CN102448501A - 治疗肝硬化和肝纤维化的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过使用含有编码IGF-I基因的病毒载体治疗肝硬化和肝纤维化的方法。本发明公开了细小病毒载体和基于SV40的载体,以及其治疗肝硬化的用途和基因疗法以及制备所述病毒载体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因疗法领域,更特别的,涉及通过使用病毒载体治疗肝硬化和肝纤维化的方法。
技术背景
肝移植是治疗罹患晚期肝硬化患者的唯一选择。由于手术禁忌症和器官稀缺,此方法只能够应用于少数患者。事实上,在美国等候名单上包括约12500患者,其进行移植的时间中数约为300天,在等候名单上有45%以上的患者超过两年,其中死亡率每年达130人/1000个患者(Freeman R.B.等,Am J.Transplant.2008;8:958-976)。
胰岛素样生长因子I(IGF-I)是强效细胞保护和合成代谢激素。血清IGF-I主要源于肝,而且必然循环调节IGF-I生物活性的一组结合蛋白(IGFBPs)(Adamo M等,1989,Endocrinology,124:2737-2744和Mohan S等,2002,J.Endocrinol.,175:19-31)。IGFBPs的降解释放能够与IGF-I受体(IGF-IR)相互作用并活化的游离IGF-I。IGF-I还能够结合胰岛素受体,而胰岛素能够活化IGF-IR,但对它们的同源受体亲和度要高100至1000倍(Nitert MD等,2005,Mol.Cell.Endocrinol.229:31-37)。与IGF-IR的相互作用导致MAP激酶和PI3激酶级联的活化,其调节参与细胞存活、生长和分化的基因(Riedemann J.等,2006,Endocr.Relat.,Cancer.13 Suppl 1:S33-43)。
在肝硬化中,由于肝细胞功能不全,IGF-I水平有明显减少。这种激素缺乏可以对存在于肝硬化中的全身代谢紊乱发挥作用(Conchillo M.等,2005;43:630-636和Lorenzo-Zuniga V.等,2006,Gut 55:1306-1312)。事实上,使用重组IGF-I(rIGF-I)对肝硬化鼠的治疗促进了重量增加、氮贮留和营养物的肠吸收(Castilla-Cortazar I.等,2000,Hepatology,31:592-600)。另外,已经示出rIGF-I在肝硬化鼠中发挥保肝护肝活性(Castilla-Cortazar I.等,1997,Gastroenterology,113:1682-1691和Muguerza B,等,2001,BiochimBiophys Acta.1536:185-195)。而且,在肝硬化患者体内每日使用100μg/kgbw剂量的rIGF-I的近期临床试验试点导致了血清白蛋白的显著升高并提高了Child-Pugh评分(Conchillo M.等,2005,J.Hepatol.43:630-636)。然而,因为需要大量rIGF-I,在肝硬化中rIGF-I疗法的潜在优势被治疗的高额成本抵消。
作为直接施用IGF-I的另一种可选方案,已经提出了使用包含编码IGF-I的多核苷酸的病毒载体。Vera M.等(Gene Ther.,2007,14:203-210)已经描述了将编码IGF-I的重组猿猴病毒40载体注入健康鼠中能够保护肝脏不受CCl4诱导的肝损伤。Sobrevals等(Molecular Therapy Volume 16,Supplement1,May 2008,S145)已经描述了施用编码IGF-I的重组猿猴病毒40载体可以恢复CCl4诱导的肝硬化的部分效果。然而,并非所有涉及病毒载体的结果都提供了阳性结果。比如,Zaraitegui等(J.Physiol.Biochem.,2002,58:169-176)已经描述了对患有CCl4诱导肝硬化的鼠进行肌肉内施用编码IGF-I的腺伴随病毒没有得到肝损伤的任何显著改善。
因此,本领域中需要用于治疗肝硬化的改进的IGF-I递送。
发明内容
第一方面,本发明涉及包含编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列的病毒基因组,该序列可操作地与肝特异性启动子连接。
第二方面,本发明涉及可通过根据本发明在合适的包装细胞内表达病毒基因组获得的病毒粒子。
另一方面,本发明涉及根据本发明用作药物的病毒粒子。在还一些方面,本发明涉及包含如权利要求9所述的病毒粒子和药学上可接受的载体的药物组合物,以及用于治疗和/或预防肝硬化或肝纤维化的方法,其包含向对其所需的受试者施用权利要求8或9所述的病毒粒子。
另一方面,本发明涉及用于治疗和/或预防肝硬化或肝纤维化的方法,其包含向需要其的受试者施用包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的重组细小病毒。
另一方面,本发明涉及用于制备重组AAV病毒粒子的方法,包含以下步骤:
(i)使细胞接触
(a)第一核酸序列,包含:
i.包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,和
ii.位于(i)中定义的表达框的两侧的AAV 5’-ITR和3’-ITR
(b)编码AAV rep蛋白的第二核酸序列
(c)编码AAV cap蛋白的第三核酸序列,和任选地,
(d)编码AAV依赖其复制的病毒和/或细胞功能的第四核酸序列和
(ii)从细胞中回收重组AAV病毒粒子。
在还另一方面,本发明涉及用于制备重组SV40病毒粒子的方法,包含
-使细胞与包含复制缺陷的SV40基因组的多核苷酸接触,该基因组包含表达框,其包含编码IGF-I或其同功能变体的序列,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,而且其中在足以使所述多核苷酸进入细胞内的条件下细胞表达SV40基因,该SV40基因补足所述多核苷酸的复制缺陷,和
-从细胞中回收重组SV40病毒粒子。
附图说明
图1.建立的肝硬化模型的分析。A.用于模型分析而施行的实验的示意图。B.转氨酶的分析。在标明的时间上从健康鼠或肝硬化对照动物的血清中评估转氨酶(AST、ALT和ALP)。C和D.肝纤维化的评定。在标明的时间上使用天狼猩红(C)染色和由图像分析(D)定量细胞外沉积。
图2.用于评估dsAAVIGF-I在肝硬化中的效果而施行的实验的示意图。诱导8周的肝硬化,处死动物,并在施用载体4天、2周、8周、16周和1年后评估血样。
图3.在IGF-I治疗的肝和对照中IGF-I表达的分析。通过qRT-PCR(A)或ELISA(B和C)从健康或肝硬化对照动物(Ci)或从标明的时间上用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)治疗的动物中获得的肝(A和B)或血清(C)定量IGF-I mRNA(A)和蛋白(B和C)。同样通过RT-PCR对来自用于上述IGF-I的动物组的肝进行定量。
图4.来自IGF-I治疗的鼠和对照的血清参数的分析。在来自健康鼠、来自肝硬化对照动物(Ci)或来自标明的时间上用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)治疗的肝硬化动物的血清中评估转氨酶(AST、ALT和ALP)(A)、胆红素(B)和白蛋白(C)。
图5.在IGF-I治疗的鼠和对照中肝纤维化的评定。使用天狼猩红(A)染色和通过图像分析(B)定量细胞外沉积。通过qRT-PCR定量I型胶原(C)和IV型胶原(D)mRNA。所有样品从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从标明的时间上用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)治疗的肝硬化动物中获得。
图6.在IGF-I治疗的肝和对照中MMPs和MMP活性表达的分析。使用荧光底物(A)测量MMP活性,通过ELISA定量MMP2(B)和MMP9(C)蛋白,并通过qRT-PCR从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量MMP 1(D)、2(E)、9(F)、14(G)mRNA和TIMP2(H)。
图7.在IGF-I治疗的动物和对照中致纤维性因子(profibrogenicfactor)、TNFα和IL6的分析。通过免疫组织化学(A)检测或通过qRT-PCR(B)从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量αSMA蛋白(A)和mRNA(B)。在这些动物中,在肝(C和D)或血液(E)中也分析了TGFβmRNA(C)和蛋白(D和E),并通过qRT-PCR定量肝CTGF(F)、PDGF(G)、VEGF(H)、双调蛋白(AR、I)、TNFα(J)和IL6(K)mRNA。
图8.在IGF-I治疗的动物和对照中HGF、HNF4α和WT的分析。通过qRT-PCR从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量HGF(A)、HNF4α(B)和WT-1mRNA(C)。
图9.在IGF-I治疗的动物和对照中增殖的分析。从组织学样品(A)中定量Ki67染色,并通过qRT-PCR从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+Luc)或dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量PCNA mRNA。
图10.在用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治疗的鼠和对照中肝纤维化的评定。用天狼猩红染色并通过图像分析(A和B)定量细胞外沉积。通过qRT-PCR定量I型胶原(C)mRNA和IV型胶原(D)mRNA。所有样品从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+AAVLuc)、dsAAVIGF-I(Ci+AAVIGF-I)、SVLuc(Ci+SVLuc)或SVIGF-I(Ci+SVIGF-I)在标明的时间上治疗的肝硬化动物中获得。
图11.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治疗的鼠和对照中IGF-I表达的分析。通过Elisa(A和B)或qRT-PCR(C)从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+AAVLuc)、SVIGF-I(Ci+SVIGF-I)或dsAAVIGF-I(Ci+AAVIGF-I)在标明的时间上治疗的肝硬化动物中获得的肝中定量总(A)和游离(B)IGF-I蛋白以及mRNA(C)。
图12.用SVIGF-I、AAV-IGF-I治疗的鼠和对照中活化的HSC的分析。通过免疫组织化学(A)检测并通过qRT-PCR(B)从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+AAVLuc)、SVIGF-I(Ci+SVIGF-I)或dsAAVIGF-I(Ci+AAVIGF-I)治疗4天(A和B)或8周(B)的肝硬化动物中获得的肝中量化αSMA蛋白(A)和mRNA(B)。
图13.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治疗的鼠和对照中TGFβ、CTGF和VEGF分析。通过qRT-PCR(A)或ELISA(B和C)从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+AAVLuc)、SVIGF-I(Ci+SVIGF-I)或dsAAVIGF-I(Ci+AAVIGF-I)治疗4天或8周的肝硬化动物中获得的肝(A和B)或血清(C)中定量TGFβmRNA(A)和蛋白(B和C)。
图14.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治疗的鼠和对照中HGF和HNF4α的分析。从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc(Ci+AAVLuc)、SVIGF-I(Ci+SVIGF-I)或dsAAVIGF-I(Ci+AAVIGF-I)治疗4天或8周的肝硬化动物中分离的肝中定量HGFmRNA(A)和HNF4αmRNA(B)。
图15.肝IGF-I表达和活性分析。A:在治疗后4天或8周在肝提取物中IGF-ImRNA的表达水平。B:在施用载体(低剂量4.8x 1010vp/鼠)后16周在肝提取物中IGF-I mRNA的表达水平。C:在肝提取物中IGF-I蛋白水平。D和E:治疗后4天定量总血清IGF-I(D)和游离血清IGF-I(E)水平;在ssAAVLuc的情况下,示出的IGF-I水平对应高剂量1.2x 1012vp/鼠和极低剂量9.7x 109vp/鼠。F:在治疗后4天或8周在肝提取物中IGF-IBP3mRNA的表达水平。G:在施用载体(低剂量4.8x 1010vp/鼠)后16周在肝提取物中IGF-IBP3mRNA的表达水平。H:在肝提取物中IGF-I受体(IGF-IR)mRNA的表达水平。通过qRT-PCR定量所有mRNA表达水平,并通过ELISA定量IGF-I蛋白水平。三角形表明剂量递减。
图16.血清转氨酶的分析。在施用载体后4天(A)、8周(B)、12周(C)和1年(D)在血清中定量转氨酶水平(AST、ALT和ALP)。在第12周,示出的水平对应于低剂量载体(4.8x 1010vp/鼠)。在第1年,示出的水平对应于高剂量载体(1.2x 1012vp/鼠)。三角形表明剂量递减。
图17.血清胆红素的分析。在施用载体后4天(A)、8周(B)、12周(C)和1年(D)在血清中定量胆红素水平。在第12周,示出的水平对应于低剂量载体(4.8x 1010vp/鼠)。在第1年,示出的水平对应于高剂量载体(1.2x 1012vp/鼠)。三角形表明剂量递减。
图18.血清白蛋白的分析。在施用载体后4天(A)、8周(B)、12周(C)和1年(D)在血清中定量白蛋白水平。在第12周,示出的水平对应于低剂量载体(4.8x 1010vp/鼠)。在第1年,示出的水平对应于高剂量载体(1.2x 1012vp/鼠)。三角形表明剂量递减。
图19.肝纤维化的评定。通过在用天狼猩红(A和C)染色的组织样品中细胞外沉积的图像分析定量;通过qRT-PC在肝组织中I型胶原(B和D)和IV型胶原(C和F)mRNA的表达水平定量来评估肝纤维化。示出的数据对应于治疗后8周(A至C)和治疗后16周(D至F)采集的样品。在后一种情况下,示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。三角形表明剂量递减。
图20.MMPs和MMP抑制剂的分析。在治疗后8周(A至H)或16周(I-M)获得肝提取物样品。ssAAVIGF-I的E和F示出数据对应于高剂量和极低剂量。在后一种情况下,示出的数据对应于低剂量(4.8x 1010vp/鼠)ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量MMP1(A,I)、MMP2(B,J)、MMP9(C,K)、MMP14(D,L)和TIMP-2(E,M)的mRNA表达。通过ELISA定量MMP2(F)和MMP9(G)蛋白水平。还评估了总MMP活性(H)。三角形表明剂量递减。
图21.肝星状细胞(HSCs)的分析。在治疗后8周(A-B)或16周(C)获得的肝样品中分析αSMA表达。在后一种情况下,显示的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。A:通过αSMA特异性免疫组织化学定位肝组织中的αSMA。B和C:通过qRT-PCR定量αSMA mRNA。三角形表明剂量递减。
图22.炎症和致纤维性因子的分析。在治疗后8周(A、C、E、G、I、K和M)或16周(B、D、F、I、J、L和N)获得肝提取物样品。在后一种情况下,示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量TGFβ、TNFα、IL-6、CTGF、VEGF、PDGF和双调蛋白(AR)mRNA的表达水平。三角形表明剂量递减。
图23.肝细胞生长因子HGF的分析。在治疗后4天(A-B)、8周(C-D)和16周(E)获得肝提取物样品。A和B示出的ssAAVIGF-I数据对应于高剂量和极低剂量。在后一种情况下,示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量HGF mRNA表达(A、C和E);通过ELISA定量HGF蛋白水平(B和D)。三角形表明剂量递减。
图24.分化因子的分析。在治疗后4天(A)、8周(B,D)和16周(C,E)获得肝提取物样品。第4天示出的ssAAVLuc剂量对应于极低剂量。第16周示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量成熟因子HNF4a(A、B和C)和分化因子WT-1(D和E)mRNA的表达水平。三角形表明剂量递减。
图25.增殖的分析。在治疗后4天获得的肝组织样品中Ki67染色细胞核的定量。B、C和D:通过qRT-PCR在治疗后4天(B)、8周(C)或16周(D)获得的肝提取物样品中定量增殖因子PCNA mRNA的表达水平。第4天示出的ssAAVLuc数据对应于极低剂量。第16周示出的数据对应于低剂量的ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。三角形表明剂量递减。
发明详述
本发明的作者已经观察到,对患有既定肝硬化的鼠施用编码IGF-I的病毒载体(其中编码IGF-I的多核苷酸在肝特异性启动子的控制下)激活了强大的组织修复程序,其特征在于刺激纤维分解、下调致纤维性因子并诱导细胞保护分子。这些改变与肝结构和肝细胞功能的明显改善有关。这些发现表明,用AAV载体将IGF-I基因向硬化肝的转移可以是患者的潜在治疗选择,所述患者罹患晚期肝硬化而不能接受肝移植或在等候移植的名单上病情恶化。
病毒基因组
本发明的作者已经观察到,使用病毒载体(其中编码IGF-I的序列在肝特异性启动子的控制下)将IGF-I转移到硬化肝中导致肝功能改善并降低肝纤维化(参见本发明的实施例3和10)。因此,第一方面,本发明涉及包含编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列(其可操作地与肝特异性启动子连接)的病毒基因组。
如本文所使用的,术语“病毒基因组”是指包含一个或多个异源性核苷酸序列的重组病毒基因组(即病毒DNA)。优选地,所有其他结构性和非结构性编码序列都不存在于病毒载体中,因为它们能够通过载体,如质粒或通过将序列稳定并入包装细胞系中反式提供。载体可以用于在体外、在体内或在活体外将DNA转移到细胞中。在本发明中适合使用的病毒基因组包括但不限于,腺病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体,包括基于痘病毒的载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、甲病毒载体或杆状病毒载体、小核糖核酸病毒载体、疱疹病毒载体,包括EBV载体(包括慢病毒载体、基于MMLV的载体)。
本文中使用的术语“核苷酸序列”与“多核苷酸”可交换使用,涉及任何长度的由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸组成的任何聚合形式的核苷酸。此术语包括单链和双链多核苷酸以及修饰的多核苷酸(甲基化的、保护的,等等)。
如本文所使用的,术语“IGF-I”与术语“胰岛素样生长因子I”和生长调节素C可交换使用,涉及多肽家族,其特征在于该多肽家族示出了胰岛素样效果和胰岛素样结构,与胰岛素共享近50%的氨基酸同源性。此外,通过三维建模,已经示出了IGF的结构与作为单链肽的胰岛素原相似,通过三个二硫桥键交联并由B链样氨基末端部分(B域)、连接肽(C域)和A链样部分(A域)组成。另外,存在在胰岛素原中未发现的羧基端延伸(D域)。IGF-I多肽还包含另一个在胰岛素原中未发现的羧基末端延伸,已经命名为E域。
用于本发明的合适的IGF-I分子包括但不限于:
-在NCBI上以登录号NP_001104753(SEQ ID NO:1)描述的多肽的氨基酸1至158、49至158或49至116,分别对应于预前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型1。
-在NCBI上以登录号NP_001104754(SEQ ID NO:2)描述的多肽的氨基酸1至137、33至137或33至102,分别对应于预前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型2。
