CN103328647B - 黄病毒重组体及其应用 - Google Patents

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Abstract

在此揭示黄病毒重组体及其应用，提供了用以于细胞内表达外源多肽的病毒重组体。此病毒重组体是衍生自日本脑炎病毒(JEV)。此病毒重组体编码融合蛋白，其包含外源(即，非JEV)多肽与JEV非结构蛋白1(JEV？NS1)或其片段。上述外源多肽插入于JEV？NS1的羧基端，且此重组融合蛋白的生产不会影响病毒复制。当利用此病毒重组体感染细胞时，会制造出包含有限增殖性病毒粒子(LMV)的JEV颗粒。每一LMV包含上述JEV复制子。JEV颗粒可用以于宿主体内诱发对该外源多肽的免疫反应，且因而使得该宿主具备对抗该外源多肽的保护免疫力。

Description

黄病毒重组体及其应用
本申请案主张美国专利临时申请案第61/384,720(2010年9月21日申请)的优先权，在此将其全文纳入作为参照。
技术领域
本发明一般是关于病毒重组体以及于宿主体内诱发专一免疫力的领域。具体来说，本发明是关于使用重组病毒载体以使宿主接触到外源多肽抗原，且因而在宿主体内诱发对该外源多肽抗原的免疫反应。
背景技术
已针对各科的RNA病毒开发出以复制子为基础的表达载体，这些病毒包括α病毒(alphaviruses)、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)以及黄病毒(flaviviruses)。举例来说，一些为人熟知的表达系统可利用黄热病病毒(YellowFevervirus，简称YFV)在宿主细胞内表达外来蛋白质或多肽，这些外来蛋白质或多肽在宿主细胞内可作为免疫原或治疗药剂。然而，在既有的表达系统或载体中，外来蛋白质或多肽的表达仅限于这些病毒的结构基因区域。
本发明提供在病毒的非结构基因区域中表达具有功能的外来蛋白质或多肽的能力，因而克服了既有表达系统或载体的缺点与缺陷；具体而言，上述非结构区域是指黄病毒的分泌性(secreted)非结构蛋白1(non-structureprotein1，简称NS1)的羧基端(C-terminus，以下称C端)。
发明内容
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在于指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
本发明提出衍生自黄病毒(如日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，简称JEV)及登革热病毒(dengueviruses，简称DEN))的病毒重组体及其用途。此病毒重组体编码一融合蛋白，该融合蛋白包含一外源(即，非JEV或非DEN)多肽抗原以及一黄病毒非结构蛋白1(NS1)或其片段。更明确地说，此外源多肽抗原是插入于黄病毒NS1(如JEVNS1)的C端，且重组融合蛋白的生产不会影响病毒复制。当利用此病毒重组体感染细胞时，会产生包含有限增殖性病毒粒子(limitedmultiplicativevirions，简称LMV)的黄病毒颗粒。每一LMV包含上述黄病毒复制子。此黄病毒颗粒可用以于宿主体内诱发对该外源多肽的免疫反应，且因而使得该宿主具备对抗该外源多肽的保护免疫力。
因此，本发明的第一方式中提供了一种经分离的病毒重组体，其可用以于细胞内表达外源多肽。此经分离的病毒重组体包含黄病毒复制子，其包含编码融合蛋白的核酸。此融合蛋白包含非结构蛋白1(NS1)或其片段以及该外源多肽，其中该外源多肽的长度为至少6个氨基酸且插入于该NS1的C端；此融合蛋白的产生不会影响病毒复制。
上述黄病毒复制子可以是日本脑炎病毒(JEV)复制子或登革热病毒(DEN)复制子。在较佳的情形中，该黄病毒复制子为JEV复制子。
在采用JEV复制子的情形中，该JEV复制子包含编码融合蛋白的核酸，该融合蛋白依序包含：JEV非结构蛋白1(JEVNS1)片段、该外源多肽以及尾部多肽。上述JEVNS1片段包含JEVNS1的至少氨基酸残基1至340位；该外源多肽具有至少6个氨基酸；且该尾部多肽包含JEVNS1的至少氨基酸残基344至352位。
根据某些实施方式，上述外源多肽包含免疫原性片段(immunogenicsegment)，如肠病毒71型(enterovirus71，简称EV71)SP70抗原、EV71VP1抗原、B型肝炎病毒表面抗原，或上述抗原的免疫原性部分。在一实施方式中，上述外源多肽至少包含6个氨基酸；较佳为至少15个氨基酸。
可任选地，上述外源多肽亦可另包含位于该免疫原性片段之前的蛋白酶片段(proteasesegment)以便水解分开前述融合蛋白。此蛋白酶片段可包含口蹄疫病毒2A(Foot-and-MouthDiseasevirus2A，简称FMDV-2A)肽。于此实施方式中，病毒重组体的插入容量(insertioncapacity)较高；举例来说，此外源多肽可为至少50个氨基酸；较佳为至少100个氨基酸；且更佳为至少150氨基酸。
黄病毒复制子包含操作上与其相连的启动子，因而能够在细胞内表达含有外源多肽与黄病毒NS1的融合蛋白，且之后可将此融合蛋白分泌至细胞外。此处所用的细胞可以是幼仓鼠肾(babyhamsterkidney)细胞(如，BHK-21细胞)、绿猿肾脏癌细胞(Vero细胞)或白线斑蚊(Aedesalbopictus)C6/36蚊细胞株(简称C6/36细胞)。在较佳的情形中，所用的细胞为BHK-21细胞。
上述经分离的病毒重组体可更包含编码黄病毒结构蛋白的核酸；上述结构蛋白如衣壳蛋白(capsidproteinC，简称C)、结构前体膜蛋白(structuralprecursor-membraneprotein，简称prM)、糖蛋白E(glycoproteinE，简称E)等，这些结构蛋白是将黄病毒复制子包装成为黄病毒颗粒所必需的。在较佳的情形中，可利用遗传工程将编码黄病毒结构蛋白的核酸加入黄病毒基因组中。
因此，本发明的第二方式中提出了一种经分离的重组黄病毒颗粒，其包含病毒粒子单元，而此病毒粒子单元包含本发明的病毒重组体。
本发明的第三方式中提出了一种在宿主体内诱发免疫反应的方法。上述方法包含将本发明的经分离的重组黄病毒颗粒投予该宿主，其中此投予步骤使得外源多肽能够表达，进而在宿主体内诱发针对该外源多肽的免疫反应。在较佳的情形中，上述宿主可为细胞或哺乳类动物；在更佳的情形中，所述的哺乳类动物为人类。
