 0,001) é mostrado na figura 6C. Vírus de P2 cresceu eficientemente, mas um pouco mais lento que ChimeriVax™-JE, com pico no dia 6, um dia comparado depois ao vírus de vetor. Em contraste, vírus de P12 teve pico no dia 5 a uma titulação mais alta que ChimeriVax™-JE, no excesso de 7 Iogio pfu/mL. A replicação mais eficiente do vírus de P12 foi mais pronunciada em MOI de 0,1. Desse modo, o clone de A25 replicou mais eficientemente após 10 passagens em células Vero. Algumas das alterações de seqüência encontradas em P12 podem ser benéficas para fabricação de rendimento alto do vírus de vacina recombinan- te.

Um experimento piloto usando vírus de A25 de Chimerivax™-JE- NS1/M2e para estabelecer um modelo de camundongo para análise de imunogenicidade e eficácia de proteção de recombinantes de Chimeri- vax™-JE/influenza

Como com qualquer vetor de vacina viral, particularmente um para os quais roedores não são hospedeiros naturais (por exemplo, hospe- deiros naturais de YF1 o protótipo do tipo selvagem de YF 17D, são macacos e seres humanos), o estabelecimento de um modelo de animal pequeno re- levante e útil é desafiador. Com um tal modelo, deveria ser possível compa- rar a imunogenicidade relativa de múltiplos constructos virais recombinantes que expressam antígenos estranhos em várias configurações. A fim de de- terminar uma ótima via de imunização e obter evidência preliminar da imu- nogenicidade para ChimeriVax™-JE-NS1/M2e, grupos de camundongos Balb/c de 5 semanas de idade (N=10) foram imunizados subcutaneamente (SC) ou intraperitonealmente (IP) com 5 Iogio pfu/dose do clone de A25 (grupos 1 e 2, respectivamente; Tabela 5). Um grupo de controle positivo 3 recebeu dose SC de 10 pg das partículas de núcleo de hepatite B contendo peptídeo de M2e na superfície produzida em E. coli (HBc-M2e; Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004) com adjuvante de alume; este grupo foi refor- çado similarmente no dia 20. Grupos de controle negativos 4 e 5 foram imu- nizados SC com vetor de ChimeriVax™-JE (5 log-ιο pfu), ou pseudo- imunizados (diluente). Viremia em animais individuais nos grupos inoculados com vírus

foi determinada em soros colhidos nos dias 1, 3, 7, 9, e 11. O vírus A25 não causou nenhuma viremia detectável por qualquer via. Dois entre 10 animais inoculados com vírus de ChimeriVax™-JE tiveram viremia de baixo nível (50 e 275 pfu/mL) no dia 1 apenas que provavelmente representou o vírus inocu- lado. Desse modo, o vírus A25 não causou infecção sistêmica pronunciada através de ambas as vias.

No dia 38, todos os animais foram sangrados e as respostas de

anticorpo de anti-M2e foram determinadas por ELISA no fundo geral de so- ros para cada grupo. Nos grupos imunes ao vírus, as respostas de baixo nível foram apenas detectadas no grupo 2 (A25 IP), que teve titulações de IgG total e lgG2a de 100 (e nenhuma IgGI detectável), enquanto as titula- ções no grupo 3 (HBc-M2e SC/SC) foram altas, como esperado: 218.700, 218.700, e 24.300 para IgG total, IgGI, e lgG2a, respectivamente. Por este motivo, grupos 1, 2, e 4 foram reforçados no dia 40 com 5 Iogi0 pfu do res- pectivo vírus: grupo 1 foi reforçado SC, enquanto os outros grupos, IP. (Gru- po 5 também recebeu uma dose IP de diluente). Duas semanas depois (dia 54), animais foram novamente sangrados e as respostas de anticorpo de M2e foram medidas no fundo geral de soros (Tabela 5). O aumento do vírus A25 resultou em um aumento dramático nas titulações de anticorpo no grupo 2 (A25 IP/IP). Titulação de IgG total neste grupo aumentou aproximadamen- te 30 vezes a 2.700. No grupo 3 (HBc-M2e), titulação de IgG total foi 72.900. As leituras de OD de 450 nm para IgG total estão ilustradas para os grupos 2 e 3 na figura 7. Importantemente, embora a imunização de HBc-M2e resul- tasse predominantemente em resposta de IgGI, quase todos anticorpos in- duzidos por vírus A25 eram da subclasse de lgG2a (Tabela 5). Anticorpos de lgG2a são os mediadores principais de ADCC que são considerados ser o mecanismo principal de proteção induzida por M2e da infecção de influenza. Desse modo, um modelo de camundongo eficiente para medir imunogenici- dade de recombinantes de ChimeriVax™-JE/influenza foi estabelecido con- tando com imunização de IP seguida por aumento de IP.

No dia 55, animais foram desafiados intranasalmente (IN) com uma dose alta de 20 LD50 de vírus influenza de A/PR/8/34 adaptado para camundongo. Esta dose é 5 vezes mais alta comparada à dose de desafio padrão de 4 LD50 usada em estudos de HBc-M2e. Neste experimento piloto, foi deliberadamente selecionado a dose alta para responder à pergunta de se proteção mais eficiente é possível, quando comparada à imunização de HBc-M2e, quando M2e for liberado por vetor viral de ChímeriVax™-JE, até mesmo se as titulações de anticorpo de M2e de pós-imunização forem infe- riores. Teoricamente, isto poderia ser devido à estimulação viral não- específica de células apresentadoras de antígeno, resposta de CTL (peptí- deo de M2e contém um epítopo de CTL), indução de célula T helper robusta, como também alguns mecanismos de imunidade inata. Curvas de sobrevi- vência de pós-desafio são mostradas na figura 8. Como esperado dada a dose de desafio, a sobrevivência em animais imunizados com HBc-M2e foi incompleta (50%). Dois animais sobreviveram no grupo 2 IP/IP imunizado com vírus A25, que teve as titulações de anticorpo de M2e mais altas entre os dois grupos imunizados de A25 (20% de sobrevivência). Um animal so- breviveu no grupo 1 (A25 SC/SC). Todos os animais nos grupos de controle negativos 4 e 5 morreram. Destes dados, parece haver uma correlação clara entre o nível de proteção e titulação de anticorpo de M2e, independente se os animais foram imunizados com um vírus recombinante ou uma vacina de subunidade. Porém, deveria ser observado que alguns dos mecanismos a- cima podem ter representado um papel na imunização de A25, como a quantidade pg real de M2e liberada aos camundongos pelo vírus é desco- nhecida e pode ter sido muito baixa devido à replícação limitada do vírus neste modelo. Este aspecto pode ser dirigido no modelo de hamster em que a replicação de vírus periférico mais eficiente é esperada. Em primatas/seres humanos, ChimeriVax™-JE (como também outras vacinas de ChimeriVax™ e YF 17D) causa uma infecção sistêmica relativamente eficiente com titula- ções de viremia de pico de ~ 2 Iogi0 pfu/mL. Desse modo, uma resposta de M2e robusta e proteção de influenza após uma inoculação simples de vírus a uma dose relativamente baixa é esperada. Experimento de Camundongo 2 Usando Vírus A25 Um experimento de camundongo adicional foi feito com o vírus

A25 usando camundongos mais jovens, 4 semanas de idade (de dois ven- dedores), e uma dose IP mais alta de vírus A25 (7 Iogi0 pfu/mL). O projeto de experimento é mostrado na Tabela 6. Na maioria dos grupos, a matéria- prima de vírus de A25 P2 foi usada (que foi também usada no experimento anterior); este experimento também incluiu um grupo (#5) inoculado com o vírus de A25 P12 adaptado para célula Vero descrito acima. Controles nega- tivo foram ChimeriVax-JE e diluente (grupos 2, 4, e 7). Camundongos tacô- nicos de controle positivo foram inoculados SC com partículas de HBc-M2e (referidos como Acam-influenza A) misturadas com adjuvante de alume. En- tre os grupos de camundongo de Jackson, havia dois grupos criados para testar o efeito sinergístico entre o vírus A25 e Acam-influenza A: grupo 8 re- cebeu apenas Acam-influenza A sem adjuvante por meio da via IP, e grupo 9 recebeu Acam-influenza A misturado com A29, também IP. Todos os ca- mundongos foram reforçados em 1 mês após inoculação inicial, e as titula- ções de anticorpo M2e-específico (IgG total, e tipos IgGI, lgG2a, lgG2b, e lgG3) foram determinadas no dia 59 por ELISA em soros individuais (para IgG total) ou em fundo geral de soros para cada grupo (para isótipos de IgG); titulações de IgG total M2e-específica foram também determinadas no dia 30 (antes do aumento). Titulações de ELISA estão mostradas na Tabela 7; valores de GMT são dados para IgG total determinado em soros individu- ais. Os dados foram de acordo com o experimento de camundongo anterior, exceto que animais imunizados de A25 tiveram titulações de anticorpo M2e peptídeo-específico significativamente mais altas. A maioria dos animais ino- culados de A25 e Acam-influenza A seroconverteram-se após a primeira do- se, no dia 30. No dia 59 1 mês após o aumento) todos os animais nos grupos A25 e Acam-influenza A foram seropositivos e titulações de IgG total aumentaram dramaticamente comparadas ao dia 30. Como esperado, imu- nização de Acam-influenza-A/adjuvante de alume (grupo 3) resultou em res- posta predominantemente do tipo Th2, com titulações de IgGI sendo mais altas comparadas aos outros isótipos de IgG. Imunização com A25 (grupos 1, 5, e 6) resultou em resposta predominantemente do tipo Th1 associada às titulações de lgG2a mais altas, que é o tipo desejado para proteção mediada por M2e por meio do mecanismo de ADCC; e anticorpos de lgG2b e lgG3 que foram também implicados em ADCC (Jegerlehner et al., J. Immunol. 172:5598-5605, 2004) foram detectados. Este novamente demonstrou imu- nogenicidade alta do epítopo de M2e inserido no sítio de NS1-236 de Chime- ri Vax-JE.

Uma observação importante neste experimento foi que coinocu- lação de Acam-influenza A com vírus A25 significativamente aumentou a resposta do anticorpo de anti-M2e quando comparada à inoculação de A- cam-influenza A ou vírus A25 sozinho (comparar grupos 9 com grupos 8 e 6 na Tabela 7). No dia 59, GMTs de IgG total foram 95.940 e 35.050 para os grupos 9 e 8, respectivamente (a diferença proporcional foi pronunciada até mesmo mais no dia 30). Desse modo, um efeito sinergístico forte de coino- culação foi observado. Além disso, embora Acam-influenza A sozinho indu- zisse resposta do tipo Th1 principalmente (titulações de IgGI, lgG2a, lgG2b, e lgG3 de 72.900, 8.100, 300, e 900, respectivamente), coinoculação de A- cam-influenza A com vírus A25 levou a um deslocamento de Th2 claro como comprovado por uma proporção inferior de IgGI e uma proporção significati- vamente mais alta dos outros isótipos de anticorpo (titulações de 72.900, 72.900, 8.100, e 8.100 para IgGI, lgG2a, lgG2b, e lgG3, respectivamente). O efeito sinergístico não pode ser atribuído somente ao aumento da massa de antígeno (M2e) por vírus A25 em animais coinoculados, uma vez que a inoculação de A25 resultou sozinha em uma resposta imune modesta (em camundongos balb/c de Jackson, vide grupo 6 na Tabela 7). Estes efeitos poderiam ser também devido a um efeito adjuvante de replicação do vírus, por exemplo, em células dendríticas no sítio de inoculação. Tais efeitos ad- juvantes foram relatados para replicons de alfavírus (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 103:3722-3727, 2006; Hidmark et al., J. Virol. 80:7100-7110, 2006).

Expressão de M2e randomicamente inserido na proteína e de Chimeri- vax-JE

Foram feitos três experimentos para determinar se M2e pode ser fortuitamente inserido e expressado na proteína E do vetor de ChimeriVax- JE, na superfície das partículas virais. No primeiro experimento, RNA foi sin- tetizado com SP6 RNA polimerase na biblioteca do plasmídeo de pBSA- AR2-rM2e (Etapa 16 na figura 2). Células Vero foram transfeccionadas com o RNA usando lipofectamina. Apenas placas de vírus não-mutante foram observadas nos sobrenadantes de célula colhidos, que não foram tingidos com Mab de M2e. Presumivelmente, como no caso com inserção aleatória em NS1, o vírus que não carrega inserção de M2e rapidamente apareceu devido às inserções nas localizações instáveis em E, e ficou dominante. No segundo experimento, a biblioteca de genes de E-M2e foi de pUCAR02- rM2e (Etapa 13 na figura 2) com Nsil e Kasl, e in vitro ligado no vetor de pB- SA-AR2stop (da Etapa 15, figura 2). O produto de ligação foi Iinearizado com Xhol e transcrito in vitro. Células Vero foram eletroporadas com o RNA sinte- tizado, a suspensão de células transfeccionadas foi depois serialmente diluí- da (para reduzir a interferência entre os vírus não-mutantes e M2e- positivos), e as diluições das células foram banhadas em placas de Petri. Células Vero não-transfeccionadas foram adicionadas às placas semeadas com diluições mais altas de células transfeccionadas a fim de assegurar que as monocamadas de célula fossem confluentes. Após ligação, as monoca- madas celulares foram revestidas com ágar. Quando as monocamadas fo- ram tingidas 6 dias depois com Mab de M2e (após remoção do revestimento de agarose), vários focos positivos foram observados em diluições de célu- las transfeccionadas mais altas (1:4 e 1:8). Um exemplo de um dos focos é mostrado na Fig 12 A. O número de focos e seus tamanhos foram menores comparados a alguns daqueles observados com transfecções de biblioteca de NS1-M2e, indicando que pode ser mais difícil de inserir a inserção longa de 35 aminoácidos (usada em pUC-AR02-rM2e; igual na figura 5) na proteí- na E comparada a NS1. No terceiro experimento, uma inserção de M2e mais curta (SLLTEVETPIRNEWGSR) foi produzida recozendo dois iniciadores fosforilados complementares. A seqüência de nucleotídeo da inserção é co- mo segue:

5'-P-AGC CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CCT ATC AGA AAC GAA TGG GGG AGC AGA-31

A mesma inserção mas contendo dois resíduos de Iigantes Gly extras em ambos os lados, para flexibilidade (comprimento total 21 aminoá- cidos), foi produzida similarmente. A seqüência de nucleotídeo da segunda inserção é como segue:

5'-P-GGA GGA AGC CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CCT ATC AGA AAC GAA TGG GGG AGC AGA GGC GGC-3' As duas inserções foram ligadas no sítio de Pmel cego da biblio-

teca de pUC-AR02-rTn7enr (Etapa 8, figura 2) no lugar do transiniciador. O DNA do plasmídeo do vetor foi desfosforilado antes da ligação. Duas biblio- tecas de plasmídeo novas foram produzidas, pUC-AR2-17M2e e pUC-AR2- 17gM2e, respectivamente. A inserção de Nsil-Kasl das duas bibliotecas foi transferida para o vetor de pBSA-AR2stop, resultando em bibliotecas de pB- SA-AR2-17M2e e pBSA-AR2-17gM2e de comprimento total, que foram de- pois usadas para transcrição in vitro. As duas bibliotecas posteriores foram digeridas primeiro com Pmel para eliminar quaisquer moléculas de DNA mo- delo de comprimento total não contendo as inserções (enquanto nas molécu- Ias contendo inserção, os sítios de clonagem de Pmel em ambos lados da inserção são removidos). Depois eles foram Iinearizados com Xhol e trans- critos com SP6 RNA polimerase. Células Vero foram eletroporadas com as transcrições e semeadas, não diluídas, em placas de Petri e revestidas com agarose após células ligarem. Para evitar interferência com vírus sem inser- ção, as monocamadas foram tingidas com Mab de M2e antecipadamente, no dia 4 pós-transfecção. Até ~ 100 focos pequenos foram observados nas du- as transfecções. Exemplos de tais focos são mostrados na figura 12 A e B, para vírus de ChimeriVax-JE contendo a inserção de M2e de 17 aminoáci- dos na proteína E, e a inserção de GG-17 aminoácido-GG, respectivamente. Desse modo, parece que encurtando a inserção significativamente de 35 aminoácidos para 17 ou 21 aminoácidos aumentou o restabelecimento dos vírus recombinantes. É possível que algumas das variantes M2e-positivas observadas, uma vez isoladas, replicarão razoavelmente bem. Se necessá- rio, variantes mais eficientemente de replicação podem ser isoladas das transfecções adicionais. Além disso, variantes de replicação lenta podem ser passadas serialmente, por exemplo, nas células Vero, com a expectativa que algumas segundas mutação(ões) de sítio) ocorrerão, melhorando o crescimento. Este exemplo claramente demonstra a possibilidade de fortui- tamente inserir epítopos imunológicos estranhos na proteína E. Inserção aleatória de epítopo de M2e na proteína de prM de vírus de vetor de Chimerivax-JE

Os modos diferentes de expressão em glicoproteínas virais (prM,

E, ou NS1) são ilustrados na figura 15. Epítopos inseridos na proteína E se- rão apresentados na superfície das partículas virais (180 cópias) e portanto pode ser esperado que sejam mais imunogênicos. Expressão na proteína de NS1 libera o epítopo inserido na superfície das células infetadas, como tam- bém extracelularmente nos oligômeros de NS1 segregados. Embora imuno- genicidade alta do modo posterior tenha sido demonstrada acima em exem- plos experimentais, pode ser inferior neste caso comparado à expressão em E (ainda suficientemente alto para alguns epítopos, por exemplo, epítopos de anticorpo neutralizante de vírus que fornecem proteção muita mais forte comparados aos epítopos não-neutralizantes, tais como M2e de influenza). Expressão em prM resultará na apresentação parcial na superfície de partí- culas virais devido ao fenômeno conhecido de clivagem incompleta de prM através de furina no processo de maturação da partícula de flavivírus, e pos- sivelmente na apresentação extracelular adicional dentro da parte N-terminal segregada de prM gerada por clivagem de furina. Este modo de expressão é também esperado ser altamente imunogênico, mais imunogênico que a ex- pressão em NS1. Se os epítopos podem ser inseridos na proteína M madura (porção C-terminal de prM), todas as moléculas de epítopo podem ser tam- bém apresentadas na superfície da partícula viral (180 cópias), similar à ex- pressão em E.

Para inserir o epítopo de M2e (35 aminoácidos comprimento to- tal de inserção) em prM de ChimeriVax-JE, entre os sítios de Sphl e Nsil (S- phl está localizado a montante do começo do gene de prM), a biblioteca de plasmídeo de pBSA-AR1-rM2e foi construída (figura 2). A representatividade desta biblioteca foi ~ 105 colônias. Ela foi usada como modelo para transcri- ção in vitro, e as transcrições de RNA resultantes foram usadas para trans- feccionar monocamadas de células Vero com lipofectamina. As células transfeccionadas foram revestidas com agarose e as monocamadas das cé- lulas foram tingidas com Mab de M2e no dia 5-6. Placas M2e-positivas foram observadas. Clones virais M2e-positivos foram colhidos que correspondem às placas positivas do revestimento de agarose e também purificadas em ciclos adicionais de purificação de placa, seguidos por 2 passagens de am- plificação para preparar 5 matérias-primas virais puras designadas M1, M2, M3, M6, e M8.

Todos novos clones recombinantes foram eficientemente tingi- dos com anticorpos de M2e e de JE, enquanto as placas do vírus de vetor de ChimeriVax-JE foram tingidas com anticorpos de JE apenas. Exemplos de placas tingidas no dia 5 em ensaio de placa padrão (revestimento de me- tila celulose) são mostrados na figura 16A. Placas de mutantes de inserções de M1, M2, e M3 foram maiores comparadas a ChimeriVax-JE1 enquanto as placas dos clones de M6 e M8 foram menores. (Esta diferença em tamanhos de placa foi mais pronunciada sob revestimento de agarose.) Desse modo, parece que os clones de M1-3 puderam replicar melhor in vitro comparados ao vírus de vetor. Isto foi confirmado no experimento de curvas de cresci- mento (figura 16B). Clones de M1-3 cresceram mais rápidos e produziram titulações de pico mais alto que ChimeriVax-JE, enquanto as titulações de M6 e M7 foram ligeiramente inferiores.

Localizações da inserção foram determinadas nos clones atra- vés de sequenciação. Os resultados estão mostrados na figura 17. De forma interessante, a inserção de M2e foi adicionada no final do término N do prM JE-específico do vírus de ChimeriVax-JE nos clones Μ1, M2, e M3, embora em aminoácidos diferentes. A localização no clones M6 e M8 foi a mesma (após resíduo Pro 147 na ORF viral; ou prM-26). No vírus de ChimeriVax-JE o N-término de prM (MKLS...) é formado através da clivagem de sinalase de célula hospedeira (figura 17). Nos clones M1, M2, e M3, a inserção foi incor- porada 4, 1, e 2 resíduos de aminoácido a montante do princípio de prM de JE, respectivamente. Desse modo nestes vírus os términos N de prM mutan- te contêm as seqüências de peptídeo de M2e seguidas por 4, 1, ou 2 resí- duos virais precedendo a seqüência de prM nativa, seguido pela seqüência de prM. Os sítios de clivagem de sinalase novos foram prognosticados nos mutantes com o programa em-linha comum SignaIP 3.0 usando dois algorit- mos diferentes (mostrados na figura 17). No clone M1, as duas possíveis clivagens podem remover um ou três aminoácidos N-terminais de M2e. Em M2, a clivagem simples fortemente prognosticada resultará em Gly N- terminal seguido por seqüência de M2e completa. Em M3, o término N será ou como em M2 ou três dos resíduos de M2e podem ser clivado por uma possível clivagem alternativa). O fato que as placas dos três clones estavam eficientemente tingidas com Mab de M2e sugere que clivagens em M1 e M3 ocorreram com perda mínima de resíduos de M2e. Importantemente, proba- bilidades prognosticadas de clivagem de sinalase para os clones de M1-3 foram mais altas comparadas a ChimeriVax-JE (por exemplo, 0,387 para clone de M2 vs. 0,073 para ChimeriVax-JE). Isto pode explicar por que os vírus de M1-3 crescem melhores que os antepassados de ChimeriVax-JE. Desse modo, a proteína de prM é altamente permissiva para in-

serções em várias localizações, particularmente seus resíduos N-terminais. Com base nos resultados descritos (placas maiores, replicação mais eficien- te em células Vero, probabilidade de clivagem de sinalase prognosticada mais alta em clones de M1-3), acredita-sE que o término N de prM, que pa- rece ser sem importância para o conjunto de partícula de flavivírus, será um sítio de inserção amplamente permissivo e tolerará várias outras inserções, incluindo inserções longas (por exemplo, 50, 100, 200, 400 aminoácidos, etc.). Desse modo é inserindo nesta localização HIV gag, peptídeos compre- endendo até 200 primeiros resíduos de proteína de 12 de HPV16, HAi de influenza, e HA de comprimento total (-550 a.a. em comprimento). Estes são projetados para conter seqüências heterólogas fundidas com o término N ou prM (como é o caso com M2e em clones de M1-3), ou ser clivados de prM mediante incorporação de sinal adicional, ou um sítio de clivagem de protea- se apropriado, ou autoprotease, em frente à seqüência de prM de vírus de vetor.

Construção de um análogo de chimerivax-wn do vírus A25 (Chimerivax- JE com inserção de M2E EM NS1-236) Vírus de ChimeriVax-JE, como também o vírus A25 descrito a- cima, não replica eficientemente em camundongos (por exemplo, não há nenhuma viremia de pós-inoculação detectável). Não obstante, réplicas de ChimeriVax-JE melhoram em seres humanos 2 Iogi0 pfu/mL de viremia) (Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003), e desse modo vírus A25 poderia induzir uma resposta de anticorpo de M2e alta em seres humanos e poderia as proteger de infecção de influenza. Foi demonstrado recentemente que vírus de ChimeriVax-WN (a versão da vacina humana de WN02; WO 2004/045529) replica muito bem em hamsters (~ 3 Iogi0 pfu/mL de viremia) (WO 2006/116182 A1), como também em seres humanos (~ 2 Iogi0 pfu/mL de viremia) (Monath et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 103:6694-6699, 2006). Para obter evidência adicional de proteção pelo epítopo de M2e ex- presso no sítio de NS1-236 do vírus de ChimeriVax usando um modelo mais robusto (ChimeriVax-WN02 em hamsters vs. ChimeriVax-JE em camundon- gos), um análogo de ChimeriVax-WN02/M2eNS 1-236 do vírus A25 foi cons- truído. Os genes de prM-E JE-específicos no plasmídeo de pBSA contendo cDNA de ChimeriVax-JE de comprimento total foram substituídos com genes de prM-E do vírus de ChimeriVax-WN02, usando técnicas de clonagem pa- drão. Isto resultou no plasmídeo de pBWN02 (figura 18). O gene de NS1 com inserção de M2e do vírus A25 (com ou sem duas adaptações de células Vero à direita a montante da seqüência de M2e; Tabela 4) foi clonado em pBWN02. Os dois plasmídeos resultantes foram transcritos in vitro, e células Vero foram transfeccionadas com as transcrições de RNA e revestidas com ágar. Placas muito grandes foram observadas no dia 6, que foram tingidas com Mab de M2e (figura 18, painel do fundo).

As duas versões de ChimeriVax-WN02/M2eNS1-236, WN02/A25 e WN02/A25adapt, foram purificadas em placa uma vez e matérias-primas do vírus clonado foram preparadas por amplificação adicional em células Vero. Exemplos de placas comparadas com ChimeriVax-WN02 e Chimeri- Vax-JE são mostrados na figura 19A. Curvas de crescimento dos vírus no- vos em células Vero estão mostradas na figura 19B. O vírus de WN02/A25 cresceu um pouco menos que ChimeriVax-WN02 (titulação de pico ~ 7,5 Iog10 pfu/mL vs. -8,7 Iog10 pfu/mL, respectivamente). Similar ao vírus A25 adaptado (vide na figura 6C), a versão de WN02/A25adapt (com duas alte- rações de aminoácido a montante da seqüência de M2e) cresceu melhor, quase também ChimeriVax-WN02. Desse modo, uma inserção originalmente introduzida na proteína de NS1 de ChimeriVax-JE foi de forma bem sucedida transferida para vírus da vacina de ChimeriVax-WN02. As duas adaptações de cultura de célula originalmente observadas no vírus A25 intensificaram o crescimento de vírus de WN02/A25. Conclusão

Sob conclusão, foi executado de forma bem-sucedida mutagê- nese mediada por transpóson dos genes prM/M, E, e NS1 do vírus de vacina de ChimeriVax™-JE para fortuitamente inserir o epítopo protetor de M2e de consensos do vírus influenza A com o propósito de gerar uma vacina univer- sal altamente eficaz contra influenza A. Viabilidade do método foi demons- trada rapidamente produzindo vários mutantes de vírus contendo a inserção reconhecível por anticorpo de anti-M2e, nas proteínas prM e NS1, e inserin- do o peptídeo de M2e na proteína E. Também foi mostrado que os clones de A25 do vírus de ChimeriVax™-JE-NS1/M2e e vários clones do vírus de Chi- meriVax™-JE-prM/M2e replicaram-se eficientemente em células Vero, e os sítios de inserção de M2e nestes vírus foram identificados. Também, foi mostrado que o vírus A25 é geneticamente estável, visto que ele manteve a inserção de M2e por 10 passagens de MOI baixo in vitro. Alguns sítios de inserção identificados pelo método de mutagênese aleatória direta da inven- ção podem ser amplamente permissivos, tanto em termos de tamanho de inserção e seqüência, como foi exemplificado usando a localização de NS1- 236. Sítios de inserção permissivos encontrados em um flavivírus podem ser usados em outros flavivírus, como exemplificado nos experimentos transfe- rindo gene de NS1 com inserção de M2e de ChimeriVax-JE para Chimeri- Vax-WN. Também, um modelo de iniciador IP/reforçador IP eficiente para análise de imunogenicidade em camundongos foi, de forma bem-sucedida, estabelecido, e imunogenicidade alta de uma variante de inserção foi de- monstrada. Apesar de replicação periférica indetectável em camundongos, incluindo após inoculação IP, o vírus foi altamente imunogênico e induziu anticorpos de M2e predominantemente de lgG2a que são altamente desejá- veis em termos de proteção mediada por ADCC através de imunização de M2e. Outra descoberta nova nesses experimentos foi um efeito sinergístico forte da coinoculação de um peptídeo de M2e expressando recombinante viral com um candidato de vacina de subunidade com base em M2e.

Como debatido acima, o método descrito aqui é aplicável a to- das as outras proteínas alvo de ChimeriVax™, como também outros vírus de vacina viva como vetores, incluindo vacinas vivas de YF17D ou de não- flavivírus, ou organismos de vetores não-virais. Este método pode ser usado para o constructo de vacinas recombinantes contra uma gama extensiva de patógenos de saúde pública humana e importância veterinária.

Observe que a seqüência esboçada das etapas de construção (figura 2) pode variar e ainda estar dentro do escopo desta invenção. Tam- bém, transpósons diferentes de Tn7 podem ser usados diretamente para inserção aleatória de um sítio de restrição aleatória ou um epítopo estranho. O antecedente, como também usando sítios de restrição diferentes de Pmel para inserção aleatória, ou marcadores seletivos diferentes em quaisquer das etapas de construção, ou usando qualquer método diferente para isolar vírus mutantes viáveis (por exemplo, ELISA usando sobrenadantes de célu- las infetadas por vírus, ou classificando a célula para isolar as células positi- vas, etc.) ou para caracterizar vírus in vitro e in vivo, etc., não altera o signifi- cado desta invenção.

Tabela 1 - Lista de exemplos de patógenos dos quais epítopos/antíaenos

/peptídeos podem ser derivados

VÍRUS:

Flaviviridae

Vírus da febre amarela Vírus da encefalite japonesa Vírus da dengue, tipos 1, 2, 3 & 4 Vírus do Nilo Ocidental Vírus de encefalite de carrapato Vírus da Hepatite C (por exemplo, genótipos 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 4a, 4b, 4c, e 4d) Papoviridae

Papilomavírus

Retroviridae

Vírus da imunodeficiência humana, tipo I Vírus da imunodeficiência humana, tipo Il Vírus da Imunodeficiência de símio Vírus linfotrópico T humano, tipos I & Il Hepnaviridae

Vírus da hepatite B Picornaviridae

Vírus da hepatite A Rinovírus Poliovírus

Herpesviridae

Vírus do herpes simples, tipo I Vírus do herpes simples, tipo Il Citomegalovírus Vírus de Epstein Barr

Vírus de varicela-zoster

Togaviridae

Alfavírus Vírus da rubéola Paramixoviridae

Vírus sincitial respiratório Vírus da parainfluenza Vírus do sarampo Vírus da caxumba Ortomixoviridae

Vírus influenza

Filoviridae Vírus de Marburg Vírus Ebola

Rotoviridae:

Rotavírus Coronaviridae

Coronavírus Adenoviridae

Adenovírus Rhabdoviridae

Vírus da raiva BACTÉRIAS: E. coli enterotoxigênico E. coli enteropatogênico Campylobacter jejuni Helicobacter pylori Salmonella typhi Vibrio cholerae Clostridium difficile Clostridium tetani Streptococccus pyogenes Bordetella pertussis Neisseria meningitides Neisseria gonorrhoea Legionella neumophilus Clamydial spp. Haemophilus spp. Shigella spp. PARASITAS: Plasmodium spp. Schistosoma spp. Trypanosoma spp. Toxoplasma spp. Cryptosporidia spp. Pneumocystis spp. Leishmania spp.

