MX2011010116A - Metodo de codificacion de video, metodo de decodificacion de video, aparato de codificacion de video y aparato de decodificacion de video. - Google Patents

Abstract

Se describe un método de codificáción de video que hace posible reducción en la disminución en la eficiencia de codificación de un video e incremento de la calidad de imagen del video decodificado resultante que incluye: predecir una señal de video para generar una señal de predicción (S100); calcular, como una señal de error de predicción, la diferencia entre la señal de video y una señal de predicción (S110); generar una señal de video reconstruida al reconstruir la señal de video con base en la señal de predicción y la señal de error de predicción (S120); determinar elementos de datos de filtro que se usen para filtrar cada una de por lo menos dos de la señal de predicción, la señal de error de predicción y la señal de video reconstruida (S130); y codificar los elementos de datos de filtro determinados con base en las correlaciones cruzadas entre los elementos de datos de filtro determinados.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE CIRROSIS Y FIBROSIS HEPÁTICA Campo Técnico La invención se refiere al campo de la terapia génica y, más en particular, a métodos para el tratamiento de cirrosis y fibrosis hepática mediante el uso de vectores virales.

Antecedentes de la Invención El trasplante de hígado es la única opción curativa para pacientes con cirrosis hepática avanzada. Este procedimiento sólo se puede aplicar a una minoría de pacientes debido a la presencia de contraindicaciones quirúrgicas y la escasez de órganos. De hecho, la lista de espera en los EE.UU. incluye -12500 pacientes con un tiempo mediano hasta el trasplante de -300 días, más del 45% de los pacientes pasan dos añós en la lista de espera donde la mortalidad alcanza 130 por 1000 pacientes/año (Freeman R.B. et al., Am J. Transplant. 2008; 8:958-976).

El factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) es una potente hormona citoprotectora y anabólica. El IGF-I en suero es principalmente de origen hepático y circula unido a una serie de proteínas de unión (IGFBPs) que regulan la actividad biológica del IGF-I (Adamo M, et al., 1989, Endocrinology, 124:2737-2744 y Mohán S et al., 2002, J. Endocrinol., 175:19-31) . La degradación de las IGFBP libera el IFG-I que puede interaccionar y activar el receptor de IGF-I (IGF-IR). IGF-I también se puede unir al receptor de insulina y la insulina puede activar IGF-IR, pero la afinidad por su receptor afín es 100-1000 veces mayor (Nitert MD et al., 2005, Mol. Cell.

Endocrinol. 229:31-37). La interacción con IGF-IR produce la activación de las cascadas de la MAP quinasa y la PI3 quinasa que regulan genes implicados en la supervivencia, crecimiento y diferenciación celulares (Riedemann J. et al., 2006, Endocr. Relat., Cáncer. 13 Supl l:S33-43).

En la cirrosis hepática, como resultado , de la insuficiencia hepatocelular, hay una marcada reducción en los niveles de IGF-I. Esta deficiencia hormonal puede desempeñar un papel en el desarreglo metabolico sistémico presente en la cirrosis hepática (Conchillo M. et al., 2005; 43:630-636 y Lorenzo-Zuniga V. et al., 2006, Gut 55:1306-1312). De hecho, el tratamiento de ratas cirróticas con IGF-I recombinante (rIGF-I) fomenta la ganancia de peso, retención de nitrógeno, y absorción intestinal de nutrientes (Castilla-Cortázar I. et al., 2000, Hepatology, 31:592-600.). Además, se ha mostrado que rIGF-I ejerce actividades hepatoprotectoras en ratas cirróticas (Castilla-Cortázar I. et al., 1997, Gastroenterology, 113:1682-1691 y Muguerza B, et al., 2001, Biochim Biophys Acta. 1536:185-195). Además, un reciente ensayo clínico piloto con una dosis diaria de rIGF-I de 100 g/kg de peso en pacientes cirróticos, produjo un aumento significativo de la albúmina en suero y una mejora en la escala de Child-Pugh (Conchillo M. et al., 2005, J. Hepatol. 43:630-636). Sin embargo, debido a la gran cantidad de rIGF-I necesitada, el beneficio potencial de la terapia de IGF-I en cirrosis hepática está compensado por el alto coste del tratamiento .

Como alternativa a la administración directa de IGF-I, se ha propuesto el uso de vectores virales que comprende un polinucleótido que codifica IFG-I. Vera M. et al. (Gene - - Ther., 2007, 14:203-210) han descrito que la inyección de vector recombinante de virus de simio 40 que codifica IGF-I en ratas sanas puede proteger el hígado contra daño hepático inducido por CC14. Sobrevals et al (Molecular Therapy Volumen 16, Suplemento 1, Mayo 2008, S145) han descrito que la inyección de un vector recombinante del virus simio' 40 que codifica IGF-I puede revertir parte de los efectos de la cirrosis hepática inducida por CC14. Sin embargo, no todos los resultados concernientes a los vectores virales han proporcionado resultados positivos, Por ejemplo, Zarategui et al ( J. Physiol . Biochem. , 2002, 58:169-176) han descrito que la administración intramuscular de un virus adenoasociado que codifica IGF-I a ratas con cirrosis inducida por CCI4 no produjo ninguna mejora significativa del daño hepático.

Según esto, hay una necesidad en la técnica para distribución mejorada de IGF-I que sean útiles para el tratamiento de la cirrosis hepática.

Sumario de la Invención En un primer aspecto, la invención se relaciona con un genoma vírico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unido a un promotor específico de hígado.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un virión obtenible expresando un genoma vírico de acuerdo a la invención en una célula empaquetadora adecuada.

En sucesivos aspectos, la invención se relaciona con un virión de acuerdo a la invención para su uso como medicamento así como con composiciones farmacéuticas que comprenden un virión de acuerdo a la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable y a un método de tratamiento y/o prevención de cirrosis hepática o fibrosis hepática que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de un virión de acuerdo a la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el tratamiento y/o prevención de cirrosis hepática o fibrosis hepática que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de un parvovirus recombinante que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para preparar un virión AAV recombinante que comprende los pasos de (i) poner en contacto una célula con (a) una primera secuencia de nucleótidos que comprende i . un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor específico de hígado y ii. una 5'-ITR y una 3'-ITR de AAV flanqueando el cásete de expresión definido en (i) (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína rep de AAV (c) una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína cap de AAV y, opcionalmente, (d) una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica funciones víricas y/o celulares de las que AAV es dependiente para replicación en condiciones adecuadas para la entrada de los tres componentes en la célula y (ii) recuperar el virión AAV recombinante de las células.

Por último, la invención se relaciona con un método para preparar un virión SV40 recombinante que comprende (i) poner en contacto una célula con un polinucleótido que comprende un genoma de SV40 deficiente para replicación que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor específico de hígado y en donde la célula expresa los genes de SV40 que complementan el defecto en replicación en dicho polinucleótido en condiciones adecuadas para la entrada en la célula de dicho polinucleótido y (ii) recuperar el virión SV40 recombinante de las células.

Breve Descripción de las Figuras de la Invención Análisis del modelo de cirrosis hepática establecida.

Figura 1A Representación esquemática del experimento realizado para el análisis del modelo. Figura IB Análisis de transaminasas . Las transaminasas (AST, ALT y ALP) se evaluaron en suero de ratas sanas o de animales cirróticos - - controles a los tiempos indicados. Figura 1C y Figura ID Evaluación de fibrosis hepática. La deposición extracelular se tiñó con rojo sirio (Figura 1C) y se cuantificó mediante análisis de imágenes (Figura ID) a los tiempos indicados.