在本发明的第四方式中提出了经转染细胞，此细胞内包含了根据本发明第一方式中与相关实施方式的病毒重组体。
此外，本发明的第五方式中提出了以得到上述经转染细胞的一种套组。此套组包含根据本发明的一种经分离的核酸重组体，以及该经分离的核酸重组体的使用说明。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图说明如下：
图1概要地绘示出根据本发明实施例的RP9-X、RP9-XM、J-R2A与J-R2A-M病毒重组体；
图2绘示根据本发明实施例，利用反式互补分析法研究在NS1的C端区域进行缺失突变后对于病毒复制能力的影响；
图3绘示根据本发明实施例，利用反式互补分析法研究重组JEV病毒[其包含肠病毒71型(EV71)SP70抗原插入于JEVNS1的氨基酸残基343与344之间]的复制能力；
图4概要绘示出根据本发明实施例的JEV重组体J-R2A-NS1-343SP70，其具有肠病毒71型(EV71)SP70抗原插入位于JEVNS1氨基酸残基343与344之间；
图5绘示根据本发明实施例，利用反式互补分析法研究缺陷复制子J-R2A-dNS1(包括J-R2A-dNS1、J-R2A-dNS1-dc340与J-R2A-NS1-343SP70)的复制能力；
图6绘示根据本发明实施例，利用Western印迹来分析由重组JEV病毒感染BHK-21细胞中融合蛋白(即，343SP70)的表达；
图7绘示根据本发明实施例，利用Western印迹来分析融合蛋白(即，343SP70)的分泌能力；
图8绘示根据本发明实施例，利用反式互补分析法探讨能够表达包含1、2、3和4套EV71SP70抗原决定区的融合蛋白的各重组复制子的复制能力；
图9为生存曲线图，其是根据本发明实施例，以动物存活百分比相对于注射RP-9XM、RP-2ms以及343SP70(即，本发明的重组JEV病毒)后的时间作图所得；
图10绘示根据本发明实施例，以Western印迹来分析以343SP70引发免疫的小鼠对于P3386抗原的反应性；
图11绘示根据本发明实施例，以Western印迹来分析所表达的融合蛋白(即，JR2A-Glu与JR2A-2A-Glu)的分泌能力；
图12摘要整理了根据本发明多个实施例，于NS1C端区域可供插入EV71SP70抗原的位置；
图13绘示根据本发明实施例，利用Western印迹来分析由图12所示的病毒重组体所表达的融合蛋白的分泌能力；
图14为生存曲线图，其是根据本发明实施例，以动物存活百分比相对于注射RP-9XM以及本发明的重组JEV病毒(即，343341SP70与352341SP70)后的时间作图所得；以及
图15绘示根据本发明实施例，以Western印迹来分析以352341SP70引发免疫的小鼠对于P3386抗原的反应性。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
在本说明书中，除非另有定义，“包含”一词的各种时态(comprise,comprises,andcomprising)为包括性地(inclusively)而非排除性地(exclusively)，因而所述的事物(integers)或事物群组(groupofintegers)可包含一或更多种未叙述的其它事物或事物群组。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者惯用者相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书中所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而以所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。一般来说，此处针对细胞及组织培养物、分子生物学、蛋白质及寡核苷酸或聚核苷酸化学与杂合所用的命名或技术皆为本领域中所熟知且惯用者。此处采用了标准技术来进行重组DNA以及组织培养与转型(transformation)；标准的转型技术如脂质转染(lipofection)。此处亦依照制造商的使用说明或相关领域惯用的技术或此处所述的方法来进行酶反应(enzymaticreactions)与纯化(purification)。上述技术与流程通常是根据相关领域中熟知的既有技术来进行，且皆已见于本说明书中引述或论及的各种一般性或较为具体的文献中。药学组合物的制备、配方与递送以及患者的治疗皆采用标准技术。
除非另有定义或说明，下列本发明所用名词的意义如下：
“核酸”(nucleicacid)一词在此是指称单股或双股RNA、mRNA、及DNA，包含cDNA与基因组DNA(genomicDNA)。
“多肽”(polypeptide)一词在此泛指天然蛋白质(nativeprotein)、或多肽序列的片段(fragments)或类似物(analogs)。因此，多肽这一上位概念涵盖了天然蛋白质、片段与类似物等下位概念。
当“重组”(recombinant)一词与多肽编码区域(codingregions)以及此编码区域所编码的多肽连用时，其是指非天然产物，其中上述编码区域(通常是其表达)于体外(invitro)经人为操控而与其在天然状态中有所不同。可利用相关领域中已知的多种不同重组系统来生产本发明的方法中所用的多肽，这些重组系统包括但不限于原核或真核系统。为了要能够在适当的表达系统中表达，可将所欲得到的病毒多肽编码区域与表达载体在操作上相连，并将其引入宿主细胞中以利表达进行。可将具有适当调控区域(regulatoryregions)的编码区域排列于适当的方向(orientation)并置于适当的阅读框架(readingframe)中以利表达进行。基因构筑的方法为相关领域所熟知。具体来说，可参见Sambrook等人所著的MolecularCloning,ALaboratoryManual[ColdSpringHarborLaboratory,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)]及其中引用的文献。