Tabela 2 - Exemplos de Antíaenos Seletos dos Vírus Listados VÍRUS ANTÍGENO

Flaviviridae

Vírus da febre amarela Nucleocapsídeo, glicoproteínas M & E

Vírus da encefalite japonesa Vírus da dengue, tipos 1, 2, 3

& 4

Vírus do Nilo Ocidental Vírus de encefalite de carra-

pato

Vírus da Hepatite C

Nucleocapsídeo, glicoproteínas E1 & E2

Papoviridae:

Papilomavírus

Proteína de capsídeo L1 & L2, proteí- na de transformação E6 & E7 (onco- genes)

Retroviridae

Vírus da imunodeficiência gag, pol, vif, tat, vpu, env, nef humana, tipo I

Vírus da imunodeficiência humana, tipo Il

Vírus da imunodeficiência de símio

Vírus linfotrópico T humano, gag, pol, env

tipos I & Il

Tabela 3 - Exemplos de epítopos de células b e t dos vírus/antígenos lista-

dos

VÍRUS ANTÍGENO

Flaviviridae

Hepatite Nucleocapsí- C deo

EPITOPO LOCALIZA- SEQÜÊNCIA (5'-3') ÇÃO

CTL

2-9

STNPKPQR 35-44 41-49 81-100

129-144 132-140 178-187

Glicoproteina CTL 231-250

Ε1

Glicoproteína CTL 686-694

E2

725-734 489-496 569-578 460-469 621-628 Célula B 384-410

411-437

441-460

511-546

Thelper 411-416

Papoviridae

HPV16 E7 Jhelper 48-54

CTL 49-57

Célula B 10-14 38-41 44-48

YLLPRRGPRL

GPRLGVRAT

YPWPLYGNEGCG-

WAGW LLS P

GFADLMGYIPLVGAPL

DLMGYIPLV

LLALLSCLTV

REGNASRCWVA VTPT-

VATRD

STGLIHLHQ

LLADARVCSC CWHYPPRPCGI CVIGGVGNNT RRLTDFAQGW Tl NYTIFK

ETHVTGG NAG RTTA-

GLVGLLTPGAKQN

IQLINTNGSWHINS-

TALNCNESLNTGW

LFYQHKFNSSGCPER-

LASCR

PSPVVVGTTDRS- GAPTYSWGANDTDV FVLNNTRPPL IQLINT

DRAHYNI

RAHYNIVTF

EYMLD

IDGP

QAEPD HPV18 Ε7 Jhelper 44-55 VNHQHLPARRA

81-90 DDLRAFQQLF

Tabela 4. Estabilidade genética do clone A25 do vírus de Chimerivax-JE- NS1/M2e. como também clones A11. A79. E A88. Genomas totais do vírus foram seauenciado na passagem de estabilidade genética P12.

Alterações/heterogeneidades do nucleotídeo e alterações de a.a. são mostradas.

Gene Posição (a.a.) nt A25 A11 A79 A88 C 401 M 931 935 (60) 956 (67) T-C C(R)-T(C) C/G (LTV) E 1223 (81) 1963 C-A C/T (H/Y) 2052 (357) 2165(395) 2453(491) T(V)-A(A) C(H)-T(Y) C(L)-T(F) C/T (H/Y)

NS1

NS2a

NS3

3012(177) 3186 (235) de Presente?

Sm

3375 (298) 3910 4099 4141 5683 5938 6031 6043

C(T)-T(I) C(T)-T(I)

G-A

C-T

T-C

G-A

A/G

C-T

T-C 2K 6893(16) A/G (T/A) 6906 (20) C/T (A/V) NS4b 7199(95) A(M)-G(V)

NS5

7963

8008 (114) 8059

G/T

G(M)- A(I)

T/C

3'UTR

10689

G-T

1 A localização da inserção em NS1 e numeração de nt/a.a. mostrada na figura 5.

Tabela 5. Respostas de anticorpo de M2e em camundonaos de BALB/C no dia 54 (2 semanas após aumento dos grupos 1, 2. 4. E 5)1.

Grupo

Imunizado

Titulações de anticorpo de

Reforço2 M2e no dia 54

Com

Via

IgG total IgGI lgG2a

1 A25 SC SC 100 <100 <100 2 A25 IP IP 2.700 300 2.700 3 HBc-M2e SC SC 72.900 72.900 24.300 4 ChimeriVax-JE SC IP <100 <100 <100 Simulado(diluente) SC IP <100 <100 <100

1 Para vírus, doses de imunização e reforço foram 5 Iogi0 pfu; para HBc-M2e, as doses foram 10 pg de partículas + alume.

2 Grupo 3 foi reforçado no dia 20, enquanto os grupos 1, 2, 4 e 5 foram re- forçados no dia 40. Tabela 6. Projeto do experimento #2 de camundongo usando vírus A25 (4 fêmeas de camundongos de BALB/C de dois vendedores). Titulações de

Grupo Vendedor Ne de animais Inoeulado Dose Via principal Via de reforço (1 mo.) 1 Taconic 8 A25 P2 7 Iog IP IP 2 8 CV-JE 7 Iog IP IP 3 8 Acam-Influenza- A + Alume 10 pg + alume SC SC 4 8 Diluente - IP IP 8 A25 P12 7 Iog IP IP 6 Jackson 8 A25P2 7 Iog IP IP 7 8 CV-JE 7 Iog IP IP 8 3 Aeam-Influenza A 10 pg IP 9 4 A25P2 + Acam- influenza A 7 Iog/ 10 pg IP IP CM

ο

C φ

φ

Q X LJU

(Λ O σ c ο

Ό C

E

CO

O E

UJ

CO

0 υ

õ φ

Q CO UJ

1

φ CM

CO O Q

O O

C <

Φ

Q

CO

CO '

CO O Q

CO φ

OC

Λ

Φ JD CO H

Titulações de M2e de ELISA no dia 59 (após reforço) lgG3 agru- pado 2,700 <100 2,700 N/D οοε o o CO <100 o O CJi 8,100 lgG2b agru- pado o o σ> <100 24,300 N/D OOl- OOI- <100 οοε o o co" lgG2a agru- pado o o CO CM <100 72,900 N/D 8,100 8,100 <100 8,100 72,900 IgGI agru- pado 8,100 <100 218,700 N/D o o CO 2,700 <100 72,900 72,900 IgG total GMT 10,090 OOl- > >187,080 N/D 3,695 3,160 <100 35,050 95,940 M2e de IgG total ELISA no dia 30 (pré- reforçado) GMT3 1.004 <100 4,677 N/D IO IO 0 01 00 001> o o σι 6,155 Seroconvertido CO 00 CO o CO CO N/D CO CO 00 CO O ε/ε Inoculado com A25P2 IP/IP CV-JE IP/IP Influenza A/Al SC/SC Diluente IP/IP A25P12 IP/IP A25P2 IP/IP CV-JE IP/IP Influenza A IP/IP A25P2/influenza A IP/IP Grupo CM CO * IO CO 00 σ> Os conteúdos de todas as referências citadas acima são incor- porados aqui por referência. Uso de formas singulares aqui, tais como "um(a)" e "o(a)M não exclui indicação da forma plural correspondente, a me- nos que o contexto indique o contrário. Desse modo, por exemplo, se uma reivindicação indicar a administração de "um" flavivírus, pode também ser interpretado como abrangendo a administração de mais de um flavivírus, a menos que do contrário indicado. Outras modalidades estão dentro das rei- vindicações a seguir. Listagem de Seqüência

<110> Acambis Inc. et al.

<120> "CONSTRUÇÃO DE VACINAS DE VÍRUS RECOMBINANTE POR INSERÇÃO DIRETA MEDIADA TRANSPÓSON DE DETERMINANTES IMUNOLÓGICOS ESTRANHOS EM PROTEÍNAS DE VÍRUS VETORIAL"

<130> 06132/111W04 <140> PCT/US07/1607 8 <141> 2007-07-16 <150> US 60/880,353 <151> 2007-01-12 <150> US 60/831,013 <151> 2006-07-14 <160> 91

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epítopo <400> 1

Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 10 15

Phe Ile Glu

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epítopo

<400> 2

Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly ίο

15

Phe Ile Glu

<210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epítopo <400> 3

Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly 10 15

Phe Leu Glu

<210> 4

<211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epítopo <400> 4

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epítopo <400> 5 Met Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro lie Ser His

lie Arg Gly Ser 20

<210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 6

Met Leu Glu Pro Phe Gln

1 5

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 7

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20

<210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 8

Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp lie Ile Pro Lys Val 20

<210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 9

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

<210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 10

Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp 10 15

Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly 25

<210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 11 Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr

Ser Leu

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 12

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr

1 5

Arg

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<22 3> epitopo

<400> 13

agccttctaa ccgaggtcga aacgcctatc

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo

<400> 14

ggaggaagcc ttctaaccga ggtcgaaacg ggc

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 15

Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Ser 15

agaaacgaat gggggagcag a

cctatcagaa acgaatgggg gagcagaggc <210> 15 <211> 8

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 15

Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg 1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 16

Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu

10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo

<400> 17

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 1 5

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> epitopo <400> 18

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 10 15

Leu Leu Ser Pro 20

<210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 19

Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 10 15

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220>

<22 3> epitopo <400> 20

Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Leu Val 1 5

<210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 21

Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val 10

22 20 PRT

Artificial

1

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> epitopo <400> 22

Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala Val Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Ala Thr Arg Asp 20

<210> 23 <211> 9 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 23

Ser Thr Gly Leu lie His Leu His Gln 1 5

<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 24

Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys

1 5 10

<210> 25

<211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22〇>

<223> epitopo

<400> 25

Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly lie

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 26

Cys Val lie Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 27

Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala Gln Gly Trp

1 5 10

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 28 Thr lie Asn Tyr Thr lie Phe Lys 1 5

<210> 29 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 29

Glu Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu 1 5 10 15

Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn 25

<210> 30 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 30

lie Gln Leu lie Asn Thr Asn Gly Ser Trp His lie Asn Ser Thr Ala 10 15

Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp 25

<210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 31

Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu 5

10

15

20

25

1 5

Ala Ser Cys Arg 20

32 26 PRT

Artificial

10

15

Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr 10 15

Ala Asn Asp Thr Asp Val 25

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> epitopo <400> 32 Pro Ser Pro Val 1

Tyr Ser Trp Gly 20

<210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 33

Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu 10

34 6

PRT

Artificial

30

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

epitopo 34

lie Gln Leu lie Asn Thr

5 <210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo

<400> 35

Asp Arg Ala His Tyr Asn lie 1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 36

Arg Ala His Tyr Asn lie Val Thr Phe 1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo

<400> 37

Glu Tyr Met Leu Asp 1 5

<210> 38

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> epitopo <400> 38

lie Asp Gly Pro

1

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 39

Gln Ala Glu Pro Asp 1 5

<210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 40

Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala

10

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 41

Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe 1 5 10

<210> 42 5

10

15

20

25

30

<211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <400> aca Thr 1

cgc Arg

120 DNA

Artificial epitopo

CDS (1).. 42 tea gtg Ser Val

(120)

aac gag Asn Glu

ttt Phe

tgg Trp 20

ggg ggc age ctg tta acc gag gtg

Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val

5

ggc age Gly Ser

gaa ccc aaa caa Glu

Pro Lys

35 43 40 PRT

Artificial

tea gtt Gln Ser Val

cgc Arg

gaa Glu

age Ser

gag Glu 40

10

aac gat age tea Asn Asp Ser Ser 25

gag Glu

gat Asp

acc cct att Thr Pro lie 15

ggc ggc ttc Gly Gly Phe 30

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> ConstrugSo sint^tica <400> 43

Thr Ser Val Phe Gly Gly Ser Leu Leu 1 5

Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn

25

Glu Pro Lys Gln Ser Val Glu Glu 40

Thr Glu Val Glu Thr Pro lie 15

Asp Ser Ser Asp Gly Gly Phe 30

48

96

120

<210> 44 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 44

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15

Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

<210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 45

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly 1 5 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp

20

<210> 46 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 46

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu 1 5 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp <210> 47 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 47

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly 1 5 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20

<210> 48 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 48

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20

<210> 49 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 49

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 5

10

15

20

25

30

20

50 24 PRT

Artificial

Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu

10 15

Asp Ser Ser Asp

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> epitopo <400> 50 Met Ser Leu Leu 1

Cys Lys Cys Ser

20

<210> 51

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 51

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr His Thr Arg Asn Gly Trp Gly 1 5 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp

20

<210> 52 24 PRT

Artificial

<211> <212> <213> <220>

<223> epitopo <400> 52

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20

<210> 53 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 53

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15

Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20

<210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 54

Pro Ser lie Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie 1 5 10 15

Glu

<210> 55

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 55

Pro Gln lie Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie <210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 56

Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly lie Phe Gly Ala 工Ie Ala Gly Phe lie 10 15

Glu

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo

<400> 57

Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe Leu

1 5 10 15

Glu

<210> 58

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 58 Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie 1 5 10 15

Glu

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo

<400> 59

Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie

1 5 10 15

Glu

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> epitopo

<400> 60

His Lys Arg Lys Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie

1 5 10 15

Glu

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 61 Pro Ala Arg Ser Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie 10 15

Glu

<210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 62

Pro Gln lie Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe Xle 10 15

Glu

<210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> epitopo <400> 63

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

<210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> epitopo <400> 64

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15

Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp

20

<210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 65

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

<210> 66 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 66

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15

Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20

<210> 67 <211> 23 <212> PRT

<213> Artificial <220> <223> epitopo <400> 67

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Glu Cys 1 5 10 15

Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20

<210> 68 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 68

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Glu Cys 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

<210> 69 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 69

Phe Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu 1 5 10 15

Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Phe Glu Pro Lys 25 30

Gln Ser Val 35

<210> 70 5

10

15

20

25

30

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

21 PRT

Artificial

epitopo 70

Gly Gly Ser 1

Glu Ser Arg

Leu Leu Thr Glu Val Glu

5

Gly Gly 20

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <400>

71

183

DNA

Artificial epitopo

aca Thr 1

cgc Arg

ggc Gly

gag Glu

CDS (1).- 71 tea gtg Ser Val

aac gag

Asn Glu

ggc age Gly Ser

35 age agg Ser Arg 50

(183)

ttt Phe

tgg Trp 20 ctg Leu

ggc Gly

ggg

Gly 5

ggc Gly

ggc Gly

age Ser

ctg acc Leu Thr

ggc Gly

gaa

Glu

age Ser

cgc Arg

gag Glu

ccc Pro 55

aac

Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp

15

tta acc Leu Thr 10 gat Asp

ctg Leu

age Ser

gtg Val 40

aaa caa tea Lys Gln Ser

gag Glu

age Ser

gtg Val

tea Ser

Asn

25

gag acc ccc acc Glu Thr Pro Thr

gtt Val

gag Glu

gat Asp

gaa

Glu 60

acc cct Thr Pro 15

ggc ggc Gly Gly 30

agg aac

Arg Asn 45 gag Glu

gag Glu

att lie

ttc Phe

tgg Trp

48

96

144

183 <210> 72 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> ConstrugSo sintetica <400> 72

Thr Ser Val Phe Gly Gly Ser Leu 1 5

Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser

20

Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val

40

Glu Ser Arg Gly Gly Glu Pro Lys

50 55

<210> 73

<211> 183

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> epitopo <220>

<221> CDS

<222> (1)..(183)

<400> 73

aca tea gtg Thr Ser Val 1

cgc aac gag Arg Asn Glu

Leu Thr

10

Asn Asp

25

Glu Thr Gln Ser

ggt ggt tea

ttt ggg ggc age ctg Phe Gly Gly Ser Leu 5

tgg ggc age cgc age Trp Gly Ser Arg Ser 20

tta tta aca gaa gtt

Glu Val Glu Thr

Ser Ser Asp

Pro Thr

Val Glu 60

tta acc

Leu Thr 10 aac gat Asn Asp 25

gaa aca

Arg

45 Glu

gag gtg Glu Val

age tea Ser Ser

Gly

30

Asn

gag

Glu

gat Asp

cca aca aga

acc Thr

ggc Gly 30 aat

Pro lie

15

Gly Phe Glu Trp

cct att

Pro lie 15

ggc ttc Gly Phe

gaa tgg

48

96

144 5

10

15

20

25

30

Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val

40

gaa tea aga ggt ggc gaa ccc aaa Glu Ser Arg Gly Gly Glu Pro Lys

50 55

<210> 74 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> ConstrugSo sintetica <400> 74

Phe Gly Gly Ser Leu

Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp 45

caa tea gtt gaa gag Gln Ser Val Glu Glu 60

183

Thr Ser Val 1

Arg Asn Glu

Trp

20

Leu

5

Gly Ser Arg Ser

Gly

Leu Thr Glu Val 40

Gly Glu Pro Lys 55

Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie

15

Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Phe 30

Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp 45

Gln Ser Val Glu Glu 60

Gly Gly Ser

35

Glu Ser Arg 50

<210> 75 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> epitopo <220>

<221> CDS <222> (1) . . (93) <400> 75

gga aca tea gtt ggc ggc tcc aaa gcc ttt tea aac age tat cca tat 48

Gly Thr Ser Val Gly Gly Ser Lys

Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Pro Tyr 5

10

15

20

25

30

gac gtg cca gat Asp Val Pro Asp 20

76 31 PRT

Artificial

10 15

tac gcc tcc ctc ggc ggc gaa gag agt gaa atg Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Glu Glu Ser Glu Met 30

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Gly Thr Ser 1

Asp Val Pro

Construgao sintetica 76

Val Gly Gly Ser Lys Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Pro Tyr 10 15

Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Glu Glu Ser Glu Met

Asp

20

25

30

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <400>

77

123

DNA

Artificial epitopo

CDS (1). 77

ggc atg ctg Gly Met Leu 1

cct att cgc Pro lie Arg

(123)

ttg atg Leu Met 5

aac gag Asn Glu 20

ttt ggg ggc age ctg tta acc gag

Phe Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu 10

tgg ggc age cgc age aac gat age Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser 25

gtg gag acc Val Glu Thr 15

tea gat ggc Ser Asp Gly 30

93

4Θ

96

ggc ttc gaa

ccc aaa

cag ttg atg acg

123 5

10

15

20

25

30

Gly Phe Glu Pro Lys Gln Leu Met Thr 40

78 41 PRT

Artificial

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Gly Met Leu

ConstrugSo sintetica 78

Leu Met Phe Gly Gly 5

Glu Trp Gly Ser

Pro lie Arg Asn

20

Gly Phe Glu Pro 35

Lys Gln Leu Met 40

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <400>

79

123

DNA

Artificial epitopo

CDS (1). 79

ttg atg acg Leu Met Thr 1

cct att cgc Pro lie Arg

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr

15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly 30

Thr

(123)

ggt gtg ttt ggg ggc Gly Val Phe Gly Gly 5

aac gag tgg ggc age Asn Glu Trp Gly Ser 20

age ctg tta acc gag gtg gag acc

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr

15

cgc age aac gat age tea gat ggc Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly 30

48

96

ggc ttc gaa

ccc aaa cag ggt ggg atg

123 5

10

15

20

25

30

Gly Phe Glu Pro Lys Gln Gly Gly Met 40

80 41 PRT

Artificial

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Leu Met Thr 1

Pro lie Arg

Construgao sintetica 80

Gly Val Phe Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu

10

Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser 25

Gly Phe Glu Pro Lys Gln Gly Gly Met 40

Val Glu Thr 15

Ser Asp Gly 30

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <400>

81

123

DNA

Artificial epitopo

CDS (1). 81

.<123)

ctg ttg atg acg gtg ttt ggg ggc age ctg tta acc gag gtg gag acc Leu Leu Met Thr Val Phe Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr 1 5

cct att cgc Pro lie Arg

aac gag tgg ggc age Asn Glu Trp Gly Ser 20

15

cgc age aac gat age tea gat ggc Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly 30

48

96

ggc ttc gaa

ccc aaa cag acg ggt ggg

123 5

10

15

20

25

30

Gly Phe Glu Pro Lys Gln Thr 35 82 41 PRT

Artificial

Gly Gly 40

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Leu Leu Met 1

Pro lie Arg

ConstrugSo sintetica 82

Thr Val Phe Gly Gly Ser 5

Glu Trp Gly

Gly Phe Glu 35

Asn

20

Pro Lys Gln Thr

Ser Arg

25 Gly Gly 40

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <400>

83

123

DNA

Artificial epitopo

CDS (1). 83

ate gtg att lie Val lie 1

cct att cgc Pro 工Ie Arg

(123)

ccc atg Pro Met 5

aac gag Asn Glu 20

ttt ggg Phe Gly

tgg ggc Trp Gly

ggc age

Gly Ser

age cgc Ser Arg 25

Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr 15

Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly 30

ctg tta acc gag gtg gag acc 48

Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr 15

age aac gat age tea gat ggc 96

Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly 30

ggc ttc gaa

ccc aaa cat ccc acc tea

123 Gly Phe Glu Pro Lys His Pro Thr Ser

40

<210> 84 <211> 41 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> ConstrugSo sintetica <400> 84 lie Val lie 1

Pro lie Arg Gly Phe Glu

35

<210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> epitopo <400> 85

lie Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly Met Lys Leu Ser Asn Phe 10 15

Gln Gly

<210> 86

<211> 10862

<212> DNA

<213> Artificial <220>

Pro Met Phe Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr

10 15

Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Gly 25 30

Pro Lys His Pro Thr Ser 40

<223> epitopo 5

10

15

20

25

30

<220>

<221> CDS

<222> (119) . . (10354) <400> 86

agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag atg tct ggt cgt aaa get cag gga aaa acc ctg

Ala Gln Gly

Met Ser Gly Arg Lys

1 5

cga cga gga gtt cgc Arg Arg Gly Val Arg 20

caa att gga aac aga Gln lie Gly Asn Arg 35

ttt ttc ttt ttg ttc Phe Phe Phe Leu Phe 50

cta aag agg ttg tgg Leu Lys Arg Leu Trp

65

cta agg aaa gtc aag Leu Arg Lys Val Lys 85 cgt Arg

tcc ttg tea Ser Leu Ser

cct gga cct Pro Gly Pro 40

aac att Asn lie

55 aaa atg Lys Met 70

aga gtg Arg Val

ttg Leu

ctg Leu

gtg Val

tea agg aaa

Ser Arg Lys

ttg gga atg Leu Gly Met 115

aga tgg ttg Arg Trp Leu

cgc Arg 100 ctg Leu

ctc Leu

tcc cat

Ser His

ttg atg acg Leu Met Thr

cta aat gtg Leu Asn Val

gat

Asp

ggt Gly 120 aca Thr

Lys Thr 10

aac aaa Asn Lys 25

tea aga Ser Arg

act gga Thr Gly

gac cca Asp Pro

gcc agt Ala Ser 90

gtt ctg Val Leu 105

gga gtg Gly Val

tct gag Ser Glu

Leu

ata

lie

ggt Gly

Thr

gac Asp

atcgagttgc taggcaataa

cagagaactg accagaac ggc gtc aat atg gta Asn

Gly Val

Val

Met

15

aaa caa aaa aca aaa

Lys Gln

Lys

aga

Arg

75

ttg

Leu

act Thr

gtt Val

aag Lys 60 caa Gln

atg Met

gtg Val

ttg Leu

ctc Leu

caa

Gln

45

ate

lie

ggc Gly

aga Arg

Gln

gtg Val 125

ggg

Gly

Lys

30

gga

Gly

Thr Lys

Thr

ttg Leu

gga Gly

ttc Phe 110 egg Arg

aaa Lys

ttt

Phe

gcc Ala

get Ala

ttg

Leu

95

cta

Leu

aaa Lys

ate lie

His

gtt Val 80 tcc Ser

att lie

Thr

Asn

ttc Phe

60 118 166

214

262

310

358

406

454

502

550 130

tct gtg ggc aca

Ser Val Gly Thr 145

tgg tgc cca gac

Trp Cys Pro Asp

gag gag cca gat Glu Glu Pro Asp 180 aga gtc gca tat Arg Val Ala Tyr 195

aga agg gcc att Arg Arg Ala lie 210

egg caa gaa aaa Arg Gln Glu Lys 225

aag att gag aga

Lys lie Glu Arg

ctg acc att gcc Leu Thr lie Ala

260

att gcc cta ctg lie Ala Leu Leu 275

att gga att act lie Gly 工Ie Thr 290

tgg gtt tea get

135

ggc aac tgc aca aca Gly Asn Cys Thr Thr 150

tea atg gaa tac aac Ser Met Glu Tyr Asn 165

gac att gat tgc tgg Asp lie Asp Cys Trp 185

ggt aag tgt gac tea Gly Lys Cys Asp Ser 200

gac ttg cct acg cat Asp Leu Pro Thr His 215

tgg atg act gga aga Trp Met Thr Gly Arg 230

tgg ttc gtg agg aac Trp Phe Val Arg Asn 245

tac ctt gtg gga age Tyr Leu Val Gly Ser 265

gtc ttg get gtt ggt Val Leu Ala Val Gly 280

gac agg gat ttc att Asp Arg Asp Phe lie 295

acc ctg gag caa gac

140

aac att ttg gaa gcc

Asn lie Leu Glu Ala 155

tgt ccc aat ctc agt Cys Pro Asn Leu Ser 170

tgc tat ggg gtg gaa Cys Tyr Gly Val Glu 190

gca ggc agg tct agg Ala Gly Arg Ser Arg 205

gaa aac cat ggt ttg Glu Asn His Gly Leu 220

atg ggt gaa agg caa Met Gly Glu Arg Gln 235

ccc ttt ttt gca gtg

Pro Phe Phe Ala Val 250

aac atg acg caa cga Asn Met Thr Gln Arg 270

ccg gcc tac tea get Pro Ala Tyr Ser Ala 285

gag ggg gtg cat gga Glu Gly Val His Gly 300

aag tgt gtc act gtt

aag tac 598

Lys Tyr 160

cca aga 646

Pro Arg

175

aac gtt 694

Asn Val

agg tea 742

Arg Ser

aag acc 790

Lys Thr

ctc caa 838

Leu Gln 240

acg get 886

Thr Ala

255

gtc gtg 934

Val Val

cac tgc 982

His Cys

gga act 1030 Gly Thr

atg gcc 1078 Trp Val Ser Ala Thr 305

cct gac aag cct tea

Pro Asp Lys Pro Ser

325

aga cct get gag gtg Arg Pro Ala Glu Val 340

gtg aag att aat gac Val Lys lie Asn Asp 355

gaa gag aac gaa ggg

Glu Glu Asn Glu Gly 370

ggc tgg ggc aat ggc Gly Trp Gly Asn Gly 385

tgc gcc aaa ttc act Cys Ala Lys Phe Thr

405

cag acc aaa att cag Gln Thr Lys lie Gln 420

aag cag gaa aat tgg Lys Gln Glu Asn Trp 435

ctg tea ggc tcc cag Leu Ser Gly Ser Gln 450

ctg gaa tgc cag gtg Leu Glu Cys Gln Val 465

Leu Glu Gln Asp 310

ttg gac ate tea

Leu Asp lie Ser

agg aaa gtg tgt Arg Lys Val Cys 345

aag tgc ccc age

Lys Cys Pro Ser 360

gac aat gcg tgc Asp Asn Ala Cys 375

tgt ggc cta ttt Cys Gly Leu Phe 390

tgt gcc aaa tcc Cys Ala Lys Ser

tat gtc ate aga Tyr Val lie Arg 425

aat acc gac att Asn Thr Asp lie 440

gaa gtc gag ttc Glu Val Glu Phe 455

caa act gcg gtg Gln Thr Ala Val 470

Lys Cys Val Thr 315

cta gag aca gta Leu Glu Thr Val

330

tac aat gca gtt

Tyr Asn Ala Val

act gga gag gcc Thr Gly Glu Ala 365

aag cgc act tat Lys Arg Thr Tyr 380

ggg aaa ggg age Gly Lys Gly Ser 395

atg agt ttg ttt Met Ser Leu Phe 410

gca caa ttg cat Ala Gln Leu His

aag act ctc aag Lys Thr Leu Lys 445

att ggg tat gga lie Gly Tyr Gly 460

gac ttt ggt aac Asp Phe Gly Asn 475

Val Met Ala 320

gcc att gat 1126 Ala lie Asp 335

ctc act cat 1174

Leu Thr His

350

cac cta get 1222

His Leu Ala

tct gat aga 1270

Ser Asp Arg

att gtg gca 1318

lie Val Ala 400

gag gtt gat 1366 Glu Val Asp 415

gta ggg gcc 1414

Val Gly Ala

430

ttt gat gcc 1462 Phe Asp Ala

aaa get aca 1510 Lys Ala Thr

agt tac ate 1558

Ser Tyr lie 480 get gag atg gaa aca Ala Glu Met Glu Thr 485

gac ttg acc ctg cca Asp Leu Thr Leu Pro 500

atg cat cat ctt gtc Met His His Leu Val 515

gta ctg gcc ctg gga Val Leu Ala Leu Gly 530

ggc gca atg agg gtt Gly Ala Met Arg Val

545

cta cat ggt gga cat Leu His Gly Gly His 565

ctc aag ggg aca tcc Leu Lys Gly Thr Ser 580

aag aac cca act gac Lys Asn Pro Thr Asp 595

gtg tea aaa gga gcc Val Ser Lys Gly Ala 610

ctt aca gcg gca ate Leu Thr Ala Ala lie

625

gcc tea acc aat gat Ala Ser Thr Asn Asp

gag age tgg ata gtg gac aga

Glu Ser Trp lie Val Asp Arg 490

tgg cag agt gga agt ggc ggg Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly 505

gaa ttt gaa cct ccg cat gcc Glu Phe Glu Pro Pro His Ala 520

aac cag gaa ggc tcc ttg aaa Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys 535 540

aca aag gac aca aat gac aac Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn 550 555

gtt tct tgc aga gtg aaa ttg Val Ser Cys Arg Val Lys Leu 570

tac aaa ata tgc act gac aaa Tyr Lys lie Cys Thr Asp Lys

585

act ggc cat ggc act gtt gtg Thr Gly His Gly Thr Val Val 600

ccc tgc agg att cca gtg ata Pro Cys Arg lie Pro Val lie 615 620

aat aaa ggc att ttg gtt aca Asn Lys Gly lie Leu Val Thr 630 635

gat gaa gtg ctg att gag gtg Asp Glu Val Leu lie Glu Val

cag tgg gcc cag 1606

Gln Trp Ala Gln 495

gtg tgg aga gag 1654

Val Trp Arg Glu 510

gcc act ate aga 1702

Ala Thr lie Arg

525

aca get ctt act 1750

Thr Ala Leu Thr

aac ctt tac aaa 1798

Asn Leu Tyr Lys 560

tea get ttg aca 1846

Ser Ala Leu Thr 575

atg ttt ttt gtc 1894 Met Phe Phe Val

590

atg cag gtg aaa 1942

Met Gln Val Lys

605

gta get gat gat 1990 Val Ala Asp Asp

gtt aac ccc ate 2038 Val Asn Pro lie 640

aac cca cct ttt 2086

Asn Pro Pro Phe gga gac Gly Asp

5

10

15

20

25

cag

Gln

atg Met

ttc Phe 705 acg Thr

ata lie

tgg Trp

aaa Lys 690 age Ser

gtg Val

30

Thr

atg Met

aac Asn 785 aga Arg

age tac Ser Tyr 660 cac aaa

His Lys 675

ggc gtg Gly Val

Thr

aga

Arg

atg Met 770 ttt Phe

gac Asp

tcc Ser

ttt Phe

aag Lys

aac Asn 755 ttt Phe

ggc Gly

tct Ser

get

Ala

ggc Gly

gtc Val 740 atg Met

ttg Leu

aag Lys

gat Asp

645 att lie

gag Glu

gaa Glu

gga Gly

tct Ser 725 ate lie

cct gtg aag ctt

Thr

tct Ser

aga Arg

gac Asp 805 gca

ate lie

gga Gly

cgc Arg

ggg

Gly 710 gcc Ala

atg Met

atg Met

cta Leu

gag Glu 790 tgg Trp

gtt

Val

age Ser

ctg Leu 695 ttc Phe

ttt Phe

ggg

Gly

tcc Ser

gga Gly 775 ctc Leu

ctg Leu

ggg

Gly

tea Ser 680 gcc Ala

ttc Phe

cag Gln

gcg Ala

atg Met 760 gtt Val

aag Lys

Asn

aga Arg

665 ata lie

gtc Val

act Thr

ggg

Gly

gta Val 745 age Ser

ggg

Gly

tgc Cys

aag Lys

tea ata gtg aaa

650 gga Gly

gga Gly

atg Met

tcg Ser

cta Leu 730 ctt Leu

atg

Met

gcg Ala

gga Gly

tac Tyr 810 gcc

gat

Asp

aag Lys

tea Ser

ttg Leu

gga gac

Gly Asp 700

gtt

Val 715 ttt Phe

ata lie

ate

lie

gat Asp

gat Asp 795 tea Ser

cgt Arg

ttc Phe 685 acc Thr

ggg

Gly

ggc Gly

tgg Trp

ttg Leu

Gln 780 ggt Gly

tac Tyr

Lys

ggc Gly

gtt Val

gta Val 765 gga Gly

ate lie

tat Tyr

ctc Leu 670 act Thr

gcc Ala

gga Gly

ttg Leu

ggc Gly 750 gga

Gly

tgc Cys

ttc Phe

Pro

tct ttt gaa gaa

655 act Thr

cag Gln

tgg Trp

att lie

aac Asn 735 ate lie

gtg

Val

gcc Ala

ata lie

gaa Glu 815

ggg

tac

Tyr

acc Thr

gat Asp

cat His 720 tgg Trp

2134

Asn

ate

lie

ate lie

ttt Phe 800 gat Asp

aag

2182

2230

2278

2326

2374

2422

2470

2518

2566

2614 5

10

15

20

25

30

Pro Val Lys Leu Ala Ser lie Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys

820 825 830

tgt ggc cta aat tea gtt gac tcc ctt gag cat gag atg tgg aga age 2662

Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser

835 840 845

agg gca gat gag ate aat gcc att ttt gag gaa aac gag gtg gac att 2710

Arg Ala Asp Glu 工Ie Asn Ala 工Ie Phe Glu Glu Asn Glu Val Asp lie

850 855 860

tct gtt gtc gtg cag gat cca aag aat gtt tac cag aga gga act cat 2758

Ser Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His 865 870 875 880

cca ttt tcc aga att egg gat ggt ctg cag tat ggt tgg aag act tgg 2806

Pro Phe Ser Arg lie Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp

885 890 895

ggt aag aac ctt gtg ttc tcc cca ggg agg aag aat gga age ttc ate 2854

Gly Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg Lys Asn Gly Ser Phe lie

900 905 910

ata gat gga aag tcc agg aaa gaa tgc ccg ttt tea aac egg gtc tgg 2902

lie Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro Phe Ser Asn Arg Val Trp

915 920 925

aat tct ttc cag ata gag gag ttt ggg acg gga gtg ttc acc aca cgc 2950

Asn Ser Phe Gln lie Glu Glu Phe Gly Thr Gly Val Phe Thr Thr Arg

930 935 940

gtg tac atg gac gca gtc ttt gaa tac acc ata gac tgc gat gga tct 2998

Val Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr lie Asp Cys Asp Gly Ser 945 950 955 960

ate ttg ggt gca gcg gtg aac gga aaa aag agt gcc cat ggc tct cca 3046 He Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys Ser Ala His Gly Ser Pro

965 970 975

aca ttt tgg atg gga agt cat gaa gta aat ggg aca tgg atg ate cac 3094

Thr Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn Gly Thr Trp Met lie His

980

985

990 acc ttg gag gca tta gat tac aag gag tgt gag tgg cca ctg aca cat Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys Glu Trp Pro Leu Thr His

3142

5

10

15

20

25

30

995 1000

acg att gga aca tea gtt gaa gag Thr 工Ie Gly Thr Ser 1010

tea ate gga ggc cca Ser lie Gly Gly Pro 1025

aag gtt cag acg aac

Lys Val Gln Thr 1040

aag aga gaa get Lys Arg Glu Ala 1055

tgt gat gga egg Cys Asp Gly Arg 1070

aaa gtt att cct Lys Val lie Pro

1085

gtg age ttc cat Val Ser Phe His 1100

agg cca agg aaa Arg Pro Arg Lys 1X15

aca get gga gaa Thr Ala Gly Glu 1130

atg ata gca atg Met lie Ala Met

Val Glu

1015 gtt age Val Ser

1030 gga cct Gly Pro

1045 cca ggg Pro Gly 1060 aaa tea Lys Ser

1075 tgg tgt Trp Cys

1090 agt gat Ser Asp

1105 cat gaa His Glu 1120 cat get His Ala 1135 gaa gtg gtc Glu Val Val

Glu

tct Ser

Asn

tgc Cys

gga Gly

gaa Glu

ggt Gly

acg Thr

ata lie

agt Ser

tgg Trp

act Thr

Thr

tgc Cys

ggg

Gly

age Ser

gtc Val

His

atg Met

age Ser

aga Arg

cgc Arg

tgt Cys

cat His

cct Pro

gaa

Glu

aat Asn

cag Gln

gtg Val

tcc Ser

tcc Ser

tgg Trp

ctg Leu

ttt Phe

atg

Met

cat His

gta Val

ate lie

1005 ttc atg

Thr

tgc Cys

tat Tyr

Phe 1020 ate lie 1035 cca Pro 1050 att lie 1065 acg Thr 1080 aca Thr 1095 ccc

cta agg Leu Arg

Lys

Pro

1110 gtg cgc Val Arg

1125 ggt ttg Gly Leu

1140 aga cag Arg Gln

Met

cct Pro

cta Leu

gat Asp

gat Asp

atg Met

atg Met

tcc Ser

gtg Val

gga Gly

ccg Pro

gga Gly

gaa Glu

ggc Gly

age Ser

ccg Pro

gaa Glu

tgg Trp

age Ser

aga

Arg

tac Tyr

gtg Val

Pro

Asn

ggg

Gly

cct Pro

att lie

gtt Val

atg Met

aag Lys

3187

3232

3277

3322

3367

3412

3457

3502

3547

3592 5

10

15

20

25

30

1145 caa atg ttg Gln Met Leu 1160 ggg caa gta Gly Gln Val Thr Leu

1175 gga ttg cat Gly Leu His

1190 atg gcg ttg Met Ala Leu

1205 ggc ttt ggg Gly Phe Gly 1220 ctg acc cta Leu Thr Leu

1235 atg ggc ggc Met Gly Gly 1250

ctg aca ata aat get Leu Thr lie Asn Ala 1265

ttg ccc ctc atg get Leu Pro Leu Met Ala 1280

aga ctt gcc gca atg Arg Leu Ala Ala Met 1295

ctt cac cag aat ttc

1150

gtt gga gga gta Val Gly Gly Val 1165

act ctc ctt gat Leu Asp 1180 gag atg Glu Met 1195 gcc ttt Ala Phe 1210 acc cta Leu 1225 gcc atg Ala Met

1240 aag tat Lys Tyr

1255 gtt get Val Ala

1270 ctg ttg Leu Leu

1285 ttc ttt Phe Phe 1300 aag gac

ttc cat Phe His

att get lie Ala

ctc agg acc Leu Arg Thr

gga gca Gly Ala

ctg tgg Leu Trp

1155

gtg ctc ttg gga gca Val Leu Leu Gly Ala 1170

ttg ctg aaa ctc aca Leu Leu Lys Leu Thr 1185

aac aat gga gga gac

Asn Asn Gly Gly Asp 1200

tea ate aga cca ggg Ser lie Arg Pro Gly 1215 gaa Glu 1230 ttg Leu 1245 tct Ser 1260 tea Ser 1275 atg Met 1290 ate lie 1305 aag

tgg age cct

Trp Ser Pro

gtg gag att Val Glu lie

cta aat gca

Leu Asn Ala

tct agg aaa Ser Arg Lys

aca cct gtc Thr Pro Val

tgt gcc gtg Cys Ala Val

egg Arg

gcc Ala

gtt

Val

gca Ala

act Thr

gtt Val

atg ctg Met Leu

gtg Val

gcc Ala

ctg Leu

cgc Arg

ggt Gly

ctc Leu

get

Ala

atg Met

ctc Leu

ctt Leu

ggc Gly

tgc

Cys

aat acc Asn Thr

get

Ala

ata lie

gag Glu

ggg

Gly

gtc

Val

gtg Val

tat Tyr

ate lie

gtg Val

gtg Val

ate lie

ate lie

gtg Val

gtc Val

3637

3682

3727

3772

3817

3862

3907

3952

3997

4042

acc tcc atg cag

act ata cct

4087 5

10

15

20

25

30

Leu His

1310 ctg gtg Leu Val

1325 ttt ttg Phe Leu

1340 agg agt Arg Ser

1355 gga gtg Gly Val

1370 ggt ccg Gly Pro

1385 get ggg Ala Gly 1400 tea tgg Ser Trp

1415 gat gtg Asp Val

1430 gag aaa Glu Lys

1445 gtt ggg Val Gly 1460

Gln Asn Phe Lys

gcc ctc

Ala Leu

ggc ctg Gly Leu

ate cca lie Pro

ctg

Leu

att lie

agg Arg

gaa Glu

gca Ala

gtg Val

get Ala

gca

Ala

gca Ala

gtg Val

gag Glu

ctc Leu

Pro

gcc Ala

aca

Thr

tgt Cys

gtg Val

gga Gly

gtt Val

gat Asp

gag Glu

agt Ser

tgg Trp

ctc Leu

ctc

Leu

gca Ala

aat Asn

ctg Leu

gga Gly

ggg

Gly

gcg Ala

gaa Glu

gac Asp

cat His

Asp 1315 aca Thr 1330 ttt Phe 1345 gag Glu 1360 get Ala 1375 gga Gly 1390 cta Leu 1405 gag Glu 1420 caa Gln 1435 cag Gln 1450 cca Pro 1465

Thr Ser Met

tct

Ser

ctg Leu

gca Ala

ttt Phe

ctc Leu

gag Glu

ate lie

ggg

Gly

gtt Val

ttt Phe

tac

Tyr

gca Ala

ctc Leu

cag Gln

ctg Leu

ctc Leu

age Ser

gag Glu

gtg Val

get Ala

ctg

Leu

acc Thr

gca Ala

gag Glu

atg Met

aag Lys

ggg

Gly

ttc Phe

atg Met

ctt Leu

Gln Lys

1320 ggc ttg Gly Leu

1335 cgc ata Arg lie

1350 gca get Ala Ala

1365 atg gag Met Glu

1380 atg ctg Met Leu

1395 aag ctt Lys Leu

1410 agt tcc Ser Ser

1425 aag ctg Lys Leu

1440 acc tcg Thr Ser

1455 ctg ctg Leu Leu 1470

Thr lie Pro

aca

Thr

ttt Phe

ggt Gly

caa cct

Gln Pro

ggg cga

Gly Arg

4132

Asn

gtt Val

ggt Gly

gcc Ala

ctt Leu

ctg Leu

gtc Val

cta Leu

ttc Phe

age Ser

gaa Glu

cgc Arg

tct Ser

gcc Ala

ctt Leu

gtg Val

ctt Leu

gtg Val

gtt Val

tat Tyr

gaa Glu

ttg Leu

get Ala

4177

4222

4267

4312

4357

4402

4447

4492

4537 5

10

15

20

25

30

ggg tgg Ctg Gly Trp Leu

1475 ttg tgg gat Leu Trp Asp

1490 ctg gag gat Leu Glu Asp

1505 gcc tcc cag Ala Ser Gln

1520 aca atg tgg Thr Met Trp

1535 aag aag ttg Lys Lys Leu

1550 gcc tat ggt

ttt cat gtc agg

Phe His Val Arg 1480

att ccc act cct lie Pro Thr Pro 1495

ggg att tat ggc Gly lie Tyr Gly 1510 cga gga gtg gga Arg Gly Val Gly 1525

cat gtc aca aga His Val Thr Arg 1540

att cca tct tgg lie Pro Ser Trp 1555

ggc tea tgg aag

Ala Tyr Gly Gly Ser Trp Lys

1565 gaa gag gtc Glu Glu Val

1580 aac gtc cag Asn Val Gln

1595 gaa ate ggg Glu lie Gly 1610 tct cct att Ser Pro lie

1570

cag ttg ate gcg Gln Leu lie Ala 1585

aca aaa ccg age Thr Lys Pro Ser 1600

get gtc get ctt Ala Val Ala Leu 1615

gtt aac agg aac Val Asn Arg Asn

gga get agg aga agt ggg gat gtc 4582

Gly Ala Arg Arg Ser Gly Asp Val 1485

aag ate ate gag gaa tgt gaa cat 4627

Lys lie lie Glu Glu Cys Glu His 1500

ata ttc cag tea acc ttc ttg ggg 4672

lie Phe Gln Ser Thr Phe Leu Gly 1515

gtg gca cag gga ggg gtg ttc cac 4717

Val Ala Gln Gly Gly Val Phe His 1530

gga get ttc ctt gtc agg aat ggc 4762

Gly Ala Phe Leu Val Arg Asn Gly 1545

get tea gta aag gaa gac ctt gtc 4807

Ala Ser Val Lys Glu Asp Leu Val 1560

ttg gaa ggc aga tgg gat gga gag 4852

Leu Glu Gly Arg Trp Asp Gly Glu

1575

get gtt cca gga aag aac gtg gtc 4897

Ala Val Pro Gly Lys Asn Val Val 1590

ttg ttc aaa gtg agg aat ggg gga 4942

Leu Phe Lys Val Arg Asn Gly Gly 1605

gac tat ccg agt ggc act tea gga 4987

Asp Tyr Pro Ser Gly Thr Ser Gly 1620

gga gag gtg att ggg ctg tac ggc 5032

Gly Glu Val lie Gly Leu Tyr Gly 5

10

15

20

25

30

aat

Asn

cag Gln

ccg Pro

cct Pro

gag Glu

agg Arg

gtg

Val

1625

ggc

Gly

1640

act

Thr

1655

aca

Thr

1670

gga

Gly

1685

tgc

Cys

1700

gtt

Val

1715

aaa

1630

ate ctt gtc ggt gac Val

lie

Leu

Lys 1730 gaa gtc Glu Val

1745 ttg gaa Leu Glu

1760 gaa gcc Glu Ala

1775 gca gcg

Gly Asp

1645

gag gtg aag gaa gaa Glu Val Lys Glu Glu 1660

atg cta aag aaa gga Met Leu Lys Lys Gly

1675

get ggg aag aca aga Ala Gly Lys Thr Arg 1690

gca egg aga cgc ttg Ala Arg Arg Arg Leu 1705

gtt ctt tct gaa atg Val Leu Ser Glu Met 1720

ttc cac aca cag get Phe His Thr Gln Ala 1735

att gat gcc atg tgc lie Asp Ala Met Cys 1750

cca act agg gtt gtt Pro Thr Arg Val Val 1765

cat ttt ttg gat cca His Phe Leu Asp Pro 1780

cac aga get agg gca

1635

aac tcc ttc gtg tcc gcc ata tcc 5077

Asn Ser Phe Val Ser Ala lie Ser 1650

gga aag gag gag ctc caa gag ate 5122

Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu lie 1665

atg aca act gtc ctt gat ttt cat 5167

Met Thr Thr Val Leu Asp Phe His 1680

cgt ttc ctc cca cag ate ttg gcc 5212

Arg Phe Leu Pro Gln lie Leu Ala 1695

cgc act ctt gtg ttg gcc ccc acc 5257

Arg Thr Leu Val Leu Ala Pro Thr 1710

aag gag get ttt cac ggc ctg gac 5302

Lys Glu Ala Phe His Gly Leu Asp 1725

ttt tcc get cac ggc age ggg aga 5347

Phe Ser Ala His Gly Ser Gly Arg 1740

cat gcc acc cta act tac agg atg 5392

His Ala Thr Leu Thr Tyr Arg Met 1755

aac tgg gaa gtg ate att atg gat 5437

Asn Trp Glu Val lie lie Met Asp 1770

get age ata gcc get aga ggt tgg 5482

Ala Ser lie Ala Ala Arg Gly Trp 1785

aat gaa agt gca aca ate ttg atg 5527 Ala Ala His Arg Ala Arg Ala 1790 1795

aca gcc aca ccg cct ggg act

Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr

Asn Glu Ser

1805 1810

ggt gaa ata gaa gat gtt caa Gly Glu lie Glu Asp Val Gln 1820 1825 aac aca ggg cat gac tgg ate Asn Thr Gly His Asp Trp lie 1835 1840

tgg ttc ctt cca tcc ate aga Trp Phe Leu Pro Ser lie Arg 1850 1855

ttg cgt aag get gga aag agt Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ser 1865 1870

ttt gag aga gaa tac ccc acg Phe Glu Arg Glu Tyr Pro Thr 1880 1885 ata ttg gcc act gac ata get lie Leu Ala Thr Asp lie Ala

1895 1900

gag cga gtg ctg gat tgc agg Glu Arg Val Leu Asp Cys Arg 1910 1915

gat gaa ggg agg aag gtg gca Asp Glu Gly Arg Lys Val Ala 1925 1930

gca tcc tct get get caa agg agg ggg cgc Ala Ser Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg

agt gat

Ser Asp

acg gac Thr Asp

cta get Leu Ala

get gca Ala Ala

gtg gtg Val Val

ata aag lie Lys

gaa atg Glu Met

acg get Thr Ala

ata aaa lie Lys

gaa

Glu

ata lie

gac

Asp

aat Asn

gtc Val

cag Gln

gga Gly

ttt Phe

ggg

Gly

Ala Thr 1800 ttt cca Phe Pro

1815 ccc agt Pro Ser

1830 aaa agg Lys Arg 1845 atg Met 1860

lie Leu Met

gtc

Val

ctg Leu

aag Lys

gcc Ala

aag Lys

Pro

att lie

aac

Asn

1875

aaa

Lys

1890

aac

Asn

1905

cct

Pro

1920

ctt

Leu

1935

ggg

Gly

cat

His

gag Glu

Pro

get Ala

agg Arg

cct Pro

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aat

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gtg Val

gtg Val

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5572

5617

5662

5707

5752

5797

5842

5887

5932

5977

1940

1945

1950 aac aga gat gga gac Asn Arg Asp Gly Asp 1955

aat aat gcc cac cac Asn Asn Ala His His 1970

gac aac atg gag gtg Asp Asn Met Glu Val 1985

gtt gaa gga act aaa Val Glu Gly Thr Lys 2000

agg gat gac cag agg Arg Asp Asp Gln Arg

2015

gac ctg ccc gtt tgg

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aag acg aat gat cgt

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Glu lie Leu Asn Asp 2060

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Gly Gly Ala Lys Lys 2075

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Val Ser Ser Asp Gln

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tea tac tac tat tct gag Ser Tyr Tyr Tyr Ser Glu 1960

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agg ggt gga atg gtc gcc Arg Gly Gly Met Val Ala 1990

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aaa gtc ttc aga gaa cta Lys Val Phe Arg Glu Leu 2020

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aag tgg tgt ttt gaa ggc Lys Trp Cys Phe Glu Gly 2050

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cct ctg cgc cca agg tgg Pro Leu Arg Pro Arg Trp 2080

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1965

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1980

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1995

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2070

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10

15

20

25

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2135 aat gca cta Asn Ala Leu

2150 ttt ata ctg

30

2110 2115

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2125 2130

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2140 2145

tea atg atg cct gag gca atg aca ata gtc atg ctg 6607

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2155 2160

get gga cta ctg aca tcg gga atg gtc ate ttt ttc 6652

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2165 2170 2175

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2180 2185 2190

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2200 2205

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2230 2235

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2245 2250

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2195 act cac ate Thr His 工Ie 2210 gtt gtg ate Val Val lie

2225 caa gtg gca Gln Val Ala

2240 gtg gca gcc Val Ala Ala 2255

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10

15

20

25

30

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tea gcc tea gtc Ser Ala Ser Val 2330

aag atg aat ate Lys Met Asn lie 2345

tea ata aca gtg Ser lie Thr Val 2360

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ctg Leu

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atg Met

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gtt Val

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7327

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7417 get ctc Ala Leu

2435 ttg get Leu Ala 2450 ata gag lie Glu 2465 tcc atg Ser Met

2480 gtc atg Val Met 2495

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gcc Ala

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7462

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7507

7552

7597

7642

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7777

7822

7867

7912 2585 2590

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2615 2620

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2645 2650

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2690 2695

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2720 2725

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2595

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15

20

25

30

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aga Arg

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2750 ctc Leu 2765 gac Asp 2780 tac Tyr 2795 tgg Trp 2810 gcg Ala 2825 gac Asp 2840 cct Pro 2855 gca Ala 2870 aac Asn 2885 ctg Leu 2900

Arg Arg Pro Thr

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121

Lys Val Thr Leu

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tat Tyr

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Lys

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gca Ala

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gga Gly

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8767

8812

8857 gca gcc att gga get tac ctg gaa gaa caa gaa cag tgg aag act 8902

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2915 2920 2925

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gaa gaa agg aag ctg cac caa caa ggc agg tgt egg act tgt gtg 8992

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tac aac atg atg ggg aaa aga gag aag aag ctg tea gag ttt ggg 9037

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2960 2965 2970

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2990 2995 3000

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Gly Gly Gly Phe Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg

3035 3040 3045

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Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val lie

3095 3100

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Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala 3110 3115

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3125 3130

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His Gln His Val Gln Asp Cys Asp 3140 3145

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3170 3175

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Phe Gly Leu Ala Leu Ser His Leu 3185 3190

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3200 3205

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3075

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Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly 3105

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Leu Asn Thr lie Thr Asn Leu 3120

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Glu Ala Glu Met Val lie His 3135

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Glu Ser Val Leu Thr Arg Leu 3150

tgt gac aga ctg aag agg atg 9622

Cys Asp Arg Leu Lys Arg Met 3165

gtc egg ccc ate gat gac agg 9667

Val Arg Pro lie Asp Asp Arg 3180

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Asn Ala Met Ser Lys Val Arg 3195

tea aaa ggg tgg aat gat tgg 9757

Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp 3210

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15

20

25

30

Lys Asp

3230 ctc att Leu Ile

3245 aag gaa Lys Glu

3260 ctg atg Leu Met

3275 gtt tcc Val Ser

3290 aca tgg Thr Trp

3305 atg ctt Met Leu

3320 atg cag Met Gln

3335 cta acc Leu Thr

3350 acc aat Thr Asn 3365 cgt ate Arg Ile 3380

Gly Arg

ggg aga Gly Arg

aca gct Thr Ala

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tca gct Ser Ala

tcg att Ser Ile

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gac aag Asp Lys

aag aga Lys Arg

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3235 gga agg gtg Gly Arg Val

3250 tgc ctc age Cys Leu Ser

3265 cac aaa agg His Lys Arg

3280 gtt ccc acc Val Pro Thr

3295 cat ggg aaa His Gly Lys

3310 tgg aac aga Trp Asn Arg

3325 aca atg gtg Thr Met Val

3340 caa gac aag Gln Asp Lys

3355 acc tgg gcc Thr Trp Ala

3370 ctg att gga Leu Ile Gly 3385

Val Pro Cys Arg

tet cca Ser Pro

aaa gcc Lys Ala

gac atg Asp Met

tca tgg Ser Trp

ggg gag Gly Glu

gta tgg Val Trp

gga aac Gly Asn

tat gcc Tyr Ala

agg cta Arg Leu

gtt cca Val Pro

tgg atg Trp Met

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Glu Gln Asp Glu 3240

ggc tgg atg ate Gly Trp Met Ile 3255

aac atg tgg tca Asn Met Trp Ser 3270

ctg tca ttg gct Leu Ser Leu Ala 3285

caa gga cgc aca Gln Gly Arg Thr 3300

acc acg gaa gac Thr Thr Glu Asp 3315

aac aac cca cac

aaa aaa tgg aga Lys Lys Trp Arg

ctg tgc Leu Cys

tcc cac Ser His

cag gag Gln Glu

gga tca Gly Ser

ate cat Ile His

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Asn Asn 3330

gat gtc Asp Val 3345

ctg att Leu Ile 3360

tta gtc Leu Val 3375

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cct tat Pro Tyr

gga atg

Gly Met

ate cat Ile His

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9892

9937

9982

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10072

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10162

10207

10252

10297 10

aca gtc atg gac agg tat tct gtg gat gct gac ctg caa ctg ggt 10342

Thr Val Met Asp Arg Tyr Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly

3395 3400 3405

gag ctt ate tga aacaccatct aacaggaata accgggatac aaaccacggg 10394

Glu Leu Ile 3410

tggagaaccg gactccccac aacctgaaac cgggatataa accacggctg gagaaccggg 10454 ctccgcactt aaaatgaaac agaaaccggg ataaaaacta cggatggaga accggactcc 10514 acacattgag acagaagaag ttgtcagccc agaaccccac acgagttttg ccactgctaa 10574 gctgtgaggc agtgcaggct gggacagccg acctccaggt tgcgaaaaac ctggtttctg 10634 ggacctccca ccccagagta aaaagaacgg agcctccgct accaccctcc cacgtggtgg 10694 tagaaagacg gggtctagag gttagaggag accctccagg gaacaaatag tgggaccata 10754 ttgacgccag ggaaagaccg gagtggttct ctgcttttcc tccagaggtc tgtgagcaca 10814 gtttgctcaa gaataagcag acctttggat gacaaacaca aaaccact 10862

<210> 87

<211> 3411 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Construção sintética <400> 87

Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 10 15

Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys

20 25 30

Gln Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gln Gly Phe Ile

40 45

Phe Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His 50 55 60

Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val

65 70 75 80

Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser 85 90 95

Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile

100 105 110

Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly Val Thr Leu Val Arg Lys Asn

115 120 125

Arg Trp Leu Leu Leu Asn Val Thr Ser Glu Asp Leu Gly Lys Thr Phe

130 135 140

Ser Val Gly Thr Gly Asn Cys Thr Thr Asn Ile Leu Glu Ala Lys Tyr 145 150 155 160

Trp Cys Pro Asp Ser Met Glu Tyr Asn Cys Pro Asn Leu Ser Pro Arg

165 170 175

Glu Glu Pro Asp Asp Ile Asp Cys Trp Cys Tyr Gly Val Glu Asn Val

180 185 190

Arg Val Ala Tyr Gly Lys Cys Asp Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg Ser

195 200 205

Arg Arg Ala Ile Asp Leu Pro Thr His Glu Asn His Gly Leu Lys Thr

210 215 220

Arg Gln Glu Lys Trp Met Thr Gly Arg Met Gly Glu Arg Gln Leu Gln 225 230 235 240

Lys Ile Glu Arg Trp Phe Val Arg Asn Pro Phe Phe Ala Val Thr Ala

245 250 255

Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Val Gly Ser Asn Met Thr Gln Arg Val Val

260 265 270

Ile Ala Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ser Ala His Cys

275 280 285

Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His Gly Gly Thr

290 295 300

Trp Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr Val Met Ala 305 310 315 320

Pro Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val Ala Ile Asp

325 330 335

Arg Pro Ala Glu Val Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val Leu Thr His 340 345 350

Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala His Leu Ala

355 360 365

Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr Ser Asp Arg

370 375 380

Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Ala 385 390 395 400

Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe Glu Val Asp

405 410 415

Gln Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His Val Gly Ala

420 425 430

Lys Gln Glu Asn Trp Asn Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys Phe Asp Ala

435 440 445

Leu Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly Lys Ala Thr

450 455 460

Leu Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn Ser Tyr Ile 465 470 475 480

Ala Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln Trp Ala Gln

485 490 495

Asp Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val Trp Arg Glu

500 505 510

Met His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile Arg

515 520 525

Val Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr Ala Leu Thr

530 535 540

Gly Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn Leu Tyr Lys 545 550 555 560

Leu His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser Ala Leu Thr

565 570 575

Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met Phe Phe Val

580 585 590

Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln Val Lys 595 600 605

Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile Val Ala Asp Asp

610 615 620

Leu Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val Asn Pro Ile 625 630 635 640

Ala Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn Pro Pro Phe

645 650 655

Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Arg Gly Asp Ser Arg Leu Thr Tyr

660 665 670

Gln Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr

675 680 685

Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp

690 695 700

Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys Gly Ile His 705 710 715 720

Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp

725 730 735

Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn

740 745 750

Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile

755 760 765

Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile

770 775 780

Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe 785 790 795 800

Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp

805 810 815

Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys

820 825 830

Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser

835 840 845

Arg Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Phe Glu Glu Asn Glu Val Asp Ile 850 855 860

Ser Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His 865 870 875 880

Pro Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp

885 890 895

Gly Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg Lys Asn Gly Ser Phe Ile

900 905 910

Ile Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro Phe Ser Asn Arg Val Trp

915 920 925

Asn Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr Gly Val Phe Thr Thr Arg

930 935 940

Val Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr Ile Asp Cys Asp Gly Ser 945 950 955 960

Ile Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys Ser Ala His Gly Ser Pro

965 970 975

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980 985 990

Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys Glu Trp Pro Leu Thr His

995 1000 1005

Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu Met Phe Met Pro Arg

1010 1015 1020

Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His Ile Pro Gly Tyr

1025 1030 1035

Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro Leu Glu Val

1040 1045 1050

Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp Gly Asn

1055 1060 1065

Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser Gly

1070 1075 1080

Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro

1085 1090 1095

Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile 1100 1105 1110

Arg Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val

1115 H20 1125

Thr Ala Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val Ser Met

1130 H35 I140

Met Ile Ala Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro Lys

1145 1150 1155

Gln Met Leu Val Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val

1160 1165 1170

Gly Gln Val Thr Leu Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val

1175 1180 1185

Gly Leu His Phe His Glu Met Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr

1190 1195 1200

Met Ala Leu Ile Ala Ala Phe Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile

1205 1210 1215

Gly Phe Gly Leu Arg Thr Leu Trp Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val

1220 1225 1230

Leu Thr Leu Gly Ala Ala Met Val Glu Ile Ala Leu Gly Gly Val

1235 1240 1245

Met Gly Gly Leu Trp Lys Tyr Leu Asn Ala Val Ser Leu Cys Ile

1250 1255 1260

Leu Thr Ile Asn Ala Val Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asn Thr Ile

1265 1270 1275

Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu Thr Pro Val Thr Met Ala Glu Val

1280 1285 1290

Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys Ala Val Val Ile Ile Gly Val

1295 1300 1305

Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser Met Gln Lys Thr Ile Pro

1310 1315 1320

Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Pro

1325 1330 1335

Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg Ile Phe Gly Arg 1340 1345 1350

Arg Ser Ile Pro Val Asn Glu Ala Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val

1355 1360 1365

Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Phe Gln Glu Met Glu Asn Phe Leu

1370 1375 1380

Gly Pro Ile Ala Val Gly Gly Leu Leu Met Met Leu Val Ser Val

1385 1390 1395

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1400 1405 1410

Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu Ile Ser Gly Ser Ser Ala Arg Tyr

1415 1420 1425

Asp Val Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Phe Lys Leu Leu Ser Glu

1430 1435 1440

Glu Lys Val Pro Trp Asp Gln Val Val Met Thr Ser Leu Ala Leu

1445 1450 1455

Val Gly Ala Ala Leu His Pro Phe Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala

1460 1465 1470

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1475 1480 1485

Leu Trp Asp Ile Pro Thr Pro Lys Ile Ile Glu Glu Cys Glu His

1490 1495 1500

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1505 1510 1515

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1520 1525 1530

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1535 1540 1545

Lys Lys Leu Ile Pro Ser Trp Ala Ser Val Lys Glu Asp Leu Val

1550 1555 1560

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1565 1570 1575

Glu Glu Val Gln Leu Ile Ala Ala Val Pro Gly Lys Asn Val Val 1580 1585 1590

Asn Val Gln Thr Lys Pro Ser Leu Phe Lys Val Arg Asn Gly Gly

1595 1600 1605

Glu Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Thr Ser Gly

1610 1615 1620

Ser Pro Ile Val Asn Arg Asn Gly Glu Val Ile Gly Leu Tyr Gly

1625 1630 1635

Asn Gly Ile Leu Val Gly Asp Asn Ser Phe Val Ser Ala Ile Ser

1640 1645 1650

Gln Thr Glu Val Lys Glu Glu Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ile

1655 1660 1665

Pro Thr Met Leu Lys Lys Gly Met Thr Thr Val Leu Asp Phe His

1670 1675 1680

Pro Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Phe Leu Pro Gln Ile Leu Ala

1685 1690 1695

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1700 1705 1710

Arg Val Val Leu Ser Glu Met Lys Glu Ala Phe His Gly Leu Asp

1715 1720 1725

Val Lys Phe His Thr Gln Ala Phe Ser Ala His Gly Ser Gly Arg

1730 1735 1740

Glu Val Ile Asp Ala Met Cys His Ala Thr Leu Thr Tyr Arg Met

1745 1750 1755

Leu Glu Pro Thr Arg Val Val Asn Trp Glu Val Ile Ile Met Asp

1760 1765 1770

Glu Ala His Phe Leu Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Trp

1775 1780 1785

Ala Ala His Arg Ala Arg Ala Asn Glu Ser Ala Thr Ile Leu Met

1790 1795 1800

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1805 1810 1815

Gly Glu Ile Glu Asp Val Gln Thr Asp Ile Pro Ser Glu Pro Trp 1820 1825 1830

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1835 1840 1845

Trp Phe Leu Pro Ser Ile Arg Ala Ala Asn Val Met Ala Ala Ser

1850 1855 1860

Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Val Leu Asn Arg Lys Thr

1865 1870 1875

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1880 1885 1890

Ile Leu Ala Thr Asp Ile Ala Glu Met Gly Ala Asn Leu Cys Val

1895 1900 1905

Glu Arg Val Leu Asp Cys Arg Thr Ala Phe Lys Pro Val Leu Val

1910 1915 1920

Asp Glu Gly Arg Lys Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Arg Ile Ser

1925 1930 1935

Ala Ser Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro

1940 1945 1950

Asn Arg Asp Gly Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Glu Pro Thr Ser Glu

1955 1960 1965

Asn Asn Ala His His Val Cys Trp Leu Glu Ala Ser Met Leu Leu

1970 1975 1980

Asp Asn Met Glu Val Arg Gly Gly Met Val Ala Pro Leu Tyr Gly

1985 1990 1995

Val Glu Gly Thr Lys Thr Pro Val Ser Pro Gly Glu Met Arg Leu

2000 2005 2010

Arg Asp Asp Gln Arg Lys Val Phe Arg Glu Leu Val Arg Asn Cys

2015 2020 2025

Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Trp Gln Val Ala Lys Ala Gly Leu

2030 2035 2040

Lys Thr Asn Asp Arg Lys Trp Cys Phe Glu Gly Pro Glu Glu His

2045 2050 2055

Glu Ile Leu Asn Asp Ser Gly Glu Thr Val Lys Cys Arg Ala Pro 2060 2065 2070

Gly Gly Ala Lys Lys Pro Leu Arg Pro Arg Trp Cys Asp Glu Arg

2075 2080 2085

Val Ser Ser Asp Gln Ser Ala Leu Ser Glu Phe Ile Lys Phe Ala

2090 2095 2100

Glu Gly Arg Arg Gly Ala Ala Glu Val Leu Val Val Leu Ser Glu

2105 2110 2115

Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Lys Gly Gly Glu Ala Met Asp Thr

2120 2125 2130

Ile Ser Val Phe Leu His Ser Glu Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Arg

2135 2140 2145

Asn Ala Leu Ser Met Met Pro Glu Ala Met Thr Ile Val Met Leu

2150 2155 2160

Phe Ile Leu Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gly Met Val Ile Phe Phe

2165 2170 2175

Met Ser Pro Lys Gly Ile Ser Arg Met Ser Met Ala Met Gly Thr

2180 2185 2190

Met Ala Gly Cys Gly Tyr Leu Met Phe Leu Gly Gly Val Lys Pro

2195 2200 2205

Thr His Ile Ser Tyr Val Met Leu Ile Phe Phe Val Leu Met Val

2210 2215 2220

Val Val Ile Pro Glu Pro Gly Gln Gln Arg Ser Ile Gln Asp Asn

2225 2230 2235

Gln Val Ala Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala

2240 2245 2250

Val Ala Ala Asn Glu Leu Gly Met Leu Glu Lys Thr Lys Glu Asp

2255 2260 2265

Leu Phe Gly Lys Lys Asn Leu Ile Pro Ser Ser Ala Ser Pro Trp

2270 2275 2280

Ser Trp Pro Asp Leu Asp Leu Lys Pro Gly Ala Ala Trp Thr Val

2285 2290 2295

Tyr Val Gly Ile Val Thr Met Leu Ser Pro Met Leu His His Trp 2300 2305 2310

Ile Lys Val Glu Tyr Gly Asn Leu Ser Leu Ser Gly Ile Ala Gln

2315 2320 2325

Ser Ala Ser Val Leu Ser Phe Met Asp Lys Gly Ile Pro Phe Met

2330 2335 2340

Lys Met Asn Ile Ser Val Ile Met Leu Leu Val Ser Gly Trp Asn

2345 2350 2355

Ser Ile Thr Val Met Pro Leu Leu Cys Gly Ile Gly Cys Ala Met

2360 2365 2370

Leu His Trp Ser Leu Ile Leu Pro Gly Ile Lys Ala Gln Gln Ser

2375 2380 2385

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2390 2395 2400

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2405 2410 2415

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2420 2425 2430

Ala Leu Ser Leu Ala Ser Val Ala Met Cys Arg Thr Pro Phe Ser

2435 2440 2445

Leu Ala Glu Gly Ile Val Leu Ala Ser Ala Ala Leu Gly Pro Leu

2450 2455 2460

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2465 2470 2475

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2480 2485 2490

Val Met Tyr Asn Leu Trp Lys Met Lys Thr Gly Arg Arg Gly Ser

2495 2500 2505

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2510 2515 2520

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2525 2530 2535

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2555 2560 2565

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2570 2575 2580

Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Tyr Ala Ala

2585 2590 2595

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2600 2605 2610

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2615 2620 2625

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2630 2635 2640

Val Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser

2645 2650 2655

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2660 2665 2670

Val Glu Lys Trp Leu Ala Cys Gly Val Asp Asn Phe Cys Val Lys

2675 2680 2685

Val Leu Ala Pro Tyr Met Pro Asp Val Leu Glu Lys Leu Glu Leu

2690 2695 2700

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2705 2710 2715

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2720 2725 2730

Asn Val Thr Phe Thr Val Asn Gln Thr Ser Arg Leu Leu Met Arg

2735 2740 2745

Arg Met Arg Arg Pro Thr Gly Lys Val Thr Leu Glu Ala Asp Val

2750 2755 2760

Ile Leu Pro Ile Gly Thr Arg Ser Val Glu Thr Asp Lys Gly Pro

2765 2770 2775

Leu Asp Lys Glu Ala Ile Glu Glu Arg Val Glu Arg Ile Lys Ser 2780 2785 2790

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2795 2800 2805

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2810 2815 2820

Ala Ala Ser Met Val Asn Gly Val Ile Lys Ile Leu Thr Tyr Pro

2825 2830 2835

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2840 2845 2850

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2855 2860 2865

Arg Ala Lys Asp Pro Pro Ala Gly Thr Arg Lys Ile Met Lys Val

2870 2875 2880

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2885 2890 2895

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2900 2905 2910

Ala Ala Ile Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Gln Glu Gln Trp Lys Thr

2915 2920 2925

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2930 2935 2940

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2945 2950 2955

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2960 2965 2970

Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala

2975 2980 2985

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2990 2995 3000

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3005 3010 3015

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Gly Gly Gly Phe Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg

3035 3040 3045

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3050 3055 3060

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3065 3070 3075

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3080 3085 3090

Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly

3095 3100 3105

Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Ile Thr Asn Leu

3110 3115 3120

Lys Val Gln Leu Ile Arg Met Ala Glu Ala Glu Met Val Ile His

3125 3130 3135

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3140 3145 3150

Glu Ala Trp Leu Thr Glu His Gly Cys Asp Arg Leu Lys Arg Met

3155 3160 3165

Ala Val Ser Gly Asp Asp Cys Val Val Arg Pro Ile Asp Asp Arg

3170 3175 3180

Phe Gly Leu Ala Leu Ser His Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg

3185 3190 3195

Lys Asp Ile Ser Glu Trp Gln Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp

3200 3205 3210

Glu Asn Val Pro Phe Cys Ser His His Phe His Glu Leu Gln Leu

3215 3220 3225

Lys Asp Gly Arg Arg Ile Val Val Pro Cys Arg Glu Gln Asp Glu

3230 3235 3240

Leu Ile Gly Arg Gly Arg Val Ser Pro Gly Asn Gly Trp Met Ile

3245 3250 3255

Lys Glu Thr Ala Cys Leu Ser Lys Ala Tyr Ala Asn Met Trp Ser 3260

Leu Met Tyr Phe His Lys 3275

Val Ser Ser Ala Val Pro 3290

Thr Trp Ser Ile His Gly 3305

Met Leu Glu Val Trp Asn 3320

Met Gln Asp Lys Thr Met 3335

Leu Thr Lys Arg Gln Asp 3350

Thr Asn Arg Ala Thr Trp 3365

Arg Ile Arg Thr Leu Ile 3380

Thr Val Met Asp Arg Tyr

3395 Glu Leu Ile

3410 <210> 88 <211> 10976 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> epítopo <220>

<221> CDS <222> (96)..(10394) <400> 88

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgtag agaagaatcg agagattagt

3265 3270

Arg Asp Met Arg Leu Leu Ser Leu Ala

3280 3285

Thr Ser Trp Val Pro Gln Gly Arg Thr

3295 3300

Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp

3310 3315

Arg Val Trp Ile Thr Asn Asn Pro His

3325 3330

Val Lys Lys Trp Arg Asp Val Pro Tyr

3340 3345

Lys Leu Cys Gly Ser Leu Ile Gly Met

3355 3360

Ala Ser His Ile His Leu Val Ile His

3370 3375

Gly Gln Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu

3385 3390

Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly

3400 3405 gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taacc atg act aaa aaa cca gga 113

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40 45 50

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55 60 65 70

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Ala Val Glu Lys Ser Val Ala Met Lys His Leu Thr Ser Phe Lys Arg

75 80 85

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Glu Leu Gly Thr Leu Ile Asp Ala Val Asn Lys Arg Gly Arg Lys Gln 90 95 100

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120 125 130

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135 140 145 150

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170 175 180

ctt acc atg ggc aat gat cca gag gat gtg gat tgc tgg tgt gac aac 689

Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn

185 190 195

caa gaa gtc tac gtc caa tat gga cgg tgc acg cgg acc agg cat tcc 737

Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg Cys Thr Arg Thr Arg His Ser

200 205 210

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Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser 215 220 225 230

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Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg

235 240 245

tat ctc atg aaa act gag aac tgg ate ata agg aat cct ggc tat gct 881

Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala 250 255 260

ttc ctg gcg gcg gta ctt ggc tgg atg ctt ggc agt aac aac ggt caa 92 9

Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln

265 270 275

cgc gtg gta ttt acc ate ctc ctg ctg ttg gtc gct ccg gct tac agt 977

Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser

280 285 290

ttt aat tgt ctg gga atg ggc aat cgt gac ttc ata gaa gga gcc agt 1025

Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser 295 300 305 310

gga gcc act tgg gtg gac ttg gtg cta gaa gga gac age tgc ttg aca 1073

Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr

315 320 325

ate atg gea aac gac aaa cca aca ttg gac gtc cgc atg att aac ate 1121 Ile Met Ala

gaa gct age Glu Ala Ser

345

gtc act gac Val Thr Asp

360 cac aac gag His Asn Glu 375

act gac cgt Thr Asp Arg

att gac aca

Ile Asp Thr

aca ate cag Thr Ile Gln

425

gga acc acc Gly Thr Thr

440 gcg tcc cag Ala Ser Gln 455

gcc ctc aaa Ala Leu Lys

agg agt gga Arg Ser Gly

Asn Asp Lys Pro Thr 330

caa ctt gct gag gtc Gln Leu Ala Glu Val 350

ate tcg acg gtg gct Ile Ser Thr Val Ala 365

aag cga gct gat agt Lys Arg Ala Asp Ser 380

ggg tgg ggc aac gga Gly Trp Gly Asn Gly 395

tgt gea aaa ttc tcc Cys Ala Lys Phe Ser 410

cca gaa aac ate aaa Pro Glu Asn Ile Lys 430

act tcg gaa aac cat Thr Ser Glu Asn His 445

gcg gea aag ttt aca Ala Ala Lys Phe Thr 460

ctt ggt gac tac gga Leu Gly Asp Tyr Gly 475

ctg aac act gaa gcg Leu Asn Thr Glu Ala 490

Leu Asp Val Arg Met 335

aga agt tac tgc tat Arg Ser Tyr Cys Tyr 355

cgg tgc ccc acg act Arg Cys Pro Thr Thr 370

age tat gtg tgc aaa Ser Tyr Val Cys Lys 385

tgt gga ttt ttc ggg Cys Gly Phe Phe Gly 400

tgc acc agt aaa gcg Cys Thr Ser Lys Ala 415

tac aaa gtt ggc att Tyr Lys Val Gly Ile 435

ggg aat tat tca gcg Gly Asn Tyr Ser Ala 450

gta aca ccc aat gct Val Thr Pro Asn Ala 465

gaa gtc aca ctg gac Glu Val Thr Leu Asp 480

ttt tac gtc atg acc Phe Tyr Val Met Thr 495

Ile Asn Ile 340

cat gct tca 1169

His Ala Ser

gga gaa gcc 1217

Gly Glu Ala

caa ggc ttc 1265

Gln Gly Phe 390

aag gga age 1313

Lys Gly Ser 405

att ggg aga 1361

Ile Gly Arg

420

ttt gtg cat 1409 Phe Val His

caa gtt ggg 1457

Gln Val Gly

cct tcg gta 1505 Pro Ser Val 470

tgt gag cca 1553 Cys Glu Pro 485

gtg ggg tca 1601

Val Gly Ser

500 aag tca ttt ctg gtc cat agg gag tgg ttt cat gac ctc gct ctc ccc 1649

Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro

505 510 515

tgg acg tcc cct tcg age aca gcg tgg aga aac aga gaa ctc ctc atg 1697

Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met 520 525 530

gaa ttt gaa ggg gcg cac gcc aca aaa cag tcc gtt gtt gct ctt ggg 1745

Glu Phe Glu Gly Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly 535 540 545 550

tca cag gaa gga ggc ctc cat cat gcg ttg gea gga gcc ate gtg gtg 1793

Ser Gln Glu Gly Gly Leu His His Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val

555 560 565

gag tac tca age tca gtg atg tta aca tca ggc cac ctg aaa tgt agg 1841

Glu Tyr Ser Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg 570 575 580

ctg aaa atg gac aaa ctg gct ctg aaa ggc aca acc tat ggc atg tgt 1889

Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys

585 590 595

aca gaa aaa ttc tcg ttc gcg aaa aat ccg gtg gac act ggt cac gga 1937

Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Val Asp Thr Gly His Gly 600 605 610

aca gtt gtc att gaa ctc tcc tac tet ggg agt gat ggc ccc tgc aaa 1985

Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys 615 620 625 630

att ccg att gtt tcc gtt gcg age ctc aat gac atg acc ccc gtt ggg 2033 Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly

635 640 645

cgg ctg gtg aca gtg aac ccc ttc gtc gcg act tcc agt gcc aac tca 2081

Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser 650 655 660

aag gtg ctg gtc gag atg gaa ccc ccc ttc gga gac tcc tac ate gta 2129

Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val 665

gtt gga agg Val Gly Arg 680

age acg ctg Ser Thr Leu 695

ctg gea gcg Leu Ala Ala

10

gtc ttc aac Val Phe Asn

ttc aga aca Phe Arg Thr 745

ggt gcc cta Gly Ala Leu 760

gct ttg gcc Ala Leu Ala 775

aat gtg cat Asn Val His

25

atg aga tgt Met Arg Cys

gtg gat agg Val Asp Arg 825

ate gtc cac

670

gga gac aag cag ate Gly Asp Lys Gln Ile 685

ggc aag gcc ttt tca Gly Lys Ala Phe Ser 700

ttg ggc gac aca gcc Leu Gly Asp Thr Ala 715

tcc ata gga aga gcc Ser Ile Gly Arg Ala 730

ctc ttt ggg gga atg Leu Phe Gly Gly Met 750

ctg ctc tgg atg ggc Leu Leu Trp Met Gly 765

ttc tta gcc aca gga Phe Leu Ala Thr Gly 780

gct gac act gga tgt Ala Asp Thr Gly Cys 795

gga agt ggc ate ttc Gly Ser Gly Ile Phe 810

tat aaa tat ttg cca Tyr Lys Tyr Leu Pro 830

aaa gcg cac aag gaa

675

aac cac cat tgg cac Asn His His Trp His 690

aca act ttg aag gga Thr Thr Leu Lys Gly 705

tgg gac ttt ggc tet Trp Asp Phe Gly Ser 720

gtt cac caa gtg ttt Val His Gln Val Phe 735

tet tgg ate aca caa Ser Trp Ile Thr Gln 755

gtc aac gea cga gac Val Asn Ala Arg Asp 770

ggt gtg ctc gtg ttc

Gly Val Leu Val Phe 785

gcc att gac ate aca Ala Ile Asp Ile Thr 800

gtg cac aac gac gtg Val His Asn Asp Val 815

gaa acg ccc aga tcc Glu Thr Pro Arg Ser 835

ggc gtg tgc gga gtc

aaa gct gga 2177

Lys Ala Gly

gct caa aga 222 5 Ala Gln Arg 710

att gga ggg 2273

Ile Gly Gly 725

ggt gat gcc 2321

Gly Asp Ala

740

ggg cta atg 23 69 Gly Leu Met

cga tca att 2417

Arg Ser Ile

tta gcg acc 2465 Leu Ala Thr 790

aga aaa gag 2 513 Arg Lys Glu 805

gaa gcc tgg 2561 Glu Ala Trp 820

cta gcg aag 2609 Leu Ala Lys

aga tet gtc 2657 Ile Val His Lys Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Val Arg Ser Val

840 845 850

act aga ctg gag cac caa atg tgg gaa gcc gta agg gac gaa ttg aac 2705 Thr Arg Leu Glu His Gln Met Trp Glu Ala Val Arg Asp Glu Leu Asn 855 860 865 870

gtc ctg ctc aaa gag aat gca gtg gac ctc agt gtg gtt gtg aac aag 2753

Val Leu Leu Lys Glu Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Val Val Asn Lys

875 880 885

ccc gtg gga aga tat cgc tca gcc cct aaa cgc cta tcc atg acg caa 2801

Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr Gln 890 895 900

gag aag ttt gaa atg ggc tgg aaa gca tgg gga aaa age ate ctc ttt 2849

Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe 905 910 915

gcc ccg gaa ttg gct aac tcc aca ttt gtc gta gat gga cct gag aca 2897 Ala Pro Glu Leu Ala Asn Ser Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr

920 925 930

aag gaa tgc cct gat gag cac aga gct tgg aac age atg caa ate gaa 2 945

Lys Glu Cys Pro Asp Glu His Arg Ala Trp Asn Ser Met Gln Ile Glu 935 940 945 950

gac ttc ggc ttt ggc ate aca tca acc cgt gtg tgg ctg aaa att aga 2993

Asp Phe Gly Phe Gly Ile Thr Ser Thr Arg Val Trp Leu Lys Ile Arg

955 960 965

gag gag age act gac gag tgt gat gga gcg ate ata ggc acg gct gtc 3041 Glu Glu Ser Thr Asp Glu Cys Asp Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Val 970 975 980

aaa gga cat gtg gca gtc cat agt gac ttg tcg tac tgg att gag agt 3089

Lys Gly His Val Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser 985 990 995

cgc tac aac gac aca tgg aaa ctt gag agg gca gtc ttt gga gag 3134

Arg Tyr Asn Asp Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Phe Gly Glu 1000 1005 1010 10

gtc aaa tct tgc act tgg cca gag aca cac acc ctt tgg gga gat 3179

Val Lys Ser Cys Thr Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Gly Asp

1015 1020 1025

gat gtt gag gaa agt gaa ctc ate att ccg cac acc ata gcc gga 3224

Asp Val Glu Glu Ser Glu Leu Ile Ile Pro His Thr Ile Ala Gly

1030 1035 1040

cca aaa age aag cac aat cgg agg gaa ggg tat aag aca caa aac 3269

Pro Lys Ser Lys His Asn Arg Arg Glu Gly Tyr Lys Thr Gln Asn

1045 1050 1055

cag gga cct tgg gat gag aat ggc ata gtc ttg gac ttt gat tat 3314

Gln Gly Pro Trp Asp Glu Asn Gly Ile Val Leu Asp Phe Asp Tyr

1060 1065 1070

tgc cca ggg aca aaa gtc acc att aca gag gat tgt age aag aga 3359

Cys Pro Gly Thr Lys Val Thr Ile Thr Glu Asp Cys Ser Lys Arg

1075 1080 1085

ggc cct tcg gtc aga acc act act gac agt gga aag ttg ate act 3404

Gly Pro Ser Val Arg Thr Thr Thr Asp Ser Gly Lys Leu Ile Thr

1090 1095 1100

gac tgg tgc tgt cgc agt tgc tcc ctt ccg ccc cta cga ttc cgg 3449

Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Ser Leu Pro Pro Leu Arg Phe Arg 1105 1110 1115

aca gaa aat ggc tgc tgg tac gga atg gaa ate aga cct gtt atg 3494

Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Val Met 1120 1125 1130

cat gat gaa aca aca ctc gtc aga tca cag gtt cat gct ttc aaa 3539

His Asp Glu Thr Thr Leu Val Arg Ser Gln Val His Ala Phe Lys

1135 1140 1145

ggt gaa atg gtt gac cct ttt cag ctg ggc ctt ctg gtg atg ttt 3584

Gly Glu Met Val Asp Pro Phe Gln Leu Gly Leu Leu Val Met Phe 1150 1155 1160

ctg gcc acc cag gaa gtc ctt cgc aag agg tgg acg gcc aga ttg 3629

Leu Ala Thr Gln Glu Val Leu Arg Lys Arg Trp Thr Ala Arg Leu 1165 1170 1175

acc att cct gcg gtt ttg ggg gtc cta ctt gtg ctg atg ctt ggg 3674

Thr Ile Pro Ala Val Leu Gly Val Leu Leu Val Leu Met Leu Gly 1180 1185 1190

ggt ate act tac act gat ttg gcg agg tat gtg gtg cta gtc gct 3719

Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Leu Ala Arg Tyr Val Val Leu Val Ala

1195 1200 1205

gct gct ttc gea gag gcc aac agt gga gga gac gtc ctg cac ctt 3764

Ala Ala Phe Ala Glu Ala Asn Ser Gly Gly Asp Val Leu His Leu

1210 1215 1220

gct ttg att gct gtt ttt aag ate caa cca gea ttt tta gtg atg 3809

Ala Leu Ile Ala Val Phe Lys Ile Gln Pro Ala Phe Leu Val Met

1225 1230 1235

aac atg ctt age acg aga tgg acg aac caa gaa aac gtg gtt ctg 3854

Asn Met Leu Ser Thr Arg Trp Thr Asn Gln Glu Asn Val Val Leu 1240 1245 1250

gtc cta ggg gct gcc ttt ttc caa ttg gcc tca gta gat ctg caa 3 899

Val Leu Gly Ala Ala Phe Phe Gln Leu Ala Ser Val Asp Leu Gln 1255 1260 1265

ata gga gtc cac gga ate ctg aat gcc gcc gct ata gea tgg atg 3944

Ile Gly Val His Gly Ile Leu Asn Ala Ala Ala Ile Ala Trp Met

1270 1275 1280

att gtc cga gcg ate acc ttc ccc aca acc tcc tcc gtc acc atg 3989

Ile Val Arg Ala Ile Thr Phe Pro Thr Thr Ser Ser Val Thr Met

1285 1290 1295

cca gtc tta gcg ctt cta act ccg ggg atg agg gct cta tac cta 4034

Pro Val Leu Ala Leu Leu Thr Pro Gly Met Arg Ala Leu Tyr Leu

1300 1305 1310

gac act tac aga ate ate ctc ctc gtc ata ggg att tgc tcc ctg 4079

Asp Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Leu Val Ile Gly Ile Cys Ser Leu

1315 1320 1325

ctg cac gag agg aaa aag acc atg gcg aaa aag aaa gga gct gta 4124 Leu His Glu Arg Lys Lys Thr Met Ala Lys Lys Lys Gly Ala Val

1330 1335 1340

ctc ttg ggc tta gcg ctc aca tcc act gga tgg ttc tcg ccc acc 4169

Leu Leu Gly Leu Ala Leu Thr Ser Thr Gly Trp Phe Ser Pro Thr 1345 1350 1355

act ata gct gcc gga cta atg gtc tgc aac cca aac aag aag aga 4214

Thr Ile Ala Ala Gly Leu Met Val Cys Asn Pro Asn Lys Lys Arg

1360 1365 1370

ggg tgg cca gct act gag ttt ttg tcg gca gtt gga ttg atg ttt 4259

Gly Trp Pro Ala Thr Glu Phe Leu Ser Ala Val Gly Leu Met Phe 1375 1380 1385

gcc ate gta ggt ggt ttg gcc gag ttg gat att gaa tcc atg tca 4304

Ala Ile Val Gly Gly Leu Ala Glu Leu Asp Ile Glu Ser Met Ser 1390 1395 1400

ata ccc ttc atg ctg gca ggt ctc atg gca gtg tcc tac gtg gtg 4349

Ile Pro Phe Met Leu Ala Gly Leu Met Ala Val Ser Tyr Val Val

1405 1410 1415

tca gga aaa gca aca gat atg tgg ctt gaa cgg gcc gcc gac ate 43 94

Ser Gly Lys Ala Thr Asp Met Trp Leu Glu Arg Ala Ala Asp Ile 1420 1425 1430

age tgg gat atg ggt gct gca ate aca gga age agt cgg agg ctg 4439

Ser Trp Asp Met Gly Ala Ala Ile Thr Gly Ser Ser Arg Arg Leu

1435 1440 1445

gat gtg aaa ctg gat gat gac gga gat ttt cac ttc att gat gat 4484

Asp Val Lys Leu Asp Asp Asp Gly Asp Phe His Phe Ile Asp Asp 1450 1455 1460

ccc ggt gtt cca tgg aag gtc tgg gtc ctg cgc atg tet tgc att 4529

Pro Gly Val Pro Trp Lys Val Trp Val Leu Arg Met Ser Cys Ile 1465 1470 1475

ggc tta gcc gcc ctc acg cct tgg gcc ate gtt ccc gcc gct ttc 4574

Gly Leu Ala Ala Leu Thr Pro Trp Ala Ile Val Pro Ala Ala Phe 1480 1485 1490 10

ggt tat tgg ctc act tta aaa aca aca aaa aga ggg ggc gtg ttt 4619

Gly Tyr Trp Leu Thr Leu Lys Thr Thr Lys Arg Gly Gly Val Phe

1495 1500 1505

tgg gac acg cca tcc cca aaa cct tgc tca aaa gga gac acc act 4664

Trp Asp Thr Pro Ser Pro Lys Pro Cys Ser Lys Gly Asp Thr Thr

1510 1515 1520

aca gga gtc tac cga att atg gct aga ggg att ctt ggc act tac 4709

Thr Gly Val Tyr Arg Ile Met Ala Arg Gly Ile Leu Gly Thr Tyr

1525 1530 1535

cag gcc ggc gtc gga gtc atg tac gag aat gtt ttc cac aca cta 47 54

Gln Ala Gly Val Gly Val Met Tyr Glu Asn Val Phe His Thr Leu

1540 1545 1550

tgg cac aca act aga gga gca gcc att gtg agt gga gaa gga aaa 4799

Trp His Thr Thr Arg Gly Ala Ala Ile Val Ser Gly Glu Gly Lys 1555 1560 1565

ttg acg cca tac tgg ggt agt gtg aaa gaa gac cgc ata gct tac 4844

Leu Thr Pro Tyr Trp Gly Ser Val Lys Glu Asp Arg Ile Ala Tyr

1570 1575 1580

gga ggc cca tgg agg ttt gac cga aaa tgg aat gga aca gat gac 4889

Gly Gly Pro Trp Arg Phe Asp Arg Lys Trp Asn Gly Thr Asp Asp 1585 1590 1595

gtg caa gtg ate gtg gta gaa ccg ggg aag ggc gca gta aac ate 4934

Val Gln Val Ile Val Val Glu Pro Gly Lys Gly Ala Val Asn Ile 1600 1605 1610

cag aca aaa cca gga gtg ttt cgg act ccc ttc ggg gag gtt ggg 4979

Gln Thr Lys Pro Gly Val Phe Arg Thr Pro Phe Gly Glu Val Gly

1615 1620 1625

gct gtt agt ctg gat tac ccg cga gga aca tcc ggc tca ccc att 5024

Ala Val Ser Leu Asp Tyr Pro Arg Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile 1630 1635 1640

ctg gat tcc aat gga gac att ata ggc cta tac ggc aat gga gtt 5069

Leu Asp Ser Asn Gly Asp Ile Ile Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val 1645 1650 1655

gag ctt ggc gat ggc tca tac gtc age gcc ate gtg cag ggt gac 5114

Glu Leu Gly Asp Gly Ser Tyr Val Ser Ala Ile Val Gln Gly Asp 1660 1665 1670

cgt cag gag gaa cca gtc cca gaa gct tac acc cca aac atg ttg 5159

Arg Gln Glu Glu Pro Val Pro Glu Ala Tyr Thr Pro Asn Met Leu

1675 1680 1685

aga aag aga cag atg act gtg cta gat ttg cac cct ggt tca ggg 5204

Arg Lys Arg Gln Met Thr Val Leu Asp Leu His Pro Gly Ser Gly 1690 1695 1700

aaa acc agg aaa att ctg cca caa ata att aag gac gct ate cag 5249

Lys Thr Arg Lys Ile Leu Pro Gln Ile Ile Lys Asp Ala Ile Gln

1705 1710 1715

cag cgc cta aga aca gct gtg ttg gea ccg acg cgg gtg gta gea 5294

Gln Arg Leu Arg Thr Ala Val Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala 1720 1725 1730

gea gaa atg gea gaa gtt ttg aga ggg ctc cca gta cga tat caa 5339

Ala Glu Met Ala Glu Val Leu Arg Gly Leu Pro Val Arg Tyr Gln 1735 1740 1745

act tca gea gtg cag aga gag cac caa ggg aat gaa ata gtg gat 5384

Thr Ser Ala Val Gln Arg Glu His Gln Gly Asn Glu Ile Val Asp

1750 1755 1760

gtg atg tgc cac gcc act ctg acc cat aga ctg atg tca ccg aac 5429

Val Met Cys His Ala Thr Leu Thr His Arg Leu Met Ser Pro Asn 1765 1770 1775

aga gtg ccc aac tac aac cta ttt gtc atg gat gaa gct cat ttc 5474

Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Phe Val Met Asp Glu Ala His Phe

