JP2016538885A - 糖原病の処置のためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年11月26日に出願された米国仮出願第61/908,861号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、糖原病、特に、糖原病Ia型を処置するための遺伝子療法ベクターに関する。
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいずれの言及にも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、2014年11月12日に作成された、39.6KBのASCIIテキストファイルとして提出され、これは、参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表では:
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー−ヌクレオチド182〜3045
スタッファー−ヌクレオチド3051〜3184
イントロン−ヌクレオチド3185〜3321
スタッファー−ヌクレオチド3322〜3367
G6PCコード配列−ヌクレオチド3368〜4441
ITR−ヌクレオチド4674〜4819
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー−ヌクレオチド182〜3045
イントロン−ヌクレオチド3052〜3188
G6PCコード配列−ヌクレオチド3202〜4275
ITR−ヌクレオチド4508〜4653
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー−ヌクレオチド182〜3045
スタッファー−ヌクレオチド3051〜3184
イントロン−ヌクレオチド3185〜3321
スタッファー−ヌクレオチド3322〜3367
G6PCコード配列−ヌクレオチド3368〜4441
ITR−ヌクレオチド4674〜4819
I.略語
AAV アデノ随伴ウイルス
BMI 肥満度指数
CBA ニワトリβ−アクチン
CMV サイトメガロウイルス
ELISA 酵素結合免疫吸着検定法
G6P グルコース−6−リン酸
G6PC グルコース−6−ホスファターゼ、触媒サブユニット
G6PT グルコース−6−リン酸トランスポーター
GPE G6PCプロモーター/エンハンサー
GSD 糖原病
H&E ヘマトキシリン&エオシン
HCA 肝細胞腺腫
HCC 肝細胞癌
ITR 末端逆位配列
ORF オープンリーディングフレーム
rAAV 組換えAAV
vg ウイルスゲノム
vp ウイルス粒子
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学において一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Press刊、1994年(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、published by Blackwell Science Ltd.、1994年(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊、1995年(ISBN 1−56081−569−8)に見出すことができる。
本明細書では、糖原病、特にGSD−Iaを処置するための遺伝子療法の適用において使用することができる組換え核酸分子、AAVベクターおよび組換えAAVが提供される。
AAVは、Parvoviridae科Dependovirus属に属する。AAVは、直鎖状の一本鎖DNAゲノムをパッケージングする、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。AAV DNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はどちらも同等の頻度でAAVカプシドにパッケージングされる。
遺伝子療法を使用した、糖原病Ia型の肝臓G6PC欠損の完全な正常化
この実施例では、G6PC欠損マウスにおける、G6Pase−αの肝臓遺伝子送達および発現の効率に関する、2つの異なるプロモーターによって駆動される、G6Pase−αを発現するAAVベクター2種の比較を記載する。その結果から、持続的なin vivoにおける肝臓導入遺伝子の発現を指向することに関して、G6PCプロモーター/エンハンサー(AAV−GPE)を有するAAVベクターの方が、ニワトリβ−アクチンプロモーター/CMVエンハンサー(AAV−CBA)を有するAAVベクターよりも効率的であったことが実証される。さらに、AAV−GPEを用いて処置したG6PC欠損マウスでは、正常なレベルの血中グルコース、血中代謝産物、肝臓グリコーゲンおよび肝臓脂肪が示された。
pUF11−GPE−G6PCの構築およびAAVベクターの調製
