TWI413691B - 黃病毒重組體及其應用 - Google Patents

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Description

黃病毒重組體及其應用 【相關申請案】
本申請案主張美國專利臨時申請案第61/384,720(2010年9月21日提申)之優先權，在此將其全文納入作為參照。
本發明一般係關於病毒重組體以及於宿主體內誘發專一免疫力之領域。具體來說，本發明係關於使用重組病毒載體以使一宿主接觸到一外源多胜肽抗原，且因而在宿主體內誘發一對該外源多胜肽抗原之免疫反應。
已針對各科的RNA病毒開發出以複製子為基礎的表現載體，這些病毒包括α病毒(alphaviruses)、微小核醣核酸病毒(picornaviruses)以及黃病毒(flaviviruses)。舉例來說，一些為人熟知的表現系統可利用黃熱病病毒(Yellow Fever virus，簡稱YFV)在宿主細胞內表現外來蛋白質或多胜肽，這些外來蛋白質或多胜肽在宿主細胞內可作為免疫原或治療藥劑。然而，在既有的表現系統或載體中，外來蛋白質或多胜肽的表現僅限於這些病毒的結構基因區域。
本發明提供在病毒的非結構基因區域中表現具有功能的外來蛋白質或多胜肽之能力，因而克服了既有表現系統或載體的缺點與缺陷；具體而言，上述非結構區域是指黃病毒的分泌性(secreted)非結構蛋白1(non-structure protein 1，簡稱NS1)之羧基端(C-terminus，以下稱C端)。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本發明提出係衍生自黃病毒(如日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，簡稱JEV)及登革熱病毒(dengue viruses，簡稱DEN))的病毒重組體及其用途。此病毒重組體編碼一融合蛋白，該融合蛋白包含一外源(即，非JEV或非DEN)多胜肽抗原以及一黃病毒非結構蛋白1(NS1)或其片段。更明確地說，此外源多胜肽抗原係插入於黃病毒NS1(如JEV NS1)的C端，且重組融合蛋白的生產不會影響病毒複製。當利用此病毒重組體感染細胞時，會產生包含有限增殖性病毒粒子(limited multiplicative virions，簡稱LMV)的黃病毒顆粒。每一LMV包含上述黃病毒複製子。此黃病毒顆粒可用以於宿主體內誘發對該外源多胜肽之免疫反應，且因而使得該宿主具備對抗該外源多胜肽的保護免疫力。
因此，本發明的第一態樣提供了一種經分離的病毒重組體，其可用以於細胞內表現一外源多胜肽。此經分離的病毒重組體包含一黃病毒複製子，其包含編碼一融合蛋白的核酸。此融合蛋白包含一非結構蛋白1(NS1)或其片段以及該外源多胜肽，其中該外源多胜肽的長度為至少6個胺基酸且係插入於該NS1的C端；此融合蛋白的產生不會影響病毒複製。
上述黃病毒複製子可以是日本腦炎病毒(JEV)複製子或登革熱病毒(DEN)複製子。在較佳的情形中，該黃病毒複製子為JEV複製子。
在採用JEV複製子的情形中，該JEV複製子包含編碼一融合蛋白之核酸，該融合蛋白依序包含：一JEV非結構蛋白1(JEV NS1)片段、該外源多胜肽以及一尾部多胜肽。上述JEV NS1片段包含JEV NS1的至少胺基酸殘基1至340；該外源多胜肽具有至少6個胺基酸；且該尾部多胜肽包含JEV NS1的至少胺基酸殘基344至352。
根據某些實施方式，上述外源多胜肽包含一免疫原性片段(immunogenic segment)，如腸病毒71型(enterovirus 71，簡稱EV71)SP70抗原、EV71 VP1抗原、B型肝炎病毒表面抗原，或上述抗原之免疫原性部分。在一實施方式中，上述外源多胜肽至少包含6個胺基酸；較佳為至少15個胺基酸。
可任選地，上述外源多胜肽亦可另包含位於該免疫原性片段之前的一蛋白酶片段(protease segment)以便水解分開前述融合蛋白。此蛋白酶片段可包含口蹄疫病毒2A(Foot-and-Mouth Disease virus 2A，簡稱FMDV-2A)胜肽。於此實施方式中，病毒重組體的插入容量(insertion capacity)較高；舉例來說，此外源多胜肽可為至少50個胺基酸；較佳為至少100個胺基酸；且更佳為至少150胺基酸。
黃病毒複製子包含操作上與其相連的一啟動子，因而能夠在細胞內表現含有外源多胜肽與黃病毒NS1的融合蛋白，且之後可將此融合蛋白分泌至細胞外。此處所用的細胞可以是幼倉鼠腎(baby hamster kidney)細胞(如，BHK-21細胞)、綠猿腎臟癌細胞(Vero細胞)或白線斑蚊(Aedes albopictus )C6/36蚊細胞株(簡稱C6/36細胞)。在較佳的情形中，所用的細胞為BHK-21細胞。
上述經分離的病毒重組體可更包含編碼黃病毒結構蛋白之核酸；上述結構蛋白如衣殼蛋白(capsid protein C，簡稱C)、結構前驅物膜蛋白(structural precursor-membrane protein，簡稱prM)、糖蛋白E(glycoprotein E，簡稱E)等，這些結構蛋白是將黃病毒複製子包裝成為黃病毒顆粒所必需的。在較佳的情形中，可利用遺傳工程將編碼黃病毒結構蛋白之核酸加入黃病毒基因組中。
因此，本發明的第二態樣提出了一種經分離的重組黃病毒顆粒，其包含一病毒粒子單元，而此病毒粒子單元包含本發明之病毒重組體。
本發明的第三態樣提出了一種在宿主體內誘發免疫反應的方法。上述方法包含將本發明之經分離的重組黃病毒顆粒投予該宿主，其中此投予步驟使得外源多胜肽能夠表現，進而在宿主體內誘發針對該外源多胜肽之免疫反應。在較佳的情形中，上述宿主可為一細胞或一哺乳類動物；在更佳的情形中，所述的哺乳類動物為人類。
在本發明的第四態樣中提出了一經轉染細胞，此細胞內包含了根據本發明第一態樣與相關實施方式的病毒重組體。
此外，本發明的第五態樣提出了以得到上述經轉染細胞的一種套組。此套組包含根據本發明的一種經分離的核酸重組體，以及該經分離的核酸重組體之使用說明。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