Representación esquemática del experimento realizado para la evaluación del efecto de dsAAVIGF-I en cirrosis hepática. Figura 2 La cirrosis se indujo durante 8 semanas y los animales se sacrificaron y se evaluaron muestras de sangre 4 días, 2 semanas, 8 semanas, 16 semanas y 1 año después de la administración del vector.

Análisis de la expresión de IGF-I en hígados tratados con IGF-I y controles. Se cuantificaron el ARNm (Figura 3A) y la proteina (Figura 3B y Figura 3C) IGF-I mediante 1 qRT-PCR (Figura 3A) o ELISA (Figura 3B y Figura 3C) de hígados (Figura 3A y Figura 3B) o suero (Figura 3C) obtenidos de animales controles sanos o cirróticos (Ci) o de animales tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los tiempos indicados. También se cuantificó el ARNm de IGFI-BP3 (Figura 3D) mediante RT-PCR a partir de los hígados obtenidos de grupos animales al igual que anteriormente para IGF-I.

Análisis de los parámetros en suero de ratas tratadas con IGF-I y controles. Se evaluaron transaminasas (AST, ALT y ALP) (Figura 4A) , bilirrubina (Figura 4B) y albúmina (Figura 4C) en suero de ratas sanas, de animales cirróticos qontrol (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los tiempos indicados.

Evaluación de la fibrosis hepática en ratas tratadas con IGF-I y controles. La deposición extracelular se tiñó con rojo sirio (Figura 5A) y se cuantificó mediante análisis por - - imágenes (Figura 5B) . Se cuantificaron los ARNm de colágeno I (Figura 5C) y IV (Figura 5D) mediante gRT-PCR. Todas las muestras se obtuvieron de ratas sanas, animales cirróticos control (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los 'tiempos indicados.

Análisis de la expresión de MMP y actividad MMP en hígados tratados con IGF-I y controles. La actividad MMP se midió con un sustrato fluorogénico (Figura 6A) , las proteínas MMP2 (Figura 6B) y MMP9 (Figura 6C) se cuantificaron mediante ELISA y los ARNm de MMP1 (Figura 6D) , 2 (Figura 6E) , 9 (Figura 6F) , 14 (Figura 6G) y TIMP2 (Figura 6H) se cuantificaron mediante qRT-PCR de hígados sanos o de hígados cirróticos obtenidos de animales control (Ci) o de animales tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los tiempos indicados.

Análisis de factores profibrogénicos , TNFot e IL6 en animales tratados con IGF-I y controles. Se detectaron la proteina (Figura 7A) y ARNm (Figura 7B) aSMA mediante inmunohistoquímica (Figura 7A) o se cuantificaron mediante qRT-PCR (Figura 7B) de hígados sanos o hígados cirróticos de animales control (Ci) o de animales tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los tiempos indicados. En estos animales, también se analizaron , el ARNm (Figura 7C) y proteína (Figura 7D y Figura 7E) de TGFfi en hígado (Figura 7C y Figura 7D) o sangre (Figura 7E) y se cuantificaron los ARNm hepáticos de CTGF (Figura 7F) , PDGF (Figura 7G) , VEGF (Figura 7H) , anfirregulina (AR, I), TNFa (Figura 7J) e IL6 (Figura 7K) mediante qRT-PCR.

Análisis de HGF, HNF4a y WT en animales tratados con - - IGF-I y controles. Se cuantificaron los ARNm de HGF (Figura 8A) , HNF4a (Figura 8B) y WT (Figura 8C) mediante qRT-PCR de hígados sanos o hígados cirróticos de animales control (Ci) o de animales tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los tiempos indicados.

Análisis de proliferación en animales tratados con IGF-I y controles. Se cuantificó la tinción de Ki67 de muestras histológicas (Figura 9A) y se cuantificó el ARNm de PCNA (Figura 9B) mediante qRT-PCR de hígados sanos o hígados cirróticos de animales control (Ci) o de animales tratados con dsAAVLuc (Ci+Luc) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) durante los tiempos indicados.

Evaluación de fibrosis hepática en ratas tratadas con SVIGF-I, dsAAV-IGF-I y controles. La deposición extracelular se tiñó con rojo sirio y se cuantificó mediante análisis por imágenes (Figura 10A y Figura 10B) . Los ARNm de colágeno I (Figura 10C) y IV (Figura 10D) se cuantificaron mediante qRT-PCR. Todas las muestras se obtuvieron de ratas, sanas, animales cirróticos control (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+AAVLuc) , dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I), SVLuc (Ci+SVLuc) o SVIGF-I (Ci+SVIGF-I) durante los tiempos indicados.

Análisis de la expresión de IGF-I en ratas tratadas con SVIGF-I, dsAAV-IGF-I y controles. Se cuantificaron la proteína IGF-I total (Figura HA) y libre (Figura 11B) y el ARNm (Figura 11C) mediante Elisa (Figura 11A y Figura 11B) o qRT-PCR (Figura 11C) de hígados de ratas sanas, animales cirróticos control (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+AAVLuc), SVIGF-I (Ci+SVIGF-I) o dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I ) durante los tiempos indicados.

- - Análisis de HSC activadas en ratas tratadas con SVIGF-I, AAV-IGF-I y controles. La proteína (Figura 12A) y ARNm (Figura 12B) de ocSMA se detectaron mediante inmunohistoquímica (Figura 12A) o se cuantificaron mediante qRT-PCT (Figura 12B) de hígados de ratas sanas, animales cirróticos control (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+AAVLuc), SVIGF-I (Ci+SVIGF-I) o dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I) durante 4 días (Figura 12A y Figura 12B) u 8 semanas (Figura 12B) .

Análisis de TGFp , CTGF y VEGF en ratas tratadas con SVIGF-I, dsAAV-IGF-I y controles. El ARNm (Figura 13A) y proteína (Figura 13B y Figura 13C) de TGF se cuantificaron mediante qRT-PCR (Figura 13A) o ELISA (Figura 13B y Figura 13C) de hígados (Figura 13A y Figura 13B) o suero (Figura 13C) obtenidos de ratas sanas, animales cirróticos 'control (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+AAVLuc), SVIGF-I (Ci+SVIGF-I) o dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I ) durante 4 días u 8 semanas. En estos animales también se cuantificaron los ARNm de CTGF (Figura 13D) y VEGF (Figural3E) mediante qRT-PCR.

Análisis de HGF y HNF4a en ratas tratadas con SVIGF-I , dsAAV-IGF-I y controles. Se cuantificaron los ARNm de HGF (Figura 14A) y HNF4a (Figural4B) mediante qRT-PCR de hígados aislados ratas sanas, animales cirróticos control (Ci) o de animales cirróticos tratados con dsAAVLuc (Ci+AAVLuc) , SVIGF-I (Ci+SVIGF-I) o dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I) durante 4 días o 8 semanas .

Análisis de la actividad y expresión de IGF-I en el hígado. (Figura 15A) iveles de expresión de ARNm de IGF-I en extractos de hígado, 4 días u 8 semanas tras el tratamiento.

