CN1247788C - 基于慢病毒的基因转移载体 - Google Patents

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Abstract

重组的慢病毒载体表达系统包括一个第一载体，所述第一载体包含至少部分马传染性贫血病病毒(EIAV)基因组的核酸序列。该载体在至少一个编码EIAV结构蛋白的基因中含有至少一个缺陷，但最好是gag/pol表达载体。该表达系统还包括一个第二载体，所述第二载体也包含一段至少部分马传染性贫血病病毒(EIAV)基因组的核酸序列，并且还含有其中可以插入异源基因的一个多克隆位点。该载体表达系统也包括一个第三载体，所述第三载体表达病毒包膜蛋白。所述第一和第三载体是包装信号缺陷的。当将该表达系统转染入慢病毒允许细胞中时，可能产生复制缺陷型EIAV颗粒，所述颗粒可用来将异源基因传递至范围广泛的分裂细胞和非分裂细胞。

Description

基于慢病毒的基因转移载体
                   相关申请
本申请要求于1997年5月13日申请的美国临时申请系列第60/046,891号的权益，该申请通过引用结合到本文中。
                   发明领域
本发明涉及作为可用于基因传递的载体的病毒，更具体地讲，涉及可用于将基因传递至非分裂细胞和分裂细胞的慢病毒载体。
                   发明背景
将特定的外源基因序列或天然基因序列引入哺乳动物细胞、并控制该基因表达的能力，在医学和生物学研究领域中具有重大的价值。这种能力提供用来研究基因调节和设计治疗疾病的治疗基础的手段。
将基因序列引入合适的核酸载体，有助于将特定的外源基因或天然基因引入哺乳动物宿主细胞中。已经开发了能够允许将这种重组载体引入所需宿主细胞的许多方法。与涉及DNA转化或转染的方法相比，使用病毒载体可以导致该重组分子快速引入种类繁多的宿主细胞中。特别是，已经使用病毒载体，以提高将重组核酸载体引入宿主细胞的效率。已经用作将外源基因转导入哺乳动物细胞中并在其中表达的载体的病毒，包括SV40病毒(参见例如H.Okayama等，Molec.CellBiol.5，1136-1142(1985))；牛乳头瘤病毒(参见例如D.DiMaio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，4030-4034(1982))；腺病毒(参见例如J.E.Morin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，4626(1987))；腺伴随病毒(AAV；参见例如N.Muzyczka等，J.Clin.Invest.94，1351(1994))；单纯疱疹病毒(参见例如A.I.Geller等，Science 241，1667(1988))和其它病毒。
基于反转录病毒的载体特别适于作为得到外源基因稳定的、整合的基因转移入哺乳动物细胞的工具。已经用作将外源基因引入哺乳动物细胞并使其在所述细胞中表达的载体的反转录病毒，包括莫洛尼鼠类肉瘤病毒(T.Curran等，J.Virol.，44，674-682(1982)；A.Gazit等，J.Virol.60，19-28(1986))和鼠类白血病病毒(MuLV；A.D.Miller，Curr.Top.Microbiol.Immunol.158，1-24(1992)。
许多细胞不能被上述病毒载体或反转录病毒载体感染，这已经阻碍了将重组分子引入哺乳动物细胞的努力。反转录病毒载体的限制例如包括相对有限的宿主范围，这部分基于用作病毒受体的膜蛋白的表达水平。M.P.Kavanaugh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7071-7075(1994)。其它限制包括不能整合入非分裂细胞(例如神经元、肝细胞、肌纤维、造血干细胞)、用目前的包装系统获得的载体效价中等、以及妨碍纯化和浓缩的载体颗粒的脆性。
慢病毒是一个亚组的反转录病毒，它们能够感染非分裂细胞。L.Naldini等报道了一个基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体系统，它能够将异源基因序列转导入非增殖海拉细胞和大鼠成纤维细胞，以及转转导入人类初级巨噬细胞和终末分化的神经元。Science272，263-267(1996)。然而，由于该载体重组为有毒力的致病形式的可能性，因此在人类中使用这种系统引起关于安全性的广泛关注。
因此，仍需要能够介导将基因转移入范围广泛的分裂细胞和非分裂细胞的安全有效的慢病毒载体系统。
                    发明概述
本发明涉及使用用于基因传递的马传染性贫血病痛毒(EIAV)衍生载体，将异源基因序列引入细胞。
本发明的第一个方面是重组的慢病毒载体表达系统，该系统包括一个第一载体，它包含至少部分马传染性贫血病病毒(EIAV)基因组的核酸序列，其中该载体(i)在至少一个编码EIAV结构蛋白的基因中含有至少一个缺陷，和(ii)含有一个缺陷的包装信号。该表达系统还包括一个第二载体，它包含一个至少部分EIAV基因组，优选地，EIAV基因的部分gag的核酸序列，其中该载体(i)含有一个活性包装信号，和(ii)含有可以插入异源基因的一个多克隆位点。该载体表达系统也包括一个第三载体，它包含一段病毒核酸序列，该序列优选地不是EIAV地核酸病毒序列，其中所述第三载体(i)表达病毒包膜蛋白，和(ii)含有一个缺陷的包装信号。
