JP2020506695A - 糖原病を処置するための組換えウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2017年1月30日に出願された米国仮出願第62/451,963号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
本明細書では、ヒトグルコース−6−ホスファターゼ(G6PC)プロモーター/エンハンサー(GPE)配列、またはミニマルグルコース−6−リン酸トランスポーター(G6PT)プロモーター/エンハンサー(miGT)配列のいずれかに作動可能に連結した、ヒトG6PTコード配列を含む組換え核酸分子が提供される。
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R. 1.822で定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、およびアミノ酸の3文字コードを使用して示されている。各核酸配列の1本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖への言及によって包含されていると理解されたい。配列表は、1月22日に作成された18.0KBのASCIIテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表:
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー(GPE)−ヌクレオチド182〜3045
イントロン−ヌクレオチド3185〜3321
G6PTコード配列−ヌクレオチド3366〜4655
ITR−ヌクレオチド4868〜5003。
ITR−ヌクレオチド17〜163
miGT−ヌクレオチド182〜792
イントロン−ヌクレオチド924〜1560
G6PTコード配列−ヌクレオチド1105〜1938
ITR−ヌクレオチド2171〜2316。
I.略称
別段の記載がない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Pressにより出版、1994年(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.により出版、1994年(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.により出版、1995年(ISBN 1−56081−569−8)において見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される:
GSD−Ib(G6pt−/−)マウスは、ヒトGSD−Ibに特徴的な代謝機能障害と骨髄機能障害の両方を示す(Chenら、Hum Mol Genet、12巻:2547〜2558頁、2003年)。処置せずに放置すると、G6pt−/−マウスは離乳を生き延びることもめったになく、ヒト患者に見られる年少の致死性を反映する。これまで研究では、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーター/CMVエンハンサーによって指示されてヒトG6PTを発現する偽型AAV2/8ベクターの全身投与が、G6PT導入遺伝子を主に肝臓に送達することが示されている。そうすることで、マウスのGSD−Ibの代謝異常を正常化する。しかしながら、51〜72週間生存した5匹の処置したG6pt−/−マウスのうち、2匹(40%)が多発性HCAを発症し、1匹は悪性転換を経た(Yiuら、J Hepatol、51巻:909〜917頁、2009年)。
本明細書では、糖原病、特にGSD−Ibの処置のための遺伝子治療適用に使用することができる、組換え核酸分子、AAVおよびレンチウイルスベクターなどの組換えベクター、ならびに組換えAAVおよび組換えレンチウイルスなどの組換えウイルスが記載されている。
AAVは、Parvoviridae科およびDependovirus属に属している。AAVは、直線状の一本鎖DNAゲノムをパッケージ化した、エンベロープを持たない小型ウイルスである。AAVのDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が、同じ頻度でAAVカプシドにパッケージされている。
レンチウイルスは、長いインキュベーション期間および非分裂細胞に感染する能力によって特徴付けられるレトロウイルスの属である。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子gag、pol、およびenvに加えて、調節機能または構造機能を持つ他の遺伝子を含有する。複雑さが増しているため、潜伏感染の過程におけるように、ウイルスはそのライフサイクルを調整することができる。レンチウイルスの例には、HIV、SIV、FIV、SIV、BIV、CAEV、およびEIAVが含まれる。
5’LTRには、ゲノムの逆転写(tRNAプライマー結合部位)およびウイルスRNAの粒子への効率的カプシド形成(Psi部位)に必要な配列が隣接している。カプシド形成(またはレトロウイルスRNAの感染性ビリオンへのパッケージング)に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、cis欠陥はゲノムRNAのカプシド形成を妨げる。しかしながら、得られた変異体は依然として全てのビリオンタンパク質の合成を指示することができる。