在本說明書中，除非另有定義，「包含」一詞的各種時態(comprise,comprises,and comprising)為包括性地(inclusively)而非排除性地(exclusively)，因而所述的事物(integers)或事物群組(group of integers)可包含一或更多種未敘述的其他事物或事物群組。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者慣用者相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書中所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而以所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。一般來說，此處針對細胞及組織培養物、分子生物學、蛋白質及寡核苷酸或聚核苷酸化學與雜合所用的命名或技術皆為本領域中所熟知且慣用者。此處採用了標準技術來進行重組DNA以及組織培養與轉型(transformation)；標準的轉型技術如脂質轉染(lipofection)。此處亦依照製造商的使用說明或相關領域慣用的技術或此處所述的方法來進行酵素性反應(enzymatic reactions)與純化(purification)。上述技術與流程通常是根據相關領域中熟知的既有技術來進行，且皆已見於本說明書中引述或論及之各種一般性或較為具體的文獻中。藥學組合物之製備、配方與遞送以及患者之治療皆採用標準技術。
除非另有定義或說明，下列本發明所用名詞之意義如下：「核酸」(nucleic acid)一詞在此係指稱單股或雙股RNA、mRNA、及DNA，包含cDNA與基因組DNA(genomic DNA)。
「多胜肽」(polypeptide)一詞在此泛指天然蛋白質(native protein)、或一多胜肽序列的片段(fragments)或類似物(analogs)。因此，多胜肽此一上位概念涵蓋了天然蛋白質、片段與類似物等下位概念。
當「重組」(recombinant)一詞與多胜肽編碼區域(coding regions)以及此編碼區域所編碼之多胜肽連用時，其係指非天然產物，其中上述編碼區域(通常是其表現)於體外(in vitro )經人為操控而與其在天然狀態中有所不同。可利用相關領域中已知的多種不同重組系統來生產本發明之方法中所用的多胜肽，這些重組系統包括但不限於原核或真核系統。為了要能夠在適當的表現系統中表現，可將所欲得到的病毒多胜肽編碼區域與一表現載體在操作上相連，並將其引入宿主細胞中以利表現進行。可將具有適當調控區域(regulatory regions)的編碼區域排列於適當的配向(orientation)並置於適當的閱讀框架(reading frame)中以利表現進行。基因構築的方法為相關領域所熟知。具體來說，可參見Sambrook等人所著的Molecular Cloning,A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Laboratory,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)]及其中引用的文獻。
「經分離的」(isolated)一詞在此係用以指稱一分子，此一詞彙係指該分子已自其天然原生環境(native environment)中移除。舉例來說，天然存在於一活體動物體內的聚核苷酸或多胜肽並非「經分離的」，但當此相同的聚核苷酸或多胜肽與在天然狀態下和其共存的材料分離時，即為「經分離的」。此外，基於本發明之目的，一載體中所攜帶的重組DNA分子視為經分離的。經分離的DNA分子包括活體內(in vivo )或活體外(in vitro )的DNA分子。經分離的核酸分子更包含利用合成而產生的分子。此外，重組宿主細胞內所含的載體分子亦為經分離的。
在此處「重組體」(construct)或「載體」(vector)等詞係指用以將遺傳材料傳送至宿主細胞的物體，如，質體(plasmid)或病毒。重組體或載體可由DNA或RNA所構成。
在此處「外源或異源聚核苷酸序列」(exogenous or heterologous polynucleotide sequence)係指存在於本發明之重組體或載體中的第二種核苷酸序列。「外源或異源多胜肽序列」(exogenous or heterologous polypeptide sequence)係指由本發明之載體中所含的外源聚核苷酸序列所編碼的任何胺基酸序列。在異源聚核苷酸序列所處的細胞中，其可編碼在該細胞類型中通常可表現或不會表現的蛋白質或RNA分子。
「黃病毒」(flavivirus)與「黃病毒的」(flaviviral)等詞係用來指稱黃病毒科(Flaviviridae )中黃病毒屬(Flavivirus )之成員，黃病毒屬包括65種以上的相關病毒物種。一般來說，黃病毒是小型的包膜RNA病毒(enveloped RNA viruses)，其包膜體(peplomer)包含單一的糖蛋白(glycoprotein)E。其他結構蛋白有核蛋白(core protein)C；以及似膜蛋白(membrane-like protein)M。黃病毒可感染非常多種的脊椎動物，且多種黃病毒係透過節肢動物[如，蜱(tick，即壁蝨)與蚊子]來傳播。具體而言，黃病毒之例示包括西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)、昆金病毒(Kunjin virus)、黃熱病病毒(YFV)、日本腦炎病毒(JEV)、登革熱病毒(DEN)、于圖病毒(Usutu virus)、聖路易腦炎病毒(St Louis Encephalitis virus，SLE)及蜱傳腦炎病毒(tick-born encephalitis virus，TBEV)。在較佳的情形中，適用於本發明之黃病毒為JEV與DEN。
「病毒重組體」(recombinant viral construct)一詞係指能夠引導一或多目標序列或基因表現之總成(assembly)。此種病毒重組體係由能夠起始病毒RNA(如，JEV RNA)複製的5’序列以及於表現時可編碼具生物活性之病毒非結構蛋白質之序列所組成。所述的病毒重組體亦可包含：來自一或多結構和/或非結構蛋白質基因之序列或其部份；外源核酸分子，其大小足以產生可存活的病毒；5’啟動子，其能夠起始由cDNA在活體外生成病毒RNA；欲表現的外源序列；以及一或多限制部位以供插入異源序列。