本发明的第二个方面是产生复制缺陷型慢病毒颗粒的方法，该方法包括用上述本发明的载体表达系统转染细胞。
本发明的第三个方面是将异源基因传递至靶细胞的方法，该方法包括用上述本发明的载体表达系统转染所述靶细胞。
本发明的第四个方面是产生慢病毒原种的方法，该方法包括(a)用上述本发明的载体表达系统转染生产细胞；(b)在足以允许在该细胞中产生复制缺陷型慢病毒颗粒的细胞培养条件下，培养所述生产细胞；且(c)从所述生产细胞收集复制缺陷型慢病毒颗粒。
在本文的附图中和下面提出的说明书中，详细解释本发明的前述方面和其它方面。
                    附图简述
图1是用来产生本发明的EIAV衍生载体的质粒构成物的图示说明。仅仅描述了每种质粒的一部分。
图2A是质粒pEV53的图示说明。
图2B是质粒pEV53A的图示说明。
图3是质粒pEC-lacZ的图示说明。
图4是质粒pEC-puro的图示说明。
图5是质粒pCI-VSV-G的图示说明。
图6A含有四个照片，说明MuLV(上面一行)和EIAV载体(下面一行)将基因转移至分裂细胞(左栏)和非分裂细胞(右栏)，如以下实施例3所述。
图6B图示说明基于MuLV的载体(直方图左手一对)和基于EIAV的载体(直方图右手一对)将基因转移至分裂细胞和非分裂细胞的比较效率。在该图的y轴上，以染成蓝色(即X-gal阳性)的感染细胞的百分率表示成功的基因转移，如下所述。
图6C图示说明在基于MuLV的基因转移载体感染的细胞中，蚜栖菌素阻断溴代脱氧尿苷(BrdU)掺入DNA的能力。在该图的y轴上，以BrdU阳性的感染细胞的百分率表示成功的基因转移，如以下实施例3中所述。
图7A和图7B说明基于EIAV的载体EC-lacZ感染并将基因转移至分裂细胞和非分裂细胞的能力。在图7A中，空心圆表示未用蚜栖菌素处理的人类CFT1细胞，而实心圆表示用蚜栖菌素处理的人类CFT1细胞。在图7B中，空心三角表示未用蚜栖菌素处理的马真皮细胞(dermal cell)，而实心三角表示用蚜栖菌素处理的马真皮细胞。在两个图中，在该图的y轴上，以X-gal阳性的感染细胞的百分率表示基因转移。在两个图中，在x轴上，以μl病毒/ml接种物为单位表示EC-lacZ载体的剂量。
图8是或者未浓缩的(未离心的)或浓缩的(离心的)EC-lacZ/VSV-G假型病毒颗粒感染性的剂量反应曲线。在图8中，空心圆表示浓缩的病毒颗粒，而实心圆表示未浓缩的病毒颗粒。在x轴上，以μl病毒/ml接种物为单位表示EC-lacZ载体的剂量，而在y轴上，以X-gal阳性细胞的百分率表示感染性。
                       发明详述
现在在下文中，参考附图更全面地描述本发明，在附图中显示本发明的优选实施方案。然而，以许多不同形式具体体现本发明，不应解释为本发明限于本文提出的实施方案。而是，提供这些实施方案，以便该说明书对本领域技术人员全面地传达本发明的范围。
I. 马传染性贫血病病毒基因组
马传染性贫血病痛毒(EIAV)是反转录病毒家族慢病毒属的一个成员。野生型EIAV病毒具有二聚的RNA基因组(单链，正极性)，该基因组包装入含有一个核蛋白核心的球形包膜病毒体中。通过反转录并整合入宿主细胞基因组中，发生野生型EIAV基因组的复制。该基因组含有编码结构蛋白gag、pol和env的三个基因和于整合型病毒基因组各端的长末端重复序列(LTR)。除gag、pol和env序列与所有反转录病毒相同外，EIAV基因组还含有几个短的可读框(ORF)。由多重剪接的mRNA翻译出这些短的ORF。ORF S1编码转录反式激活蛋白tat。ORF S2编码一种其功能未知的蛋白，而ORF S3看来编码rev蛋白。据认为，rev是gag、pol和env的有效表达所需的。rev通过与位于EIAV env基因中、称为rev-效应元件(RRE)的RNA序列相互作用，而在转录后起作用.
EIAV的野生型基因组也含有几个顺式作用序列，包括R序列(于该基因组各端的短的重复序列)；U5序列(紧接R序列后的特有的序列元件)；U3序列(位于所述结构蛋白下游的特有的序列元件)；启动子元件，它们控制整合的原病毒的转录起始；一个包装序列(本文可互换地称为包装位点或包装信号)；和一个5’剪接供体位点。
II. 本发明的EIAV载体
本发明的载体提供在系统发生范围广泛的宿主细胞中独立于宿主细胞核而复制和表达异源核酸的工具。这种载体介导的异源核酸掺入宿主细胞，称为该宿主细胞的转染或感染，其中感染是指使用病毒颗粒，而转染是指使用裸露的核酸分子。
本发明的载体还允许将异源核酸掺入病毒颗粒中，由此提供扩增其中含异源核酸的感染宿主细胞的数目。该异源核酸的掺入，有助于该异源核酸在病毒颗粒中的复制以及随后在其中产生异源蛋白。本文将异源蛋白定义为蛋白或其片段，其中该蛋白的全部或部分不由该宿主细胞表达。如果一种核酸或基因序列不是天然存在于用来将该基因传递入细胞中的野生型病毒载体(例如野生型EIAV基因组)，则认为该核酸或基因序列是异源的。本文所用的术语核酸序列或基因序列，是指核酸分子(最好是DNA)。这类基因序列可以得自多种来源，包括DNA、cDNA、合成DNA、RNA或其组合物。这类基因序列可以含有基因组DNA，该DNA可以包括或不包括天然存在的内含子。此外，这种基因组DNA可以结合启动子序列或多腺苷酸化序列而获得。本发明的基因序列最好是cDNA。基因组或cDNA可以以任何多种方法获得。可通过本领域熟知的方法，从合适的细胞提取和纯化基因组DNA。或者，可以从细胞分离mRNA，并用来通过反转录或其它方法制备cDNA。