多数の種々のレンチウイルスベクター、パッケージング細胞株、およびレンチウイルス遺伝子治療用ベクターを生成する方法は、当技術分野で公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、EscorsおよびBreckpot、Arch Immunol Ther Exp、58巻(2号):107〜119頁、2010年;Naldiniら、Science、272巻:263〜267頁、1996年;Naldiniら、Proc Natl Acad Sci USA、93巻:11382〜11388頁、1996年;Naldiniら、Curr Opin Biotechnol、9巻:457〜463頁、1998年;Zuffereyら、Nat Biotechnol、15巻:871〜875頁、1997年;Dullら、J Virol、72巻:8463〜8471頁、1998年;Ramezaniら、Mol Ther、2巻:458〜469頁、2000年;ならびに米国特許第5,994,136号、同第6,013,516号、同第6,165,782号、同第6,207,455号、同第6,218,181号、同第6,218,186号、同第6,277,633号、同第7,901,671号、同第8,551,773号、同第8,709,799号、および同第8,748,169号を参照されたい)。したがって、当業者は、本明細書に開示される組換え核酸分子に適したレンチウイルスベクターを選択することができる。
この実施例は、実施例2に記載される研究のための材料および実験手順を記載する。
2.8kbのヒトG6PCプロモーター/エンハンサーの制御下のヒトG6PTを含有するpTR−GPE−G6PTプラスミドは、pTR−GPE−G6PC(Yiuら、Mol Ther、18巻:1076〜1084頁、2010年)中の5’のSbfIと3’のNotI部位でのヒトG6PCを、5’のNsiIと3’のNotI部位でのヒトG6PTのcDNAで置き換えることによって構築した。ヒトG6PTミニマルプロモーター/エンハンサーの制御下のヒトG6PTを含有するpTR−miGT−G6PTプラスミドは、pTR−GPE−G6PT中の5’のKpnIと3’のHindIII部位でのGPEを、5’のKpnIと3’のHindIII部位でのmiGTで置き換えることによって構築した。両方のプラスミドはDNAシーケンシングによって検証した。rAAV−GPE−G6PTおよびrAAV−miGT−G6PTベクターは、それぞれ、pTR−GPE−G6PCおよびpTR−miGT−G6PTから作製した。遺伝子治療では、各ベクターをG6pt−/−マウスに2回用量で、新生仔では側頭静脈から、4週齢では後眼窩洞(retro−orbital sinus)から投与した。区別できない表現型を持つ年齢を合わせたG6pt+/+/G6pt+/−マウスを対照として使用した(まとめて野生型または対照マウスと呼ぶ)。
ミクロソーム調製物、G6P取り込み、およびホスホヒドロラーゼ測定は、これまでに記載された(Chenら、Hum Mol Genet、12巻:2547〜2558頁、2003年;Leiら、Nat Genet、13巻:203〜209頁、1996年)ように実施した。G6P取り込みアッセイでは、肝臓から分離されたミクロソームを、50mMのカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH6.5、250mMのスクロース、および0.2mMの[U−14C]G6P(50μCi/μmol、American Radiolabeled Chemicals、St Louis、MO)を含有する反応混合物(100μl)中、30℃で3分間インキュベートした。ニトロセルロース膜(Millipore、Billerica、MA)を通して濾過することにより、反応を停止した。G6Pの取り込みを無効にするために0.2%デオキシコレートで透過処理したミクロソームを、陰性対照として使用した。G6PT活性の1単位は、ミクロソームタンパク質1mgあたり1分あたり1pmolのG6Pの取り込みを表す。
ヘパリン化マウス末梢血細胞は、赤血球を枯渇させ、Lysis/Fix緩衝液(BD Biosciences、San Jose、CA)で固定した。得られた白血球をFITCコンジュゲートマウスモノクローナルGr−1抗体(eBiosciences、San Diego、CA)およびPEコンジュゲートCD11b抗体(eBiosciences)で染色し、Guava EasyCyte Mini System(Millipore)を使用してフローサイトメトリーにより分析した。
Bruker minispec NMRアナライザー(Karlsruhe、Germany)を使用して、体組成を評価した。マウスのHCA結節の存在は、肝臓ごとに5つまたはそれよりも多い、別々の切片を使用して、肝生検試料の組織学的分析によって確認した。グルコース、コレステロール、トリグリセリド、乳酸塩、および尿酸塩の血中レベルと、グルコース、トリグリセリド、乳酸塩、およびG6Pの肝臓のレベルを、これまでに記載された(Leeら、Hepatology、56巻:1719〜1729頁、2012年;Kimら、Hum Mol Genet、24巻:5115〜5125頁、2015年)ように、決定した。