1780 1785 1790

acc gac cca gcc agt ata gcc gea cga gga tac att gct acc aag 5519

Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile Ala Thr Lys 1795 1800 1805

gtg gaa tta ggg gag gea gea gcc ate ttt atg aca gcg acc ccg 5564 Val Glu Leu Gly Glu 1810

cct gga acc acg gat Pro Gly Thr Thr Asp 1825

gat ttg caa gat gag Asp Leu Gln Asp Glu 1840

gaa tgg ate aca gaa

Glu Trp Ile Thr Glu 1855

age gta aaa atg ggg Ser Val Lys Met Gly 1870

ggg aaa aag gtc ate Gly Lys Lys Val Ile 1885

tac cca aaa tgt aag Tyr Pro Lys Cys Lys

1900

gac ate tet gaa atg Asp Ile Ser Glu Met 1915

gac tgt aga aag age

Asp Cys Arg Lys Ser 1930

ggc aga gtc ate etc Gly Arg Val Ile Leu 1945

gea gct caa cgg agg Ala Ala Gln Arg Arg 1960

Ala Ala Ala Ile Phe Met 1815

cct ttt cct gac tca aat Pro Phe Pro Asp Ser Asn 1830

ata cca gac agg gea tgg Ile Pro Asp Arg Ala Trp 1845

tat gcg ggt aaa acc gtg Tyr Ala Gly Lys Thr Val 1860

aat gag att gea atg tgc Asn Glu Ile Ala Met Cys 1875

caa etc aac cgc aag tcc Gln Leu Asn Arg Lys Ser 1890

aat gga gac tgg gat ttt Asn Gly Asp Trp Asp Phe 1905

ggg gcc aac ttc ggt gcg Gly Ala Asn Phe Gly Ala 1920

gtg aaa ccc acc ate tta Val Lys Pro Thr Ile Leu 1935

gga aac cca tet ccc ata Gly Asn Pro Ser Pro Ile 1950

ggc aga gta ggc aga aac Gly Arg Val Gly Arg Asn 1965

Thr Ala Thr Pro 1820

gcc cca ate cat 5609

Ala Pro Ile His

1835

age agt gga tac 5654

Ser Ser Gly Tyr

1850

tgg ttt gtg gcg 5699

Trp Phe Val Ala

1865

etc caa aga gcg 5744

Leu Gln Arg Ala 1880

tat gac aca gaa 5789

Tyr Asp Thr Glu

1895

gtc att acc acc 5834

Val Ile Thr Thr

1910

age agg gtc ate 5879

Ser Arg Val Ile

1925

gaa gag gga gaa 5924

Glu Glu Gly Glu

1940

acc agt gea age 5969

Thr Ser Ala Ser

1955

ccc aat caa gtt 6014

Pro Asn Gln Val

1970 gga gat gaa tac cac tat ggg ggg gct acc agt gaa gat gac agt 6059

Gly Asp Glu Tyr His Tyr Gly Gly Ala Thr Ser Glu Asp Asp Ser

1975 1980 1985

aac cta gcc cat tgg aca gag gca aag ate atg tta gac aac ata 6104

Asn Leu Ala His Trp Thr Glu Ala Lys Ile Met Leu Asp Asn Ile 1990 1995 2000

cac atg ccc aat gga ctg gtg gcc cag ctc tat gga cca gag agg 6149

His Met Pro Asn Gly Leu Val Ala Gln Leu Tyr Gly Pro Glu Arg 2005 2010 2015

gaa aag gct ttc aca atg gat ggc gaa tac cgt ctc aga ggt gaa 6194

Glu Lys Ala Phe Thr Met Asp Gly Glu Tyr Arg Leu Arg Gly Glu

2020 2025 2030

gaa aag aaa aac ttc tta gag ctg ctt agg acg gct gac ctc ccg 6239

Glu Lys Lys Asn Phe Leu Glu Leu Leu Arg Thr Ala Asp Leu Pro 2035 2040 2045

gtg tgg ctg gcc tac aag gtg gcg tcc aat ggc att cag tac acc 6284

Val Trp Leu Ala Tyr Lys Val Ala Ser Asn Gly Ile Gln Tyr Thr

2050 2055 2060

gac aga aag tgg tgt ttt gat ggg ccg cgt acg aat gcc ata ctg 6329

Asp Arg Lys Trp Cys Phe Asp Gly Pro Arg Thr Asn Ala Ile Leu 2065 2070 2075

gag gac aac acc gag gta gag ata gtc acc cgg atg ggt gag agg 6374

Glu Asp Asn Thr Glu Val Glu Ile Val Thr Arg Met Gly Glu Arg 2080 2085 2090

aaa ate ctc aag ccg aga tgg ctt gat gca aga gtt tat gca gat 6419

Lys Ile Leu Lys Pro Arg Trp Leu Asp Ala Arg Val Tyr Ala Asp

2095 2100 2105

cac cag gcc ctc aag tgg ttc aaa gac ttt gca gca ggg aag aga 6464

His Gln Ala Leu Lys Trp Phe Lys Asp Phe Ala Ala Gly Lys Arg

2110 2115 2120

tca gcc gtt age ttc ata gag gtg ctc ggt cgc atg cct gag cat 6509

Ser Ala Val Ser Phe Ile Glu Val Leu Gly Arg Met Pro Glu His 2125

ttc atg gga aag acg Phe Met Gly Lys Thr 2140

gca acg gct gag aaa Ala Thr Ala Glu Lys 2155

gag ctg cca gat gca Glu Leu Pro Asp Ala

2170

act gtg atg aca gga Thr Val Met Thr Gly 2185

ggt ata ggg aag atg

Gly Ile Gly Lys Met 2200

acc ttc ttc ctg tgg Thr Phe Phe Leu Trp 2215

ggg acc ctg ctg ate Gly Thr Leu Leu Ile 2230

gaa ccg gaa aaa cag Glu Pro Glu Lys Gln

2245

ttt ctc ate tgt gtc Phe Leu Ile Cys Val 2260

gag tac ggg atg cta

Glu Tyr Gly Met Leu 2275

ttt ggc gga aag acg

2130

cgg gaa gct tta gac acc Arg Glu Ala Leu Asp Thr 2145

ggt ggg aaa gca cac cga Gly Gly Lys Ala His Arg 2160

ctg gaa acc ate aca ctt Leu Glu Thr Ile Thr Leu 2175

gga ttc ttc cta cta atg Gly Phe Phe Leu Leu Met 2190

ggt ctt gga gct cta gtg Gly Leu Gly Ala Leu Val 2205

gcg gca gag gtt cct gga Ala Ala Glu Val Pro Gly 2220

gcc ctg ctg ctg atg gtg

Ala Leu Leu Leu Met Val 2235

agg tca cag aca gat aac Arg Ser Gln Thr Asp Asn 2250

ttg acc gtg gtt gga gtg Leu Thr Val Val Gly Val 2265

gaa aaa acc aaa gcg gat Glu Lys Thr Lys Ala Asp 2280

cag gca tca gga ctg act

2135

atg tac ttg gtt 6554

Met Tyr Leu Val

2150

atg gct ctc gaa 6599

Met Ala Leu Glu

2165

att gtc gcc att 6644

Ile Val Ala Ile 2180

atg cag cga aag 6689

Met Gln Arg Lys

2195

ctc aca cta gct 6734

Leu Thr Leu Ala

2210

acc aaa ata gca 6779

Thr Lys Ile Ala

2225

gtt ctc ate cca 6824

Val Leu Ile Pro

2240

caa ctg gcg gtg 6869

Gln Leu Ala Val

2255

gtg gca gca aac 6914

Val Ala Ala Asn

2270

ctc aag age atg 6959

Leu Lys Ser Met

2285

gga ttg cca age 7004 Phe Gly Gly Lys Thr 2290

atg gca ctg gac ctg

Met Ala Leu Asp Leu

2305

ggg age aca gtc gtg Gly Ser Thr Val Val 2320

tcg gaa tac gtc acc

Ser Glu Tyr Val Thr 2335

ggc tca tta ttc gtc Gly Ser Leu Phe Val 2350

gac ttg act gtt ggc Asp Leu Thr Val Gly 2365

acc ctc aca acg ttt Thr Leu Thr Thr Phe

2380

tat ggg tac atg ctc Tyr Gly Tyr Met Leu 2395

gcc cag aga agg aca

Ala Gln Arg Arg Thr 2410

gac gga atg gtc gcc Asp Gly Met Val Ala 2425

cct ctg atg caa aag Pro Leu Met Gln Lys 2440

Gln Ala Ser Gly Leu Thr 2295

cgt cca gcc aca gcc tgg Arg Pro Ala Thr Ala Trp 2310

cta acc cct ctt ctg aag Leu Thr Pro Leu Leu Lys 2325

aca tcg cta gct tca att Thr Ser Leu Ala Ser Ile 2340

ttg cca cga ggc gtg cct Leu Pro Arg Gly Val Pro 2355

ctc gtc ttc ctt ggc tgt Leu Val Phe Leu Gly Cys 2370

ctg aca gcc atg gtt ctg Leu Thr Ala Met Val Leu 2385

cct gga tgg caa gca gaa Pro Gly Trp Gln Ala Glu 2400

gcg gct gga ata atg aag Ala Ala Gly Ile Met Lys 2415

act gat gtg cct gaa ctg Thr Asp Val Pro Glu Leu 2430

aaa gtc gga cag gtg ctc Lys Val Gly Gln Val Leu 2445

Gly Leu Pro Ser 2300

gca ctg tat ggg 7049

Ala Leu Tyr Gly

2315

cac ctg ate acg 7094

His Leu Ile Thr

2330

aac tca caa gct 7139

Asn Ser Gln Ala

2345

ttt acc gac cta 7184

Phe Thr Asp Leu

2360

tgg ggt caa gtc 7229

Trp Gly Gln Val

2375

gcg aca ctt cac 7274

Ala Thr Leu His

2390

gca ctc agg gct 7319

Ala Leu Arg Ala

2405

aat gcc gtt gtt 7364

Asn Ala Val Val

2420

gaa agg act act 7409

Glu Arg Thr Thr

2435

ctc ata ggg gta 7454

Leu Ile Gly Val

2450 age gtg gea gcg ttc ctc gtc aac cct aat gtc acc act gtg aga 7499

Ser Val Ala Ala Phe Leu Val Asn Pro Asn Val Thr Thr Val Arg

2455 2460 2465

gaa gea ggg gtg ttg gtg acg gcg gct acg ctt act ttg tgg gac 7544

Glu Ala Gly Val Leu Val Thr Ala Ala Thr Leu Thr Leu Trp Asp 2470 2475 2480

aat gga gcc agt gcc gtt tgg aat tcc acc aca gcc acg gga ctc 7589

Asn Gly Ala Ser Ala Val Trp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Gly Leu 2485 2490 2495

tgc cat gtc atg cga ggt age tac ctg gct gga ggc tcc att gct 7634

Cys His Val Met Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Ile Ala

2500 2505 2510

tgg act ctc ate aag aac gct gat aag ccc tcc ttg aaa agg gga 7679

Trp Thr Leu Ile Lys Asn Ala Asp Lys Pro Ser Leu Lys Arg Gly 2515 2520 2525

agg cct ggg ggc agg acg cta ggg gag cag tgg aag gaa aaa cta 7724

Arg Pro Gly Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gln Trp Lys Glu Lys Leu

2530 2535 2540

aat gcc atg agt aga gaa gag ttt ttt aaa tac cgg aga gag ggc 7769

Asn Ala Met Ser Arg Glu Glu Phe Phe Lys Tyr Arg Arg Glu Gly 2545 2550 2555

ata ate gag gtg gac cgc act gaa gea cgc agg gcc aga agt gaa 7814

Ile Ile Glu Val Asp Arg Thr Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Glu 2560 2565 2570

aat aac ata gtg gga gga cat ccg gtt tcg cga ggc tca gea aaa 7859

Asn Asn Ile Val Gly Gly His Pro Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys

2575 2580 2585

ctc cgt tgg ctt gtg gag aaa gga ttt gtc tcg cca ata gga aaa 7904

Leu Arg Trp Leu Val Glu Lys Gly Phe Val Ser Pro Ile Gly Lys 2590 2595 2600

gtc att gat cta ggg tgt ggg cgt gga gga tgg age tac tac gea 7949

Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Ala 2605

gca acc ctg aag aag

Ala Thr Leu Lys Lys 2620

ggg gcg gga cat gaa

Gly Ala Gly His Glu 2635

aac ctg gtc tcc ctg

Asn Leu Val Ser Leu

2650

tca gag ccc agt gat Ser Glu Pro Ser Asp 2665

cca agt cca gaa gta

Pro Ser Pro Glu Val 2680

atg aca tct gac tgg Met Thr Ser Asp Trp 2695

aaa gtt ctc tgc cct Lys Val Leu Cys Pro 2710

gtt ctg cag cgc cgc Val Leu Gln Arg Arg

2725

tcc cga aac tcc aat Ser Arg Asn Ser Asn 2740

ggc aat gtg gtg cac

Gly Asn Val Val His 2755

ggg cga atg gat cgc

2610

gtc cag gaa gtc aga gga Val Gln Glu Val Arg Gly 2625

gaa ccg atg ctc atg cag Glu Pro Met Leu Met Gln 2640

aag agt gga gtg gac gtg Lys Ser Gly Val Asp Val 2655

acc ctg ttc tgt gac ata Thr Leu Phe Cys Asp Ile 2670

gaa gaa caa cgc aca cta Glu Glu Gln Arg Thr Leu 2685

ttg cac cga gga cct aga Leu His Arg Gly Pro Arg 2700

tac atg ccc aag gtt ata Tyr Met Pro Lys Val Ile 2715

ttc gga ggt ggg cta gtg Phe Gly Gly Gly Leu Val 2730

cac gag atg tat tgg gtt His Glu Met Tyr Trp Val 2745

gct gtg aac atg acc age Ala Val Asn Met Thr Ser 2760

aca gtg tgg aga ggg cca

2615

tac acg aaa ggt 7994

Tyr Thr Lys Gly

2630

age tac ggc tgg 803 9

Ser Tyr Gly Trp

2645

ttt tac aaa cct 8084

Phe Tyr Lys Pro 2660

ggg gaa tcc tcc 8129

Gly Glu Ser Ser

2675

cgc gtc cta gag 8174

Arg Val Leu Glu

2690

gag ttc tgc att 8219

Glu Phe Cys Ile

2705

gaa aaa att gaa 8264

Glu Lys Ile Glu 2720

cgt ctc ccc ctg 8309

Arg Leu Pro Leu

2735

agt gga gcc gct 8354

Ser Gly Ala Ala

2750

cag gta tta ctg 8399

Gln Val Leu Leu

2765

aag tat gag gaa 8444 Gly Arg Met Asp Arg 2770

gat gtc aac cta ggg Asp Val Asn Leu Gly

2785

gtc cat age aat cag Val His Ser Asn Gln 2800

aaa gaa gaa ttc gcc Lys Glu Glu Phe Ala 2815

tac cgc act tgg aca Tyr Arg Thr Trp Thr 2830

ggc tca gcc age tet

Gly Ser Ala Ser Ser 2845

aaa cct tgg gac gcc

Lys Pro Trp Asp Ala 2860

gac acc acc cct ttt

Asp Thr Thr Pro Phe 2875

gac acg aag gct cct

Asp Thr Lys Ala Pro 2890

aac gag acc acc aac

Asn Glu Thr Thr Asn 2905

aga ccc cgc ttg tgc

Arg Pro Arg Leu Cys 2920

Thr Val Trp Arg Gly Pro 2775

age gga aca aga gcc gtg Ser Gly Thr Arg Ala Val 2790

gag aaa ate aag aag aga Glu Lys Ile Lys Lys Arg 2805

aca acg tgg cac aaa gac Thr Thr Trp His Lys Asp 2820

tac cac gga age tat gaa Tyr His Gly Ser Tyr Glu 2835

etc gtc aac gga gtg gtg Leu Val Asn Gly Val Val 2850

att gcc aac gtc acc acc Ile Ala Asn Val Thr Thr 2865

gga cag caa aga gtt ttc Gly Gln Gln Arg Val Phe 2880

gag cca cca gct gga gcc Glu Pro Pro Ala Gly Ala 2895

tgg ctg tgg gcc tac ttg Trp Leu Trp Ala Tyr Leu 2910

acc aag gaa gaa ttc att Thr Lys Glu Glu Phe Ile 2925

Lys Tyr Glu Glu 2780

gga aag gga gaa 8489

Gly Lys Gly Glu

2795

ate cag aag ctt 8534

Ile Gln Lys Leu 2810

cct gag cat cca 8579

Pro Glu His Pro

2825

gtg aag gct act 8624

Val Lys Ala Thr

2840

aag ctc atg age 8669

Lys Leu Met Ser

2855

atg gcc atg act 8714

Met Ala Met Thr

2870

aag gag aaa gtt 8759

Lys Glu Lys Val

2885

aag gaa gtg ctc 8804

Lys Glu Val Leu

2900

tca cgg gaa aaa 8849

Ser Arg Glu Lys

2915

aag aaa gtt aac 8894

Lys Lys Val Asn

2930 10

15

20

25

30

age aac gcg gct ctt gga gea gtg ttc gct gaa cag aat caa tgg 8939

Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Ala Glu Gln Asn Gln Trp

2935 2940 2945

age acg gcg cgt gag gct gtg gat gac ccg cgg ttt tgg gag atg 8984

Ser Thr Ala Arg Glu Ala Val Asp Asp Pro Arg Phe Trp Glu Met

2950 2955 2960

gtt gat gaa gag agg gaa aac cat ctg cga gga gag tgt cac aca 9029

Val Asp Glu Glu Arg Glu Asn His Leu Arg Gly Glu Cys His Thr

2965 2970 2975

tgt ate tac aac atg atg gga aaa aga gag aag aag cct gga gag 9074

Cys Ile Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Pro Gly Glu

2980 2985 2990

ttt gga aaa gct aaa gga age agg gcc att tgg ttc atg tgg ctt 9119

Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Phe Met Trp Leu

2995 3000 3005

gga gea cgg tat cta gag ttt gaa gct ttg ggg ttc ctg aat gaa 9164

Gly Ala Arg Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu

3010 3015 3020

gac cat tgg ctg age cga gag aat tca gga ggt gga gtg gaa ggc 9209

Asp His Trp Leu Ser Arg Glu Asn Ser Gly Gly Gly Val Glu Gly

3025 3030 3035

tca ggc gtc caa aag ctg gga tac ate ctc cgt gac ata gea gga 9254

Ser Gly Val Gln Lys Leu Gly Tyr Ile Leu Arg Asp Ile Ala Gly

3040 3045 3050

aag caa gga ggg aaa atg tac gct gat gat acc gcc ggg tgg gac 9299

Lys Gln Gly Gly Lys Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp

3055 3060 3065

act aga att acc aga act gat tta gaa aat gaa gct aag gta ctg 9344

Thr Arg Ile Thr Arg Thr Asp Leu Glu Asn Glu Ala Lys Val Leu

3070 3075 3080

gag ctc cta gac ggt gaa cac cgc atg ctc gcc cga gcc ata att 9389

Glu Leu Leu Asp Gly Glu His Arg Met Leu Ala Arg Ala Ile Ile 3085

gaa ctg act tac agg Glu Leu Thr Tyr Arg 3100

gca gaa gga aag acc Ala Glu Gly Lys Thr 3115

agg ggg agt gga cag Arg Gly Ser Gly Gln

3130

aac ate gct gtc cag Asn Ile Ala Val Gln 3145

att gga cca caa cac

Ile Gly Pro Gln His 3160

gct gtc agg acc tgg Ala Val Arg Thr Trp 3175

agg atg gcg ate age Arg Met Ala Ile Ser 3190

gac aga ttc gcc aca Asp Arg Phe Ala Thr

3205

gtc aga aaa gac ate

Val Arg Lys Asp Ile 3220

gat tgg cag caa gtt

Asp Trp Gln Gln Val 3235

gtg atg aaa gat gga

3090

cac aaa gtg gtc aag gtc His Lys Val Val Lys Val 3105

gtg atg gac gtg ata tca Val Met Asp Val Ile Ser 3120

gtg gtc act tat gct ctt Val Val Thr Tyr Ala Leu 3135

ctc gtc agg ctg atg gag Leu Val Arg Leu Met Glu 3150

ttg gaa cat cta cct agg Leu Glu His Leu Pro Arg 3165

ctc ttt gag aat gga gag Leu Phe Glu Asn Gly Glu 3180

gga gac gac tgt gcc gtc

Gly Asp Asp Cys Ala Val 3195

gcc ctc cac ttc ctc aac Ala Leu His Phe Leu Asn 3210

cag gaa tgg aag cct tcg Gln Glu Trp Lys Pro Ser 3225

ccc ttc tgt tet aac cat Pro Phe Cys Ser Asn His 3240

agg agt ata gtt gtc ccg

3095

atg aga cct gca 9434

Met Arg Pro Ala

3110

aga gaa gat caa 9479

Arg Glu Asp Gln

3125

aac act ttc acg 9524

Asn Thr Phe Thr

3140

gct gag ggg gtc 9569

Ala Glu Gly Val

3155

aaa aac aag ata 9614

Lys Asn Lys Ile

3170

gag aga gtg acc 9659

Glu Arg Val Thr

3185

aaa ccg ctg gac 9704

Lys Pro Leu Asp

3200

gca atg tca aag 9749

Ala Met Ser Lys

3215

cat ggc tgg cac 9794

His Gly Trp His

3230

ttt cag gag att 9839

Phe Gln Glu Ile

3245

tgc aga gga cag 9884 Val

gat Asp

5

aat Asn

tgg Trp

aat Asn

agg Arg

gaa Glu

gaa Glu

15

20

ccg

Pro

gga Gly

ata

Ile

Met Lys Asp Gly Arg Ser 3250 3255

gag ctg ata ggc agg gct Glu Leu Ile Gly Arg Ala 3265 3270

gtg aag gac aca gct tgc Val Lys Asp Thr Ala Cys 3280 3285

gta ctc cta tac ttc cac Val Leu Leu Tyr Phe His 3295 3300

gcg att tgc tca gca gtg Ala Ile Cys Ser Ala Val 3310 3315

aca tcc tgg tca ata cac Thr Ser Trp Ser Ile His 3325 3330

gac atg ctg cag gtc tgg Asp Met Leu Gln Val Trp 3340 3345

tgg atg atg gac aag act Trp Met Met Asp Lys Thr 3355 3360

tat gtg gga aag cgc gag Tyr Val Gly Lys Arg Glu 3370 3375

acg cga tcc aga gca acc Thr Arg Ser Arg Ala Thr 3385 3390

aac cag gtt aga gct gtc Asn Gln Val Arg Ala Val 3400 3405

Ile Val Val Pro Cys 3260

cgc ate tet cca gga Arg Ile Ser Pro Gly 3275

ctg ccc aaa gca tat Leu Pro Lys Ala Tyr 3290

cgc agg gac ttg cgt Arg Arg Asp Leu Arg 3305

cca gta gat tgg gtg Pro Val Asp Trp Val 3320

tcg aaa gga gag tgg Ser Lys Gly Glu Trp 3335

aac aga gtt tgg att Asn Arg Val Trp Ile 3350

cca ate aca age tgg Pro Ile Thr Ser Trp 3365

gac ate tgg tgt ggc Asp Ile Trp Cys Gly 3380

tgg gct gag aac ate Trp Ala Glu Asn Ile 3395

att ggg aaa gaa aat Ile Gly Lys Glu Asn 3410

Arg Gly Gln

gct gga tgg Ala Gly Trp

gca caa atg Ala Gln Met

ctc atg gca Leu Met Ala

ccc aca ggc Pro Thr Gly

atg acc acg Met Thr Thr

gaa gaa aat Glu Glu Asn

aca gac gtt Thr Asp Val

age ctc ate Ser Leu Ile

tat gcg gcg Tyr Ala Ala

tat gtt gac Tyr Val Asp

9929

9974

10019

10064

10109

10154

10199

10244

10289

10334 10

tac atg acc tca ctc agg aga tac gaa gac gtc ttg ate cag gaa 10379

Tyr Met Thr Ser Leu Arg Arg Tyr Glu Asp Val Leu Ile Gln Glu

3415 3420 3425

gac agg gtc ate tag tgtgatttaa ggtagaaaag tagactatgt aaacaatgta 10434 Asp Arg Val Ile 3430

aatgagaaaa tgcatgcata tggagtcagg ccagcaaaag ctgccaccgg atactgggta 10494 gacggtgctg cctgcgtctc agtcccagga ggactgggtt aacaaatctg acaacagaaa 10554 gtgagaaagc cctcagaact gtctcggaag taggtccctg ctcactggaa gttgaaagac 10614 caacgtcagg ccacaaattt gtgccactcc gctagggagt gcggcctgcg cagccccagg 10674 aggactgggt taccaaagcc gttgagcccc cacggcccaa gcctcgtcta ggatgcaata 10734 gacgaggtgt aaggactaga ggttagagga gaccccgtgg aaacaacaac atgcggccca 10794 agccccctcg aagctgtaga ggaggtggaa ggactagagg ttagaggaga ccccgcattt 10854 gcatcaaaca gcatattgac acctgggaat agactgggag atcttctgct ctatctcaac 10914 atcagctact aggcacagag cgccgaagta tgtacgtggt ggtgaggaag aacacaggat 10974 ct 10976

<210> 89 <211> 3432 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Construção sintética <400> 89

Met Thr Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Asn Arg Ala Ile Asn Met

1 5 10 15

Leu Lys Arg Gly Leu Pro Arg Val Phe Pro Leu Val Gly Val Lys Arg

25 30

Val Val Met Ser Leu Leu Asp Gly Arg Gly Pro Val Arg Phe Val Leu 40 45

Ala Leu Ile Thr Phe Phe Lys Phe Thr Ala Leu Ala Pro Thr Lys Ala 50 55 60

Leu Ser Gly Arg Trp Lys Ala Val Glu Lys Ser Val Ala Met Lys His 65

Leu Thr Ser Phe Lys 85

Lys Arg Gly Arg Lys 100

Met Trp Leu Ala Ser 115

Lys Leu Ser Asn Phe 130

Asp Ile Ala Asp Val 145

Cys Trp Val Arg Ala 165

Thr Tyr Glu Cys Pro 180

Asp Cys Trp Cys Asp 195

Thr Arg Thr Arg His 210

Thr His Gly Glu Ser

225

Ser Thr Lys Ala Thr 245

Arg Asn Pro Gly Tyr 260

Gly Ser Asn Asn Gly 275

Val Ala Pro Ala Tyr 290

Phe Ile Glu Gly Ala 305

Gly Asp Ser Cys Leu

70 75

Arg Glu Leu Gly Thr Leu 90

Gln Asn Lys Arg Gly Gly 105

Leu Ala Val Val Ile Ala 120

Gln Gly Lys Leu Leu Met 135

Ile Val Ile Pro Thr Ser 150 155

Ile Asp Val Gly Tyr Met 170

Lys Leu Thr Met Gly Asn 185

Asn Gln Glu Val Tyr Val 200

Ser Lys Arg Ser Arg Arg 215

Ser Leu Val Asn Lys Lys 230 235

Arg Tyr Leu Met Lys Thr 250

Ala Phe Leu Ala Ala Val 265

Gln Arg Val Val Phe Thr 280

Ser Phe Asn Cys Leu Gly 295

Ser Gly Ala Thr Trp Val 310 315

Thr Ile Met Ala Asn Asp

80

Ile Asp Ala Val Asn 95

Asn Glu Gly Ser Ile 110

Cys Ala Gly Ala Met 125

Thr Ile Asn Asn Thr 140

Lys Gly Glu Asn Arg 160

Cys Glu Asp Thr Ile 175

Asp Pro Glu Asp Val 190

Gln Tyr Gly Arg Cys 205

Ser Val Ser Val Gln 220

Glu Ala Trp Leu Asp

240

Glu Asn Trp Ile Ile 255

Leu Gly Trp Met Leu 270

Ile Leu Leu Leu Leu 285

Met Gly Asn Arg Asp 300

Asp Leu Val Leu Glu 320

Lys Pro Thr Leu Asp 325 330 335

Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser

340 345 350

Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys

355 360 365

Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr

370 375 380

Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly 385 390 395 400

Phe Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr

405 410 415

Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Lys

420 425 430

Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn

435 440 445

Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr

450 455 460

Pro Asn Ala Pro Ser Val Ala Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val 465 470 475 480

Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr

485 490 495

Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe

500 505 510

His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg

515 520 525

Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Gly Ala His Ala Thr Lys Gln

530 535 540

Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His His Ala Leu 545 550 555 560

Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Met Leu Thr Ser

565 570 575

Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly 580 585 590

Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro

595 600 605

Val Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly

610 615 620

Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn 625 630 635 640

Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala

645 650 655

Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe

660 665 670

Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His

675 680 685

His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr

690 695 700

Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp 705 710 715 720

Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Arg Ala Val His

725 730 735

Gln Val Phe Gly Asp Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp

740 745 750

Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn

755 760 765

Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val

770 775 780

Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala Ile 785 790 795 800

Asp Ile Thr Arg Lys Glu Met Arg Cys Gly Ser Gly Ile Phe Val His

805 810 815

Asn Asp Val Glu Ala Trp Val Asp Arg Tyr Lys Tyr Leu Pro Glu Thr

820 825 830

Pro Arg Ser Leu Ala Lys Ile Val His Lys Ala His Lys Glu Gly Val 835 840 845

Cys Gly Val Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu His Gln Met Trp Glu Ala

850 855 860

Val Arg Asp Glu Leu Asn Val Leu Leu Lys Glu Asn Ala Val Asp Leu 865 870 875 880

Ser Val Val Val Asn Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys

885 890 895

Arg Leu Ser Met Thr Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp

900 905 910

Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu Ala Asn Ser Thr Phe Val

915 920 925

Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro Asp Glu His Arg Ala Trp

930 935 940

Asn Ser Met Gln Ile Glu Asp Phe Gly Phe Gly Ile Thr Ser Thr Arg 945 950 955 960

Val Trp Leu Lys Ile Arg Glu Glu Ser Thr Asp Glu Cys Asp Gly Ala

965 970 975

Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly His Val Ala Val His Ser Asp Leu

980 985 990

Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Tyr Asn Asp Thr Trp Lys Leu Glu Arg

995 1000 1005

Ala Val Phe Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr Trp Pro Glu Thr His

1010 1015 1020

Thr Leu Trp Gly Asp Asp Val Glu Glu Ser Glu Leu Ile Ile Pro

1025 1030 1035

His Thr Ile Ala Gly Pro Lys Ser Lys His Asn Arg Arg Glu Gly

1040 1045 1050

Tyr Lys Thr Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Asn Gly Ile Val

1055 1060 1065

Leu Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Lys Val Thr Ile Thr Glu

1070 1075 1080

Asp Cys Ser Lys Arg Gly Pro Ser Val Arg Thr Thr Thr Asp Ser 1085 1090 1095

Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Ser Leu Pro

1100 1105 1110

Pro Leu Arg Phe Arg Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu

1115 1120 1125

Ile Arg Pro Val Met His Asp Glu Thr Thr Leu Val Arg Ser Gln

1130 1135 1140

Val His Ala Phe Lys Gly Glu Met Val Asp Pro Phe Gln Leu Gly

1145 1150 1155

Leu Leu Val Met Phe Leu Ala Thr Gln Glu Val Leu Arg Lys Arg

1160 1165 1170

Trp Thr Ala Arg Leu Thr Ile Pro Ala Val Leu Gly Val Leu Leu

1175 1180 1185

Val Leu Met Leu Gly Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Leu Ala Arg Tyr

1190 1195 1200

Val Val Leu Val Ala Ala Ala Phe Ala Glu Ala Asn Ser Gly Gly

1205 1210 1215

Asp Val Leu His Leu Ala Leu Ile Ala Val Phe Lys Ile Gln Pro

1220 1225 1230

Ala Phe Leu Val Met Asn Met Leu Ser Thr Arg Trp Thr Asn Gln

1235 1240 1245

Glu Asn Val Val Leu Val Leu Gly Ala Ala Phe Phe Gln Leu Ala

1250 1255 1260 Ser Val Asp Leu Gln Ile Gly Val His Gly Ile Leu Asn Ala Ala

1265 1270 1275 Ala Ile Ala Trp Met Ile Val Arg Ala Ile Thr Phe Pro Thr Thr

1280 1285 1290 Ser Ser Val Thr Met Pro Val Leu Ala Leu Leu Thr Pro Gly Met

129fi 1300 1305 Arg Ala Leu Tyr Leu Asp Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Leu Val Ile