本发明的一个目的是在将目的基因传递至靶细胞的方法中产生能够进行单轮复制的载体。该技术的一个方面是一种基因传递系统，它排除了将病毒基因转移至靶细胞。通过从编码目的基因的载体中物理分离编码病毒基因的表达载体，来完成这一步。将分离的表达载体转染入允许细胞(例如“生产细胞”)中。病毒基因的产物对于病毒颗粒的产生是必需的。然而，在本发明中，编码这些基因的基因位于含有缺陷包装信号的表达载体上；因此，编码结构蛋白的基因不包装。
本文所用的术语“结构蛋白”或“EIAV结构蛋白”是指EIAV基因组包衣壳(例如包装)需要的编码蛋白，包括gag、pol和env。
本文所用的术语“缺陷的”是指一种核酸序列，该序列在或者编码其基因产物、或者用作信号序列方面是没有功能的。为了说明，缺陷env基因序列将不编码env蛋白；一个缺陷包装信号将不促进该缺陷信号位于其上的核酸分子的包装。可以通过本领域已知的方法，将核酸序列制成缺陷的，所述方法包括缺失该序列的某些或全部、将该序列置于读框外、或者在其它情况下阻断该序列。
按照标准用法，本文所用的术语“缺失的”或“缺失”是指或者特定区段全部缺失或特定区段的足够部分缺失，以使得该区段为非操作性的或是非功能性的。本文所用的术语“复制缺陷型”，是指该载体转染后，编码EIAV结构蛋白的载体不能在靶细胞中包衣壳。所产生的慢病毒颗粒是复制缺陷的，因为包装的载体不包含包衣壳所需的所有病毒结构蛋白，至少其中一种所需的结构蛋白从中缺失，使得包装的载体不能复制完整的病毒基因组。
本发明的优选载体得自EIAV。可以从感染EIAV的细胞中分离天然的EIAV核酸，并从中制备载体。在S.T.Perry等，J.Virol.66，4085-4097(1992)中提供了制备EIAV载体的典型方法。例如，采用本领域已知的方法，用反转录酶，可以从EIAV RNA产生cDNA。然后可以产生双链EIAV cDNA，并将其克隆入克隆载体，诸如细菌克隆载体。可以使用任何克隆载体，诸如本领域技术人员已知并使用的细菌、酵母或真核载体。本发明的载体最好包含与至少部分EIAVRNA基因组互补的cDNA。一种载体可以含有异源cDNA分子，该分子可以引入人类或动物细胞中，以达到该异源分子的转录或表达。所述cDNA分子将包含与至少部分EIAV基因组互补、并包含复制该基因组所需的部分RNA基因组的cDNA，并且将该cDNA分子置于在该细胞中有功能的启动子序列的转录控制之下。
本发明的启动子序列可以包括真核或原核来源的启动子，它们将足以在细胞中指导远距离定位序列(即连接于该启动子序列5’端的序列)的转录。启动子区也可以包括增强或抑制转录的控制元件。合适的启动子是巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子(pRSV)和SP6、T3或T7启动子。该启动子上游的增强子序列或所述编码区下游的终止子序列可以可选地包含于本发明的载体中，以促进表达。本发明的载体也可以含有额外的核酸序列，诸如多腺苷酸化序列、定位序列或信号序列，足以允许细胞效率高地和有效地加工由该载体的核酸表达的蛋白。优选的多腺苷酸化序列的实例是SV40早期区多腺苷酸化位点(C.V.Hall等，J.Molec.App.Genet.2，101(1983))和SV40晚期区多腺苷酸化位点(S.Carswell和J.C.Alwine，Mol.Cell Biol.9，4248(1989))。将这类额外的序列插入该载体中，使得如果需要转录，将它们与启动子序列操作性地连接，或如果需要翻译和加工，还与起始序列和加工序列操作性地连接。或者，可以将插入的序列置于该载体中的任何位置。术语“操作性地连接”用来描述基因序列和启动子或其它调节或加工序列之间的连接，使得由操作性连接的启动子序列指导该基因的转录，由操作性地连接的翻译调节序列指导该基因序列的翻译，以及由操作性连接的加工序列指导该基因序列的翻译后加工。
用来构建本发明载体的标准技术是本领域技术人员熟知的，并且在诸如Sambrook等，分子克隆：实验室指南第二版(Cold SpringHarbor，NY，1989)的文献中发现这些技术。多种策略可用来连接DNA片段，所述策略的选择取决于所述DNA片段末端的性质，本领域技术人员可以容易地进行这些选择。
在本发明的一个实施方案中，重组慢病毒表达系统包括三种载体。第一载体包含至少部分马传染性贫血病病毒(EIAV)基因组的核酸序列，其中该载体(i)在至少一个编码EIAV结构蛋白的基因中含有至少一个缺陷，和(ii)含有一个缺陷的包装信号。第二载体包含至少部分EIAV基因组的一段核酸序列，其中该载体(i)含有一个活性包装信号，和(ii)含有一个可以插入异源基因的多克隆位点。第三载体包含一段病毒核酸序列，其中该载体(i)表达病毒包膜蛋白，和(ii)含有一个缺陷的包装信号。
在本发明的一个实施方案中，第一载体是gag/pol表达载体。gag/pol表达载体表达装配病毒颗粒并从细胞释放病毒颗粒所需的EIAV蛋白，包括编码蛋白gag和pol的基因。第一载体也可以表达编码辅助蛋白rev和tat的基因。编码功能未知的蛋白的可读框S2，可以另外包含于第一载体中。将第一载体构建成含有排除反转录病毒介导的转移病毒基因的突变。这类突变可以是病毒env基因中序列的缺失，由此排除产生有复制能力的EIAV的可能性；或可以缺失病毒反转录和整合所需的该基因组3’端某些顺式作用序列元件。因此，即使来自该构成物的病毒基因包装入病毒颗粒，它们也不复制，并且不产生有复制能力的野生型病毒。
