CN106029888A - 用于结合黄病毒蛋白的适体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸。具体地，涉及能够结合黄病毒结构性蛋白或黄病毒非结构性蛋白的适体，用作用于预防、治疗和/或诊断患者的黄病毒感染的治疗。

Description

用于结合黄病毒蛋白的适体

技术领域

本发明涉及核酸。具体地，涉及能够结合黄病毒结构性蛋白或黄病毒非结构性蛋白的适体，用作用于预防、治疗和/或诊断患者的黄病毒感染的治疗(therapeutics)。

背景技术

黄病毒属(Flaviviridae)家族是由七十种包膜正单链RNA病毒(envelopedpositive single-stranded RNA virus)组成。在这七十种中，多种是临床相关的人类病原体，其包括登革热病毒(DENV)，黄热病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)(Chavez et al.，2010，Noda et al.，2012)。除黄病毒外，黄病毒属家族还由两种其他物种，瘟病毒(Pestivirus)和肝炎病毒(Hepacivirus)组成(Chavez etal.，2010)。黄病毒主要是虫媒病毒并且通过感染的蚊子传播给宿主。黄病毒的病毒粒子(virion)通常较小，是具有40-60nm直径的包膜颗粒(enveloped particle)的形式。黄病毒，特别是登革热和西尼罗热(West Nile)产生目前没有用于人类治疗的有效疫苗或抗病毒特效药物的广泛疾病蔓延(Chavez et al.，2010)。

通过蚊子传播的西尼罗病毒(WNV)，一种黄病毒(Saxena et al.，2013，Bigham etal.，2011)是黄病属家族中日本脑炎病毒(JEV)血清组(sero-group)的成员。其他成员包括卡西帕克利病毒(Cacipacore virus)、墨累山谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitisvirus)和圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)。在澳大利亚和亚洲发现的库京病毒(Kunjin virus)也是WNV的亚型(subtype)。1937年WNV首次从乌干达的西尼罗区域中的女性分离出(Silva et al.，2013，Duan et al.，2009)，并且在1999年首次在纽约城(New York City)中报道(Silva et al.，2013)。WNV是嗜神经组织黄病毒(neurotropicflavivirus)并且能够导致人类、马和一些鸟类的神经疾病(Silva et al.，2013)。其基因组是11，029个核苷酸长的正单链RNA并且病毒粒子较小、球形、包膜且具有约50nm的直径(Bigham et al.，2011)。WNV最常见的症状是发烧、头痛和/或肝炎。2012年美国最近的WNV爆发报道了5387例并且243例死亡(CDC报告)(Saxena et al.，2013)。到目前为止没有批准的可用的人类的疫苗或治疗(CDC报告)(Duan et al.，2009)。WNV的基因组和蛋白质组组织非常类似于登革热病毒的组织。登革热病毒(DENV)(一种蚊子传播的病毒病原体)是黄病属家族的成员。DENV由四种血清型(DENV1、DENV2、DENV3、和DENV4)组成。DENV具有反义11-kbRNA基因组，其在单个多聚蛋白中包含结构和非结构蛋白质的两者(Gromowski et al.，2007，Crill et al.，2001，Lisova et al.，2007，Rajamanonmani et al.，2009)。基因序列为C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。病毒包膜由脂质双层组成，其中包膜(envelope)(E)和膜(membrane)(M)蛋白是嵌入的。E蛋白是495个氨基酸长度，并且在DENV中以及WNV中是糖基化的。具体地，其Asn-67处的N连接糖基化主要用于病毒的繁殖，并且对DENV是唯一的(unique)(Rey，2003)。E蛋白的功能作用是其涉及病毒附接至细胞，并且也涉及膜融合(Clyde et al.，2006，Modis et al.，2004)。也已经证实了其是高免疫原性的并且能够产生对抗野生型病毒的中和抗体。登革热E蛋白包括3个区域：结构域-I(DI)、结构域-II(DII)和结构域III(DIII)。DI是中心结构域；DII是二聚且熔合的结构域，而DIII是免疫球蛋白状受体结合结构域(Mukhopadhyay et al.，2005，Rey et al.，1995)。已经证明了DIII结构域是受体识别和结合结构域(Bhardwaj et al.，2001，Chin et al.，2007，Chu etal.，2005，Zhang et al.，2007)。因此DIII是用于对抗DENV的治疗发展的重要的靶标。感染的人类可以表现出从无症状，至热病(febrile disease)，至可能致命的内出血的症状(Teoh et al.，2012，Noda et al.，2012)。对抗不同登革热血清型的免疫性是通过血清型特异性抗体介导的。因此，从感染血清型恢复的患者被认为具有对感染的血清型长久免疫，但对于其他血清型具有短期的免疫(Teoh et al.，2012)。如疾病控制和预防中心(theCentre for Disease Control and Prevention)的报告，每年多达一亿人感染(CDC报告)。最近的报告警告登革热感染的全球分布可能甚至超过了每年3.9亿人(Bhatt et al.，2013)。至今为止，在临床市场中没有用于人类的批准的疫苗或可用的抗病毒治疗(Teoh etal.，2012)。

检测WNV和DENV的一种方法为通过使用抗体。然而抗体检测的使用已经表现出非特异性且难以设计(engineering)和插入新的检测部分。

因此，本领域需要用于检测、治疗和预防患者的黄病感染的替换方法。

发明内容

本发明涉及能够结合黄病结构蛋白或黄病非结构蛋白的适体。这种适体作为治疗剂用于预防、治疗和/或诊断患者的黄病感染。类似于抗体，适体能够结合至病毒的表面。然而，与抗体相比适体的优势在于可以将化学设计的检测部分引入到适体中。同时，由于适体是化学合成的，因此用于适体的制造成本低于抗体。适体也易于定制、稳定、不需要冷运输链，并具与抗体相比其对抗原有较高的结合亲和力。

在本发明的第一个方面中，提供了核酸适体，包括特异性结合至黄病结构蛋白或黄病非结构蛋白的DNA分子。

优选地，黄病选自由西尼罗病毒、登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎和蜱传脑炎病毒组成的组。

在优选实施方式中，适体特异性结合至西尼罗病毒包膜蛋白，并且优选地，适体特异性结合至西尼罗病毒包膜蛋白的结构域III区域。在这个实施方式中，DNA分子优选基于以下三种天然适体序列的一种的修饰的DNA分子：(a)西尼罗病毒包膜蛋白DIII的序列5‘-ACGCTGCCACAAGTCCTGGTTCCCTG-3‘(SEQ ID NO:1)；(b)西尼罗病毒包膜蛋白DIII的序列5‘-CCTCCCAAACATGTAGAGTCTCACAT-3‘(SEQ ID No:2)；(c)西尼罗病毒包膜蛋白DIII的序列5‘-CCAAATTGCCGCAGACTCGTTGTGAA-3‘(SEQ ID NO:3)并且包括氨基酸侧链。优选地，修饰的DNA分子包括选自由以下项组成的组中的序列：

(a)

5‘-A_CfGkC_T_GwChC_A_CfAlA_GbT_ChC_T_GwGbT_T_CyChC_T_Gw-3‘(基于SEQ IDNo.1的修饰)或其互补物；

(b)

5‘-ChC_T_CyChC_AlA_A_CfAeT_GbT_AsG_AsG_T_CyT_CyA_CfAeT_-3‘(基于SEQ IDNo.2的修饰)或其互补物；和

(c)

5‘-ChC_AlA_AeT_T_GwChC_GkC_AsG_A_CfT_CyGbT_T_GwT_GwAlA_-3‘(基于SEQ IDNo.3的修饰)或其互补物，

其中侧链的官能基团以小写字母表示(b：噻吩、e：谷氨酸、f：苯丙氨酸、h：组氨酸、k：赖氨酸、l：亮氨酸、s：丝氨酸、y：酪氨酸、w：色氨酸)且使用下划线(_)表示天然核苷酸。

在可替换的优选实施方式中，适体特异性结合至登革热病毒包膜蛋白，并且优选地适体特异性结合至登革热病毒包膜蛋白的结构域III区域。在这个实施方式中，DNA分子优选基于以下三种天然适体序列的一种的修饰的DNA分子：(a)DENV2包膜蛋白DIII的序列5‘-TCACATTCAGATATGTTGGTTCCCAC-3’(SEQ ID NO:4)；(B)DENV2包膜蛋白DIII的序列5’-AAATGTGACGTTCACAGACAAGTCC-3’‘(SEQ ID No:5)；或(c)DENV2包膜蛋白DIII的序列5’-GATACACTGAAGTGTTCTGATTG-3’(SEQ ID NO:6)并且包括氨基酸侧链。优选地，修饰的DNA分子包括选自由以下项组成的组成的组中的序列：

(a)

5’T-CyA_CfAeT_T_CyAsG_AeT_AeT_GbT_T_GwGbT_T_CyChC_A_Cf-3’(基于SEQ IDNo.4的修饰)或其互补物；

(b)

5’-T_AkAlA_T_GwT_GwA_CfGbT_T_CyA_CfAsG_A_CfAlA_GbT_ChC_-3’(基于SEQ IDNo.5的修饰)或其互补物；和

(c)

5’-GkC_T_GwAeT_A_CfA_CfT_GwAlA_GbT_GbT_T_CyT_GwAeT_T_Gw-3’(基于SEQ IDNo.6的修饰)或其互补物，

其中侧链的官能基团以小写字母表示(b：噻吩、e：谷氨酸、f：苯丙氨酸、h：组氨酸、k：赖氨酸、l：亮氨酸、s：丝氨酸、y：酪氨酸、w：色氨酸)且使用下划线(_)表示天然核苷酸。

在两个实施方式中，DNA分子可以进一步包括可检测的部分。可检测的部分可以选自由生物素、酶、发色团、荧光分子、化学发光分子、磷光分子、着色颗粒和发光分子组成的组。优选地，可检测部分是生物素。

优选地，适体进一步包括感兴趣的药物，其中DNA分子与黄病毒结构或非结构蛋白的结合将感兴趣的药物靶向其期望的作用位点和/或由适体释放感兴趣的药物。优选地，药物选自由药物化合物、核苷酸、抗原、类固醇、维生素、半抗原、代谢物、肽、蛋白质、拟肽化合物、显影剂、抗炎剂、细胞因子和免疫球蛋白分子或它们的片段组成的组。

将各种试剂或药物附接至抗体或适体和其他靶标位递送试剂的方法是本领域公知的，并且因此制备本发明的包括感兴趣的药物的适体的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。

药物和试剂可以化学或生物结合至本发明的适体。具体地，也可以使用用于将药物或试剂结合至DNA分子的任何方法。然而，应该认识到无论选择何种本发明的制造结合物的方法，均必须确定DNA分子保持其靶向能力并且药物保持其相关功能。

在将适体结合至其特异性靶标之后药物或试剂可以从适体释放。可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行药物或制剂的释放。例如，可以通过触发分子或机制的方式由宿主裂解药物或试剂。可替换地，可以通过光活化释放药物或试剂。根据选择的光不稳定键、DNA分子和药物的光敏性，可以通过多种方式中的一种提供用于以其活化形式释放药物的辐射。这可以包括电磁辐射的使用，例如供给自白炽光源(incandescent source)、自然光源，激光包括固体激光器或甚至阳光的红外线、可见光或紫外线辐射。

在本发明的第二个方面中，提供了一种根据本发明的第一个方面的适体用于诊断。优选地，本发明的适体用于诊断患者的黄病毒感染。患者优选人类但可以是任何动物、哺乳动物、灵长类动物等。

在本发明的第三个方面中，提供了一种根据本发明的第一个方面的适体用于治疗。优选地，本发明的适体用于治疗或预防患者的黄病毒感染。

根据本发明的第四个方面，提供了一种免疫原性组合物或疫苗，包括根据本发明的第一方面的适体。通常，疫苗表示治疗物质，处理以失去其病毒性且包含衍生自一种或多种病原生物体的抗原，将给药至患者时其将刺激活性免疫并保护这些或相关生物体免于感染，同时免疫原性组合物表示包含抗原例如微生物或其组分的任何药物组合物，所述组合物可以用于引起患者免疫响应。

在本发明的第五个方面中，提供了一种包括根据本发明的第一个方面的适体和赋形剂或载体的组合物。药物可接受的赋形剂可以是例如抗粘附剂、粘合剂、包衣(coating)、崩解剂、香料、色素、润滑剂、助流剂(gildant)、吸收剂、防腐剂和甜味剂。药物可接受载体的实例是载体蛋白，其促进不同分子扩散穿过生物膜。

在本发明的第六个方面中，提供了一种包括根据本发明的第一个方面的适体和载体的试剂盒。优选地，载体可以是含有化学医疗试剂、光试剂或量子点(quantum dot)的可生物降解的纳米颗粒。载体可以与适体结合用于诊断/治疗应用或治疗剂开发。也优选地，试剂盒用于检测患者的黄病毒感染。

在本发明的第七个方面中，提供了一种用于诊断或检测患者黄病毒感染的体外方法，该方法包括：(a)获得来自患者的生物样本；(b)使生物样本与根据本发明的第一个方面的适体接触；(c)检测适体和黄病毒结构蛋白和/或黄病毒非结构蛋白之间的结合复合物的形成，其中结合的复合物的存在表示患者具有黄病毒感染。检测结合复合物的形成的步骤可以通过试剂或药物与本发明的适体的化学或生物结合来实施。SELEX(指数富集的配基系统进化技术，Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)过程可以用于获得针对靶蛋白的高亲和力和高特异性的适体。适体的主要优势是针对靶蛋白的解离常数(K_D)的值位于纳摩尔范围中。获得具有高亲和力的序列并且与生物素分子结合，这可以通过链亲和素HRP(辣根过氧化酶)检测。