1310 1315 1320 Gly Ile Cys Ser Leu Leu His Glu Arg Lys Lys Thr Met Ala Lys 1325 1330 1335

Lys Lys Gly Ala Val Leu Leu Gly Leu Ala Leu Thr Ser Thr Gly

1340 1345 I350

Trp Phe Ser Pro Thr Thr Ile Ala Ala Gly Leu Met Val Cys Asn

1355 1360 1365

Pro Asn Lys Lys Arg Gly Trp Pro Ala Thr Glu Phe Leu Ser Ala

1370 1375 1380

Val Gly Leu Met Phe Ala Ile Val Gly Gly Leu Ala Glu Leu Asp

1385 1390 1395

Ile Glu Ser Met Ser Ile Pro Phe Met Leu Ala Gly Leu Met Ala

1400 1405 1410

Val Ser Tyr Val Val Ser Gly Lys Ala Thr Asp Met Trp Leu Glu

1415 1420 1425

Arg Ala Ala Asp Ile Ser Trp Asp Met Gly Ala Ala Ile Thr Gly

1430 1435 1440

Ser Ser Arg Arg Leu Asp Val Lys Leu Asp Asp Asp Gly Asp Phe

1445 1450 1455

His Phe Ile Asp Asp Pro Gly Val Pro Trp Lys Val Trp Val Leu

1460 1465 1470

Arg Met Ser Cys Ile Gly Leu Ala Ala Leu Thr Pro Trp Ala Ile

1475 1480 1485

Val Pro Ala Ala Phe Gly Tyr Trp Leu Thr Leu Lys Thr Thr Lys

1490 1495 1500

Arg Gly Gly Val Phe Trp Asp Thr Pro Ser Pro Lys Pro Cys Ser

1505 1510 1515

Lys Gly Asp Thr Thr Thr Gly Val Tyr Arg Ile Met Ala Arg Gly

1520 1525 1530

Ile Leu Gly Thr Tyr Gln Ala Gly Val Gly Val Met Tyr Glu Asn

1535 1540 1545

Val Phe His Thr Leu Trp His Thr Thr Arg Gly Ala Ala Ile Val

1550 1555 1560

Ser Gly Glu Gly Lys Leu Thr Pro Tyr Trp Gly Ser Val Lys Glu 1565 1570 1575

Asp Arg Ile Ala Tyr Gly Gly Pro Trp Arg Phe Asp Arg Lys Trp

1580 1585 1590

Asn Gly Thr Asp Asp Val Gln Val Ile Val Val Glu Pro Gly Lys

1595 1600 1605

Gly Ala Val Asn Ile Gln Thr Lys Pro Gly Val Phe Arg Thr Pro

1610 1615 1620

Phe Gly Glu Val Gly Ala Val Ser Leu Asp Tyr Pro Arg Gly Thr

1625 1630 1635

Ser Gly Ser Pro Ile Leu Asp Ser Asn Gly Asp Ile Ile Gly Leu

1640 1645 1650

Tyr Gly Asn Gly Val Glu Leu Gly Asp Gly Ser Tyr Val Ser Ala

1655 1660 1665

Ile Val Gln Gly Asp Arg Gln Glu Glu Pro Val Pro Glu Ala Tyr

1670 1675 1680

Thr Pro Asn Met Leu Arg Lys Arg Gln Met Thr Val Leu Asp Leu

1685 1690 1695

His Pro Gly Ser Gly Lys Thr Arg Lys Ile Leu Pro Gln Ile Ile

1700 1705 1710

Lys Asp Ala Ile Gln Gln Arg Leu Arg Thr Ala Val Leu Ala Pro

1715 1720 1725

Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Ala Glu Val Leu Arg Gly Leu

1730 1735 1740

Pro Val Arg Tyr Gln Thr Ser Ala Val Gln Arg Glu His Gln Gly

1745 1750 1755

Asn Glu Ile Val Asp Val Met Cys His Ala Thr Leu Thr His Arg

1760 1765 1770

Leu Met Ser Pro Asn Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Phe Val Met

1775 1780 1785

Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly

1790 1795 1800

Tyr Ile Ala Thr Lys Val Glu Leu Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe 1805 1810 1815

Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Thr Asp Pro Phe Pro Asp Ser

1820 1825 1830

Asn Ala Pro Ile His Asp Leu Gln Asp Glu Ile Pro Asp Arg Ala

1835 1840 1845

Trp Ser Ser Gly Tyr Glu Trp Ile Thr Glu Tyr Ala Gly Lys Thr

1850 1855 1860

Val Trp Phe Val Ala Ser Val Lys Met Gly Asn Glu Ile Ala Met

1865 1870 1875

Cys Leu Gln Arg Ala Gly Lys Lys Val Ile Gln Leu Asn Arg Lys

1880 1885 1890

Ser Tyr Asp Thr Glu Tyr Pro Lys Cys Lys Asn Gly Asp Trp Asp

1895 1900 1905

Phe Val Ile Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Gly

1910 1915 1920

Ala Ser Arg Val Ile Asp Cys Arg Lys Ser Val Lys Pro Thr Ile

1925 1930 1935

Leu Glu Glu Gly Glu Gly Arg Val Ile Leu Gly Asn Pro Ser Pro

1940 1945 1950

Ile Thr Ser Ala Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Val Gly Arg

1955 1960 1965

Asn Pro Asn Gln Val Gly Asp Glu Tyr His Tyr Gly Gly Ala Thr

1970 1975 1980

Ser Glu Asp Asp Ser Asn Leu Ala His Trp Thr Glu Ala Lys Ile

1985 1990 1995

Met Leu Asp Asn Ile His Met Pro Asn Gly Leu Val Ala Gln Leu

2000 2005 2010

Tyr Gly Pro Glu Arg Glu Lys Ala Phe Thr Met Asp Gly Glu Tyr

2015 2020 2025

Arg Leu Arg Gly Glu Glu Lys Lys Asn Phe Leu Glu Leu Leu Arg

2030 2035 2040

Thr Ala Asp Leu Pro Val Trp Leu Ala Tyr Lys Val Ala Ser Asn 2045 2050 2055

Gly Ile Gln Tyr Thr Asp Arg Lys Trp Cys Phe Asp Gly Pro Arg

2060 2065 2070

Thr Asn Ala Ile Leu Glu Asp Asn Thr Glu Val Glu Ile Val Thr

2075 2080 2085

Arg Met Gly Glu Arg Lys Ile Leu Lys Pro Arg Trp Leu Asp Ala

2090 2095 2100

Arg Val Tyr Ala Asp His Gln Ala Leu Lys Trp Phe Lys Asp Phe

2105 2110 2115

Ala Ala Gly Lys Arg Ser Ala Val Ser Phe Ile Glu Val Leu Gly

2120 2125 2130

Arg Met Pro Glu His Phe Met Gly Lys Thr Arg Glu Ala Leu Asp

2135 2140 2145

Thr Met Tyr Leu Val Ala Thr Ala Glu Lys Gly Gly Lys Ala His

2150 2155 2160

Arg Met Ala Leu Glu Glu Leu Pro Asp Ala Leu Glu Thr Ile Thr

2165 2170 2175

Leu Ile Val Ala Ile Thr Val Met Thr Gly Gly Phe Phe Leu Leu

2180 2185 2190

Met Met Gln Arg Lys Gly Ile Gly Lys Met Gly Leu Gly Ala Leu

2195 2200 2205

Val Leu Thr Leu Ala Thr Phe Phe Leu Trp Ala Ala Glu Val Pro

2210 2215 2220

Gly Thr Lys Ile Ala Gly Thr Leu Leu Ile Ala Leu Leu Leu Met

2225 2230 2235

Val Val Leu Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Gln Thr Asp

2240 2245 2250

Asn Gln Leu Ala Val Phe Leu Ile Cys Val Leu Thr Val Val Gly

2255 2260 2265

Val Val Ala Ala Asn Glu Tyr Gly Met Leu Glu Lys Thr Lys Ala

2270 2275 2280

Asp Leu Lys Ser Met Phe Gly Gly Lys Thr Gln Ala Ser Gly Leu 2285 2290 2295

Thr Gly Leu Pro Ser Met Ala Leu Asp Leu Arg Pro Ala Thr Ala

2300 2305 2310

Trp Ala Leu Tyr Gly Gly Ser Thr Val Val Leu Thr Pro Leu Leu

2315 2320 2325

Lys His Leu Ile Thr Ser Glu Tyr Val Thr Thr Ser Leu Ala Ser

2330 2335 2340

Ile Asn Ser Gln Ala Gly Ser Leu Phe Val Leu Pro Arg Gly Val

2345 2350 2355

Pro Phe Thr Asp Leu Asp Leu Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Gly

2360 2365 2370

Cys Trp Gly Gln Val Thr Leu Thr Thr Phe Leu Thr Ala Met Val

2375 2380 2385

Leu Ala Thr Leu His Tyr Gly Tyr Met Leu Pro Gly Trp Gln Ala

2390 2395 2400

Glu Ala Leu Arg Ala Ala Gln Arg Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met

2405 2410 2415

Lys Asn Ala Val Val Asp Gly Met Val Ala Thr Asp Val Pro Glu

2420 2425 2430

Leu Glu Arg Thr Thr Pro Leu Met Gln Lys Lys Val Gly Gln Val

2435 2440 2445

Leu Leu Ile Gly Val Ser Val Ala Ala Phe Leu Val Asn Pro Asn

2450 2455 2460

Val Thr Thr Val Arg Glu Ala Gly Val Leu Val Thr Ala Ala Thr

2465 2470 2475

Leu Thr Leu Trp Asp Asn Gly Ala Ser Ala Val Trp Asn Ser Thr

2480 2485 2490

Thr Ala Thr Gly Leu Cys His Val Met Arg Gly Ser Tyr Leu Ala

2495 2500 2505

Gly Gly Ser Ile Ala Trp Thr Leu Ile Lys Asn Ala Asp Lys Pro

2510 2515 2520

Ser Leu Lys Arg Gly Arg Pro Gly Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gln 2525 2530 2535

Trp Lys Glu Lys Leu Asn Ala Met Ser Arg Glu Glu Phe Phe Lys

2540 2545 2550

Tyr Arg Arg Glu Gly Ile Ile Glu Val Asp Arg Thr Glu Ala Arg

2555 2560 2565

Arg Ala Arg Ser Glu Asn Asn Ile Val Gly Gly His Pro Val Ser

2570 2575 2580

Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg Trp Leu Val Glu Lys Gly Phe Val

2585 2590 2595

Ser Pro Ile Gly Lys Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly

2600 2605 2610

Trp Ser Tyr Tyr Ala Ala Thr Leu Lys Lys Val Gln Glu Val Arg

2615 2620 2625

Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Ala Gly His Glu Glu Pro Met Leu Met

2630 2635 2640

Gln Ser Tyr Gly Trp Asn Leu Val Ser Leu Lys Ser Gly Val Asp

2645 2650 2655

Val Phe Tyr Lys Pro Ser Glu Pro Ser Asp Thr Leu Phe Cys Asp

2660 2665 2670

Ile Gly Glu Ser Ser Pro Ser Pro Glu Val Glu Glu Gln Arg Thr

2675 2680 2685

Leu Arg Val Leu Glu Met Thr Ser Asp Trp Leu His Arg Gly Pro

2690 2695 2700

Arg Glu Phe Cys Ile Lys Val Leu Cys Pro Tyr Met Pro Lys Val

2705 2710 2715

Ile Glu Lys Ile Glu Val Leu Gln Arg Arg Phe Gly Gly Gly Leu

2720 2725 2730

Val Arg Leu Pro Leu Ser Arg Asn Ser Asn His Glu Met Tyr Trp

2735 2740 2745

Val Ser Gly Ala Ala Gly Asn Val Val His Ala Val Asn Met Thr

2750 2755 2760

Ser Gln Val Leu Leu Gly Arg Met Asp Arg Thr Val Trp Arg Gly 2765 2770 2775

Pro Lys Tyr Glu Glu Asp Val Asn Leu Gly Ser Gly Thr Arg Ala

2780 2785 2790

Val Gly Lys Gly Glu Val His Ser Asn Gln Glu Lys Ile Lys Lys

2795 2800 2805

Arg Ile Gln Lys Leu Lys Glu Glu Phe Ala Thr Thr Trp His Lys

2810 2815 2820

Asp Pro Glu His Pro Tyr Arg Thr Trp Thr Tyr His Gly Ser Tyr

2825 2830 2835

Glu Val Lys Ala Thr Gly Ser Ala Ser Ser Leu Val Asn Gly Val

2840 2845 2850

Val Lys Leu Met Ser Lys Pro Trp Asp Ala Ile Ala Asn Val Thr

2855 2860 2865

Thr Met Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val

2870 2875 2880

Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Lys Ala Pro Glu Pro Pro Ala Gly

2885 2890 2895

Ala Lys Glu Val Leu Asn Glu Thr Thr Asn Trp Leu Trp Ala Tyr

2900 2905 2910

Leu Ser Arg Glu Lys Arg Pro Arg Leu Cys Thr Lys Glu Glu Phe

2915 2920 2925

Ile Lys Lys Val Asn Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Ala

2930 2935 2940

Glu Gln Asn Gln Trp Ser Thr Ala Arg Glu Ala Val Asp Asp Pro

2945 2950 2955

Arg Phe Trp Glu Met Val Asp Glu Glu Arg Glu Asn His Leu Arg

2960 2965 2970

Gly Glu Cys His Thr Cys Ile Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu

2975 2980 2985

Lys Lys Pro Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile

2990 2995 3000

Trp Phe Met Trp Leu Gly Ala Arg Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Leu 3005 3010 3015

Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp Leu Ser Arg Glu Asn Ser Gly

3020 3025 3030

Gly Gly Val Glu Gly Ser Gly Val Gln Lys Leu Gly Tyr Ile Leu

3035 3040 3045

Arg Asp Ile Ala Gly Lys Gln Gly Gly Lys Met Tyr Ala Asp Asp

3050 3055 3060

Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile Thr Arg Thr Asp Leu Glu Asn

3065 3070 3075

Glu Ala Lys Val Leu Glu Leu Leu Asp Gly Glu His Arg Met Leu

3080 3085 3090

Ala Arg Ala Ile Ile Glu Leu Thr Tyr Arg His Lys Val Val Lys

3095 3100 3105

Val Met Arg Pro Ala Ala Glu Gly Lys Thr Val Met Asp Val Ile

3110 3115 3120

Ser Arg Glu Asp Gln Arg Gly Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala

3125 3130 3135

Leu Asn Thr Phe Thr Asn Ile Ala Val Gln Leu Val Arg Leu Met

3140 3145 3150

Glu Ala Glu Gly Val Ile Gly Pro Gln His Leu Glu His Leu Pro

3155 3160 3165

Arg Lys Asn Lys Ile Ala Val Arg Thr Trp Leu Phe Glu Asn Gly

3170 3175 3180

Glu Glu Arg Val Thr Arg Met Ala Ile Ser Gly Asp Asp Cys Ala

3185 3190 3195

Val Lys Pro Leu Asp Asp Arg Phe Ala Thr Ala Leu His Phe Leu

3200 3205 3210

Asn Ala Met Ser Lys Val Arg Lys Asp Ile Gln Glu Trp Lys Pro

3215 3220 3225

Ser His Gly Trp His Asp Trp Gln Gln Val Pro Phe Cys Ser Asn

3230 3235 3240

His Phe Gln Glu Ile Val Met Lys Asp Gly Arg Ser Ile Val Val 3245 3250 3255

Pro Cys Arg Gly Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Ala Arg Ile Ser

3260 3265 3270

Pro Gly Ala Gly Trp Asn Val Lys Asp Thr Ala Cys Leu Pro Lys

3275 3280 3285

Ala Tyr Ala Gln Met Trp Val Leu Leu Tyr Phe His Arg Arg Asp

3290 3295 3300

Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val Pro Val Asp

3305 3310 3315

Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Ser Trp Ser Ile His Ser Lys Gly

3320 3325 3330

Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Gln Val Trp Asn Arg Val

3335 3340 3345

Trp Ile Glu Glu Asn Glu Trp Met Met Asp Lys Thr Pro Ile Thr

3350 3355 3360

Ser Trp Thr Asp Val Pro Tyr Val Gly Lys Arg Glu Asp Ile Trp

3365 3370 3375

Cys Gly Ser Leu Ile Gly Thr Arg Ser Arg Ala Thr Trp Ala Glu

3380 3385 3390

Asn Ile Tyr Ala Ala Ile Asn Gln Val Arg Ala Val Ile Gly Lys

3395 3400 3405

Glu Asn Tyr Val Asp Tyr Met Thr Ser Leu Arg Arg Tyr Glu Asp

3410 3415 3420

Val Leu Ile Gln Glu Asp Arg Val Ile

3425 3430

<210> 90 <211> 11029 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> epítopo <22 0> <221> CDS

<222> (97) . . (10398)

<400> 90

agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60 acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcg atg tct aag aaa cca gga 114

Met Ser Lys Lys Pro Gly 1 5

ggg ccc ggc aag age cgg gct gtc aat atg cta aaa cgc gga atg ccc 162

Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met Leu Lys Arg Gly Met Pro

10 15 20

cgc gtg ttg tcc ttg att gga ctg aag agg gct atg ttg age ctg ate 210

Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg Ala Met Leu Ser Leu Ile

30 35

gac ggc aag ggg cca ata cga ttt gtg ttg gct etc ttg gcg ttc ttc 258

Asp Gly Lys Gly Pro Ile Arg Phe Val Leu Ala Leu Leu Ala Phe Phe 40 45 50

agg ttc aca gea att gct ccg acc cga gea gtg ctg gat cga tgg aga 306

Arg Phe Thr Ala Ile Ala Pro Thr Arg Ala Val Leu Asp Arg Trp Arg 55 60 65 70

ggt gtg aac aaa caa aca gcg atg aaa cac ctt ctg agt ttt aag aag 3 54

Gly Val Asn Lys Gln Thr Ala Met Lys His Leu Leu Ser Phe Lys Lys

75 80 85

gaa cta ggg acc ttg acc agt gct ate aat cgg cgg age tca aaa caa 402

Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala Ile Asn Arg Arg Ser Ser Lys Gln

90 95 100

aag aaa aga gga gga aag acc gga att gea gtc atg att ggc ctg ate 450

Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala Val Met Ile Gly Leu Ile

105 110 115

gcc age gta gga gea gtt acc ctc tct aac ttc caa ggg aag gtg atg 498

Ala Ser Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Val Met 120 125 130

atg acg gta aat gct act gac gtc aca gat gtc ate acg att cca aca 546 Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp Val Ile Thr Ile Pro Thr 135 140 145 150

gct gct gga aag aac cta tgc att gtc aga gca atg gat gtg gga tac 594

Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg Ala Met Asp Val Gly Tyr 155 160 165

atg tgc gat gat act ate act tat gaa tgc cca gtg ctg tcg gct ggt 642

Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Val Leu Ser Ala Gly

170 175 180

aat gat cca gaa gac ate gac tgt tgg tgc aca aag tca gca gtc tac 690

Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Thr Lys Ser Ala Val Tyr 185 190 195

gtc agg tat gga aga tgc acc aag aca cgc cac tca aga cgc agt cgg 73 8

Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg His Ser Arg Arg Ser Arg 200 205 210

agg tca ctg aca gtg cag aca cac gga gaa age act cta gcg aac aag 786

Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn Lys 215 220 225 230

aag ggg gct tgg atg gac age acc aag gcc aca agg tat ttg gta aaa 834

Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys 235 240 245

aca gaa tca tgg ate ttg agg aac cct gga tat gcc ctg gtg gca gcc 882

Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ala

250 255 260

gtc att ggt tgg atg ctt ggg age aac acc atg cag aga gtt gtg ttt 930

Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val Val Phe 265 270 275

gtc gtg cta ttg ctt ttg gtg gcc cca gct tac age ttc aac tgc ctt 978

Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu 280 285 290

gga atg age aac aga gac ttc ttg gaa gga gtg tet gga gca aca tgg 1026 Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser Gly Ala Thr Trp 295 300 305 310 gtg gat ttg gtt ctc gaa ggc gac age tgc gtg act ate atg tet aag 1074

Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr Ile Met Ser Lys

315 320 325

gac aag cct acc ate gat gtg aag atg atg aat atg gag gcg gcc aac 1122

Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met Glu Ala Ala Asn

330 335 340

ctg gea gag gtc cgc agt tat tgc tat ttg gct acc gtc age gat ctc 1170

Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr Val Ser Asp Leu

345 350 355

tcc acc aaa gct gcg tgc ccg acc atg gga gaa gct cac aat gac aaa 1218

Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala His Asn Asp Lys

360 365 370

cgt gct gac cca gct ttt gtg tgc aga caa gga gtg gtg gac agg ggc 12 66

Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val Val Asp Arg Gly 375 380 385 390

tgg ggc aac ggc tgc gga cta ttt ggc aaa gga age att gac aca tgc 1314

Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys

395 400 405

gcc aaa ttt gcc tgc tet acc aag gea ata gga aga acc ate ttg aaa 1362

Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Leu Lys

410 415 420

gag aat ate aag tac gaa gtg gcc att ttt gtc cat gga cca act act 1410

Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly Pro Thr Thr

425 430 435

gtg gag tcg cac gga aac tac tcc aca cag gtt gga gcc act cag gea 1458

Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly Ala Thr Gln Ala

440 445 450

ggg aga ttc age ate act cct gcg gcg cct tca tac aca cta aag ctt 1506

Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu 455 460 465 470

gga gaa tat gga gag gtg aca gtg gac tgt gaa cca cgg tca ggg att 1554

Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile 475 480 485

gac acc aat gca tac tac gtg atg act gtt gga aca aag acg ttc ttg 1602

Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr Lys Thr Phe Leu

490 495 500

gtc cat cgt gag tgg ttc atg gac ctc aac ctc cct tgg age agt gct 1650

Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro Trp Ser Ser Ala

505 510 515

gga agt act gtg tgg agg aac aga gag acg tta atg gag ttt gag gaa 1698

Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met Glu Phe Glu Glu

520 525 530

cca cac gcc acg aag cag tet gtg ata gca ttg ggc tca caa gag gga 1746

Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly 535 540 545 550

gct ctg cat caa gct ttg gct gga gcc att cct gtg gaa ttt tca age 1794

Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val Glu Phe Ser Ser

555 560 565

aac act gtc aag ttg acg tcg ggt cat ttg aag tgt aga gtg aag atg 1842

Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Val Lys Met 570 575 580

gaa aaa ttg cag ttg aag gga aca acc tat ggc gtc tgt tca aag gct 1890

Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala

585 590 595

ttc aag ttt ctt ggg act ccc gca gac aca ggt cac ggc act gtg gtg 1938

Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val

600 605 610

ttg gaa ttg cag tac act ggc acg gat gga cct tgc aaa gtt cct ate 1986

Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile

615 620 625 630

tcg tca gtg gct tca ttg aac gac cta acg cca gtg ggc aga ttg gtc 2034

Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val

635 640 645

act gtc aac cct ttt gtt tca gtg gcc acg gcc aac gct aag gtc ctg 2082 Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu

650 655 660

att gaa ttg gaa cca ccc ttt gga gac tca tac ata gtg gtg ggc aga 2130

Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg 665 670 675

gga gaa caa cag ate aat cac cat tgg cac aag tet gga age age att 2178

Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile

680 685 690

ggc aaa gcc ttt aca acc acc etc aaa gga gcg cag aga cta gcc gct 2226

Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala

695 700 705 710

cta gga gac aca gct tgg gac ttt gga tca gtt gga ggg gtg ttc acc 2274

Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe Thr 715 720 725

tca gtt ggg aag gct gtc cat caa gtg ttc gga gga gea ttc cgc tca 2322

Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Ser

730 735 740

ctg ttc gga ggc atg tcc tgg ata acg caa gga ttg ctg ggg gct ctc 2370

Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Leu Gly Ala Leu 745 750 755

ctg ttg tgg atg ggc ate aat gct cgt gat agg tcc ata gct ctc acg 2418

Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Thr

760 765 770

ttt ctc gea gtt gga gga gtt ctg ctc ttc ctc tcc gtg aac gtg cac 2466

Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser Val Asn Val His

775 780 785 790

gct gac act ggg tgt gcc ata gac ate age cgg caa gag ctg aga tgt 2514

Ala Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Ser Arg Gln Glu Leu Arg Cys 795 800 805

gga agt gga gtg ttc ata cac aat gat gtg gag gct tgg atg gac cgg 2 562

Gly Ser Gly Val Phe Ile His Asn Asp Val Glu Ala Trp Met Asp Arg 810 815 820 10

tac aag tat tac cct gaa acg cca caa ggc cta gcc aag ate att cag 2610

Tyr Lys Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gln Gly Leu Ala Lys Ile Ile Gln

825 830 835

aaa gct cat aag gaa gga gtg tgc ggt cta cga tca gtt tcc aga ctg 2658 Lys Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Leu Arg Ser Val Ser Arg Leu

840 845 850

gag cat caa atg tgg gaa gea gtg aag gac gag ctg aac act ctt ttg 2706

Glu His Gln Met Trp Glu Ala Val Lys Asp Glu Leu Asn Thr Leu Leu 855 860 865 870

aag gag aat ggt gtg gac ctt agt gtc gtg gtt gag aaa cag gag gga 2754

Lys Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Val Val Val Glu Lys Gln Glu Gly

875 880 885

atg tac aag tca gea cct aaa cgc ctc acc gcc acc acg gaa aaa ttg 2802

Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr Thr Glu Lys Leu 890 895 900

gaa att ggc tgg aag gcc tgg gga aag agt att tta ttt gea cca gaa 2850

Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu

905 910 915

ctc gcc aac aac acc ttt gtg gtt gat ggt ccg gag acc aag gaa tgt 2898

Leu Ala Asn Asn Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys 920 925 930

ccg act cag aat cgc gct tgg aat age tta gaa gtg gag gat ttt gga 2946

Pro Thr Gln Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Phe Gly 935 940 945 950

ttt ggt ctc acc age act cgg atg ttc ctg aag gtc aga gag age aac 2994 Phe Gly Leu Thr Ser Thr Arg Met Phe Leu Lys Val Arg Glu Ser Asn

955 960 965

aca act gaa tgt gac tcg aag ate att gga acg gct gtc aag aac aac 3042

Thr Thr Glu Cys Asp Ser Lys Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Asn Asn 970 975 980

ttg gcg ate cac agt gac ctg tcc tat tgg att gaa age agg ctc aat 3090

Leu Ala Ile His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Leu Asn 985

gat acg tgg aag ctt

Asp Thr Trp Lys Leu 1000

tgt acg tgg cct gag

Cys Thr Trp Pro Glu 1015

gag agt gac ttg ata

Glu Ser Asp Leu Ile

1030

aat cac aat cgg aga Asn His Asn Arg Arg 1045

tgg gac gaa ggc cgg

Trp Asp Glu Gly Arg 1060

act acg gtc acc ctg Thr Thr Val Thr Leu 1075

act cgc acc acc aca Thr Arg Thr Thr Thr 1090

tgc agg age tgc acc Cys Arg Ser Cys Thr

1105

ggc tgt tgg tat ggt Gly Cys Trp Tyr Gly 1120

aag acc ctc gtg cag

Lys Thr Leu Val Gln 1135

att gac cct ttt cag

990

gaa agg gea gtt ctg ggt Glu Arg Ala Val Leu Gly

1005

acg cat acc ttg tgg ggc Thr His Thr Leu Trp Gly

1020

ata cca gtc aca ctg gcg Ile Pro Val Thr Leu Ala 1035

cct ggg tac aag aca caa Pro Gly Tyr Lys Thr Gln 1050

gta gag att gac ttc gat Val Glu Ile Asp Phe Asp 1065

agt gag age tgc gga cac Ser Glu Ser Cys Gly His 1080

gag age gga aag ttg ata

Glu Ser Gly Lys Leu Ile 1095

tta cca cca ctg cgc tac Leu Pro Pro Leu Arg Tyr 1110

atg gag ate aga cca cag Met Glu Ile Arg Pro Gln 1125

tca caa gtg aat gct tat Ser Gln Val Asn Ala Tyr 1140

ttg ggc ctt ctg gtc gtg

995

gaa gtc aaa tca 313 5

Glu Val Lys Ser 1010

gat gga ate ctt 3180

Asp Gly Ile Leu

1025

gga cca cga age 3225

Gly Pro Arg Ser

1040

aac cag ggc cca 3270

Asn Gln Gly Pro

1055

tac tgc cca gga 3 315

Tyr Cys Pro Gly

1070

cgt gga cct gcc 3360

Arg Gly Pro Ala

1085

aca gat tgg tgc 3405

Thr Asp Trp Cys 1100

caa act gac age 3450

Gln Thr Asp Ser

1115

aga cat gat gaa 3495

Arg His Asp Glu

1130

aat gct gat atg 3 540

Asn Ala Asp Met

1145

ttc ttg gcc acc 3585 Ile Asp Pro Phe Gln 1150

cag gag gtc ctt cgc

Gln Glu Val Leu Arg 1165

gct ata ctg att gct

Ala Ile Leu Ile Ala 1180

tac act gat gtg tta

Tyr Thr Asp Val Leu 1195

gca gaa tct aat tcg

Ala Glu Ser Asn Ser 1210

gcg acc ttc aag ata

Ala Thr Phe Lys Ile 1225

aaa gcg aga tgg acc

Lys Ala Arg Trp Thr

1240

gct gtt ttc ttt caa

Ala Val Phe Phe Gln 1255

ctc tgg gag ate cct

Leu Trp Glu Ile Pro 1270

atg ata ctg aga gcc

Met Ile Leu Arg Ala 1285

gtt ccg ctg cta gcc

Val Pro Leu Leu Ala 1300

Leu Gly Leu Leu Val Val 1155

aag agg tgg aca gcc aag Lys Arg Trp Thr Ala Lys 1170

ctg cta gtc ctg gtg ttt Leu Leu Val Leu Val Phe 1185

cgc tat gtc ate ttg gtg Arg Tyr Val Ile Leu Val 1200

gga gga gac gtg gta cac Gly Gly Asp Val Val His 1215

caa cca gtg ttt atg gtg Gln Pro Val Phe Met Val 1230

aac cag gag aac att ttg Asn Gln Glu Asn Ile Leu 1245

atg gct tat cac gat gcc Met Ala Tyr His Asp Ala 1260

gat gtg ttg aat tca ctg Asp Val Leu Asn Ser Leu 1275

ata aca ttc aca acg aca Ile Thr Phe Thr Thr Thr 1290

ctg cta aca ccc ggg ctg Leu Leu Thr Pro Gly Leu 1305

Phe Leu Ala Thr 1160

ate age atg cca 3630

Ile Ser Met Pro

1175

ggg ggc att act 3675

Gly Gly Ile Thr

1190

ggg gca gct ttc 372 0

Gly Ala Ala Phe

1205

ttg gcg ctc atg 3765

Leu Ala Leu Met 1220

gca tcg ttt ctc 3810

Ala Ser Phe Leu

1235

ttg atg ttg gcg 3855

Leu Met Leu Ala

1250

cgc caa att ctg 3900

Arg Gln Ile Leu

1265

gcg gta gct tgg 3945

Ala Val Ala Trp 1280

tca aac gtg gtt 3990

Ser Asn Val Val

1295

aga tgc ttg aat 403 5

Arg Cys Leu Asn

1310 ctg gat gtg tac agg

Leu Asp Val Tyr Arg 1315

ttg ate agg gag aag

Leu Ile Arg Glu Lys 1330

agt ctg cta tgc ttg

Ser Leu Leu Cys Leu 1345

atg ate ctt gct gct

Met Ile Leu Ala Ala 1360

cgc gga tgg ccc gea

Arg Gly Trp Pro Ala

1375

ttt gcc ate gtc gga

Phe Ala Ile Val Gly 1390

gcc att cca atg act

Ala Ile Pro Met Thr

1405

att tet ggg aaa tca

Ile Ser Gly Lys Ser 1420

att tcc tgg gaa agt

Ile Ser Trp Glu Ser 1435

gtt gat gtg cgg ctt Val Asp Val Arg Leu

1450

gat cca gga gea cct Asp Pro Gly Ala Pro

ata ctg ctg ttg atg gtc Ile Leu Leu Leu Met Val 1320

agg agt gea gct gea aaa Arg Ser Ala Ala Ala Lys 1335

gct cta gcc tca aca gga Ala Leu Ala Ser Thr Gly 1350

gga ctg att gea tgt gat Gly Leu Ile Ala Cys Asp 1365

act gaa gtg atg aca gct Thr Glu Val Met Thr Ala 1380

ggg ctg gea gag ctt gac Gly Leu Ala Glu Leu Asp 1395

ate gcg ggg etc atg ttt Ile Ala Gly Leu Met Phe 1410

aca gat atg tgg att gag Thr Asp Met Trp Ile Glu 1425

gat gea gaa att aca ggc Asp Ala Glu Ile Thr Gly 1440

gat gat gat gga aac ttc Asp Asp Asp Gly Asn Phe 1455

tgg aag ata tgg atg ctc Trp Lys Ile Trp Met Leu

gga ata ggc age 4080

Gly Ile Gly Ser

1325

aag aaa gga gea 4125

Lys Lys Gly Ala

1340

ctt ttc aac ccc 4170

Leu Phe Asn Pro

1355

ccc aac cgt aaa 4215

Pro Asn Arg Lys

1370

gtc ggc cta atg 4260

Val Gly Leu Met

1385

att gac tcc atg 4305

Ile Asp Ser Met

1400

gct gct ttc gtg 4350

Ala Ala Phe Val

1415

aga acg gcg gac 43 95

Arg Thr Ala Asp

1430

tcg age gaa aga 4440

Ser Ser Glu Arg

1445

cag ctc atg aat 4485

Gln Leu Met Asn

1460

aga atg gtc tgt 453 0

Arg Met Val Cys 1465 1470 1475

ctc gcg att agt gcg tac acc ccc tgg gca ate ttg ccc tca gta 4575

Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Thr Pro Trp Ala Ile Leu Pro Ser Val 1480 1485 1490

gtt gga ttt tgg ata act ctc caa tac aca aag aga gga ggc gtg 4620

Val Gly Phe Trp Ile Thr Leu Gln Tyr Thr Lys Arg Gly Gly Val

1495 1500 1505

ttg tgg gac act ccc tca cca aag gag tac aaa aag ggg gac acg 4665

Leu Trp Asp Thr Pro Ser Pro Lys Glu Tyr Lys Lys Gly Asp Thr 1510 1515 1520

acc acc ggc gtc tac agg ate atg act cgt ggg ctg ctc ggc agt 4710

Thr Thr Gly Val Tyr Arg Ile Met Thr Arg Gly Leu Leu Gly Ser

1525 1530 1535

tat caa gca gga gcg ggc gtg atg gtt gaa ggt gtt ttc cac acc 4755

Tyr Gln Ala Gly Ala Gly Val Met Val Glu Gly Val Phe His Thr 1540 1545 1550

ctt tgg cat aca aca aaa gga gcc gct ttg atg age gga gag ggc 4800

Leu Trp His Thr Thr Lys Gly Ala Ala Leu Met Ser Gly Glu Gly 1555 1560 1565

cgc ctg gac cca tac tgg ggc agt gtc aag gag gat cga ctt tgt 4845

Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Ser Val Lys Glu Asp Arg Leu Cys