-在NCBI上以登录号NP_001104755(SEQ ID NO:3)描述的多肽的氨基酸1至195、49至195或49至118,其分别对应于预前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型3。
本发明还仔细考虑了来自不同动物种的编码IGF-1的多核苷酸的用途,如但不限于:马鹿胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA(GenBank登录号U62106);马胰岛素样生长因子I前体(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号U28070);山羊mRNA胰岛素样生长因子I(GenBank登录号D11378);兔胰岛素样生长因子I前体(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号U75390);猪胰岛素样生长因子I(pIGF-I)mRNA,(GenBank登录号M31175);绵羊胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号M89787);人胰岛素样生长因子(IGF-I)IA和IB基因,外显子1,(GenBank登录号M12659和M77496);鼠胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号M15480);鸡胰岛素样生长因子(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号M32791和M29720);大马哈鱼胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号M32792);非洲爪蟾胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA,(GenBank登录号M29857)。
技术人员将会理解的是,IGF-I以前体形式合成,一旦进入分泌途径便通过信号肽酶首先经历裂解步骤裂解产生前IGF-I,然后通过其C端区域的内切蛋白酶解处理而变为成熟IGF-I。因此,本发明载体中存在的核苷酸序列可以编码全长前体形式,其然后应该通过基于IGF-I内源性信号肽存在的靶细胞机制处理。可选地,还可能包括编码融合于异源信号序列的前IGF-I的多核苷酸。如本文所使用的,表述“信号序列”是指在结构基因5′端的DNA序列,其与该基因一起转录并翻译。前导序列通常使蛋白质具有n端肽延伸,有时称为前序列。对指定分泌到细胞外介质或膜的蛋白,该信号序列将蛋白引入内质网中,其从当中释放到适当的终点。前导序列正常地由人造地源于不同基因序列或从不同基因序列分离的所需的核酸编码。适于作信号序列用于促进本发明的多核苷酸分泌的合适的异源性序列包括凝溶胶蛋白、白蛋白、血纤蛋白原的信号序列,除了别的以外,来自组织纤维蛋白溶酶原活化因子、胰岛素和神经生长因子(NGF)的信号肽。
技术人员还会理解的是,只要病毒基因组的长度不超过病毒衣壳的包装大小限度,本发明的病毒基因组可以包含编码IGF-I的部分或全部基因组序列,在此情况下,IGF-I的编码区将被内含子区域隔开。
本发明还仔细考虑了病毒基因组,其包含编码本领域已知的IGF-I变体和片段的序列,如由Sara,V.R.等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:4904-4907)、Ballard,F.J.等(Biochem.Biophys.Res.Commun.1987,149:398-404);Bayne等(J.Biol.Chem.1988,263:6233-6239);Sara V.R.等(Biochem.Biophys.Res.Commun.,1989,165:766-771);Forsberg等,1990,Biochem.J.271:357-363);美国专利号4,876,242和5,077,276;和国际专利公开号WO87/01038和WO89/05822所描述。代表性类似物包括具有谷氨酸-3缺失的成熟分子的类似物、具有从N末端切断最多达5个氨基酸的类似物、具有切断最初的3个N端氨基酸(称为脱(1-3)-IGF-I、脱IGF-I、tIGF-I或大脑IGF)的类似物和包括替换人IGF-1最初的16个氨基酸的人类胰岛素B链的最初的17个氨基酸的类似物。
因此,本发明应该解释为包括编码IGF-I的同功能变体的DNA。如本文所使用的,术语“同功能变体”涉及能够通过将一个或多个核苷酸插入序列中、将一个或多个核苷酸添加入序列任何端或序列中,或缺失序列任何端或序列中的一个或多个核苷酸方式从如上定义的IGF-I序列中获得的序列的任何多肽,其大体上保留了IGF-I的生物活性。用于确定变体是否保留天然IGF-I生物活性的方法对技术人员是众所周知的,其包括如Canalis等(J.Clin.Invest.,1980,66:709-719)所描述的在培养的鼠颅顶中测定DNA和蛋白合成,如Jennings等(J.Clin.Endocrinol.Metab.,1980,51:1166-70)所描述的刺激在鸡软骨中硫酸盐和胸腺嘧啶脱氧核苷的摄取,或如Bayne等(J.Biol.Chem.,1988,263:6233-6239)所描述的刺激在鼠克隆主动脉平滑肌细胞系A10中的DNA合成。
可以通过在用于产生IGF-I的宿主细胞中占密码子偏爱性的多核苷酸内替换核苷酸来获得IGF-I变体。可以通过计算机算法确定这种“密码子最优化”,所述计算机算法中合并了密码子频率表,如威斯康辛大学PackageVersion 9.0、Genetics Computer Group、Madison、Wis提供的用于高表达细菌基因的密码子偏爱性的“Ecohigh.Cod”。其他有用的密码子频率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。
可以通过使保守氨基酸改变并在上述功能性试验之一或本领域中已知的另一个功能性试验中测试得到的变体来产生IGF-I变体。保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的互换性。例如,具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸;具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺;具有芳香族侧链的氨基酸族是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸。具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
IGF-I的同功能变体包括大体上与天然IGF-I同源的多肽。如本文所使用的,表述“大体上同源”涉及上述任何核苷酸序列,其核苷酸序列与本发明的核苷酸序列有至少60%、有利地至少70%、优选地至少85%,和更优选地至少95%的同一度。典型地,大体上与本发明的核苷酸序列同源的核苷酸序列能够基于在所述核苷酸序列中含有的信息,从本发明的多肽生产者有机体中分离,或其基于上述DNA序列构建。使用计算机算法和本领域技术人员众所周知的方法确定两个多核苷酸之间的同一度。优选地通过使用BLASTN算法【BLAST Manual,Altschul,S.,等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)】确定两个氨基酸序列之间的同一性。使用BLAST和BLAST 2.0,用本文所述的参数来确定序列同一性百分比。进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心公开获得的。这种算法涉及通过识别在查询序列中长度W的短字来首先识别高分值序列对(HSP),当将其与数据序列中相同长度的字比对时,其匹配或符合某些正值阈值分值T。T称为相邻字分值阈值(Altschul等,如上所述)。这些初始相邻字击(word hit)作为种子用于启动搜索以找到含有它们的较长HSP。字击沿每个序列双向延伸,直到累积比对分值能够增加。对核苷酸序列,使用参数M(匹配残基对的奖励分值;总是0)和N(不匹配残基的惩罚分值;总是0)计算累积分值。对氨基酸序列,使用得分矩阵来计算累计分值。当:通过量X累积比对分值从最大获得值下降时;由于一个或多个负评分的残基比对的累积,累积分值变成0或以下时;或序列达到末端时,字击在每个方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望(E)为10、M=5、N=-4和双链比较作为默认值。对氨基酸序列,BLASTN程序使用字长为3、期望(E)为10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sd.USA,1989,89:10915)比对(B)为50、期望(E)为10、M=5、N=-4和双链比较作为默认值。
如本领域技术人员将会理解的是,使用常规技术,如诱变,包括建立分立点突变或通过截断能够产生IGF-I的变体或片段。比如,突变能够产生大体上保留原状或其起源的仅仅是多肽生长因子的生物活性子集的变体。
如本文所使用的,术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件的功能性关系的连接。当核酸置于与另一个核酸序列的功能性关系中时,其被可操作地连接。比如,如果转录调控序列影响编码序列的转录,则其可操作地与编码序列连接。可操作地连接是指连接的DNA序列是典型邻接的,在其中有必要连接两个邻接的并在阅读框中的蛋白编码区。
如本文所使用的,术语“启动子”或“转录调控序列”是指核酸片段,其具有控制一个或多个编码序列转录的功能,并位于编码序列转录起始位点的转录方向的上游,而且通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活剂蛋白结合位点),以及本领域技术人员已知的任何其他核苷酸序列(其直接或间接调节开始于启动子的转录量,所述启动子包括,例如弱化子或增强子,还包括沉默子)的存在来结构性地识别。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子受生理或发育调节,例如通过使用化学诱导剂。“组织特异性”启动子是指仅在特异性类型的组织或细胞中有活性的启动子。也就是说,在本发明的上下文中,组织特异性启动子是在一个或几个(例如两个、三个或四个)特殊组织中要比在其他组织中更有活性的启动子(即,能够较高地激发允许与其在组织中可操作连接的编码序列的表达的启动子,与任何其他组织比较,其特异于该组织)。典型地,“组织特异性”启动子中的下游基因是在其具有特异性的组织中比在其他任何组织中具有更高程度的活性。在这种情况下,该启动子在除了其具有特异性的组织之外,在任何其他组织中可能极少或大体上没有活性。
在本发明的上下文中,肝特异性启动子是与其在体内任何其他组织中的活性相比,在肝中更有活性的启动子。典型地,肝特异性启动子的活性在肝中比在其他组织中高很多。例如,这种启动子可以具有至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的活性(例如,通过其在给定组织中驱动表达而在其他细胞或组织中阻止表达的能力来确定)。因此,肝特异性启动子在肝中允许连接的基因的活性表达,并在其他细胞或组织中阻止表达。
合适的肝特异性启动子包括但不限于,α1抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II启动子、因子VIII(FVIII)启动子、HBV基本核心启动子(BCP)和PreS2启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、肝控制区(HCR)-ApoCII杂交启动子、HCR-hAAT杂交启动子、与鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件结合的AAT启动子、载脂蛋白E启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)启动子、载脂蛋白H(ApoH)启动子、转铁蛋白启动子、运甲状腺素蛋白启动子、α纤维蛋白原和β纤维蛋白原启动子、α1抗胰凝乳蛋白酶启动子、α2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、纤维蛋白溶酶原启动子、补体蛋白(Ciq、Cir、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、补体因子I和因子H)的启动子、C3补体活化剂和α1酸糖蛋白启动子。另外的组织特异性启动子可以在组织特异性启动子数据库TiProD(Nucleic Acids Research,J4:D104-D107(2006)中找到。
在优选的实施方式中,肝特异性启动子是包含肝特异性增强子和肝特异性启动子如肝控制区(HCR)-ApoCII杂交启动子、HCR-hAAT杂交启动子、与鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件结合的AAT启动子和载脂蛋E启动子的杂交启动子。在优选的实施方式中,杂交启动子包含鼠白蛋白基因增强子(Ealb)和鼠α1抗胰蛋白酶(AAT)启动子(Ealb-AATp)。在还更优选的实施方式中,启动子区对应于SEQ ID NO:4序列。
在优选的实施方式中,肝特异性启动子是诱导型肝特异性启动子,例如四环素诱导的肝特异性启动子,如由Wang等(Nature Biotech.,1997;15:239-43)所描述的启动子、由Burcin等,(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96:355-60)所描述的腺病毒介导的可调节的肝特异性启动子、由Manickan等(J.Biol.Chem.,2001,276:13989-13994)所描述的四环素调节的肝特异性启动子、由Han等(Molecular Therapy,2005,11,S161)所描述的启动子、由Tietge等(J.Gen.Medicine,2003,5:567-575)所描述的用于体内递送至肝的四环素调节的腺病毒表达系统、由Crettaz等(Molecular Therapy(2006)13,S224)所描述的米非司酮(RU-486)诱导的肝特异性启动子,等等。
能够插入到本发明的病毒基因组的其他元件包括围绕编码IGF-I及其变体的核苷酸序列的起始密码子的Kozak共有序列。Kozak共有序列在本文中定义为GCCRCC(AUG)A(SEQ ID NO:5),其中R是嘌呤(即腺嘌呤核苷A或鸟嘌呤核苷G),其中(AUG)代表胆色素原脱氨酶编码序列的起始密码子。Kozak共有序列可以另一个GCC三联密码为先导。
本发明的病毒基因组还可以包含与编码IGF-I或其同功能变体的核酸可操作连接的聚腺苷酸化信号。如本文所使用的,术语“聚腺苷酸化信号”涉及调节伸展到mRNA3’端的多腺茄碱的连接物的核酸序列。合适的聚腺苷酸化信号包括SV40早期聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、HSV胸苷激酶聚腺苷酸化信号、鱼精蛋白基因聚腺苷酸化信号、腺病毒5EIb聚腺苷酸化信号、牛生长激素聚腺苷酸化信号、人类变体生长激素聚腺苷酸化信号等等。
在优选的实施方式中,本发明的病毒基因组是多瘤病毒基因组。多瘤病毒,如SV40,已知感染非分裂以及活跃分裂细胞,还已知是非免疫原性的,其允许重复施用于相同个体。另外,其允许转基因的长期表达。多瘤病毒包括基于多瘤属的病毒的任何载体,并包括JC病毒、BK病毒、KI病毒、Wu病毒、Merkel细胞多瘤病毒和猿空泡形成病毒40(以下称SV40)。在优选的实施方式中,多瘤病毒基因组是SV40基因组。
SV40包含5.25千碱基、长的环状双链DNA基因组,其由两个调节区、启动子区/起始区和聚腺苷酸化区组成。启动子区/起始区长500个碱基对并包含两个反向启动子,两侧连着复制和包装信号中心起点的早期启动子和晚期启动子(分别是SVEP和SVLP)。聚腺苷酸化区长100个碱基对,并含有早期和晚期转录的聚腺苷酸化信号。早期启动子激发对于晚期启动子的病毒复制和活化的所必须的小、中、大T抗原(分别是stag、mtag和Tag)的表达。晚期启动子激发病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的表达。
本发明仔细考虑了通过包含肝特异性启动子和编码IGF-I或其同功能变体的序列的多核苷酸置换SV40的至少一个表达框。技术人员将会理解的是,包含肝特异性启动子和IGF-I编码序列的多核苷酸能够通过置换早期启动子和小、中、大T抗原而被插入。可选地,包含肝特异性启动子和IGF-I编码序列的多核苷酸可以通过置换晚期启动子区和编码病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的序列插入。本发明还仔细考虑了,本发明将包含缺乏所有编码序列(无内脏(gutless)SV40基因组)、缺乏除了包含必须用于载体复制和包装的控制元件的区之外的所有病毒基因组的SV40载体。因此,最小SV40基因组源于该区并含有至少完整的复制起点。本发明合适的SV40载体包括pSVT7和pMT2。
在另一实施方式中,本发明的病毒基因组是细小病毒基因组。如本文所使用的,术语“细小病毒”包含细小病毒科家族,其包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主的细小病毒包括细小病毒属、红细胞病毒属、浓核病毒属、重复病毒属和对立病毒(Contravirus)属的成员。典型的自主细小病毒包括但不限于,鼠细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、.美洲家鸭细小病毒、B19病毒和现在已知或以后发现的任何其他自主细小病毒。其他自主细小病毒对本领域技术人员已知。参见例如,BERNARD N.FIELDS等,VIROLOGY,第2卷,第69章(4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。
在另一方面,如可以从它们属的名字推断,依赖病毒属成员是独特的,因为它们通常需要与辅助病毒,如腺病毒或疱疹病毒共同感染才能在细胞培养中有效感染。依赖病毒属包括AAV,其通常感染人类(例如血清1、2、3A、3B、4、5和6型)或灵长类(例如血清型1和4),和感染其他恒温动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊腺病毒伴随病毒)。在Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,”Chapter 69 in FieldsVirology(3d Ed.1996)中描述了关于细小病毒和其他细小病毒属成员的进一步信息。
在还更优选的实施方式中,细小病毒基因组是腺病毒伴随病毒(AAV)基因组。如本文所使用的,术语“腺病毒伴随病毒”(AAV)包括任何AAV血清型。一般地,AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列,提供了相同组的遗传功能,产生了实质上同等生理和功能的病毒粒子,并通过实际上相同的机制复制和装配。特别地,可以实施本发明用于AAV血清型1(AAV1)、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV和现在已知或以后发现的任何其他AAV。参见,例如Fields等,Virology,第2卷,第69章(4th ed.,Lippincott-RavenPublishers)。近来,已经识别出很多推定的新AAV血清型和进化枝(参见,例如Gao等,(2004)J.Virology 78:6381-6388;Moris等(2004)Virology33-:375-383;和表1)。AAV的各种血清型的基因组序列和自主细小病毒以及末端重复序列、Rep蛋白序列和衣壳亚基序列在本领域中已知。这种序列可以在文献或公开数据库如GenBank中发现。参见,例如GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579;它们的公开内容通过引用并入本文以了解细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还参见,例如Srivistava等,(1983)J.Virology 45:555;Chiorini等,(1998)J.Virology 71:6823;Chiorini等,(1999)J.Virology 73:1309;Bantel-Schaal等,(1999)J.Virology 73:939;Xiao等,(1999)J.Virology 73:3994;Muramatsu等,(1996)Virology 221:208;;Shade等,(1986)J.Virol.58:921;Gao等,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854;Moris等,(2004)Virology 33-:375-383;国际专利公开WO00/28061、WO99/61601、WO98/11244;和美国专利号6,156,303;它们的公开内容通过引用并入本文以了解细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。