- - (Figura 15B) Niveles de expresión de ARNm de IGF-I en extractos de hígado 16 semanas tras la administración del vector (dosis baja de 4,8 x 1010 pv/rata) . (Figura 15C) Niveles de proteína IGF-I en extractos de hígado. (Figura 15D y Figura 15E) Niveles de IGF-I en suero total (Figura 15D) y de IGF-I en suero libre (Figura 15E) cuantificados¦ 4 días tras el tratamiento; en el caso de ssAAVLuc, los niveles de IGF-I representados corresponden a la dosis alta de 1,2 x 1012 pv/rata y la dosis muy baja de 9,7 x 109 pv/rata. (Figura 15F) Niveles de expresión de ARNm de IGF-IBP3 en extractos de hígado, 4 días u 8 semanas tras el tratamiento. (Figura 15G) Niveles de expresión de ARNm de IGF-IBP3 en extractos de hígado 16 semanas tras la administración del vector (dosis baja 4,8 x 1010 pv/rata). (Figura 15H) Niveles de expresión de ARNm de receptor de IGF-I (IGF-IR) en extractos de hígado. Se cuantificaron todos los niveles de expresión de ARNm mediante qRT-PCR y se cuantificaron los niveles de proteína IGF-I mediante ELISA. Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Análisis de transaminasas séricas. Niveles de transaminasas (AST, ALT y ALP) cuantificados en el suero 4 días (Figura 16A) , 8 semanas (Figura 16B) , 12 semanas (Figura 16C) y 1 año (Figura 16D) tras la administración del vector. Para la semana 12, los niveles representados corresponden a la dosis baja del vector (4,8 x 1010 pv/rata). Para 1 año, los niveles representados corresponden a la dosis alta del vector (1,2 x 1012 pv/rata). Los triángulos indican dosis en orden decreciente .

Análisis de bilirrubina sérica. Niveles de bilirrubina cuantificados en el suero 4 días (Figura 17A) , 8 semanas (Figura 17B) , 12 semanas (Figura 17C) y 1 año (Figura 17D) tras la administración del vector. Para la semana 12, los niveles representados corresponden a la dosis baja del vector (4,8 x 1010 pv/rata) . Para 1 año, los niveles representados corresponden a la dosis alta del vector (1,2 x 1012 pv/rata). Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Análisis de albúmina sérica. Niveles de albúmina cuantificados en el suero 4 días (Figura 18A) , 8 semanas (Figura 18B) , 12 semanas (Figura 18C) y 1 año (Figura 18D) tras la administración del vector. Para la semana 12, los niveles representados corresponden a la dosis baja del vector (4,8 x 1010 pv/rata). Para 1 año, los niveles representados corresponden a la dosis alta del vector (1,2 x 1012 pv/rata). Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Evaluación de la fibrosis hepática. Se evaluó la fibrosis hepática mediante: cuantificación por análisis de imagen de la deposición extracelular en muestras de tejido teñidas con rojo Sirio (Figura 19A y Figura 19C) ; y cuantificación de los niveles de expresión de ARNm de colágeno I (Figura 19B y Figura 19D) y IV (Figura 19C y Figura 19F) en tejido hepático mediante qRT-PCR. Los datos representados corresponden a muestras tomadas 8 semanas tras el tratamiento (Figura 19A-Figura 19C) y 16 semanas tras el tratamiento (Figura 19D-Figura 19F) . Para el último caso, los datos representados corresponden a la dosis baja de ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

- - Análisis de MMP y de inhibidores de MP. Se obtuvieron muestras de extractos de hígado 8 semanas (Figura 20A-Figura 20H) o 16 semanas tras el tratamiento (Figura 201-Figura 20 ) . Para Figura 20E y Figura 20F, los datos representados para ssAAVIGF-I corresponden a la dosis alta y a la dosis muy baja. Para el último caso, los datos representados corresponden a la dosis baja (4,8 x 1010 pv/rata) de. ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Se cuantificó la expresión de ARNm para MMP1 (Figura 20A, Figura 201), MMP2 (Figura 20B, Figura 20J) , MMP9 (Figura 20C, Figura 20K) , M P14 (Figura 20D, Figura. 20L) y TIMP-2 (Figura 20E, Figura 20M) mediante qRT-PCR. Se cuantificaron los niveles de proteína MMP2 (Figura 20F) y MMP9 (Figura 20G) mediante ELISA. Se evaluó también la actividad MMP total (Figura 20H) . Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Análisis de células estrelladas hepáticas (HSC) . Se analizó la expresión de aSMA en muestras de hígado obtenidas 8 semanas (Figura 21A-Figura 21B) o 16 semanas tras el tratamiento (Figura 21C) . Para el último caso, los datos representados corresponden a la dosis baja de ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Figura 21A Localización de aSMA en tejido hepático mediante inmunohistoquímica específica de aSMA . Figura 21B y Figura 21C Expresión de ARNm de aSMA cuantificada mediante qRT-PCR. Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Análisis de factores inflamatorios y profibrogénicos . Se obtuvieron muestras de extractos de hígado 8 semanas (Figura 22A, Figura 22C, Figura 22E, Figura 22G, Figura 221, Figura 22K y Figura 22M) o 16 semanas tras el tratamiento (Figura - - 22B, Figura 22D, Figura 22F, Figura 221, Figura 22J, , Figura 22L y Figura 22N) . Para el último caso, los datos representados corresponden a la dosis baja de ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Se cuantificó la expresión de ARNm de TGFft, TNFa, IL-6, CTGF, VEGF, PDGF y anfirregulina (AR) mediante qRT-PCR. Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Análisis del factor de crecimiento de hepatoci os HGF.

Se obtuvieron muestras de extractos de hígado 4 días (Figura 23A- Figura 23B) , 8 semanas (Figura 23C- Figura 23D) o 16 semanas tras el tratamiento (Figura 23E) . Para Figura 23A y Figura 23B, los datos representados para ssAAVIGF-I corresponden a la dosis alta y a la dosis muy baja. Para el último caso, los datos representados corresponden a la dosis baja de ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Se cuantificó la expresión de ARNm de HGF mediante qRT-PCR (Figura 23A, Figura 23C y Figura 23E) ; se cuantificaron los niveles de proteína HGF mediante ELISA (Figura 23B y Figura 23D) . Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Análisis de factores de diferenciación. Se obtuvieron muestras de extractos de hígado 4 días (Figura 24A) , 8 semanas (Figura 24B, Figura 24D) o 16 semanas tras el tratamiento (Figura 24C, Figura 24E) . Para los 4 días, la dosis representada para ssAAVLuc corresponde a la dosis muy baja. Para las 16 semanas, los datos representados corresponden a la dosis baja de ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Se cuantificaron los niveles de expresión de ARNm del factor de maduración HNF4a (Figura 24A, Figura 24B y Figura 24C) y el factor de diferenciación WT-1 (Figura 24D y Figura 24E) mediante qRT-PCR. Los triángulos indican dosis en orden decreciente .

Análisis de proliferación. Figura 25A Cuantificación de núcleos teñidos con Ki67 en muestras de tejido hepático obtenidas 4 días tras el tratamiento. Figura 25B, Figura 25C y Figura 25 Niveles de expresión de ARNm del factor de proliferación PCNA cuantificados mediante qRT-PCR en muestras de extractos de hígado obtenidas 4 días (Figura 25B) , 8 semanas (Figura 25C) o 16 semanas (Figura 25D) tras el tratamiento. Para los 4 días, la dosis representada para ssAAVLuc corresponde a la dosis muy baja. Para las 16 semanas, los datos representados corresponden a la dosis baja de ssAAVLuc y ssAAVIGF-I. Los triángulos indican dosis en orden decreciente.