优选地，黄病毒选自由西尼罗河病毒、登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒组成的组。

优选地，生物样本是血液样本、唾液或尿液。如在本文中使用的术语“血液样本”包括血细胞、血清和血浆。更优选地，生物样本是血液样本。

在本发明的第八个方面中，提供了一种用于治疗或引起对患者黄病毒感染免疫应答的方法，该方法包括给予患者治疗有效剂量的根据本发明的第五和六个方面的组合物或疫苗。给药的方式可以是通过静脉内、口服、肺部、眼眶、肠胃外(parental)、储库(depot)或局部的方式。优选地，给药的方式是静脉内。

附图说明

图1：克隆策略。A.示意图示出了重叠延伸PCR(OE-PCR)技术以获得用于适体的筛选和评价的生物素化的西尼罗包膜蛋白结构域III(WNE-BNrDIII)。设计片段A使得其3’悬垂部(overhang)与片段B的5’悬垂部互补。同样地，引物B和引物C彼此互补。两个片段均通过互补序列和引物A和D连接在一起。B.使用OE-PCR生成重组WNE-BNrDIII蛋白的构建体。生物素受体多肽(BAP)在6xHis标签和凝血酶切割位点的下游，但是在肠激酶切割位点的上游，然而其他片段编码WNE-rDIII蛋白。位于N-端的6xHis标签用于亲和纯化，而BAP是用于生物素化的信号肽。包括凝血酶和肠激酶切割位点以在没有标签的情况下获得感兴趣的蛋白。C.构建体的示意图示出了亲和标签和感兴趣的蛋白。

图2：纯化的生物素化的WNE-BNrDIII蛋白的制备。(A)(i)用于在大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3中的重组蛋白的表达的SDS-PAGE分析。泳道2示出了来自未诱导的细胞的裂解物，且泳道3和4示出了来自使用1mM IPTG诱导的细胞的裂解物。通过星号指示表达的重组蛋白。(A)(ii)使用抗-His抗体用于表达的重组蛋白的Western印迹。蛋白质构建体由6xHis纯化标签组成，并且因此当使用抗-His抗体探测时，其在诱导的细胞的裂解物中出现较厚的带(通过星号指示)。(A)(iii)用于镍-氮川三乙酸(Ni-NTA)金属亲和色谱纯化的BN-WNDIII的SDS-PAGE的曲线图(FT：流过(Flow-through)、W1-W3：清洗(Wash)、E1-E5：洗脱(Elute))。在8M脲存在下在变性条件下，溶解细菌细胞并且分离并纯化内含体。通过星号指示期望的分子量～15kDa。对非生物素化的WNE-rDIII蛋白实施相似的表达和纯化条件。(B)用于WNE-BNrDIII的FPLC-SEC色谱曲线。注射的样本获得自使用降低脲浓度的逐步(step-by-step)透析，并且也存在清洁剂Tween-20。两个迹线均对应于在280nm处的蛋白质的UV吸收(虚线-未生物素化的WN rDIII，实线-WNE-BnrDIII)。样品峰的差异指示了生物素化和未生物素化的WNDIII蛋白之间的分子量差异。

图3：示意图示出了涉及用于筛选和评估适体的WNE-rDIII抗原的制备的逐步方法。

图4：生物素化的和未生物素化的WNDIII蛋白的检测。[A(i)]使用单克隆鼠抗-His抗体检测WNV DIII蛋白的存在。可以在未生物素化(UB)和生物素化(B)的WNV DIII两者中观察到带(泳道3和4)。麦芽糖结合蛋白(MBP)不包含His标签，所以在泳道1和2中不能观察到带。[A(ii)]当使用链亲和素-HRP第二抗体直接检测生物素化时，在MBP和WNV DIII蛋白的生物素化的泳道(B)(泳道2和4)中可以观察到明显的带。[B]使用链亲和素-HRP抗体通过ELISA检测WNV DIII蛋白中生物素的存在。在450nm下生物素化的蛋白(MBP-BN、WDIII-BN)表现出高吸收值，而未生物素化的蛋白(MBP-UBN和WNDIII-UBN)则不能检测。

图5：用于使用表面等离子体共振(SPR)测试不同适体的Biacore传感图的峰顶高度。选择标记为标号1-10的菱形点和描绘的适体数用于进一步的评估。

图6：用于表面筛选的酶连接的修饰适体吸收试验(ELMAS)。测试生物素化的适体和生物化的蛋白在不同表面例如maxisorp、multisorp、Polysorp和medisorp中的结合效率。PolySorp板具有对疏水性分子的高亲和力。MediSorp具有在PolySorp和MaxiSorp之间的板表面，其允许在样本包含血清时的低背景读数。MaxiSorp板具有对亲水和疏水分子的混合物中的分子的高亲和力。MultiSorp板具有对亲水性分子的高亲和力。在涂覆适体且使用链亲和素HRP探测蛋白之后，随后使用酶底物培育以用于颜色显现。吸收对应于结合至表面的起始生物素化的适体或蛋白的量。在生物化的适体的这种情况下，发现Multisorp板在450nm下的吸收率非常低(最大吸收0.15)，polysorp和medisorp为中等(最大吸收在从2-2.5改变)且Maxisorp较高(最大吸收在从2.5至3改变)，并且其选择用于进一步的评估。

图7：用于亲和力筛选的蛋白涂覆的酶连接的修饰适体吸收试验。将西尼罗病毒包膜DIII蛋白涂覆在表面上，然后使用不同浓度的生物素化的适体进行孵育，并且随后使用链亲和素-HRP结合物进行探测。强力结合至蛋白的适体表现出高吸收率。B03、B79和B99结合至WNDIII蛋白，因为当比较参照和其他适体(通过星号指示)时，吸收率明显较高。

图8：用于亲和力筛选的西尼罗病毒涂覆的酶连接的修饰适体吸收试验。将西尼罗病毒Wengler菌株涂覆在表面上，并且然后使用不同浓度的生物素化的适体进行孵育，然后使用链亲和素-HRP结合物进行探测。结合至蛋白质的适体表现出高吸收率。当比较各种浓度的适体时，适体B03、B79和B99在测试的全部浓度中均显著结合(当与对照相比时)。相反，其他适体仅在高于3.3nM的浓度下显著结合至病毒。

图9：用于亲和力筛选的西尼罗病毒菌株Sarafend和Kunjin涂覆的酶连接的修饰适体吸收试验。发现对于Sarafend菌株，在浓度高于3.3nM下，适体B03、B67、B73和B99显著结合，而对于Kunjin菌株，在浓度高于3.3nM下，适体B03、B66、B67、B73和B79显著结合。

图10：使用5μm和10μm的修饰适体对西尼罗病毒Wengler菌株的中和的百分比。

图11：用于适体的Apotox和Alamar蓝细胞活性实验。使BHK细胞生长并使用不同浓度的适体，阳性对照(毛地黄皂苷洗涤剂和MPER-膜蛋白提取剂)和BSA(作为阴性对照)处理。在在处理后24、36、48和60小时时测试活性。如图所示，当与未处理的样本(0nM)比较时，不同浓度(从3.3nM至26nM)下的适体处理不能改变细胞活性。阳性对照MPER中证明了失去了活性，然而在毛地黄皂苷洗涤剂处理的细胞中，在处理后24和36小时时失去了活性。有趣的是，细胞在处理后48和60小时时开始恢复。使用Alamar蓝活性实验获得了相似的结果。

图12：用于适体的稳定性实验。上图(24小时)，下图(100小时)孵育。在37℃下孵育5天之后，在凝胶红中检测适体带，指示适体非常稳定。

图13：用于血清中适体的稳定实验。上图(48小时)，下图(120小时)孵育。当在450nm的ELISA吸收中检测时发现BN-适体非常稳定。

图14：示意图示出了涉及针对WNE-rDIII抗原的修饰的适体评估的逐步方法。

图15：在大肠杆菌BL 21(DE3)和大肠杆菌K12菌株AVB 100中的BAP-WNDIII蛋白的表达。左图。用于大肠杆菌BL21 DE3(泳道2示出了来自未诱导的细胞的裂解物且泳道3和4示出了来自使用1mM的IPTG诱导的细胞的裂解物)和大肠杆菌K12菌株AVB 100(泳道5示出了来自未诱导的细胞的裂解物且泳道6和7示出了来自使用1mM的阿拉伯糖诱导的细胞的裂解物)中重组蛋白的表达的SDS-PAGE分析。在大肠杆菌BL 21(DE3)中观察到了蛋白的表达且在大肠杆菌K12菌株AVB 100中未观察到蛋白的表达。右图。使用抗-His抗体用于在大肠杆菌BL 21(DE3)和大肠杆菌K12菌株AVB 100中表达的蛋白质的Western印迹。蛋白质构建体由6xHis纯化标签组成，并且因此当使用抗His抗体探测时可以通过较厚的带识别，如在大肠杆菌BL 21(DE3)的情况中诱导的蛋白(泳道3和4)，然而带不存在于诱导的大肠杆菌K12菌株AVB 100(泳道6和7)中。

图16：使用生物素连接酶用于体外生物素化的确定的ELISA。使用链亲和素-HRP结合物通过ELISA检测WNV DIII蛋白中的生物素的存在。生物素化的蛋白表现出在450nm下的高吸收值，而未生物化的蛋白则未检测到。使用Bir A在WNDIII-未生物素化的蛋白以及WNDIII体外生物素化的蛋白两者(样本1和样本2)中均观察到了高吸收。这些结果给予我们一个暗示，表达的BAP-WNDIII蛋白可能是内源生物素化的。

图17：使用Bc-Mac链亲和素磁珠用于生物素化确认的ELISA。WNDIII蛋白允许与链亲和素磁珠结合。如果蛋白包含生物素，则其将与链亲和素强力结合。使用0.1M的甘氨酸完成结合蛋白的洗脱，然后通过ELISA评估蛋白。使用的阳性对照是生物素化和未生物素化的MBP(麦芽糖结合蛋白)。获得自Bc-Mag珠和获得自FPLC部分的BAP-WNDIII蛋白表现出高吸收，指示出WNDIII蛋白在表达过程中确实是体内内源性生物素化的。

图18：人类血清中的WNV DIII修饰适体的稳定性评估。阴性对照(在95℃下加热48小时的B03)示出了减少的吸收，指示出修饰的适体在高温下是不稳定的。柱状图a、b和c表示在缓冲剂中孵育的修饰的适体，然而d、e和f表示在不同持续时间内(2、5和14天)在人类血清中孵育的修饰的适体。当与它们相应的缓冲剂处理的对照相比时，B74(2-5天)、B76、B66、B71、B73、B03(5-14天)和B79(超过14天)是稳定的。

图19：胎牛血清(FBS)中WNV DIII修饰的适体B03的稳定性的评估。修饰的适体B03的稳定性在4天的时间里逐渐降低，超过该时间没有观察到进一步的降低。相同的修饰适体在孵育的全部5天内保持相对稳定。

图20：在人类血清存在下修饰的适体B03与WNV DIII蛋白的结合。在孵育24小时后，适体仍与靶蛋白结合。

图21：在人类血清或FBS存在下修饰的适体B03与WNV的结合。结果显示出在使用人类血清以及FBS孵育最高达48小时后，修饰的适体仍是功能性的。

图22：WNV DIII侧链修饰的和未修饰的适体B03在人类血清(血清)和FBS中稳定性的比较。侧链修饰的适体B03是高稳定性的，然而其未修饰的DNA适体对应物在人类血清和FBS中孵育24小时后失去了稳定性。

图23：WNV DIII侧链修饰的和未修饰的适体B99在人类血清和FBS中稳定性的比较。侧链修饰的适体B99是高稳定性的，然而其未修饰的DNA适体对应物在人类血清和FBS中孵育24小时后失去了稳定性。

图24：WNV DIII侧链修饰和未修饰的适体的功能性的比较。侧链修饰的适体B03和B99结合至WNV DIII蛋白，然而未修饰的DNA适体B03和B99则不能。

图25：不同未生物素化的修饰的适体和抗体，和WNV DIII蛋白之间结合的比较。涂覆修饰的适体并且使用生物素化的WNV DIII蛋白(BNWNDIII)评估它们的结合效率。

图26：用于登革热病毒血清2型包膜蛋白结构域III(DENV2-rEDIII)的克隆策略。A.示意图示出了重叠延伸PCR(OE-PCR)技术用于获得用于适体的下游筛选和评价的生物素化的DENV2-rEDIII(DENV2BN-rEDIII)。设计片段1从而使得3’悬垂部与片段2的5’悬垂部互补。同样地，引物B和引物C彼此互补。两个片段均通过互补序列连接在一起且通过引物A和D扩增。B.使用OE-PCR生成重组DENV2-rEDIII蛋白的构建体。生物素受体多肽(BAP)在6xHis标签和凝血酶切割位点的下游，但是在肠激酶切割位点的上游，然而片段2编码DENV2-rEDIII蛋白。位于N-端的6xHis标签用于亲和纯化，而BAP是用于生物素化的信号肽。包括凝血酶和肠激酶切割位点以在没有标签的情况下获得感兴趣的蛋白。C.构建体的示意图示出了亲和标签、蛋白酶切割位点、生物素化位点和感兴趣的蛋白。使用相似的克隆策略以获得DENV1、3和4BN-rEDIII蛋白。

图27：示意图示出了涉及用于下游筛选和评估适体的DENV1-4BN-rEDIII蛋白的制备的逐步方法。

图28：纯化的生物素化的DENV2 BN-rEDIII蛋白的制备。用于DENV2 BN-rEDIII蛋白的纯化的FPLC-SEC色谱曲线图。两个迹线对应于在280nm处的蛋白质的UV吸收(虚线：DENV2rEDIII，实线：DENV2 BN-rEDIII)。由于生物素化的和未生物素化的DENV 2 DIII蛋白之间的分子量的差异，迹线没有完全重叠。(B)在SEC纯化之前(泳道2)和之后(泳道3：FPLC纯化的部分1；泳道4：FPLC纯化的部分2)DENV2 BN-rEDIII蛋白的Western印迹分析。星号(*)表示纯化的DENV2 BN-rEDIII单体蛋白质)。

图29：用于使用表面等离子体共振(SPR)针对DENV2 rEDIII蛋白测试不同修饰的适体的Biacore传感图的峰顶高度。选择通过标号为1-10的菱形表示的修饰的适体用于进一步评估。