mRNA発現は、Applied Biosystems TaqManプローブ(Foster City、CA)を使用したApplied Biosystems 7300リアルタイムPCRシステムでのリアルタイムRT−PCRにより定量化した。データはRpl19のRNAに対して正規化した。ウエスタンブロット画像は、LI−COR OdysseyスキャナーとImage studio 3.1ソフトウェア(Li−Cor Biosciences、Lincoln、NE)を使用して検出した。使用されたマウスモノクローナル抗体は、β−アクチン(Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX)であった。使用されたウサギモノクローナル抗体は、p−Akt−S473およびp−Akt−T308(Cell Signaling、Danvers、MA);ならびにFGF21(Abcam、Cambridge、MA)であった。使用されたウサギポリクローナル抗体は、ChREBP(Novus biologicals、Littleton、CO);Akt、ACC、およびSCD−1(Cell Signaling);ならびにFASN(Abcam)であった。ImageJ 1.51aソフトウェア(NIH、Bethesda、MD)を使用したデンシトメトリーによりタンパク質発現を定量化した。
マウスの肝臓切片でのChREBP核局在化は、これまでに記載された(Kimら、Hum Mol Genet、24巻:5115〜5125頁、2015年)ように、実施した。マウス肝臓パラフィン切片(厚さ10μm)をメタノール中の0.3%過酸化水素で処理して内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、次いでアビジン/ビオチンブロッキングキット(Vector Laboratories、Burlingame、CA)でブロッキングした。ChREBP検出のために、肝臓切片を、逐次的に、ChREBPに対するウサギ抗体とビオチン化抗ウサギIgG(Vector Laboratories)とでインキュベートした。得られた複合体は、DAB基質(Vector Laboratories)を使用したABCキットで検出した。切片をヘマトキシリン(Sigma−Aldrich)で対比染色し、40倍/0.50NA対物レンズ(Carl Zeiss MicroImaging、Jena、Germany)を備えたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡を使用して視覚化した。Nikon DS−FilデジタルカメラとNIS−Elements F3.0イメージングソフトウェア(株式会社ニコン、東京、日本)を使用して画像を取得した。ChREBP陽性核を含有する、10のランダムに選択された視野における細胞の百分率を記録した。
対応のないt検定は、GraphPad Prism Programバージョン4(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して実行した。値は、p<0.05で統計学的に有意とみなした。
この実施例では、G6PCまたはG6PTプロモーター/エンハンサーのいずれかによって指示される組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを使用して、G6pt−/−マウスにおけるG6PT遺伝子治療の有効性を調べる研究について記載する。両方のベクターがマウスGSD−Ibの肝臓のG6PT欠損を修正したが、G6PCプロモーター/エンハンサーがより有効であった。rAAV構築物の用量滴定を使用した78週間にわたる研究で、正常な肝臓のG6PT活性の3〜62%を発現するG6pt−/−マウスは、正常化された肝臓表現型を示した。正常な肝臓のG6PT活性の6%未満を発現する12匹のマウスのうち2匹がHCAを発症した。全ての処置したマウスは、野生型マウスよりも痩せており、インスリンに対してより感受性であった。正常な肝臓のG6PT活性の3〜22%を発現するマウスは、44〜62%を発現するマウスよりも高いインスリン感受性を示した。インスリン感受性のレベルは、肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質シグナル伝達活性化の大きさと相関していた。これらの研究は、腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のG6PT活性の閾値を確立し、正常な肝臓のG6PT活性の3〜62%を発現するマウスがグルコース恒常性を維持し、加齢に伴う肥満症とインスリン抵抗性から保護されることを示した。