Descripción de las Modalidades Representativas de la Invención Los autores de la presente invención han observado que la administración a ratas con cirrosis hepática establecida de un vector viral que codifica IGF-I en donde el polinucleótido que codifica IGF-I esté bajo el control de un promotor específico de hígado activa un programa de reparación de tejido caracterizado por la estimulación de fibrolisis, la regulación por descenso de factores profibrogénicos y la inducción de moléculas citoprotectoras . Estos cambios se asocian con una marcada mejora de la estructura del hígado y la función hepatocelular . Estos descubrimientos sugieren que la transferencia del gen IGF-I con los vectores AAV al hígado cirrótico puede ser una opción terapéutica potencial para pacientes con cirrosis hepática - - avanzada a los que no se les puede ofrecer trasplante de hígado o que empeoran en la lista de espera para el trasplante .

Genomas Víricos Los autores de la presente invención han observado que la transferencia de IGF-I al hígado cirrótico usando un vector viral en donde la secuencia que codifica IGF-I está bajo el control de un promotor específico de hígado produce una mejora en la función hepática y una reducción de la fibrosis hepática (ver los ejemplos 3 y 10 de la presente invención) . De esta manera, en un primer aspecto, la invención se refiere a un genoma vírico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor específico de hígado.

Como se usa aquí, el término "genoma vírico" se refiere a un genoma vírico (es decir, ADN vírico) recombindnte que comprende una o más secuencias heterólogas de nucleótidos. Preferiblemente, no todas las otras secuencias codificantes estructurales y no estructurales están presentes en el vector viral ya que pueden ser proporcionadas en trans de un vector, tal como un plásmido, o integrando establemente las secuencias en una línea celular empaquetadora. Los vectores se pueden utilizar con el fin de transferir ADN a células, in vitro, in vivo o ex vivo. Los genomas víricos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, un vector de adenovirus, un vector de retrovirus, un vector del virus de la vacuna, incluyendo vectores basados en poxvirus, un vector de virus adenoasociado, un vector de virus de - - polioma, un vector de alfavirus, un vector de rabdovirus, un vector de picornavirus, un vector de herpesvirus, incluyendo vectores de EBV, incluyendo vectores de lentivirus, vectores basados en MMLV.

El término "secuencia de nucleótidos" , se usa aquí de forma intercambiable con "polinucleótido", y se refiere a cualquier forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y compuesta por ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos . El término incluye tanto polinucleótidos monocatenarios como bicatenarios asi como polinucleótidos modificados (metilados, protegidos y similares) .

El término "IGF-I", como se usa aquí, se usa de forma intercambiable con los términos "factor de crecimiento insulinico I" y somatomedina C y se refiere a una familia de polipéptidos caracterizados en que muestran efectos similares a insulina y estructura similar a insulina, compartiendo casi el 50% de homología de aminoácidos con la insulina. Además, mediante modelado tridimensional, se ha observado que las estructuras de los IGF son similares a proinsulina que es un polipéptido de cadena sencilla, entrecruzado por tres puentes disulfuro y que consiste en un parte amino terminal similar a la cadena B (dominio B) , un péptido de conexión (dominio C) , y una parte similar a la cadena A (dominio A) . Además, está presente una extensión carboxilo terminal no encontrada en la proinsulina (dominio D) . El polipéptido IGF-I comprende aún otra extensión carboxilo terminal no encontrada en la proinsulina a la que se ha designado como dominio E.

Las moléculas adecuadas de IGF-I útiles para la invención incluyen, sin limitación: - - Aminoácidos 1-158, 49-158 ó 49-116 del polipéptido descrito en NCBI con el número de acceso NP_001104753 (SEQ ID N0:1), que corresponde, respectivamente, a la isoforma humana 1 de prepro-IGF-I, pro-IGF-I o IGF-I maduro.

Aminoácidos 1-137, 33-137 ó 33-102 del polipéptido descrito en NCBI con el número de acceso NP_001104754 (SEQ ID NO:2), que corresponde, respectivamente, a la isoforma humana 2 de prepro-IGF-I , pro-IGF-I o IGF-I maduro.

Aminoácidos 1-195, 49-195 ó 49-118 del polipéptido descrito en NCBI con el número de> acceso NP_001104755 (SEQ ID NO: 3), que corresponde, respectivamente, a la isoforma 3 de prepro-IGF-I, pro- IGF-I o IGF-I maduro humano.

La invención también contempla el uso de polinucleótidos que codifican IGF-I de diferentes especies animales tal como, sin limitación: ARNm del factor de crecimiento insulinico I (IGF-I) de Cervus elaphus (No. de acceso de GenBank U62106) ; ARNm del precursor del factor de crecimiento insulinico I (IGF-I) de Equus caballus (No. de acceso de GenBank U28070) ; : ARNm para el factor de crecimiento insulinico I (IGF-I) de cabra (No. de acceso de GenBank D11378); ARNm del precursor del factor de crecimiento insulinico I (IGF-I) de Oryctolagus cuniculus (No. de acceso de GenBank U75390) ; ARNm del factor de crecimiento insulinico I de cerdo (pIGF-I) (No. de acceso de GenBank M31175); ARNm del factor de crecimiento insulinico I (IGF-I) de Ovis aries (No. de acceso de GenBank M89787); - - genes IA y IB del factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) humano, exón 1, (Nos. de acceso de GenBank M12659 y M77496;) ARNm del factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) de rata (No. de acceso de GenBank No. M15480) ; ARNm del factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) de pollo ((Nos. de adceso de GenBank 32791 y M29720) ; ARNm del factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) de salmón (No. de acceso a GenBank M32792) ; ARNm del factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) de X. laevis (No. de acceso de GenBank No. M29857) .

El experto en la materia apreciará que IGF-I se sintetiza como una forma precursora que sufre un primer paso de corte por la peptidasa señal tras el acceso a la vía secretora para producir pro-IGF-I que se procesa entonces a IGF-I maduro medíante procesamiento endoproteolíticó de su región C-terminal. De esta manera, la secuencia de nucleótidos presente en el vector de la invención puede codificar para la forma precursora de longitud completa, que debe ser procesada por la maquinaria de la célula diana basada en la presencia del péptido señal endógeno dé IGF-I. De forma alternativa, también es posible incluir un polinucleótido que codifique el pro-IGF-I fusionado a una secuencia señal heteróloga. La expresión "secuencia señal", como se usa aquí, se refiere a una secuencia de ADN en el extremo 5' de un gen estructural que se transcribe y traduce junto con el gen. El líder normalmente produce una proteína que tiene una extensión peptídica N-terminal algunas veces denominada una pro-secuencia. Para proteínas destinadas para la secreción al medio extracelular o a la membrana, esta secuencia señal dirige la proteína al retículo endoplásmico a partir del cual es liberada al destino apropiado. La - - secuencia líder normalmente está codificada por el ácido nucleico deseado, derivada sintéticamente o aislada dé una secuencia génica diferente. Las secuencias heterólogas adecuadas como secuencias señal para fomentar la secreción del polinucleótido de la invención incluyen las secuencias señal de gelsolina, albúmina, fibrinógeno, entre otras, los péptidos señal de activador tisular del plasminógeno, insulina y factor de crecimiento de neuronas (NGF) .

El experto en la materia también apreciará que, mientras que la longitud del genoma vírico no supere el límite del tamaño de empaquetamiento de la cápside vírica, el1 genoma vírico de la invención puede comprender parte o todas las secuencias genómicas que codifican IGF-I, en cuyo caso, la región codificante de IGF-I estará interrumpida por regiones intrónicas.