在本发明的一个优选实施方案中，该表达系统的第一载体是质粒pEV53，示于图2A中。pEV53是一种12170个碱基对(bp)的质粒和cDNA克隆，它于碱基对209-1072含有一个嵌合CMV/EIAV增强子启动子区，该区位于EIAV tat编码区(bp 1124-1210和5886-6026)、gag编码区(bp 1216-2676)、pol编码区(bp 2433-5874)和ORF S2编码区(bp 6037-6234)的上游。该载体也含有一个部分env编码区(bp6063-7733)和rev编码区(bp 6188-6288和7250-7654)。提供牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号(bp 7759-7973)，也提供一个噬菌体f1区(bp8037-8450)、一个SV40早期启动子区和复制起点(bp 8514-8839)、一个新霉素抗性编码区(bp 9685-9924)、一个SV40多腺苷酸化信号(bp9685-9924)、一个Col E1复制起点(bp 10356-11029)和一个β-内酰胺酶(氨苄青霉素抗性)编码区(bp 11174-12035)。
在本发明的一个更优选的实施方案中，该表达系统的第一载体是质粒pEV53A，示于图2B中。质粒pEV53A衍生自pEV53质粒，其中进行了修饰，以进一步减少反转录病毒介导的病毒基因转移的机会，而不影响EIAV蛋白的表达水平。在质粒pEV53A中，已经从pEV53中缺失含有启动子/增强子元件和对于整合重要的顺式作用元件以及起始反转录的tRNA引物结合位点序列的所有EIAV长末端重复(LTR)序列。通过缺失pEV53的核苷酸902至1077，由pEV53构建pEV53A。
本发明表达系统的第二载体设计用作基因转移的载体，它含有支持反转录该载体基因组所需的所有顺式作用序列元件，也含有一个多克隆位点，用于插入编码目的异源基因的cDNA。在本发明中，编码目的基因的载体是重组EIAV衍生载体，它携带待转导入靶细胞的遗传信息、以及包装和整合该病毒基因组所需的顺式作用序列元件。该第二载体最好含有gag编码序列的某些部分，因为人们认为gag序列的某些部分在EIAV基因组的包装中起作用。此外，LTR中含有的5’剪接供体位点最好含有提高所产生病毒滴度的突变，如在例如W.Tan等，J.Virol.70，3645-3658(1996)中描述的。
图3和图4中提供了两个优选第二载体的实例。图3描述了质粒和cDNA克隆pEC-lacZ，这是一个8749bp的质粒，得自表达大肠杆菌1acZ报道基因的EIAV。该质粒含有两个CMV立即早期增强子启动子区(位于bp 1-734和bp 1609-2224)、来自EIAV长末端重复序列(LTR)的R-U5序列域(bp 735-849)、一个来自EIAV的部分gag序列(bp 993-1570)、lacZ编码序列(bp 2297-5437)、一个EIAV LTR序列(bp 5752-6073)、一个噬菌体f2区(bp 6163-6618)、一个氨苄青霉素抗性编码区(bp 7075-7917)和一个ColE1复制起点(bp 8062-8736)。
图4描述了质粒和cDNA克隆pEC-puro，这是一个6099bp的质粒，得自表达嘌呤霉素抗性基因的EIAV。该质粒含有两个CMV立即早期增强子启动子区(位于bp 1-734和bp 1609-2224)、来自EIAV长末端重复序列(LTR)的R-U5序列域(bp 735-849)、一个来自EIAV的部分gag序列(bp 993-1570)、嘌呤霉素抗性基因编码区(bp 2334-2933)、一个EIAV LTR序列(bp 3102-3423)、一个噬菌体f2区(bp3513-3968)、一个氨苄青霉素抗性编码区(bp 4407-5267)和一个ColE1复制起点(bp 5412-6086)。
正如本领域技术人员理解的，一种或多种所插入的异源基因序列的核苷酸序列可以是任何核苷酸序列。例如所插入的异源基因序列可以是一个报道基因序列或选择标记基因序列。本文所用的报道基因序列是任何基因序列，它在表达时，导致可以监测其存在或活性的蛋白的产生。合适的报道基因的实例包括半乳糖激酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-内酰胺酶等基因。或者，该报道基因序列可以是其表达产生的基因产物影响细胞生理的任何基因序列。本发明的异源基因序列可以包含已经具有一个或多个启动子、起始序列或加工序列的一种或多种基因序列。
选择标记基因序列是任何基因序列，所述基因序列能够表达其存在允许人们选择性繁殖含有其的细胞的蛋白。选择标记基因的实例包括能够赋予宿主对抗生素抗性的基因序列(例如嘌呤霉素、氨苄青霉素、四环素、卡那霉素等)、或赋予宿主对氨基酸类似物抗性、或允许细菌在其它碳源上生长或在其它不允许的培养条件下生长的基因序列。一段基因序列可以既是报道基因，又是选择标记基因序列。本发明最优选的报道基因是编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性的lacZ基因；和编码嘌呤霉素抗性的基因。
优选的报道基因序列或选择标记基因序列足以允许在正常细胞中识别或选择该载体。在本发明的一个实施方案中，该报道基因序列将编码一种酶或其它蛋白，它正常情况下不存在于哺乳动物细胞中，并且因此其存在可以明确地确定在这种细胞中该载体的存在。
异源基因序列也可以包含所需产物的编码序列，诸如合适生物活性的蛋白或多肽、免疫原性或抗原性蛋白或多肽、或治疗活性的蛋白或多肽。或者，所述异源基因序列可以包含与RNA序列互补的序列，诸如反义RNA序列，可以将该反义序列给予个体，以抑制互补多核苷酸在该个体细胞中的表达。