GSD−Ibマウスは頻繁に低血糖発作に苦しみ、低血糖症を制御するためのグルコース療法にもかかわらず、離乳後に生存するマウスは10%未満である(Chenら、Hum Mol Genet、12巻:2547〜2558頁、2003年)。遺伝子治療の場合、各ベクターをG6pt−/−マウスに新生仔に1回と4週齢に1回との2回用量で投与し、早期治療を提供することと、肝臓質量の発達的増加を可能にすることの両方を行った。最初に、2つのG6PT発現ベクター:2.8kbのG6PCプロモーター/エンハンサー(Yiuら、Mol Ther、18巻:1076〜1084頁、2010年;Leeら、Mol Genet Metab、110巻:275〜280頁、2013年)によって指示される一本鎖ベクターである、rAAV−GPE−G6PTと、類似の1.62kbのG6PTプロモーター/エンハンサーによって指示される一本鎖G6PT発現ベクターである、rAAV−GT−G6PTを調べた。rAAV−GPE−G6PTで観察された有効性とは対照的に(後述)、rAAV−GT−G6PT注入はG6pt−/−マウスの生存を維持できず、注入された40匹のG6pt−/−マウスのうち4匹のみが12週齢まで生存した。さらなるプロモーター解析に続いて、代替のG6PTプロモーター、610bpのG6PTプロモーター/エンハンサーによって指示されるrAAV−miGT−G6PTが含まれる別のG6PT発現ベクターを構築し、AAVウイルスの適切なパッケージングを確保するための二本鎖ベクターが得られた。このベクター構築物は、律速である、形質導入中の一本鎖ベクターゲノムから二本鎖ベクターゲノムへの変換を迂回することから生じる(Fisherら、J Virol、70巻:520〜532頁、1996年)、増大した形質導入効率からも恩恵を受けることも予想されていた(McCarty、Mol Ther、16巻、1648〜1656頁、2008年)。予備実験は、rAAV−GPE−G6PTベクターもまた、rAAV−miGT−G6PTベクターよりも有効であることを示した。したがって、この研究では、G6pt−/−マウスに投与される2つのベクターの投与量を調整して、肝臓のG6PT活性の同等な回復レベルを得た。
G6pt−/−マウスのグルコース恒常性を維持し、HCAの発症を防ぐために必要なrAAVベクターの投与量を78週間にわたる研究で調べた。rAAV−GPE−G6PTの研究の場合、全ての新生仔マウス(n=15)は0.7×1013vp/kgを投与され、続けて4週齢で2×1013vp/kg(GPEマウス、n=6)または0.7×1013vp/kg(GPE−lowマウス、n=9)を投与された。rAAV−miGT−G6PTの研究の場合、全ての新生仔マウス(n=15)は、1.4×1013vp/kgを新生仔で投与され、次いで4週齢で4×1013vp/kgを投与され、これらは、「miGT」マウスと呼ばれた。肝臓のG6PT活性は、24時間の絶食後に屠殺された野生型およびrAAV処置したマウスで調べた。60〜78週齢の野生型マウスの場合、平均的な肝臓のミクロソームのG6P取り込み活性は、123±6単位(またはpmol/分/mg)(100%正常の肝臓のG6PT活性に相当)であった。GPEマウスは、野生型の肝臓のG6PT活性の44〜62%を再構成するために滴定され、G6PT/44−62%マウスと命名された(図2A)。GPE−lowおよびmiGTマウスは、野生型の肝臓のG6PT活性の3〜22%を有し、G6PT/3−22%マウスと命名された(図2A)。60〜78週齢の野生型またはG6PT/44−62%マウスのいずれにもHCAは存在しなかった(図2A)。24匹のG6PT/3−22%マウスのうち、12匹が7単位以下のミクロソームのG6P取り込み活性(または正常な肝臓のG6PT活性の5.7%以下)を有した。非腫瘍肝組織でそれぞれ正常な肝臓のG6P取り込み活性の5.7%および3.2%を有する1匹のGPE−lowおよび1匹のmiGTマウスがHCAを発症した(図2A)。これは、正常な肝臓のG6PT活性の5.7%がGSD−IbのHCA形成の閾値にあることを示唆する。肝臓のG6P取り込み活性の増加は、肝臓のベクターゲノムコピー数の増加と相関するように思われた(図2B)。要約すると、正常な肝臓のG6PT活性の6%未満が回復したrAAV処置したG6pt−/−マウスは、HCAを発症するリスクがある。
GSD−Ibは、低血糖症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症によって特徴付けられる(Chouら、Curr Mol Med、2巻:121〜143頁、2002年;Chouら、Nat Rev Endocrinol、6巻:676〜688頁、2010年)。60〜78週齢のrAAV処置したG6pt−/−マウスはいずれも低血糖発作に苦しんでいなかった。G6PT/44−62%および野生型マウスの基礎血中グルコースレベルは区別できなかった(図3A)。正常血糖を維持するG6PT/3−22%マウスの能力にもかかわらず、それらの基礎血中グルコースレベルは野生型マウスよりも有意に低かった(図3A)。遺伝子治療により、全ての処置したマウスの血清コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸プロファイルが正常化された(図3A)。処置したG6pt−/−マウスの平均BWおよび体脂肪(図3B)値は、年齢を合わせた対照マウスのものよりも有意に低く、処置したマウスが加齢に伴う肥満症から保護されたことを示唆した。GSD−Ibはまた、肝腫大によっても特徴付けられる(Chouら、Curr Mol Med、2巻:121〜143頁、2002年;Chouら、Nat Rev Endocrinol、6巻:676〜688頁、2010年)。肝臓の体重に対する比は、G6PT/44−62%と野生型マウスの間で同様であったが、G6PT/3−22%マウスは肝腫大を示し続けた(図3C)。