「複製子」一詞係指在標的細胞(target cell)中能夠引導其自身進行活體內增殖或自我複製的病毒DNA或RNA分子。為了要能夠引導其自身的複製，該DNA或RNA分子可：(1)編碼一或多種聚合酶(polymerase)、複製酶(replicase)或可和衍生自病毒或宿主細胞之蛋白質、核酸或核醣核蛋白(ribonucleoprotein)互動的其他蛋白質，此類蛋白質可催化DNA或RNA複製；以及(2)含有複製所必需的順式(cis)DNA或RNA序列，此序列可和其自身編碼之蛋白質(self-encoded proteins)或非其自身編碼之蛋白質(non-self-encoded proteins)、衍生自細胞之蛋白質(cell-derived proteins)、核酸或核醣核蛋白等結合，或複合於任何上述成分之間。在RNA轉染(transfection)或質體DNA轉染後，黃病毒複製子RNA會進行自我複製而於細胞內產生黃病毒複製子RNA，可提供來自一第二載體之結構蛋白，藉以將所產生的黃病毒複製子RNA包裝於分泌性似病毒顆粒(secreted virus-like particles，簡稱VLP)中。
本發明至少部分係基於發現到黃病毒(如，JEV)之非結構蛋白1(NS-1)的C端部分可容忍外源多胜肽之插入，因而其可作為使外來抗原決定區(epitope)與宿主接觸的適當途徑。此外，在黃病毒複製子中加入外源多胜肽並不會明顯地降低黃病毒複製子的複製能力。
可以理解，本發明提出了一種病毒重組體，其能夠使另一有毒(virulent)和/或致病(pathogenic)病毒之免疫原性抗原決定區與宿主接觸。因此，本發明可用於人類醫學與獸醫學領域。
因此，在較佳實施方式中，本發明包含一種用以於細胞內表現一外源多胜肽之經分離的病毒重組體。上述經分離的病毒重組體包含一JEV複製子，此JEV複製子包含編碼一融合蛋白的一核酸，此融合蛋白包含一JEV非結構蛋白1(JEV NS1)或其片段以及一外源多胜肽，其中該外源多胜肽的長度為至少6個胺基酸且插入於JEV NS1的C端中，其中該外源多胜肽之生產不會影響病毒複製。
更明確地說，上述融合蛋白依序包含：一JEV非結構蛋白1(JEV NS1)片段、該外源多胜肽以及一尾部多胜肽。一般來說，上述外源多胜肽具有至少6個胺基酸；較佳為至少15個胺基酸；更佳為至少50個胺基酸。具體而言，所插入之外源多胜肽可包含至少6、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個胺基酸。舉例來說，下文實施例所述的某些外源多胜肽其長度分別為22、39、56與73個胺基酸。
上述JEV NS1片段包含JEV NS1的至少胺基酸殘基1至340，且該尾部多胜肽包含JEV NS1的至少胺基酸殘基344至352。在本說明書中，將包含JEV NS1胺基酸殘基1至n的JEV NS1片段稱為JEV NS1n ，並將包含JEV NS1胺基酸殘基m至352的尾部多胜肽稱為尾部多胜肽m 。
根據本發明一實施方式，融合蛋白包含JEV NS1340 、外源多胜肽及尾部多胜肽341 ，如下文所述之cDNA選殖株(clone)340341 SP70。在另一實施方式中，融合蛋白包含JEV NS1343 、外源多胜肽及尾部多胜肽344 ，如下文所述之cDNA選殖株343344 SP70。在又一實施方式中，融合蛋白包含JEV NS1340 、外源多胜肽及尾部多胜肽344 ，如下文所述之cDNA選殖株340344 SP70。
在不受限於理論的前提下，據信在此融合蛋白的末端連續存有JEV NS1之胺基酸殘基344至352乃表現與分泌此一融合蛋白所必需。因此，在一實施方式中，融合蛋白包含JEV NS1352 、外源多胜肽及尾部多胜肽344 ，如下文所述之cDNA選殖株352344 SP70。
在某些情形中，在此融合蛋白的末端較佳需連續存有JEV NS1之胺基酸殘基341至352。因而，融合蛋白包含一JEV NS1343 、外源多胜肽及尾部多胜肽341 ，如下文所述之cDNA選殖株343341 SP70。在另一實施方式中，融合蛋白包含JEV NS1352 、外源多胜肽及尾部多胜肽341 ，如下文所述之cDNA選殖株352341 SP70。
根據本發明的原理與精神，外源多胜肽包含一免疫原性片段，如EV71 SP70抗原、EV71 VP1抗原或其免疫原性部分。根據一實施方式，上述外源多胜肽的長度為至少6個胺基酸；較佳為至少15個胺基酸。在非限制性的例示中，外源多胜肽為EV71 SP70抗原，其胺基酸序列為YPTFGEHKQEKDLEY，共15個胺基酸。在一實施方式中，將腸病毒71型(EV71)SP70抗原序列插入於JEV NS1343 及尾部多胜肽344 之間；所插入的胺基酸序列為galYPTFGEHKQEKDLEYasra，共22個胺基酸，其中小寫者為連接序列(linker)，如第4圖所示。在其他實施方式中，將包含2、3或4倍的上述EV71 SP70抗原序列(YPTFGEHKQEKDLEY)之免疫原性片段分別插入JEV NS1343 以及尾部多胜肽344 之間，可得到具有較低病毒複製力或感染力的重組體；這些免疫原性片段的長度分別為39、56與73個胺基酸，如第8圖所示。
在可任選的實施方式中，上述外源多胜肽可更包含位於該免疫原性片段之前的蛋白酶片段，因而得到一種具有較高插入容量之病毒重組體。上述蛋白酶片段可包含一口蹄疫病毒2A(FMDV-2A)胜肽。於此實施方式中，所得之病毒重組體能夠攜帶長度為至少100個胺基酸之外源多胜肽。具體來說，欲插入之外源多胜肽的長度可為至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250個胺基酸。舉例來說，下文實施例中所述的兩種外源多胜肽之長度分別為153與202個胺基酸。
同樣可任選地，上述外源多胜肽可更包含位於該蛋白酶片段與免疫原性片段之間的分泌訊息(secretion-signal)片段。上述分泌訊息片段包含來自深海橈足類名為Gaussia princeps 之螢光酶(luciferase)的分泌訊息胜肽。