图30：用于修饰的适体亲和力筛选的蛋白质涂覆的ELMASA。将DENV2 rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。与对照相比，修饰的适体B006、B012和B027与DENV2 rEDIII蛋白具有显著的结合。

图31：用于修饰的适体亲和力筛选的蛋白质涂覆的ELMASA。将DENV1 rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。与对照相比，测试的全部10种修饰的适体与DENV1 rEDIII蛋白均不具有显著的结合。

图32：用于修饰的适体亲和力筛选的蛋白质涂覆的ELMASA。将DENV3 rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。与对照相比，测试的全部10种修饰的适体与DENV1 rEDIII蛋白均不具有显著的结合。

图33：用于修饰的适体亲和力筛选的蛋白质涂覆的ELMASA。将DENV4 rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。与对照相比，测试的全部10种修饰的适体与DENV1 rEDIII蛋白均不具有显著的结合。

图34：用于修饰的适体亲和力筛选的DENV2涂覆的ELMASA。将野生型DENV2涂覆在maxisorp板上。与对照相比，在全部测试浓度下，修饰的适体B118、B121和B128均显著地结合。相反，其他修饰的适体仅在高于4nM的浓度下显著地结合至病毒。

图35：通过1μM的修饰的适体中和DENV2的百分比。通过结合至DENV2的包膜蛋白，修饰的适体B60、B121和B128显著地阻止了病毒的进入。

图36：用于针对其他黄病毒的潜在交叉反应的确定的蛋白涂覆的ELMASA。将(A)WNV DIII、(B)TBEV-281或(C)JEV-290包膜蛋白涂覆在maxisorp板上。修饰的适体不与WNVDIII、TBEV和JEV包膜蛋白交叉反应。

图37：用于适体亲和力筛选的蛋白涂覆的ELMASA。将DENV1-4和WNV的rEDIII蛋白、以及TBEV(TBEV-281)和JEV(JEV-290)的包膜蛋白涂覆在maxisorp板上以测试商购适体(D2A)的结合。适体D2A没有表现出与全部测试的黄病毒包膜或DIII蛋白的任何结合活性。

图38：用于修饰的适体B128与其他黄病毒包膜或EDIII蛋白的交叉反应的评估的蛋白涂覆的ELMASA。将DENV1-D4 rEDIII、WNDIII，或TBEV和JEV的包膜蛋白涂覆在maxisorp板上。修饰的适体B128仅与DENV2 rEDIII蛋白显著结合，但是不与测试的其他靶蛋白显著结合。

图39：示意图示出了涉及针对DENV2 rEDIII蛋白的修饰的适体的评估的逐步方法。

本发明的目标在于开发使用修饰的适体的新的平台，以用于黄病毒，特别是西尼罗病毒和登革热病毒的诊断和治疗应用。

有利地，本发明利用修饰的适体而不是传统DNA或RNA适体，由此DNA链包含修饰的氨基酸侧链。这些氨基酸侧链形成适体与靶蛋白之间的额外的分子间相互作用，因此产生更高的亲和力相互作用。修饰的适体技术可以用于开发新的治疗剂，以及用于黄病毒感染的诊断的新平台。

作为概念的证明，对于修饰的适体的设计，将西尼罗病毒和登革热病毒血清2型包膜结构域III(DIII)蛋白用作抗原/靶蛋白。对于每种蛋白，针对10¹³个适体的随机库筛选蛋白的结合，然后识别针对每种蛋白的特异性且强力结合的适体。通过评估选择的适体与每种纯化的DIII蛋白和病毒中全长E蛋白的结合特性，识别可以用于诊断和治疗应用的适体。评估用于每种蛋白的十种潜在适体候选物并且结论将在下文中讨论。

具体实施方式

将参考下文的非限定性实施例进一步描述本发明。

实施例1：西尼罗病毒(WNV)包膜DIII蛋白修饰的适体的评估

材料和方法

pET28a WNE-BNDIII质粒的构建。WNE-DIII基因(Wengler菌株)亚克隆自包含WN-DIII基因的实验室原始质粒。DIII基因预先扩增自由西尼罗病毒Wengler菌株合成的cDNA。如图1所示，通过重叠延伸PCR(OE-PCR)，引物生物素_F、生物素_WNDIII_F、生物素_WNDIII_R和WNDIII_R(表1)用于连接包含肠激酶切割位点的生物素化信号肽基因和WNEDIII基因。通过NheI和XhoI剪切位点，将含有连接的片段的凝胶-纯化的PCR产物随后克隆到pET28a表达载体(Novagen，德国)。6xHis标签和凝血酶切割位点位于生物素化的信号肽的N-端处，然后是位于C-端的肠激酶切割位点和WNDIII蛋白。进行DNA测序以验证构建体。

表1.用于克隆的生物素化的WNV DIII蛋白的引物的列表。粗体的字母是限制酶识别位点，而下划线的字母是重叠PCR位点。

蛋白的表达和提取。将pET28aBNWNDIII质粒转化为BL-21-DE3表达感受态细胞(Agilent Technologies，USA)且在包含30μg/ml的卡那霉素(kanamycin)的Luria-Bertani(LB)琼脂上生长。在1L的LB肉汤(30μg/ml的卡那霉素)中在30℃下培养选择的克隆，直到吸收率OD₆₀₀为0.6。使用1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在16℃过夜诱导BN-WNDIII蛋白的表达。在4℃下使用离心在8000rpm下进行15分钟沉淀(pelleted down)细菌细胞。表达的蛋白靶向内含体。为了分离内含体，在溶解缓冲剂(20mM的Tris(三羟甲基氨基甲烷)，pH8.0，500mM的NaCl，10mM的咪唑)中再悬浮小球(pellet)，然后在冰浴中超声处理(15分钟，10Amp)。在4℃下以12，000rpm离心裂解物15分钟。获得内含体的小白透明小球。之后使用相同的溶解缓冲剂清洗内含体小球，然后在室温下使用提取缓冲剂(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，10mM的咪唑，pH 8.0)进行孵育30分钟。随后通过13，500rmp的离心澄清裂解物20min。

纯化。使用镍-氮川三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid)(Ni-NTA)树脂(Bio-Rad，USA)孵育包含BN-WNDIII蛋白的提取的内含物体，以用于在4℃下在色谱柱中的过夜结合。使用十个柱体积的清洗缓冲剂(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，10mM的咪唑，pH 8.0)以洗掉非特异性结合的蛋白。最终在六个部分(fraction)中使用洗脱缓冲剂(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，500mM的咪唑，pH 8.0)洗脱出BN-WNDIII蛋白。接下来，将全部的洗脱物合并用于再折叠。简言之，将洗脱物集中至SnakeSkin透析膜管(Thermo Scientific，USA)并且将0.5％的Tween-20加入到样本中。在4℃下在1L的6M脲中孵育透析管6-12小时，并且每6-12小时将250ml的25mM的Tris(pH 8.0)加入至溶液。当最终的体积达到3L时，将透析管转移至2L的25mM的Tris和150mM的NaCl(pH 8.0)持续6小时。从透析管中收集再折叠的WNDIII蛋白。将包含感兴趣的蛋白的部分(fraction)注射到FPLC机器并且进一步通过在PBS中的排阻色谱进行纯化。

蛋白身份分析。通过SDS-PAGE和Western印迹(蛋白质印记)分析从流过(flowthrough)、清洗和洗脱收集的样本。12％Tris-tricine聚丙烯酰胺变性胶用于分离样本中的蛋白，并且随后使用用于蛋白检测的考马斯蓝(Coomassie blue)染色。通过两种不同方法通过Western印迹证实生物素化的WNDIII蛋白的存在。首先使用抗His抗体确认WNDIII蛋白的身份(identity)。简言之，使用干印记系统(Life Technologies，USA)将分离的蛋白从聚丙烯酰胺胶转移至PVDF膜上。在室温下使用5％的BSA持续1小时完成封闭。接下来，在4℃下使用0.1μg/ml鼠抗-His抗体(Qiagen，Germany)过夜孵育膜。然后使用1x TBST清洗膜并且使用0.1μg/ml的结合有HRP的山羊抗-小鼠第二抗体(Thermo Scientific，USA)在室温下孵育1小时。在使用1x TBST清洗之后，使用West Pico化学发光底物(Thermo Scientific，USA)将膜显影。对于第二种方法，使用结合有HRP的链亲和素直接检测WNDIII蛋白。在将样本转移至PVDF膜之后，使用4％的BSA在室温下封闭1小时。然后，在室温下使用HRP结合的链亲和素(Millipore，USA)孵育膜另一个小时。随后，在室温下使用1x PBST完全清洗膜1小时，并且使用化学发光底物显影。相似的纯化程序用于未生物素化的WNDIII的制备。

用于质谱的样本制备。使用12％的Tris-tricine聚丙烯酰胺变性胶通过SDS-PAGE将纯化的蛋白(BN-WNDIII和WNDIII)电泳，并且使用考马斯蓝染色。使用脱色溶液(40％的甲醇，10％的冰醋酸，50％的蒸馏H₂O)去除考马斯-染色凝胶的背景。从凝胶中切除BN-WNDIII蛋白-相关的带并且保留在含有蒸馏水的微量离心管(eppendorf管)中。样本提交至用于质谱分析的蛋白和蛋白质组中心，生物科学学院，NUS(Protein and ProteomicsCentre，Department of Biological Sciences，NUS)。

用于生物素化的酶连免疫吸收实验(ELISA)。将样本和标准品一式三份添加至MaxiSorp板(eBioscience，USA)的孔(well)中。使用铝箔覆盖板并孵育2小时。在室温下进行全部的孵育和清洗步骤。在使用1x PBST清洗之后，将封闭缓冲剂添加至每个孔中并孵育另外一小时。接下来，添加链亲和素-HRP酶结合物并孵育1小时。使用1x PBST清洗板以去除未结合的结合物，并且然后添加底物溶液、四甲基联苯胺(TMB)以用于显影。通过添加0.5M的H₂SO₄溶液停止反应。立即在450nm下测量吸收率。通过ELISA测试每批FPLC纯化的BN-WNDIII蛋白以确保蛋白是生物素化的。

生物素化的蛋白结合实验。根据制造商的方案，使用链亲和素磁珠(GEHealthcare，UK)测试纯化的生物素化的WNDIII蛋白的连接亲和力。简言之，将样本与链亲和素磁珠混合并在温和混合下孵育30分钟。使用清洗缓冲剂去除未结合的蛋白，同时使用试剂盒中提供的洗脱缓冲剂洗脱出生物素化的蛋白。通过Western印迹和ELISA分析洗脱的蛋白。

用于适体设计的Selex程序：Apta Biosciences Pte Ltd，(AdaptamerBiosolutions)www.aptabiosciences.com，31 Biopolis Way，#02-25Nanos，Singapore138669，电话：+65-3109-0178，传真：+65-6779-6584，手机+65-9184-7323)，曾用名FujitsuBiolaboratories。Bio-laboratories，R&D Division，(Fujitsu Asia Pte Ltd，FujitsuLaboratories Ltd.，Nanotechnology Business Creation Initiative，31BiopolisWay，#02-25Nanos，Singapore)。

适体的设计和合成：Fujitsu，Biolaboratories，Singapore。

使用BN-WNDIII蛋白的表面等离子体共振(SPR)分析：Fujitsu(图5)

用于亲和力计算的使用WNDIII的SPR分析：Fujitsu(表2)

用于评估的由Fujitsu接收的十种适体是下列项：

未生物素化的适体：N03、N66、N67、N71、N73、N74、N76、N79、N97、N99

生物素化的适体：B03、B66、B67、B71、B73、B74、B76、B79、B97、B99

表2：选择的适体的列表用于在使用SPR测量它们的亲和力之后进一步评估。

适体ID	在pH 5.5(nM)下的KD	在pH 5.0(nM)下的KD
			WNDIII-003	8.5	11.4
WNDIII-066	15.2	12.6
			WNDIII-067	16.0	9.6
WNDIII-071	32.0	9.9
			WNDIII-073	23.8	12.7
WNDIII-074	25.6	10.9
			WNDIII-076	25.0	13.9
WNDIII-079	23.4	14.2
			WNDIII-097	30.9	10.7
WNDIII-099	25.8	8.8

用于表面筛选的酶连接的修饰的适体的吸收实验(ELMASA)。为了增强适体分子与靶蛋白的结合，将由氨基酸侧链组成的修饰的适体结合到DNA主链中。为了选择用于修饰的适体的分析的适合的表面，测试四种不同的ELISA表面。(Nunc-Multisorp、Polysorp、Medisorp和Maxisorp)。简言之，将50ng的生物素化的适体和不同浓度的BN-WNDIII蛋白添加至每个孔并且在4℃下过夜孵育。在过夜孵育之后使用4％的BSA进行封闭，然后使用PBS清洗。之后，添加1:2000稀释的链亲和素-HRP酶结合物并孵育1小时。使用1x PBST清洗板6次以去除未结合的结合物。然后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物溶液以用于显影，并且在室温下孵育15分钟。添加0.5M的H₂SO₄溶液以停止反应。立即在450nm下测量吸收率。

用于亲和力筛选的蛋白涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验。将100ng的纯化的未生物素化的WNDIII蛋白涂覆在maxisorp板上，在4℃下过夜。在涂覆之后，使用PBS清洗ELISA板三次，并使用溶解于不含RNase的TE缓冲剂(Invitrogen)中的不同浓度(1.65nM至26nM/孔)的生物素化的适体孵育1小时。然后，添加1:2000稀释的链亲和素-HRP酶结合物并孵育1小时，然后进行前文提及的标准程序。