La invención también contempla genomas víricos que comprenden secuencias que codifican variantes y fragmentos de IGF-I conocidos en la técnica tal como los descritos por Sara, V.R. et al ( Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 1986, 83: 4904-4907), Ballard, F.J. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 149: 398-404); Bayne et al (J. Biol . Chem. 1988, 263:6233-6239); Sara V. R. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 165:766-771); Forsberg et al., 1990, Biochem. J. 271:357-363); Patentes de EE.UU. Nos. 4876242 y 5077276; y las publicaciones de patentes internacionales Nos. WO87/01038 y WO89/05822. Los análogos representativos incluyen uno con una deleción del Glu-3 de la molécula madura, análogos con hasta 5 aminoácidos truncados del extremo N, un análogo con un truncamiento de los 3 primeros aminoácidos N-terminal (referido como des (1-3) -IGF-I, des-IGF-I, tIGF-I, o IGF de - - cerebro) , y un análogo que incluye los primeros 17 aminoácidos de la cadena B de la insulina humana en lugar de los primeros 16 aminoácidos de IGF-I humano.

De esta manera, la invención se debe interpretar que incluye ADN que codifica variantes funcionales equivalentes de IGF-I. El término "variante funcional equivalente", como se usa aquí se refiere a cualquier polipéptido cuya secuencia se puede obtener de la secuencia de IGF-I como se ha definido anteriormente por medio de inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o dentro de la secuencia y que sustancialmente conserva la actividad biológica de IGF-I. Los métodos para determinar si una variante conserva la actividad biológica de IGF-I nativo son ampliamente conocidos para el experto en la materia e incluyen, la determinación de la síntesis de ADN y proteína en bóveda craneal de rata cultivada como describen Canalis et al ( J.Clin. Invest. , 1980, 66:709-719), la estimulación de absorción de sulfato y timidina en cartílago de pollo como describen Jennings et al., (J. Clin. Endocrinol. Metab., 1980, 51:1166-70) o la estimulación de la síntesis dé ADN en la línea celular de músculo liso clónico aórtico de rata A10 como describen Bayne et al ( J. Biol . Chem. , 1988, 263 : 6233-6239) .

Las variantes de IGF-I se pueden obtener sustituyendo nucleótidos en el polinucleótido que representan la preferencia de codones en la célula huésped que se va a usar para producir el IGF-I. Tal "optimización de codón" se puede determinar a través de algoritmos de ordenador que incorporan - - tablas de frecuencia de codones tal como "Ecohigh . Cod" para preferencia de codones de genes bacterianos que se expresan mucho proporcionado por Paquete de Universidad de Wi'sconsin versión 9, Genetics Computer Group, adison, Wis. Otras tablas útiles de frecuencia de codones incluyen "Celegans_high . cod" , "Celegans _low.cod", Drosophila_high . cod" , "Human_high . cod" , "Maize_ high.cod", y "Yeast_ high.cod".

Las variantes de IGF-I se pueden generar haciendo cambios conservadores de aminoácidos y probando la variante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente u otro ensayo funcional conocido en la técnica. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifático-hidroxilo es sérina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparragina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina , fenilalanina-tirosina, lisina-arginina , alanina-valina, y asparragina-glutamina.

Las variantes funcionalmente equivalentes de IGF-I incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos al - - IGF-I nativo. La expresión "sustancialmente homólogos", como se usa aquí, se refiere a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente cuando su secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos de la invención de al menos iel 60%, de forma ventajosa al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 85% y más preferiblemente de al menos el 95%. Una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos de la invención típicamente se puede aislar de un organismo productor del polipéptido de la invención basado en la información contenida en dicha secuencia de nucleótidos, o se construye basado en la secuencia de ADN descrita anteriormente. El grado de identidad entre dos polinucleótidos se determina usando algoritmos y métodos de ordenador que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTN [BLAST Manual, Altschul,, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S . , et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]. BLAST y BLAST 2.0 se usan, con parámetros descritos aquí, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia. El software para realizar los análisis por BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud en la secuencia interrogante, que bien coincide o satisface alguna puntuación umbral valorada positivamente T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. A T se hace referencia como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul, et al., supra) . Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia durante tanto como la puntuación acumulativa de alineamiento se pueda aumentar. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación recompensa para un par de residuos que se aparean; siempre 0) y N (puntuación de penalización para residuos mal emparejados; siempre 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabra en cada dirección se paran cuando: la puntuación acumulativa de alineamiento desciende en la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa po defecto una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y los alineamientos de matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 1989, 89:10915) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.

Como apreciarán los expertos en la materia, las variantes o fragmentos de IGF-I se pueden generar usando técnicas convencionales, tal como mutagénesis, incluyendo la creación de mutaciones puntuales discretas, o mediante truncamientos. Por ejemplo, una mutación puede dar lugar a variantes que retienen sustancialmente la misma, o simplemente una subserie, de la actividad biológica de un factor de crecimiento polipeptidico del que deriva.

Como se usa aquí, el término "unido operativamente" se refiere a una unión de elementos de un polinucleótido (o polipéptido) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en un relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de transcripción está operativamente unida a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente unido significa que las secuencias de ADN que están unidas son típicamente contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Como se usa aquí, el término "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificantes, y está localizada en dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción de la secuencia codificante, y se identifica estructuralmente mediante la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero no limitado - - a sitios de unión de factores de transcripción, sitios de unión de proteina represoras y activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos que el experto en la materia sabe que actúa directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor, incluyendo, por ejemplo, atenuadores o potenciadores, pero también silenciadores. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de los tejidos en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o en relación al desarrollo, por ejemplo mediante la aplicación de un inductor químico. Un promotor "específico de tejido" es un promotor activo sólo en tipos específicos de tejidos o células, es decir, un promotor que es más activo en uno o varios (por ejemplo dos, tres o cuatro) tejidos particulares que en otros tejidos (es decir, es capaz de llevar más alto un promotor que permite la expresión de una secuencia codificante a la que está operativamente unido en el tejido(s) para el que es específico comparado con cualquier otro) . Típicamente, el gen en 3' en un promotor "específico de tejido" es un gen que es activo a un nivel mucho más alto en el/los tejido (s) para el que es específico que ningún otro. En este caso, puede haber poca o sustancialmente ninguna actividad del promotor en otro tejido diferente de aquel (los) para el que es específico.

En el contexto de esta invención, un promotor específico de hígado es un promotor que es más activo en hígado comparado con su actividad en cualquier otro tejido del cuerpo. Típicamente, la actividad de un promotor específico de hígado será considerablemente mayor en hígado que en otros tejidos. Por ejemplo, tal promotor puede ser al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 ó al menos 10 veces más activo (por ejemplo determinado mediante su capacidad de dirigir la expresión en un tejido determinado al tiempo que previene la expresión en otras células o tejidos. Según esto, un promotor especifico de hígado permite una expresión activa del gen unido en el hígado y previene la expresión en otras células o tejidos.