在一例示的實施方式中，上述外源多胜肽的總長為153個胺基酸，其係由FMDV-2A胜肽(NFDLLKLAGDVESNPGP，17個胺基酸)、來自Gaussia princeps 螢光酶之分泌訊息胜肽(MGVKVLFALICIAVAEAGL，19個胺基酸)以及EV71 VP1之胺基酸殘基145至261(117胺基酸)所組成。此一外源多胜肽係插入於JEV NS1343 以及尾部多胜肽344 之間。
可將一適當的啟動子在操作上連接(operably linked)至上述複製子，來協助在宿主細胞內進行病毒複製子以及連接至該病毒複製子之該外源多胜肽的擴增或自我複製。適當的啟動子包括但不限於：可透過細菌乳糖操縱子(lac operon)誘導的可由哺乳類動物操作(mammalian-operable)之啟動子，譬如受乳糖操控之(lac-regulated)CMV或RSV啟動子)。較佳的啟動子為CMV啟動子。
適用於接受本發明之病毒重組體的宿主細胞可為BHK-21細胞、綠猿腎臟癌Vero細胞或C6/36細胞。較佳的宿主細胞為BHK-21細胞。
本發明的特徵在於使得外源蛋白質或多胜肽能夠在病毒的非結構區域中表現出功能；更明確地說，上述病毒的非結構區域係指黃病毒的非結構蛋白1(NS1)。非結構蛋白1含有兩個可區分的結構域(domains)或區域，而目前科學界仍不清楚這兩種結構域在病毒複製中所扮演的角色。在已知的各種黃病毒之間，其C端區域的長度與序列並非保留(conserved)區域，且此一區域可容忍多重變異。在本發明一實驗例中針對JEV NS1的C端區域進行了插入/缺失試驗。試驗結果顯示，可將由至少6個胺基酸組成的外源多胜肽插入NS1的C端中。
上經分離的病毒重組體可更包含編碼黃病毒結構蛋白(如，結構蛋白C、prM與E)之核酸，這些結構蛋白是將黃病毒複製子包裝成為黃病毒顆粒所必需的。在較佳的情形中，可利用遺傳工程將編碼黃病毒結構蛋白之核酸加入黃病毒基因組中。
因而，本發明一較佳的實施方式提出了一種經分離的重組黃病毒顆粒，其包含一病毒粒子單元，而該病毒粒子單元包含本發明之經分離的病毒重組體。此病毒粒子可作為抗原(如，活毒疫苗(live vaccine)或死毒疫苗(killed vaccine))，以在一對象體內誘發至少針對本發明之黃病毒複製子編碼的外源多胜肽之保護性免疫反應。因此，可據以製造出一種免疫療法組合物(immunotherapeutic composition)或疫苗。可利用上述免疫療法組合物或疫苗來預防性地或治療性地使動物(如人類)免疫。
因此，本發明的第四態樣提出了一種在一對象體內誘發免疫反應的方法。上述方法包含將本發明之經分離的重組黃病毒顆粒投予該對象，其中該投予的步驟使得該外源多胜肽能夠表現，因而可在該對象體內誘發對於該外源多胜肽之免疫反應。上述對象可以是脊椎動物，如乳牛、綿羊、狗、鳥類、豬等。在其他實施方式中，上述脊椎動物可為哺乳類動物；該哺乳類動物較佳為人類。
本發明的某些實施方式亦包含了一種經轉染細胞，其包含本發明之病毒重組體。上述經轉染細胞可以是能夠表現由重組體編碼之外源多胜肽的任一種細胞類型。舉例來說，已知可利用JEV載體於哺乳類動物細胞中表現外源多胜肽，適當的哺乳類動物細胞之實施例包括但不限於：BHK-21細胞、綠猿腎臟癌Vero細胞與C6/36細胞；較佳為BHK-21細胞。
本發明亦有關於一種套組，此套組可供應進行細胞轉染所必需的材料。舉例來說，此套組包含本發明之經分離的病毒重組體，以及此種經分離的病毒重組體之使用說明。
在一實施方式中提出了用以將目標DNA序列插入至一病毒重組體中的套組。上述病毒重組體包含第一核酸序列與第二核酸序列，其中該第二核酸序列操作連接至該第一核酸序列。上述第一核酸序列編碼一JEV NS1片段，其包含JEV NS1的至少胺基酸殘基1至340；而上述第二核酸序列編碼一尾部多胜肽，其包含JEV NS1的至少胺基酸殘基344至352。可根據套組內提供的使用說明將目標DNA序列插入至該第一及第二核酸序列之間，以得到用以在細胞內表現外源多胜肽之病毒重組體。在任選的實施方式中，上述套組可更包含第三種核酸序列，其係位於該第一及第二核酸序列之間。此第三核酸序列編碼FMDV-2A胜肽，且可根據套組內提供的使用說明將目標DNA序列插入至該第三及第二核酸序列之間，以得到用以在細胞內表現外源多胜肽之病毒重組體。
或者是，可預先將目標DNA序列插入至病毒重組體中。在此種情形中，所提供的套組可包含用以在細胞中表現外源多胜肽之病毒重組體及其使用說明。在一實施方式中，上述用以在細胞中表現外源多胜肽之病毒重組體依序包含：上述第一核酸序列、目標DNA序列以及上述第二核酸序列。在任選的實施方式中，用以在細胞中表現外源多胜肽之病毒重組體依序包含：上述第一核酸序列、上述第三核酸序列、目標DNA序列以及上述第二核酸序列。
在某些任選的實施方式中，任何上述套組亦可包含可受該病毒重組體感染的適當細胞。
該經分離的病毒重組體之使用說明可包含所提供之經分離的病毒重組體之數量或濃度。若所提供的是乾燥的重組體，使用說明可包含於溶液中重建(reconstitute)該重組體的方法。使用說明亦可教導如何將該重組體引入細胞內。此外，使用說明可指出可經該重組體轉染之各種細胞類型，以及如何培養經轉染細胞，而使得這些細胞能夠表現所欲的外源多胜肽。使用說明亦可提出如何由轉染細胞或轉染細胞所產生之條件細胞培養介質中取得所欲的外源多胜肽。套組內可包含紙本印刷或電子形式的使用說明；或者是可將使用說明儲存於一網際網路(internet)或商際網路(extranet)網站，並於套組內提供可用以存取使用說明內容之連結(link)或網際網路地址(internet address)。上述的網際網路網站可以是公開的或具安全機制的網站。
該套組內的各種材料可分別包裝於適當的容器內，如小玻璃瓶(vials)、試管(tubes)、微滴定孔盤(microtiterwell plates)、瓶子(bottles)及與其相似者。套組內亦可包含獨立包裝的其他試劑；如，陽性對照組(positive control)樣本、陰性對照組(negative control)樣本、緩衝液、細胞培養介質等。
相關領域中具有通常知識者在閱讀了以下的本發明實驗例後，將可更清楚地瞭解本發明的各種態樣與優點。
實驗例
下文實施例旨在完整地向本領域具有通常知識者說明與敘述如何製造與使用本發明，其本意並非用以限制本發明之範圍，且當可理解這些實驗例僅非研發過程中所進行的部分實驗。已透過適當努力來確保此處提出的數據(如用量、溫度等等)盡可能正確，但仍無法完全排除實驗過程所致的誤差與偏差。