1570 1575 1580

tac gga gga ccc tgg aaa ttg cag cac aag tgg aac ggg cag gat 4890

Tyr Gly Gly Pro Trp Lys Leu Gln His Lys Trp Asn Gly Gln Asp 1585 1590 1595

gag gtg cag atg att gtg gtg gaa cct ggc aag aac gtt aag aac 4935

Glu Val Gln Met Ile Val Val Glu Pro Gly Lys Asn Val Lys Asn

1600 1605 1610

gtc cag acg aaa cca ggg gtg ttc aaa aca cct gaa gga gaa ate 4980

Val Gln Thr Lys Pro Gly Val Phe Lys Thr Pro Glu Gly Glu Ile 1615 1620 1625

ggg gcc gtg act ttg gac ttc ccc act gga aca tca ggc tca cca 5025 Gly Ala Val Thr Leu 1630

ata gtg gac aaa aac Ile Val Asp Lys Asn 1645

gtc ata atg ccc aac Val Ile Met Pro Asn 1660

gaa agg atg gat gag

Glu Arg Met Asp Glu 1675

ctg agg aaa aaa cag Leu Arg Lys Lys Gln 1690

ggt aaa aca agg agg Gly Lys Thr Arg Arg 1705

aac aga aga ctg aga Asn Arg Arg Leu Arg

1720

gct gct gag atg gct Ala Ala Glu Met Ala 1735

cag aca tcc gca gtg

Gln Thr Ser Ala Val 1750

gat gtc atg tgt cat Asp Val Met Cys His 1765

cac agg gtg ccg aac His Arg Val Pro Asn 1780

Asp Phe Pro Thr Gly Thr 1635

ggt gat gtg att ggg ctt Gly Asp Val Ile Gly Leu 1650

ggc tca tac ata age gcg Gly Ser Tyr Ile Ser Ala 1665

cca ate cca gcc gga ttc Pro Ile Pro Ala Gly Phe 1680

ate act gta ctg gat ctc Ile Thr Val Leu Asp Leu 1695

att ctg cca cag ate ate Ile Leu Pro Gln Ile Ile 1710

aca gcc gtg cta gca cca Thr Ala Val Leu Ala Pro 1725

gaa gca ctg aga gga ctg Glu Ala Leu Arg Gly Leu 1740

ccc aga gaa cat aat gga Pro Arg Glu His Asn Gly 1755

gct acc ctc acc cac agg Ala Thr Leu Thr His Arg 1770

tac aac ctg ttc gtg atg Tyr Asn Leu Phe Val Met 1785

Ser Gly Ser Pro 1640

tat ggc aat gga 5070

Tyr Gly Asn Gly

1655

ata gtg cag ggt 5115

Ile Val Gln Gly

1670

gaa cct gag atg 5160

Glu Pro Glu Met

1685

cat ccc ggc gcc 5205

His Pro Gly Ala

1700

aaa gag gcc ata 52 50

Lys Glu Ala Ile

1715

acc agg gtt gtg 5295

Thr Arg Val Val

1730

ccc ate cgg tac 5340

Pro Ile Arg Tyr

1745

aat gag att gtt 5385

Asn Glu Ile Val

1760

ctg atg tet cct 5430

Leu Met Ser Pro

1775

gat gag gct cat 5475

Asp Glu Ala His

1790 10

ttc acc gac cca gct age att gea gea aga ggt tac att tcc aca 5520

Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile Ser Thr

1795 1800 1805

aag gtc gag cta ggg gag gcg gcg gea ata ttc atg aca gcc acc 5565

Lys Val Glu Leu Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr Ala Thr

1810 1815 1820

cca cca ggc act tca gat cca ttc cca gag tcc aat tca cca att 5610

Pro Pro Gly Thr Ser Asp Pro Phe Pro Glu Ser Asn Ser Pro Ile

1825 1830 1835

tcc gac tta cag act gag ate ccg gat cga gct tgg aac tet gga 5655

Ser Asp Leu Gln Thr Glu Ile Pro Asp Arg Ala Trp Asn Ser Gly

1840 1845 1850

tac gaa tgg ate aca gaa tac acc ggg aag acg gtt tgg ttt gtg 5700

Tyr Glu Trp Ile Thr Glu Tyr Thr Gly Lys Thr Val Trp Phe Val 1855 1860 1865

cct agt gtc aag atg ggg aat gag att gcc ctt tgc cta caa cgt 5745

Pro Ser Val Lys Met Gly Asn Glu Ile Ala Leu Cys Leu Gln Arg

1870 1875 1880

gct gga aag aaa gta gtc caa ttg aac aga aag tcg tac gag acg 5790

Ala Gly Lys Lys Val Val Gln Leu Asn Arg Lys Ser Tyr Glu Thr 1885 1890 1895

gag tac cca aaa tgt aag aac gat gat tgg gac ttt gtt ate aca 5835

Glu Tyr Pro Lys Cys Lys Asn Asp Asp Trp Asp Phe Val Ile Thr 1900 1905 1910

aca gac ata tet gaa atg ggg gct aac ttc aag gcg age agg gtg 5880

Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Ser Arg Val

1915 1920 1925

att gac age cgg aag agt gtg aaa cca acc ate ata aca gaa gga 5925

Ile Asp Ser Arg Lys Ser Val Lys Pro Thr Ile Ile Thr Glu Gly 1930 1935 1940

gaa ggg aga gtg ate ctg gga gaa cca tet gea gtg aca gea gct 5970

Glu Gly Arg Val Ile Leu Gly Glu Pro Ser Ala Val Thr Ala Ala 1945 1950 1955

agt gcc gcc cag aga cgt gga cgt ate ggt aga aat ccg tcg caa 6015

Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Ser Gln 1960 1965 1970

gtt ggt gat gag tac tgt tat ggg ggg cac acg aat gaa gac gac 6060

Val Gly Asp Glu Tyr Cys Tyr Gly Gly His Thr Asn Glu Asp Asp

1975 1980 1985

tcg aac ttc gcc cat tgg act gag gea cga ate atg ctg gac aac 6105

Ser Asn Phe Ala His Trp Thr Glu Ala Arg Ile Met Leu Asp Asn 1990 1995 2000

ate aac atg cca aac gga ctg ate gct caa ttc tac caa cca gag 6150

Ile Asn Met Pro Asn Gly Leu Ile Ala Gln Phe Tyr Gln Pro Glu

2005 2010 2015

cgt gag aag gta tat acc atg gat ggg gaa tac cgg ctc aga gga 6195

Arg Glu Lys Val Tyr Thr Met Asp Gly Glu Tyr Arg Leu Arg Gly 2020 2025 2030

gaa gag aga aaa aac ttt ctg gaa ctg ttg agg act gea gat ctg 6240

Glu Glu Arg Lys Asn Phe Leu Glu Leu Leu Arg Thr Ala Asp Leu 2035 2040 2045

cca gtt tgg ctg gct tac aag gtt gea gcg gct gga gtg tca tac 6285

Pro Val Trp Leu Ala Tyr Lys Val Ala Ala Ala Gly Val Ser Tyr

2050 2055 2060

cac gac cgg agg tgg tgc ttt gat ggt cct agg aca aac aca att 6330

His Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Pro Arg Thr Asn Thr Ile 2065 2070 2075

tta gaa gac aac aac gaa ctg gaa gtc ate acg aag ctt ggt gaa 6375

Leu Glu Asp Asn Asn Glu Val Glu Val Ile Thr Lys Leu Gly Glu

2080 2085 2090

agg aag att ctg agg ccg cgc tgg att gac gcc agg gtg tac tcg 642 0

Arg Lys Ile Leu Arg Pro Arg Trp Ile Asp Ala Arg Val Tyr Ser 2095 2100 2105

gat cac cag gea cta aag gcg ttc aag gac ttc gcc tcg gga aaa 6465 Asp His Gln Ala Leu Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ala Ser Gly Lys

2110 2115 2120

cgt tct cag ata ggg ctc att gag gtt ctg gga aag atg cct gag 6510

Arg Ser Gln Ile Gly Leu Ile Glu Val Leu Gly Lys Met Pro Glu

2125 2130 2135

cac ttc atg ggg aag aca tgg gaa gca ctt gac acc atg tac gtt 6555

His Phe Met Gly Lys Thr Trp Glu Ala Leu Asp Thr Met Tyr Val

2140 2145 2150

gtg gcc act gca gag aaa gga gga aga gct cac aga atg gcc ctg 6600

Val Ala Thr Ala Glu Lys Gly Gly Arg Ala His Arg Met Ala Leu

2155 2160 2165

gag gaa ctg cca gat gct ctt cag aca att gcc ttg att gcc tta 6645

Glu Glu Leu Pro Asp Ala Leu Gln Thr Ile Ala Leu Ile Ala Leu

2170 2175 2180

ttg agt gtg atg acc atg gga gta ttc ttc ctc ctc atg cag cgg 6690

Leu Ser Val Met Thr Met Gly Val Phe Phe Leu Leu Met Gln Arg

2185 2190 2195

aag ggc att gga aag ata ggt ttg gga ggc gct gtc ttg gga gtc 6735

Lys Gly Ile Gly Lys Ile Gly Leu Gly Gly Ala Val Leu Gly Val

2200 2205 2210

gcg acc ttt ttc tgt tgg atg gct gaa gtt cca gga acg aag ate 6780

Ala Thr Phe Phe Cys Trp Met Ala Glu Val Pro Gly Thr Lys Ile

2215 2220 2225

gcc gga atg ttg ctg ctc tcc ctt ctc ttg atg att gtg cta att 6825

Ala Gly Met Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Met Ile Val Leu Ile 2230 2235 2240

cct gag cca gag aag caa cgt tcg cag aca gac aac cag cta gcc 6870

Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Gln Thr Asp Asn Gln Leu Ala 2245 2250 2255

gtg ttc ctg att tgt gtc atg acc ctt gtg age gca gtg gca gcc 6915

Val Phe Leu Ile Cys Val Met Thr Leu Val Ser Ala Val Ala Ala 2260 2265 2270 10

aac gag atg ggt tgg cta gat aag acc aag agt gac ata age agt 6960

Asn Glu Met Gly Trp Leu Asp Lys Thr Lys Ser Asp Ile Ser Ser

2275 2280 2285

ttg ttt ggg caa aga att gag gtc aag gag aat ttc age atg gga 7005

Leu Phe Gly Gln Arg Ile Glu Val Lys Glu Asn Phe Ser Met Gly

2290 2295 2300

gag ttt ctt ttg gac ttg agg ccg gea aca gcc tgg tca ctg tac 7050

Glu Phe Leu Leu Asp Leu Arg Pro Ala Thr Ala Trp Ser Leu Tyr

2305 2310 2315

gct gtg aca aca gcg gtc ctc act cca ctg cta aag cat ttg ate 7095

Ala Val Thr Thr Ala Val Leu Thr Pro Leu Leu Lys His Leu Ile

2320 2325 2330

acg tca gat tac ate aac acc tca ttg acc tca ata aac gtt cag 7140

Thr Ser Asp Tyr Ile Asn Thr Ser Leu Thr Ser Ile Asn Val Gln

2335 2340 2345

gea agt gea cta ttc aca ctc gcg cga ggc ttc ccc ttc gtc gat 7185

Ala Ser Ala Leu Phe Thr Leu Ala Arg Gly Phe Pro Phe Val Asp

2350 2355 2360

gtt gga gtg tcg gct ctc ctg cta gea gcc gga tgc tgg gga caa 7230

Val Gly Val Ser Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Cys Trp Gly Gln 2365 2370 2375

gtc acc ctc acc gtt acg gta aca gcg gea aca ctc ctt ttt tgc 7275

Val Thr Leu Thr Val Thr Val Thr Ala Ala Thr Leu Leu Phe Cys 2380 2385 2390

cac tat gcc tac atg gtt ccc ggt tgg caa gct gag gea atg cgc 7320

His Tyr Ala Tyr Met Val Pro Gly Trp Gln Ala Glu Ala Met Arg

2395 2400 2405

tca gcc cag cgg cgg aca gcg gcc gga ate atg aag aac gct gta 7365

Ser Ala Gln Arg Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn Ala Val 2410 2415 2420

gtg gat ggc ate gtg gcc acg gac gtc cca gaa tta gag cgc acc 7410

Val Asp Gly Ile Val Ala Thr Asp Val Pro Glu Leu Glu Arg Thr 2425 2430 2435

aca ccc ate atg cag aag aaa gtt gga cag ate atg ctg ate ttg 7455

Thr Pro Ile Met Gln Lys Lys Val Gly Gln Ile Met Leu Ile Leu 2440 2445 2450

gtg tet cta gct gea gta gta gtg aac ccg tet gtg aag aca gta 7500

Val Ser Leu Ala Ala Val Val Val Asn Pro Ser Val Lys Thr Val

2455 2460 2465

cga gaa gcc gga att ttg ate acg gcc gea gcg gtg acg ctt tgg 7545

Arg Glu Ala Gly Ile Leu Ile Thr Ala Ala Ala Val Thr Leu Trp 2470 2475 2480

gag aat gga gea age tet gtt tgg aac gea aca act gcc ate gga 7590

Glu Asn Gly Ala Ser Ser Val Trp Asn Ala Thr Thr Ala Ile Gly

2485 2490 2495

ctc tgc cac ate atg cgt ggg ggt tgg ttg tca tgt cta tcc ata 7635

Leu Cys His Ile Met Arg Gly Gly Trp Leu Ser Cys Leu Ser Ile 2500 2505 2510

aca tgg aca ctc ata aag aac atg gaa aaa cca gga cta aaa aga 7680

Thr Trp Thr Leu Ile Lys Asn Met Glu Lys Pro Gly Leu Lys Arg 2515 2520 2525

ggt ggg gea aaa gga cgc acc ttg gga gag gtt tgg aaa gaa aga 7725

Gly Gly Ala Lys Gly Arg Thr Leu Gly Glu Val Trp Lys Glu Arg

2530 2535 2540

ctc aac cag atg aca aaa gaa gag ttc act agg tac cgc aaa gag 7770

Leu Asn Gln Met Thr Lys Glu Glu Phe Thr Arg Tyr Arg Lys Glu 2545 2550 2555

gcc ate ate gaa gtc gat cgc tca gcg gea aaa cac gcc agg aaa 7815

Ala Ile Ile Glu Val Asp Arg Ser Ala Ala Lys His Ala Arg Lys

2560 2565 2570

gaa ggc aat gtc act gga ggg cat cca gtc tet agg ggc aca gea 7860

Glu Gly Asn Val Thr Gly Gly His Pro Val Ser Arg Gly Thr Ala 2575 2580 2585

aaa ctg aga tgg ctg gtc gaa cgg agg ttt ctc gaa ccg gtc gga 7905 Lys Leu Arg Trp Leu 2590

aaa gtg att gac ctt Lys Val Ile Asp Leu 2605

atg gca acc caa aaa Met Ala Thr Gln Lys 2620

ggc ggt ccc gga cat Gly Gly Pro Gly His 2635

tgg aac att gtc acc Trp Asn Ile Val Thr 2650

cct tct gag tgt tgt Pro Ser Glu Cys Cys 2665

tcg tca agt gct gag Ser Ser Ser Ala Glu 2680

gaa atg gtt gag gac Glu Met Val Glu Asp 2695

gtg aag gtg ctc tgc Val Lys Val Leu Cys 2710

gag ctg ctc caa cgc Glu Leu Leu Gln Arg 2725

ctc tca cgg aat tcc Leu Ser Arg Asn Ser 2740

Val Glu Arg Arg Phe Leu 2595

gga tgt gga aga ggc ggt Gly Cys Gly Arg Gly Gly 2610

aga gtc caa gaa gtc aga Arg Val Gln Glu Val Arg 2625

gaa gag ccc caa cta gtg Glu Glu Pro Gln Leu Val 2640

atg aag agt gga gtg gat Met Lys Ser Gly Val Asp 2655

gac acc ctc ctt tgt gac Asp Thr Leu Leu Cys Asp 2670

gtt gaa gag cat agg acg Val Glu Glu His Arg Thr 2685

tgg ctg cac cga ggg cca Trp Leu His Arg Gly Pro 2700

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cgg tat ggg ggg gga ctg Arg Tyr Gly Gly Gly Leu 2730

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Glu Pro Val Gly 2600

tgg tgt tac tat 7 950

Trp Cys Tyr Tyr

2615

ggg tac aca aag 7995

Gly Tyr Thr Lys

2630

caa agt tat gga 8040

Gln Ser Tyr Gly

2645

gtg ttc tac aga 8085

Val Phe Tyr Arg 2660

ate gga gag tcc 8130

Ile Gly Glu Ser

2675

att cgg gtc ctt 8175

Ile Arg Val Leu

2690

agg gaa ttt tgc 8220

Arg Glu Phe Cys

2705

ata gag aag atg 8265

Ile Glu Lys Met

2720

gtc aga aac cca 8310

Val Arg Asn Pro

2735

gtg agt cga gct 8355

Val Ser Arg Ala

2750 10

15

20

25

30

tca ggc aat gtg gta cat tca gtg aat atg acc age cag gtg ctc 8400

Ser Gly Asn Val Val His Ser Val Asn Met Thr Ser Gln Val Leu

2755 2760 2765

cta gga aga atg gaa aaa agg acc tgg aag gga ccc caa tac gag 8445

Leu Gly Arg Met Glu Lys Arg Thr Trp Lys Gly Pro Gln Tyr Glu

2770 2775 2780

gaa gat gta aac ttg gga agt gga acc agg gcg gtg gga aaa ccc 8490

Glu Asp Val Asn Leu Gly Ser Gly Thr Arg Ala Val Gly Lys Pro

2785 2790 2795

ctg ctc aac tca gac acc agt aaa ate aag aac agg att gaa cga 8535

Leu Leu Asn Ser Asp Thr Ser Lys Ile Lys Asn Arg Ile Glu Arg

2800 2805 2810

ctc agg cgt gag tac agt tcg acg tgg cac cac gat gag aac cac 8580

Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Ser Thr Trp His His Asp Glu Asn His

2815 2820 2825

cca tat aga acc tgg aac tat cac ggc agt tat gat gtg aag ccc 862 5

Pro Tyr Arg Thr Trp Asn Tyr His Gly Ser Tyr Asp Val Lys Pro

2830 2835 2840

aca ggc tcc gcc agt tcg ctg gtc aat gga gtg gtc agg ctc ctc 8670

Thr Gly Ser Ala Ser Ser Leu Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu

2845 2850 2855

tca aaa cca tgg gac acc ate acg aat gtt acc acc atg gcc atg 8715

Ser Lys Pro Trp Asp Thr Ile Thr Asn Val Thr Thr Met Ala Met

2860 2865 2870

act gac act act ccc ttc ggg cag cag cga gtg ttc aaa gag aag 8760

Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys

2875 2880 2885

gtg gac acg aaa gct cct gaa ccg cca gaa gga gtg aag tac gtg 8805

Val Asp Thr Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu Gly Val Lys Tyr Val

2890 2895 2900

ctc aat gag acc acc aac tgg ttg tgg gcg ttt ttg gcc aga gaa 8850

Leu Asn Glu Thr Thr Asn Trp Leu Trp Ala Phe Leu Ala Arg Glu 2905

aaa cgt ccc aga atg Lys Arg Pro Arg Met 2920

aac age aat gea gct Asn Ser Asn Ala Ala 2935

tgg agg age gcc aga Trp Arg Ser Ala Arg

2950

atg gtg gat gag gag Met Val Asp Glu Glu 2965

act tgc att tac aac

Thr Cys Ile Tyr Asn 2980

gag ttc gga aag gcc Glu Phe Gly Lys Ala 2995

ctc gga gct cgc ttt Leu Gly Ala Arg Phe 3010

gaa gac cac tgg ctt Glu Asp His Trp Leu

3025

ggc ttg ggc ctc caa Gly Leu Gly Leu Gln 3040

acc cgg cct ggg ggc

Thr Arg Pro Gly Gly 3055

gac acc cgc ate acg

2910

tgc tet cga gag gaa ttc Cys Ser Arg Glu Glu Phe 2925

ttg ggt gcc atg ttt gaa Leu Gly Ala Met Phe Glu 2940

gaa gea gtt gaa gat cca Glu Ala Val Glu Asp Pro 2955

cgc gag gea cat ctg cgg Arg Glu Ala His Leu Arg 2970

atg atg gga aag aga gag Met Met Gly Lys Arg Glu 2985

aag gga age aga gcc att Lys Gly Ser Arg Ala Ile 3000

ctg gag ttc gag gct ctg

Leu Glu Phe Glu Ala Leu 3015

gga aga aag aac tca gga Gly Arg Lys Asn Ser Gly 3030

aaa ctg ggt tac ate ctg Lys Leu Gly Tyr Ile Leu 3045

aag ate tat gct gat gac Lys Ile Tyr Ala Asp Asp 3060

aga gct gac ttg gaa aat

2915

ata aga aag gtc 8895

Ile Arg Lys Val

2930

gag cag aat caa 8940

Glu Gln Asn Gln

2945

aaa ttt tgg gag 8985

Lys Phe Trp Glu

2960

ggg gaa tgt cac 9030

Gly Glu Cys His

2975

aaa aaa ccc gga 9075

Lys Lys Pro Gly

2990

tgg ttc atg tgg 9120

Trp Phe Met Trp

3005

ggt ttt ctc aat 9165

Gly Phe Leu Asn

3020

gga ggt gtc gag 9210

Gly Gly Val Glu

3035

cgt gaa gtt ggc 92 55

Arg Glu Val Gly

3050

aca gct ggc tgg 93 00

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3065

gaa gct aag gtg 9345 Asp Thr Arg Ile Thr 3070

ctt gag ctg ctt gat Leu Glu Leu Leu Asp 3085

att gag ctc acc tat Ile Glu Leu Thr Tyr 3100

gct gct gat gga aga Ala Ala Asp Gly Arg 3115

cag agg ggg agt gga Gln Arg Gly Ser Gly 3130

acc aac ctg gcc gtc Thr Asn Leu Ala Val 3145

gtg att ggc cca gat Val Ile Gly Pro Asp

3160

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age cgc atg gct gtc

Ser Arg Met Ala Val 3190

gac gat cgc ttt gcc Asp Asp Arg Phe Ala 3205

aag gtt cgc aaa gac Lys Val Arg Lys Asp 3220

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cgt cac aaa gtt gtg aaa Arg His Lys Val Val Lys

3105

acc gtc atg gat gtt ate Thr Val Met Asp Val Ile 3120

caa gtt gtc acc tac gcc Gln Val Val Thr Tyr Ala 3135

cag ctg gtg agg atg atg Gln Leu Val Arg Met Met 3150

gat gtg gag aaa ctc aca Asp Val Glu Lys Leu Thr 3165

tgg ctg ttt gag aat ggg Trp Leu Phe Glu Asn Gly 3180

agt gga gat gac tgt gtg Ser Gly Asp Asp Cys Val 3195

acc tcg ctc cac ttc ctc Thr Ser Leu His Phe Leu 3210

ate caa gag tgg aaa ccg Ile Gln Glu Trp Lys Pro 3225

Glu Ala Lys Val 3080

gcc agg gcc ate 9390

Ala Arg Ala Ile

3095

gtg atg cgc ccg 9435

Val Met Arg Pro

3110

tcc aga gaa gat 9480

Ser Arg Glu Asp

3125

cta aac act ttc 9525

Leu Asn Thr Phe

3140

gaa ggg gaa gga 957 0

Glu Gly Glu Gly

3155

aaa ggg aaa gga 9615

Lys Gly Lys Gly

3170

gaa gaa aga ctc 9660

Glu Glu Arg Leu

3185

gta aag ccc ctg 9705

Val Lys Pro Leu

3200

aat gct atg tca 9750

Asn Ala Met Ser

3215

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Ser Thr Gly Trp

3230 10

15

20

25

30

tat gat tgg cag cag gtt cca ttt tgc tca aac cat ttc act gaa 9840

Tyr Asp Trp Gln Gln Val Pro Phe Cys Ser Asn His Phe Thr Glu

3235 3240 3245

ttg ate atg aaa gat gga aga aca ctg gtg gtt cca tgc cga gga 9885

Leu Ile Met Lys Asp Gly Arg Thr Leu Val Val Pro Cys Arg Gly

3250 3255 3260

cag gat gaa ttg gta ggc aga gct cgc ata tet cca ggg gcc gga 9930

Gln Asp Glu Leu Val Gly Arg Ala Arg Ile Ser Pro Gly Ala Gly

3265 3270 3275

tgg aac gtc cgc gac act gct tgt ctg gct aag tet tat gcc cag 9975

Trp Asn Val Arg Asp Thr Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln

3280 3285 3290

atg tgg ctg ctt ctg tac ttc cac aga aga gac ctg cgg ctc atg 10020

Met Trp Leu Leu Leu Tyr Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met

3295 3300 3305

gcc aac gcc att tgc tcc gct gtc cct gtg aat tgg gtc cct acc 10065

Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val Pro Val Asn Trp Val Pro Thr

3310 3315 3320

gga aga acc acg tgg tcc ate cat gea gga gga gag tgg atg aca 10110

Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Ala Gly Gly Glu Trp Met Thr

3325 3330 3335

aca gag gac atg ttg gag gtc tgg aac cgt gtt tgg ata gag gag 10155

Thr Glu Asp Met Leu Glu Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu

3340 3345 3350

aat gaa tgg atg gaa gac aaa acc cca gtg gag aaa tgg agt gac 10200

Asn Glu Trp Met Glu Asp Lys Thr Pro Val Glu Lys Trp Ser Asp

3355 3360 3365

gtc cca tat tca gga aaa cga gag gac ate tgg tgt ggc age ctg 10245

Val Pro Tyr Ser Gly Lys Arg Glu Asp Ile Trp Cys Gly Ser Leu

3370 3375 3380

att ggc aca aga gcc cga gcc acg tgg gea gaa aac ate cag gtg 10290

Ile Gly Thr Arg Ala Arg Ala Thr Trp Ala Glu Asn Ile Gln Val 3385 3390 3395

gct ate aac caa gtc aga gea ate ate gga gat gag aag tat gtg 10335

Ala Ile Asn Gln Val Arg Ala Ile Ile Gly Asp Glu Lys Tyr Val 3400 3405 3410

gat tac atg agt tca cta aag aga tat gaa gac aca act ttg gtt 103 80 Asp Tyr Met Ser Ser Leu Lys Arg Tyr Glu Asp Thr Thr Leu Val

3415 3420 3425

gag gac aca gta ctg tag atatttaatc aattgtaaat agacaatata 10428

Glu Asp Thr Val Leu 3430

agtatgcata aaagtgtagt tttatagtag tatttagtgg tgttagtgta aatagttaag 10488 aaaattttga ggagaaagtc aggccgggaa gttcccgcca ccggaagttg agtagacggt 10548 gctgcctgcg actcaacccc aggaggactg ggtgaacaaa gccgcgaagt gatccatgta 10608 agccctcaga accgtctcgg aaggaggacc ccacatgttg taacttcaaa gcccaatgtc 10668 agaccacgct acggcgtgct actctgcgga gagtgcagtc tgcgatagtg ccccaggagg 1072 8 actgggttaa caaaggcaaa ccaacgcccc acgcggccct agccccggta atggtgttaa 10788 ccagggcgaa aggactagag gttagaggag accccgcggt ttaaagtgca cggcccagcc 10848 tgactgaagc tgtaggtcag gggaaggact agaggttagt ggagaccccg tgccacaaaa 10908 caccacaaca aaacagcata ttgacacctg ggatagacta ggagatcttc tgctctgcac 10968 aaccagccac acggcacagt gcgccgacaa tggtggctgg tggtgcgaga acacaggatc 1102 8 t 11029

<210> 91 <211> 3433 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Construção sintética <400> 91

Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met

1 5 10 15

Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg 25 30 Ala Met Leu Ser Leu Ile Asp Gly Lys Gly Pro Ile Arg Phe Val Leu

40 45

Ala Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala Ile Ala Pro Thr Arg Ala