所述异源基因的表达可以提供免疫原性或抗原性蛋白或多肽，以得到抗体应答，所述抗体可以从动物的体液(诸如血液、血清或腹水)中收集。
在本发明的一个优选实施方案中，所述重组慢病毒表达系统的第三载体表达一种病毒包膜蛋白。这种载体因此包含一种在合适启动子控制下编码病毒蛋白的核酸序列。通过利用来自另一种密切相关的病毒的包膜蛋白，改变本发明病毒载体可以感染的细胞的宿主范围，这是可能的。换句话说，通过利用某些病毒的包膜蛋白参与其它病毒包衣壳的能力，扩大本发明EIAV载体的宿主范围是可能的。在本发明的特别优选的实施方案中，水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G；参见例如Rose和Gillione，J.Virol.39，519-528(1981)；Rose和Bergmann，Cell30，753-762(1982))或其片段或衍生物是由所述第三载体表达的包膜蛋白。VSV-G有效地形成具有其它病毒基因组和基质组分的假型病毒体。本文所用的术语“假型”是指含有一种病毒的核酸、但含有另一种病毒的包膜蛋白的病毒颗粒。一般而言，VSV-G假型载体具有非常广泛的宿主范围，可以通过超离心沉淀以获得高浓度的滴度(例如按照J.C.Burns等的方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，8033-8037(1993))，而仍保留高水平的感染性。
本发明第三载体的说明性和优选的实例示于图5中。该图描述了质粒和cDNA克隆pCI-VSV-G，这是用于包膜糖蛋白VSV-G的优选的表达载体。该质粒含有5679个碱基对，包含CMV立即早期增强子启动子区(bp 1-795)、一个嵌合内含子区(bp 857-989)、VSV-G编码区(bp 1088-2633)、一个噬菌体f1区(3093-3548)、一个SV40晚期多腺苷酸化信号(bp 2782-3003)、一个ColE1的DNA复制起点(bp4992-5666)和一个氨苄青霉素抗性编码区(bp 3987-4847)。
在本发明的一个方法中，按照本文公开的方法结合本领域技术人员已知的技术，可以制备传染性复制缺陷型EIAV颗粒。该方法包括用本发明的载体表达系统转染慢病毒允许细胞；在转染细胞中产生所述EIAV衍生颗粒；并且从细胞中收集所述病毒颗粒。可以按照本领域技术人员已知的任何合适的方法，进行转染慢病毒允许细胞的步骤。例如，在本发明的一个方法中，本文所述的第三质粒表达系统用来通过瞬时转染，产生EIAV衍生的反转录病毒载体颗粒。作为另一个实例，用任何合适的方法，可以完成将所述载体吸收入细胞，所述方法诸如通过用DEAE-葡聚糖处理细胞、在将所述RNA加入细胞之前用“LIPOFECTIN”处理所述RNA、或通过电穿孔。这些技术是本领域熟知的。
采用常规技术，诸如用标准细胞培养生长技术，也可以完成促进在细胞中产生传染性病毒颗粒的步骤。
也可以采用常规技术完成收集所述传染性病毒颗粒的步骤。例如，如本领域已知的，通过细胞裂解、或收集细胞培养物的上清液，可以收集所述传染性颗粒。可选的是，需要时，可以纯化所收集的病毒颗粒。合适的纯化技术是本领域技术人员熟知的。
如果本领域技术人员需要，采用本发明的载体和方法可以制备慢病毒原种溶液。制备病毒原种溶液的方法是本领域已知的，并由例如Y.Soneoka等，Nucl.Acids Res.23，628-633(1995)和N.R.Landau等，J.Virol.66，5110-5113(1992)描述。在本发明的产生原种溶液的方法中，用本发明的载体系统转染慢病毒允许细胞(本文称为生产细胞)。然后在合适的细胞培养条件下培养所述细胞，然后如上所述，或者从细胞本身，或者从细胞培养基中，收集慢病毒颗粒。合适的生产细胞系包括但不限于人类胚肾细胞系293、马真皮细胞系NBL-6和犬胎胸腺细胞系Cf2TH。
本发明的载体也可用来制备稳定的包装细胞(即稳定表达EIAV病毒蛋白的细胞，所述细胞本身不能产生传染性病毒颗粒)。制备表达反转录病毒蛋白的包装细胞的方法是本领域已知的，例如为在例如Temin等的美国专利第4,650,764号中提出的方法，该专利通过引用结合到本文中。在本发明范围内，包装细胞将包括慢病毒允许宿主细胞，该细胞包含一段编码至少一个EIAV结构蛋白的EIAV核酸序列，该核酸序列是包装信号缺陷的，因此使得该细胞本身能够产生至少一种EIAV结构蛋白，但不能产生有复制能力的传染性病毒。在一个实施方案中，所述EIAV核酸序列是EIAV gag-pol表达载体，诸如pEV53。通过用按照已知方法提供的合适EIAV核酸序列转染EIAV允许宿主细胞(例如人类胎肾293细胞)，可以制备包装细胞。所产生的包装细胞因此能够表达并产生至少一种EIAV结构蛋白。然而，因为该EIAV核酸序列的包装信号是缺陷的，所以该细胞自身不能产生有复制能力的EIAV病毒。然后，可以用其它核酸序列(例如pEC-puro、pEC-laeZ或pCI-VSV-G)转染所述包装细胞，所述其它核酸序列可以含有目的异源基因和一个正确的包装信号。一旦用一种或多种其它序列转染，则该包装细胞因此可以用来提供EIAV病毒的原种，所述原种含有异源基因，但所述病毒本身是无复制能力的。