實驗例1產生日本腦炎病毒(JEV)重組體
利用下文所述的步驟來進行JEV複製子J-R2A的重組。根據梁等人[Liang et al,Vaccine(2009) 27: 2746-2754]先前提出的方法來製備CMV-RP-9-ribo-polyA/pBR322，這是台灣株RP-9日本腦炎病毒[美國國家生物科技資訊中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)編號：AF014161]的全長且具感染性之cDNA選殖株。利用此cDNA選殖株作為JEV複製子的重組體J-R2A(第1圖)，利用跳躍式(jumping)聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)來移除此重組體中的日本腦炎病毒的結構基因C-prM-E，並以水母螢光酶(Renilla luciferase)基因取而代之。此外，將FMDV 2A胜肽序列插入於作為報導基因的水母螢光酶基因之後，而使得在轉譯之後，可以精確地將水母螢光酶與非結構蛋白切割開來。簡言之，利用PCR截斷JEV cDNA選殖株之C-prM-E。使用引子prJE2388ApaKpnF(序列編號1：5'-gagggcccatggtaccatgggcgtcaacgcacga-3’)及引子JE4507-4489(-)(序列編號2：5'-cagaccttccatggaacac-3')來擴增JEV部分E至NS2片段；將擴增的產物經過ApaI與XmaI切割後放置於CMV-RP-9-ribo-polyA/pBR322的C-prM-E部分中。之後利用引子prJE181-197-AgeI-RLuc(序列編號3：5'-cataaactttcgaagtcataccggttactacc-ctcttcactc-3')、prJE1-25-F(序列編號4：5'-agaagtttatctgtgtgaacttctt-3')以及prRLuc-NotKpnR(序列編號5：5'-ctggtaccggcggccgcttgttcatttttgagaactc-3')來擴增水母螢光酶基因並回復用以編碼部分衣殼之複製所必需的CS序列。利用ApaI與KpnI來切割此PCR產物，並將產物插入至刪除了C-prM-E之cDNA選殖株中。最後，利用引子prFMDV2A_F(序列編號6：5'-gctagcggccgccaacttcgacctcctcaagttggcgggagacg-3')以及prFMDV2A_R(序列編號7：5'-ctggtacccggcccagggttgga-ctcaacgtctcccgccaacttg-3')來進行PCR擴增，以將FMDV 2A胜肽序列引入至該重組體中。利用NotI與KpnI進行切割，以將FMDV 2A序列引入上述cDNA選殖株中，將所得到的選殖株編號為J-R2A(第1圖)。
利用單引子突變由J-R2A複製子得到J-R2A-M複製子，其中利用引子prJE_SP_NS2A_3856-3897(+)(序列編號8：5’-tcctaggggctgcctttttccagttagcctcagtagatctgc-3’)及prR2A_SP_polyA_10106-10147(+)(序列編號9：5’-tgaacctgaaacataaaatgaatgcagttgttgttgttaacttgtt-3’)靜默移除其中的MfeI辨識部位。位於J-R2A之NS2A中以及δ核醣核酸酶中的MfeI部位皆被移除。利用類似的方法，取代RP9-X中與J-R2A-M相對應的區域來得到具感染性的RP9-XM重組體(第1圖)，且在老鼠試驗中，由RP9-XM回收病毒的感染力與其親本RP9-X者不相上下。
實驗例2利用實驗例1之J-R2A的NS1 C端截斷突變株來決定JEV NS1的功能
設計生產了多種有缺陷的複製子J-R2A-dNS1(即，實驗例1之J-R2A的NS1 C端截斷突變株)，並利用反式互補分析(trans -complementation assays)分別分析每一突變株的功能，以探究JEV NS1C端胺基酸和NS1功能之間的關係。具體來說，以J-R2A-dNS1以及一系列獨立表現的NS1 C端截斷突變株(包括J-NS1.332/pCR3.1、J-NS1.337/pCR3.1、J-NS1.342/pCR3.1以及J-NS1.344/pCR3.1)進行互補分析。將每一種J-NS1 C端截斷選殖株進行反式互補分析，並於轉染後96個小時收集每一選殖株的細胞溶解產物，且利用雙重螢光酶分析(dual luciferase assay)來定量每一選殖株的複製能力。
簡言之，將每一重組複製子DNA(0.3 μg)以及作為內部控制用的pGL3質體DNA(0.03 μg)和1.5 μl的脂質體(Lipofectamine)2000(購自Invitrogen,USA)混合；另外，24孔培養盤中每一孔的BHK-21細胞密度(confluence)為50-60%，利用上述混合物分別感染每一孔中的細胞。進行反式互補分析時，將0.3 μg的重組J-NS1.flag/pCR3.1質體DNA、0.3 μg的複製子DNA加上0.03 μg的pGL3質體DNA和脂質體2000混合，並採用與上文類似的步驟，以此混合物共同轉染BHK-21細胞。於轉染48或96小時之後，收集每一選殖株的細胞溶解產物，並利用商業套組(Promega,Madison,WI,USA)根據製造商的使用說明針對每一選殖株進行螢光酶活性分析，試驗結果見於第2圖。
J-R2A-dNS1是一種NS1缺失突變株，其中刪除了NS1的第61-260個胺基酸，試驗發現此種刪除會導致病毒喪失複製能力(第2圖)。另一方面，若J-R2A-dNS1和能夠經由CMV啟動子來表現JEV NS1蛋白的J-NS1.flag/pCR3.1進行反式互補時，即可回復其病毒複製能力(第2圖)。此外，結果顯示C端截斷之突變株J-NS1.332/pCR3.1在反式互補分析中無法回復病毒複製能力；但截斷突變株J-NS1.337/pCR3.1則展現了較低的複製能力；而截斷突變株J-NS1.342/pCR3.1或J-NS1.344/pCR3.1所表現出的反式互補複製能力則與J-NS1.flag/pCR3.1不相上下。