機能的なG6PTを欠損するG6pt−/−マウスは、G6PT/G6Pase−α複合体を介して内因性グルコースを産生することができない。rAAV処置したG6pt−/−マウスは全て、長期の絶食に耐えることができた。実際、24時間の絶食後、G6PT/44−62%およびG6PT/3−22%マウスの肝臓の遊離グルコースレベルは、それぞれ野生型の肝臓のグルコースレベル(204±6nmole/mg)の76%および58%であった(図4B)。さらに、肝臓の乳酸塩レベルは、全てのrAAV処置したマウスで有意に増加したが、G6PT/3−22%マウスではより顕著であった。肝臓のトリグリセリド含有量はG6PT/44−62%と野生型マウスの間で同様であったが、G6PT/3−22%マウスの肝臓のトリグリセリドレベルは対照と比較して有意に増加した(図4C)。
研究は、肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質(ChREBP)を過剰発現するマウスは、対照と比較して改善されたグルコース耐性を示すことを示した(Benhamedら、J Clin Invest、122巻、2176〜2194頁、2012年)。ChREBPシグナル伝達の活性化は、rAAV処置したGSD−Iaマウスを加齢に伴うインスリン抵抗性の発症から保護する1つの経路であることが示された(Kimら、Hum Mol Genet、24巻:5115〜5125頁、2015年)。ChREBPシグナル伝達は、ChREBP核移行を促進するG6Pによって活性化され得る(Filhoulaudら、Trends Endocrinol Metab、24巻、257〜268頁、2013年)。このrAAV処置したG6pt−/−マウスの研究では、G6PT/44−62%およびG6PT/3−22%マウスの肝臓のG6Pレベルは、それぞれ対照マウスより1.9倍および3.1倍高かった(図5A)。これには、全てのrAAV処置したG6pt−/−マウスにおける肝臓のChrebp転写物の増加が伴った(図5B)。野生型マウスと比較して、肝臓の核ChREBPタンパク質含有量はG6PT/3−22%マウスで著しく増加したが、肝臓の核ChREBPタンパク質含有量の増加はG6PT/44−62%マウスでは統計学的に有意ではなかった(図5C)。一貫して、ChREBPによって調節される肝臓の遺伝子(Benhamedら、J Clin Invest、122巻、2176〜2194頁、2012年;Filhoulaudら、Trends Endocrinol Metab、24巻、257〜268頁、2013年)、アセチル−CoAカルボキシラーゼアイソフォーム−1(ACC1)、脂肪酸シンターゼ(FASN)、およびステアロイル−CoAデサチュラーゼ1(SCD1)のmRNAおよびタンパク質のレベルは、G6PT/3−22%マウスでは著しく増加したが、G6PT/44−62%マウスでは中程度および一貫性のない増加しかなかった(図5Dおよび5E)。
これまでの遺伝子治療研究は、CBAプロモーター/CMVエンハンサーによって指示されるG6PT発現rAAV2/8ベクターが導入遺伝子を肝臓に送達し、マウスGSD−Ibの代謝補正を達成したことを示した(Yiuら、J Hepatol、51巻:909〜917頁、2009年)。その研究は有望であったが、52〜72週齢のG6pt−/−マウスで回復した肝臓のG6PT活性は低く、正常な肝臓のG6PT活性の平均およそ3%であり、5匹の形質導入マウスのうち2匹が多発性HCAを発症し、1匹が悪性転換となった(Yiuら、J Hepatol、51巻:909〜917頁、2009年)。肝臓疾患のこれまでの研究はまた、組織特異的プロモーター/エンハンサーエレメントの使用が発現効率を改善し、長期導入遺伝子発現を低下させる免疫応答のレベルを低下させることを示した(Zieglerら、Mol Ther、15巻:492〜500頁、2007年;Francoら、Mol Ther、12巻:876〜884頁、2005年)。糖新生組織特異的G6PCプロモーター/エンハンサーは、マウスGSD−Iaでの持続的な肝臓のG6Pase−α発現の指示においてCBA/CMAよりも顕著に有効であること、およびCBA/CMAエレメントを含有するベクターによって誘発される炎症性免疫応答が肝臓の導入遺伝子発現を低下させたことが示されている(Yiuら、Mol Ther、18巻:1076〜1084頁、2010年)。本明細書に開示される研究では、G6PCプロモーター/エンハンサー(GPE)(Leeら、Hepatology、56巻:1719〜1729頁、2012年;Kimら、Hum Mol Genet、24巻:5115〜5125頁、2015年;Yiuら、Mol Ther、18巻:1076〜1084頁、2010年)によって指示される一本鎖rAAVベクターである、rAAV−GPE−G6PTと、天然のG6PTプロモーター/エンハンサー(miGT)(HiraiwaおよびChou、DNA Cell Biol、20巻:447〜453頁、2001年)によって指示される二本鎖rAAVベクターである、rAAV−miGT−G6PTとの有効性を比較した。