Los promotores específicos de hígado adecuados incluyen, sin limitación, un promotor de a?-anti-tripsina (AÁT) , un promotor de globulina de unión a hormona tiroidea, un promotor de alfa fetoproteína , un promotor de alcohol deshidrogenasa , un promotor de IGF-II, el promotor del factor VIII (FVIII), un promotor de núcleo básico (BCP) de HBV y promotor PreS2, un promotor de albúmina, un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG) , un promotor de híbrido región de control hepática (HCR) -ApoCII , un promotor híbrido HCR-hAAT, un promotor AAT combinado con el elemento potenciador del gen de la albúmina de ratón (Ealb) , un promotor de apolipoproteína E, un promotor de lipoproteína de baja densidad, un promotor de piruvato quinasa, un promotor de fosfenol piruvato carboxiquinasa, un promotor de lecitina-colesterol acil transferasa (LCAT) , un promotor de apolipoproteína H (ApoH) , el promotor de la transferrina, un promotor de transtiretina, promotores de alfa-fibrinógeno y beta-fibrinógeno, un promotor de alfa 1-antiquimiotripsina, un promotor de glicoproteína alfa 2-HS, un promotor de haptoglobina, un promotor de ceruloplasmina, un promotor de plasminógeno, promotores de las proteínas del complemento (CIq, CIr, C2, C3, C4, C5, C6, C8, C9, factor I y factor H del complemento) , promotor del activador del complemento C3 y - - de la glicoproteína a?-ácida. Se pueden encontrar promotores específicos de tejido adicionales en Tissue-Specific Promoter Datábase, TiProD (Nucleic Acids Research, J4:D104-D107 (2006) .

En una forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor híbrido que comprende un potenciador específico de hígado y un promotor específico de hígado tal como un promotor híbrido de la región de control hepática (HCR) -ApoCII, un promotor híbrido HCR-hAAT, un promotor AAT combinado con el elemento potenciador del gen de la albúmina de ratón (Ealb) y un promotor de apolipoproteína E. En una forma de realización preferida, el promotor híbrido comprende el potenciador del gen de la albúmina de ratón (Ealb) y el promotor de la alfal-antitripsina (AAT) de ratón (Ealb-AATp) . En una forma de realización aún más preferida, la región promotora corresponde a la secuencia de SEQ ID NO: 4.

En una forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor inducible específico de hígado, por ejemplo, un promotor específico de hígado inducible por tetraciclina tal como el promotor descrito por Wang et al. (Nature Biotech., 1997; 15:239-43), el promotor específico de hígado regulable mediado por adenovirus descrito por Burcin et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1999, 96:355-60), el promotor específico de hígado regulable por tetraciclina descrito por Manickan et al (J. Biol. Chem. , 2001, 276:13989-13994), los promotores descritos por Han et al. (Molecular Therapy, 2005, 11, S161), el sistema de expresión de adenovirus regulado por tetraciclina para distribución in vivo al hígado descrito por Tietge et al.

- - (J. Gen. Medicine, 2003, 5:567-575), el promotor específico de hígado inducible por mifepristona (RU-486) descrito por Crettaz et al. (Molecular Therapy (2006) 13, S224) y similares .

Los elementos adicionales que se pueden insertar en los genomas víricos de la invención incluyen una secuencia consenso de Kozak alrededor del codón de iniciación de la secuencia de nucleótidos que codifica el IGF-I o la variante del mismo. La secuencia consenso de Kozak se define aquí como GCCRCC(AUG)A (SEQ ID NO: 5), en donde R es una purina (es decir, A, adenosina o G, guanosina) y en donde (AUG) representa el codón de iniciación de la secuencia codificante de la porfobilinógeno desaminasa. La secuencia consenso de Kozak puede estar precedida de otro triplete GCC.

Los genomas víricos de la invención también pueden comprender señales de poliadenilación operativamente unidas al ácido nucleico que codifica IGF-I o la variante funcionalmente equivalente del mismo. El término "señal de poliadenilación", como se usa aquí, se refiere . a una secuencia de ácido nucleico que media la unión de un tramo de poliadenina al extremo 3' del ARNm. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen la señal de poliadenilación temprana de SV40, la señal de poliadenilación tardía de SV40, la señal de poliadenilación de la timidina quinasa de HSV, la señal de poliadenilación del gen de la protamina, la señal de poliadenilación de Elb de adenovirus 5, la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, la señal de poliadenilación de la variante humana de la hormona de crecimiento y similares.

En una forma de realización preferida, el genoma vírico - - de la invención es un genoma del virus del polioma. Se sabe que los virus del polioma, tal como SV40, infectan células que no se dividen asi como células que se dividen activamente y también se sabe que son no inmunogénicos permitiendo la administración repetida al mismo individuo. Además, permite la expresión a largo plazo del transgén. Los virus del polioma incluyen cualquier vector basado en virus del género Polyoma e incluyen virus JC, virus BK, virus KI, virus Wu, poliomavirus de células de Merkel y virus 40 vacuolado del simio (de aqui en adelante SV40). En una forma de realización preferida, el genoma vírico de polioma es un genoma de SV40.

SV40 comprende un genoma de 5,25 kilobases, de ADN largo circular bicatenario que consiste en dos regiones reguladoras, la región promotor/origen y la región de poliadenilación . La región promotor/origen tiene 500 pares de bases de longitud y comprende dos promotores de direcciones opuestas, el promotor temprano y tardío (SVEP y SVLP respectivamente) que flanquean la señal central de origen de replicación y empaquetamiento. La región de poliadenilación tiene 100 pares de bases de longitud y contiene las señales de poliadenilación tanto para los transcritos tempranos como para los tardíos. El promotor temprano dirige la expresión de los antígenos T pequeño, medio, y grande (stag, mtag y Tag, respectivamente) necesarios para la replicación del virus y activación del promotor tardío. El promotor tardío dirige la expresión de las proteínas de la cápside del virus VP1, 2 y 3.

La invención contempla el cambio de al menos un cásete de expresión de SV40 por un polinucleótido que comprende un promotor específico de hígado y una secuencia que codifica - - IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo. El experto en la materia apreciará que el polinucleótido que comprende el promotor especifico de hígado y la secuencia codificante de IGF-I se puede insertar cambiando el promotor temprano y los antígenos T pequeño, mediano y grande. De forma alternativa, el polinucleótido que comprende el promotor específico de hígado y la secuencia codificante de IGF-I se puede insertar cambiando la región del promotor tardío y la secuencia que codifica las proteínas de la cápside del virus VP1, 2 y 3. También se contempla: que la presente invención comprenda vectores de SV40 que carecen de todas las secuencias codificantes (un genoma SV40 "gutless"), que carece de todo el genoma vírico excepto de las regiones que comprenden los elementos de control necesarios para la replicación y empaquetamiento del vector. De esta manera, se derivan genomas mínimos de SV40 de esta región y contienen al menos un origen de replicación completo. Los vectores de SV40 adecuados para la presente invención incluyen pSVT7 y pMT2.

En otra forma de realización, el genoma vírico de la invención es un genoma de parvovirus. El término "parvovirus" como se usa aquí abarca la familia Parvoviridae , incluyendo los parvovirus de replicación autónoma y los dependovirus . Los parvovirus autónomos incluyen miembros de los géneros Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus, y Contravirus. Los parvovirus autónomos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, virus diminuto del ratón, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus de pollo, virus de panleucopenia felina, parvovirus felino, parvovirus de ganso, parvovirus Hl, parvovirus de pato real, virus B19, y cualquier otro parvovirus autónomo conocido ahora o - - descubierto posteriormente. Otros parvovirus autónomos son conocidos para los expertos en la materia. Ver, por ejemplo, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capitulo 69 (4a ed., Lippincott-Raven Publishers).