“经分离的”(isolated)一词在此是用以指称一分子，此词汇是指该分子已自其天然原生环境(nativeenvironment)中移除。举例来说，天然存在于活体动物体内的聚核苷酸或多肽并非“经分离的”，但当此相同的聚核苷酸或多肽与在天然状态下和其共存的材料分离时，即为“经分离的”。此外，基于本发明的目的，载体中所携带的重组DNA分子视为经分离的。经分离的DNA分子包括活体内(invivo)或活体外(invitro)的DNA分子。经分离的核酸分子更包含利用合成而产生的分子。此外，重组宿主细胞内所含的载体分子亦为经分离的。
在此处“重组体”(construct)或“载体”(vector)等词是指用以将遗传材料传送至宿主细胞的物体，如，质粒(plasmid)或病毒。重组体或载体可由DNA或RNA所构成。
在此处“外源或异源聚核苷酸序列”(exogenousorheterologouspolynucleotidesequence)是指存在于本发明的重组体或载体中的第二种核苷酸序列。“外源或异源多肽序列”(exogenousorheterologouspolypeptidesequence)是指由本发明的载体中所含的外源聚核苷酸序列所编码的任何氨基酸序列。在异源聚核苷酸序列所处的细胞中，其可编码在该细胞类型中通常可表达或不会表达的蛋白质或RNA分子。
“黄病毒”(flavivirus)与“黄病毒的”(flaviviral)等词是用来指称黄病毒科(Flaviviridae)中黄病毒属(Flavivirus)的成员，黄病毒属包括65种以上的相关病毒物种。一般来说，黄病毒是小型的包膜RNA病毒(envelopedRNAviruses)，其包膜体(peplomer)包含单一的糖蛋白(glycoprotein)E。其它结构蛋白有核蛋白(coreprotein)C；以及似膜蛋白(membrane-likeprotein)M。黄病毒可感染非常多种的脊椎动物，且多种黄病毒是透过节肢动物[如，蜱(tick，即壁虱)与蚊子]来传播。具体而言，黄病毒的例示包括西尼罗病毒(WestNilevirus，WNV)、昆金病毒(Kunjinvirus)、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、登革热病毒(DEN)、于图病毒(Usutuvirus)、圣路易脑炎病毒(StLouisEncephalitisvirus，SLE)及蜱传脑炎病毒(tick-bornencephalitisvirus，TBEV)。在较佳的情形中，适用于本发明的黄病毒为JEV与DEN。
“病毒重组体”(recombinantviralconstruct)一词是指能够引导一或多目标序列或基因表达的总成(assembly)。此种病毒重组体是由能够起始病毒RNA(如，JEVRNA)复制的5’序列以及于表达时可编码具生物活性的病毒非结构蛋白质的序列所组成。所述的病毒重组体亦可包含：来自一或多结构和/或非结构蛋白质基因的序列或其部份；外源核酸分子，其大小足以产生可存活的病毒；5’启动子，其能够起始由cDNA在活体外生成病毒RNA；欲表达的外源序列；以及一或多限制部位以供插入异源序列。
“复制子”一词是指在标的细胞(targetcell)中能够引导其自身进行活体内增殖或自我复制的病毒DNA或RNA分子。为了要能够引导其自身的复制，该DNA或RNA分子可：(1)编码一或多种聚合酶(polymerase)、复制酶(replicase)或可和衍生自病毒或宿主细胞的蛋白质、核酸或核糖核蛋白(ribonucleoprotein)互动的其它蛋白质，此类蛋白质可催化DNA或RNA复制；以及(2)含有复制所必需的顺式(cis)DNA或RNA序列，此序列可和其自身编码的蛋白质(self-encodedproteins)或非其自身编码的蛋白质(non-self-encodedproteins)、衍生自细胞的蛋白质(cell-derivedproteins)、核酸或核糖核蛋白等结合，或复合于任何上述成分之间。在RNA转染(transfection)或质粒DNA转染后，黄病毒复制子RNA会进行自我复制而于细胞内产生黄病毒复制子RNA，可提供来自第二载体的结构蛋白，藉以将所产生的黄病毒复制子RNA包装于分泌性类病毒颗粒(secretedvirus-likeparticles，简称VLP)中。
本发明至少部分是基于发现到黄病毒(如，JEV)的非结构蛋白1(NS-1)的C端部分可容忍外源多肽的插入，因而其可作为使外来抗原决定区(epitope)与宿主接触的适当途径。此外，在黄病毒复制子中加入外源多肽并不会明显地降低黄病毒复制子的复制能力。
可以理解，本发明提出了一种病毒重组体，其能够使另一有毒(virulent)和/或致病(pathogenic)病毒的免疫原性抗原决定区与宿主接触。因此，本发明可用于人类医学与兽医学领域。
因此，在较佳实施方式中，本发明包含一种用以于细胞内表达外源多肽的经分离的病毒重组体。上述经分离的病毒重组体包含JEV复制子，此JEV复制子包含编码融合蛋白的核酸，此融合蛋白包含JEV非结构蛋白1(JEVNS1)或其片段以及外源多肽，其中该外源多肽的长度为至少6个氨基酸且插入于JEVNS1的C端中，其中该外源多肽的生产不会影响病毒复制。
更明确地说，上述融合蛋白依序包含：JEV非结构蛋白1(JEVNS1)片段、该外源多肽以及尾部多肽。一般来说，上述外源多肽具有至少6个氨基酸；较佳为至少15个氨基酸；更佳为至少50个氨基酸。具体而言，所插入的外源多肽可包含至少6、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。举例来说，下文实施例所述的某些外源多肽其长度分别为22、39、56与73个氨基酸。
上述JEVNS1片段包含JEVNS1的至少氨基酸残基1至340位，且该尾部多肽包含JEVNS1的至少氨基酸残基344至352位。在本说明书中，将包含JEVNS1氨基酸残基1至n位的JEVNS1片段称为JEVNS1n，并将包含JEVNS1氨基酸残基m至352位的尾部多肽称为尾部多肽m。
根据本发明一实施方式，融合蛋白包含JEVNS1340、外源多肽及尾部多肽341，如下文所述的cDNA克隆株(clone)340341SP70。在另一实施方式中，融合蛋白包含JEVNS1343、外源多肽及尾部多肽344，如下文所述的cDNA克隆株343344SP70。在又一实施方式中，融合蛋白包含JEVNS1340、外源多肽及尾部多肽344，如下文所述的cDNA克隆株340344SP70。