両方のベクターが持続的な肝臓のG6PT発現を指示したが、G6PCプロモーター/エンハンサーを使用するベクターは、天然のG6PTプロモーター/エンハンサーを使用するベクターよりも、用量に基づくと、導入遺伝子発現がおよそ4倍効率的であった。正常な肝臓のG6PT活性の3〜62%を発現するrAAV処置したG6pt−/−マウスは、78週間まで正常に成長し、正常化された代謝表現型を示し、検出可能な抗G6PT抗体を有さず、加齢に伴う肥満症とインスリン抵抗性から保護されたこともまた示された。重要なことに、本明細書に開示される研究は、正常な肝臓のG6PT活性の6%未満が回復したG6pt−/−マウスが肝腫瘍を発症するリスクがあることを示し、腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のG6PT活性の閾値が確立された。
rAAV8を介したG6PT導入遺伝子の発現は、主に肝臓を標的とし、腎臓と腸では導入遺伝子の発現はほとんど観察されなかった。その結果、処置したマウスの腎臓および腸はG6pt−nullのままであり、内因性グルコース産生ができないままであった。腎臓および腸からの内因性グルコース産生がない場合、G6PT/3−22%マウスは、対照の同腹仔のものの平均58%の低下した肝臓のグルコースレベルを産生し(図4B)、G6PT/3−22%マウスは、カロリー制限下で生存する動物を模倣することを示唆する。
Claims (23)
- 配列番号1のヌクレオチド182〜4655、または配列番号2のヌクレオチド182〜1938を含む、組換え核酸分子。
- 配列番号1のヌクレオチド17〜5003を含む、請求項1に記載の組換え核酸分子。
- 配列番号1を含む、請求項1または請求項2に記載の組換え核酸分子。
- 配列番号2のヌクレオチド17〜2316を含む、請求項1に記載の組換え核酸分子。
- 配列番号2を含む、請求項1または請求項4に記載の組換え核酸分子。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項6に記載のベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV血清型8(AAV8)のベクターまたは血清型9(AAV9)のベクターである、請求項7に記載のベクター。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え核酸分子を含む組換えAAV(rAAV)。
- rAAV8またはrAAV9である、請求項9に記載のrAAV。
- レンチウイルスベクターである、請求項6に記載のベクター。
- 前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ベクターである、請求項11に記載のベクター。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え核酸分子を含む組換えレンチウイルス。
- 組換えHIVである、請求項13に記載の組換えレンチウイルス。
- 薬学的に許容される担体中に、請求項9もしくは請求項10に記載のrAAV、または請求項13もしくは請求項14に記載の組換えレンチウイルスを含む組成物。
- 静脈内投与のために製剤化された、請求項15に記載の組成物。
- 糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、糖原病Ib型(GSD−Ib)を有する被験体を選択することと、治療有効量の、請求項9もしくは請求項10に記載のrAAV、請求項13もしくは請求項14に記載の組換えレンチウイルス、または請求項15もしくは請求項16に記載の組成物を前記被験体に投与することとを含む、方法。
- 前記rAAVが、静脈内投与される、請求項17に記載の方法。
- 1用量あたり約1×1011〜約1×1014ウイルス粒子(vp)/kgの前記rAAVを投与することを含む、請求項17または請求項18に記載の方法。
- 1用量あたり約1×1012〜約1×1014vp/kgの前記rAAVを投与することを含む、請求項19に記載の方法。
- 1用量あたり約5×1012〜約5×1013vp/kgの前記rAAVを投与することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記rAAVを投与することが、単回用量のrAAVの投与を含む、請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記rAAVを投与することが、複数回用量のrAAVの投与を含む、請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法。
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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