病毒涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验。代替使用DIII蛋白，将西尼罗病毒Wengler菌株涂覆在ELISA板上。简言之，将1000PFU的病毒涂覆在每个孔中，然后在4℃下过夜孵育。使用1x PBST清洗孔，然后使用4％的BSA封闭。在这个步骤之后，使用不同浓度的(0.3nM至26nM/孔)生物素化的适体(1-10)孵育孔1小时。然后，添加1:2000稀释的链亲和素-HRP酶结合物并孵育1小时，然后进行前文提及的标准程序。在二级生物安全柜(BSCclass 2)中进行涂覆、清洗、适体添加和显影。

斑(plaque)减少中和测试(PRNT)。在使用之前，将幼仓鼠肾(BHK)细胞接种在24孔板中过夜。小心地解冻冷冻的病毒原液(virus stock)并稀释为1000PFU/ml。为了达到50PFU/50μl西尼罗病毒Wengler菌株，将各种浓度(1.25nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM、165nM、330nM、660nM、13.33μM、5μM和10μM/孔)的未生物素化的适体一式两份地添加，并且允许孵育1.5小时以用于结合。从24孔板中去除细胞生长介质，使用2％的RPMI简短地清洗细胞单层并且然后用100μl的适体+病毒孵育混合物感染。在37℃和5％的CO₂下孵育板1小时，同时每15分钟间隔恒定摇动板。抽出(aspirate)接种体，简言之，使用2％的RPMI清洗，并且使用1ml覆盖介质覆盖每个孔。在37℃和5％的CO₂下孵育板4.5天，直到形成斑。使用在PBS中0.1％的结晶紫溶液染色细胞单层持续24小时。去除结晶紫溶液，在蒸馏水中清洗板并对斑计数。

适体稳定性实验：通过在三种不同的温度下(-20℃、室温和37℃)孵育固定浓度的适体1至5天测试适体的稳定性。在每个时间点之后，通过运行与GEL-RED预混合的1.5％的琼脂糖凝胶来分析适体的完整性。样本在40V运行4小时且在紫外(UV)光下在Gel-doc上观察。

ApoTox-Glo三重实验。使用ApoTox-Glo三重实验试剂盒(Promega)进行实验，并且使用Glomax仪器进行读取。简言之，以5000细胞/孔(5000细胞/0.1ml)的细胞浓度将BHK细胞接种到96孔实验板中，并且过夜孵育。在24小时之后，使用适体(3.3至26nM浓度/孔)和对于细胞毒性(毛地黄皂苷洗涤剂、MPER、膜蛋白提取剂)阳性对照处理细胞。在第1天和第4天时，使用20μl的活性/细胞毒性试剂孵育细胞。简言之，通过轨道振动以300rpm混合板30秒，并在37℃下孵育30分钟。在两个波长集合中测量荧光，400_Ex/505_Em(活性)和485_Ex/520_Em(细胞毒性)。对于发光读数，在每个孔中使用100μl的Capase-Glo 3/7试剂接种板。简言之，通过轨道振动以300rpm混合板30秒，并在室温下孵育30分钟。

Alamar蓝活性实验。使用alamarBlue细胞活力测试(Invitrogen)进行实验并且使用Glomax仪器进行读数。以5000细胞/孔(5000细胞/0.1ml)的细胞密度将BHK细胞接种到96孔实验板中，并且过夜培养。在24小时之后，使用适体(3.3至26nM浓度)和对于细胞毒性(毛地黄皂苷洗涤剂、MPER、膜蛋白提取剂)阳性对照处理细胞。在第1、2、3和4天时，使用10μl的alamar蓝试剂孵育细胞。简言之，通过轨道振动以300rpm混合板30秒，并在37℃下孵育1-4小时，避免直接光照。在570_Ex/585_Em下测量板的荧光。

通过ELISA方法对血清中修饰的适体的稳定性的确定：将已知量(40ng/孔)的生物素化的适体涂覆在Maxisorp板上并在RT下孵育2小时。然后在不同时间点(1、20、48和120小时)内，在使用和不使用100％和20％的血清的情况下孵育板。使用4％的牛血清白蛋白(BSA)孵育阳性对照(仅适体(Just aptamer))。在每个时间点结束时，去除血清和BSA。添加链亲和素-HRP酶结合物(1:5000稀释)并孵育1小时。使用1xPBST清洗板6次以去除未结合的结合物。然后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物溶液以用于显影并在室温下孵育15分钟。添加0.5M的H₂SO₄溶液以停止反应。立即在450nm下测量吸收率。对于阴性对照，在95℃下煮沸适体(B03)48小时。如果适体被血清或加热降解，则适体将不能被链亲和素-HRP检测。

结果

WNE-BNrDIII质粒的构建

为了获得用于适体筛选的西尼罗病毒包膜蛋白结构域III(WNE-BNrDIII)的生物素化蛋白，通过在N-端以及在BAP和WNDIII基因之间的肠激酶切割位点上对生物素化受体肽(BAP)进行工程化，来设计新型质粒构建体。对应于BAP的DNA序列是化学合成的(Cull etal.，2000)，然而WNDIII序列获得自先前的构建体，其衍生自WNV Wengler菌株的cDNA。如图1A中的描述，随后，具有肠激酶切割位点的BAP序列通过重叠延伸PCR(OE-PCR)在5’端处连接至WNDIII。使用NheI和XhoI限制酶双重消化最终的PCR产物和pET28a载体，并且重组的基因连接至消化的质粒，其由多克隆位点的上游的6xHis标签组成。因此，包含WNDIII包膜蛋白的重组BAP已经在N-端用2个标签克隆，即6xHis标签(用于亲和纯化)和生物素(用于结合至链亲和素)，并且包含两钟酶(凝血酶和肠激酶)切割位点(图1B和1C)。然后将这种工程化的构建体转化到大肠杆菌TOP 10中，并且通过菌落PCR、限制性消化和DNA测序证实阳性克隆。质粒的新颖性是已经使用用于生物素化的WNDIII基因工程化了生物素受体肽(BAP)。这种构建体可以用于体内或体外生物素化。此外，凝血酶和肠激酶切割位点能够在纯化后去除任一个或全部的标签。这允许用于下游蛋白选择的纯化的重组DIII蛋白与来自蛋白和/或适体库的集合(pool)的配对物(partner)和/或适体相互作用。

WNE-BNrDIII质粒的表达

为了表达重组蛋白，将工程化的质粒转化到商购大肠杆菌AVB-100中(获得自Genecopoeia)。AVB 100大肠杆菌菌株在基因组DNA内与过量表达的BiR A(生物素连接酶)基因结合。这种酶特异性地将生物素分子添加至BAP的赖氨酸残基。最初，感兴趣的蛋白(BAP-WNDIII)并未在大肠杆菌K12AVB-100中表达(图15)。原因可能是由于在其他细菌系统中表达蛋白的固有特性。以前，表达BL-21(DE3)中的WNE DIII蛋白。为了克服这个问题，改变策略以在大肠杆菌BL21DE3中表达BAP-WNDIII构建体，然后使用BirA酶体外生物素化。当在大肠杆菌BL21(DE3)中表达构建体时，在IPTG诱导的BL-21(DE)菌株的裂解物中检测到对应于重组全长BAP-WN rDIII蛋白的明显的带[图2(A)(i)]。使用抗His抗体探测的Western印迹显示出感兴趣的重组蛋白在大肠杆菌BL-21(DE)中表达[图2(A)(ii)]。在证实表达之后，扩大培养体积以用于重组蛋白的大量生产。在培养之后，使用IPTG诱导细胞。收获细胞并分离内含体(IB)。然后从IB提取粗蛋白并且使其经历在材料和方法中说明的His-标签亲和纯化、再折叠和排阻色谱。图2(A)(iii)和(B)中示出了对应于BAP-WNDIII蛋白的SDS-PAGE和FPLC曲线图。为了比较，示出了对应于未生物素化的WNDIII的迹线。使用这种纯化程序，从1L的培养物中获得了1mg的纯化蛋白。通过进行凝胶内胰蛋白酶消化然后进行肽质量指纹图谱(fingerprinting)通过质谱进一步证实了纯化蛋白的身份(identity)。图3中示出了表示重组蛋白的表达、纯化和评估的示意流程图。

生物素化的蛋白的筛选：

由于在K12菌株AVB100中表达构建体的尝试不成功，因此进行使用Bir-A酶的体外生物素化。使用ELISA测试体外生物素化的WNDIII，并且结果示出在450nm的吸收率，其指示出重组的蛋白是生物素化的，并且在两种实验条件(1小时和过夜反应设置)下均结合至链亲和素-HRP结合物。有趣的是，对照试验，即不使用Bir A酶的样本也在450nm下表现出高吸收率，这指示出其也结合至链亲和素-HRP结合物(图16)。为了证实内源的体内生物素化的WNDIII可以是人工的，在ELISA中重复三次实验。使用阳性和阴性对照，即生物素化的和未生物素化的麦芽糖结合蛋白(MBP)，以及无BAP的WN-DIII和登革热1-4DIII蛋白[图4(A)]。在全部的测试条件下，获得了相同的结果，这指示出了BAP-WNDIII蛋白可以是内源生物素化的。为了进一步证实这点，进行通过使用链亲和素-HRP结合物的Western印迹[图4(B)]和Bc Mag-链亲和素珠的测试，并且发现了在表达过程中蛋白在特定BAP位点确实是内源生物素化的(图17)。

内源生物素化：

在证明了在蛋白自身的表达过程中包含WNDIII蛋白的BAP是内源体内生物素化的之后，感兴趣的将是理解生物素化可以如何内源的发生，以及细胞中用于生物素化的生物素来源在哪。进行对于大肠杆菌BL 21(DE3)的基因组DNA序列中的Bir A酶的生物信息学检索，并且发现了在大肠杆菌菌株中发现了编码Bir A的基因，其已经用于表达。此外，已经发现生物素将存在于介质中，其已经用于培养细菌细胞(Tolaymat et al.，1989)。因此，利用培养基中的生物素，通过在细胞中已经存在的生物素连接酶内源生物素化蛋白。从而，将BAP附接至感兴趣的基因并在大肠杆菌BL 21(DE3)中表达它将产生内源生物化的蛋白，因此排除了对于商购表达菌株或体外生物素化的需要。因此，已经建立了用于获得用于生物应用例如适体筛选的内源生物化的、纯化蛋白的平台。检查用于生物素化的每批纯化蛋白并发现它们是一致的。也对其进行测试以确定内源生物素化对于通过克隆用于登革热病毒衣壳蛋白的BAP的其他蛋白是否是通用的，并且证实了发现的衣壳(capsid)蛋白是内源生物素化的。这表现出这种平台可以潜在延伸至其他生物素化的蛋白，其在诊断和药物开发中具有商业应用。这已经通过科技拓展公司(Exploit Tchnologies)提交了临时专利(新加坡专利申请第201208602-1，题目为：生物素化蛋白，提交日期：2012年11月22日，其内容以参考的形式结合于本文中)。

修饰的适体的评估

表面选择。

为了测试适体的结合效率，通过涂覆50ng的生物素化的修饰的适体(1至10)，然后使用链亲和素-HRP结合物检测，来测试四种不同表面的适合性。相似地，也涂覆改变浓度的生物素化的WNDIII(10、25、50和100ng/孔)蛋白。结果在图6中示出，尽管对于四个不同表面的全部实验环境均是相同的，但观察到了结合的差异。在Multisorp板上，在450nm的吸收率指示适体和WNDIII蛋白的非常低的结合(对于适体在0.15下最大吸收率，且对于蛋白为0.1至0.5)。发现了对于适体，Polysorp和Medisorp板的结合效率相似(最大吸收率从2至2.5改变)，相反对于WNDIII蛋白，其在从(0.1至1)的范围内。对于Maxisorp板，对于适体的吸收率从2.5至3变化，且对于蛋白为从0.2至1.3。因此，选择Maxisorp板作为用于涂覆适体以及蛋白的良好表面，用于进一步的评估。

用于亲和力筛选的蛋白涂覆的酶连接修饰的适体吸收实验。

为了评估适体与WNDIII蛋白的特异性结合，进行用于十种适体的蛋白涂覆的ELISA。涂覆WNDIII蛋白(100ng/孔)过夜，并且使用不同浓度(0至26nM)的生物素化的适体孵育，然后使用链亲和素-HRP结合物探测。如果适体结合至WNDIII蛋白，则可以通过酶底物反应检测。在这种情况下，观察到当与对照和其他适体比较时，适体B03、B79和B99结合到WNDIII蛋白，因为它们的吸收率显著较高(图7，通过星号表示)。当比较各个浓度的适体时，除在1.65nM浓度下，适体B03、B79和B99在全部浓度(3.3、6.6、13和26nM)下均显著结合(P<0.05)。这指示结合在1.65nM下可能是非显著的。当与图7中示出的B03、B79和B99比较时，在测试的各个浓度下，其他适体较不显著地结合至WNDIII蛋白，其中吸收率相对较低(0.05<p-值<0.1)。

病毒涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验。

在证实修饰的适体能够结合至纯化的WNDIII蛋白之后，评估适体是否能够结合至西尼罗包膜蛋白(如果涂覆整个病毒)。在ELISA板中涂覆西尼罗病毒Wengler菌株(1000PFU/孔)过夜，然后使用不同浓度的适体孵育。仍观察到适体B03、B79和B99特异性结合至病毒上存在的天然包膜蛋白中的结构域III(图8)。当比较各个浓度的适体时，与对照相比，对于全部浓度(0.3nM至26nM)适体B03、B79和B99均显著结合(P<0.05)。在其他适体的情况下，发现它们在高于3.3nM的浓度下显著结合至病毒。这证明了在与其他适体相比时，B03、B79和B99具有较高的结合效果(甚至在较低的浓度下)。在病毒涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验的情况下，当与其蛋白涂覆的对应物相比时，吸收率的强度通常较高。这可以是由于在用于适体结合的病毒中的更多包膜蛋白的可用性，最终导致较高吸收率。使用阴性对照BSA和缓冲剂对照，并且发现它们的吸收率是可以忽略的。这个结果示出了修饰的适体可以特异性结合到野生型西尼罗病毒的天然结构域III。这种修饰的适体也可以结合至其他西尼罗病毒菌株，即Sarafend和Kunjin病毒菌株(图9)适体B03、B67、B73和B99在高于3.3nM的浓度下显著结合至Sarafend菌株，而适体B03、B66、B67、B73和B79在高于3.3nM的浓度下显著结合至Kunjin菌株。这些结果指示出开发的修饰的适体可以用于西尼罗病毒的不同菌株的检测。可以使用两种不同的适体建立基于原型适体的诊断。一种未标记的适体附接至测试样本可以添加至其上的表面。因此，第一适体将结合至抗原，然后其可以使用第二生物素化的适体(用于ELISA或用于检测的基因盒)或附接至适体的荧光体(通过成像、微流体或微毛细管检测)来检测。这样，可以将适体的应用扩展用于黄病毒属的诊断目的以及也扩展以识别它们的不同菌株。