为方便起见,本发明通过在本文中引用AAV进一步例证和描述。然而,可以理解的是,本发明并不限制于AAV,而是可以同等地应用于其他细小病毒。
所有已知AAV血清型的基因组组织是非常相似的。AAV的基因组是长度不到约5,000个核苷酸(nt)的线性、单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)侧面连着独特的用于编码非结构性复制(Rep)蛋白和结构性(VP)蛋白的核苷酸序列。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端145nt是自补并有组织的,从而可以形成有力的稳定分子内双螺旋形成T形发夹结构。用作病毒DNA复制起点的这些发夹结构,作为细胞DNA聚合酶复合物的引物发挥作用。在哺乳动物细胞内感染wtAAV后,Rep基因(即Rep78和Rep52)分别从P5启动子和P19启动子中表达,而且两个Rep蛋白均具有复制病毒基因组的功能。实际上,Rep ORF的剪接作用导致四个Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)表达。然而,已经示出了在哺乳动物细胞内编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以用于产生AAV载体。而且在昆虫细胞中Rep78和Rep52蛋白足以用于产生AAV载体。
本文的“重组细小病毒或AAV基因组”(或“rAAV基因组”)是指包含一个或多个目的多核苷酸序列、目的基因或“转基因”的载体,其侧面连着至少一个细小病毒或AAV反向末端重复序列(ITR)。当这种rAAV载体存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时,其能够被复制和包装成感染性的病毒颗粒。当rAAV载体合并入较大的核酸构建体(例如染色体中或另一个用于克隆或转染的载体如质粒或杆状病毒中)时,然后rAAV载体典型地指“前载体”,其在AAV包装功能和必要的辅助功能存在的情况下能够通过复制和衣壳化被“救助”。
因此,在另一方面本发明涉及包含如本文上述定义的编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列的核酸构建体,其中该核酸构建体是重组细小病毒或AAV载体,从而包含至少一个细小病毒或AAV ITR。优选地,在核酸构建体中,编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列在侧面某一边连着细小病毒或AAV ITR。可以将任何细小病毒或AAV ITR用于本发明的构建体,包括来自AAV1、AAV2、AAV4和/或AAV5的ITR。AAV2的ITR是最优选的。
可以用于本发明的AAV序列能够源于任何AAV血清型的基因组。一般地,AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有显著同一性的基因组序列,提供了相同组的遗传功能,产生了实质上同等生理和功能的病毒粒子,并通过实际上相同的机制复制和装配。关于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的综述,参见例如GenBank登录号U89790;GenBank登录号J01901;GenBank登录号AF043303;GenBank登录号AF085716;Chlorini等(1997,J.Vir.71:6823-33);Srivastava等(1983,J.Vir.45:555-64);Chlorini等(1999,J.Vir.73:1309-1319);Rutledge等(1998,J.Vir.72:309-319);和Wu等(2000,J.Vir.74:8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是本发明上下文中使用的AAV核苷酸序列的优选来源。优选地,本发明上下文中使用的AAV ITR序列源于AAV1、AAV2和/或AAV4。
尽管优选地,编码衣壳基因的核酸序列通过包装细胞或通过第二载体反式提供,本发明还仔细考虑了AAV基因组,其进一步包含编码一个或多个包装上述多核苷酸序列的衣壳蛋白的序列。然而,本发明上下文中使用的编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列可以从任何已知42血清型,更优选地从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或新研制的通过例如衣壳重组技术或AAV衣壳库中获得的AAV样颗粒中采集。如国际专利公开WO00/28004和Chao等(2000)Molecular Therapy 2:619所描述的,当编码衣壳蛋白的序列源于不同AAV血清型(如ITR)时,AAV基因组已知为“杂交”细小病毒基因组(即,其中AAV衣壳或AAV末端重复是来自不同AAV)。如本文所述,rAAV载体能够是现在已知或以后发现的任何合适的rAAV载体。可选地,编码衣壳基因的序列可以通过将编码所述衣壳蛋白的多核苷酸共转染进入包装细胞来反式提供。在优选的实施方式中,病毒载体包含来自AAV1、AAV2和/或AAV4的ITR和来自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6或AAV8的一个或多个或所有衣壳基因。
如果病毒载体包含编码衣壳蛋白的序列,这些可以修饰从而包含外源靶序列。合适的外源靶序列在以下本发明的病毒粒子的背景下详细描述。
任选地,本发明的AAV基因组可以包含编码Rep蛋白的另外的序列。Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列优选地源自AAV1、AAV2和/或AAV4。AAV Rep和ITR序列在大多数血清型中特别地保守。各种AAV血清型的Rep78蛋白例如具有89%以上同一性,并在AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之间的基因组水平下的总核苷酸序列同一性大约为82%(Bantel-Schaal等,1999,J.Virol.,73:939-947)。此外,已知很多AAV血清型的Rep序列和ITR在哺乳动物细胞内产生AAV颗粒中有效地交叉补充(即,功能性置换)来自其他血清型的相应序列。US2003148506报道了AAVRep和ITR序列还在昆虫细胞内有效地交叉补充其他AAV Rep和ITR序列。
已知AAV VP蛋白确定AAV病毒粒子的细胞营养机能。VP蛋白编码序列明显比在不同AAV血清型中的Rep蛋白和基因的保守度明显较低。Rep和ITR序列交叉补充其他血清型相应序列的能力允许产生包含一个血清型(例如AAV5)的衣壳蛋白和另一个AAV血清型(例如AAV2)的Rep和/或ITR序列的假型rAAV颗粒。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。
典型地,本发明的AAV基因组,除了包含肝特异性启动子和编码IGF-I或其同等功能变的序列的表达框之外,还包含一个或多个以下元件:
-反向末端重复
-不可分解的末端重复
-编码衣壳基因的序列
-完成最小可包装的基因组大小的填充片段序列。
典型地,本发明反向末端重复(ITR)存在于至少两个AAV载体复制中,典型地侧面连着含有异源性序列的表达框。ITR典型地将处于异源性核苷酸序列的5′端和3′端,但不需要与其邻接。末端重复能够彼此相同或不同。术语“末端重复”包括任何病毒末端重复和/或形成发夹结构和起反向末端重复功能的部分的或全部的合成序列,如美国专利号5,478,745中由Samulski等所述的“双D序列”。“AAV末端重复”可以来自任何AAV,包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或现在已知或以后发现的任何其他AAV。AAV末端重复不需要具有野生型序列(例如,野生型序列可以通过插入、缺失、截断或错义突变改变),只要末端重复调节理想的功能,例如复制、切割、病毒包装、整合和/或前病毒救助等等。载体基因组能够包含一个或多个(例如两个)AAV末端重复,其可以相同或不同。此外,一个或多个AAV末端重复能够来自如AAV衣壳的相同AAV血清型,或能够是不同的。在特殊实施方式中,载体基因组包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV12末端重复,特别地来自AAV1、AAV2和/或AAV4。在优选的实施方式中,ITR可以源自AAV2,并可以由SEQ ID NO:6(5’ITR)和SEQ ID NO:7(3’-ITR)定义。
本发明的AAV基因组还含有不可分解的末端重复。如本文所使用的,表述“不可分解的末端重复”是指不能通过AAV Rep蛋白识别和分解(即“带切口的”)的末端重复,以使得末端重复的分解大量地降低(例如与可分解的末端重复相比,降低了至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多)或去除。这种不可分解的末端重复可以是自然发生的末端重复序列(包括其改变的形式)和,例如能够源于细小病毒,包括AAV,或能够来自另一种病毒或,如进一步可选的,能够部分地或全部地合成。不可分解的末端重复可以是通过AAV Rep蛋白不识别的非AAV病毒序列,或其能够是已经修饰的AAV末端重复(例如,通过插入、置换和/或缺失)以使得其不再被AAV Rep蛋白识别。此外,不可分解的末端重复是能够在用于产生病毒载体条件下不可分解的任何末端重复。例如,不可分解的末端重复可以不被用于复制载体基因组的Rep蛋白识别。为了说明,除了不被AAV Rep蛋白识别的细小病毒末端重复,不可分解的末端重复能够是自主细小病毒末端重复或病毒末端重复。在优选的实施方式中,可分解的末端重复和Rep蛋白可以来自一个AAV血清型(例如AAV8),不可分解的末端重复来自不由AAV8Rep蛋白识别的另一个AAV血清型(例如AAV2),以便大量地降低或去除分解。此外,AAV末端重复能够修饰以大量地降低或去除通过AAV Rep蛋白的分解。不可分解的末端重复能够是形成发夹结构的任何反向重复序列,而且不能被AAV Rep蛋白切割。
细小病毒ITR核苷酸序列是典型的回文序列,包含大多互补、对称排列序列,也称为“A”、“B”和“C”区域。ITR作为复制起点发挥作用,在复制中具有“cis”作用的位点,即是用于反作用复制蛋白如识别回文序列和回文序列内部特异性序列的Rep 78(或Rep68)的识别位点。ITR序列对称性的一个例外是ITR的“D”区域。它是独特的(在一个ITR内不具有互补)。单链DNA的切割发生在A和D区域之间的连接处。新DNA合成开始在这个区域。D区域通常地位于回文序列的一边,并为核酸复制步骤提供指向。在哺乳动物细胞中复制的细小病毒典型地具有两个ITR序列。然而,可能设计ITR以使得结合位点在A区域的两条链上,并将D区域对称性放置,各自在回文序列的每一边上。在双链环状DNA模板(即质粒)上,然后在双向上进行Rep78-和Rep68-辅助核酸复制,而且单个ITR足以进行环状载体的细小病毒的复制。因此,能够在本发明的上下文中使用一个ITR核苷酸序列。然而,优选地,使用两个或其他偶数个常规ITR。最优选地,使用两个ITR序列。因此,在本发明中,可以使用至少一个ITR,即可以使用一个ITR,尽管更典型地会使用两个ITR。
在优选的实施方式中,本发明的AAV基因组包含多核苷酸,其包含由肝特异性启动子、编码IGF-I或其同功能变体的序列、聚腺苷酸化信号形成的表达框,其中所述表达框侧面连着AAV ITR。在还更优选的实施方式中,肝特异性启动子是包含白蛋白增强子和α1抗胰蛋白酶启动子区的杂交启动子。
本发明的病毒基因组能够是单链细小病毒载体,如AAV载体。在优选的实施方式中,AAV载体是单链AAV(ssAAV)。如本文所使用的,表述“单链细小病毒载体”涉及在AAV衣壳内包装的单链多核苷酸(典型地,DNA)。如本文所使用的,术语“单链”,当提及核酸分子时,是指与另一个核酸分子杂交并且不具有在生理条件或严格条件下进行分子内杂交的区域的核酸分子。这与作为通过链间碱基对相互作用而结合在一起的双链核酸的双链靶标相反。单链核酸分子是有义链或反义链,因为两条链同样有感染性。
本发明的病毒基因组还能够是如国际专利公开WO01/92551和McCarty等,(2003)Gene Therapy 10:2112-2118所描述的双螺旋(duplexed)细小病毒载体。在本发明的上下文中,术语“双链细小病毒载体”和“双螺旋细小病毒载体”具有相同的意思,而且它们在描述中不分开地使用。在特殊实施方式中,细小病毒载体是AAV载体,优选地是双链AAV。另外,AAV衣壳或载体基因组能够含有其他修饰,包括插入、缺失和/或置换。rAAV载体包含源自,但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12衣壳,包括其修饰形式的AAV衣壳。任选地,衣壳能够是AAV2、AAV3或AAV6衣壳或其修饰形式,例如使用重组技术和AAV衣壳库产生的修饰衣壳。
在本发明的代表性实施方式中,病毒基因组是双螺旋细小病毒载体,其中重组载体基因组包含5′和3AAV末端重复(其是可分解的),编码IGF-I或其功能变体的异源核苷酸序列和不可分解的末端重复。在国际专利公开WO01/92551和McCarty等,(2003)Gene Therapy 10:2112-2118中描述了双螺旋细小病毒载体和它们的制备。
典型地,rAAV载体基因组只保留最小末端重复序列(每个145个碱基)以使能够由载体有效包装的转基因大小最大化。
一般地,双螺旋细小病毒载体是在AAV衣壳内包装的二聚的自补多核苷酸(典型地,DNA)。在某些方面,在衣壳内包装的重组病毒基因组实质上是“捕获”的AAV复制中间体,其不能分解以产生正极链和负极链。双螺旋细小病毒载体表现出规避宿主细胞调节的在常规rAAV载体中固有的互补DNA合成的需要,从而解决了rAAV载体的一个局限。
双螺旋细小病毒载体根本上不同于常规rAAV载体和亲代AAV,因为病毒DNA可以由于链内碱基对形成双链发夹结构,而且使两极的DNA链衣壳化。因此,双螺旋细小病毒载体功能上与双链DNA病毒载体,而不是其起源的AAV相似。这种特征解决了rAAV介导的基因转移的之前存在的识别缺陷,其是所需靶细胞对合成与由AAV正常衣壳化的单链基因组互补的DNA的限制性倾向。
尽管不希望受本发明的任何特殊理论限制,病毒粒子基因组在病毒衣壳内包装时可能以单链形式保留。在病毒感染时从衣壳中释放,其表现出二聚分子通过链内碱基对“突然恢复”或退火以形成双链分子,具有在一端形成共价闭合发夹结构的不可分解TR序列。这种双链病毒DNA避免了宿主细胞介导的第二链合成的需要,其已经假定为AAV转导的限速步骤。
在肝组织细胞实例中,双螺旋细小病毒载体可以是有利的,因为它们可以提供较快开始的基因表达和/或较高水平的基因表达,从而允许较低剂量,其相应地可以导致靶组织中炎症的的可能性和/或程度的降低。
一般地,双螺旋细小病毒载体基因组在5’至3’方向上包含(i)可分解的AAV末端重复,(ii)异源性目的核苷酸序列(编码或非编码链),(iii)不可分解的末端重复,(iv)对(ii)中异源性目的核苷酸序列互补的序列或大体上互补(例如,至少约90%、95%、98%、99%或更多)的序列,和(v)可分解的AAV末端重复。本领域技术人员将会理解的是,载体基因组能够包含其他序列(例如,在上述特异性序列之间的内含子)。
在特殊实施方式中,在每个一半的载体基因组中的序列(例如,全序列或在AAV末端重复和不可分解的末端重复之间的序列)是大体上互补的(即,至少约90%、95%、98%、99%核苷酸序列互补性或更多),以使得载体基因组由于互补序列之间的碱基对可以形成双链分子。换言之,载体基因组实质上是具有通过不可分解的末端重复连结的两等份的反向重复。在特殊实施方式中,载体基因组的两等份(即全序列或在AAV末端重复和不可分解的末端重复之间的序列)是实质上完全自补(即,含有不显著数量的配错碱基)或完全自补的。
在其他实施方式中,异源性目的核苷酸序列的双链(具有或不具有调节元件)是大体上互补的(即,至少约90%、95%、98%、99%核苷酸序列互补性或更多)。在特殊实施方式中,异源性核苷酸序列的双链是实质上完全自补(即,含有不显著数量的配错碱基)或完全自补的。
一般地,双螺旋细小病毒的载体基因组能够含有非互补性位置或区域,其程度使得来自双螺旋细小病毒载体的异源性核苷酸序列的表达比来自相应的rAAV载体的表达增强(例如,较早的开始和/或较高水平的表达)。本发明的双螺旋细小病毒提供了具有双链分子的宿主细胞,其解决了rAAV载体的一个缺陷,即需要宿主细胞以将单链rAAV病毒粒子DNA转化成双链DNA。在病毒粒子DNA内,特别地,在异源性核苷酸序列内非互补性的任何实质性区域的存在可以通过宿主细胞识别,而且可以导致DNA修复机制补充以纠正配错碱基,从而抵消双螺旋细小病毒载体的有利特征,例如降低或去除宿主细胞处理病毒模板的需要。
可以通过本领域已知的任何方法产生不可分解的AAV末端重复。例如,插入末端重复将取代切割位点(即trs)并导致不可分解的末端重复。在末端重复内各种区域或元件的名称在本领域中已知(参见,例如BERNARD N.FIELDS等,VIROLOGY,第2卷,第69章,图5,3d ed.,Lippincott-RavenPublishers和WO01/925551的图6)。插入还能够在末端分解位点(trs)的序列中发生。可选地,插入可以在A元件内的Rep结合元件(RBE)与trs之间的位点上发生(参见,WO 01/925551的图6)。AAV trs位点的核心序列在本领域已知,并已经被描述(Snyder等,(1990)Cell,60:105;Snyder等,(1993)J.Virology 67:6096;Brister和Muzyczka,(2000)J.Virology74:7762;Brister和Muzyczka,(1999)J.Virology 73:9325。例如,Brister和Muzyczka,(1999)J.Virology 73:9325描述了与D元件邻接的3′-CCGGT/TG-5的核心trs序列.。Snyder等(1993)J.Virology 67:6096识别出最小trs序列.3′-GGT/TGA-5′,其大体上与由Brister和Muzyczka确认的序列重复。
插入可以是任何合适长度,其大体上降低(例如至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多)或去除末端重复的分解。插入能够是至少约3、4、5、6、10、15、20或30个核苷酸或更多。对插入的序列大小没有特殊上限,只要获得合适水平的病毒复制和包装(例如,插入能够为长50、100、200或500个核苷酸或更长)。
作为另一个方法,末端重复通过缺失trs位点变成不可分解的。缺失可以延伸1、3、5、8、10、15、20、30个核苷酸或超过trs位点,只要模板保留期望的功能。除了trs位点之外,能够缺失某些或所有D元件(参见,例如McCarty等,(2003)Gene Therapy 10:2112-2118;and WO 01/92551)。缺失能够进一步延伸到A元件中;然而本领域中技术人员将会理解的是,在A元件中保留RBE可以是有利的,例如促进有效包装。A元件中的缺失能够是长度为2、3、4、5、8、10、或15个核苷酸或更多,只要不可分解的末端重复保留任何其他期望的功能:此外,超过末端重复序列外部的D元件(例如,到PCT公开号WO01/925551的图6中D元件的右边)的某些或全部病毒序列能够缺失以降低或防止基因转化过程以纠正改变的末端重复。
作为还另一可选方案,在切割位点上的序列能够突变以降低或大体上去除通过Rep蛋白的分解。例如,A和/或C碱基能够在或临近切割位点处置换成G和/或T碱基。Brister和Muzyczka,(1999)J.Virology 73:9325已经描述了末端分解位点上的置换对Rep切割的的影响。
作为进一步的可选择方案,在包围切割位点的区域中,已经假定形成茎环结构的核苷酸置换还能够用于降低在末端分解位点的Rep切割。本领域技术人员将会理解的是,能够选择在不可分解的末端重复中的改变以维持改变的末端重复的期望功能(如果有的话)(例如,包装、Rep识别和/或位点特异性整合,等等)。