由此可知全長為352個胺基酸的JEV NS1需要至少342個胺基酸才能展現NS1完整功能，而將NS1之C端變短可以減弱其複製能力。另外，NS1之C端的最末8個胺基酸是進行多聚蛋白處理區以分隔NS1與NS2A所必需的(Falgout and Markoff,(1995) J Virol 69: 7232-7243)，因此推論出可將外源胜肽插入於NS1蛋白的第342至344個胺基酸之間。
實驗例3設計生產包含JEV NS1與腸病毒71型(EV71)SP70抗原決定區的融合蛋白
在本實驗例中，首先利用單引子突變產生法將兩個限制酶辨識部位BssHII與PmlI引入NS1 C端胺基酸343及344中，此重組體稱為J-NS1.BP.flag/pCR3.1。此選殖株的複製能力略低於J-NS1.flag/pCR3.1的複製能力。同時，將一外源胜肽─腸病毒71型(EV71)SP70抗原決定區(序列YPTFGEHKQEKDLEY)[參見Foo et al.,(2007) Virus Res 125: 61-68]插入上述J-NS1.BP.flag/pCR3.1之中，所得選殖株稱為J-NS1.EV71.flag/pCR3.1。反式互補試驗顯示，融合了EV71 SP70之J-NS1.343SP70.flag/pCR3.1選殖株的複製能力降低至約50%(第3圖)。此種複製能力的降低可能是因為插入序列使得NS1的C端變長或是使得NS1的構型改變所造成。
此外，利用常用的選殖技術(如限制性酵素剪切與接合)重組出J-R2A-343SP70(第4圖)重組體。在J-R2A-343SP70選殖株中，將EV71 SP70插入於JEV NS1343 與尾部多胜肽344 之間。於確認序列之後，將J-R2A-343SP70與J-R2A的質體DNA轉染至BHK-21細胞中，並根據上文所述的方法利用雙重螢光酶分析系統來定量其複製能力。結果顯示J-R2A-343SP70所展現的複製活性為親本J-R2A的50%(第5圖)，這意味著在鄰近NS1之C端處插入EV71 SP70抗原決定區對於病毒複製的影響有限。
進行西方墨點分析，以確認融合蛋白之表現。簡言之，使用分別對JEV NS1及EV71 VP1具專一性的抗血清J2-54以及PAB7630-B01P(購自Abnova Corp,USA)來進行西方墨點分析。以被動溶解緩衝液(passive lysis buffer，購自Promega,Madison,WI,USA)來處理經轉染的BHK-21細胞，並收集全蛋白溶解物；之後進行10% PAGE並轉移至PVDF薄膜。結果如第6圖所示。
抗J-NS1抗血清可和J-NS1單體、J-NS1同型二聚體蛋白以及J-NS1和J-NS1’的異型二聚體進行專一結合。第6圖的結果確認NS1可形成二聚體，且形成二聚體的NS1之分子量與帶有EV71 SP70抗原決定區之融合J-NS1相同(與原生J-NS1和蛋白質大小標記相較)。多株PAB7630-B01P可專一地辨識和EV71 SP70抗原決定區融合之二聚體J-NS1蛋白，而無法辨識原生J-NS1。這些結果顯示EV71 SP70抗原決定區可和JNS1的C端融合，且之後可在活體細胞中正確地表現。
此外，以重組具感染性的JEV選殖株以及含EV71 SP70融合NS1(RP9-SP70)者，轉染BHK-21細胞，收集該細胞培養基，並利用PALL Nanosep濃縮器(MWCO=10K)將其濃縮，以探究NS1的分泌能力。利用10% PAGE進行分離並轉漬至PVDF薄膜，之後利用抗-JEV NS1單株抗體以及抗-EV71 VP1多株抗體進行西方墨點分析；結果呈現於第7圖。
此一結果確認了與對照組病毒RP-9一樣，重組JEV NS1-SP70可分泌至培養基中，且此重組JEV NS1-SP70與RP-9所分泌出的NS1一樣呈現二聚體的形式。
總結來看，本實驗例的結果顯示，利用NS1的C端作為外來胜肽之載體所得到的具感染性的JEV重組選殖株可成功地在所感染的細胞內表現，並可分泌至感染細胞外。
實驗例4生產包含JEV NS1與多重腸病毒71型(EV71)SP70抗原決定區之融合蛋白
在本實驗例中，利用與上文實驗例3相似的方法，分別生產帶有2、3、4套EV 71 SP70抗原決定區的融合蛋白。
已知J-R2A-343SP70(即1XSP70-J-R2A)重組體在EV71-SP70之DNA序列的5’端帶有獨特的BssHII限制辨識部位，且在3’端帶有MluI與PmlI限制辨識部位。雖然BssHII和MluI是相容的限制辨識部位可彼此接合，此處系利用上文所述的步驟對EV71-SP70的PCR產物進行BssHII與PmlI雙重切割，並將其和經過MluI與PmlI切割的J-R2A-NS1-SP70相接合。當BssHII和MluI彼此接合後，這兩種限制辨識部位都會消失，並於EV71 SP70抗原決定區之間產生丙胺酸-白胺酸(Ala-Leu)的二胺基酸；將所得到之選殖株稱為2XSP70-J-R2A。同時可利用類似的方法選殖出3XSP70-J-R2A與4XSP70-J-R2A。在本實施例中，分別將22、39、56與73個胺基酸插入於JEV NS1343 尾部多胜肽344 之間，以得到1XSP70-J-R2A、2XSP70-J-R2A、3XSP70-J-R2A與4XSP70-J-R2A。確認多重EV71-SP70選殖株的序列之後，將多重EV71-SP70選殖株的質體DNA轉染至BHK-21細胞中，並利用雙重螢光酶分析確認之，結果如第8圖所示。
由第8圖可以看出，在轉染後96小時，2XSP70-J-R2A和3XSP70-J-R2A的複製能力約為J-R2A的50%；而4XSP70-J-R2A的複製能力低於J-R2A複製能力的40%。
實驗例5接種343SP70重組JEV病毒之動物的生存曲線圖
在本實驗例中，進行接種了重組JEV病毒之動物的生存試驗。對小鼠以顱骨內(intracerebral，簡稱i.c)注射的方式給予10 μL的PBS以打破血腦障礙(blood-brain barrier，簡稱BBB)；其後以腹膜內(intraperitoneal)注射的方式分別給予2x105 菌斑形成單元(plaque formation unit，簡稱pfu)的RP9-XM、2x105 pfu的RP-2ms或2x105 pfu的343SP70(即，插入了EV71 SP70抗原決定區之重組JEV病毒)。經RP9-XM接種的動物在12天內全數死亡，但以弱毒株RP-2ms病毒以及重組JEV病毒(即，343SP70)接種的動物則仍在注射後21天分別有超過90%的存活(第9圖)。這些結果顯示本發明的重組JEV病毒和弱毒疫苗株RP-2ms一樣具有較弱的毒性。