在不受限于理论的前提下，据信在此融合蛋白的末端连续存有JEVNS1的氨基酸残基344至352位乃表达与分泌此融合蛋白所必需。因此，在一实施方式中，融合蛋白包含JEVNS1352、外源多肽及尾部多肽344，如下文所述的cDNA克隆株352344SP70。
在某些情形中，在此融合蛋白的末端较佳需连续存有JEVNS1的氨基酸残基341至352位。因而，融合蛋白包含JEVNS1343、外源多肽及尾部多肽341，如下文所述的cDNA克隆株343341SP70。在另一实施方式中，融合蛋白包含JEVNS1352、外源多肽及尾部多肽341，如下文所述的cDNA克隆株352341SP70。
根据本发明的原理与精神，外源多肽包含一免疫原性片段，如EV71SP70抗原、EV71VP1抗原或其免疫原性部分。根据一实施方式，上述外源多肽的长度为至少6个氨基酸；较佳为至少15个氨基酸。在非限制性的例示中，外源多肽为EV71SP70抗原，其氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEY，共15个氨基酸。在一实施方式中，将肠病毒71型(EV71)SP70抗原序列插入于JEVNS1343及尾部多肽344之间；所插入的氨基酸序列为galYPTFGEHKQEKDLEYasra，共22个氨基酸，其中小写者为连接序列(linker)，如图4所示。在其它实施方式中，将包含2、3或4倍的上述EV71SP70抗原序列(YPTFGEHKQEKDLEY)的免疫原性片段分别插入JEVNS1343以及尾部多肽344之间，可得到具有较低病毒复制力或感染力的重组体；这些免疫原性片段的长度分别为39、56与73个氨基酸，如图8所示。
在可任选的实施方式中，上述外源多肽可更包含位于该免疫原性片段之前的蛋白酶片段，因而得到一种具有较高插入容量的病毒重组体。上述蛋白酶片段可包含口蹄疫病毒2A(FMDV-2A)肽。于此实施方式中，所得的病毒重组体能够携带长度为至少100个氨基酸的外源多肽。具体来说，欲插入的外源多肽的长度可为至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸。举例来说，下文实施例中所述的两种外源多肽的长度分别为153与202个氨基酸。
同样可任选地，上述外源多肽可更包含位于该蛋白酶片段与免疫原性片段之间的分泌信号(secretion-signal)片段。上述分泌信号片段包含来自深海桡足类名为Gaussiaprinceps的荧光酶(luciferase)的分泌信号肽。
在一例示的实施方式中，上述外源多肽的总长为153个氨基酸，其是由FMDV-2A肽(NFDLLKLAGDVESNPGP，17个氨基酸)、来自Gaussiaprinceps荧光酶的分泌信号肽(MGVKVLFALICIAVAEAGL，19个氨基酸)以及EV71VP1的氨基酸残基145至261(117氨基酸)所组成。此外源多肽插入于JEVNS1343以及尾部多肽344之间。
可将一适当的启动子在操作上连接(operablylinked)至上述复制子，来协助在宿主细胞内进行病毒复制子以及连接至该病毒复制子的该外源多肽的扩增或自我复制。适当的启动子包括但不限于：可透过细菌乳糖操纵子(lacoperon)诱导的可由哺乳类动物操作(mammalian-operable)的启动子，譬如受乳糖操控的(lac-regulated)CMV或RSV启动子。较佳的启动子为CMV启动子。
适用于接受本发明的病毒重组体的宿主细胞可为BHK-21细胞、绿猿肾脏癌Vero细胞或C6/36细胞。较佳的宿主细胞为BHK-21细胞。
本发明的特征在于使得外源蛋白质或多肽能够在病毒的非结构区域中表达出功能；更明确地说，上述病毒的非结构区域是指黄病毒的非结构蛋白1(NS1)。非结构蛋白1含有两个可区分的结构域(domains)或区域，而目前科学界仍不清楚这两种结构域在病毒复制中所扮演的角色。在已知的各种黄病毒之间，其C端区域的长度与序列并非保守(conserved)区域，且此区域可容忍多重变异。在本发明一实验例中针对JEVNS1的C端区域进行了插入/缺失试验。试验结果显示，可将由至少6个氨基酸组成的外源多肽插入NS1的C端中。
上经分离的病毒重组体可更包含编码黄病毒结构蛋白(如，结构蛋白C、prM与E)的核酸，这些结构蛋白是将黄病毒复制子包装成为黄病毒颗粒所必需的。在较佳的情形中，可利用遗传工程将编码黄病毒结构蛋白的核酸加入黄病毒基因组中。
因而，本发明一较佳的实施方式提出了一种经分离的重组黄病毒颗粒，其包含病毒粒子单元，而该病毒粒子单元包含本发明的经分离的病毒重组体。此病毒粒子可作为抗原(如，活毒疫苗(livevaccine)或死毒疫苗(killedvaccine))，以在对象体内诱发至少针对本发明的黄病毒复制子编码的外源多肽的保护性免疫反应。因此，可据以制造出一种免疫疗法组合物(immunotherapeuticcomposition)或疫苗。可利用上述免疫疗法组合物或疫苗来预防性地或治疗性地使动物(如人类)免疫。
因此，本发明的第四方式中提出了一种在对象体内诱发免疫反应的方法。上述方法包含将本发明的经分离的重组黄病毒颗粒投予该对象，其中该投予的步骤使得该外源多肽能够表达，因而可在该对象体内诱发对于该外源多肽的免疫反应。上述对象可以是脊椎动物，如乳牛、绵羊、狗、鸟类、猪等。在其它实施方式中，上述脊椎动物可为哺乳类动物；该哺乳类动物较佳为人类。
本发明的某些实施方式亦包含了一种经转染细胞，其包含本发明的病毒重组体。上述经转染细胞可以是能够表达由重组体编码的外源多肽的任一种细胞类型。举例来说，已知可利用JEV载体于哺乳类动物细胞中表达外源多肽，适当的哺乳类动物细胞的实施例包括但不限于：BHK-21细胞、绿猿肾脏癌Vero细胞与C6/36细胞；较佳为BHK-21细胞。
本发明亦有关于一种套组，此套组可供应进行细胞转染所必需的材料。举例来说，此套组包含本发明的经分离的病毒重组体，以及此种经分离的病毒重组体的使用说明。