此外,如Samulski等,(1983)Cell 33:135所描述的,能够致使不可分解的末端重复对基因转化过程耐受。在不可分解的末端重复上的基因转化将还原trs位点,其会产生可分解的末端重复。基因转化从可分解的末端重复和改变的末端重复之间的同源性重组得到。降低基因转化的一个方案是产生使用对DNA修复有缺陷的细胞系(例如,哺乳动物的)的病毒,如本领域中已知的,因为这些细胞系纠正引入病毒模板中的突变能力将会损坏。
可选地,能够通过将非同源性区域引入不可分解的末端重复产生具有大体上降低基因转化率的模板。在模板上包围不可分解的末端重复和未改变的末端重复之间的trs元件的区域中非同源性会降低或,甚至大体上消除基因转化。可以将任何合适的插入或缺失引入不可分解的末端重复以产生非同源性区域,只要降低或大体上消除基因转化。采用缺失以创造非同源性的方案是优选的。进一步优选的是,缺失不会过度地损坏模板的复制和包装。在缺失的情况下,同样的缺失可以足以损坏trs位点的分解并降低基因转化。
作为进一步的可选择方案,可以通过插入到不可分解的末端重复中或,可选地,插入到在RBE和trs位点之间的A元件中降低基因转化。典型地,插入是长度至少约3、4、5、6、10、15、20或30个核苷酸或更多。对插入序列的大小没有特殊的上限,其长度可以是50、100、200或500个核苷酸或更长,然而,一般地,选择插入以使得其不过度地损坏载体基因组的复制和包装。
不可分解的末端重复和双螺旋细小病毒载体在国际专利公开WO01/92551和McCarty等,(2003)Gene Therapy 10:2112-2118)中描述。
本发明的rAAV载体还可以包含转录末端信号。虽然本发明的载体中可以包括任何转录终止信号,优选地,转录终止信号是SV40转录终止信号。
修饰的“AAV”序列还能够用于本发明的上下文中,例如用于昆虫细胞中rAAV载体的产生。这种修饰的序列,例如包括对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9 ITR、Rep或VP具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或更多核苷酸和/或氨基酸序列同一性的序列(例如,具有75-99%核酸序列同一性)能够用于取代野生型AAV ITR、Rep或VP序列。
尽管与其他AAV血清型在很多方面相似,AAV5不同于其他人类或猿AAV血清型,要比不同于其他已知人类和猿血清型更多。鉴于此,在昆虫细胞中产生rAAV5能够与产生其他血清型不同。如果将本发明的方法用于产生rAAV5,优选的是一个或多个构建体共同包含(在一个以上构成的情况下)含有AAV5ITR的核苷酸序列,核苷酸序列包含AAV5Rep编码序列(即,核苷酸序列包含AAV5 Rep78)。这种ITR和Rep序列能够随意地修饰以在昆虫细胞中有效产生rAAV5或假型rAAV5载体。例如,Rep序列的起始密码子能够被修饰,VP剪接位点能够被修饰或去除,和/或VP1起始密码子和旁边的核苷酸能够被修饰以改进昆虫细胞中rAAV5载体的产生。
重组病毒粒子
另一方面,本发明涉及通过在合适的包装细胞中表达本发明的病毒基因组而获得的病毒粒子。
在本文中术语“病毒粒子”、“重组病毒颗粒”和“病毒载体”可交换使用,并涉及包含衣壳内包装的病毒基因组的有感染性、复制缺陷的病毒颗粒,视情况而定,为包围衣壳的油脂包膜。
本发明的病毒粒子可以是多瘤病毒粒子,更优选地SV40病毒粒子。根据本发明SV40病毒粒子包含5.2kb的双链环状DNA基因组和包围由三个病毒编码蛋白VP1、VP2和VP3组成的病毒微型染色体的病毒衣壳。
在另一实施方式中,如果病毒粒子是通过包装本发明的AAV载体获得的,本发明的病毒粒子是“重组AAV病毒粒子”。如本文所使用的,术语“重组AAV病毒粒子”或“rAAV病毒粒子”是指由衣壳化异源性目的核苷酸序列的AAV蛋白壳组成的有感染性的、复制缺陷病毒,该异源性核苷酸序列两侧连着AAV ITR和一个或多个Rep蛋白。
如本文所使用的,术语“Cap蛋白”是指具有至少一个天然AAV Cap蛋白(例如VP1、VP2、VP3)功能活性的多肽。Cap蛋白(例如VP1、VP2、VP3)的功能活性例子包括诱导衣壳形成、促进单链DNA累积、促进AAVDNA包装到衣壳中(即,衣壳化)、结合细胞受体和促进病毒粒子进入宿主细胞的能力。在优选的实施方式中,编码cap基因的多核苷酸序列对应于AAV8cap基因。AAV病毒粒子壳示出了二十面体对称性,并通常含有主Cap蛋白,通常是Cap蛋白和一个或两个较小的Cap蛋白中最小的。
如本文所使用的,术语“Rep蛋白”是指具有至少一个天然AAV Rep蛋白(例如Rep 40、52、68、78)功能活性的多肽。Rep蛋白(例如Rep 40、52、68、78)的“功能活性”是与蛋白的生理活性相关的任何活性,包括促进通过识别的DNA的复制、结合和切割DNA复制起点的AAV起点以及DNA解旋酶活性。另外的功能包括调整从AAV(或其他异源性)启动子转录和AAV DNA的位点特异性整合到宿主染色体中。在优选的实施方式中,编码rep基因的多核苷酸序列对应于AAV1rep基因。
技术人员将会理解的是,本发明的AAV病毒粒子可以包含来自任何AAV血清型的衣壳蛋白。然而,由于已知AAV血清型对于不同细胞的不同取向,AAV病毒粒子将含有更适于递送至肝细胞的衣壳蛋白。优选的是使用AAV1、AAV8和AAV5衣壳蛋白转导肝细胞rAAV病毒粒子(Nathwani等,2007,Blood 109:1414-1421;Kitajima等,2006,Atherosclerosis 186:65-73)。
此外,本发明的AAV基因组还包括,如Stemmer,W.P.C.,(Nature 270:389-391,1994);Schmidt-Dannert等,(Nat.Biotech.18:750-753,2000)和Oreneis等,(Nat.Struct.Biol.9:238-242,2001)所描述的,已经通过DNA重组制备的AAV基因组。DNA或基因重组涉及基因家族成员随机片段的创造及其重组以获得很多新组合。为了重组AAV衣壳基因,要考虑几个参数,包括:三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的参与和8个血清型之间同源性的不同程度。为了增加获得具有细胞或组织特异性取向的有活力的rcAAV载体的可能性,例如,优选的是产生高多样性和大量置换的重组方案。产生嵌合rcAAV的DNA重组方案的例子是临时模板随机嵌合生长(RACHITT),Coco等,Nat.Biotech.19:354-358,2001。
RACHITT方法能够用于重组源自两个不同血清型AAV基因组(例如AAV 1和AAV2)的两个PCR片段。例如,使用RATCHITT或其他DNA重组方案,包括在体内重组方案(美国专利号5,093,257;Volkov等,NAR 27:e18,1999;和Wang P.L.,Dis.Markers 16:3-13,2000)能够重组85%同一、跨越大约1kbp并包括所有三个基因(VP1、VP2和VP3)的起始密码子的区段,cap基因的保守区。得到的组合的嵌合库能够克隆到合适的AAV含TR的载体(例如pTR-AAV2)以置换WT AAV基因组的各自片段。随机克隆能够使用载体NTI 7 Suite软件的AlignX应用,用亲代基因组测序和比对。从测序和比对中,能够确定每1Kbp基因的重组交叉的数量。可选地,能够使用本发明的方法重组AAV基因组的可变域。例如,突变能够在AAV的两个氨基酸群(氨基酸509至522和561至591)内产生,其可能在VP3中形成颗粒表面环。为了重组这种低同源域,能够使用独立于亲代同源性的重组方案(Ostermeier等,Nat.Biotechnol.17:1205-1209,1999;Lutz等,Proc.Nat.Acad.Sci.98:11248-11253,2001)和Lutz等,(NAR 29:E16,2001)或被修饰以退火或重组低同源性DNA片段的RACHITT方案。
还可使用短随机化的寡核苷酸插入衣壳基因的特定位置构建组合库,其可能形成环并暴露在颗粒表面上以与细胞表面受体(例如,AAV2中的氨基酸509至522和561至591)相互作用(Xie等,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:10405-10410)。这种库能够用于选择具有新细胞/组织取向的病毒粒子。病毒粒子的选择涉及图1B和1C中描述的方案。
除了简并寡核苷酸合成之外,制备AAV衣壳突变体的方法还可以使用随机肽插入和RATCHITT方法。可选择的方法例子包括定点诱变(Wu等,J.Virol.72:5919-5926);分子育种、核酸、外显子和DNA家族重组(Soong等,Nat.Genet.25:436-439,2000;Coco等,Nature Biotech.2001;19:354;和美国专利号5,837,458;5,811,238;和6,180,406;Kolkman和temmer,Nat.Biotech.19:423-428,2001;Fisch等,Proceedings of the National Academy ofSciences 93:7761-7766,1996;Christians等,Nat.Biotech.17:259-264,1999);配体插入(Girod等Nat.Med.9:1052-1056,1999);和表达框诱变(Rueda等Virology 263:89-99,1999;Boyer等,J.Virol.66:1031-1039,1992)。关于AAV衣壳基因的突变分析,参见Wu等,J.Virol.74:8635-8647,2000和Rabinowitz等,Virology 265;274-285,1999。
修饰的“AAV”序列还能够用于本发明的上下文中,例如用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。这种修饰的序列,例如包括对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9 ITR、Rep或VP具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或更多的核苷酸和/或氨基酸序列同一性(例如,具有约75%至99%核苷酸序列同一性的序列)的序列能够用于置换野生型AAV ITR、Rep或VP序列。
Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列可以来自任何AAV血清型,但优选地源自AAV1、AAV2和/或AAV4。然而,用于本发明上下文中的编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列可以采自任何已知的42血清型,更优选地采自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6或AAV8。
本发明还仔细考虑了包含衣壳和重组病毒基因组的病毒粒子,其中天然衣壳中已经插入或置换有外源定位序列。病毒粒子优选地通过外源定位序列置换到或插入衣壳中来靶定(即定向到特定的细胞型)。可选地说明,外源定位序列优选地赋予病毒粒子改变的取向。如还进一步可选择的说明,定位序列提高了靶载体递送到细胞的效率。
外源定位序列可以取代或置换部分或全部衣壳亚基,可选地,一个以上衣壳亚基。如进一步可选地,一个以上外源定位序列(例如,两个、三个、四个、五个或多个序列)可以引入病毒粒子衣壳中。在可选的实施方式中,在较小的衣壳亚基内插入和置换是优选的。对AAV衣壳,在Vp2或Vp3中插入或置换也是优选的。
在更优选的实施方式中,外源定位序列可以是编码肽或蛋白的任何氨基酸序列,其插入或置换到病毒粒子衣壳中以改变病毒粒子的取向。可以通过插入或置换氨基酸序列降低或消除天然的病毒粒子取向。可选地,插入或置换外源氨基酸序列可以将病毒粒子靶向特殊细胞类型。外源定位序列可以是编码改变病毒粒子取向的蛋白或肽的任何氨基酸序列。在特殊实施方式中,靶向肽或蛋白可以自然地发生或,可选地,完全或部分地合成。典型的肽或蛋白包括与存在于肝细胞中的细胞表面受体结合的配体和其他肽,包括能够与用于载脂蛋白E、半乳糖和乳糖特异性凝集素的Sr-B1受体结合的配体、低密度脂蛋白受体配体、脱唾液酸糖蛋白(半乳糖末端)配体,等等。
可选地,外源定位序列可以是抗体或其抗原识别的部分。如本文所使用的,术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白,包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆或多克隆的,而且可以来自任何种类,包括(例如)鼠、鼠、兔、马或人类,或可以是嵌合抗体。如本领域技术人员已知,术语“抗体”还包含双特异性或“交联”抗体。本发明范围内的抗体片段包括,例如Fab、F(ab′)2和Fc片段,和从除了IgG的抗体获得的相应片段。这种片段可以通过已知技术产生。
插入病毒粒子衣壳中的外源氨基酸序列可以促进病毒粒子纯化或检测。根据本发明的这个方面,外源氨基酸序列没有必要也改变修饰的细小病毒的病毒粒子。例如,如本领域技术人员已知,外源氨基酸序列可以包括用于在镍柱上纯化病毒粒子的聚组氨酸序列,或可以通过标准免疫纯化技术用于纯化病毒粒子的抗原肽或蛋白。可选地,氨基酸序列可以编码受体配体或可以通过亲和纯化或本领域已知的任何其他技术(例如,基于差别尺寸、密度、电荷或等电点的纯化技术、离子交换层析或肽层析)用于纯化修饰的病毒粒子的任何其他肽或蛋白。
优选地将外源氨基酸序列插入细小病毒较小的Cap亚基内,例如AAVVp1和Vp2亚基内。可选地,优选的是插入Vp2或Vp3中。
修饰优选的AAV病毒粒子以降低如Russell(2000,J.Gen.Virol.81:2573-2604)评述的或如US20080008690和Zaldumbide和Hoeben(GeneTherapy,2008:239-246)所描述的宿主应答。
在优选的实施方式中,本发明的病毒粒子包含病毒基因组,其包含编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列,其与肝特异性启动子可操作连接。在还另一实施方式中,肝特异性启动子包含白蛋白基因增强子区域和α1抗胰蛋白酶启动子。在另一实施方式中,IGF-I对应于人IGF-I.。
治疗方法
本发明的作者已经观察到,将病毒载体施用于罹患CCl4诱导的肝硬化的动物体内得到通过生物化学肝检验(血清AST、ALT、ALP和胆红素的降低和血清白蛋白的升高)和组织化学观察(见实施例3和10)测量的肝功能显著改善的结果。另外,本发明的病毒粒子导致在硬化肝中诱导纤维溶解(见实施例4和11)并减少致纤维性因子(见实施例5和12)。
因此,另一方面,本发明涉及用作药物的本发明的病毒粒子。另一方面,本发明涉及包含如本文上述定义的病毒粒子的药物组合物。药物组合物进一步优选地包含药学上可接受的载体。任何合适的药学上可接受的载体或赋形剂可用在本发明的组合物中(参见,例如Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April1997)。优选的药物形式会是与无菌生理盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液,或其他药学上可接受的无菌液体的组合。可选地,可以使用如微载体珠这样的固体载体。
还一方面,本发明涉及用于治疗和/或防止或预防肝硬化或肝纤维化的方法,包含对受试者施用其所需的本发明的病毒粒子。
另一方面,本发明涉及根据本发明的病毒粒子在制造防止和/或治疗肝硬化或肝纤维化方面的药物中的用途。
还另一方面,本发明涉及根据本发明用于治疗和/或防止肝硬化或肝纤维化的病毒粒子。
如本文所使用的,术语“肝硬化”涉及因为肝组织被纤维化疤痕组织和再生结节取代而使得肝缓慢恶化和发生障碍的状况。这导致血液流经肝的部分阻滞以及肝控制感染能力、从血液中清除细菌和毒素、处理营养素、激素和药物、制造调节凝血的蛋白和产生胆汁以帮助吸收脂肪(包括胆固醇)和脂溶性维生素的功能受损。本发明的疗法适于治疗不同原因的肝硬化,包括酒精相关肝硬化、慢性丙肝、乙肝、或丁肝、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、自身免疫性肝炎、原发性或继发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、例如囊性纤维化、α1抗胰蛋白酶缺陷、血色沉着病、肝豆状核变性、半乳糖血症和糖原贮积病等遗传性疾病。
如本文所使用的,术语“肝纤维化”涉及这样的状况,其特征在于肝内包括骨胶原的细胞外基质蛋白累积增加,以及包括根据metavir评分系统的纤维化评分1(最小疤痕)、2(疤痕已经发生并延伸到含有血管的肝内区的外部)、3(桥接纤维化扩散并与含有纤维化的其他区连接)或4(肝的硬化或深度进展的疤痕);或根据Knodell评分的1至4、5至8、9至12或13至18的评分。
病毒粒子的量和这种组合物的施用时间将在从本发明信息中获益的技术人员的权限范围内获得。事实上,本发明的发明人仔细考虑到,可以通过单独施用,如单独注射足够数量的感染颗粒以对进行这种治疗的患者提供疗效来实现本发明的病毒粒子的有效治疗施用量。可选地,在某些情况下,理想的情况可以是,在相对短,或相对延长的时间段内提供多次或连续施用病毒粒子组合物,如可以通过医师监督这种组合物的使用来确定。例如,施用于哺乳动物的感染颗粒数量可以按约107、108、109、1010、1011、1012、1013的顺序,或甚至更高的感染颗粒/ml,作为单独剂量施用或如可以要求的分成两次或多次施用,以实现治疗特殊疾病或病症的疗法。事实上,在特定实施方式中,理想的情况可以施用两次或多次不同病毒粒子载体组合物,或单独或与一种或多种其他治疗药物组合以获得特殊治疗方案的理想效果。在大多数基于病毒粒子的基因治疗方案中,本发明的发明人相信使用肝特异性启动子来控制IGF-I或其同功能变体的表达将会导致这样的情况:当使用根据本发明的病毒粒子时,将会需要比常规基因治疗方案更低滴度的感染粒子。
在本发明特别优选的实施方式中,目的核苷酸序列被递送到受试者的肝中。可以通过本领域已知的任何方法实现对肝的施用,其包括但不限于静脉施用、门静脉施用、胆道内施用、动脉内施用和直接注射入肝实质。在优选的实施方式中,通过动脉内施用病毒粒子。在还更优选的实施方式中,通过肝动脉实施动脉内施用。
使用编码IGF-I的细小病毒载体防止和/或治疗肝硬化和肝纤维化的方法
本发明的作者提供的结果已经示出,施用包含IGF-I编码序列的重组细小病毒的病毒粒子导致在肝硬化的动物模型中肝功能的改善(见实施例3至6和10至13)。而且,使用其他病毒载体观察的结果表明,如果在疾病发展前使用IGF-I,其可以延迟疾病进展。因此,本发明的病毒粒子还适用于防止肝硬化或肝纤维化的发展。
因此,另一方面,本发明涉及包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的重组细小病毒在药物中的用途,更优选在治疗和/或防止肝硬化或肝纤维化中的用途。
另一方面,本发明涉及包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的重组细小病毒用于制备治疗和/或防止肝硬化或肝纤维化的药物。
另一方面,本发明涉及用于治疗肝硬化或肝纤维化的方法,包含对受试者施用其所需的包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的重组细小病毒。
如本文所使用的,术语“治疗”涉及逆转、缓和或抑制病症的进程或这种术语适用的状况,或这种病症或状况的一个或多个症状的行为。
如本文所使用的,术语“防止”是指防止发生、存在或可选地延迟疾病、病症或这种术语适用的状况的发病或复发,或与疾病、病症或状况相关的一个或多个症状的发病或复发的行为。
术语“肝硬化”和“肝纤维化”已经在前文详细描述。
上文已经结合本发明的病毒载体详细描述了术语“细小病毒”。优选地,细小病毒是腺病毒伴随病毒。还更优选地,AAV包含基因组,所述基因组包含编码侧面连着ITR的IGF-I或其同功能变体的序列,其中所述ITR来自AAV1、AAV2和/或AAV4。在还更优选的实施方式中,AAV是与AAV1、AAV2和/或AAV4假型的AAV1、AAV5、AAV6或AAV8,即,其含有来自AAV1、AAV5、AAV6或AAV8的cap蛋白。在优选的实施方式中,重组细小病毒是单链细小病毒,优选地,是单链AAV。在另一优选的实施方式中,重组细小病毒是双链细小病毒,优选地,双链AAV。
当涉及本发明的病毒载体时,术语“IGF-I”已经在前文中详细描述。在优选的实施方式中,IGF-I对应于人IGF-I。