本发明的药用制剂(诸如疫苗)包含免疫原性量的本文公开的传染性复制缺陷型病毒颗粒结合药用可接受的载体。“免疫原性量”是传染性病毒颗粒足以在给予该药用制剂的受治疗者中引起免疫应答的量。每一剂量大约103至107病毒颗粒、最好是大约104至106病毒颗粒的量，相信是合适的，这取决于待治疗的受治疗者的年龄和物种、以及需要针对其的免疫应答的免疫原。典型的药用可接受的载体包括但不限于无菌无致热原的水和无菌无致热原的生理盐水溶液。可以给予免疫原性量的本发明的传染性复制缺陷型病毒颗粒的受治疗者，包括但不限于人类和动物(例如猪、牛、狗、马、驴、小鼠、仓鼠、猴)受治疗者。
本发明的药用制剂包括适用于胃肠外(例如皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)、经口或吸入给药的药用制剂。或者，本发明的药用制剂可以适于给予受治疗者的粘膜(例如鼻内给药)。所述制剂可以方便地以单位剂量形式制备，可以通过本领域已知的任何方法制备。
本发明的载体和方法可用于体外表达系统，其中位于第二载体的插入的异源基因编码最好在体外生产的蛋白或肽。
本发明的载体、方法和药用制剂还可用于将蛋白或肽给予需要所需蛋白或肽的受治疗者的方法，作为治疗方法或其它方法。在本发明的该实施方案中，位于本发明第二载体上的异源基因编码所需蛋白或肽，并且将辅助细胞或本发明含有辅助细胞的药用制剂给予需要所需蛋白或肽的受治疗者。以该方式，所述蛋白或肽因此可以在受治疗者体内产生。所述受治疗者可能需要该蛋白或肽，因为该受治疗者缺乏该蛋白或肽，或因为在该受治疗者中该蛋白或肽的产生可能赋予某些治疗效应，这作为治疗方法或其它方法，如下文进一步解释的。
III. 基因转移技术
本发明的基因转移技术具有几个应用。最直接的应用也许是阐明肽的加工和蛋白的功能域。可以将克隆的蛋白的cDNA或基因组序列引入培养中的不同细胞类型中，或引入体内，以便研究加工和细胞命运的细胞特异性差异。通过将所述编码序列置于强启动子控制之下，可以制备大量的所需蛋白。此外，通过在所述编码序列的单独的残基中进行突变改变，可以确定参与蛋白加工、胞内分选或生物活性的特定残基。
本发明的基因转移技术也可以用来提供控制蛋白表达和评估其调节细胞事件的能力的工具。可以在组织培养物中研完蛋白的某些功能，诸如其在分化中的作用，而其它将需要于不同发育时间再引入体内系统中，以便监测相关特性的变化。
基因转移提供了研究调节特定基因表达的核酸序列和细胞因子的手段。这种研究的一个方法是将该研究的调节元件与报道基因融合，随后分析该报道基因的表达。
基因转移在理解并提供对疾病状态的疗法方面，也具有相当有潜力的用途。有许多遗传病的缺陷基因是已知的并已被克隆。在某些情况下，这些克隆基因的功能是已知的。一般而言，上述疾病分为两类：缺陷状态，通常是酶缺陷，这一般以隐性方式遗传；不平衡状态，至少有时涉及调节蛋白或结构蛋白，这以显性方式遗传。对于缺陷状态的疾病，基因转移可以用来将正常基因引入受影响的组织，以进行替代疗法，以及用反义突变产生该疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可以用来在模型系统中产生疾病状态，然后可以将其用来努力对抗该疾病状态。因此，本发明的方法允许治疗遗传病。如文所用的，通过部分或全面治疗引起该疾病或使得该疾病更严重的缺陷或不平衡，治疗该疾病状态。利用核酸序列的定点整合来引起突变或更正缺陷也是可能的。
造血干细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、呼吸上皮细胞、胶质细胞、骨骼肌细胞和心肌(muscle cardiac)细胞、神经元和癌细胞是其中提出的用于或者体外或者体内治疗性基因转移的靶。参见例如A.D.Miller，Nature 357，455-460(1992)；R.C.Mulligan，Science 260，926-932(1993)。这些细胞和其它细胞是适用于本发明载体和方法的靶细胞。
总之，本发明的病毒载体可以用来稳定地转染或者分裂细胞或者非分裂细胞，并且稳定地表达异源基因。使用该载体系统，现在可能将基因引入分裂细胞或非分裂细胞，所述基因编码可以影响所述细胞生理的蛋白。本发明的载体因此可用于疾病状态的基因疗法，或用于细胞生理学的实验改进。
现在已经描述了本发明，参考某些实施例说明本发明，包括这些实施例仅仅为了说明，不会限制本发明。
                       实施例1
                       质粒的构建
本文描述的EIAV载体的亲代质粒是质粒pER2.1，由北卡罗来钠州立大学(Raleigh，North Carolina，USA)的Fred Fuller博士慷慨提供。在S.T.Perry等，J.Virol.66，4085-4097(1992)中描述了克隆pER2.1的构建。pER2.1编码EIAV Malmquist Wyoming毒株的传染性DNA克隆。该克隆的一个安全方面是：产生的该病毒在其天然马宿主中不致病。此外，与得自考虑用于基因转移的其它反转录病毒(例如鼠类白血病病毒、人免疫缺陷病毒)的载体不同，野生型EIAV在人类细胞中不确立活性感染。
EIAV gag/pol(第一)表达载体。设计pEV53质粒(示于图2A)，以表达装配病毒颗粒并从细胞释放病毒颗粒所需的EIAV蛋白，包括编码由gag和pol基因表达的蛋白的基因和编码辅助蛋白rev和tat的基因。也包括可读框S2，它编码其功能未知的蛋白。构建pEV53，使其含有阻止反转录病毒介导的病毒基因转移的突变。所述突变包括在病毒env基因中的序列缺失(由此排除产生有复制能力的EIAV病毒颗粒的可能性)和病毒反转录和整合所需的该基因组3’端的某些顺式作用序列元件的缺失。包括缺失，使得在不可能的事件中，病毒基因包装入传染性颗粒，但它们不复制(例如将不产生有复制能力的野生型载体)。示于图2B的质粒pEV53A得自pEV53，但不同于pEV53，因为通过去除pEV53的核苷酸902至1077，已经缺失了含有启动子/增强子元件和对整合重要的顺式作用序列元件、以及起始反转录的tRNA引物结合位点序列的所有的EIAV长末端重复序列(LTR)。制备pEV53A，以进一步减少反转录病毒介导的病毒基因转移的机会，而不影响EIAV蛋白的表达水平。