ヒトG6PCプロモーター/エンハンサーの制御下にある、ヒトG6Pase−αを含有するUF11−GPE−G6PCプラスミドを、マウスG6Pase−αがCBAプロモーター/CMVエンハンサーによって駆動される(Xuら、Hum Gene Ther 12巻:563〜573頁、2001年)pUF11−mG6Pase−α−CBA(Ghoshら、Gene Ther 13巻:321〜329頁、2006年)を以下の通り改変することによって構築した:pUF11−mG6Pase−α−CBAからのTkp−neo断片をXhoI/SphI消化によって切り出し、残りのベクターをゲル精製し、T4 DNAポリメラーゼを用いてポリッシュ(polish)し、次いで、自己ライゲーションしてpUF11−mG6Pase−α−CBA−[Tkp−neo]−/−を得た。次いで、pUF11−mG6Pase−α−CBA−[Tkp−neo]−/−内のmG6Pase−αを、CBAプロモーター/CMVエンハンサーと一緒に、5’−SbfI部位および3’−NotI部位においてヒトG6Pase−α cDNAで置換し、pUF11−G6PCを得た。次いで、PCRを使用して、ヒトG6PCプロモーター/エンハンサーを含有するG6PC 5’−フランキング領域のヌクレオチド−2864〜−1をクローニングした。PCR鋳型は、ヒトG6PC遺伝子を含有する細菌人工染色体であり(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)、プライマー対は、5’末端および3’末端にそれぞれ追加的なKpnI部位およびXbaI部位を含有する、1S(5’−CCTTTGAGAATCCACGGTGT−3’;配列番号5)および2AS(5’−CCTCATTTCCTTGGCACCTC−3’;配列番号6)であった。次いで、G6PCプロモーター/エンハンサーを含有するKpnI−XbaI断片を、KpnI−XbaIで直鎖化したpUF11−G6PCにライゲーションして、pUF11−G6PC−GPE−1を得た。次に、5’末端および3’末端にそれぞれ追加的なSpeI部位およびSbfI部位を含有するプライマー対3S(5’−AGGTAAGTATCAAGGTTACA−3’;配列番号7)および4AS(5’−ACCTGTGGAGAGAAAGGCAA−3’;配列番号8)を使用したPCRを使用して、pCIベクター(Promega、Madison、WI)由来のキメライントロンをクローニングした。次いで、このキメライントロンをSpeI−SbfI断片として、SpeI−SbfIで直鎖化したpUF11−G6PC−GPE−Iの大きな断片にライゲーションして、pUF11−GPE−G6PC(配列番号1)を得た。全ての構築物を、DNA配列決定によって検証した。
以前に記載されている通り、12時間ごとに15%グルコース25〜100μlを腹腔内注射することからなるグルコース療法をG6pc−/−マウスに施行した(Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)。離乳後に残存したマウスにマウス固形飼料を無制限に与えた(Zeigler Bros., Inc.、Gardners、PA)。
ミクロソーム単離およびホスホヒドロラーゼアッセイを基本的に以前に記載されている通り決定した(Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)。50mMのカコジル酸緩衝液、pH6.5、10mMのG6Pおよび適量のミクロソーム調製物を含有する反応混合物(100μl)を37℃で10分インキュベートした。インタクトな膜を0.2%デオキシコール酸中、0℃で20分インキュベートすることによって破壊ミクロソーム膜を調製した。非特異的ホスファターゼ活性を、破壊ミクロソーム調製物をpH5、37℃で10分プレインキュベートすることによって推定し、酸に不安定なG6Pase−αを不活化した。
血液試料を尾静脈から採取した。血中グルコース、総コレステロール、および尿酸を、Thermo Electron(Louisville、CO)から得たキットを使用して分析した。トリグリセリドをSigma Diagnostics(St Louis、MO)からのキットを用いて測定し、乳酸をTrinity Biotech(St Louis、MO)からのキットによって測定した。
ヒトG6Pase−αまたはマウスG6Pase−αに対する抗体をウエスタン−ブロット分析によって検出した。Ad−ヒトG6Pase−αまたはAd−マウスG6Pase−αを感染させたCOS−1細胞由来のミクロソームタンパク質(Ghoshら、J Biol Chem 277巻:32837〜32842頁、2002年)を12%ポリアクリルアミド−SDSゲルによる電気泳動によって分解し、フッ化ポリビニリデン膜にトランスブロットした(Millipore、Bedford、MA)。膜を、多数のチャネルを含有するMultiscreen Apparatus(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)に入れた。各チャネルの下の膜細片を、1:3000に希釈したウサギ抗ヒトG6Pase−α血清(Ghoshら、J Biol Chem 277巻:32837〜32842頁、2002年)、または1:200希釈した、AAV−GPEを注入した動物またはAAV−CBAを注入した動物由来の血清試料と一緒にインキュベートした。1:200に希釈した、無処置のG6pc−/−およびG6pc+/+/G6pc+/−同腹仔由来の血清試料を対照として使用した。一晩インキュベートした後、膜細片を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgGまたはヤギ抗マウスIgG(Kirkegarrd & Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)と一緒にインキュベートした。免疫複合体を、Pierce(Rockford、IL)からのSuperSignal(商標)West Pico Chemiluminescent substrateを使用した化学発光系によって可視化した。