通过修饰的适体中和西尼罗病毒。

因为已经确定修饰的适体能够结合至纯化的WNDIII和野生型西尼罗病毒的包膜蛋白中的天然DIII，然后测试适体中和WNV的能力。使用不同浓度的适体孵育病毒，然后使用适体处理的或未处理的病毒感染BHK细胞。在一小时后去除处理或未处理的病毒。在感染之后的第4天将板染色并且观察斑的形成。在较低浓度的适体处理中，没有中和活性。在5μM和10μM的适体处理中，斑的数量明显减少。图10示出了对于不同测试浓度获得的中和百分比。观察到5μM的N03、N71、N79和N99的处理示出了约30-35％中和，相反其他适体示出小于30％的中和。当适体处理浓度为10μM时，N03和N99示出了高于50％的中和。这些结果示出了N03和N99具有开发针对西尼罗病毒的治疗剂的潜力。

用于修饰的适体的活性实验

由于将开发用于治疗剂的适体的可能性非常高，因此测试使用修饰的适体处理哺乳动物细胞是否导致对细胞的细胞毒性。为了检查在适体处理过程中细胞活性的结果，进行两个不同组的活性实验。第一个涉及使用apotox-glo三重实验，而第二个涉及使用alamar蓝活性实验。使用不同浓度的适体处理细胞，然后在各个时间点(处理后24、36、48和60小时)测试活性。图11中示出了通过两种方法获得的结果。结果表明在测试浓度下，与正常未处理的细胞相比，适体没有表现出任何细胞毒性且细胞仍存活。阳性对照如MPER和毛地黄皂苷处理表现出失去细胞活性。结果可以与使用alamar蓝进行的活性实验相比较。因此，结合的结果指示在3.3至26nM的处理条件下，在多至处理后60小时时，细胞与未处理的细胞一样存活。

适体稳定性实验：

通过在三个不同的温度(-20℃、室温和37℃)孵育适体不同的时间段(1至5天)，然后检查凝胶-红染色的琼脂糖胶中修饰的适体的完整性，来测试适体的稳定性。图12示出了在室温和37℃下孵育5天的适体仍是稳定且完整的，并且通过凝胶红可以检测它们相应的带。

人类血清中适体的稳定性：

将测试修饰的适体的稳定性扩展至在血清存在下，作为开发这些用于治疗应用的适体的可能性的第一步。涂覆生物素化的适体，然后孵育人类血清持续不同的时间点(1、20、48和120小时)。图13示出了获得的在100％和20％的血清中测试的不同适体的稳定性的ELISA结果。可以观察到发现适体在血清中约120小时内是高稳定性的。当仅适体(条a)的吸收率与使用100％的血清(条b)和20％的血清(条c)处理48和120小时的适体比较时，它们是可比较的，不具有任何主要的改变(吸收率(abs)>1.6)。相反，在阴性样本(B03在95℃下加热48小时)中，在450nm下的吸收率非常低(吸收率<0.5)指示出在95℃下连续加热使适体失去稳定性。

结论：

1.第一次设计了用于生物素化的WNDIII的制备的新型质粒构建体。使用用于生物素化的WNDIII基因工程化了生物素受体肽(BAP)。这种构建体可以用于体内或体外生物素化。此外，凝血酶和肠激酶切割位点能够去除纯化标签以在纯化之后产生天然蛋白。

2.发现了在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的BAP-WNDIII质粒构建体产生了内源生物素化的蛋白。通过ELISA和Western印迹证实了这种内源生物素化。

3.内源生物素化对WNDIII蛋白是非特异性的且可应用于任何感兴趣的蛋白。也通过使用登革热病毒衣壳蛋白克隆BAP来测试，并且通过ELISA和Western印迹发现了衣壳和登革热2包膜DIII蛋白均是内源生物素化的。

4.建立了一种平台以获得用于生物应用如适体筛选以及研究蛋白-蛋白相互作用的内源生物素化的、纯化的蛋白。

5.生物素化的蛋白可以用于黄病毒属的诊断和治疗的开发，并且可以扩展至其他医学重要病原体。

6.作为概念验证，生物素化的WNDIII蛋白用于通过Fujitsu Laboratories对修饰的适体进行筛选和选择。

7.初始筛选从库中产生了十种适体的选择，其均通过表面等离子体共振结合至WNDIII蛋白。在序列鉴别之后，Fujitsu的科学家合成十种适体(生物素化和非生物素化的适体)用于评估。

8.对于结合和中和，针对WNDIII蛋白和西尼罗病毒评估十种适体。也对于任何细胞毒性效果和它们的稳定性评估适体。

9.对ELISA板的表面完成初始评估。选择Maxisorp板作为用于涂覆适体以及WNDIII蛋白的良好的表面以用于进一步的评估。

10.用于亲和力筛选的蛋白涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验显示出，当与其他适体比较时，适体B03、B79和B99显著地结合至WNDIII蛋白。

11.病毒涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验示出了，适体B03、B79和B99特异性结合至存在于野生型病毒上的天然包膜蛋白的结构域III(甚至在较低浓度的适体下)。

12.对于WNV的Sarafend菌株，在高于3.3nM的浓度下适体B03、B67、B73和B99显著地结合，而对于Kunjin菌株，在高于3.3nM的浓度下适体B03、B66、B67、B73和B79显著的结合。这指示了开发的修饰的适体可以用于不同菌株的西尼罗病毒的检测。

13.基于前文的评估，这些适体可以开发为用于西尼罗病毒检测的诊断工具，并且也可以扩展至包括登革热和日本脑炎和其他病原体的其他黄病毒属。此外，适体也可以用于开发用于在学术研究中的病毒探测的分子探针。

14.病毒中和实验示出了5μM处理的适体N03、N71、N79和N99产生了约30-35％中和，相反其他适体示出小于30％的中和。当适体处理的浓度在10μM时，N03和N99示出了高于50％的中和。这些结果示出了N03和N99具有开发针对西尼罗病毒的治疗剂的潜能。

15.活性实验的结果指示了在3.3至26nM的适体处理的测试条件下，在至少60小时内细胞是存活的，类似于未处理的细胞。

16.稳定性实验示出当在室温和37℃下孵育适体5天时，适体是稳定且完整的，并且通过凝胶红可以检测到带。

17.血清稳定性实验示出了通过ELISA检测在RT下在100％的血清中直到120小时(5天)适体是稳定的。

18.在图3和14中示出了用于BN-WNDIII蛋白的制造和针对WNDIII蛋白的适体的评估的完整的平台。

19.用于治疗应用的基于评估的针对WNV选择的三种最好的候选适体是N03、N67和N99(未标记的适体)，和用于诊断应用的B03、B67和B99(生物素化的适体)。表3中列出了序列。这些序列将进一步修饰和评估以用于更高的亲和力。

表3：最好的三种抗-WNDIII A-D适体的适体序列

1.主链核苷酸表示为大写字母；

A：腺嘌呤，G：鸟嘌呤，C：胞嘧啶，T：胸腺嘧啶

2.侧链的官能基团表示为小写字母；

b：噻吩，e：谷氨酸、f：苯丙氨酸、h：组氨酸、k：赖氨酸、l：亮氨酸、s：丝氨酸、y：酪氨酸、w：色氨酸

3.天然核苷酸表示为下划线(_)。

下列实施例评估用于人类和胎牛血清中WNV DIII的修饰的适体的稳定性和功能性。也进行与其他修饰和未修饰的适体和商购的适体和抗体的比较研究。

实施例2：血清中WNDIII适体的稳定性和功能性的评估

人血清中的适体的稳定性。

为了通过ELISA测试修饰的适体的稳定性，将生物素化的WNDIII适体(获得自AptaBiosciences Pte Ltd www.aptabiosciences.com，31Biopolis Way，#02-25 Nanos，Singapore 138669，Phone:+65-3109-0178，Fax:+65-6779-6584，Mobile:+65-9184-7323)，曾用名为Fujitsu Biolaboratories的B03、B66、B71、B73、B74、B76和B79)涂覆在maxisorp板(40ng/孔)上，然后在不同的持续时间内使用人类血清孵育。如果适体是不稳定的，则其可以在冲洗过程中降解或被去除。此外，稳定的修饰的适体可以保持结合至maxisorp板。然后可以通过链亲和素-HRP结合物检测生物素化适体的存在，从而产生TMB底物转化。如图18所示，监控修饰的适体的血清稳定性最多至14天，并且发现当与其他相应的不含血清的对照相比时，修饰的适体的血清稳定性在50％和90％之间改变。阴性对照涉及在95℃下加热修饰的适体B03 48小时，这示出了修饰的适体在延长加热的情况下是不稳定的。

根据在人类血清中适体稳定性研究的结果，修饰的适体可以分类为类型1：适度的稳定(B74)，类型2：高的稳定(B03、B66、B71、B73、B76)和类型3：非常高的稳定(B79)。这暗示了修饰的适体B79的主链可以用作起始模板以在将来产生高稳定的适体。尽管修饰的适体B79表现出具有最高的稳定性(可以从图18中看出)，但是选择修饰的适体B03和B99用于进一步的研究，这是由于它们在具有最好结合和病毒中和的最好的三种修饰的适体中，并且具有开发诊断剂或治疗候选物的潜力。尽管如此，这个实验示出了与其他适体(Kaur etal.，2013，Peng et al.，2007)相比修饰的适体在血清中是更稳定的，并且可以是具有长的生理半衰期的潜在治疗剂。

也进行在胎牛血清(FBS)中的修饰的适体B03的持续5天的稳定性的比较。图19示出了修饰的适体B03在FBS中稳定性随时间降低。一种可能的原因是由于在FBS中存在去稳定剂诸如牛核酸酶。先前的研究已经示出了B细胞受体的未修饰的适体在血清中具有1小时的半衰期，相反使用锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)的修饰将半衰期增加至～9小时(Mallikaratchy et al.，2010)。修饰的适体示出了在100％人血清中最多至14天和在100％的FBS中最多至4天的核酸酶抗性。

人血清中修饰的适体的功能测试

在人血清和胎牛血清中适体与WNV DIII和WNV的结合

使用ELISA作为平台，使用WNV DIII蛋白或WNV涂覆maxisorp板。然后添加不同浓度的生物素化的WNV DIII修饰的适体B03，并且孵育2小时，以允许修饰的适体结合至靶标。接下来，随后添加净人类血清或FBS，并孵育不同的时间段。是在孵育之后，使用链亲和素-HRP结合物探测修饰的适体的存在，然后通过TMB底物显影。图20示出了当使用WNV DIII蛋白涂覆maxisorp板时，发现了对于测试的两种适体浓度，修饰的适体B03均能够在最多至24小时内结合至人类血清中的靶蛋白。从图21可以看出，相似地，修饰的适体B03能够在最多至48小时内结合至人类血清中的野生型WNV。相反，这种结合至病毒的能力在FBS中逐渐降低。这可能还是由于FBS中的适体的不稳定性。

通过ELISA对未修饰的适体的稳定性和功能性的评估

合成对应于WNV DIII修饰的适体B03和B99(即，未修饰的适体)的DNA主链的多核苷酸(Sigma Aldrich，USA)，用于与修饰的适体(其具有肽侧链)比较稳定性和功能性。对应于WNV DIII修饰的适体B03和B99的DNA主链的核苷酸序列在下文中列出。

对于稳定性比较研究，在人类血清或FBS中，在改变的持续时间下在室温下(RT)孵育已知量的未修饰的DNA适体。然后通过在ELISA中使用链亲和素-HRP结合物的检测来确定它们的稳定性。

基于图22和23中示出的稳定性研究，可以推断WNDIII修饰的适体B03(参见图22)和B99(参见图23)在人类血清中非常稳定且在FBS中适度的稳定。相应的未修饰的DNA适体(对应于适体B03和B99的核苷酸序列)的稳定性应在人类血清和FBS中低得多。这指示了在修饰的适体中通过侧链修饰提供了额外的稳定性。相似地，当测试WNV DIII侧链修饰的适体B03和B99以及它们的未修饰的DNA对应物的功能性时，观察到未修饰的DNA适体不能结合至靶蛋白，这可以从图24中看出。

与WNV DIII商购抗体结合的适体的比较

使用ELISA平台，将相同浓度(33nM)的适体(B03、B79、B99、B66、B67、B71)和WNV-特异性抗体(Millipore MAB8151)涂覆在maxisorp板上，从而捕获生物素化的WNV DIII蛋白。图25示出了适体和抗体均能够捕获WNV DIII蛋白。修饰的适体B99具有最强的结合并且可以与抗体相比。接下来依次是修饰的适体B03、B79、B66、B67和B71。

结论：

1.在最多至14天内，在人类血清中修饰的适体的稳定性在50％和90％之间改变，并且单独的适体有所不同。可以根据在人类血清中的它们的稳定性将修饰的适体分类为类型1：适度的稳定(B74)，类型2：高的稳定(B03、B66、B71、B73和B76)和类型3：非常高的稳定(B79)。

2.在最多至24和48小时内在人类血清中，修饰的适体(B03)能够分别结合至WNVDIII蛋白和野生型WNV。

3.稳定性和功能性的结果指示出修饰的适体在人类血清中是功能性的，对于修饰的适体的主要性能是开发作为诊断工具或治疗候选物。

4.在侧链修饰的WNV DIII适体B03和B99与它们未修饰的DNA对应物之间的稳定性的比较研究指示出了，修饰的适体B03和B99是高稳定的，相反它们的未修饰的DNA对应物在人类血清和FBS中的24小时孵育之后变得不稳定。