在一实施方式中提出了用以将目标DNA序列插入至病毒重组体中的套组。上述病毒重组体包含第一核酸序列与第二核酸序列，其中该第二核酸序列操作连接至该第一核酸序列。上述第一核酸序列编码JEVNS1片段，其包含JEVNS1的至少氨基酸残基1至340位；而上述第二核酸序列编码尾部多肽，其包含JEVNS1的至少氨基酸残基344至352位。可根据套组内提供的使用说明将目标DNA序列插入至该第一及第二核酸序列之间，以得到用以在细胞内表达外源多肽的病毒重组体。在任选的实施方式中，上述套组可更包含第三种核酸序列，其位于该第一及第二核酸序列之间。此第三核酸序列编码FMDV-2A肽，且可根据套组内提供的使用说明将目标DNA序列插入至该第三及第二核酸序列之间，以得到用以在细胞内表达外源多肽的病毒重组体。
或者是，可预先将目标DNA序列插入至病毒重组体中。在此种情形中，所提供的套组可包含用以在细胞中表达外源多肽的病毒重组体及其使用说明。在一实施方式中，上述用以在细胞中表达外源多肽的病毒重组体依序包含：上述第一核酸序列、目标DNA序列以及上述第二核酸序列。在任选的实施方式中，用以在细胞中表达外源多肽的病毒重组体依序包含：上述第一核酸序列、上述第三核酸序列、目标DNA序列以及上述第二核酸序列。
在某些任选的实施方式中，任何上述套组亦可包含可受该病毒重组体感染的适当细胞。
该经分离的病毒重组体的使用说明可包含所提供的经分离的病毒重组体的数量或浓度。若所提供的是干燥的重组体，使用说明可包含于溶液中重建(reconstitute)该重组体的方法。使用说明亦可教导如何将该重组体引入细胞内。此外，使用说明可指出可经该重组体转染的各种细胞类型，以及如何培养经转染细胞，而使得这些细胞能够表达所欲的外源多肽。使用说明亦可提出如何由转染细胞或转染细胞所产生的条件细胞培养介质中取得所欲的外源多肽。套组内可包含纸本印刷或电子形式的使用说明；或者是可将使用说明储存于因特网(internet)或商际网络(extranet)网站，并于套组内提供可用以存取使用说明内容的连结(link)或因特网地址(internetaddress)。上述的因特网网站可以是公开的或具安全机制的网站。
该套组内的各种材料可分别包装于适当的容器内，如小玻璃瓶(vials)、试管(tubes)、微滴定孔盘(microtiterwellplates)、瓶子(bottles)及与其相似者。套组内亦可包含独立包装的其它试剂；如，阳性对照组(positivecontrol)样本、阴性对照组(negativecontrol)样本、缓冲液、细胞培养介质等。
相关领域中具有通常知识者在阅读了以下的本发明实验例后，将可更清楚地了解本发明的各种实施方式与优点。
实验例
下文实施例旨在完整地向本领域具有通常知识者说明与叙述如何制造与使用本发明，其本意并非用以限制本发明的范围，且当可理解这些实验例仅非研发过程中所进行的部分实验。已透过适当努力来确保此处提出的数据(如用量、温度等等)尽可能正确，但仍无法完全排除实验过程所致的误差与偏差。
实验例1
产生日本脑炎病毒(JEV)重组体
利用下文所述的步骤来进行JEV复制子J-R2A的重组。根据梁等人[Liangetal,Vaccine(2009)27:2746-2754]先前提出的方法来制备CMV-RP-9-ribo-polyA/pBR322，这是台湾株RP-9日本脑炎病毒[美国国家生物科技信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，简称NCBI)编号：AF014161]的全长且具感染性的cDNA克隆株。利用此cDNA克隆株作为JEV复制子的重组体J-R2A(图1)，利用跳跃式(jumping)聚合酶链反应(polymerasechainreaction，简称PCR)来移除此重组体中的日本脑炎病毒的结构基因C-prM-E，并以水母荧光酶(Renillaluciferase)基因取而代之。此外，将FMDV2A肽序列插入于作为报导基因的水母荧光酶基因之后，而使得在转译之后，可以精确地将水母荧光酶与非结构蛋白切割开来。简言之，利用PCR截断JEVcDNA克隆株的C-prM-E。使用引物prJE2388ApaKpnF(SEQIDNO:1：5’-gagggcccatggtaccatgggcgtcaacgcacga-3’)及引物JE4507-4489(-)(SEQIDNO:2：5’-cagaccttccatggaacac-3’)来扩增JEV部分E至NS2片段；将扩增的产物经过ApaI与XmaI切割后放置于CMV-RP-9-ribo-polyA/pBR322的C-prM-E部分中。之后利用引物prJE181-197-AgeI-RLuc(SEQIDNO:3：5’-cataaactttcgaagtcatac-cggtta-ctacc-ctcttcactc-3’)、prJE1-25-F(SEQIDNO:4：5’-agaagtttatctgtgtgaacttctt-3’)以及prRLuc-NotKpnR(SEQIDNO:5：5’-ctggtaccggcggccgcttgttcatttttgagaactc-3’)来扩增水母荧光酶基因并回复用以编码部分衣壳的复制所必需的CS序列。利用ApaI与KpnI来切割此PCR产物，并将产物插入至删除了C-prM-E的cDNA克隆株中。最后，利用引物prFMDV2A_F(SEQIDNO:6：5’-gctagcggccgccaacttcgacctcctcaagttggcgggagacg-3’)以及prFMDV2A_R(SEQIDNO:7：5’-ctggtacccggcccagggttgga-ctcaac-gtctc-ccgccaacttg-3’)来进行PCR扩增，以将FMDV2A肽序列引入至该重组体中。利用NotI与KpnI进行切割，以将FMDV2A序列引入上述cDNA克隆株中，将所得到的克隆株编号为J-R2A(图1)。
利用单引物突变由J-R2A复制子得到J-R2A-M复制子，其中利用引物prJE_SP_NS2A_3856-3897(+)(SEQIDNO:8：5’-tcctaggggctgcctttttccagttagcctcagt-agatctgc-3’)及prR2A_SP_polyA_10106-10147(+)(SEQIDNO:9：5’-tgaacctgaaacataa-aatgaatgcagttgttgttgttaacttgtt-3’)静默移除其中的MfeI酶切位点。位于J-R2A的NS2A中以及δ核糖核酸酶中的MfeI部位皆被移除。利用类似的方法，取代RP9-X中与J-R2A-M相对应的区域来得到具感染性的RP9-XM重组体(图1)，且在老鼠试验中，由RP9-XM回收病毒的感染力与其亲本RP9-X者不相上下。