マウス肝臓を急速凍結させ、O.C.T.(Sakura Finetek、Terrance、CA)に包埋し、8ミクロンの厚さの薄片を作製した。切片をアセトン中に−20℃で10分にわたって固定し、乾燥させ、PBSで洗浄し、2%のBSAを含有するPBSを用いて30分にわたってブロッキングし、1%BSAを補充したPBS中、CD8(Abcam Inc.、Cambridge、MA)に対するウサギポリクローナル抗体と一緒に4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄した後、切片を、Alexa Fluor(登録商標)488(Invitrogen)色素とコンジュゲートしたヤギ抗ラットIgG抗体と一緒に、25℃で1時間、暗所でインキュベートした。PBSで洗浄した後、標識した細胞を、DAPI(Vector Laboratories、Burlingame、CA)を含有する退色防止水性封入剤を用いて封入し、Axioskop2 plus fluorescence microscope(Carl Zeiss、Thornwood、NY)を使用して可視化した。200倍拡大率で、ランダムに選択した10視野でCD8+細胞を計数し、平均(mean average)として報告した。
独立t検定を、GraphPad Prism(登録商標)Program、version 4(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して実施した。値は、p<0.05であれば統計学的に有意とみなした。
AAV−GPE注入により、長期間の肝臓G6Pase−α発現が指向される
以前に試験された(Koeberlら、Mol Ther 16巻:665〜672頁、2008年)ヒトG6PCプロモーターエレメントのヌクレオチド−298の上流の配列のin vivoにおける影響を調査するために、ヒトG6PC 5’−フランキング領域のヌクレオチド−2864〜−1の制御下でヒトG6Pase−αを発現するAAV8ベクターであるAAV−GPEを構築した。マウスにおいてAAV−媒介性遺伝子療法を開始する標準の年齢はなく(Ghoshら、Gene Ther 13巻:321〜329頁、2006年;Koeberlら、Gene Ther 13巻:1281〜1289頁、2006年;Koeberlら、Mol Ther 16巻:665〜672頁、2008年)、また、遺伝子移入の効率および持続の損失は肝臓の成長に伴う肝細胞増殖の速度の増大に影響されるという証拠があるので(Cunninghamら、Mol Ther 16巻:1081〜1088頁、2008年)、G6pc−/−マウスに、3つの異なる年齢、2日齢、2週齢、または4週齢の時点で注入し、肝臓G6Pase−α発現を24週齢まで調査した。年齢の違いにかかわらず、マウスの各群に同じ用量のAAV−GPE(1.2×1011ウイルスゲノム(vg)/マウス)を注入した。注入を受けた動物の代謝プロファイルを24週間の試験の間モニターし、全ての測定値を、それらのG6pc+/+/G6pc+/−同腹仔および4〜6週齢の無処置のG6pc−/−マウスの測定値と比較した。GSD−Iaは、常染色体劣性障害であり、以前の試験では、G6pc+/+同腹仔およびG6pc+/−同腹仔の表現型は野生型と区別できないことが示されている(Leiら、Nat Genet13巻:203〜209頁、1996年)。
高レベルの肝臓導入遺伝子の発現を指向するために、CBAプロモーター/CMVエンハンサーが広く使用されている(Xuら、Hum Gene Ther 12巻:563〜573頁、2001年)。しかし、CMVエンハンサーは、広範囲にわたるCpGおよび非CpGメチル化によってサイレンシングされることが知られている(Brooksら、J Gene Med 6巻:395〜404頁、2004年;Mehtaら、Gene 428巻:20〜24頁、2009年)。ハイブリッドCBAプロモーター/CMVエンハンサーの制御下でマウスG6Pase−αを発現するAAV8ベクターであるAAV−CBAを使用した以前のin vivoでの実験では、乏しい発現が示され(Ghoshら、Gene Ther 13巻:321〜329頁、2006年)、これは、おそらく、CMVプロモーターのメチル化に関連する。肝臓の遺伝子移入のin vivoにおける有効性をAAV−CBAとAAV−GPEの間で比較するために、G6pc−/−マウスに、AAV−GPE実験と同様に、AAV−CBAを、用量を増やし、4.8×1011vg/マウスで2日齢時および2週齢時に注入し、24週齢まで追跡した。
グルコース療法下にあるG6pc−/−マウスは成長が遅延し、2週齢までそれらの平均体重はそれらのG6pc+/+/G6pc+/−同腹仔のおよそ60%であった(Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)。AAV−GPEの注入を受けた新生児G6pc−/−マウスは成長速度が著しく改善され、注入を受けた動物の体重は、対照マウスに匹敵した(図1A)。2週齢時または4週齢時にAAV−GPEの注入を受けたG6pc−/−マウスでは、それらのG6pc+/+/G6pc+/−同腹仔と平行するが値が低い成長曲線が示され、これは、遺伝子療法を始める前のG6pc−/−マウスの開始時の体重が低いことと一貫している(図1A)。