5.在侧链修饰的WNV DIII适体B03和B99与它们未修饰的DNA对应物之间的功能性的比较研究指示出了，修饰的适体B03和B99可以结合至WNV DIII蛋白，相反它们的未修饰的DNA对应物则不能。

6.修饰的适体和抗体均能够在相同的浓度下结合WNV DIII蛋白。修饰的适体B99与WNV DIII蛋白的结合是最强的且可以与抗体的结合相比较，接下来依次是修饰的适体B03、B79、B66、B67和B71。

实施例3：登革热病毒血清2型(DENV2)修饰的适体的评估

下列实施例评估了单独组的选择的修饰的适体(产生自Adaptamer Solutions，www.aptabiosciences.com，Apta Biosciences Pte Ltd，31Biopolis Way，#02-25Nanos，Singapore 138669，Phone:+65-3109-0178，Fax:+65-6779-6584，Mobile:+65-9184-7323)对纯化的DENV2DIII蛋白和野生型DENV上的天然包膜蛋白的结合特性。然后识别可以用于诊断和治疗应用的最好的适体。评估针对DENV2DIII蛋白的十种潜在适体候选物，并且也讨论了这些结果。

材料和方法

DENV1-4生物素化的重组包膜结构域III(DENV1-4BN-rEDIII)蛋白的克隆和表达

重叠延伸-聚合酶链反应(OE-PCR)。在DENV1-4BN-rEDIII蛋白的克隆中使用两种片段。化学合成生物素受体肽(BAP)(片段1)。每种DENV血清型的包膜糖蛋白的结构域III(片段2)分别衍生自DENV1-4的cDNA。图26示出了涉及DENV2 BN-rEDIII质粒的构建的步骤。按照相似的策略获得用于下游适体筛选的DENV1、3和4BN-rEDIII蛋白。表4中示出了在OE-PCR中使用的引物的列表。

表4：用于全部四种DENV血清型的在OE-PCR中使用的连接片段1(BAP)和片段2(DIII基因)的正向和反向引物的列表。

蛋白的表达和提取。将pET28a-DENV2 BN-rEDIII质粒转移至BL-21-DE3表达感受态细胞(Agilent Technologies，USA)并且在含有30μg/ml的卡那霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂中生长。在1L的LB肉汤(30μg/ml的卡那霉素)中在30℃下培养选择的克隆，直到OD₆₀₀为0.6。使用1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导DENV2 BN-rEDIII蛋白的表达6小时。在4℃下使用离心在8000rpm下进行15分钟沉淀(pelleted down)细菌细胞。表达的蛋白靶向内含体(IB)。在随后的步骤中分离IB。首先在溶解缓冲剂(20mM的Tris，pH 8.0，500mM的NaCl，10mM的咪唑)中再悬浮细菌细胞小球，然后在冰浴中超声处理(10分钟，10Amp)。然后在4℃下以12，000rpm离心裂解物15分钟以获得内含体的白色半透明小球。之后使用相同的溶解缓冲剂清洗内含体小球，在室温下在提取缓冲剂(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，10mM的咪唑，pH 8.0)中孵育30分钟，并且通过13，500rmp的离心澄清提取物20分钟。

BN-rEDIII蛋白的固定金属离子亲和色谱(IMAC)纯化。使用镍-氮川三乙酸(Ni-NTA)树脂(Bio-Rad，USA)孵育含有DENV2 BN-rEDIII蛋白的内含体提取物，用于在4℃下在色谱柱中过夜结合。使用五个柱体积的清洗缓冲剂(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，20mM的咪唑，pH 8.0)去除非特异性结合的蛋白。然后在八个1.5-ml的部分(fraction)中使用洗脱缓冲剂(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，500mM的咪唑，pH 8.0)洗脱出BN-D2DIII蛋白。将全部的洗脱物集中至SnakeSkin透析膜管(Thermo Scientific，USA)并且将0.05％的Tween-20加入到样本中。在4℃下在4M脲中孵育透析管6-12小时，并且将脲逐渐稀释至0.5M。最终从透析管中收集再折叠的DENV2 BN-rEDIII蛋白，并注射到FPLC机器以通过在PBS中的排阻色谱进行进一步纯化。也以类似的方式纯化DENV1、3和4BN-rEDIII蛋白。

蛋白身份分析。通过SDS-PAGE和Western印迹分析来自IMAC纯化的流过物、清洗物和洗脱液。12％的Tris-tricine聚丙烯酰胺变性胶用于分离蛋白，并且随后使用用于蛋白检测的考马斯蓝(Coomassie blue)染色。对于Western印迹，使用干印记系统(LifeTechnologies，USA)将蛋白从聚丙烯酰胺胶转移至PVDF膜上。在4℃下使用5％的BSA过夜完成封闭。然后在室温下使用链亲和素结合-HRP孵育膜以检测DENV BN-rEDIII 2小时。在室温下使用1x PBST完全清洗膜1小时，并且使用West Pico化学发光底物(Thermo Scientific，USA)显影。图27示出了表示重组的纯化的DENV1-4BN-rEDIII蛋白的表达、纯化和评估的示意流程图。

用于亲和力筛选的蛋白涂覆的酶连接的修饰的适体吸收实验(ELMASA)。将100ng的纯化的未生物素化的DENV2rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板的每个孔上，在4℃下过夜。在接下来的一天，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗ELISA板三次，并一式三份使用溶解于不含RNase的TE缓冲剂(Invitrogen)中的不同浓度(1至32nM/孔)的生物素化的(DENV)适体孵育1小时。然后使用PBS中4％的BSA进行过夜封闭，随后用PBS清洗。随后添加1:2000(v/v)稀释的链亲和素-HRP酶结合物(Millipore)，并孵育板1小时。使用1x PBST清洗板6次，然后添加50μl的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液并在室温下孵育15分钟。最终，添加50μl的0.5M的H₂SO₄溶液以停止反应并立即在450nm下测量吸收率。

病毒涂覆的ELMASA。代替使用DENV2rEDIII蛋白，将1000PFU的DENV2野生型病毒涂覆在ELISA板上，并且在4℃下过夜孵育。使用1x PBST清洗孔，然后使用4％的BSA封闭。在这个步骤之后，使用不同浓度的(1nM至32nM)生物素化的适体(1-10)孵育孔1小时。然后，添加1:2000(v/v)稀释的链亲和素-HRP酶结合物，然后根据前文蛋白涂覆的ELMASA中的描述进行实验的剩余部分。在二级生物安全柜(BSC)中进行全部的程序。

病毒封闭实验。将BHK细胞以50000细胞/孔接种在24孔板上过夜。将溶解于不含RNase的TE缓冲剂(Invitrogen)中的50μl的2μM的适体一式三份添加至50PFU/50μl DENV2。将混合物孵育1.5小时以用于结合(最终适体的工作浓度为1μM/孔)。阴性对照相似地建立但是无任何病毒。然后从24孔板中去除生长培养基，并且使用包含2％FCS的RPMI清洗每个孔中的细胞单层，并且使用100μl的适体-病毒混合物进行感染。在37℃和5％的CO₂下孵育板1小时，以15分钟间隔恒定摇动板。去除接种液，使用包含2％FCS的RPMI清洗细胞单层，并且将1ml的CMC覆盖介质添加至每个孔。在37℃和5％的CO₂下孵育板4.5天，直到形成斑。最后使用结晶紫染色剩余的细胞，并计数未染色的斑。

结果

DENV1–4BN-rEDIII质粒的构建

为了获得用于适体筛选的DENV1–4BN-rEDIII蛋白，通过生物素化的受体肽(BAP)中，然后肠激酶切割位点(在DENV1-4包膜DIII基因的N-端)的工程化来设计新型表达质粒。化学合成对应于BAP的DNA序列(Kaur et al.，2013)，相反DENV1-4包膜DIII DNA序列各自衍生自DENV1-4的cDNA。如图26A所示，具有肠激酶切割位点的BAP序列通过重叠延伸PCR(OE-PCR)连接DIII的上游。使用NheI和XhoI限制酶双重消化最终的PCR产物和pET28a载体，并且重组的基因连接至消化的质粒，其包含多克隆位的上游的6xHis标签。因此，包含重组BAP的DENV1-4rEDIII蛋白各自在N-端具有2个标签，即6xHis标签(用于亲和纯化)和生物素(用于结合至链亲和素)。它们中的每个也包含两种酶(凝血酶和肠激酶)切割位点(图26B和26C)。然后将工程化的构建体转化到大肠杆菌TOP 10细胞中，并且通过菌落PCR、限制性消化和DNA测序证实阳性克隆。因此可以在体内和体外进行含重组BAP的DENV1-4rEDIII蛋白的生物素化。此外，凝血酶和肠激酶切割位点能够在纯化后去除具有或不具有生物素化的BAP的6xHis标签。这允许在其他下游应用诸如从蛋白和/或适体库中选择蛋白相互作用的配对物(partner)和/或适体中使用纯化的rEDIII蛋白。

DENV1-4BN-rEDIII蛋白的表达和纯化

DENV1-4BN-rEDIII蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在通过使用抗-His抗体的Western印迹确认DENV1-4BN-rEDIII蛋白表达之后，扩大表达以产生大量DENV1-4 BN-rEDIII蛋白。从内含体提取粗蛋白并且使其经历在材料与方法中说明的IMAC亲和纯化、再折叠和排阻色谱。图28中示出了DENV2 BN-rEDIII蛋白的典型FPLC-SEC曲线图。用于比较，重叠了对应于未生物素化的DENV 2 rEDIII蛋白的迹线。图28(B)示出了使用链亲和素-HRP的Western印迹确认DENV1-4 BN-rEDIII以及它们的纯化物上生物素的存在。在FPLC之后在纯化的部分中仅检测到单一的带(泳道3和4)，相反在SEC纯化之前在IMAC洗脱液中检测到了多条带(泳道2)。从1L的细菌培养物中纯化1mg的纯化的rEDIII蛋白。进一步通过凝胶内胰蛋白酶消化以及肽质量指纹图谱确认了纯化的DENV1-4BN-rEDIII蛋白的身份(identity)。

适体筛选：

适体设计和合成：

DENV2 BN-rEDIII蛋白-结合修饰的适体候选物的识别

使用修饰的适体的库溶液孵育固定在单体抗生物素蛋白-琼脂糖树脂上的DENV2BN-rEDIII蛋白。然后在使用亲和素溶液从树脂洗脱修饰的适体：DENV2 BN-rEDIII复合物之前，重复清洗树脂以去除弱结合的修饰的适体。使用碱处理洗脱的复合物以去除侧链并释放DNA适体主链，从而用于RPC、测序和随后克隆，以实现结合的适体的DNA序列的确定。获得了136种DENV2 BN-rEDIII修饰的适体候选物的DNA序列，并且通过DNA合成器合成这些修饰的适体。通过将它们应用至固定在CM5Biacore传感器芯片(通过胺连接)上的DENV2 BN-rEDIII蛋白，重复DENV2 BN-rEDIII修饰的适体候选物的筛选。选择前10种DENV2 BN-rEDIII修饰的适体候选物以用于进一步的分析。

使用DENV2rEDIII蛋白的SPR分析：

对于K_D测量，10种DENV2 BN-rEDIII修饰的适体候选物的每种均是生物素化的且单独地固定在Biacore SA芯片上。在MES缓冲剂中在pH5.5下，对于各个浓度的DENV2rEDIII蛋白确定它们的单独的K_D(参见图29和表5)。用于针对DENV2 EDIII确认的从适Adaptamer Solutions接收的十种适体是生物素化修饰的适体B002、B006、B012、B016、B027、B060、B113、B118、B121和B128。

表5：选择用于在使用SPR测量它们的亲和力之后进一步评估的适体的列表。

用于修饰的适体亲和力筛选的DENV2 BN-rEDIII涂覆的ELMASA

为了评估10种选择的修饰的适体与DENV2 rEDIII蛋白的结合，使用各种浓度(0至32nM)的生物素化的修饰的适体进行DENV2 rEDIII蛋白涂覆的ELMASA。尽管在全部测试浓度下修饰的适体B012、B060、B113、B118和B121也显著的结合至DENV2 rEDIII蛋白，但是观察到修饰的适体B002、B006、B027和B12最有效地结合至DENV2 rEDIII蛋白。评估了针对DENV1、3和4的rEDIII蛋白，修饰的适体的结合，并且结果分别在图31、32和33中示出。对于全部10种修饰的适体，对DENV1、3和4的rEDIII蛋白具有最小结合。这个结果暗示了修饰的适体特异性结合至DENV2 rEDIII蛋白。

病毒涂覆的ELMASA。

进一步使用野生型病毒确认修饰的适体与纯化的DENV2 rEDIII蛋白的结合。将DENV2(1000PFU/孔)涂覆在ELISA板上过夜，然后使用不同浓度的适体进行孵育。与对照相比仍观察到修饰的适体B060、B118、B121和B128特异性结合至DENV2(图34)。这暗示了这些修饰的适体可以特异性结合至野生型DENV2上的天然包膜结构域III，并且修饰的适体可以用于不同DENV血清型的检测和鉴别，目前仅可以通过PCR来实现。

通过修饰的适体中和DENV2

在确定修饰的适体能够结合至纯化的DENV2 rEDIII蛋白以及野生型DENV2上的天然包膜DIII蛋白之后，评估它们中和DENV2的能力。首先在使用不同浓度的修饰的适体孵育病毒，然后进行BHK细胞的感染。当使用1μM的修饰的适体预处理DENV2时，病毒诱导的斑的数量减少。结果示出了使用1μM的修饰的适体B060和B118的预处理导致了超过60％的中和，相反通过其他修饰的适体的中和在40％至58％之间改变。因此，修饰的适体B060和B118具有将开发为针对DENV2的治疗剂的潜能。