Por otra parte, y como se puede deducir del nombre de su género, los miembros de los Dependovirus son únicos en que normalmente requieren coinfección con un virus auxiliar tal como adenovirus o virus del herpes, para una infección productiva en cultivo de células. El género Dependovirus incluye AAV, que normalmente infecta seres humanos (por ejemplo, serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y ß) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4), y virus relacionados que infectan otros animales de sangre caliente (por ejemplo virus adenoasociados bovinos, caninos, equinos, y ovinos) . Se describe más información sobre parvovirus y otros miembros de los Parvoviridae en Kenneth I. Berns, " Parvoviridae : The Viruses and Their Replication, " Capitulo 69 en Fields Virology (3a Ed. 1996) .

En una forma de realización aún más preferida, el genoma de parvovirus es un genoma de virus adenoasociado (AAV). Como se usa aquí, el término "virus adenoasociado" (AVV) incluye cualquier serotipo de AAV. En general, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa a nivel de aminoácidos y ácido nucleico, proporcionan un serie idéntica de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente física y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan mediante mecanismos prácticamente idénticos. En particular, la invención se puede llevar a cabo usando el serotipo 1 de AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (incluyendo los tipos 3A y 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 , AA 8 , AAV9, - - AAV10, AAV11, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino, y cualquier otro AAV conocido ahora o descubierto más adelante. Ver por ejemplo, Fields et al., Virology, volumen 2, capitulo 69 (4a ed., Lippincott-Raven Publishers). Recientemente, se han identificado un número de putativos nuevos serotipos y ciados de AAV (ver, por ejemplo,1 Gao et al., (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris et al., (2004) Virology 33:375-383; y Tabla 1). Las secuencias genómicas de varios serotipos de AAV y los parvovirus autónomos, asi como las secuencias de de las repeticiones terminales, proteínas Rep, y subunidades de la cápside son conocidas en la técnica. Tales secuencias se pueden encontrar en la bibliografía o en bases de datos públicas tal como GenBank. Ver por ejemplo, Números de acceso de GenBank NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852, AY530579; las divulgaciones de los cuales se incorporan aquí mediante referencia para enseñanza de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de parvovirus y AAV. Ver también, por ejemplo, Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al., (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994; uramatsu et al., (1996) Virology 221: 208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Morís et al., (2004) Virology 33-: 375-383; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y patente de EE.UU. No. 6156303; las divulgaciones de los cuales se incorporan aquí mediante referencia para enseñanza de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de parvovirus y AAV.

Por conveniencia la presente invención se ejemplifica y describe adicionalmente aquí mediante referencia a AAV. Sin embargo se entiende que la invención no se limita a AAV sino que se puede aplicar igualmente a otros parvovirus.

La organización genómica de todos los serotipos de AAV conocidos es muy similar. El genoma de AVV es una molécula de ADN monocatenaria lineal que tiene menos de alrededor de 5000 nucleótidos (nt) de longitud. Repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias codificantes únicas para las proteínas no estructurales de replicación (Rep) y las proteínas estructurales (VP) . Las proteínas VP (VPl, -2 y -3) forman la cápside. Los 145 nt terminales son autocomplementarios y están organizados de forma que se puede formar un dúplex intramolecular energéticamente estable que forma una horquilla en forma de T. Estas estructuras en horquilla funcionan como origen para la replicación del ADN vírico, sirviendo como cebadores para el complejo de la ADN polimerasa celular. Tras la infección con wtAAV en células de mamífero los genes Rep (es decir, Rep78 y Rep52) se expresan del promotor P5 y del promotor P19, respectivamente y ambas proteínas Rep tienen una función en la replicación del genoma vírico. Un suceso de ayuste en la ORF de Rep produce la expresión de realmente cuatro proteínas Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40) . Sin embargo, se ha mostrado que los ARNm sin ayuste, que codifican las proteínas Rep78 y Rep52, en células de mamífero son suficientes para la producción de - - vectores AAV. También en células de insecto las proteínas Rep78 y Rep52 son suficientes para la producción de vector AVV.

Un "genoma recombinante de parvovirus o AAV" (o "genoma rAAV") aquí se refiere a un vector que comprende una o más secuencias de polinucleotidos de interés, genes de interés o "transgenes" que están flanqueados por al menos una secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de parvovirus o AVV. Tales vectores rAAV se pueden replicar y empaquetar en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula huésped de insecto que expresa los productos de los genes rep y cap de AAV (es decir las proteínas Rep y Cap de AAV) . Cuando un vector rAAV se incorpora en una construcción de ácido nucleico mayor (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido o baculovirus usado para clonación o transí cción) , el vector rAAV se refiere típicamente como un "pro-vector" que se puede "rescatar" mediante replicación y encapsidación en presencia de funciones empaquetadoras de AAV y funciones auxiliares necesarias.

De esta manera, en otro aspecto la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un secuencia de nucleótidos que codifica un IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo como se ha definido aquí anteriormente, en donde la construcción de ácido nucleico es un vector recombinante de parvovirus o AAV y de está manera comprende al menos una ITR de parvovirus o AAV. Preferiblemente, en la construcción de ácido nucleico la secuencia de nucleótidos que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo está flanqueada por ITR - - de parvovirus o AAV a cada lado. Se puede usar cualquier ITR de parvovirus o AAV en las construcciones de la invención, incluyendo ITR de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV5. Las ITR de AAV2 son las más preferidas.

Las secuencias de AAV que se pueden usar en la presente invención pueden derivar del genoma de cualquier serotipo de AAV. Generalmente, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa a nivel de aminoácidos y ácido nucleico, proporcionan una serie idéntica de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente equivalentes física y funcionalmente, y se replican y ensamblan mediante mecanismo prácticamente idénticos.

Para las secuencias genómicas de varios serotipos de AAV y una visión general de la similitudes genómicas ver por ejemplo, número de acceso de GenBank U89790; número de acceso de GenBank J01901; número de acceso de GenBank AF043303; número de acceso de GenBank AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); y Wu. et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47) . Los serotipos de AAV 1, 2, 3, 4 y 5 son una fuente preferida de secuencias de nucleótidos de AAV para su uso en el contexto de la presente invención. Preferiblemente, las secuencias ITR de AAV para su uso en el contexto de la presente invención derivan de AAV1, AAV2 y/o AAV4.

Aunque se prefiere que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los genes de la cápside estén proporcionadas en trans por la célula empaquetadora o por un - - segundo vector, la invención también contempla genomas AAV que comprenden además una secuencia que codifica una o más proteínas de la cápside que empaqueta la secuencia de polinucleótido mencionada anteriormente. Las secuencias que codifican las proteínas de cápside VPl, VP2 y VP3 para1 su uso en el contexto de la presente invención se pueden tomar sin embargo de cualquiera de los 42 serotipos conocidos, más preferiblemente de AAVl, AAV2, AAV3 , AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o partículas similares a AAV recién desarrolladas obtenidas mediante, por ejemplo técnicas de mezcla de la cápside y librerías de cápside de AAV. Cuando las secuencias que codifican las proteínas de la cápside derivan de un serotipo de AAV diferente que las ITR, el genoma de AAV se conoce como genoma de parvovirus "híbrido" (es decir, en el que la cápside de AAV y las repeticiones terminales de AAV son de diferentes AAV) como se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28004 y .Chao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619. Como se describe aquí, el vector rAAV puede ser cualquier vector rAAV adecuado conocido ahora o descubierto más adelante. De forma alternativa, las secuencias que codifican los genes de la cápside se pueden proporcionar en trans mediante cotransfección en la célula empaquetadora de un polinucleótido que codifica dichas proteínas de la cápside. En una forma de realización preferida, el vector viral comprende ITR de AAVl, AAV2 y/o AAV4 y uno o más o todos los genes de la cápside de AAVl, AAV2, AAV5 , AAV6 o AAV8.