基因转移(第二)载体。设计pEC-lacZ(示于图3)和pEC-puro(示于图4)质粒，以用作基因转移的载体，它们含有支持该载体基因组反转录(例如复制)的所有顺式作用序列元件以及用于插入目的cDNA编码基因的一个多克隆位点。pEC-lacZ质粒编码β-半乳糖苷酶报道基因lacZ，而pEC-puro质粒编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶显性选择标记基因puro。
病毒包膜基因表达(第三)载体。本文描述的表达系统的第三质粒是质粒pCI-VSV-G，示于图5。该质粒表达一个病毒包膜基因，具体地说是水泡性口膜炎病毒G糖蛋白基因。
                       实施例2
                  病毒载体的产生和测试
按照标准磷酸钙介导的共转染法，将pEC53A gag-pol表达质粒、pCI-VSV-G env表达质粒以及或者pEC-lacZ或者pEC-puro表达载体质粒共转染入人293细胞培养物(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，产生EIAV载体。转染后48小时，从细胞收集培养基，并测试EIAV载体的产生。根据该载体的连续稀释液赋予药物嘌呤霉素抗性的能力，测试pEC-puro载体的基因转移效率。在该测定中，感染的细胞产生抗药性细胞集落，然后对其计数。人293细胞用作靶细胞。从6个独立的实验中，确定Ec-puro载体的平均滴度为2±1×1O5集落形成单位(cfu)/ml。
通过用半乳糖的类似物X-gal(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon)将感染的人CFT1人气道上皮细胞染色，测定EC-lacZ载体的基因转移效率。在该测定中，表达β-半乳糖苷酶基因的细胞将变为蓝色，通过计数确定蓝色细胞的百分率。将染色细胞的分数乘以原始感染的细胞数，得到病毒的滴度。以该方式，确定EC-lacZ病毒的滴度为5±1×104感染单位(n＝5)/ml。
进行几个对照实验，以确定是否实际上由病毒组分介导puro和lacZ基因的表达。在第一个实验中，EC-puro和EC-lacZ载体均显示出，pEV53或pEV53A和pCI-VSS-G载体对于基因转移是必需的。该结果与病毒(而不是游离的DNA)介导的基因转移和表达相一致。在采用lacZ载体的第二个对照实验中，在2小时感染后立即用X-gal将细胞染色，发现没有蓝色细胞。该结果与反转录、整合和基因表达的瞬时方面相一致，这对于其它反转录病毒而言，已知需要最少大约10小时来完成反转录、整合和基因表达。
                       实施例3
                 基因转移至非分裂细胞
EIAV能够感染非分裂细胞、终末分化的细胞，诸如巨噬细胞和气道上皮细胞。为了用本发明测试这种特性，用蚜栖菌素(Calbiochem-Novabiochem Corp.，La Jolla，California)使人CFT1气道上皮细胞(由Chapel Hill的北卡罗来钠州立大学的J.R.Yankaskas慷慨提供)静息于细胞周期中，然后用pEC-lacZ载体感染。作为对照，用LZ载体平行感染细胞，LZ载体是衍生自鼠类白血病病毒(MuLV)的含lacZ的反转录病毒载体。感染后48小时，用X-gal将培养物染色，以测试β-半乳糖苷酶活性。在蚜栖菌素处理的培养物中，在感染期间和感染后均存在蚜栖菌素。
图6A显示染色细胞的显微镜视野。LZ载体有效感染未用蚜栖菌素处理的细胞(上面左边一板)。然而，当通过蚜栖菌素处理使细胞静息于细胞周期时，基因转移效率显著下降(上面右边一板)。通过计数稀少的染成蓝色的细胞来估计，对于LZ载体，基因转移至分裂细胞与转移至非分裂细胞的相对效率为大约100∶1(如图6B所示，左边一对直方图)。结果与其它实验室的实验中获得的结果相一致。参见例如D.G.Miller等，Mol.Cell.Biol.10，4329-4343(1990)；P.F.Lewis和M.Emerman，J.Virol.，68，510-516(1994)。感染时，平行培养物用溴代脱氧尿苷(BrdU)脉冲处理2小时，以测试蚜栖菌素阻断的效率，并分析DNA中BrdU的掺入，如图6C所示。我们发现：蚜栖菌素显著降低DNA中BrdU的掺入。
与用LZ载体获得的结果相反，蚜栖菌素处理对EC-lacZ载体感染的人CFT1细胞的百分率没有显著的影响(参见图6A下面两板中的结果和图6B右边一对直方图的结果)。这些结果表明，EIAV载体可以有效地感染非分裂细胞。例如，在图7所示的实验中，与未用蚜栖菌素处理的细胞相比，当细胞用蚜栖菌素处理时，马真皮成纤维细胞细胞系NBL-6被感染的容易性高大约10倍(对于给定量的病毒)。
                    实施例4
              VSV-G假型EIAV载体的超离心