それぞれ2週齢時および4週齢時にAAV−GPEの注入を受けた、12週齢および14週齢のG6pc−/−マウスにおける空腹時血中グルコースレベルを調査した。G6pc+/+/G6pc+/−マウスにおける血中グルコースレベルは6時間の絶食後に変化しなかった。重要なことに、2週齢時または4週齢時のいずれかにAAV−GPEの注入を受けたG6pc−/−マウスにおける血中グルコースレベルも6時間の絶食後に変化せず、これにより、注入を受けたG6pc−/−マウスがもはやGSD−Iaの特徴である空腹時低血糖を患っていないことが実証される(Chouら、Curr Mol Med 2巻:121〜143頁、2002年)。無処置のG6pc−/−マウスを用いた同様の絶食実験により、急速な低血糖症が生じ、その後、ほんの短時間の絶食後に低血糖発作が生じた。
注入を受けたG6pc−/−マウスにおいて、ヒトG6Pase−αに対する液性応答が生じるかどうかを決定するために、AAV−GPEまたはAAV−CBAの注入を受けたマウス由来の血清を使用してウエスタンブロット分析を実施した。陽性対照として、同じくマウスG6Pase−αを認識するウサギ抗ヒトG6Pase−α抗血清を使用した(Ghoshら、J Biol Chem 277巻:32837〜32842頁、2002年)。24週齢まで生存した、AAV−GPEを注入したG6pc−/−マウスまたはAAV−CBAを注入したG6pc−/−マウスのいずれにおいてもG6Pase−αに対する抗体は検出されなかった。さらに、G6pc+/+/G6pc+/−同腹仔または無処置のG6pc−/−マウスの血清においてG6Pase−αに対する内在性抗体は存在しなかった。
AAV−CBAを注入したG6pc−/−マウスの肝臓内にG6Pase−αに対する検出可能な抗体が存在しないことにより、G6Pase−α導入遺伝子に対する細胞性免疫応答はこのベクターによって指向される導入遺伝子の発現の急速な低下の原因ではないことが示唆される。別の可能性は、AAV−CBAベクターによって誘発される炎症性免疫応答である。したがって、G6pc−/−マウスにAAV−CBAまたはAAV−GPEを注入後2週間の肝臓CD8+リンパ球浸潤を調査した。2週齢および4週齢の野生型またはG6pc−/−マウスでは、肝臓CD8+リンパ球数は少なかった。2日齢時にAAV−CBAまたはAAV−GPEの注入を受けたG6pc−/−マウスでは、2週齢時の肝臓CD8+リンパ球数は、ベクターの種類のそれぞれについて同様であり、無処置の2週齢の野生型またはG6pc−/−動物における数に匹敵した。2週齢時にAAV−GPEの注入を受けたG6pc−/−マウスでは、肝臓CD8+リンパ球数は4週齢時に少ないままであった。対照的に、2週齢時にAAV−CBAの注入を受けたG6pc−/−マウスでは、肝臓CD8+リンパ球数は4週齢時に著しく増加した。その結果から、AAV−CBAによって誘発される炎症応答により、少なくとも一部において、CBAプロモーター/CMVエンハンサーによって指向される肝臓G6Pase−α発現の急速な低下および有効性の低さを説明することができることが示唆される。
遺伝子療法を使用した糖原病Ia型における肝細胞腺腫の予防および代謝異常の修正
この実施例では、長期試験においてAAV−GPEベクターの有効性を評価するための試験を記載している。G6pc−/−マウスにおけるAAV−GPEベクターによって媒介される遺伝子療法は、野生型肝臓G6Pase−αの3%超を発現するマウスにおいて少なくとも70〜90週間にわたって効果的であった。その結果から、AAV−GPEで処置したマウスでは、正常な肝臓脂肪の貯蔵、正常な血中代謝産物および耐糖能プロファイル、空腹時血中インスリンレベルの低下が示され、肝臓の異常の証拠は示されないことが実証された。
G6pc−/−マウスへのAAV−GPEの注入
AAV−GPEベクター(実施例1およびYiuら、Mol Ther 18巻:1076〜1084頁、2010年に記載されている)を、G6pc−/−マウス(Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)に後眼窩洞を通じて注入した。年齢を釣り合わせたG6pc+/+/G6pc+/−ならびに6〜10週齢のG6pc−/−マウスを対照として使用した。ウイルスの注入を受けたマウスについては、注入後すぐにグルコース療法(Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)を終了した。
ミクロソームの単離、ホスホヒドロラーゼアッセイ、G6Pase−αの酵素組織化学的分析、およびミクロソームG6P取り込みアッセイを以前に記載されている通り実施した(Yiuら、Mol Ther 18巻:1076〜1084頁、2010年;Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)。