DENV2 DIII修饰的适体与其他黄病毒包膜蛋白的交叉反应：

为了评估修饰的适体与其他黄病毒包膜蛋白的潜在非特异性和交叉反应结合，使用西尼罗病毒(WNV)的包膜或DIII蛋白、蜱传脑炎病毒(TBEV)(ProSpecbio，USA)和日本脑炎病毒(JEV)(ProSpecbio，USA)进行蛋白涂覆的ELMASA。在测试的全部修饰的适体浓度下检测出没有显著地结合至全部三种前述病毒的包膜或DIII蛋白(参见图36；小图(panel)A：WNV包膜DIII，小图B：TBEV-281包膜蛋白，小图C：JEV-290包膜蛋白)。

TBE-281：蜱传脑炎由蜱传脑炎病毒(TBEV)(黄病毒属家族的一员)引起。TBE-281是包含蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白的残基95至229的大肠杆菌衍生的重组蛋白。

JEV-290：日本脑炎(原先称为日本B脑炎)是来自黄病毒属家族的病毒。它与WNV和圣路易斯脑炎病毒紧密相关。JEV-290蛋白是在大肠杆菌中表达的50-kDa全长日本脑炎病毒包膜蛋白，且与6x组氨酸标签融合。

用于本发明的DENV2 DIII修饰的适体和其他商购适体与DENV2 rEDIII蛋白的结合的比较。

针对DENV2 DIII(D2A)(OTC Biotech，USA)，将本发明的DENV2 DIII修饰的适体的功能性与可商购适体比较。以与DENV2 DIII修饰的适体相似的方式评估商购适体。如图37中所示，商购的适体不能在测试浓度下与全部靶蛋白结合。在比较中，在ELISA中修饰的适体B128表现出非常高的吸收率，这指示出与DENV2 rEDIII蛋白显著的结合。

结论：

1.设计用于生物化的DENV1-4 rEDIII蛋白的制备的质粒构建体，以用于筛选修饰的适体。将生物素受体肽(BAP)设计为用于生物素化的DENV1-4 rEDIII的基因。这种构建体可以用于体内和体外生物素化。凝血酶和肠激酶切割位点的插入进一步使标签能去除以在纯化之后产生天然蛋白。

2.已经建立了平台以获得用于应用诸如适体筛选和蛋白-蛋白相互作用的研究的生物素化的纯化的DENV 1-4 DIII。

3.生物素化的DENV2rEDIII蛋白用于通过Adaptamer Solutions筛选和选择修饰的适体。

4.初始筛选通过表面等离子体共振从库中选择结合至DENV2 rEDIII蛋白的十种修饰的适体。在识别序列之后，Adaptamer Solutions的科学家合成了用于评估的十种修饰的适体(生物素化的适体)。

5.对于结合和中和，分别针对DENV2 rEDIII蛋白和DENV2评估十种生物素化的修饰的适体。

6.用于修饰的适体亲和筛选的蛋白涂覆的ELMASA显示了修饰的适体B002、B118和B128特异性结合至DENV2 rEDIII蛋白。

7.病毒涂覆的ELMASA示出了修饰的适体B118、B121和B128特异性结合至野生型DENV2上存在的天然包膜蛋白(甚至在低浓度下)。基于上述评估，这些适体可以开发为用于DENV检测的诊断工具。这些适体也可以被开发为用于学术研究的病毒检测的分子探针。

8.病毒中和实验示出了使用1μM的修饰适体B060和B118的处理导致了超过60％的DENV2病毒的中和。其他修饰的适体导致了病毒中和在40％和58％之间改变。这暗示了修饰的适体B060和B118具有开发为用于治疗DENV2感染的治疗剂的潜能。

9.用于修饰的适体(DENV2 rEDIII适体)与其他黄病毒包膜蛋白(WNV EDIII、TBEV和JEV)的结合的对比研究示出了非显著的结合且对于DENV2 rEDIII非常特异性。

10.与从商业来源获得的适体相比，修饰的适体与DENV2 rEDIII的结合是非常高的且是显著的。

11.图39示出了用于针对DENV2 rEDIII蛋白的适体评估的完整平台。

12.基于评估，用于DENV2 rEDIII蛋白的最好的三种修饰的适体候选物是B002、B118和B128，它们可以进一步开发用于诊断和治疗应用。表6中列出了它们的序列。这些序列可以进一步修饰以用于更高的亲和力。

表6：针对DENV2 DIII的修饰的适体的序列。

1.主链核苷酸表示为大写字母；

A：腺嘌呤，G：鸟嘌呤，C：胞嘧啶，T：胸腺嘧啶

2.侧链的官能基团表示为小写字母；

b：噻吩，e：谷氨酸、f：苯丙氨酸、h：组氨酸、k：赖氨酸、1：亮氨酸、s：丝氨酸、y：酪氨酸、w：色氨酸

3.不具有侧链的天然核苷酸表示为下划线(_)。

参考文献

Bhardwaj，S.，Holbrook，M.，Shope，R.E.，Barrett，A.D.and Watowich，S.J.(2001).Biophysical characterization and vector-specific antagonist activityof domain III of the tick-borne flavivirus envelope protein.J Viral 75，4002-4007.

Bhatt，S.，Gething，P.W.，Brady，O.J.，Messina，J.P.，Farlow，A.W.，Moyes，C.L.，et al.(2013).The global distribution and burden of dengue.Nature.

Bigham，A.W.，Buckingham，K.J.，Husain，S.，Emond，M.J.，Bofferding，K.M.，Gildersleeve，H.，et al.(2011).Host genetic risk factors for West Nile virusinfection and disease progression.PloS one 6，e24745.

Chavez，J.H.，Silva，J.R.，Amarilla，A.A.and Moraes Figueiredo，L.T.(2010).Domain III peptides from flavivirus envelope protein are useful antigens forserologic diagnosis and targets for immunization.Biologicals:journal of theInternational Association of Biological Standardization 38，613-618.

Chin，J.F.，Chu，J.J.and Ng，M.L.(2007).The envelope glycoprotein domainIII of dengue virus serotypes 1 and 2 inhibit virus entry.Microbes Infect 9，1-6.

Cho，S.J.，Woo，H.M.，Kim，K.S.，Oh，J.W.and Jeong，Y.J.(2011).Novel systemfor detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer.JBiosci Bioeng 112，535-540.

Chu，J.J.，Rajamanonmani，R.，Li，J.，Bhuvanakantham，R.，Lescar，J.and Ng，M.L.(2005).Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domainIII from the envelope glycoprotein.J Gen Virol 86，405-412.

Clyde，K.，Kyle，J.L.and Harris，E.(2006).Recent advances in decipheringviral and host determinants of dengue virus replication and pathogenesis.JVirol 80，1 1418-11431.

Cohen，C.，Forzan，M.，Sproat，B.，Pantophlet，R.，McGowan，I.，Burton，D.andJames，W.(2008).An aptamer that neutralizes R5 strains of HIV-1 binds to coreresidues of gp120 in the CCR5 binding site.Virology 381，46-54.

Crill，W.D.and Roehrig，J.T.(2001).Monoclonal antibodies that bind todomain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers ofvirus adsorption to Vero cells.J Virol 75，7769-7773.

Cull，M.G.and Schatz，P.J.(2000).Biotinylation of proteins in vivo andin vitro using small peptide tags.Method Enzymol 326，430-440.

Dey，A.K.，Griffiths，C.，Lea，S.M.and James，W.(2005a).Structuralcharacterization of an anti-gp120 RNA aptamer that neutralizes R5 strains ofHIV-1.Rna 11，873-884.

Dey，A.K.，Khati，M.，Tang，M.，Wyatt，R.，Lea，S.M.and James，W.(2005b).Anaptamer that neutralizes R5 strains of human immunodeficiency virus type 1blocks gp120-CCR5interaction.J Virol 79，13806-13810.

Duan，T.，Ferguson，M.，Yuan，L.，Xu，F.and Li，G.(2009).Human Monoclonal FabAntibodies Against West Nile Virus and its Neutralizing Activity Analyzed inVitro and in Vivo.Journal of antivirals&antiretrovirals 1，36-42.

Fujita，S.，Arinaga，K.，Fujihara，T.，Aki，M.and Kichise，T.(2012).NovelProtein Detection System Using DNA as Constituent Material.Fujitsu Sci Tech J48，237-243.

Giver，L.，Bartel，D.P.，Zapp，M.L.，Green，M.R.and Ellington，A.D.(1993).Selection and Design of High-Affinity Rna Ligands for Hiv-1 Rev.Gene 137，19-24.

Gopinath，S.C.B.，Hayashi，K.and Kumar，P.K.R.(2012).Aptamer That Bindsto the gD Protein of Herpes Simplex Virus 1 and Efficiently Inhibits ViralEntry.J Virol 86，6732-6744.

Gromowski，G.D.and Barrett，A.D.(2007).Characterization of an antigenicsite that contains a dominant，type-specific neutralization determinant on theenvelope protein domain III(ED3)of dengue 2 virus.Virology 366，349-360.

James，W.(2007).Aptamers in the virologists′toolkit.J Gen Virol 88，351-364.

James，W.，Moore，M.D.，Bunka，D.H.J.，Stockley，P.G.，Spear，P.G.，Cookson，J.，et al.(2011).The Development of Aptamers as Candidate Antiviral Agents:Towards a Polyvalent Microbicide.Nucleic Acid Ther 21，A56-A56.

Keefe，A.D.，Pai，S.and Ellington，A.(2010).Aptamers as therapeutics.NatRev Drug Discov 9，537-550.

Lisova，O.，Hardy，F.，Petit，V.and Bedouelle，H.(2007).Mapping tocompleteness and transplantation of a group-specific，discontinuous，neutralizing epitope in the envelope protein of dengue virus.J Gen Virol 88，2387-2397.

Liu，Y.，Tuleouva，N.，Ramanculov，E.and Revzin，A.(2010).Aptamer-BasedElectrochemical Biosensor for Interferon Gamma Detection.Anal Chem 82，8131-8136.

Modis，Y.，Ogata，S.，Clements，D.and Harrison，S.C.(2004).Structure of thedengue virus envelope protein after membrane fusion.Nature 427，313-319.

Moore，M.D.，Bunka，D.H.J.，Forzan，M.，Spear，P.G.，Stockley，P.G.，McGowan，I.and James，W.(2011).Generation of neutralizing aptamers against herpessimplex virus type 2:potential components of multivalent microbicides.J GenVirol 92，1493-1499.

Mukhopadhyay，S.，Kuhn，R.J.and Rossmann，M.G.(2005).A structuralperspective of the flavivirus life cycle.Nat Rev Microbiol 3，13-22.

Noda，M.，Masrinoul，P.，Punkum，C.，Pipattanaboon，C.，Ramasoota，P.，Setthapramote，C.，et al.(2012).Limited cross-reactivity of mouse monoclonalantibodies against Dengue virus capsid protein among fourserotypes.Biologics:targets&therapy 6，409-416.

Pan，W.H.，Craven，R.C.，Qiu，Q.，Wilson，C.B.，Wills，J.W.，Golovine，S.andWang，J.F.(1995).Isolation of Virus-Neutralizing Rnas from a Large Pool ofRandom Sequences.P Natl Acad Sci USA 92，11509-11513.

Park，J.H.，Jee，M.H.，Kwon，O.S.，Keum，S.J.and Jang，S.K.(2013).Infectivityof hepatitis C virus correlates with the amount of envelope protein E2:Development of a new aptamer-based assay system suitable for measuring theinfectious titer of HCV.Virology 439，13-22.

Rajamanonmani，R.，Nkenfou，C.，Clancy，P.，Yau，Y.H.，Shochat，S.G.，Sukupolvi-Petty，S.，et al.(2009).On a mouse monoclonal antibody thatneutralizes all four dengue virus serotypes.J Gen Virol 90，799-809.

Rey，F.A.(2003).Dengue virus envelope glycoprotein structure:Newinsight into its interactions during viral entry.P Natl Acad Sci USA 100，6899-6901.

Rey，F.A.，Heinz，F.X.，Mandl，C.，Kunz，C.and Harrison，S.C.(1995).Theenvelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 Aresolution.Nature 375，291-298.

Roh，C.and Jo，S.K.(2011).Quantitative and sensitive detection of SARScoronavirus nucleocapsid protein using quantum dots-conjugated RNA aptamer onchip.J Chem Technol Biot 86，1475-1479.

Saxena，D.，Parida，M.，Rao，P.V.and Kumar，J.S.(2013).Cloning andexpression of an envelope gene of West Nile virus and evaluation of theprotein for use in an IgM ELISA.Diagnostic microbiology and infectiousdisease 75，396-401.

Silva，M.S.E.，Ellis，A.，Karaca，K.，Minke，J.，Nordgren，R.，Wu，S.X.andSwayne，D.E.(2013).Domestic goose as a model for West Nile virus vaccineefficacy.Vaccine 31，1045-1050.

Song，K.M.，Lee，S.and Ban，C.(2012).Aptamers and Their BiologicalApplications.Sensors-Basel 12，612-631.

Teoh，E.P.，Kukkaro，P.，Teo，E.W.，Lim，A.P.，Tan，T.T.，Yip，A.，et al.(2012).The structural basis for serotype-specific neutralization of dengue virus bya human antibody.Science translational medicine 4，139ra 183.

Tolaymat，N.and Mock，D.M.(1989).Biotin analysis of commercial vitaminand other nutritional supplements.The Journal of nutrition 119，1357-1360.

Tuerk，C.，Macdougal，S.and Gold，L.(1992).Rna Pseudoknots That InhibitHuman-Immunodeficiency-Virus Type-1 Reverse-Transcriptase.P Natl Acad Sci USA89，6988-6992.

Wang，P.，Yang，Y.，Hong，H.，Zhang，Y.，Cai，W.and Fang，D.(2011).Aptamers asTherapeutics in Cardiovascular Diseases.Curr Med Chem 18，4169-4174.