50 55 60

Val Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gln Thr Ala Met Lys His 65 70 75 80

Leu Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala Ile Asn

85 90 95

Arg Arg Ser Ser Lys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala

100 105 110

Val Met Ile Gly Leu Ile Ala Ser Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn

115 120 125

Phe Gln Gly Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp

130 135 140

Val Ile Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg 145 150 155 160

Ala Met Asp Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys

165 170 175

Pro Val Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys

180 185 190

Thr Lys Ser Ala Val Tyr Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg

195 200 205

His Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu

210 215 220

Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala 225 230 235 240

Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly

245 250 255

Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr

260 265 270

Met Gln Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala 275 280 285 Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly

290 295 300

Val Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys 305 310 315 320

Val Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met

325 330 335

Asn Met Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu

340 345 350

Ala Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly

355 360 365

Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln

370 375 380

Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys 385 390 395 400

Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile

405 410 415

Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe

420 425 430

Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln

435 440 445

Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro

450 455 460

Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys 465 470 475 480

Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val

485 490 495

Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn

500 505 510

Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr

515 520 525

Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala 530 535 540 Leu Gly Ser Gln Glu 545

Pro Val Glu Phe Ser 565

Lys Cys Arg Val Lys 580

Gly Val Cys Ser Lys 595

Gly His Gly Thr Val

610

Pro Cys Lys Val Pro 625

Pro Val Gly Arg Leu 645

Ala Asn Ala Lys Val 660

Tyr Ile Val Val Gly 675

Lys Ser Gly Ser Ser 690

Ala Gln Arg Leu Ala 705

Val Gly Gly Val Phe 725

Gly Gly Ala Phe Arg 740

Gly Leu Leu Gly Ala 755

Arg Ser Ile Ala Leu 770

Leu Ser Val Asn Val 785

Gly Ala Leu His Gln Ala 550 555

Ser Asn Thr Val Lys Leu 570

Met Glu Lys Leu Gln Leu 585

Ala Phe Lys Phe Leu Gly 600

Val Leu Glu Leu Gln Tyr 615

Ile Ser Ser Val Ala Ser 630 635

Val Thr Val Asn Pro Phe 650

Leu Ile Glu Leu Glu Pro 665

Arg Gly Glu Gln Gln Ile 680

Ile Gly Lys Ala Phe Thr 695

Ala Leu Gly Asp Thr Ala 710 715

Thr Ser Val Gly Lys Ala 730

Ser Leu Phe Gly Gly Met 745

Leu Leu Leu Trp Met Gly 760

Thr Phe Leu Ala Val Gly 775

His Ala Asp Thr Gly Cys 790 795

Leu Ala Gly Ala Ile 560

Thr Ser Gly His Leu 575

Lys Gly Thr Thr Tyr 590

Thr Pro Ala Asp Thr 605

Thr Gly Thr Asp Gly 620

Leu Asn Asp Leu Thr 640

Val Ser Val Ala Thr 655

Pro Phe Gly Asp Ser 670

Asn His His Trp His 685

Thr Thr Leu Lys Gly 700

Trp Asp Phe Gly Ser 720

Val His Gln Val Phe 735

Ser Trp Ile Thr Gln 750

Ile Asn Ala Arg Asp 765

Gly Val Leu Leu Phe 780

Ala Ile Asp Ile Ser 800 Arg Gln Glu Leu Arg Cys Gly Ser Gly Val Phe Ile His Asn Asp Val

805 810 815

Glu Ala Trp Met Asp Arg Tyr Lys Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gln Gly

820 825 830

Leu Ala Lys Ile Ile Gln Lys Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Leu

835 840 845

Arg Ser Val Ser Arg Leu Glu His Gln Met Trp Glu Ala Val Lys Asp

850 855 860

Glu Leu Asn Thr Leu Leu Lys Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Val Val 865 870 875 880

Val Glu Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr

885 890 895

Ala Thr Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser

900 905 910

Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu Ala Asn Asn Thr Phe Val Val Asp Gly

915 920 925

Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro Thr Gln Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu

930 935 940

Glu Val Glu Asp Phe Gly Phe Gly Leu Thr Ser Thr Arg Met Phe Leu 945 950 955 960

Lys Val Arg Glu Ser Asn Thr Thr Glu Cys Asp Ser Lys Ile Ile Gly

965 970 975

Thr Ala Val Lys Asn Asn Leu Ala Ile His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp

980 985 990

Ile Glu Ser Arg Leu Asn Asp Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Leu

995 1000 1005

Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp

1010 1015 1020

Gly Asp Gly Ile Leu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro Val Thr Leu

1025 1030 1035

Ala Gly Pro Arg Ser Asn His Asn Arg Arg Pro Gly Tyr Lys Thr 1040 1045 1050 Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Gly Arg Val Glu Ile Asp Phe

1055 1060 1065

Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Thr Val Thr Leu Ser Glu Ser Cys Gly

1070 1075 1080

His Arg Gly Pro Ala Thr Arg Thr Thr Thr Glu Ser Gly Lys Leu

1085 1090 1095

Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg

1100 1105 1110

Tyr Gln Thr Asp Ser Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro

1115 1120 1125

Gln Arg His Asp Glu Lys Thr Leu Val Gln Ser Gln Val Asn Ala

1130 1135 1140

Tyr Asn Ala Asp Met Ile Asp Pro Phe Gln Leu Gly Leu Leu Val

1145 1150 1155

Val Phe Leu Ala Thr Gln Glu Val Leu Arg Lys Arg Trp Thr Ala

1160 1165 1170

Lys Ile Ser Met Pro Ala Ile Leu Ile Ala Leu Leu Val Leu Val

1175 1180 1185

Phe Gly Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Val Leu Arg Tyr Val Ile Leu

1190 1195 1200

Val Gly Ala Ala Phe Ala Glu Ser Asn Ser Gly Gly Asp Val Val

1205 1210 1215

His Leu Ala Leu Met Ala Thr Phe Lys Ile Gln Pro Val Phe Met

1220 1225 1230

Val Ala Ser Phe Leu Lys Ala Arg Trp Thr Asn Gln Glu Asn Ile

1235 1240 1245

Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Phe Phe Gln Met Ala Tyr His Asp

1250 1255 1260

Ala Arg Gln Ile Leu Leu Trp Glu Ile Pro Asp Val Leu Asn Ser

1265 1270 1275

Leu Ala Val Ala Trp Met Ile Leu Arg Ala Ile Thr Phe Thr Thr 1280 1285 1290 Thr Ser Asn Val Val Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Thr Pro Gly

1295 1300 1305

Leu Arg Cys Leu Asn Leu Asp Val Tyr Arg Ile Leu Leu Leu Met

1310 1315 1320

Val Gly Ile Gly Ser Leu Ile Arg Glu Lys Arg Ser Ala Ala Ala

1325 1330 1335

Lys Lys Lys Gly Ala Ser Leu Leu Cys Leu Ala Leu Ala Ser Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Phe Asn Pro Met Ile Leu Ala Ala Gly Leu Ile Ala Cys

1355 1360 1365

Asp Pro Asn Arg Lys Arg Gly Trp Pro Ala Thr Glu Val Met Thr

1370 1375 1380

Ala Val Gly Leu Met Phe Ala Ile Val Gly Gly Leu Ala Glu Leu

1385 1390 1395

Asp Ile Asp Ser Met Ala Ile Pro Met Thr Ile Ala Gly Leu Met

1400 1405 1410

Phe Ala Ala Phe Val Ile Ser Gly Lys Ser Thr Asp Met Trp Ile

1415 1420 1425

Glu Arg Thr Ala Asp Ile Ser Trp Glu Ser Asp Ala Glu Ile Thr

1430 1435 1440

Gly Ser Ser Glu Arg Val Asp Val Arg Leu Asp Asp Asp Gly Asn

1445 1450 1455

Phe Gln Leu Met Asn Asp Pro Gly Ala Pro Trp Lys Ile Trp Met

1460 1465 1470

Leu Arg Met Val Cys Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Thr Pro Trp Ala

1475 1480 1485

Ile Leu Pro Ser Val Val Gly Phe Trp Ile Thr Leu Gln Tyr Thr

1490 1495 1500

Lys Arg Gly Gly Val Leu Trp Asp Thr Pro Ser Pro Lys Glu Tyr

1505 1510 1515

Lys Lys Gly Asp Thr Thr Thr Gly Val Tyr Arg Ile Met Thr Arg 1520 1525 1530 Gly Leu Leu Gly Ser Tyr Gln Ala Gly Ala Gly Val Met Val Glu

1535 1540 1545

Gly Val Phe His Thr Leu Trp His Thr Thr Lys Gly Ala Ala Leu

1550 1555 1560

Met Ser Gly Glu Gly Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Ser Val Lys

1565 1570 1575

Glu Asp Arg Leu Cys Tyr Gly Gly Pro Trp Lys Leu Gln His Lys

1580 1585 1590

Trp Asn Gly Gln Asp Glu Val Gln Met Ile Val Val Glu Pro Gly

1595 1600 1605

Lys Asn Val Lys Asn Val Gln Thr Lys Pro Gly Val Phe Lys Thr

1610 1615 1620

Pro Glu Gly Glu Ile Gly Ala Val Thr Leu Asp Phe Pro Thr Gly

1625 1630 1635

Thr Ser Gly Ser Pro Ile Val Asp Lys Asn Gly Asp Val Ile Gly

1640 1645 1650

Leu Tyr Gly Asn Gly Val Ile Met Pro Asn Gly Ser Tyr Ile Ser

1655 1660 1665

Ala Ile Val Gln Gly Glu Arg Met Asp Glu Pro Ile Pro Ala Gly

1670 1675 1680

Phe Glu Pro Glu Met Leu Arg Lys Lys Gln Ile Thr Val Leu Asp

1685 1690 1695

Leu His Pro Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Ile Leu Pro Gln Ile

1700 1705 1710

Ile Lys Glu Ala Ile Asn Arg Arg Leu Arg Thr Ala Val Leu Ala

1715 1720 1725

Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Ala Glu Ala Leu Arg Gly

1730 1735 1740

Leu Pro Ile Arg Tyr Gln Thr Ser Ala Val Pro Arg Glu His Asn

1745 1750 1755

Gly Asn Glu Ile Val Asp Val Met Cys His Ala Thr Leu Thr His 1760 1765 1770 Arg Leu Met Ser Pro His Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Phe Val

1775 1780 1785

Met Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg

1790 1795 1800

Gly Tyr Ile Ser Thr Lys Val Glu Leu Gly Glu Ala Ala Ala Ile

1805 1810 1815

Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Ser Asp Pro Phe Pro Glu

1820 1825 1830

Ser Asn Ser Pro Ile Ser Asp Leu Gln Thr Glu Ile Pro Asp Arg

1835 1840 1845

Ala Trp Asn Ser Gly Tyr Glu Trp Ile Thr Glu Tyr Thr Gly Lys

1850 1855 1860

Thr Val Trp Phe Val Pro Ser Val Lys Met Gly Asn Glu Ile Ala

1865 1870 1875

Leu Cys Leu Gln Arg Ala Gly Lys Lys Val Val Gln Leu Asn Arg

1880 1885 1890

Lys Ser Tyr Glu Thr Glu Tyr Pro Lys Cys Lys Asn Asp Asp Trp

1895 1900 1905

Asp Phe Val Ile Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe

1910 1915 1920

Lys Ala Ser Arg Val Ile Asp Ser Arg Lys Ser Val Lys Pro Thr

1925 1930 1935

Ile Ile Thr Glu Gly Glu Gly Arg Val Ile Leu Gly Glu Pro Ser

1940 1945 1950

Ala Val Thr Ala Ala Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly

1955 1960 1965

Arg Asn Pro Ser Gln Val Gly Asp Glu Tyr Cys Tyr Gly Gly His

1970 1975 1980

Thr Asn Glu Asp Asp Ser Asn Phe Ala His Trp Thr Glu Ala Arg

1985 1990 1995

Ile Met Leu Asp Asn Ile Asn Met Pro Asn Gly Leu Ile Ala Gln 2000 2005 2010 Phe Tyr Gln Pro Glu Arg Glu Lys Val Tyr Thr Met Asp Gly Glu

2015 2020 2025

Tyr Arg Leu Arg Gly Glu Glu Arg Lys Asn Phe Leu Glu Leu Leu

2030 2035 2040

Arg Thr Ala Asp Leu Pro Val Trp Leu Ala Tyr Lys Val Ala Ala

2045 2050 2055

Ala Gly Val Ser Tyr His Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Pro

2060 2065 2070

Arg Thr Asn Thr Ile Leu Glu Asp Asn Asn Glu Val Glu Val Ile

2075 2080 2085

Thr Lys Leu Gly Glu Arg Lys Ile Leu Arg Pro Arg Trp Ile Asp

2090 2095 2100

Ala Arg Val Tyr Ser Asp His Gln Ala Leu Lys Ala Phe Lys Asp

2105 2110 2115

Phe Ala Ser Gly Lys Arg Ser Gln Ile Gly Leu Ile Glu Val Leu

2120 2125 2130

Gly Lys Met Pro Glu His Phe Met Gly Lys Thr Trp Glu Ala Leu

2135 2140 2145

Asp Thr Met Tyr Val Val Ala Thr Ala Glu Lys Gly Gly Arg Ala

2150 2155 2160

His Arg Met Ala Leu Glu Glu Leu Pro Asp Ala Leu Gln Thr Ile

2165 2170 2175

Ala Leu Ile Ala Leu Leu Ser Val Met Thr Met Gly Val Phe Phe

2180 2185 2190

Leu Leu Met Gln Arg Lys Gly Ile Gly Lys Ile Gly Leu Gly Gly

2195 2200 2205

Ala Val Leu Gly Val Ala Thr Phe Phe Cys Trp Met Ala Glu Val

2210 2215 2220

Pro Gly Thr Lys Ile Ala Gly Met Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu

2225 2230 2235

Met Ile Val Leu Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Gln Thr 2240 2245 2250 Asp Asn Gln Leu Ala Val Phe Leu Ile Cys Val Met Thr Leu Val

2255 2260 2265

Ser Ala Val Ala Ala Asn Glu Met Gly Trp Leu Asp Lys Thr Lys

2270 2275 2280

Ser Asp Ile Ser Ser Leu Phe Gly Gln Arg Ile Glu Val Lys Glu

2285 2290 2295

Asn Phe Ser Met Gly Glu Phe Leu Leu Asp Leu Arg Pro Ala Thr

2300 2305 2310

Ala Trp Ser Leu Tyr Ala Val Thr Thr Ala Val Leu Thr Pro Leu

2315 2320 2325

Leu Lys His Leu Ile Thr Ser Asp Tyr Ile Asn Thr Ser Leu Thr

2330 2335 2340

Ser Ile Asn Val Gln Ala Ser Ala Leu Phe Thr Leu Ala Arg Gly

2345 2350 2355

Phe Pro Phe Val Asp Val Gly Val Ser Ala Leu Leu Leu Ala Ala

2360 2365 2370

Gly Cys Trp Gly Gln Val Thr Leu Thr Val Thr Val Thr Ala Ala

2375 2380 2385

Thr Leu Leu Phe Cys His Tyr Ala Tyr Met Val Pro Gly Trp Gln

2390 2395 2400

Ala Glu Ala Met Arg Ser Ala Gln Arg Arg Thr Ala Ala Gly Ile

2405 2410 2415

Met Lys Asn Ala Val Val Asp Gly Ile Val Ala Thr Asp Val Pro

2420 2425 2430

Glu Leu Glu Arg Thr Thr Pro Ile Met Gln Lys Lys Val Gly Gln

2435 2440 2445

Ile Met Leu Ile Leu Val Ser Leu Ala Ala Val Val Val Asn Pro

2450 2455 2460

Ser Val Lys Thr Val Arg Glu Ala Gly Ile Leu Ile Thr Ala Ala

2465 2470 2475

Ala Val Thr Leu Trp Glu Asn Gly Ala Ser Ser Val Trp Asn Ala 2480 2485 2490 Thr Thr Ala Ile Gly Leu Cys His Ile Met Arg Gly Gly Trp Leu

2495 2500 2505

Ser Cys Leu Ser Ile Thr Trp Thr Leu Ile Lys Asn Met Glu Lys

2510 2515 2520

Pro Gly Leu Lys Arg Gly Gly Ala Lys Gly Arg Thr Leu Gly Glu

2525 2530 2535

Val Trp Lys Glu Arg Leu Asn Gln Met Thr Lys Glu Glu Phe Thr

2540 2545 2550

Arg Tyr Arg Lys Glu Ala Ile Ile Glu Val Asp Arg Ser Ala Ala

2555 2560 2565

Lys His Ala Arg Lys Glu Gly Asn Val Thr Gly Gly His Pro Val

2570 2575 2580

Ser Arg Gly Thr Ala Lys Leu Arg Trp Leu Val Glu Arg Arg Phe

2585 2590 2595

Leu Glu Pro Val Gly Lys Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly

2600 2605 2610

Gly Trp Cys Tyr Tyr Met Ala Thr Gln Lys Arg Val Gln Glu Val

2615 2620 2625

Arg Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Pro Gly His Glu Glu Pro Gln Leu

2630 2635 2640

Val Gln Ser Tyr Gly Trp Asn Ile Val Thr Met Lys Ser Gly Val

2645 2650 2655

Asp Val Phe Tyr Arg Pro Ser Glu Cys Cys Asp Thr Leu Leu Cys

2660 2665 2670

Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Val Glu Glu His Arg

2675 2680 2685

Thr Ile Arg Val Leu Glu Met Val Glu Asp Trp Leu His Arg Gly

2690 2695 2700

Pro Arg Glu Phe Cys Val Lys Val Leu Cys Pro Tyr Met Pro Lys

2705 2710 2715

Val Ile Glu Lys Met Glu Leu Leu Gln Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 2720 2725 2730 Leu Val Arg Asn Pro Leu Ser Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr

2735 2740 2745

Trp Val Ser Arg Ala Ser Gly Asn Val Val His Ser Val Asn Met

2750 2755 2760

Thr Ser Gln Val Leu Leu Gly Arg Met Glu Lys Arg Thr Trp Lys

2765 2770 2775

Gly Pro Gln Tyr Glu Glu Asp Val Asn Leu Gly Ser Gly Thr Arg

2780 2785 2790

Ala Val Gly Lys Pro Leu Leu Asn Ser Asp Thr Ser Lys Ile Lys

2795 2800 2805

Asn Arg Ile Glu Arg Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Ser Thr Trp His

2810 2815 2820

His Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Asn Tyr His Gly Ser

2825 2830 2835

Tyr Asp Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ser Ser Leu Val Asn Gly

2840 2845 2850

Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp Asp Thr Ile Thr Asn Val

2855 2860 2865

Thr Thr Met Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg

2870 2875 2880

Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu

2885 2890 2895

Gly Val Lys Tyr Val Leu Asn Glu Thr Thr Asn Trp Leu Trp Ala

2900 2905 2910

Phe Leu Ala Arg Glu Lys Arg Pro Arg Met Cys Ser Arg Glu Glu

2915 2920 2925

Phe Ile Arg Lys Val Asn Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Met Phe

2930 2935 2940

Glu Glu Gln Asn Gln Trp Arg Ser Ala Arg Glu Ala Val Glu Asp

2945 2950 2955

Pro Lys Phe Trp Glu Met Val Asp Glu Glu Arg Glu Ala His Leu 2960 2965 2970 Arg Gly Glu Cys His Thr Cys Ile Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg

2975 2980 2985

Glu Lys Lys Pro Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala

2990 2995 3000

Ile Trp Phe Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala

3005 3010 3015

Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp Leu Gly Arg Lys Asn Ser

3020 3025 3030

Gly Gly Gly Val Glu Gly Leu Gly Leu Gln Lys Leu Gly Tyr Ile

3035 3040 3045

Leu Arg Glu Val Gly Thr Arg Pro Gly Gly Lys Ile Tyr Ala Asp

3050 3055 3060

Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile Thr Arg Ala Asp Leu Glu

3065 3070 3075

Asn Glu Ala Lys Val Leu Glu Leu Leu Asp Gly Glu His Arg Arg

3080 3085 3090

Leu Ala Arg Ala Ile Ile Glu Leu Thr Tyr Arg His Lys Val Val

3095 3100 3105

Lys Val Met Arg Pro Ala Ala Asp Gly Arg Thr Val Met Asp Val

3110 3115 3120

Ile Ser Arg Glu Asp Gln Arg Gly Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr

3125 3130 3135

Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Ala Val Gln Leu Val Arg Met

3140 3145 3150

Met Glu Gly Glu Gly Val Ile Gly Pro Asp Asp Val Glu Lys Leu

3155 3160 3165

Thr Lys Gly Lys Gly Pro Lys Val Arg Thr Trp Leu Phe Glu Asn

3170 3175 3180

Gly Glu Glu Arg Leu Ser Arg Met Ala Val Ser Gly Asp Asp Cys

3185 3190 3195

Val Val Lys Pro Leu Asp Asp Arg Phe Ala Thr Ser Leu His Phe 3200 3205 3210 Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg Lys Asp Ile Gln Glu Trp Lys

3215 3220 3225

Pro Ser Thr Gly Trp Tyr Asp Trp Gln Gln Val Pro Phe Cys Ser

3230 3235 3240

Asn His Phe Thr Glu Leu Ile Met Lys Asp Gly Arg Thr Leu Val

3245 3250 3255

Val Pro Cys Arg Gly Gln Asp Glu Leu Val Gly Arg Ala Arg Ile

3260 3265 3270

Ser Pro Gly Ala Gly Trp Asn Val Arg Asp Thr Ala Cys Leu Ala

3275 3280 3285

Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Leu Leu Leu Tyr Phe His Arg Arg

3290 3295 3300

Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val Pro Val

3305 3310 3315

Asn Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Ala Gly

3320 3325 3330

Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Glu Val Trp Asn Arg

3335 3340 3345

Val Trp Ile Glu Glu Asn Glu Trp Met Glu Asp Lys Thr Pro Val

3350 3355 3360

Glu Lys Trp Ser Asp Val Pro Tyr Ser Gly Lys Arg Glu Asp Ile

3365 3370 3375

Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly Thr Arg Ala Arg Ala Thr Trp Ala

3380 3385 3390

Glu Asn Ile Gln Val Ala Ile Asn Gln Val Arg Ala Ile Ile Gly

3395 3400 3405

Asp Glu Lys Tyr Val Asp Tyr Met Ser Ser Leu Lys Arg Tyr Glu

3410 3415 3420

Asp Thr Thr Leu Val Glu Asp Thr Val Leu 3425 3430

Claims (57)

1. Método para gerar um genoma viral compreendendo uma mo- lécula de ácido nucléico que codifica um peptídeo heterólogo, o método compreendendo as etapas de: (i) fornecer um gene viral alvo; (ii) submeter o gene viral alvo à mutagênese; e (iii) ligar uma molécula de ácido nucléico que codifica um peptí- deo heterólogo no sítio de mutagênese do gene viral alvo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo as etapas de: (iv) transfeccionar as células com bibliotecas de ácido nucléico genômico para iniciar a replicação do vírus; e (v) selecionar os recombinantes de vírus viáveis.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o gene viral alvo é fornecido em um vetor ponte e, após ligação da molécula de ácido nucléico que codifica o peptídeo heterólogo no sítio de mutagênese do gene viral alvo, o método também compreende a etapa de introduzir o gene viral alvo mutado em um genoma viral do qual o gene viral alvo foi derivado, no lugar do gene viral correspondente carecendo da inserção, para gerar um genoma viral compreendendo uma inserção.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o vetor pon- te compreende dois ou mais genes virais alvos.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o gene viral alvo é fornecido no contexto de um genoma viral intacto, e o método gera um genoma viral compreendendo uma inserção.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, adicionalmente compreendendo gerar um vetor viral do genoma viral com- preendendo uma inserção mediante introdução do genoma viral compreen- dendo uma inserção nas células.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, adicionalmente compreendendo isolar o vetor viral das células ou o sobrenadante das mes- mas.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo submeter dois ou mais vetores ponte, compreendendo dois ou mais genes virais alvos, à mutagênese, e introduzir dois ou mais genes virais alvos, compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam um ou mais pep- tídeos heterólogos, em um genoma viral do qual os genes alvos foram deri- vados, no lugar dos genes virais correspondentes carecendo de inserções, para gerar um genoma viral compreendendo inserções.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de mutagênese compreende introdução de um ou mais transiniciadores no ge- ne viral alvo através de mutagênese de transpóson.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o um ou mais transiniciadores são removidos por digestão de endonuclease e a mo- lécula de ácido nucléico que codifica o peptídeo heterólogo é introduzida no gene viral alvo através de ligação no sítio de digestão de endonuclease de restrição.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo a geração de uma biblioteca de genes virais alvos mutados.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o gene viral alvo compreende inserções introduzidas pelo método de acordo com a reivindicação 1 antes de ser submetido a este método nova- mente.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o genoma viral é o genoma de um flavivírus.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o flaviví- rus é um flavivírus quimérico.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o flaviví- rus quimérico compreende as proteínas de capsídeo e não-estruturais de um primeiro flavivírus e as proteínas de pré-membrana e de envelope de um segundo flavivírus diferente.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que os primei- ro e segundo flavivírus são independentemente selecionados do grupo que consiste em encefalite japonesa, Dengue-1, Dengue-2, Dengue-3, Dengue- .4, febre amarela, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ocidental, Kunjin, encefalite de Rocio, Ilhéus, encefalite de carrapato, ence- falite da Europa Central, encefalite siberiana, encefalite russa da primavera- verão, doença de Kyasanur Florest, febre hemorrágica de Omsk, doença de Louping, vírus de Powassan, Negishi1 Absettarov1 Hansalova, Apoi1 e Hypr.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o gene vi- ral alvo é selecionado do grupo que consiste em genes que codificam prote- ínas de envelope, capsídeo, pré-membrana, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo heterólogo compreende um epítopo de vacina.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o epítopo de vacina é um epítopo de célula B ou um epítopo de célula T.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o epítopo é derivado de um antígeno de um patógeno viral, um patógeno bacteriano, um patógeno parasitário, um alergênio, ou um antígeno associado ao tumor.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o patóge- no viral é um vírus influenza.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o peptí- deo heterólogo compreende um peptídeo de M2e de influenza ou um peptí- deo compreendendo um sítio de clivagem da proteína de precursor de he- maglutinina de influenza (HAO).

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o vírus influenza é um vírus influenza aviário ou um humano.

24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o genoma viral compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica mais de um peptídeo heterólogo, e os peptídeos heterólogos compreendem peptídeos de M2e de influenza humano e aviário.

25. Genoma viral gerado por quaisquer dos métodos como defi- nido nas reivindicações 1-24, ou o complemento do mesmo.

26. Vetor viral codificado pelo genoma viral como defindo na reivindicação 25.

27. Vetor de flavivírus compreendendo um peptídeo heterólogo inserido dentro de uma proteína selecionada do grupo que consiste em pro- teínas de capsídeo, pré-membrana, envelope, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5.

28. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 27, em que o flavivírus é um vírus de febre amarela.

29. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 27, em que o flavivírus é um flavivírus quimérico.

30. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 29, em que o flavivírus quimérico compreende as proteínas de capsídeo e não- estruturais de um primeiro flavivírus e as proteínas de pré-membrana e de envelope de um segundo flavivírus diferente.

31. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 30, em que os primeiro e segundo flavivírus são independentemente selecionados do grupo que consiste em encefalite japonesa, Dengue-1, Dengue-2, Dengue-3, Dengue-4, febre amarela, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ocidental, Kunjin, encefalite de Rocio, Ilhéus, encefalite de carra- pato, encefalite da Europa Central, encefalite siberiana, encefalite russa da primavera-verão, doença de Kyasanur Florest, febre hemorrágica de Omsk, doença de Louping, vírus de Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, e Hypr.

32. Vetor de flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 27-31, em que o vetor de flavivírus compreende uma inserção de um peptídeo heterólogo entre os aminoácidos 236 e 237 da proteína 1 não- estrutural (NS1).

33. Vetor de flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 27-32, em que o vetor de flavivírus compreende inserção de um pep- tídeo heterólogo na região amino terminal da proteína de pré-membrana do vetor.

34. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 33, em que o peptídeo heterólogo é inserido na posição -4, -2, ou -1 que precede o sítio de clivagem de capsídeo/pré-membrana, ou posição 26 da proteína de pré- membrana.

35. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 33 ou 34, adicionalmente compreendendo um sítio de clivagem proteolítico que facilita a remoção do peptídeo da proteína de pré-membrana.

36. Vetor de flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 27-35, em que o peptídeo heterólogo compreende um peptídeo de M2e de influenza ou um peptídeo compreendendo um sítio de clivagem da proteína de precursor de hemaglutinina de influenza (HAO).

37. Vetor de flavivírus de acordo com a reivindicação 36, em que o vírus influenza é um vírus influenza aviário ou um vírus influenza humano.

38. Vetor de flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 27-37, em que o genoma viral compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica mais de um peptídeo heterólogo, e os peptídeos hete- rólogos compreendem os peptídeos de M2e de influenza humano e aviário.

39. Vetor de flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 27-38, adicionalmente compreendendo uma ou mais segundas adap- tações de sítio.

40. Molécula de ácido nucléico correspondendo ao genoma do vetor de flavivírus como definido em qualquer uma das reivindicações 27-39, ou o complemento do mesmo.

41. Composição farmacêutica compreendendo o vetor viral como definido em qualquer uma das reivindicações 27-39.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, adicionalmente compreendendo um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41 ou 42, adicionalmente compreendendo um adjuvante.

44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 43, em que o adjuvante compreende um composto de alumínio.

45. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 44, em que o composto de alumínio é alume.

46. Método de liberar um peptídeo a um paciente, o método compreendendo administrar ao paciente uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 41-45.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o peptí- deo é um antígeno e a administração é realizada para induzir uma resposta imune a um patógeno ou tumor do qual o antígeno é derivado.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, adicionalmente compreendendo administração de uma vacina de subunidade.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o vetor de flavivírus e a vacina de subunidade são co-administrados, o vetor de flaviví- rus é administrado como uma dose preparatória e a vacina de subunidade é administrada como uma dose de reforço, ou a vacina de subunidade é admi- nistrada como uma dose preparatória e o vetor de flavivírus é administrado como uma dose de reforço.

50. Método de acordo com a reivindicação 48 ou 49, em que a vacina de subunidade compreende partículas de núcleo do vírus da hepatite B compreendendo fusão de um peptídeo heterólogo à proteína de núcleo do vírus da hepatite B.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o peptí- deo heterólogo fundido compreende um peptídeo de M2e de influenza ou um peptídeo compreendendo um sítio de clivagem da proteína de precursor de hemaglutinina de influenza (HAO).

52. Vetor de flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 27-39, a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 40, a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindi- cações 41-45, o genoma viral como definido na reivindicação 25, vetor viral como definido na reivindicação 26, ou o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1-24 ou 46-51, em que o peptídeo heterólogo ou fonte de peptídeo é selecionado daqueles listados em outro lugar aqui, inclu- indo as tabelas e apêndices de seqüência.

53. Método de fazer um vetor viral, o método compreendendo inserir uma seqüência que codifica um peptídeo de interesse em um flaviví- rus em um sítio que é permissivo para a dita inserção.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o vetor viral compreende um flavivírus ou um flavivírus quimérico.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que a inser- ção é realizada na posição NS1-236 do dito vetor viral ou na porção amino terminal da proteína de pré-membrana do vetor.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que a inser- ção amino terminal é na posição -4, -2, ou -1 que precede o sítio de cliva- gem de capsídeo/pré-membrana, ou posição 26 da proteína de pré- membrana.

57. Método de fazer uma composição farmacêutica, o método compreendendo misturar os vetores de flavivírus como definido em qualquer uma das reivindicações 27-39 com um veículo ou diluente farmaceuticamen- te aceitável, um adjuvante, e/ou um agente ativo adicional.