实验例2
利用实验例1的J-R2A的NS1C端截断突变株来决定JEVNS1的功能
设计生产了多种有缺陷的复制子J-R2A-dNS1(即，实验例1的J-R2A的NS1C端截断突变株)，并利用反式互补分析(trans-complementationassays)分别分析每一突变株的功能，以探究JEVNS1C端氨基酸和NS1功能之间的关系。具体来说，以J-R2A-dNS1以及一系列独立表达的NS1C端截断突变株(包括J-NS1.332/pCR3.1、J-NS1.337/pCR3.1、J-NS1.342/pCR3.1以及J-NS1.344/pCR3.1)进行互补分析。将每一种J-NS1C端截断克隆株进行反式互补分析，并于转染后96个小时收集每一克隆株的细胞溶解产物，且利用双重荧光酶分析(dualluciferaseassay)来定量每一克隆株的复制能力。
简言之，将每一重组复制子DNA(0.3μg)以及作为内部控制用的pGL3质粒DNA(0.03μg)和1.5μl的脂质体(Lipofectamine)2000(购自Invitrogen,USA)混合；另外，24孔培养盘中每一孔的BHK-21细胞密度(confluence)为50-60％，利用上述混合物分别感染每一孔中的细胞。进行反式互补分析时，将0.3μg的重组J-NS1.flag/pCR3.1质粒DNA、0.3μg的复制子DNA加上0.03μg的pGL3质粒DNA和脂质体2000混合，并采用与上文类似的步骤，以此混合物共同转染BHK-21细胞。于转染48或96小时之后，收集每一克隆株的细胞溶解产物，并利用商业套组(Promega,Madison,WI,USA)根据制造商的使用说明针对每一克隆株进行荧光酶活性分析，试验结果见于图2。
J-R2A-dNS1是一种NS1缺失突变株，其中删除了NS1的第61-260位氨基酸，试验发现此种删除会导致病毒丧失复制能力(图2)。另一方面，若J-R2A-dNS1和能够经由CMV启动子来表达JEVNS1蛋白的J-NS1.flag/pCR3.1进行反式互补时，即可回复其病毒复制能力(图2)。此外，结果显示C端截断的突变株J-NS1.332/pCR3.1在反式互补分析中无法回复病毒复制能力；但截断突变株J-NS1.337/pCR3.1则展现了较低的复制能力；而截断突变株J-NS1.342/pCR3.1或J-NS1.344/pCR3.1所表达出的反式互补复制能力则与J-NS1.flag/pCR3.1不相上下。
由此可知全长为352个氨基酸的JEVNS1需要至少342个氨基酸才能展现NS1完整功能，而将NS1的C端变短可以减弱其复制能力。另外，NS1的C端的最末8个氨基酸是进行多聚蛋白处理区以分隔NS1与NS2A所必需的(FalgoutandMarkoff,(1995)JVirol69:7232-7243)，因此推论出可将外源肽插入于NS1蛋白的第342至344位氨基酸之间。
实验例3
设计生产包含JEVNS1与肠病毒71型(EV71)SP70抗原决定区的融合蛋白
在本实验例中，首先利用单引物突变产生法将两个限制性酶切位点BssHII与PmlI引入NS1C端氨基酸343及344中，此重组体称为J-NS1.BP.flag/pCR3.1。此克隆株的复制能力略低于J-NS1.flag/pCR3.1的复制能力。同时，将一外源肽—肠病毒71型(EV71)SP70抗原决定区(序列YPTFGEHKQEKDLEY)[参见Fooetal.,(2007)VirusRes125:61-68]插入上述J-NS1.BP.flag/pCR3.1之中，所得克隆株称为J-NS1.EV71.flag/pCR3.1。反式互补试验显示，融合了EV71SP70的J-NS1.343SP70.flag/pCR3.1克隆株的复制能力降低至约50％(图3)。此种复制能力的降低可能是因为插入序列使得NS1的C端变长或是使得NS1的构型改变所造成。
此外，利用常用的克隆技术(如限制性酶剪切与接合)重组出J-R2A-343SP70(图4)重组体。在J-R2A-343SP70克隆株中，将EV71SP70插入于JEVNS1343与尾部多肽344之间。于确认序列之后，将J-R2A-343SP70与J-R2A的质粒DNA转染至BHK-21细胞中，并根据上文所述的方法利用双重荧光酶分析系统来定量其复制能力。结果显示J-R2A-343SP70所展现的复制活性为亲本J-R2A的50％(图5)，这意味着在邻近NS1的C端处插入EV71SP70抗原决定区对于病毒复制的影响有限。
进行Western印迹分析，以确认融合蛋白的表达。简言之，使用分别对JEVNS1及EV71VP1具专一性的抗血清J2-54以及PAB7630-B01P(购自AbnovaCorp,USA)来进行Western印迹分析。以被动溶解缓冲液(passivelysisbuffer，购自Promega,Madison,WI,USA)来处理经转染的BHK-21细胞，并收集全蛋白溶解物；之后进行10％PAGE并转移至PVDF薄膜。结果如图6所示。
抗J-NS1抗血清可和J-NS1单体、J-NS1同型二聚体蛋白以及J-NS1和J-NS1’的异型二聚体进行专一结合。图6的结果确认NS1可形成二聚体，且形成二聚体的NS1的分子量与带有EV71SP70抗原决定区的融合J-NS1相同(与原生J-NS1和蛋白质大小标记相较)。多株PAB7630-B01P可专一地辨识和EV71SP70抗原决定区融合的二聚体J-NS1蛋白，而无法辨识原生J-NS1。这些结果显示EV71SP70抗原决定区可和JNS1的C端融合，且之后可在活体细胞中正确地表达。
此外，以重组具感染性的JEV克隆株以及含EV71SP70融合NS1(RP9-SP70)者，转染BHK-21细胞，收集该细胞培养基，并利用PALLNanosep浓缩器(MWCO＝10K)将其浓缩，以探究NS1的分泌能力。利用10％PAGE进行分离并转渍至PVDF薄膜，之后利用抗-JEVNS1单株抗体以及抗-EV71VP1多株抗体进行Western印迹分析；结果呈现于图7。
此结果确认了与对照组病毒RP-9一样，重组JEVNS1-SP70可分泌至培养基中，且此重组JEVNS1-SP70与RP-9所分泌出的NS1一样呈现二聚体的形式。