编码IGF-I或其同功能变体的序列可以可操作地与启动子区连接。用在病毒粒子中以用于本发明疗法的合适的启动子包括能够在肝细胞中积极转录下游序列的任何启动子,包括组成型启动子以及肝特异性启动子。适于肝内异源性序列表达的组成型启动子包括但不限于,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPTR)启动子、腺苷脱氨酶启动子、丙酮酸激酶启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、中间丝(肌间线蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等等)启动子和其他组成型启动子。典型的在真核细胞中发挥基本功能的病毒启动子包括,例如SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon,1981,Nature290:304-310)、在鲁斯氏肉瘤病毒的3′长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等,1980,Cell 22:787-797)、疱疹胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子(Wagner等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)。
在优选的实施方式中,与编码IGF-I或其同功能变体的序列可操作连接的启动子是肝特异性启动子。在更优选的实施方式中,肝特异性启动子是包含白蛋白基因增强子区和α1抗胰蛋白酶启动子的杂交启动子。在另一优选的实施方式中,肝特异性启动子是诱导型肝特异性启动子。
本发明的疗法涉及通过培养病毒粒子/病毒颗粒来转导细胞以施用编码IGF-I或其同功能变体的细小病毒的病毒粒子。这种细胞可以存在于有机体中,在这种情况下通过穿刺注射、射流注射或基因枪获得这种细胞。另一方面,待转导的细胞还能够从有机体中分离,在有机体外部感染然后再回到有机体内。这种细胞称为自体细胞。另外,至于有机体,还可能使用异体细胞进行转导。在这种连接中,合适的情况是,这些细胞属于对应于有机体的HLA型。本领域技术人员知道提供具有特定HLA型的细胞的方法。病毒粒子制剂的优选滴度通常是107和109感染性病毒/ml之间。
本发明发现了在兽医和医疗应用方面的用途。合适的受试者包括鸟类和哺乳动物,优选哺乳动物。如本文所使用的,术语“鸟类”包括但不限于,鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和雉鸡。如本文所使用的,术语“哺乳动物””包括但不限于人类、牛、绵羊、公山羊、马、猫、犬、兔类动物等等。人类受试者是最优选的。人类受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、未成年和成年受试者。
因此,本发明的主题还涉及含有根据本发明的细小病毒颗粒,更优选的AAV颗粒的药物。此处,药物可以另外含有药学上可接受的载体。这种药物合适的载体和制剂对本领域技术人员已知。合适的载体包含,例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳浊液,例如油/水乳浊液、湿润剂、无菌溶液等等。这种载体取决于如何根据本发明施用包装质粒和/或细小病毒颗粒的细小病毒载体。合适剂量由主治医师决定并取决于多种因素,例如患者的年龄、性别和体重、疾病严重程度、施用类别等等。结果已经证明,通过使用本发明的包装质粒和/或颗粒的细小病毒载体的方式,可能使用大多数不同的细胞,例如角膜上皮细胞或肌肉细胞的初生细胞获得高转导率。
对人类受试者或动物施用其所需的本发明的细小病毒颗粒能够通过本领域已知的任何方法施用病毒载体。施用的典型模式包括口服、直肠、经粘膜、局部、经皮、吸入、不经肠(例如静脉、皮下、真皮内、肌肉内和关节内)施用等等,以及直接组织或器官注射,可选地,鞘内、直接肌肉内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。血管注射剂可以制备成常规形式,如液体溶液或悬浮液、适于注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式,或乳浊液。可选地,可以以局部而不是全身的方式,例如以药性持久的或缓释制剂的形式施用病毒。
在本发明特别优选的实施方式中,目的核苷酸序列被递送到受试者的肝中。可以通过本领域已知的任何方法,包括但不限于静脉施用、门静脉施用、胆道内施用、动脉内施用和直接注入肝实质来对肝施用。在优选的实施方式中,通过动脉内施用病毒粒子。在还更优选的实施方式中,通过肝动脉实施动脉内施用。
本发明的细小病毒颗粒的剂量将取决于施用模式、个体受试者的状况、特殊病毒载体和递送的基因,并能够以常规方式确定。获得疗效的典型剂量是病毒滴度至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014转导单位或更多,优选的约108至1013转导单位,还更优选的1012转导单位。
在本发明的特殊实施方式中,可以采用施用一次以上(例如,两次、三次、四次或更多次施用)以获得基因表达的治疗水平。根据此实施方式,如上所述,优选地是使用对每种施用具有不同抗原性能的细小病毒载体以避免中和抗体效果。
制备重组AAV病毒粒子的方法
还一方面,本发明提供了产生重组AAV病毒粒子的方法,包含在足以使三种或四种组分进入细胞内并从细胞中回收重组AAV病毒粒子的条件下使细胞接触:
(a)第一核酸序列,其包含:
i.包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,和
ii.侧面连着(i)中定义的表达框的AAV 5’-ITR和3’-ITR
(b)编码AAV rep蛋白的第二核酸序列
(c)编码AAV cap蛋白的第三核酸序列,和任选地,
(d)编码病毒和/或AAV依赖其复制的细胞功能的第四核酸序列
用于产生重组AAV病毒粒子的方法的步骤(i)包含在足以使三种或四种组分进入细胞内的条件下使细胞接触:
(a)第一核酸序列,其包含:
i.包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,和
ii.侧面连着(i)中定义的表达框的AAV 5’-ITR和3’-ITR
(b)编码AAV rep蛋白的第二核酸序列
(c)编码AAV cap蛋白的第三核酸序列,和任选地,
(d)编码病毒和/或AAV依赖其复制的细胞功能的第四核酸序列
形成第一核酸序列的元件在前文本发明病毒载体的上下文中已经基本上描述了。在优选的实施方式中,第一核酸序列进一步包含编码IGF-I或其同等功能的序列下游的聚腺苷酸化信号。合适的聚腺苷酸化信号已经在前文中描述了。通过实施例的方法,聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。
肝特异性启动子能够是上述定义的任何启动子。在优选的实施方式中,肝特异性启动子是包含白蛋白增强区和α1抗胰蛋白酶启动子的杂交启动子。在另一优选的实施方式中,肝特异性启动子是诱导型肝特异性启动子。
为了促进包装,重组载体基因组通常是约80%至约105%的野生型基因组大小,并包含适当的包装信号。为了促进包装到AAV衣壳中,基因组的大小优选地大约为5.2kb或更小。在其他实施方式中,基因组的长度优选地大于约3.6、3.8、4.0、4.2或4.4kb和/或小于约5.4、5.2、5.0或4.8kb。可选地说明,异源性核苷酸序列长度将典型地小于约5kb(更优选地小于约4.8kb,还更优选地小于约4.4kb,还更优选地小于约4.2kb),以通过AAV衣壳促进重组基因组的包装。
产生本发明病毒粒子所需的第二和第三核酸序列是所谓的“AAV辅助功能”,并包含一个或两个主要AAV ORFS,即rep和cap编码区,或其功能性同源物。已经在上述关于本文的病毒粒子中详细描述了首次用于本发明方法的编码rep和cap蛋白的合适核酸序列。
然而,本领域技术人员将会理解的是,能够在多种组合的两个或多个载体上提供第一、第二和第三核酸序列。如本文所使用的,术语“载体”包括任何遗传元件,如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等等,当其与合适的控制元件相联系时能够复制,并能够在细胞间转移基因序列。因此,术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。
AAV rep和/或cap基因能够可选地由稳定表达基因的包装细胞提供(参见,例如Gao等,(1998)Human Gene Therapy 9:2353;Inoue等,(1998)J.Virol.72:7024;美国专利号5,837,484;WO 98/27207;美国专利号5,658,785;WO 96/17947)。
在优选的实施方式中,可以在单个载体中提供第二和第三多核苷酸,其通常是指如AAV辅助功能载体。适用于本发明的载体例子包括在美国专利号6,001,650中描述的pHLP19和在美国专利号6,156,303中描述的pRep6cap6载体,它们的全部内容通过引用并入本文。
在其他特殊的实施方式中,第二和第三核酸序列以腺病毒辅助病毒的形式存在,其可以是编码AAV Rep和/或衣壳蛋白的杂交辅助病毒。表达AAVrep和/或cap基因的杂交辅助Ad/AAV载体和使用这些试剂产生AAV原株(stock)的方法在本领域中已知(参见,例如美国专利号5,589,377;和美国专利号5,871,982、美国专利号6,251,677;和美国专利号6,387,368)。优选地,本发明的杂交Ad表达AAV衣壳蛋白(即VP1、VP2和VP3)。可选地,或另外地,杂交腺病毒能够表达一个或多个AAV Rep蛋白(即Rep40、Rep52、Rep68和/或Rep78)。AAV序列能够与组织特异性或诱导型启动子可操作地连接。
在另一特殊实施方式中,用于制备重组AAV病毒粒子的细胞是昆虫细胞,而且第一、第二和第三核酸序列包含在杆状病毒载体中。
在优选的实施方式中,通过此方法产生的重组AAV病毒粒子是单链AAV病毒粒子。在另一优选的实施方式中,产生的重组AAV病毒粒子是双链AAV病毒粒子。
不同核酸序列与细胞在所述核酸序列足以进入该细胞的条件下接触。适于此目的的许多转染技术通常在本领域中已知,并包括磷酸钙共同沉淀、直接微量注射入培养细胞、电穿孔法、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导和使用高速微粒的核酸递送。
组分(d)可以包含编码AAV依赖其复制的非AAV源病毒和/或细胞功能(即“辅助功能”)的核酸序列。辅助功能包括AAV复制所需的那些功能,包括但不限于涉及活化AAV基因转录的那些部分、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装。基于病毒的辅助功能能够源于任何已知的辅助病毒,如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯性疱疹病毒1型)和牛痘病毒。
可选地,组分(d)的核酸序列可以通过包装细胞,附加体地(episomally)和/或合并入包装细胞基因组来承载。辅助功能可以分布于如上所述的第四核酸(组分(D))和包装细胞之间。
腺病毒包含很多不同亚群,尽管C亚群的腺病毒5型(Ad5)是最常用的。许多人类、非人哺乳动物和鸟类源的腺病毒是已知的并可从如ATCC的贮藏所中获得。
还可能提供第四核苷酸序列,作为病毒DNA序列,其通常称为“辅助病毒”。根据本发明合适的辅助病毒在德国专利申请号196 44 500.0-41中描述,例如,它们还包含如该专利申请中公开的质粒pTG9585的DNA序列,其作为辅助病毒DNA序列包含除E1区外完整的腺病毒5序列。
形成疱疹病毒DNA的序列可以整合到载体中,其通常称为“AAV载体包装质粒”。包装质粒还能够含有与pTG 9585中不同的辅助病毒DNA序列,因为它们在Ad5序列的结构基因L1中,特别在核苷酸16614-18669的区域中缺失。
辅助病毒DNA序列优选地源自疱疹病毒或腺病毒,而优选的是腺病毒5(Ad5)。
在特别优选的实施方式中,根据本发明AAV载体包装质粒包括作为辅助病毒DNA序列的Ad5基因E2A、E4和VA,其可以源自例如德国专利申请196 44 500.0-41中描述的pDG质粒,并由各自的原始启动子或异源启动子控制。
此外,AAV载体包装质粒可以含有编码可检测的表型标记的基因以证明AAV载体包装质粒成功引入靶细胞。在甚至更优选的实施方式中,根据本发明的AAV载体包装质粒因此另外含有用于表达标记蛋白,优选地荧光蛋白的表达框。在这一点上,术语“表达框”是指编码,例如荧光基因的基因和控制此基因的合适的启动子和聚腺苷酸化信号的组合。这轻易地证实了理想靶细胞的转染。编码荧光蛋白的合适的基因例子是RFP-(红)、GFP-(绿)、CFP-(蓝绿)和YFP-(黄)基因,优选RFP-(红)(Dsred-cDNA;Clontech)。合适的启动子例子是RSV(鲁斯氏肉瘤病毒)启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子和HSV(单纯性疱疹病毒)tk启动子,优选RSV启动子。这种表达框在合适的位点上插入AAV载体包装质粒,该位点能够容易地由本领域技术人员确定,优选的在cap基因的3′端和腺病毒VA基因的起点之间,例如在ClaI切割位点。此ClaI切割位点存在于pDG中。
在另一特别优选的实施方式中,本发明涉及AAV载体包装质粒,AAV表达载体DNA序列含有在CMV启动子的控制下的HPV16-L1编码DNA序列。这种AAV载体包装质粒称为pDS2-Lh1,根据2001年7月17日布达佩斯条约的规定,在DSMZ【德国微生物和细胞培养保藏中心】,布伦瑞克,德国,保藏为DSM 14406。这种质粒可以承载所有所需辅助功能或只有某些必要功能,在这种情况下,剩余的辅助功能可以通过包装细胞提供。
在可选的方法中,本发明的AAV病毒粒子可以通过以下方法产生,该方法包含以下步骤:
(i)接触第一核酸序列,其包含
i.包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,而且
ii.侧面连着(i)中定义的表达框的AAV 5’-ITR和3’-ITR
具有包含AAV衣壳蛋白的组合物
(ii)从混合物中回收重组AAV病毒粒子。
产生AAV病毒粒子的可选的方法是使用基于昆虫细胞的系统。众所周知,杆状病毒表达系统用作真核细胞克隆和表达载体(King,L.A.,和R.D.Possee,1992,″The baculovirus expression system″,Chapman and Hall,UnitedKingdom;O′Reilly,D.R.,等,1992.Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual.New York:W.H.Freeman.)。杆状病毒表达系统的优点在于,其中表达蛋白几乎总是可溶、正确折叠并具有生物活性。进一步的优点包括高蛋白表达水平、较快的产生、大型蛋白表达的适合性和大规模产生的适合性。
杆状病毒表达系统成功已用于产生重组腺病毒伴随病毒(AAV)载体(Urabe等,2002,Hum.Gene Ther.13:1935-1943;US 6,723,551和US20040197895)。这种系统由在昆虫细胞中开发AAV产生系统的Urabe等(2002,如上所述)所描述。
在此系统中,产生以下核酸:
(i)第一核酸序列,包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,以及侧连着所述表达框的AAV 5’-ITR和3’-IT,
(ii)编码AAV rep蛋白的第二核酸序列,和
(iii)编码AAV cap蛋白的第三核酸序列。
三个核酸序列典型地承载在为昆虫细胞兼容载体的载体上。可以由一个、两个或三个载体实现序列。如上所述,第一核苷酸序列包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列。第二核苷酸序列将典型地包含开放阅读框(ORF),其包含编码与至少一个表达控制序列可操作连接以在昆虫细胞中表达的AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列。第三核苷酸序列典型地包含编码与至少一个表达控制序列可操作连接的以在昆虫细胞中表达的Rep52或Rep40编码序列和Rep78或Rep68编码序列的开放阅读框。Rep蛋白可以由单个开放阅读框编码。
用于产生AAV病毒粒子的方法包含将包含在一个、两个或三个昆虫细胞兼容载体(典型的杆状病毒)的核酸序列引入昆虫细胞并在产生AAV的条件下保存昆虫细胞。然后可以回收AAV。
为了在昆虫细胞中产生AAV,可以必要地进行一些修饰以获得三个AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)正确的化学计量,其取决于两个剪接受体位点的可选择用法和未通过昆虫细胞准确复制的VP2的ACG起始密码子的次优使用的组合。为了模拟昆虫细胞中衣壳蛋白正确的化学计量,Urabe等(2002,如上所述)提出了使用转录入单个多顺反子信使的构建体,其能够表达所有三个VP蛋白而不需要剪接,其中最上游起始密码子由次优起始密码子ACG取代。WO2007/046703公开了基于通过最优化昆虫细胞中产生的AAV衣壳蛋白的化学计量而产生的杆状病毒的rAAV载体的感染性的进一步改善。
为了在由Urabe等(2002,如上所述)最初开发的AAV昆虫细胞表达系统中表达AAV Rep蛋白,使用重组杆状病毒构建体以包含两个独立的Rep表达单元(一个用于Rep78,一个用于Rep52),每个在单个昆虫细胞启动子的控制下,分别是δIE1和PolH启动子。
Kohlbrenner等(2005,MoI.Ther.12:1217-25;WO 2005/072364)报道了用于两个Rep蛋白表达的杆状病毒构建体,如由Urabe等所使用的,具有固有的不稳定性。通过分解Urabe的原始载体中两个Rep基因的回文方向并设计两个单独的杆状病毒载体以表达Rep52和Rep78,Kohlbrenner等(2005,如上所述)增加了载体的传代稳定性。然而,尽管来自两个独立的杆状病毒Rep构建体的Rep78和Rep52在昆虫细胞中至少5代的表达一致,rAAV载体的产量比Urabe等设计的原始杆状病毒Rep构建体低5至10倍(2002,如上所述)。
WO2007/148971中,通过使用Rep78和Rep52蛋白的单个编码序列(其中次优起始密码子用于Rep78蛋白)来获得昆虫细胞中rAAV载体产生的显著改善的稳定性,该Rep78蛋白部分由扫描核糖体遗漏以允许翻译开始以同样发生在Rep52蛋白起始密码子的更远的下游处。
所有上述修饰可以用于本文所述的发明的方法中。
在本发明的昆虫细胞中,第一、第二和第三核酸序列优选地包含在核酸载体内,它们可以在相同或不同载体上。昆虫细胞可以包含三个单独的核酸构建体,一个用于第一和第二以及第三核苷酸序列之一,或者昆虫细胞可以包含单型核酸构建体或包含适当分布的第一、第二和第三核苷酸序列的两个载体(例如,第一核酸序列可以置于第一载体上,而第二和第三核酸序列可以置于第二载体上)。
优选地,第二和第三核酸序列与表达控制序列可操作地连接以在昆虫细胞中表达。这些表达控制序列会至少包括在昆虫细胞中有活性的启动子。本领域技术人员已知的用于在昆虫宿主细胞中表达外来基因的技术能够用于实践本发明。分子工程方法论和在昆虫细胞中的多肽表达在例如,Summers和Smith.1986.A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and InsectCulture Procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555,College Station,Tex.;Luckow.1991。在Prokop等,Cloning and Expression ofHeterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors′RecombinantDNA Technology and Applications,97-152;King,L.A.和R.D.Possee,1992,The baculovirus expression system,Chapman和Hall,United Kingdom;O′Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow,1992,Baculovirus ExpressionVectors:A Laboratory Manual,New York;W.H.Freeman和Richardson,C.D.,1995,Baculovirus Expression Protocols,Methods in Molecular Biology,volume39;US 4,745,051;US2003148506;和WO 03/074714中描述。用于本发明的第一和第二核苷酸序列转录的合适启动子包括例如,多角体(PoIH)、plO、p35、IE-I或δIE-1启动子和在以上引用中描述的另外的启动子。因为已知在哺乳动物细胞中Rep78与Rep52相比具有较少的大量表达,其促进了高载体产量(Li等,1997,J Virol.71:5236-43;Grimm et al.,1998,Hum Gene Ther.9,2745-2760),优选地将比用于Rep52或40蛋白表达的较弱的启动子用于激发Rep78或68蛋白的表达。例如,可以使用较强的多角体启动子用于Rep52 or 40蛋白的表达,可以选择δIE1启动子,比PoIH启动子弱很多的启动子用于激发Rep78或68蛋白的表达。优选地,在昆虫细胞中,选择分别用于Rep52或40蛋白和Rep78或68蛋白的启动子以在昆虫细胞中产生Rep78/68对Rep52/40的摩尔比在1∶10至10∶1、1∶5至5∶1或1∶3至3∶1的范围内,通过使用杆状病毒表达,优选地在约20至40小时后感染,更优选地在约30至40小时后感染。可以通过蛋白质印迹法,优选地使用识别Rep78/68和Rep52/40的共同表位的单克隆抗体,或使用例如鼠抗Rep抗体(303.9,Progen,Germany;1∶50稀释)确定Rep78和Rep52的摩尔比。