マウスを、まず、肝臓小結節についてVevo2100 system(VisualSonics、Ontario、Canada)を使用した超音波によって検査し、血液試料を尾静脈から採取した。血中グルコース、総コレステロール、および尿酸をThermo Electron(Louisville、CO)から入手したキットを使用して分析し、トリグリセリドをSigma Diagnostics(St Louis、MO)からのキットによって分析し、乳酸をTrinity Biotech(St Louis、MO)からのキットによって分析し、インスリンをCrystal Chem(Downers Grove、IL)からの超高感度マウスインスリンELISAキットによって分析した。肝臓グリコーゲン含量を以前に記載されている通り測定した(Yiuら、Mol Ther 18巻:1076〜1084頁、2010年)。肝臓トリグリセリド、グルコース、およびG6Pの含量を決定するために、肝組織をRIPA緩衝液(50mMのTris HCl、pH8.0、150mMのNaCl、1%トリトンX−100、0.5%Na−デオキシコール酸、および0.1%SDS)(Thermo Scientific、Rockford、IL)中でホモジナイズし、トリグリセリドをSigma Diagnosticsからキットを使用して測定し、グルコースをThermo Electronからのキットによって測定し、G6PをBioVision(Mountain View、CA)からのキットによって測定した。
全RNAを肝組織からTRIzol(商標)Reagent(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して単離した。mRNA発現をApplied Biosystems TaqManプローブを使用したApplied Biosystems 7300 Real−Time PCR System(Foster City、CA)におけるリアルタイムRT−PCRによって定量化した。データを、Applied Biosystems SDS v1.3 softwareを使用して分析し、β−アクチンRNAに対して正規化した。ヒトG6Pase−αに対する抗体を以前に記載されている通りウエスタン−ブロット分析によって検出した(Yiuら、Mol Ther 18巻:1076〜1084頁、2010年)。
GraphPad Prism(登録商標)Program、 version 4(San Diego、CA)を使用して独立t検定を実施した。値は、P<0.05で統計学的に有意であるとみなした。
AAV−GPE注入により、長期間の肝臓G6Pase−α発現が指向される
AAV−GPEを、用量を変動させて(5×1012〜3×1013ウイルス粒子(vp)/kg)注入した2週齢または4週齢のG6pc−/−マウス(n=18)では、野生型肝臓G6Pase−α活性の3%から100%に回復し、維持されると予測された。15週齢のG6pc−/−マウス1匹(5×1012vp/kg)および30週齢のG6pc−/−マウス1匹(1×1013vp/kg)にも注入を行った。グルコース療法下のGSD−Iaマウスの低い生存率により、試験のために入手可能な成体マウスの数が重度に制限された(Leiら、Nat Genet13巻:203〜209頁、1996年)。注入を受けた動物20匹の代謝プロファイルおよび組織学的プロファイルを70〜90週間にわたってモニターし、全ての測定値をそれらのG6pc+/+同腹仔およびG6pc+/−同腹仔の測定値と比較した。G6pc+/+マウスおよびG6pc+/−マウスの表現型はどちらも野生型と区別できない(Leiら、Nat Genet 13巻:203〜209頁、1996年)。
GSD−Iaは、低血糖症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高尿酸血症、および乳酸血症を特徴とする(Chouら、Nat Rev Endocrinol 6巻:676〜688頁、2010年)。野生型肝臓G6Pase−α活性を発現するAAV−Hマウスにおける血中グルコースレベルは対照同腹仔におけるレベルと区別できなかった(図3A)。それぞれ正常な肝臓G6Pase−α活性の22〜63%および3〜9%を発現するAAV−MおよびAAV−Lでも、正常血糖(約100mg/dl)の状態が維持されたが(Yoshizawaら、J Clin Invest 119巻:2807〜2817頁、2009年)、それらの血中グルコースレベルは一貫して対照同腹仔よりも低かった(図3A)。AAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスの全てでコレステロールおよびトリグリセリドの正常な血清プロファイルが示されたが、処置を受けたG6pc−/−マウスにおける尿酸および乳酸の血清中レベルは、対照同腹仔におけるレベルよりも低かった(図3A)。
AAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスにおけるHCA小結節の存在を決定するために、肝臓当たり5つまたはそれ超の別々の切片を使用して、超音波分析を行い、その後、広範囲にわたる肝臓の検査および肝臓生検試料の組織学的分析を行った。超音波および形態学的分析により、70週齢〜90週齢まで生存した野生型マウス(n=20)およびAAV−GPEを形質導入したG6pc−/−マウス(n=20)において肝臓小結節は検出されなかった。2週齢時または4週齢時に注入を受けた、AAV−GPEで処置したG6pc−/−マウス(n=18)では、グリコーゲン貯蔵が増加した以外は肝臓の組織学的異常は示されなかった。正常な肝臓G6Pase−α活性の6%を発現した、15週齢時に注入を受けた84週齢のマウスでは、1つの肝臓切片においてグリコーゲン貯蔵の上昇およびわずかな壊死性病巣が示された。正常な肝臓G6Pase−α活性の38%を発現した、30週齢時に注入を受けた90週齢のマウスの肝組織切片の大部分では、組織学的異常は示されず、1つの肝臓切片が多くの壊死性病巣を有した。壊死性病巣は、6週齢以降の無処置のGSD−Iaマウスにおいて見られる特徴的な肝臓病態であるので(Kimら、J Hepatol 48巻:479〜485頁、2008年)、これらの壊死性病巣は、15週齢時または30週齢時の遺伝子療法を開始する前に発生した可能性がかなり高い。