VSV-G假型载体的一个优点是，VSV-G提供的稳定性的提高允许通过在超离心机中沉淀来浓缩感染性(参见例如J.C.Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，8033-8037(1993))。我们确定：通过使用离心技术沉淀，也可以回收VSV-G假型EIAV载体的感染性。在该实验中，通过在高速离心机中沉淀病毒，浓缩720ml来自双质粒(pEC-lacZ/pCI-VSV-G)共转染293细胞(经稳定修饰，以表达pEV53质粒)的含EC-lacZ的上清液。将沉淀悬浮于0.36ml 1×Hank平衡盐溶液(HBSS，Cat.#14175，Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)，以得到2000倍浓缩的病毒颗粒。测定感染性(参见图8的感染性剂量反应曲线)，并且发现滴度从5×105至6×108增加约1200倍。因此，感染性的收率为大约60％。该结果说明，通过沉淀，可以将EIAV载体浓缩至高滴度。
                    实施例5
                    包装细胞系
对于稳定的包装细胞，采用标准钙转染方法，用pEV53转染人胚肾细胞系293。用G418(遗传霉素)(Life Technologies Inc.，Gaitherburg Mryland，USA)选择表达新霉素的细胞。用pECpuro和pCI-VSV-G转染后，选择单个菌落，扩增并测试病毒的产生。将表现出最大载体产生的克隆包装细胞系或者冷冻用于长期贮存，或者在培养物中保持，以分析包装功能的持久性。我们发现，包装功能稳定至少一个月，表明本发明在制备稳定的基于EIAV的包装细胞系方面是有用的和成功的。
尽管已经结合具体实施方案描述了本发明，但应该理解，本发明能够进一步改进，本申请将包括一般按照本发明原理的本发明的任何变化、应用或适应性变化，包括偏离本说明书的这类变化，这些是本领域已知的或为常规实践，它们可以适用于所附权利要求书提出的基本特性。

Claims (25)

1.重组慢病毒载体表达系统，它包含：
(a)第一载体，它包含编码马传染性贫血病病毒EIAV的gag和EIAV pol的核酸序列，其中所述载体(i)在至少一个编码EIAV结构蛋白的基因中含有至少一个缺陷，和(ii)含有一个缺陷的包装信号；
(b)第二载体，它包含一个EIAV的部分gag核酸序列，其中所述载体(i)含有一个活性包装信号，和(ii)含有一个其中能插入异源基因的多克隆位点；和
(c)第三载体，它包含一段不是EIAV的病毒的核酸序列，其中所述第三载体(i)表达病毒包膜蛋白，和(ii)含有一个缺陷的包装信号。
2.按照权利要求1的载体表达系统，其中所述第一载体含有一个env基因的缺陷。
3.按照权利要求2的载体表达系统，其中env基因的所述缺陷是缺失突变。
4.按照权利要求1的载体表达系统，其中所述第三载体表达水泡性口膜炎病毒G糖蛋白。
5.按照权利要求1的载体表达系统，其中所述第二载体含有一个异源基因。
6.按照权利要求5的载体表达系统，其中所述异源基因编码一种抗原性蛋白或肽。
7.一种质粒，它选自：
(i)图2A中提出为pEV53的质粒；
(ii)图2B中提出为pEV53A的质粒；
(iii)图3中提出为pEC-lacZ的质粒；和
(iv)图4中提出为pEc-puro的质粒。
8.按照权利要求1的载体表达系统，其中所述第一载体选自权利要求7的组(i)和(ii)；所述第二载体选自权利要求7的组(iii)和(iv)；而所述第三载体为图5中提出为pCl-VSV-G的质粒。
9.体外产生复制缺陷型慢病毒颗粒的方法，所述方法包括用依照权利要求1的重组慢病毒载体表达系统转染细胞。
10.按照权利要求9的方法，其中所述细胞为非分裂细胞。
11.按照权利要求9的方法，其中所述第二载体含有一种异源基因。
12.按照权利要求9-11中任一项的方法产生的复制缺陷型慢病毒颗粒。
13.含有复制缺陷型慢病毒颗粒的细胞，其中按照权利要求9的方法产生所述慢病毒颗粒。
14.将异源基因体外传递至靶细胞的方法，所述方法包括用依照权利要求5的重组慢病毒载体表达系统转染所述靶细胞。
15.按照权利要求14的方法，其中所述靶细胞为非分裂细胞。
16.体外产生慢病毒原种的方法，所述方法包括：
(a)用依照权利要求1的重组慢病毒载体表达系统转染慢病毒允许生产细胞，其中所述第二载体包含一个异源基因；
(b)在足以允许在所述细胞中产生复制缺陷型慢病毒颗粒的细胞培养条件下，培养所述生产细胞；且
(c)从所述生产细胞收集所述复制缺陷型慢病毒颗粒。
17.按照权利要求15的方法，其中在细胞培养基中培养所述生产细胞，并且从所述培养基中收集所述复制缺陷型慢病毒颗粒。
18.将异源基因体外传递至靶细胞的方法，所述方法包括用按照权利要求16的步骤(c)收集的复制缺陷型慢病毒颗粒，感染所述靶细胞。
19.按照权利要求16的步骤(c)收集的复制缺陷型慢病毒颗粒，它用作药物。
20.按照权利要求18的方法，其中所述靶细胞是非分裂细胞。
21.按照权利要求18的方法，其中所述靶细胞是人气道上皮细胞。
22.将异源基因体外传递至靶细胞的方法，所述方法包括用按照权利要求12的慢病毒颗粒感染所述靶细胞。
23.按照权利要求12的慢病毒颗粒，它用作药物。
24.药用制剂，它包含药学上可接受的载体中的按照权利要求12的复制缺陷型慢病毒颗粒。
25.包括慢病毒允许宿主细胞的包装细胞，所述包装细胞含有权利要求1的重组慢病毒载体表达系统。
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