實驗例6在以343SP70重組病毒誘發小鼠產生專一的抗體反應
在本實施例中，探討了JEV 343SP70-RP9是否能在免疫小鼠體內誘導專一辨識SP70抗原決定區的抗體產生。首先，由JEV 343SP70感染的小鼠抽取血清。再利用重組EV71 VP1蛋白質(P3386，購自Abnova)為抗原進行免疫墨點分析。利用抗EV71 VP1的多株抗體PAB7630-B01P(購自Abnova)作為陽性控制組。第10圖的結果顯示與JEV NS1融合的抗原決定區SP70確實可引發免疫的小鼠產生專一的抗體反應。
實驗例7設計生產包含JEV NS1與 深海橈足類Gaussia princeps 之螢光酶的融合蛋白
在本實施例中，利用深海橈足類Gaussia princeps 螢光酶(Gaussia luciferase，簡稱Gluc)來探討可插入至NS1之C端的外源胜肽的容量；Gluc是一種分泌性的蛋白質，全長為185個胺基酸。
首先，將Gluc(185個胺基酸)插入至JEV NS1343 與尾部多胜肽344 之間，以得到J-R2A-Gluc複製子。然而，此複製子的複製能力不及其親本J-R2A複製子的複製能力。
為了解決此一問題，將FMDV-2A胜肽(序列為NFDLLKLAGDVESNPGP，共17個胺基酸)融合至Gluc的前方，以得到J-R2A-2A-Gluc複製子。此J-R2A-2A-Gluc複製子所含的外源多胜肽總長為202個胺基酸(185+17=202)，且經上文所述的雙重螢光酶分析顯示，其於經轉染之BHK-21細胞內的複製能力和親本J-R2A複製子不相上下(第11圖)。
在不限於特定理論的前提下，據信FMDV-2A胜肽的轉譯切割功能可以適當地區隔開JEV NS1和Gluc，因而有助於複製過程的進行。此一結果顯示在外源多胜肽中加入一蛋白酶片段，可提升病毒重組體的插入容量。
實驗例8生產包含JEV NS1與EV71 VP1抗原決定區之融合蛋白
EV71衣殼蛋白質VP1係由297個胺基酸殘基組成。因此，採用了和上文實驗例6相似的方法來設計攜帶EV71 VP1抗原決定區的複製子。具體而言，將由FMDV 2A胜肽(17個胺基酸)、衍生自Gluc的分泌訊息胜肽(序列為MGVKVLFALICIAVAEAGL，共19個胺基酸)以及部分EV71 VP1抗原決定區(對應於EV71 VP1的第145至第261個胺基酸)所組成的外源多胜肽插入於JEV NS1343 和尾部多胜肽344 之間，以得到J-R2A-2A-Gss-VP1-C複製子。所插入的外源多胜肽的總長為153個胺基酸。雙重螢光酶分析顯示J-R2A-2A-Gss-VP1-C複製子的複製能力和親本J-R2A複製子相近。
實驗例9生產包含JEV NS1與EV71 SP70抗原決定區且插入於不同位置的融合蛋白
在本實施例中，探討了各種插入位置以闡明這些位置是否能夠容忍外源多胜肽之插入而不致於影響重組JEV的感染力。
具體而言，如第12圖所示，重組出六種病毒重組體：340341 SP70、340344 SP70、343341 SP70、343344 SP70、352341 SP70、與352344 SP70。這些重組體是根據所插入之EV71 SP70抗原前後的胺基酸殘基編號來命名。舉例來說，cDNA選殖株340341 SP70表示EV71 SP70抗原係插入於JEV NS1340 和尾部多胜肽341 之間，而cDNA選殖株352344 SP70表示EV71 SP70抗原係插入於JEV NS1352 和尾部多胜肽344 之間。
由所製備出的這些重組JEV載體可以發現，在鄰近JEV NS1的第343個胺基酸殘基附近的區域(如，包含胺基酸340至352之區域)頗具彈性，可供插入外來基因片段，而不會顯著地影響所得重組JEV之感染力。
利用對NS1專一的抗體或對SP70專一的抗血清進行西方墨點分析，以研究NS1-SP70融合蛋白之表現，結果摘要整理於第13圖。具體來說，在感染後48小時，收集細胞培養基並依照上文所述的步驟將其濃縮。之後，針對JEV NS1利用抗血清J2-54或針對EV71 VP1利用抗血清PAB7630-B01P(購自Abnova)來進行西方墨點分析。所有測試的重組JEV皆能使受感染細胞分泌NS1-SP70融合蛋白至培養基中，且更重要的是，這些融合蛋白和來自RP-9感染細胞之野生型的NS1蛋白一樣，可以正確地形成二聚體。這些結果顯示JEV NS1的C端區域適合融合外來胜肽，且於融合後不會干擾NS1在JEV複製中應發揮的功能。
實驗例10接種 343341 SP70與 352341 SP70重組JEV病毒之動物的生存曲線圖
在本實施例中，利用與實驗例5相似的步驟來探討分別接種了重組343341 SP70與352341 SP70重組JEV病毒的動物的生存分析。
經RP9-XM接種的動物在10天內全數死亡。相較之下，經343341 SP70與352341 SP70重組JEV病毒接種的動物，在接種後21天則分別有超過55%與75%的動物仍然健康存活(第14圖)。這些結果顯示，和野生型的RP-9病毒相較之下，本發明提出的重組JEV病毒對於受試小鼠具有較低的毒性。
實驗例11在引發免疫的小鼠體內誘發專一的抗體反應
在本實施例中，根據實驗例6所述的步驟來探討JEV352341 SP70是否能引發免疫的小鼠產生專一辨識SP70抗原決定區的抗體反應。第15圖所示的結果顯示出以352341 SP70感染的小鼠的確會誘發產生強烈針對EV71 VP1之抗體反應。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
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為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖概要地繪示出根據本發明一實施例的RP9-X、RP9-XM、J-R2A與J-R2A-M病毒重組體；
第2圖繪示根據本發明一實施例，利用反式互補分析法研究在NS1的C端區域進行缺失突變後對於病毒複製能力的影響；