优选地,在昆虫细胞中用于表达本发明的第二和第三核苷酸序列的核酸构建体是昆虫细胞兼容载体。“昆虫细胞兼容载体”或“载体”理解为能够生产转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。典型的生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。能够采用任何载体只要其是昆虫细胞兼容的。载体可以整合到昆虫细胞基因组,但载体也可以是附加体的。在昆虫细胞中载体的存在不需要永久的,而瞬态附加体载体也包括在内。可以通过已知的任何方法,例如通过细胞的化学处理、电穿孔法或感染引入载体。在优选的实施方式中,载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在更优选的实施方式中,载体是杆状病毒,即构建体是杆状病毒载体。在上述引用的关于昆虫细胞的分子工程的参考文献中描述了杆状病毒载体及其使用方法。
昆虫细胞可以是适于产生异源蛋白的任何细胞。优选地,昆虫细胞允许杆状病毒载体复制,并能够在培养基中保存。更优选地,昆虫细胞还允许重组细小病毒载体,包括rAAV载体的复制。例如,使用的细胞系能够来自草地贪夜蛾、果蝇细胞系或蚊子细胞系,例如白纹伊蚊细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自易受杆状病毒感染的昆虫物种的细胞,包括例如,Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-I、Tn368、HzAmI、Ha2302、Hz2E5、High Five(Invitrogen,CA,USA)和expresSF+(US 6,103,526;Protein Sciences Corp.,CT,USA)。
用于本发明方法中的优选的昆虫细胞是用于产生重组细小病毒载体的昆虫细胞。除了上述“第二“和”第三”核酸序列外,该昆虫细胞进一步包括,包含至少一个细小病毒反向末端重复(ITR)核苷酸序列和编码IGF-I或其同功能变体的序列的第一核酸构建体,该序列可操作地与肝特异性启动子连接。
在本发明中没有限制在昆虫细胞中采用核酸构建体(以递送三个上述核酸序列)以产生重组细小病毒(rAAV)载体的数量。例如,根据本发明的方法,一个、两个、三个、四个、五个或更多单独的构建体能够用于在昆虫细胞中产生rAAV。如果采用五个构建体,一个构建体编码AAV VP1,另一个构建体编码AAV VP2,还另一个构建体编码AAV VP3,再还另一个构建体编码如上定义的Rep蛋白,而最后一个构建体包含至少一个AAV ITR。如果使用少于五个构建体,构建体能够包含至少一个AAV ITR和VP1、VP2、VP3,以及Rep蛋白编码序列的各种组合。
如本文所使用的,“包装”是指导致病毒载体,特别是rAAV载体组装和衣壳化的一系列亚细胞作用。因此,当在适当条件下将合适的载体引入包装细胞系时,其能够组装成病毒颗粒。在本文和本领域中描述与病毒载体,特别是rAAV载体包装相关的功能。
用于产生AAV病毒粒子的方法的步骤(ii)包含从包装细胞中回收病毒粒子。为此,将含病毒样品进行一个或多个纯化步骤,包括密度梯度分离和层析。
用于纯化rAAV病毒粒子的方法例子包括几个步骤,首先,提供受rAAV病毒粒子感染的多个细胞。从这些感染的细胞中收集rAAV病毒粒子。然后将这些病毒粒子进行密度梯度分离步骤,如一个使用碘克沙醇梯度。典型的碘克沙醇不连续梯度含有15%的碘克沙醇步骤、25%碘克沙醇步骤、40%碘克沙醇步骤和60%碘克沙醇步骤。碘克沙醇步骤能够进一步包括1M NaCl。将含病毒粒子的碘克沙醇步骤离心,并从碘克沙醇梯度步骤中收集得到的含毒粒子的样品。然后将这种样品用于层析步骤,如离子交换或羟基磷灰石层析步骤。
本发明的纯化方法特别地用于纯化具有含有来自AAV血清型1和5的蛋白的衣壳的病毒粒子,因为这些血清型不结合肝素柱。为了纯化rAAV1和rAAV5病毒粒子,采用纯化方案,使用碘克沙醇密度梯度离心,接着通过阳离子交换或羟基磷灰石层析。碘克沙醇是原来产生成X射线对比化合物以注入人体的碘化密度梯度媒介。不像超渗无机盐(CsCl)和普遍用于分馏大分子的蔗糖梯度,碘克沙醇溶液能够制成在所有密度上等渗的。这种性能使得碘克沙醇成为用于分析和下游纯化步骤的理想媒介。此外,碘克沙醇具有从含载体基因组(全部)衣壳中分离游离衣壳蛋白和空衣壳的能力。尽管在本发明中是优选使用碘克沙醇,但是其他合适的密度梯度媒介可以取代。
在密度梯度离心之后,rAAV载体通过柱层析纯化。可以使用任何允许rAAV病毒粒子纯化的层析方法。例如,能够使用离子交换层析。离子交换层析是依赖在目的蛋白和离子交换基质之间的电荷相互作用的方法,离子交换基质通常由树脂,如琼脂糖、葡聚糖和交联的纤维素和琼脂糖组成,其与荷电基团共价结合。荷电基团根据类型(阳离子和阴离子)和强度(强或弱)分类。离子交换层析技术通常在以下几个步骤发生:柱平衡至用于靶蛋白结合的理想pH和离子条件、样品通过反离子取代可逆吸附样品至柱上、引入改变缓冲pH或离子强度的洗脱条件以置换结合蛋白和按照结合强度次序从柱中洗脱物质(弱结合蛋白先洗脱)。离子交换层析可直接从小规模向大规模水平升级。阴离子交换层析是离子交换层析的一种,其中负荷电树脂会与具有净正电荷的蛋白结合。商用阴离子树脂例子包括Pharmacia的HiTrapQ;MonoQ、MonoS、MiniQ、Source 15Q、30Q、Q Sepharose、DEAE和AmershamBiosciences(Piscataway,N.J.)的Q Sepharose High Performance;J.T.Baker(St.Louis,Mo.)的WP PEI、WP DEAM和WP QUAT;Biochrom Labs(TerreHaute,Ind.)的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA;Bio-Rad(Hercules,Calif.)的UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE和Macro-Prep HighQ;Ciphergen(Fremont,Calif.)的Ceramic HyperD Q、Ceramic HyperD S、Ceramic HyperD DEAE、Trisacryl M DEAE、Trisacryl LS.DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil和QMA M Spherosil;Dow Liquid Separations(Midland,Mich.)的DOWEXMONOSPHERE;Millipore(Bedford,Mass.)的Matrex Q500、Matrex A500、Matrex Q800、Matrex A800和Matrex A200;Novagen(Madison,Wis.)的Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE和Fractogel EMD DMAE;Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)的Diaion强阴离子交换剂I型、安伯来特强阴离子交换剂II型、DOWEX强阴离子交换剂I型、DOWES强阴离子交换剂II型、Diaion强阴离子交换剂I型、Diaion强阴离子交换剂I型、Diaion强阴离子交换剂II型、安伯来特弱阴离子交换剂和DOWEX弱阴离子交换剂;Tosoh Biosep(Montgomeryville,PA)的TSK Gel DEAE-5PW-HR、TSKGel DEAE-5PW、TSK Gel Q-5PW-HR和TSK Gel Q-5PW;和Whatman(Kent,UK)的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D和Express-IonQ。对纯化rAAV1和rAAV5病毒粒子,优选阴离子交换层析。
羟基磷灰石层析是层析技术的另一个合适的实例。羟基磷灰石是磷酸钙的结晶形式。羟基磷灰石层析的机制涉及负荷电蛋白羧基与树脂上的正荷电钙离子,以及正荷电蛋白氨基和树脂上的负荷电磷酸盐离子间的非特异性相互作用。商用羟基磷灰石树脂实例包括Bio-Rad(Hercules,Calif.)的Bio-GelHT和CHT陶瓷树脂;Calbiochem(San Diego,Calif.)的羟基磷灰石高分辨率和羟基磷灰石高流速;Ciphergen(Fremont,Calif.)的HA Ultrogel;和Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)的羟基磷灰石。除了阴离子交换层析之外;使用羟基磷灰石层析纯化rAAV5病毒粒子(图3B)。优选的羟基磷灰石树脂实例是Bio-Rad,Hercules,Calif.的陶瓷羟基磷灰石,因为其是具有提高的钙:磷酸盐定量分配的稳定、多孔形式的羟基磷灰石,其克服了由于过量磷酸盐造成的低结合力。
为了纯化rAAV2病毒粒子,优选肝素琼脂糖层析。参见,例如美国专利号6,146,874。
碘克沙醇不连续梯度之后,进行亲和性肝素(用于纯化rAAV2)、羟基磷灰石或阴离子交换层析(用于纯化AAV1、2和5),这样的组合用于促进几个病毒的高通量从而直接比较在动物模型和细胞培养中的转导效率和特异性。通过使用细胞工厂,如具有大培养表面积的塑料盘(Nunc、Rochester、N.Y.)促进在组织培养中病毒的比例增大生产。更重要地,在Q-Sepharose上纯化rAAV1、2和5病毒粒子以允许使用相同的方法比较纯化的病毒粒子。而且,基于方案的细胞工厂得到具有从1×109细胞中纯化的1×1012至1×1013vg/ml滴度的病毒粒子原株。这些层析方法具有额外的益处,即它们能够轻易地增大比例以从1×1010细胞中纯化病毒。
通过优化转染方案和纯化方法,常规能够获得每个细胞100至200感染单位(IU)。为了从1×109细胞中制备,例如,rAAV的最终产量是大约1至5×1011IU或大约1×1012至1×10-13载体基因组。
在没有密度梯度离心的情况下还使用层析纯化病毒粒子。例如,来自感染细胞的分解产物能够直接进行层析以纯化rAAV病毒粒子。关于涉及层析的rAAV载体的大规模生产方法,参见Potter等(Methods Enzymol.,2002,346:413-430)。
通过使用抗AAV抗体,优选地固定抗体,重组病毒粒子可以进行或可以包括亲和性纯化病毒粒子载体的另外步骤。抗AAV抗体优选的是单克隆抗体。特别合适的抗体是单链骆驼科动物抗体或其片段,如可从骆驼或美洲鸵身上获得的(参见,例如Muyldermans,2001,Biotechnol.74:277-302)。rAAV的亲和性纯化抗体优选的是与AAV衣壳蛋白上的表位特异性地结合的抗体,借此优选地表位存在于一个以上AAV血清型衣壳蛋白上。例如,可以基于与AAV2衣壳结合的特异性提高或选择抗体,但同时其也可以与AAV1、AAV3和AAV5衣壳特异性结合。
重组SV40病毒粒子的制备方法
另一方面,本发明涉及用于重组SV40病毒粒子的制备方法,包括:
(i)使细胞接触包含复制缺陷的SV40基因组的多核苷酸,其包含表达框,该表达框包含编码IGF-I或其同功能变体的序列,该序列可操作地与肝特异性启动子连接,而且其中在所述多核苷酸足以进入细胞的情况下细胞表达在所述多核苷酸中补充复制缺陷的SV40基因,和
(ii)从细胞中回收重组SV40病毒粒子。
在步骤(i)中,细胞与包含复制缺陷的SV40基因组的多核苷酸接触,该SV40基因组包含含有编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,该序列可操作地与肝特异性启动子连接。优选地,SV40基因组缺乏编码大T抗原的区域。
SV40基因组,其在晚期启动子的控制下缺乏编码大T抗原的序列但还含有编码衣壳蛋白的序列,然后能够在常规克隆载体中增殖。然后在肝特异性启动子的控制下的转基因能够在之前由大T抗原占据的克隆载体的区域中克隆。病毒DNA序列能够从克隆载体中切除和纯化,而且能够重新连接以形成环状DNA。通过使用重新连接的环状病毒载体DNA转染表达大T抗原的包装细胞来产生和扩增病毒粒子。特别优选的包装细胞是基本表达能够补充SV40载体的T抗原的细胞系。合适的细胞是Cos-1细胞系。然而,在对SV40大T抗原引入基因后能够使用其他细胞系。
肝特异性启动子能够是上述定义的任何启动子。在优选的实施方式中,肝特异性启动子是包含白蛋白增强子区和α1抗胰蛋白酶启动子的杂交启动子。在另一优选的实施方式中,肝特异性启动子是诱导型肝特异性启动子。
因此本发明通过以下实施例来解释,这些实施例仅用于说明,而不会限制本发明的范围。
具体实施例
在肝硬化中编码IGF-I(dsAAVIGF-I)的双链AAV载体的效果评估
材料和方法
构建和产生双链AAV载体。本研究中使用的AAV质粒含有两侧连着来自AAV2的两个ITR的表达框和适当填充序列以调整AAV基因组的大小从而达到所述的用于AAV的最佳的包装能力。转基因表达框具有以下元件:来自AAV2的5’ITR,来自白蛋白增强子的具有调控序列的肝特异性启动子EalbAATp(Kramer等,2003,Mol Ther.7:375-85),鼠IGF-I cDNA、SV40聚腺苷酸化和来自AAV2的3’ITR。为了产生双链AAV载体,3’ITR缺乏末端分解位点,如McCarty等et al.(Gene Therapy 2003;10:2112-2118)所描述。该AAV质粒命名为pAAVIGF-I。使用十分普遍的PBGD启动子和荧光素酶报道基因(GenBank acc #M15077)制备相似的构建体。该AAV质粒命名为pAAVLuc。通过在三个不同质粒pAdDeltaF6、p5E18-VD2/8和治疗的(pAAVIGF-I)或报道基因(pAAVLuc)的293个细胞中通过磷酸钙介导的共转染来产生双链dsAAV2/1载体(Hermens等,1999 Hum Gene Ther.10:1885-91和Gao等2002,Proc Natl Acad Sci USA,99:11854-9)。简言之,用pAdDeltaF6、p5E18-VD2/8和靶载体通过磷酸钙共转染293个细胞,而且病毒通过在转染后48小时冻融细胞来获得。病毒通过离子交换柱层析和碘克沙醇梯度离心以及之后的对磷缓冲盐水(PBS)-5%蔗糖的过滤和进一步浓缩后来纯化。通过重复三次实施Q-PCR来确定每毫升基因组的拷贝数,从而确定dsAAVIGF-I病毒滴度,TaqMan(AppliedBiosystems)分析使用扩增95bp片段的hAAT启动子区的引物pr300fw5’CCCTGTTTGCTCCTCCGATAA3’(SEQ ID NO:8)pr301rv 5’GTCCGTATTTAAGCAGTGGATCCA 3’(SEQ ID NO:9)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来确定蛋白组成和纯度。
建立的肝硬化模型。如描述的持续8周每周胃内施用四氯化碳(CCl4,Riedel-de)施用和饮用水中400mg/l的苯巴比妥在(180至200g)的雄性Sprague-Dawley鼠中诱导硬化(Runyon BA等,Gastroenterology.1991;100:489-493.)。简言之,初始CCl4剂量是每只鼠20μl。随后的剂量基于最后剂量后48小时的体重变化来调整(Runyon等,如上所述)。每天至少观察所有鼠两次直至其死亡。在此方案后,一些动物体内明显有腹水。第一次施用CCl4后第3、5和8周从眼窝丛收集血样。在Hitachi自动分析仪(Roche)中测量(ABX诊断学)血清转氨酶(丙氨酸转氨酶和天冬氨酸以及碱性磷酸酶)、白蛋白和胆红素。结果示出在施用CCl48周后转氨酶达到最高水平。
病毒载体的施用。分析四个动物实验组:健康鼠(n=19)、用盐水(Ci)注射的肝硬化鼠(n=16)、用dsAAVLuc(Ci+Luc)的3.4x 109病毒颗粒治疗的肝硬化鼠(n=19)或用dsAAVIGF-I(Ci+IGF-I)的3.4x 109病毒颗粒治疗的肝硬化鼠(n=23)。通过在肝动脉中注射施用载体。在施用载体4天(健康n=5,Ci n=4,Ci+Luc n=4,Ci+IGF-I n=6)、2周(健康n=4,Cin=3,Ci+Luc n=5,Ci+IGF-I n=6)、8周(健康n=5,Ci n=4,Ci+Luc n=5,Ci+IGF-I n=5)、16周(健康n=5,Ci n=5,Ci+Luc n=5,Ci+IGF-I n=6)或一年后(健康n=3,盐水n=4,Ci+AAVLuc n=2,Ci+IGF-I n=4)处死动物。也处死健康鼠作为对照。在最后一次施用CCl4后4天和8周用SVIGF-I的1011病毒颗粒治疗并处死的动物也包括在阳性对照中,而且包括在补充信息中。在处死前收集血样并如上述说明分析。为了用于组织学并用于进一步分析纯化RNA和蛋白,处理肝样品。
在血清中血清标记和IGF-I的分析。在Hitachi自动分析仪(Roche)中测量(ABX诊断学)血清转氨酶(丙氨酸转氨酶和天冬氨酸和碱性磷酸酶)、白蛋白和胆红素。通过ELISA使用OCTEIA大鼠/小鼠IGF-I(IDS)定量血清中的IGF-I。
肝组织学和免疫组织化学。如描述的(Vera M.等,Gene Ther.2007;14:203-210)定量和评估肝胶原含量。使用以1∶100或1∶400稀释的抗体1A4(M0851,Dako)进行α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的免疫组织化学染色,并使用以1∶50稀释的抗体SP6(RM-9106,NeoMarkers)进行Ki-67的免疫组织化学染色。
肝蛋白和RNA分析。通过ELISA在肝提取物中测量总肝IGF-I(OCTEIA大鼠/小鼠IGF-I,体外)。
通过ELISA在肝提取物中测量HGF(Institute of immunology Co,Ldt)、MMP2(基质金属蛋白酶-2活性试验Biotrak系统)和MMP9(基质金属蛋白酶-9活性试验Biotrak系统)。
还使用荧光生成肽底物(Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2;R&Dsystems)在肝提取物中评估总MMP活性(Knight CG等,FEBS Lett.1992;296:263-266)。使用重组人MMP-2(Calbiochem)作为阳性对照。如前所述提取总RNA(Vera等,如上所述)。如所描述的使用表1中示出的引物进行qRT-PCR(Vera等,如上所述)。
肝细胞分离。在使用链霉蛋白酶和释放酶(以分离星形细胞、库普弗细胞和内皮细胞)或胶原酶(以分离肝细胞)(Wang SR等In Vitro Cell DevBiol.1985;21:526-530)。为了分离肝细胞,将肝细胞在4℃下以500rpm离心4分钟。在不含血清的William′s培养基中将肝细胞颗粒冲洗两次,并在4℃下以500rpm离心2分钟。当细胞活力低于70%时,有活力的肝细胞在80%Percoll梯度中纯化。为了分离星形细胞、库普弗细胞和内皮细胞,在4℃下以50g离心5分钟后首先弃掉肝细胞。通过4℃下以450g离心7分钟在不含血清的DMEM-F12中将上清液冲洗3次。然后,通过在Nycodenz梯度下在4℃下以1450g离心20分钟分离细胞。从梯度上层去除肝星状细胞,将其在DMEM中冲洗,并在4℃下以450g离心5分钟。将库普弗细胞和内皮细胞从Nycodenz梯度的中间相中回收,并在不含血清的DMEM中冲洗。