絶食を始める前の野生型マウス(n=20)の平均血中グルコースレベルは165.0±3.0mg/dl(ゼロ時間)であり、これは24時間の絶食後には113.3±6.5mg/dlに減少した(図4A)。AAV−LマウスとAAV−Mマウスの空腹時血中グルコースプロファイルは対照マウスのプロファイルと平行したが、血中グルコースレベルは一貫して低く(図4A)、一方、AAV−Hマウスの空腹時血糖プロファイルは対照マウスのプロファイルと区別できなかった。著しく異なり、無処置のG6pc−/−マウスは、絶食60〜75分以内にGSD−Iaの特質である顕著な低血糖症を示した(図4B)(Chouら、Nat Rev Endocrinol 6巻:676〜688頁、2010年)。要約すると、AAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスは、もはやGSD−Iaの空腹時低血糖特性を患っていない(Chouら、Nat Rev Endocrinol 6巻:676〜688頁、2010年)。
インスリンシグナル伝達により、肝臓のグルコース代謝および脂質代謝が調節される(LeavensおよびBirnbaum、Crit Rev Biochem Mol Biol 46巻:200〜215頁、2011年)。24時間の絶食後に、70〜90週齢の野生型マウス(n=20)およびAAV−GPEで処置したG6pc−/−マウス(n=20)における血中インスリンレベルは、それぞれ1.84±0.29および0.56±0.09ng/mlであった(図5A)。どちらも正常範囲内であったが(de Lucaら、J Clin Invest 115巻:3484〜3493頁、2005年)、AAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスにおける空腹時血中インスリンレベルの方が正常な平均値に近かった(de Lucaら、J Clin Invest 115巻:3484〜3493頁、2005年)。AAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスにおける空腹時血中インスリンレベルは肝臓G6Pase−αの回復と相関しなかったが、野生型マウスおよび処置を受けたG6pc−/−マウスにおけるインスリンレベルは、それらの体重と直線関係を示した(図5A)。
絶食中、血中グルコース恒常性は、肝臓において糖新生およびグリコーゲン分解の最終ステップにおけるG6PT/G6Pase−α複合体によるG6Pの加水分解によって産生される内在性グルコースによって維持される(Chouら、Nat Rev Endocrinol 6巻:676〜688頁、2010年)。機能的なG6Pase−αを欠くG6pc−/−マウスは、肝臓、腎臓、または腸において内在性グルコースを産生することができない。24時間の絶食後の肝臓の遊離のグルコースレベルは、野生型マウス(n=20)ではタンパク質1mg当たり389±17nmolであり、AAV−Lマウス(n=6)、AAV−Mマウス(n=9)、およびAAV−Hマウス(n=5)では、それぞれ野生型マウスの61%、68%および90%であった。絶食させたAAV−L肝臓およびAAV−M肝臓における細胞内G6Pレベルは、それぞれ野生型肝臓の2.9倍および1.6倍であったが、絶食させたAAV−H肝臓における細胞内G6Pレベルは野生型肝臓のレベルと統計学的に同様であった。
注入を受けたマウスにおいてヒトG6Pase−αに対する液性応答が生じるかどうかを決定するために、70〜90週齢の対照マウスおよびAAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスから得た血清を使用してウエスタンブロット分析を実施した。マウスG6Pase−αも認識する、ヒトG6Pase−αに対するモノクローナル抗体(Yiuら、Mol Ther 18巻:1076〜1084頁、2010年)を陽性対照として使用した。70〜90週齢まで生存した、AAV−GPEを注入したG6pc−/−マウスまたは野生型対照マウスのいずれにおいてもG6Pase−αに対する抗体は検出されなかった。
G6PCプロモーターの上流エンハンサーエレメントは糖原病Ia型における最適なG6PC発現に極めて重要である
この実施例では、AAV−GPEベクターの有効性をさらに評価するための試験を記載している。2684bpのG6PCプロモーター/エンハンサーを含む一本鎖ベクターであるAAV−GPEを、382bpの最小G6PCプロモーター/エンハンサーを含有する二本鎖ベクターであるAAV−miGPEと比較した。この実施例に記載されている結果は、AAV−GPEベクターにより、GSD−Iaマウスにおいて、AAV−miGPEベクターと比較して有意に高いレベルの肝臓G6Pase−α発現が指向され、肝臓グリコーゲン蓄積のより大きな減少が実現され、また、より良好な絶食耐性につながったことを示すものである。
G6pc−/−マウスへのrAAVベクターの注入
全てのG6pc−/−マウスをグルコース療法で生存維持させた(Leiら、Nat. Genet.13巻:203〜209頁、1996年)。2週齢のG6pc−/−マウスに後眼窩洞を通じてrAAVベクターを注入した。年齢を釣り合わせたG6pc+/+/G6pc+/−マウスを対照として使用した。rAAVベクターの注入を受けたマウスについては、注入後すぐにグルコース療法を終了した。全てのウイルス形質導入を2週齢のG6pc−/−マウスに実施し、12週齢時に有効性を評価した。