第3圖繪示根據本發明一實施例，利用反式互補分析法研究重組JEV病毒[其包含腸病毒71型(EV71)SP70抗原插入於JEV NS1的胺基酸殘基343與344之間]的複製能力；
第4圖概要繪示出根據本發明一實施例的JEV重組體J-R2A-NS1-343SP70，其具有一腸病毒71型(EV71)SP70抗原插入位於JEV NS1胺基酸殘基343與344之間；
第5圖繪示根據本發明一實施例，利用反式互補分析法研究缺陷複製子J-R2A-dNS1(包括J-R2A-dNS1、J-R2A-dNS1-dc340與J-R2A-NS1-343SP70)的複製能力；
第6圖繪示根據本發明一實施例，利用西方墨點法來分析由重組JEV病毒感染BHK-21細胞中融合蛋白(即，343SP70)之表現；
第7圖繪示根據本發明一實施例，利用西方墨點法來分析融合蛋白(即，343SP70)之分泌能力；
第8圖繪示根據本發明一實施例，利用反式互補分析法探討能夠表現包含1、2、3和4套EV71 SP70抗原決定區之融合蛋白的各重組複製子之複製能力；
第9圖為生存曲線圖，其係根據本發明一實施例，以動物存活百分比相對於注射RP-9XM、RP-2ms以及343SP70(即，本發明之重組JEV病毒)後的時間作圖所得；
第10圖繪示根據本發明一實施例，以西方墨點法來分析以343SP70引發免疫之小鼠對於P3386抗原的反應性；
第11圖繪示根據本發明一實施例，以西方墨點法來分析所表現之融合蛋白(即，JR2A-Glu與JR2A-2A-Glu)的分泌能力；
第12圖摘要整理了根據本發明多個實施例，於NS1C端區域可供插入EV71 SP70抗原的位置；
第13圖繪示根據本發明一實施例，利用西方墨點法來分析由第12圖所示的病毒重組體所表現的融合蛋白之分泌能力；
第14圖為生存曲線圖，其係根據本發明一實施例，以動物存活百分比相對於注射RP-9XM以及本發明之及重組JEV病毒(即，343341 SP70與352341 SP70)後的時間作圖所得；以及
第15圖繪示根據本發明一實施例，以西方墨點法來分析以352341 SP70引發免疫之小鼠對於P3386抗原的反應性。

Claims (20)

  1. 一種用以於一細胞內表現一外源多胜肽之經分離的病毒重組體，包含一日本腦炎病毒(JEV)複製子，其包含編碼一融合蛋白之一核酸，該融合蛋白依序包含：一非結構蛋白1(JEV NS1)片段，其包含該JEV NS1的至少胺基酸殘基1至340；該外源多胜肽，其具有至少6-250個胺基酸；以及一尾部多胜肽，其包含JEV NS1的至少胺基酸殘基344至352，且該融合蛋白之生產不會影響病毒複製。
  2. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該外源多胜肽包含一免疫原性片段。
  3. 如請求項2所述之經分離的病毒重組體，其中該免疫原性片段為一腸病毒71型SP70抗原、腸病毒71型VP1抗原或其一部分。
  4. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該尾部多胜肽包含該JEV NS1之胺基酸殘基341至352。
  5. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該JEV NS1片段為該JEV NS1之胺基酸殘基1至343，且該尾部多胜肽為該JEV NS1之胺基酸殘基341至352。
  6. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該JEV NS1片段為該JEV NS1之胺基酸殘基1至343，且該尾部多胜肽為該JEV NS1之胺基酸殘基344至352。
  7. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該JEV NS1片段為該JEV NS1之胺基酸殘基1至352，且該尾部多胜肽為該JEV NS1之胺基酸殘基341至352。
  8. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該JEV NS1片段為該JEV NS1之胺基酸殘基1至352，且該尾部多胜肽為該JEV NS1之胺基酸殘基344至352。
  9. 如請求項2所述之經分離的病毒重組體，其中該外源多胜肽更包含一蛋白酶片段，其係位於該免疫原性片段之前，其中該蛋白酶片段包含一口蹄疫病毒2A胜肽，且該外源多胜肽具有至少100個胺基酸。
  10. 如請求項9所述之經分離的病毒重組體，其中該外源多胜肽更包含一分泌訊息片段，其係位於該蛋白酶片段及該免疫原性片段之間，其中該分泌訊息片段包含來自深海橈足類Gaussia princeps 螢光酶之一分泌訊息胜肽。
  11. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該JEV複製子包含一CMV啟動子，其係操作上連接於該JEV 複製子，而使得該細胞可表現該融合蛋白且其後將該融合蛋白分泌至該細胞外。
  12. 如請求項1所述之經分離的病毒重組體，其中該細胞為一BHK-21細胞、一綠猿腎臟癌Vero細胞或一C6/36細胞。
  13. 一種經分離的重組JEV顆粒，包含一病毒粒子單元，該病毒粒子單元包含一如請求項1所述之經分離的病毒重組體。
  14. 如請求項13所述之經分離的重組JEV顆粒，其中該病毒粒子單元包含一如請求項3所述之經分離的病毒重組體。
  15. 如請求項13所述之經分離的重組JEV顆粒，其中該病毒粒子單元包含一如請求項9所述之經分離的病毒重組體。
  16. 一種活體外經轉染細胞，包含一如請求項1所述之經分離的病毒重組體。
  17. 如請求項16所述之活體外經轉染細胞，其中該細胞為一BHK-21細胞、一綠猿腎臟癌Vero細胞或一C6/36 細胞。
  18. 如請求項17所述之活體外經轉染細胞，其中該細胞為該BHK-21細胞。
  19. 如請求項16所述之活體外經轉染細胞，其中該活體外經轉染細胞包含一如請求項3所述之經分離的病毒重組體。
  20. 如請求項16所述之活體外經轉染細胞，其中該活體外經轉染細胞包含一如請求項9所述之經分離的病毒重組體。
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