统计分析。数据以平均数±标准方差来表示。使用Student’st检验评估统计上的显著性。P值<0.05被认为是显著的(*)。使用SPSS v11.0(SPSSInc)进行所有的统计分析。
实施例1.建立的肝硬化模型的分析
在第一次施用CCl4 8、16、25、33周后从眼窝丛中收集血样(图1A)。在Hitachi自动分析仪(Roche)测量(ABX诊断学)血清转氨酶(丙氨酸转氨酶和天冬氨酸以及碱性磷酸酶)、白蛋白和胆红素。结果表明在施用CCl48周后转氨酶达到最高水平(图1B)。然后,转氨酶下降但水平高于首次使用CCl4甚至33周后的健康动物(图1B)。使用胆红素获得同样的结果(数据未示出)。而且,在施用CCl48周后白蛋白水平下降而且仍然低于初始方案33周后的健康对照(数据未示出)。
首次施用CCl4后16、21或33周处死动物。将肝样品固定在4%多聚甲醛中、石蜡包埋并用苏木精伊红染色以评估肝形态学(数据未示出)。通过天狼星红染色评估肝胶原含量并通过成像分析来评分(AnalySIS 3.1,软成像系统)(Vera等,如上所述)。在方案开始16周后肝纤维化明显,并在21和33周肝纤维化仍然存在(图1C和D)。如通过天狼星红染色定量所示,所有实例中观察相似的水平(图1D)。我们没有在不同的样品中观察到实质结节大小的显著改变。
实施例2.IGF-I基因转移到硬化肝
为了评估IGF-I在鼠硬化肝中的影响,使用CCl4持续诱导肝硬化8周(图2)。通过动脉内施用盐水或编码荧光素酶(dsAAVLuc)或IGF-I(dsAAVIGF-I)的重组双链腺病毒相关(dsAAV)载体来治疗肝硬化鼠。我们选择这种路线因为之前用dsAAVLuc的实验在动脉内注射载体后示出了良好的表达水平。而且,肝动脉导管插入之后的该路线可能是对患者使用的最适当的程序。将治疗的鼠在病毒注射4天、2周、8周、16周和1年后处死。同样将健康鼠处死作为对照。
为了评估在鼠肝中来自dsAAVIGF-I的转基因表达,我们在来自所有组的肝和血样中施行IGF-I的qRT-PCR和ELISA。如所预料的一样,与健康鼠相比,IGF-I的mRNA和蛋白水平在Ci+IGF-I组中显著升高,并在对照硬化肝(Ci and Ci+Luc)中显著下降(图3A和B)。如已经描述的,在施用最后剂量的CCl44天后,与健康对照相比,IGF-I在肝硬化动物血清中下降(图3C)。然而,在施用最后剂量的肝毒物2周后在硬化和健康动物中IGF-I水平是相似的。在任何分析时间下施用dsAAVIGF-I不会导致血清中IGF-I的升高(图3C)。综合考虑,这些数据表明dsAAVIGF-I载体能够转导硬化肝并表达保存进肝中的IGF-I蛋白。通过qRT-PCR在肝提取物中评估IGF-IBP3mRNA水平(图3D)。结果示出,与对照相比,在dsAAVIGF-I治疗的动物中IGF-I升高。表达的IGF-I是活性的,因为其可以激活IGF-IBP3的表达。因此,在dsAAVIGF-I注射一年后还能够检测IGF-I和IGF-IBP3的升高水平。然而,在后施用载体的较早时期,这些因子的水平低于观察的水平。
实施例3.转移到硬化肝的IGF-I基因改善肝功能并导致肝纤维化的明显减少
使用dsAAVIGF-I治疗的肝硬化鼠示出了在生物化学肝测试中的显著改善:血清AST、ALT、ALP和胆红素显著低于对照肝硬化鼠中的水平,并与健康对照的水平相似(图4A至B)。而且,与Ci和Ci+Luc动物比较,血清白蛋白在Ci+IGF-I鼠中显著升高,达到与健康对照相似的水平(图4C)。施用载体2周后,这些改变是显著的。
这些发现伴随明显的组织学改善,即在dsAAVIGF-I治疗的鼠中纤维化的极度减少和硬化的溶解(图5A)。通过qRT-PCR定量纤维化并测量I型胶原和IV型胶原的mRNA表达,证实与肝硬化对照相比,在dsAAVIGF-I治疗的动物中观察到纤维化减少(图5B至D)。从施用载体2周后纤维化的减少是显著的,并且治疗16周后纤维化复原获得健康肝。另外,施用载体1年后肝的组织病理学分析并未显示肝硬化。这表明在施用最后剂量的肝毒物1年后即使在肝硬化对照中肝硬化退化。在肝硬化对照中天狼星红染色的肝区显示某些纤维化病变。天狼星红染色的定量表明肝硬化对照示出了比健康动物或使用dsAAVIGF-I治疗的动物更多的纤维化(图5B)。不令人惊奇地,在1年后在所有实验组中I型胶原和IV型胶原mRNA水平相似(图5C和D)。
此外,在施用载体1年后在一些动物中进行(数据未示出)全面的尸检和完全的组织病理学分析。结果示出,使用dsAAVIGF-I治疗的动物与健康鼠或肝硬化对照没有显著差异。
实施例4.在硬化肝内的IGF-I基因表达诱导纤维溶解
在施用IGF-I的动物中观察到的肝硬化的实际溶解将需要能够去除胶原的酶(如MMP)的活化。使用功能试验以测量MMP活性,我们观察到在来自Ci和Ci+Luc组的肝提取物中,MMP活性与健康对照比较降低(图6A)。与之相反,在IGF-I治疗动物的MMP活性显著高于在健康动物中的MMP活性(图6A)。MMP活性与在获得dsAAVIGF-I的肝中MMP1、2、9和14mRNA的表达以及MMP2和MMP9蛋白表达显著升高相关(图6B至G)。从施用载体2周后检测dsAAVIGF-I治疗的动物中MMP表达和活性。在研究结束时,MMP1、MMP2、MMP9和MMP14在所有组中都示出了相似水平(图6B至G)。相反,施用载体2周后IGF-I治疗的动物示出了MMP的最高水平。然后,在研究结束时水平降低以达到与健康和肝硬化对照的相似水平。
在研究结束时,MMP的抑制剂TIMP-2在所有组中还示出了相似水平(图6E)。TIMP-2水平在健康动物是恒定的,而且在所有肝硬化组中随时间下降。在研究结束时,IGF-I治疗的动物示出了比肝硬化对照更快的下降,但示出了与肝硬化对照相似的水平。
实施例5.在硬化肝内的IGF-I基因表达降低促肝纤维化因子的表达
降低的纤维化还能够源于活化的HSC的下降。因此,肝样品的免疫组织学分析示出了αSMA(HSC活化的标记)的表达在IGF-I治疗的动物中几乎不存在,而其在对照肝硬化动物(Ci和Ci+Luc)中在隔膜周边结节中很显著(图7A)。跟观察的一致的是,我们发现在IGF-I治疗的肝中αSMAmRNA水平显著下降(图7B),表明IGF-I疗法能够降低活化的HSC。令人惊奇的是,在施用载体4天后检测出活化的HSC下降。
在施用载体1年后,与健康和IGF-I治疗的动物相比,还能够检测出αSMA mRNA水平肝硬化对照的微小上升。
在本次的后施用载体中,我们观也察到Ci+IGF-I鼠降低的TGFβ表达(图7C至E)。因为TGFβ是HSC强有力的活化剂和肝纤维化最有力的促进剂,通过IGF-I基因疗法对其下调可能是根本上形成治疗的抗纤维发生效果的主要因素。能够在肝(图7C和D)还有血清(图7E)中检测出TGFβmRNA和蛋白的下降。除了TGFβ之外,其他促进HSC生长和促成肝纤维化的分子如结缔组织生长因子(CTGF)、血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和双调蛋白(AR)在对照硬化肝中上调,但在那些用dsAAVIGF-I治疗的样品中,与对照肝硬化鼠相比明显抑制(图7F至I)。与对照肝硬化鼠相比,其他损伤和炎症的标记如IL6和TNFα也在dsAAVIGF-I中下降(图7J和K)。在施用载体4天后很多这些标记明显下降。在所有评估的时期,这些因子的水平与在健康动物中相似。在肝硬化动物中水平随时间而下降。在研究结束时,IGF-I治疗的动物示出了比肝硬化对照更快的下降,但具有与肝硬化对照相似的水平。
实施例6.在硬化肝内IGF-I基因表达增加了抗纤维发生和保肝因子的表达,而且不刺激增殖。
与这些改变一起,我们发现,与对照动物比较,在Ci+IGF-I鼠的肝中,肝细胞生长因子(HGF)的表达显著升高(图8A)。因为HGF表现出强有力的抗纤维发生活性,这种分子的上调可以促成在IGF-I治疗鼠中观察到的肝硬化的溶解。HGF还表现成保肝因子,并与HNF4α一起作为肝细胞分化的标记。HNF4a还在施用载体后4天在dsAAVIGF-I治疗的动物中上调(图8B)。相反地,WT-1,肝细胞去分化的标记在治疗的动物中降低(图8C)。最终,尽管IGF-I作为生长因子,通过PCNA表达和Ki67染色定量测量的细胞增殖也在dsAAVIGF-I治疗的动物中降低了(图9A和B)。在研究结束时,HNF4a、WT-1和PCNA水平在所有实验组中相似。然而,在IGF-I施用载体一年后仍检测出在IGF-I存在下HGF的升高。
实施例7.dsAAVIGF-I与SVIGF-I的比较
在肝硬化中已经单独研究了SVIGF-I的效果(Vera等,如上所述)或与dsAAVIGF-I同时进行了研究。使用SVIGF-I作为IGF-I的唯一源来进行两种单独研究,其示出了可重复的结果。这些结果与当SVIGF-I与dsAAVIGF-I同时分析时获得的结果非常相似。在这最后的实例中,在施用载体后SVIGF-I只分析了4天和8周。一般地,dsAAVIGF-I和SVIGF-I均能够使肝硬化恢复。使用任何一个载体,恢复肝功能至转氨酶、胆红素和白蛋白的相似水平(数据未示出)。使用SVIGF-I的转氨酶和胆红素比使用dsAAVIGF-I的略高,但差异并不显著(数据未示出)。然而,在施用载体8周后,在SVIGF-I治疗的动物中肝纤维化显著地高于使用dsAAVIGF-I治疗的鼠(图10)。另外,纤维化在dsAAVIGF-I载体施用16周后消失。这种减少即使在施用载体25周后分析动物时,在SVIGF-I治疗的动物中从未观察到(图10B)。通过测量I型胶原和IV型胶原mRNA观察到相似的差异(如上图10C和10D)。
与SVIGF-I相比,dsAAVIGF-I的升高的效率仍是个谜。在SVIGF-I和dsAAVIGF-I治疗的动物中IGF-I的表达水平都升高(图11),而且从SV40表达的IGF-I是有活性的,因为其能够活化IGF-IBP3的表达(数据未示出)。然而,在施用载体后的不同时间点上,施用dsAAVIGF-I趋向表达比注射SVIGF-I更高的IGF-I水平(图11)。在施用载体4天或8周后,IGF-I表达中的这些差异没有导致在dsAAVIGF-I和SVIGF-I治疗的动物中不同的MMP活性(数据未示出)。在从使用dsAAVIGF-I或SVIGF-I治疗的动物中分离的肝提取物中,通过ELISA测量的MMP2和MMP9的量或通过qRT-PCR测量的MMP1、MMP2、MMP9和MMP14mRNA的水平相似(数据未示出)。然而,在施用载体4天后,dsAAVIGF-I治疗示出了下降的αSMA蛋白和mRNA水平,而SVIGF-I示出了与肝硬化对照相似的水平(图12)。在dsAAVIGF-I动物中观察到的活化HSC的降低与在这些动物中致纤维性因子比在施用SVIGF-I的鼠中较高的降低相关。因此,在施用载体4天后,与SVIGF-I治疗的鼠和肝硬化对照相比,在dsAAVIGF-I治疗的动物中TGFβ、CTGF和VEGF下降(图13)。而且与对照或施用SVIGF-I相比,在递送dsAAVIGF-I 4天后保肝因子如HGF和HNF4α升高(图14)。当通过Ki67染色定量来检测dsAAVIGF-I和SVIGF-I治疗动物时,在它们之间没有观察到增殖中的显著差异(数据未示出)。
实施例8.在治疗一年后dsAAVIGF-I治疗的动物的毒物学评定。
通过比较施用dsAAVIGF-I或dsAAVLuc、或盐水治疗的肝硬化动物和健康动物来进行评估。
对注射病毒1年后处死的动物施行尸检。收集血液以评估几个参数。通过组织病理学分析来评估肾、肺、小肠、肝、大脑、小脑、骨骼肌、睾丸、脾、胃、骨髓、淋巴结、胸腺和心脏。
在研究的实验组中,脾、心脏、睾丸、肾和肝的相对重量没有示出显著差异。
从处死前24小时代谢笼中的所有动物身上收集尿液。评估几个参数,如密度、pH、颜色和浊度,以及包括酮体、葡萄糖、胆红素、蛋白和尿胆素原的分子。还定量了存在红细胞和白细胞的尿。结果示出,在所有实验组的所有这些参数中没有显著差异,甚至在某些定量中获得的值显示出高变异性。
使用血清定量红血球、血小板、白血球、中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性细胞。单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性细胞,它们在所有实验组中示出了相似值。同样的情况也发生在红血球、血小板、白血球和淋巴细胞上,尽管在这些实例中某些组具有高变异性。中性白细胞的量在健康和使用dsAAVLuc治疗的肝硬化动物中相似,但低于使用dsAAVIGF-I治疗的动物中的量。
分析造血细胞的几个特征。这些包括血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、红细胞平均体积,其通过包装的红血球总数除以红血球(MCV)总数计算、平均红细胞血红蛋白(MCH),其由红血球里携氧血红蛋白的平均量计算,以及平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)。这些参数得到在所有实验组中没有显著差异的低变异性的值。
在施用载体1年后观察到转氨酶、胆红素和白蛋白在所有实验组中没有显著差异。此外,在施用载体1年后分析血清中几个参数(数据未示出)。大多数这些参数,如肌酸磷酸激酶(fosfokinase)、甘油三酯、钠、氯、肌酐、钾、钙、镁和凝血酶原时间示出了低变异性的值,在所有实验组中非常相似,并且其统计分析示出差异不显著。在所有实验组中也没有观察到转氨酶和LDH的显著差异,但在这些实例中变异性很高。观察到总蛋白、葡萄糖、磷和TCA差异不显著的相似结果,但这些参数在dsAAVIGF-I治疗的动物中略有升高(总蛋白和TCA)或降低(葡萄糖和磷)。
如上所述,肝的组织病理学分析没有表现出肝硬化。其表明在施用最后剂量的肝毒物一年后即使在肝硬化对照中肝硬化退化。在肝硬化对照中天狼星红染色的肝区表现出某些纤维化病变。天狼星红染色的定量表明肝硬化对照示出了比健康动物或使用dsAAVIGF-I治疗的动物更多的纤维化。然而,在较早时间点上在纤维变性对照中纤维化百分比是15%,而且在施用最后剂量的肝毒物和治疗一年后已经降低到大约5%。不出所料,I型胶原和IV型胶原mRNA的水平在所有实验组中都相似。
通过组织病理学分析来评估肾、肺、小肠、肝、大脑、小脑、骨骼肌、睾丸、脾、胃、骨髓、淋巴结、胸腺和心脏。睾丸、胸腺、大脑和小脑、骨髓、淋巴结和胃没有示出显著的组织病理学变化。某些肝硬化对照示出了心脏、肌肉和脾的变化,但在健康或dsAAVIGF-I治疗的动物中没有观察到这种变化。也在对照动物中观察到了在dsAAVIGF-I治疗的动物中观察到的所有变化。在肾、肺、肝和小肠中观察到唯一的例外。一半或不到一半的动物示出了肺支气管流血、轻实质性炎症和肝中的小面积坏死或小肠派伊尔淋巴集结中的淋巴衰竭。在dsAAVIGF-I治疗的动物的肾中观察到更多变化。一半或不到一半的动物示出了肾小球尺寸增加、在鲍曼氏囊中的偶见嗜酸含量、肾炎和包围再生肾小球的增殖。所有动物示出了可能解释血清中GGT水平升高原因的某些肾小球坏死。很难使外源肝IGF-I表达与观察到的变化关联。应该评估更多的动物以解决这种结果是否具有统计显著性和关联性。
结论是,表达外源肝IGF-I一年的肝硬化动物与健康和肝硬化对照相似。分析的大多数血清和尿参数以及组织病理学研究示出AAVIGF-I治疗的动物和对照动物之间没有可复制的显著差异。然而,应该在临床试验之前的毒物学研究中使用较大组来重新评估一些参数如GGT的血清水平和肾中的组织病理学变化。
有趣的是,施用dsAAVIGF-I一年后仍然能够检测出IGF-I表达。IGF-I表达与IGFIBP3和HGF的水平升高相关,如在健康动物中所观察的。然而,在该时间点上没有检测出金属蛋白酶中的变化、炎症和致纤维性因子。
在肝硬化中编码IGF-I(ssAAVIGF-I)的单链AAV载体的效果评估
材料和方法
单链AAV载体构建和产生
使用AAV2基因组并使用AAV1将病毒假型(pseudotype)。除了荧光素酶表达框外,ssAAV载体在基因结构上与dsAAV载体(如上所述)相同,其具有与IGF-I载体相同的a1AT启动子。另外,表达框的5’和3’ITR侧翼区是AAV2野生型。
质粒pVD204的构建 为了产生pVD204,IGF1基因序列使用AccuprimeTM pfx DNA聚合酶试剂盒(Stratagene;ref:12344-024)PCR克隆。用于基因序列扩增的引物是正向引物373(5’-GGTA CCAT GTC G TC TTCACATCTC-3’)(SEQ ID NO:56)和反向引物374(5’-GCGGCCGCGAATGTTTACTT-3’)(SEQ ID NO:57)。引物373在5’侧含有KpnI位点,引物374在第5’侧上含有NotI位点。用模板质粒scAAV-IGF1(外部获得的)扩增。在1%的琼脂糖凝胶上目测PCR产物,然后直接将PCR产物连接到来自Zero BluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen)的pCRII-Blunt-TOPO载体中。连接反应后,接着重组TOPO载体在Stabl III细胞中化学转化并在Kanamycin LB琼脂板上生长。第二天,挑选6个单菌落并直接用于菌落PCR以筛选载有重组TOPO-IGF载体的菌株。对于该PCR,使用多元PCR试剂盒(QIAGEN)和引物373和374以证实在TOPO载体内存在PCR产物。然后选择1个阳性菌落并在含有卡那霉素的250ml LB培养基中生长。在进行maxiprep之后,使用100单位的NotI切割20μg分离的TOPO-IGF质粒,并使用100单位的NheI切割20μgpVD158。在80℃下热钝化20分钟后,通过加入4μL Klenow大片段(Westburg)完成两个线性构建体的平端,将其加入到两种反应中并在25℃下培养15分钟。加入20μL EDTA(100μM)并在75℃下热钝化20分钟后,使用Qiaquick PCR纯化试剂盒分离两个反应的DNA,获得11,4μg的线性TOPO-IGF和7.2μg的线性pVD157。然后,通过使用100单位KpnI.切割11,4μgTOPO-IGF和7.2μg pVD157进行第二酶切反应。通过琼脂糖凝胶电泳(1.0%)分离片段,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒从TOPO-IGF载体中分离600bp插入片段,并从凝胶中分离10900bp pVD157载体片段。通过使用基于3∶1载体/插入物摩尔比例的Quick-ligation(NEB)进行载体和插入DNA的连接。室温下培养15分钟后,如制造商手册所描述的转化进入化学活性SURE II细胞(Stratagene)。选择两个阳性菌落,并通过菌落PCR筛选。然后将阳性克隆扩增和大抽提并在-20℃下保存。
杆状病毒原株的产生。使用杆状病毒表达系统来产生杆状病毒原株:靶向质粒pVD204是使用Cellfectine共转染线性化的病毒基因组DNA进入草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞中,其中目的序列将会通过同源重组转入杆状病毒基因组中。通过使用标准菌斑测定程序识别和纯化产生的重组杆状病毒。选择良好分离的病毒菌斑并用于通过感染越来越多的昆虫细胞较大培养来产生病毒原株,达到P2或更高,其在-170℃下保存。为了插入DNA的稳定性和野生型杆状病毒杂质的存在,筛选这些原株。对rAAV产生,使用三种不同杆状病毒原株:1)藏有AAV2-Rep78/52表达框的杆状病毒;Bac.Rep 2)藏有AAV-Cap血清型1表达框的杆状病毒;Bac.Cap和3)呈现侧面连着AAV2 ITR(Bac.VD204)以包装入AAV颗粒的载体基因组的杆状病毒。
用于1L rAAV生产的杆状病毒扩增。冰冻的杆状病毒原株在37℃下解冻,然后加入1.7x 106Sf9细胞培养(每mL细胞培养3μL)。72±5小时后,通过以1900G下旋转15分钟获得感染的悬浊液。分离上清并在4℃下在黑暗处保存直至使用。对于1.0L rAAV生产,制备三种杆状病毒扩增,并将等量的Bac.Rep P5;Bac.Cap P5和Bac.VD204 P3施用于产生的细胞中。
rAAV生产。在感染前20小时启动每个都含有400mL 1.0x 106细胞的Sf9培养的两个振荡器。感染当天,监测细胞密度达到2.0x 106细胞/mL,而且活性在98%以上。将获得的杆状病毒(Bac.Rep,Bac.Cap(AAV1病毒蛋白)和Bac.VD204(AAV-IGF1表达框))加入振荡器培养中。72±5小时后,通过将45mL(10X)Tris裂解缓冲液加入每个振荡器烧瓶中获得rAAV。28℃下培养1小时后,将4000单位benzonase核酸酶加入每个振荡器中,并在37℃下在振荡器培养箱中以128rpm培养1小时。