ミクロソームの単離およびホスホヒドロラーゼアッセイを基本的に以前に記載されている通り決定した(Leiら、Nat. Genet.13巻:203〜209頁、1996年)。ホスホヒドロラーゼアッセイに関しては、50mMのカコジル酸緩衝液、pH6.5、10mMのG6Pおよび適量のミクロソーム調製物を含有する反応混合物(100μl)を30℃で10分インキュベートした。インタクトな膜を0.2%デオキシコール酸中、0℃で20分インキュベートすることによって破壊ミクロソーム膜を調製した。非特異的ホスファターゼ活性を、破壊ミクロソーム調製物をpH5、37℃で10分プレインキュベートすることによって推定し、酸に不安定なG6Pase−αを不活化した。
GenElute(商標)Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma−Aldrich、St Louis、MO)を使用してマウス組織由来の総DNAを単離し、TRIzol(商標)Reagent(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して全RNAをマウス組織から単離した。ベクターゲノム数およびmRNA発現を、Applied Biosystems TaqManプローブを使用したApplied Biosystems 7300 Real−Time PCR System(Applied Biosystems、Foster City、CA)でそれぞれPCRおよびリアルタイムRT−PCRによって定量化した。G6PCについてはTaqManプローブセットHs00609178_m1、およびβ−アクチンについてはMm00607939_s1を使用してヒトG6PC遺伝子のベクターゲノム数をマウスβ−アクチンに対して正規化した。ヒトG6PC遺伝子の0.01〜100コピーに対応するプラスミドDNAを標準曲線に使用した。ベクターゲノムコピー数を決定するために、試料のCt値を標準曲線と比較した。G6PCについてはTaqMan(登録商標)プローブセットHs00609178_m1およびRpl19についてはMm02601633_g1を使用してG6PC mRNA発現をRpl19 RNAに対して正規化した。
Thermo Electron(Louisville、CO)から入手したキットを使用して血中グルコースを分析した。肝臓グリコーゲンおよびトリグリセリド含量を以前に記載されている通り測定した(実施例1および2、ならびにYiuら、Mol. Ther.18巻:1076〜1084頁、2010年;Leeら、Hepatology 56巻:1719〜1729頁、2012年)。肝臓トリグリセリドを決定するために、肝組織をRIPA緩衝液(50mMのTris HCl、pH8.0、150mMのNaCl、1%トリトンX−100、0.5%Na−デオキシコール酸、および0.1%SDS)(Thermo Scientific、Rockford、IL)中にホモジナイズし、Sigma Diagnostics(St Louis、MO)からのキットを使用してトリグリセリドを測定した。
GraphPad Prism(登録商標)Program、version 4(GraphPad Software Inc.、San Diego、CA)を使用して独立t検定を実施した。値は、p<0.05であれば統計学的に有意とみなした。
rAAV−GPEまたはrAAV−miGPEで処置したG6pc−/−マウスにおける肝臓G6Pase−α発現
12週間にわたるG6pc−/−マウスの処置におけるrAAV−GPEベクター(実施例1およびYiuら、Mol. Ther.18巻:1076〜1084頁、2010年を参照されたい)およびrAAV−miGPEベクター(Koeberlら、Mol. Ther.16巻:665〜672頁、2008年)の有効性を調査するための試験を行った。各ベクターを、2つの異なる研究センターにおいて、群当たりマウス6匹のマウスを用い、2種類の用量、1×1013ウイルス粒子(vp)/kg(高用量)および2×1012vp/kg(低用量)で使用した。どちらのセンターでも同様の結果が得られた。形質導入されたG6pc−/−マウスにおける肝臓G6Pase−α活性は、2つのセンターからの統合データを表すが、他の報告データは単一の試験からのものである。rAAVに媒介される肝臓の遺伝子移入の効率および持続が、初期発生の間は、肝臓の成長に伴う肝細胞増殖の速度が大きく、それによりrAAVが有効に感染した細胞の数が希薄化することに起因して少ないことが複数の試験によって示されている(Yiuら、Mol. Ther.18巻:1076〜1084頁、2010年;Cunningham、Mol. Ther.16巻:1081〜1088頁、2008年)。この試験では、rAAVベクターを、肝細胞増殖が高いままである2週齢のG6pc−/−マウスに投与した。したがって、12週齢時に検査した肝臓G6Pase−α発現は、同じベクター投与量の注入を受けた成体マウスにおいて見られる発現よりも有意に低い。ヒト疾患における最良の介入の時期はまだ確立されていない。
rAAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスおよびrAAV−miGPEで処置したG6pc−/−マウスは全て、体重は少なかったが、それらの野生型同腹仔と平行する成長曲線を示した(図6B)。処置を受けたマウスの肥満度指数(BMI)値は、ベクターまたは用量レベルに関係なく、野生型マウスの値と区別できなかった(図6C)。処置を受けたG6pc−/−マウスの全てで、血中グルコースレベルは一貫して野生型対照よりも低かったが、それでも正常範囲の下限は上回り(図6D)、注入を受けた動物の中で、GSD−Iaに典型的である頻繁な低血糖発作を患ったものはなかった(Chouら、Curr. Mol. Med.2巻:121〜143頁、2002年;Chouら、Nat. Rev. Endocrinol.6巻:676〜688頁、2010年;Leeら、Hepatology56巻:1719〜1729頁、2012年)。
野生型マウス(n=24)については、絶食前の平均血中グルコースレベルは172.2±2.6mg/dl(ゼロ時間)であり、これは、絶食8時間後には134.6±3.8mg/dlに低下した(図8A)。高用量療法マウス(処置当たりn=6)の空腹時血中グルコースプロファイルは、低用量療法マウス(処置当たりn=6)よりも有意に良好であったが、高用量であっても、rAAV−GPEで処置したマウスでは有意に高いグルコースレベルが持続し、6時間の絶食中、野生型レベルで安定化し、一方、rAAV−miGPEで処置したマウスでは、はるかに低い、野生型レベルの60%でプラトーに達した(図8A)。高用量のrAAV−GPEで処置したマウスおよびrAAV−miGPEで処置したマウスは同様に24時間の絶食を持続させることができたが、空腹時血中グルコースレベルは、rAAV−GPEで処置したマウスにおいて、rAAV−miGPEで処置したマウスよりも有意に高かった(図8B)。要約すると、rAAV−GPEで処置したG6pc−/−マウスは、rAAV−miGPEで処置したG6pc−/−マウスよりも野生型に近く、より絶食に耐えることができた。
スタッファー配列を有するAAVベクターとスタッファー配列を有さないAAVベクターの比較
この実施例では、G6Pase−αを発現するAAVベクターにおけるイントロンに隣接するスタッファーヌクレオチド配列が効率的な肝臓の形質導入のために重要であるという所見を記載している。
コドン最適化されたG6PCをコードするAAVベクターの生成
この実施例では、コドン最適化されたG6PCを含有するAAVベクターの構築および特徴付けを記載している。
コドン最適化されたヒトG6Paseを発現する組換えAAVベクターの有効性の評価
本実施例では、GSD−IaマウスにおけるrAAV8−GPE−G6Paseによって媒介される遺伝子送達の有効性とrAAV8−GPE−co−G6Paseによって媒介される遺伝子送達の有効性を比較するための試験を記載する。
AAVベースの遺伝子療法を使用したヒトGSD−Iaの処置
この実施例では、G6PCをコードするAAVベクターをGSD−Iaの処置のために臨床使用する例示的な方法を記載している。
Claims (18)
- 配列番号3のヌクレオチド182〜4441または配列番号1のヌクレオチド182〜4441を含む組換え核酸分子。
- 配列番号3のヌクレオチド17〜4819または配列番号1のヌクレオチド17〜4819を含む、請求項1に記載の組換え核酸分子。
- 配列番号3または配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項1または請求項2に記載の組換え核酸分子。
- 請求項1から3までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項4に記載のベクター。
- 前記AAVベクターがAAV血清型8(AAV8)ベクターである、請求項5に記載のベクター。
- 請求項1から3までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子または請求項4から6までのいずれか一項に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項1から3までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む組換えAAV(rAAV)。
- 前記rAAVがrAAV8である、請求項8に記載のrAAV。
- 薬学的に許容される担体中に請求項8または請求項9に記載のrAAVを含む組成物。
- 静脈内投与用に製剤化されている、請求項10に記載の組成物。
- 糖原病と診断された対象を処置する方法であって、糖原病Ia型(GSD−Ia)の対象を選択するステップと、前記対象に、治療有効量の請求項8もしくは請求項9に記載のrAAVまたは請求項10もしくは請求項11に記載の組成物を投与するステップとを含む方法。
- 前記rAAVを静脈内に投与する、請求項12に記載の方法。
- 前記rAAVを、約1×1011〜約1×1014ウイルス粒子(vp)/kgの用量で投与する、請求項12または請求項13に記載の方法。
- 前記rAAVを、約1×1012〜8×1013vp/kgの用量で投与する、請求項14に記載の方法。
- 前記rAAVを、約1×1013〜6×1013vp/kgの用量で投与する、請求項14に記載の方法。
- 前記rAAVを投与するステップが、単回用量のrAAVの投与を含む、請求項12から16までのいずれか一項に記載の方法。
- rAAVを投与するステップが、複数回用量のrAAVの投与を含む、請求項12から16までのいずれか一項に記載の方法。
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