总结来看，本实验例的结果显示，利用NS1的C端作为外来肽的载体所得到的具感染性的JEV重组克隆株可成功地在所感染的细胞内表达，并可分泌至感染细胞外。
实验例4
生产包含JEVNS1与多重肠病毒71型(EV71)SP70抗原决定区的融合蛋白
在本实验例中，利用与上文实验例3相似的方法，分别生产带有2、3、4套EV71SP70抗原决定区的融合蛋白。
已知J-R2A-343SP70(即1XSP70-J-R2A)重组体在EV71-SP70的DNA序列的5’端带有独特的BssHII限制性酶切位点，且在3’端带有MluI与PmlI限制性酶切位点。虽然BssHII和MluI是兼容的限制性酶切位点可彼此接合，此处是利用上文所述的步骤对EV71-SP70的PCR产物进行BssHII与PmlI双重切割，并将其和经过MluI与PmlI切割的J-R2A-NS1-SP70相接合。当BssHII和MluI彼此接合后，这两种限制性酶切位点都会消失，并于EV71SP70抗原决定区之间产生丙氨酸-亮氨酸(Ala-Leu)的二氨基酸；将所得到的克隆株称为2XSP70-J-R2A。同时可利用类似的方法克隆出3XSP70-J-R2A与4XSP70-J-R2A。在本实施例中，分别将22、39、56与73个氨基酸插入于JEVNS1343尾部多肽344之间，以得到1XSP70-J-R2A、2XSP70-J-R2A、3XSP70-J-R2A与4XSP70-J-R2A。确认多重EV71-SP70克隆株的序列之后，将多重EV71-SP70克隆株的质粒DNA转染至BHK-21细胞中，并利用双重荧光酶分析确认，结果如图8所示。
由图8可以看出，在转染后96小时，2XSP70-J-R2A和3XSP70-J-R2A的复制能力约为J-R2A的50％；而4XSP70-J-R2A的复制能力低于J-R2A复制能力的40％。
实验例5
接种343SP70重组JEV病毒的动物的生存曲线图
在本实验例中，进行接种了重组JEV病毒的动物的生存试验。对小鼠以颅骨内(intracerebral，简称i.c)注射的方式给予10μL的PBS以打破血脑障碍(blood-brainbarrier，简称BBB)；其后以腹膜内(intraperitoneal)注射的方式分别给予2x105菌斑形成单元(plaqueformationunit，简称pfu)的RP9-XM、2x105pfu的RP-2ms或2x105pfu的343SP70(即，插入了EV71SP70抗原决定区的重组JEV病毒)。经RP9-XM接种的动物在12天内全数死亡，但以弱毒株RP-2ms病毒以及重组JEV病毒(即，343SP70)接种的动物则仍在注射后21天分别有超过90％的存活(图9)。这些结果显示本发明的重组JEV病毒和弱毒疫苗株RP-2ms一样具有较弱的毒性。
实验例6
在以343SP70重组病毒诱发小鼠产生专一的抗体反应
在本实施例中，探讨了JEV343SP70-RP9是否能在免疫小鼠体内诱导专一辨识SP70抗原决定区的抗体产生。首先，由JEV343SP70感染的小鼠抽取血清。再利用重组EV71VP1蛋白质(P3386，购自Abnova)为抗原进行免疫印迹分析。利用抗EV71VP1的多株抗体PAB7630-B01P(购自Abnova)作为阳性控制组。图10的结果显示与JEVNS1融合的抗原决定区SP70确实可引发免疫的小鼠产生专一的抗体反应。
实验例7
设计生产包含JEVNS1与深海桡足类Gaussiaprinceps的荧光酶的融合蛋白
在本实施例中，利用深海桡足类Gaussiaprinceps荧光酶(Gaussialuciferase，简称Gluc)来探讨可插入至NS1的C端的外源肽的容量；Gluc是一种分泌性的蛋白质，全长为185个氨基酸。
首先，将Gluc(185个氨基酸)插入至JEVNS1343与尾部多肽344之间，以得到J-R2A-Gluc复制子。然而，此复制子的复制能力不及其亲本J-R2A复制子的复制能力。
为了解决此问题，将FMDV-2A肽(序列为NFDLLKLAGDVESNPGP(SEQIDNO:10)，共17个氨基酸)融合至Gluc的前方，以得到J-R2A-2A-Gluc复制子。此J-R2A-2A-Gluc复制子所含的外源多肽总长为202个氨基酸(185+17＝202)，且经上文所述的双重荧光酶分析显示，其于经转染的BHK-21细胞内的复制能力和亲本J-R2A复制子不相上下(图11)。
在不限于特定理论的前提下，据信FMDV-2A肽的转译切割功能可以适当地区隔开JEVNS1和Gluc，因而有助于复制过程的进行。此结果显示在外源多肽中加入蛋白酶片段，可提升病毒重组体的插入容量。
实验例8
生产包含JEVNS1与EV71VP1抗原决定区的融合蛋白
EV71衣壳蛋白质VP1是由297个氨基酸残基组成。因此，采用了和上文实验例6相似的方法来设计携带EV71VP1抗原决定区的复制子。具体而言，将由FMDV2A肽(17个氨基酸)、衍生自Gluc的分泌信号肽(序列为MGVKVLFALICIAVAEAGL(SEQIDNO:11)，共19个氨基酸)以及部分EV71VP1抗原决定区(对应于EV71VP1的第145至第261个氨基酸)所组成的外源多肽插入于JEVNS1343和尾部多肽344之间，以得到J-R2A-2A-Gss-VP1-C复制子。所插入的外源多肽的总长为153个氨基酸。双重荧光酶分析显示J-R2A-2A-Gss-VP1-C复制子的复制能力和亲本J-R2A复制子相近。
实验例9
生产包含JEVNS1与EV71SP70抗原决定区且插入于不同位置的融合蛋白
在本实施例中，探讨了各种插入位置以阐明这些位置是否能够容忍外源多肽的插入而不致于影响重组JEV的感染力。
具体而言，如图12所示，重组出六种病毒重组体：340341SP70、340344SP70、343341SP70、343344SP70、352341SP70、与352344SP70。这些重组体是根据所插入的EV71SP70抗原前后的氨基酸残基编号来命名。举例来说，cDNA克隆株340341SP70表示EV71SP70抗原是插入于JEVNS1340和尾部多肽341之间，而cDNA克隆株352344SP70表示EV71SP70抗原是插入于JEVNS1352和尾部多肽344之间。
由所制备出的这些重组JEV载体可以发现，在邻近JEVNS1的第343个氨基酸残基附近的区域(如，包含氨基酸340至352位的区域)颇具弹性，可供插入外来基因片段，而不会显著地影响所得重组JEV的感染力。