rAAV纯化:天然溶解块以3000g离心,而且使用millipak60过滤器(Millipore)0.45μm过滤上清液。使用由XK-16柱装配的AKTA-Explorer层析系统进行亲和层析,该XK-16柱由5mL柱床体积的AVB琼脂糖凝胶高性能亲和介质填充(所有来自GE healthcare,Piscataway,NJ。接下来处理洗脱馏分(约50ml)收集到含有25mL【0.1】Tris-HCL(pH 7.5)的容器中。接着,使用横流渗滤模式进行缓冲液更换。洗出液渗滤并0.22μM过滤。将产物在-80℃下冷冻保存。
建立的肝硬化模型。如上所述的dsAAVIGF-I研究,在雄性Sprague-Dawley鼠中每周使用CCl4的胃内施用持续8周诱导硬化。
病毒载体的施用。健康动物未治疗(健康),或用于诱导肝硬化。使用盐水治疗的健康鼠组(健康),也包括硬化未治疗的鼠组(Ci)作为对照。
在肝硬化诱导结束一周后,使用以下物质治疗肝硬化动物:
-盐水(Ci);
-编码荧光素酶(ssAAV-Luc)的重组单链腺病毒伴随病毒载体(ssAAV),剂量为9.7x 109vp/鼠(极低剂量)、4.8x 1010vp/鼠(低剂量)、2.4x 1011vp/鼠(中等剂量)或可选地1.2x 1012vp/鼠(高剂量);
-编码IGF-I(ssAAVIGF-I)的重组ssAAV,剂量还为9.7x 109(极低剂量)、4.8x 1010(低剂量)、2.4x 1011(中等剂量)或可选地1.2x 1012vp/鼠(高剂量);
-编码荧光素酶(dsAAVLuc)的双链腺病毒伴随病毒载体(dsAAV),剂量为3.4x 109vp/鼠;或
-编码IGF-I(dsAAVIGF-I)的dsAAV,剂量为3.4x 109vp/鼠。
选择动脉内施用路线进行治疗。进行动脉内注射时,之前使用dsAAVLuc的实验示出了良好的表达水平。通过肝动脉的导管插入的施用可能也是用于患者的最适当程序。
在感染后(治疗)4天、2周、3周、4周和8周、12周和1年收集用于血清蛋白和因子的生物化学分析的血样。
使用dsAAVIGF-I或中等剂量ssAAVLuc治疗的某些动物(n=4)评估2个月,然后处死以分离不同群体的肝细胞,其中测量荧光素酶的表达。
在感染后的不同时期,选择、处死某些动物并获得用于评估的肝样品:
-4天后(健康n=4、盐水n=4、dsAAVLuc n=4、dsAAVIGF-I n=5、ssAAVLuc、高剂量n=4、中等剂量n=4、低剂量n=4和极低剂量n=4和ssAAVIGF-I、高剂量n=6、中等剂量n=5、低剂量n=4和极低剂量n=5);
-8周后(健康n=4、盐水n=4、dsAAVLuc n=3、dsAAVIGF-I n=6、ssAAVLuc、高剂量n=5、中等剂量=4、低剂量n=6和极低剂量n=6和ssAAVIGF-I、高剂量n=6、中等剂量n=4、低剂量n=6和极低剂量n=6);
-16周后(健康n=6、盐水n=6、ssAAVLuc低剂量n=6、ssAAVIGF-I低剂量n=6);和
-1年后(健康n=4、盐水n=4、ssAAVLuc高剂量n=4、ssAAVIGF-I高剂量n=6)。
如对dsAAVIGF-I效果评估所描述的进行所有程序和分析方法。
实施例9.转入硬化肝的IGF-I基因
在载体接种4天、8周后通过qRT-PCR在肝提取物中评估IGF-I mRNA(图15A)。为了使用低剂量ssAAVLuc和ssAVVIGF-I治疗,施用载体16周后进一步评估IGF-I mRNA(图15C)。在施用载体4天和8周后通过ELISA评估总肝IGF-1蛋白(图15B)。
结果示出,与健康对照相比,IGF-I mRNA在肝硬化动物中减少。与健康和肝硬化对照相比,IGF-I水平在IGF-I治疗动物(ssAAVIGF-I或dsAAVIGF-I)中升高。在施用IGF-I表达载体后第4天,已经可见IGF-I的升高水平。然后,在AAVIGF-I施用8周后,IGF-I蛋白水平升高,而且直到研究结束时保持恒定。同样,当使用较高剂量的ssAAVIGF-I时,观察到较高水平的IGF-I。
在施用载体4天、2周和8周后在血清中评估IGF-I。结果示出,在治疗4天后,在所有肝硬化组中IGF-I的总水平低于在健康动物中的总水平(图15D)。然而,在注射高剂量和中等剂量ssAAVIGF-I的动物血清中游离IGF-I蛋白增加。在施用载体的2和8周后,总的和游离(数据未示出)IGF-I在所有组中相似。可能的情况会是,通过诱导IGF-I结合蛋白的表达,在使用最高剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中增加的血清游离IGF-I转变成在较晚时间点上的总IGF-I。
此外,从载体中表达的IGF-I是有活性的,因为其能够活化IGF-IBP3和IGF-IR的表达,其在注射4天、8周和16周载体的IGF-I表达的动物中升高(图15F至H)。
实施例10.转入硬化肝的IGF-I基因改善肝功能并导致肝纤维化的显著减少。
载体接种4天后,转氨酶在所有肝硬化组中相似,并高于在健康动物中的水平(图16A)。然而,在施用载体2周后,使用ssAAVIGF-I或dsAAVIGF-I载体治疗的动物示出了比肝硬化对照更低的转氨酶水平。在后一个时间点上,转氨酶水平在IGF-I治疗动物中进一步降低,而且在施用载体后8周,在使用ssAAVIGF-I或dsAAVIGF-I载体治疗的动物中转氨酶水平与健康动物的水平相似(图16B)。施用载体12周后,使用低剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中观察到同样情况(图16C)。有趣的是,使用dsAAVIGF-I治疗的动物中和使用低剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中观察到相似效果。然而,在使用最高剂量ss-AAV1-IGF-I治疗的动物中效果较低(图16D)。
接种载体后第4天,胆红素在所有肝硬化动物中相似,而且高于在健康对照中的水平(图17A)。然而,施用载体2周后,使用dsAAVIGF-I或ssAAVIGF-I治疗的动物均示出了比肝硬化对照更低的胆红素水平。在后一个时间点上,胆红素水平在AAVIGF-I(单链和双链)治疗动物中进一步降低,而且施用载体8周后,胆红素水平在使用AAVIGF-I治疗的动物中与健康动物相似(图17B)。施用载体12周后,使用低剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中观察到同样情况(图17C)。施用1年后在使用高剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中发现的相似结果并且其统计学分析中示出了不显著的差异。有趣的是,使用dsAAV1IGF-I或低剂量ssAAV1IGF-I治疗的动物中观察到相似效果。然而,在使用高剂量ssAAV1IGF-I治疗的动物中效果较低(图17D)。
载体接种4天和2周后,白蛋白在所有肝硬化动物中相似,并低于健康对照水平(图18A、B)。然而,施用载体8周后,使用AAVIGF-I(单链或双链)治疗的动物示出了比肝硬化对照升高的白蛋白水平(图18B)。施用载体12周后,使用低剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中观察到同样情况(图18C)。施用1年后在使用高剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中发现相似结果并且其统计学分析示出了不显著的差异(图18D)。
使用天狼星红给肝样品染色,并定量肝纤维化(图19A)。结果示出了,硬化肝是纤维变性的,而且纤维化在使用AAVIGF-I(单链或双链)治疗的动物中下降。令人惊奇的是,高剂量AAVIGF-I比其他效率低。当通过qRT-PCR定量I型胶原和IV型胶原mRNA表达水平时,观察到相似的结果(图19B、C)。使用低剂量ssAAVIGF-I治疗16周后,纤维化和胶原mRNA表达水平在表示肝硬化总逆转的健康动物中的水平相同(图19D至F)。未检测出II型胶原mRNA,而且III型胶原mRNA水平在组中未示出区别(数据未示出)。这是预期的,因为它们在肝纤维化未累积。
实施例11.在硬化肝内IGF-I基因表达诱导纤维溶解
使用AAVIGF-I载体减少的纤维化能够由事先存在的基质沉积的降解产生。MMP能够降解细胞外胶原,因此我们在所有实验组的肝中评估MMP表达。
接种载体8周和16周后,通过qRT-PCR和ELISA分别确定MMP1、MMP2、MMP9和MMP14mRNA表达水平(图20A至D和I至M)和MMP2和MMP9蛋白水平(图20F、G)。
结果示出,与健康对照比较,所有这些MMP的表达在肝硬化动物中降低。然而,与使用AAVIGF-I载体(单链或双链)治疗的鼠中肝硬化和健康动物比较,这些因子的水平显著地升高了。这种升高在治疗后4天未检测出,但在AAVIGF-I载体施用8或16周后检测出。尽管在AAVIGF-I治疗的动物中MMP水平随时间降低,然而它们仍然高于在AAVIGF-I载体施用16周后在健康动物中观察到的水平。
观察到TIMP-2表达的逆转模式(图20E和M)。TIMP蛋白是MMP活性的抑制剂。因此,TIMP水平本质上因为高MMP活性而降低。与健康对照比较,TIMP-2mRNA表达在肝硬化动物中升高。与使用AAVIGF-I载体治疗的鼠中肝硬化对照比较,TIMP-2水平降低。这种降低在AAVIGF-I载体施用8周后检测出,而且TIMP-2水平随时间进一步降低,但在16周治疗后,它们仍高于在健康动物中观察到的水平。升高的MMP和降低的TIMP的平衡与升高的MMP活性相关。令人惊奇的是,最高剂量的AAVIGF-I诱导比其他较低的MMP表达和活性。
实施例12.在硬化肝内IGF-I基因表达诱导致纤维性因子的表达
减少的纤维化还由致纤维性细胞的降低产生。由平滑肌肌动蛋白(αSMA)标记的活化的肝星状细胞(HSC)是细胞外胶原的主要制造者。因此,我们通过具有抗αSMA抗体的免疫组织化学或通过定量αSMA mRNA来评估活化的HSC的量(图21B、C)。
结果示出在肝硬化动物中表达细胞的高水平αSMA。施用AAVIGF-I载体(单或双链)8周后,αSMA mRNA表达水平和αSMA表达细胞有明显降低。8周后,αSMA mRNA表达在肝硬化动物中降低,但高于健康对照中的表达。然而,使用ssAAVIGF-I治疗的动物中αSMA mRNA的水平与在健康动物中观察到的水平相似。使用高剂量ssAAVIGF-I治疗的动物中αSMA的降低不太明显。
来自HSC的活化、增殖、迁移和胶原合成通过致纤维性因子,如TGFβ、VEGF、PDGF、双调蛋白(AR)或CTGF调解。这种应答在由IL-6和TNFα表达标记的炎症环境中有利。因此,接种载体8周和16周后评估这些因子的肝表达(图22)。与健康动物比较,这些因子在所有肝硬化对照中大量增加并随时间趋于降低。然而,所有这些因子在AAVIGF-I治疗的肝硬化动物中明显降低,其水平达到不显著不同于在健康动物中观察到的水平。唯一的例外是IL6,其在所有动物中都相似。当使用高剂量ssAAVIGF-I时,致纤维性和炎症因子的降低不太明显。
实施例13.在硬化肝内IGF-I基因表达提高了抗纤维化和保肝因子的表达,而且未刺激增殖。
使用AAVIGF-I治疗而改善的肝功能能够由保肝因子,如HGF或HNF4α的活化产生。因此,我们首先测量HGF的mRNA和蛋白表达(图23)。
与健康鼠相比,HGF的水平在肝硬化对照中降低。然而,施用载体4天后,使用AAVIGF-I(单或双链)治疗的动物示出了与健康鼠相似的水平。在这些动物中HGF水平在较晚时间点上较高,并且与在健康对照中观察到的水平相比大量升高。当使用高剂量ssAAVIGF-I时,HGF的升高不太明显。
对HGF观察的结果与对HNF4αmRNA观察的结果非常相似(图24A至C)。因为HNF4a是成熟因子,这种结果非常有趣。事实上,IGF-I是生长因子,因此能够使用IGF-I受体活化细胞增殖。除此之外,IGF-I活化也是生长因子的HGF。即使在健康肝中肝细胞不表达IGF-I受体,我们基于AAVIGF-I治疗想要测试肝细胞的增殖和分化。我们使用作为肝分化标记WT-1,其在胎儿肝脏而不是成人组织中表达。与健康鼠相比,WT-1mRNA水平在肝硬化动物中明显升高(图24D、E)。有趣的是,使用AAVIGF-I治疗的鼠示出WT-1的mRNA水平与健康动物中的水平相似。当使用高剂量ssAAVIGF-I时,这些效果不太明显。
通过定量PCNA mRNA表达水平并通过使用增殖标记Ki67染色来测定增殖(图25)。染色后,在所有实验组中计算阳性细胞,并将结果绘入测量肝细胞增殖的图表中。与健康对照或使用AAVIGF-I治疗的动物相比,增殖水平在肝硬化对照中是最高的。施用载体4天后,硬化和AAVIGF-I治疗的动物之间没有观察到Ki67水平的任何区别。然而,施用载体8周后,表达IGF-I的动物示出了较低水平的Ki67(图25A),而且施用载体4天、8周或16周后,示出了较低水平的PCNA mRNA(图25B至D)。在IGF-I治疗的动物中这些增殖因子的水平与在健康对照中观察的水平相似。使用最高剂量的AAVIGF-I治疗的动物中观察到唯一的例外,其示出了增殖水平高于健康动物的水平,但低于肝硬化对照的水平。
实施例14.治疗一年后,在ssAAVIGF-I治疗的动物(高剂量)中的毒物学评定
通过比较使用高剂量ssAAVIGF-I或ssAAVLuc,或盐水治疗的肝硬化动物与健康动物来进行评定。
注射病毒1年后处死的动物中施行尸检。收集血液以评估几个参数。通过组织病理学分析来评估肾、肺、小肠、肝、大脑、小脑、骨骼肌、睾丸、脾、胃、骨髓、淋巴结、胸腺和心脏。
在研究的实验组中,脾、心脏、睾丸、肾和肝的相对重量未示出显著差异。
使用血清定量红血球、血小板、白血球、中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性细胞。所有细胞在所有实验组中示出了相似值。
分析造血细胞的几个特征。这些包括血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞容积,其通过包装的红血球总数除以红血球(MCV)总数计算、平均红细胞血红蛋白(MCH),其由红血球里携氧血红蛋白的平均量计算,以及平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)。这些参数得到在所有实验组中没有显著差异的低变异性的值。
分析血清中的几个参数。这些包括转氨酶(AST、ALT和ALP)(图16D)、胆红素(图17D)、白蛋白(图18D)、γ谷胺酰转肽酶(GGT)、肌酐、钾、钙、磷、镁、钠和和氯。这些参数在所有实验组中示出了相似值,并且其统计学分析示出了不显著的差异。在某些实例如胆红素、白蛋白或GGT的测量示出了高变异性。
通过测量凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白来评估凝结作用。这些测量示出了高变异性,却也示出了在所有实验组中相似的方法。统计学分析示出了不显著的差异。
通过定量天狼星红染色的肝区来评估肝纤维化(图19D)。结果和肝的组织病理学分析一起在任何一个实验组中未显示肝硬化。这表明在施用最后剂量的肝毒物一年后,即使在肝硬化对照中肝硬化是退化的。
通过组织病理学分析来评估肾、肺、小肠、肝、大脑、小脑、骨骼肌、睾丸、脾、胃、骨髓、淋巴结、胸腺和心脏。大脑、小脑、骨骼肌、睾丸、胃、骨髓、淋巴结和胸腺没有示出显著的组织病理学变化。某些肝硬化对照示出了肺、小肠、肝和脾的变化,但这种变化在健康或ssAAVIGF-I治疗的动物中没有观察到。有趣的是,这些包括在对照硬化动物中的两个肿瘤,一个在肝中,一个在肺中。在对照动物中也观察到了在ssAAVIGF-I治疗的动物中观察到的所有变化。唯一的例外是在使用ssAAVIGF-I治疗的6个动物中的2个中观察到轻微肠炎。
结论,在后治疗1年后,通过使用ssAAVIGF-I治疗表达外源肝IGF-I的肝硬化动物与健康和肝硬化对照相似。分析的所有血清参数和组织病理学研究示出了在ssAAVIGF-I治疗的动物和对照之间没有可复制的显著差异。
Claims (34)
1. 一种病毒基因组,其包含编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列,所述序列与肝特异性启动子可操作地连接。
2. 如权利要求1所述的病毒基因组,其是细小病毒载体或多瘤病毒载体。
3. 如权利要求2所述的病毒基因组,其中所述多瘤病毒载体是基于SV40的载体。
4. 如权利要求2所述的病毒基因组,其中所述所述细小病毒载体是AAV。
5. 如权利要求4所述的病毒基因组,其中所述AAV 载体是AAV1、AAV2、AAV5 或AAV8。
6. 如权利要求4或5所述的病毒基因组,其中所述AAV 载体是单链 AAV。
7. 如权利要求4或5所述的病毒基因组,其中所述AAV 载体是双链 AAV。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的病毒基因组,其中所述肝特异性启动子包含白蛋白基因增强子区和α1抗胰蛋白酶启动子。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的病毒基因组,其中IGF-I对应于人IGF-I。
10. 一种通过在合适的包装细胞中表达如权利要求1至9任一项所述的病毒基因组获得的病毒粒子。
11. 根据权利要求10所述用作药物的病毒粒子。
12. 包含如权利要求11所述的病毒粒子和药学上可接受的载体的药物组合物。
13. 治疗和/或防止肝硬化或肝纤维化的方法,包含将如权利要求10或11所述的病毒粒子施用于所需受试者。
14. 治疗和/或防止肝硬化或肝纤维化的方法,其包含将包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的重组细小病毒施用于所需受试者。
15. 如权利要求14所述的方法,其中所述重组细小病毒是AAV。
16. 如权利要求15所述的方法,其中所述AAV是AAV1、AAV2、AAV5或AAV8。
17. 如权利要求15或16所述的方法,其中所述AAV是单链 AAV。
18. 如权利要求15或16所述的方法,其中所述AAV是双链 AAV。
19. 如权利要求15至18所述的方法,其中所述AAV是AAV8 假型AAV1、AAV5或AAV8。
20. 如权利要求14至19中任一项所述的方法,其中所述编码IGF-I的序列可操作地与肝特异性启动子连接。
21. 如权利要求20所述的方法,其中肝特异性启动子包含白蛋白基因增强子区和α1抗胰蛋白酶启动子。
22. 如权利要求14至21中任一项所述的方法,其中IGF-I对应于人IGF-I。
23. 如权利要求13至22中任一项所述的方法,其中通过动脉内施用病毒粒子或重组细小病毒。
24. 如权利要求23所述的方法,其中通过肝动脉实施动脉内施用。
25. 制备重组AAV 病毒粒子的方法包含以下步骤:
在三个组分足以进入细胞中的条件下,
(i)使细胞接触
(a)第一核酸序列,其包含
i. 包含编码IGF-I或其同功能变体的的序列的表达框,所述序列可操作地与肝特异性启动子连接,和
ii. 两面连着(i)中定义的表达框的AAV 5’-ITR和3’-ITR
(b)编码AAV rep 蛋白的第二核酸序列
(c)编码AAV cap 蛋白的第三核酸序列和任选地,
(d)编码AAV依赖其复制的病毒和/或细胞功能的第四核酸序列
和
(ii)从细胞中回收重组 AAV 病毒粒子。
26. 如权利要求25所述的方法,其中步骤(i)中使用的细胞是昆虫细胞,而且其中第一、第二和第三核酸序列包含于杆状病毒载体。
27. 如权利要求25或26所述的方法,其中所述重组AAV病毒粒子是单链AAV病毒粒子。
28. 如权利要求25或26所述的方法,其中所述重组AAV病毒粒子是双链AAV病毒粒子。
29. 如权利要求25至28所述的方法,其中所述表达框(a)包含编码IGF-I或其同功能的序列下游的聚腺苷酸化信号。
30. 如权利要求25至29所述的方法,其中组分(b)包含编码AAV2 rep 基因的基因和/或组分(c)包含AAV1、AAV2、AAV5或AAV8 cap基因。
31. 如权利要求25至30中任一项所述的方法,其中肝特异性启动子包含白蛋白基因增强子区和α1抗胰蛋白酶启动子。
32. 制备重组SV40病毒粒子的方法,其包含
(i)使细胞接触包含复制缺陷SV40基因组的多核苷酸,其包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框,所述序列可操作地与肝特异性启动子连接,而且其中在所述多核苷酸足以进入细胞的条件下,所述细胞表达补充所述多核苷酸中复制缺陷的SV40基因以及
(ii) 从细胞中回收重组 SV40病毒粒子。
33. 如权利要求32所述的方法,其中所述复制缺陷SV40基因组缺乏编码大T 抗原的序列,而且包装细胞表达大T 抗原。
34. 如权利要求32或33所述的方法,其中肝特异性启动子包含白蛋白基因增强子区和α1抗胰蛋白酶启动子。
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