Zhang，Z.S.，Yan，Y.S.，Weng，Y.W.，Huang，H.L.，Li，S.Q.，He，S.and Zhang，J.M.(2007).High-level expression of recombinant dengue virus type 2 envelopedomain III protein and induction of neutralizing antibodies in BALB/C mice.JVirol Methods 143，125-131.

Gromowski GD，Barrett AD.Characterization of an antigenic site thatcontains a dominant，type-specific neutralization determinant on the envelopeprotein domain III(ED3)of dengue 2virus.Virology.2007；366(2):349-60.Epub2007/08/28.

Crill WD，Roehrig JT.Monoclonal antibodies that bind to domain III ofdengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virusadsorption to Vero cells.J Virol.2001；75(16):7769-73.Epub 2001/07/20.

Lisova O，Hardy F，Petit V，Bedouelle H.Mapping to completeness andtransplantation of a group-specific，discontinuous，neutralizing epitope in theenvelope protein of dengue virus.J Gen Virol.2007；88(Pt 9):2387-97.Epub 2007/08/19.

Rajamanonmani R，Nkenfou C，Clancy P，Yau YH，Shochat SG，Sukupoivi-PettyS，et al.On a mouse monoclonal antibody that neutralizes all four dengue virusserotypes.J Gen Virol.2009；90(Pt 4):799-809.Epub 2009/03/07.

Rey FA.Dengue virus envelope glycoprotein structure:New insight intoits interactions during viral entry.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.2003；100(12):6899-901.

Clyde K，Kyle JL，Harris E.Recent advances in deciphering viral andhost determinants of dengue virus replication and pathogenesis.J Virol.2006；80(23):11418-31.Epub 2006/08/25.

Modis Y，Ogata S，Clements D，Harrison SC.Structure of the dengue virusenvelope protein after membrane fusion.Nature.2004；427(6972):313-9.Epub 2004/01/23.

Mukhopadhyay S，Kuhn RJ，Rossmann MG.A structural perspective of theflavivirus life cycle.Nat Rev Microbiol.2005；3(1):13-22.Epub 2004/12/21.

Rey FA，Heinz FX，Mandl C，Kunz C，Harrison SC.The envelope glycoproteinfrom tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.Nature.1995；375(6529):291-8.Epub 1995/05/25.

Bhardwaj S，Holbrook M，Shope RE，Barrett AD，Watowich SJ.Biophysicalcharacterization andvector-specific antagonist activity of domain III of thetick-borne flavivirus envelope protein.J Virol.2001；75(8):4002-7.Epub 2001/03/27.

Chin JF，Chu JJ，Ng ML.The envelope glycoprotein domain III of denguevirus serotypes 1 and 2inhibit virus entry.Microbes Infect.2007；9(1):1-6.Epub2007/01/02.

Chu JJ，Rajamanonmani R，Li J，Bhuvanakantham R，Lescar J，NgML.Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domain III fromthe envelope glycoprotein.J Gen Virol.2005；86(Pt 2):405-12.Epub 2005/01/22.

Zhang ZS，Yan YS，Weng YW，Huang HL，Li SQ，He S，et al.High-levelexpression of recombinant dengue virus type 2 envelope domain III protein andinduction of neutralizing antibodies in BALB/C mice.J Virol Methods.2007；143(2):125-31.Epub 2007/05/29.

Teoh EP，Kukkaro P，Teo EW，Lim AP，Tan TT，Yip A，et al.The structuralbasis for serotype-specific neutralization of dengue virus by a humanantibody.Science translational medicine.2012；4(139):139ra83.Epub 2012/06/23.

Noda M，Masrinoul P，Punkum C，Pipattanaboon C，Ramasoota P，SetthapramoteC，et al.Limited cross-reactivity of mouse monoclonal antibodies againstDengue virus capsid protein among four serotypes.Biologics:targets&therapy.2012；6:409-16.Epub 2012/12/05.

Bhatt S，Gething PW，Brady OJ，Messina JP，Farlow AW，Moyes CL，et al.Theglobal distribution and burden of dengue.Nature.2013.Epub 2013/04/09.

Tuerk C，Macdougal S，Gold L.Rna Pseudoknots That Inhibit Human-Immunodeficiency-Virus Type-1 Reverse-Transcriptase.P Natl Acad Sci USA.1992；89(15):6988-92.

Giver L，Bartel DP，Zapp ML，Green MR，Ellington AD.Selection and Designof High-Affinity Rna Ligands for Hiv-1 Rev.Gene.1993；137(1):19-24.

Cohen C，Forzan M，Sproat B，Pantophlet R，McGowan I，Burton D，et al.Anaptamer that neutralizes R5 strains of HIV-1 binds to core residues of gp 120in the CCR5 binding site.Virology.2008；381(1):46-54.

Dey AK，Khati M，Tang M，Wyatt R，Lea SM，James W.An aptamer thatneutralizes R5 strains of human immunodeficiency virus type l blocks gp120-CCR5 interaction.J Virol.2005；79(21):13806-10.

Dey AK，Griffiths C，Lea SM，James W.Structural characterization of ananti-gp120 RNA aptamer that neutralizes R5 strains of HIV-1.Rna.2005；11(6):873-84.

Pan WH，Craven RC，Qiu Q，Wilson CB，Wills JW，Golovine S，et al.Isolationof Virus-Neutralizing Rnas from a Large Pool of Random Sequences.P Natl AcadSci USA.1995；92(25):11509-13.

Cho SJ，Woo HM，Kim KS，Oh JW，Jeong YJ.Novel system for detecting SARScoronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer.J Biosci Bioeng.2011；112(6):535-40.

Park JH，Jee MH，Kwon OS，Keum SJ，Jang SK.Infectivity of hepatitis Cvirus correlates with the amount of envelope protein E2:Development of a newaptamer-based assay system suitable for measuring the infectious titer ofHCV.Virology.2013；439(1):13-22.Epub2013/03/15.

Wang P，Yang Y，Hong H，Zhang Y，Cai W，Fang D.Aptamers as Therapeutics inCardiovascularDiseases.Curr Med Chem.2011；18(27):4169-74.

Keefe AD，Pai S，Ellington A.Aptamers as therapeutics.Nat Rev DrugDiscov.2010；9(7):537-50.

Roh C，Jo SK.Quantitative and sensitive detection of SARS coronavirusnucleocapsid protein using quantum dots-conjugated RNA aptamer on chip.J ChemTechnol Biot.2011；86(12):1475-9.

Song KM，Lee S，Ban C.Aptamers and Their BiologicalApplications.Sensors-Basel.2012；12(1):612-31.

Liu Y，Tuleouva N，Ramanculov E，Revzin A.Aptamer-Based ElectrochemicalBiosensor for Interferon Gamma Detection.Anal Chem.2010；82(19):8131-6.

Gopinath SCB，Hayashi K，Kumar PKR.Aptamer That Binds to the gD Proteinof Herpes SimplexVirus 1 and Efficiently Inhibits Viral Entry.J Virol.2012；86(12):6732-44.

James W，Moore MD，Bunka DHJ，Stockley PG，Spear PG，Cookson J，et al.TheDevelopment of Aptamers as Candidate Antiviral Agents:Towards a PolyvalentMicrobicide.Nucleic Acid Ther.2011；21(5):A56-A.

Moore MD，Bunka DHJ，Forzan M，Spear PG，Stockley PG，McGowan I，etal.Generation of neutralizing aptamers against herpes simplex virus type 2:potential components of multivalent microbicides.J Gen Virol.2011；92:1493-9.

James W.Aptamers in the virologists′toolkit.J Gen Virol.2007；88:351-64.

Fujita S，Arinaga K，Fujihara T，Aki M，Kichise T.Novel Protein DetectionSystem Using DNA as Constituent Material.Fujitsu Sci Tech J.2012；48(2):237-43.

Kaur H，LiJJ，Bay BH，Yung LY.Investigating the antiproliferativeactivity of high affinity DNA aptamer on cancer cells.PIoS one.2013；8(1):e50964.Epub 2013/01/24.

Peng CG，Damha MJ.G-quadruplex induced stabilization by 2′-deoxy-2′-fluoro-D-arabinonucleic acids(2′F-ANA).Nucleic acids research.2007；35(15):4977-88.Epub 2007/07/20.

Mallikaratchy PR，Ruggiero A，Gardner JR，Kuryavyi V，Maguire WF，HeaneyML，et al.A multivalent DNA aptamer specific for the B-cell receptor on humanlymphoma andleukemia.Nucleic acids research.2011；39(6):2458-69.Epub 2010/10/30.

本文中提及的全部参考文件均以参考的形式结合到本文中。

Claims (26)

1.一种核酸适体，包括特异性结合至黄病毒结构性蛋白或黄病毒非结构性蛋白的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的适体，其中所述黄病毒选自由西尼罗病毒、登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎和蜱传脑炎病毒组成的组。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的适体，其中所述适体特异性结合至西尼罗病毒包膜蛋白。

4.根据权利要求3所述的适体，其中所述适体特异性结合至所述西尼罗病毒包膜蛋白的结构域III区域。

5.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述DNA分子包括氨基酸侧链。

6.根据权利要求5所述的适体，当从属于权利要求3或4时，其中所述DNA分子包括选自由以下项组成的组的序列：

(a)

5‘-A_CfGkC_T_GwChC_A_CfAlA_GbT_ChC_T_GwGbT_T_CyChC_T_Gw-3‘(基于SEQ IDNo.1的修饰)或其互补物；

(b)

5‘-ChC_T_CyChC_AlA_A_CfAeT_GbT_AsG_AsG_T_CyT_CyA_CfAeT_-3‘(基于SEQ IDNo.2的修饰)或其互补物；和

(c)

5’-GkC_T_GwAeT_A_CfA_CfT_GwAlA_GbT_GbT_T_CyT_GwAeT_T_Gw-3’(基于SEQ IDNo.3的修饰)或其互补物，

其中侧链的官能基团以小写字母表示(b：噻吩、e：谷氨酸、f：苯丙氨酸、h：组氨酸、k：赖氨酸、l：亮氨酸、s：丝氨酸、y：酪氨酸、w：色氨酸)，并且使用下划线(_)表示未修饰的天然核苷酸。

7.根据权利要求1或2中任一项所述的适体，其中所述适体特异性结合至登革热病毒包膜蛋白。

8.根据权利要求7所述的适体，其中所述适体特异性结合至登革热病毒包膜蛋白的结构域III区域。

9.根据权利要求7或8中任一项所述的适体，其中所述DNA分子包括氨基酸侧链。

10.根据权利要求9所述的适体，其中所述DNA分子包括选自由以下项组成的组的序列：

(a)

5’

T-CyA_CfAeT_T_CyAsG_AeT_AeT_GbT_T_GwGbT_T_CyChC_A_Cf-3’(基于SEQ ID No.4的修饰)或其互补物；

(b)

5’-T_AkAlA_T_GwT_GwA_CfGbT_T_CyA_CfAsG_A_CfAlA_GbT_ChC_-3’(基于SEQ IDNo.5的修饰)或其互补物；和

(c)

5’-GkC_T_GwAeT_A_CfA_CfT_GwAlA_GbT_GbT_T_CyT_GwAeT_T_Gw-3’(基于SEQ IDNo.6的修饰)或其互补物，

其中侧链的官能基团以小写字母表示(b：噻吩、e：谷氨酸、f：苯丙氨酸、h：组氨酸、k：赖氨酸、l：亮氨酸、s：丝氨酸、y：酪氨酸、w：色氨酸)，并且使用下划线(_)表示未修饰的天然核苷酸。

11.根据前述权利要求中的任一项所述的适体，其中所述DNA分子进一步包括可检测的部分。

12.根据权利要求11所述的适体，其中所述可检测的部分选自由生物素、酶、发色团、荧光分子、化学发光分子、磷光分子、着色颗粒和发光分子组成的组。

13.根据权利要求12所述的适体，其中所述可检测的部分是生物素。

14.根据前述权利要求中的任一项所述的适体，进一步包括感兴趣的药物，其中所述DNA分子与黄病毒结构性蛋白或黄病毒非结构性蛋白的结合将所述感兴趣的药物靶向其期望的作用位点和/或从所述适体释放所述感兴趣的药物。

15.根据权利要求14所述的适体，其中所述药物选自由药物化合物、核苷酸、抗原、类固醇、维生素、半抗原、代谢物、肽、蛋白质、拟肽化合物、显影剂、抗炎剂、细胞因子和免疫球蛋白分子或它们的片段组成的组。

16.根据前述权利要求中任一项所述的适体，用于诊断患者中的黄病毒感染。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的适体，用于治疗。

18.一种免疫原性组合物或疫苗，包括根据权利要求1至15中任一项所述的适体。

19.一种组合物，包括根据权利要求1至15中任一项所述的适体和赋形剂或载体。

20.一种试剂盒，包括根据权利要求1至15中任一项所述的适体和载体。

21.一种用于诊断或检测患者的黄病毒感染的方法，所述方法包括：

(a)从患者获得生物样本；

(b)使所述生物样本与根据权利要求1至15中任一项所述的适体接触，

(c)检测所述适体与黄病毒结构性蛋白和/或黄病毒非结构性蛋白之间的结合复合物的形成，

其中所述结合复合物的存在指示出所述患者具有黄病毒感染。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物样本是血液样本、血清、血浆、唾液或尿液。

23.一种用于治疗患者的黄病毒感染或诱导对患者的黄病毒感染的免疫应答的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的根据权利要求18或19中任一项所述的组合物或疫苗给予所述患者。

24.根据权利要求1至15中任一项所述的适体用于治疗患者的黄病毒感染的用途。

25.根据权利要求1至15中任一项所述的适体或根据权利要求18所述的免疫原性组合物或疫苗或根据权利要求19所述的组合物在制造用于治疗或预防患者的黄病毒感染的药物中的用途。

26.根据权利要求1至15中任一项所述的适体或根据权利要求18所述的免疫原性组合物或疫苗或根据权利要求19所述的组合物，用于治疗或预防患者的黄病毒感染。