利用对NS1专一的抗体或对SP70专一的抗血清进行Western印迹分析，以研究NS1-SP70融合蛋白的表达，结果摘要整理于图13。具体来说，在感染后48小时，收集细胞培养基并依照上文所述的步骤将其浓缩。之后，针对JEVNS1利用抗血清J2-54或针对EV71VP1利用抗血清PAB7630-B01P(购自Abnova)来进行Western印迹分析。所有测试的重组JEV皆能使受感染细胞分泌NS1-SP70融合蛋白至培养基中，且更重要的是，这些融合蛋白和来自RP-9感染细胞的野生型的NS1蛋白一样，可以正确地形成二聚体。这些结果显示JEVNS1的C端区域适合融合外来肽，且于融合后不会干扰NS1在JEV复制中应发挥的功能。
实验例10
接种343341SP70与352341SP70重组JEV病毒的动物的生存曲线图
在本实施例中，利用与实验例5相似的步骤来探讨分别接种了重组343341SP70与352341SP70重组JEV病毒的动物的生存分析。
经RP9-XM接种的动物在10天内全数死亡。相较之下，经343341SP70与352341SP70重组JEV病毒接种的动物，在接种后21天则分别有超过55％与75％的动物仍然健康存活(图14)。这些结果显示，和野生型的RP-9病毒相较之下，本发明提出的重组JEV病毒对于受试小鼠具有较低的毒性。
实验例11
在引发免疫的小鼠体内诱发专一的抗体反应
在本实施例中，根据实验例6所述的步骤来探讨JEV352341SP70是否能引发免疫的小鼠产生专一辨识SP70抗原决定区的抗体反应。图15所示的结果显示出以352341SP70感染的小鼠的确会诱发产生强烈针对EV71VP1的抗体反应。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求范围所界定者为准。

Claims (20)

1.一种用以于细胞内表达外源多肽的分离的病毒重组体，包含日本脑炎病毒(JEV)复制子，其包含核酸，可编码产生融合蛋白，该融合蛋白依序包含：
日本脑炎非结构蛋白1(JEVNS1)片段，其是由该JEVNS1的氨基酸残基1位起到340至352位止的连续氨基酸残基所组成；
该外源多肽，其具有6至250个氨基酸；以及
尾部多肽，其是由JEVNS1的氨基酸残基341至344位起到352位止的连续氨基酸残基所组成，其中该融合蛋白的生产允许病毒复制；
所述的JEVNS1的序列如SEQIDNO:12所示。
2.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该外源多肽包含免疫原性片段。
3.如权利要求2所述的经分离的病毒重组体，其中该免疫原性片段为肠病毒71型SP70抗原、肠病毒71型VP1抗原或其一部分。
4.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该尾部多肽为该JEVNS1的氨基酸残基341至352位。
5.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该JEVNS1片段为该JEVNS1的氨基酸残基1至343位，且该尾部多肽为该JEVNS1的氨基酸残基341至352位。
6.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该JEVNS1片段为该JEVNS1的氨基酸残基1至343位，且该尾部多肽为该JEVNS1的氨基酸残基344至352位。
7.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该JEVNS1片段为该JEVNS1的氨基酸残基1至352位，且该尾部多肽为该JEVNS1的氨基酸残基341至352位。
8.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该JEVNS1片段为该JEVNS1的氨基酸残基1至352位，且该尾部多肽为该JEVNS1的氨基酸残基344至352位。
9.如权利要求2所述的经分离的病毒重组体，其中该外源多肽更包含蛋白酶片段，其位于该免疫原性片段之前，其中该蛋白酶片段包含如SEQIDNO:10所示的口蹄疫病毒2A肽，且该外源多肽具有至少100个氨基酸。
10.如权利要求9所述的经分离的病毒重组体，其中该外源多肽更包含分泌信号片段，其位于该蛋白酶片段及该免疫原性片段之间，其中该分泌信号片段包含如SEQIDNO:11所示的来自深海桡足类Gaussiaprinceps荧光酶的分泌信号肽。
11.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该JEV复制子包含CMV启动子，其操作上连接于该JEV复制子，而使得该细胞可表达该融合蛋白且其后将该融合蛋白分泌至该细胞外。
12.如权利要求1所述的经分离的病毒重组体，其中该细胞为BHK-21细胞、绿猿肾脏癌Vero细胞或C6/36细胞。
13.一种经分离的重组JEV颗粒，包含病毒粒子单元，该病毒粒子单元包含如权利要求1所述的经分离的病毒重组体。
14.如权利要求13所述的经分离的重组JEV颗粒，其中该外源多肽包含免疫原性片段，且该免疫原性片段为肠病毒71型SP70抗原、肠病毒71型VP1抗原或其一部分。
15.如权利要求13所述的经分离的重组JEV颗粒，其中该外源多肽包含免疫原性片段以及蛋白酶片段，其位于该免疫原性片段之前，且该蛋白酶片段包含口蹄疫病毒2A肽，且该外源多肽具有至少100个氨基酸。
16.一种经转染细胞，包含如权利要求1所述的经分离的病毒重组体。
17.如权利要求16所述的经转染细胞，其中该细胞为BHK-21细胞、绿猿肾脏癌Vero细胞或C6/36细胞。
18.如权利要求17所述的经转染细胞，其中该细胞为该BHK-21细胞。
19.如权利要求16所述的经转染细胞，其中该外源多肽包含免疫原性片段，且该免疫原性片段为肠病毒71型SP70抗原、肠病毒71型VP1抗原或其一部分。
20.如权利要求16所述的经转染细胞，其中该外源多肽包含免疫原性片段以及蛋白酶片段，其位于该免疫原性片段之前，且该蛋白酶片段包含口蹄疫病毒2A肽，且该外源多肽具有至少100个氨基酸。
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