Si el vector viral comprende secuencias que codifican las proteínas de la cápside, estas se pueden modificar de modo que comprenden una secuencia de direccionamiento - - exógena. Las secuencias de direccionamiento exógenas se describen en detalle más adelante en el contexto de los viriones de la invención.

Opcionalmente, los genomas de AAV de la invención pueden comprender secuencias adicionales que codifican proteínas Rep. Las secuencias que codifican Rep (Rep78/68 y Rep52/40) derivan preferiblemente de AAV1, AAV2 y/o AAV . Las secuencias Rep e ITR de AAV están particularmente conservadas entre la mayoría de los serotipos. Las proteínas Rép78 de varios serotipos de AAV son por ejemplo, más del 89% idénticas y la identidad total de la secuencia de nucleótidos a nivel del genoma entre AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV6 es alrededor del 82% (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73:939-947). Además, se sabe que las secuencias Rep y las ITR de la muchos serotipos de AAV trans-complementan (es decir, sustituyen funcionalmente) de forma eficaz las secuencias correspondientes de otros serotipos en la producción de partículas de AAV en células de mamífero. US2003148506 describe que las secuencias Rep e ITR de AAV también trans-complementan eficazmente otras secuencias Rep e ITR de AAV en células de insecto.

Se sabe que las proteínas VP de AAV determinan la troficidad celular del virión AAV. Las secuencias que codifican las proteínas VP están significativamente menos conservadas que las proteínas y genes Rep entre los diferentes serotipos de AAV. La capacidad de las secuencias Rep e ITR para trans-complementar las secuencias correspondientes de otros serotipos permite la producción de partículas rAAV pseudotipadas que comprenden las proteínas de - - la cápside de un serotipo (por ejemplo, AAV5) y las secuencias Rep y/o ITR de otro serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2). Tales partículas rAAV pseudotipadas son parte de la presente invención.

Típicamente, el genoma de AAV de la invención comprende, además del cásete de expresión que comprende el promotor específico de hígado y las secuencias codificantes de IGF-I o la variante funcionalmente equivalente del mismo, uñó o más de los siguientes elementos: - Repeticiones terminales invertidas Repeticiones terminales no resolubles Secuencias que codifican los genes de la cápside Secuencias de relleno para completar el tamaño mínimo de genoma empaquetable .

Las repeticiones terminales invertidas (ITR) están típicamente presentes en al menos dos copias del vector AAV, típicamente flanqueando el cásete de expresión que contienen la secuencia heteróloga. Las ITR típicamente estarán en los extremos 5' y 3' de la(s) secuencia (s) heteróloga (s) de nucleótidos, pero no necesitan ser contiguas a ella. Las repeticiones terminales pueden ser iguales o diferentes entre sí. El término "repetición terminal" incluye cualquier repetición terminal vírica y/o secuencias parcial o completamente sintéticas que forman estructuras en horquilla y funcionan como repeticiones terminales invertidas, tal como la "secuencia doble D" descrita en la patente de los Estados Unidos No. 5478745 a Salmulski y col. Una "repetición terminal de AAV" puede ser de cualquier AAV, incluyendo pero - - no limitado a los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 o cualquier otro AAV conocido ahora o descubierto con posterioridad. La repetición terminal de AAV no necesita tener una secuencia salvaje (por ejemplo, una secuencia salvaje puede estar alterada por inserción, deleción, truncamiento o mutaciones sin sentido) , mientras la repetición terminal medie las funciones deseadas, por ejemplo, replicación, corte, empaquetamiento de virus, integración, y/o rescate de provirus, y similares. El genoma del vector puede comprender una o más (por ejemplo, dos) repeticiones terminales de AAV, que pueden ser iguales o diferentes. Además, la una o más repeticiones terminales de AAV pueden ser del mismo serotipo de AAV que la cápside de AAV, o puede ser diferente. En formas de realización particulares, el genoma del vector comprende una repetición terminal de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4', AAV5 , AAV6, AAV7, AAV8 , AAV9, AAV10, AAV11 y/o AAV12, en particular de AAV1, AAV2 y/o AAV . En una forma de realización preferida, las ITR pueden derivar de AAV2 y se pueden definir mediante SEQ ID NO: 6 (5'-ITR) y SEQ ID NO:7 (3'-ITR).

Los genomas AAV de la invención también pueden contener repeticiones terminales no resolubles. La expresión "repetición terminal no resoluble", como se usa aquí, se refiere repeticiones terminales que no son reconocidas por y resueltas (es decir, "cortadas") por las proteínas Rep de AAV, de modo que la resolución de la repetición terminal está sustancialmente reducida (por ejemplo en al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98% o más comparada con una repetición terminal resoluble) o eliminada. Tales repeticiones terminales no resolubles pueden ser secuencias - - de repeticiones terminales naturales (incluyendo formas alteradas de las mismas) y, por ejemplo, puede derivar de un parvovirus, incluyendo un AAV, o puede ser de otro virus o, como una alternativa más, puede ser parcial o totalmente sintética. La repetición terminal no resoluble puede ser una secuencia vírica no de AAV que no es reconocida por las proteínas Rep de AAV, o puede ser una repetición terminal de AAV que ha sido modificada (por ejemplo, mediante inserción, sustitución y/o deleción) de modo que ya no es reconocida por las proteínas Rep de AAV. Además, una repetición terminal no resoluble puede ser cualquier repetición terminal qué no es resoluble en las condiciones usadas para producir el vector del virus. Por ejemplo, la repetición terminal no resoluble puede que no sea reconocida por las proteínas Rep usadas para replicar el genoma del vector. A modo de ejemplo, la repetición terminal no resoluble puede ser una repetición terminal de parvovirus autónomo o la repetición terminal de un virus diferente de la repetición terminal de parvovirus que no es reconocida por las proteínas Rep de AAV. En una forma de realización preferida, la repetición terminal resoluble y las proteínas Rep pueden ser de un serótipo de AAV (por ejemplo, AAV8) y la repetición terminal no resoluble es de otro serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2) que no es reconocido por las proteínas Rep de AAV8, de modo que la resolución está sustancialmente reducida o eliminada. Además, se puede modificar una repetición terminal de AAV de modo que la resolución por las proteínas Rep de AAV esté sustancialmente reducida o eliminada. La repetición terminal no resoluble puede ser cualquier secuencia de repetición invertida que forma una estructura de horquilla y no se puede - - cortar por las proteínas Rep de AAV .

Las secuencias de nucleótidos de ITR de parvovirus son típicamente secuencias palindrómicas , que comprenden mayoritariamente secuencias complementarias organizadas simétricamente a las que también se hace referencia como regiones "A", "B", y "C". La ITR funciona como un origen de replicación, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicación, es decir, ser un sitio de reconocimiento para proteínas de replicación que actúan en trans tal cómo por ejemplo, Rep78 (o Rep68) que reconocen el palíndromo y secuencias específicas internas del palíndromo. Una excepción a la simetría de la secuencia ITR es la región "D" de la ITR. Es única (no tiene un complemento dentro de una ITR) . El corte del ADN monocatenario se producen en la unión entre las regiones A y D. Es la región donde se inicia la síntesis de ADN nuevo. La región D normalmente está a un lado del palíndromo y proporciona direccionalidad al paso de replicación del ácido nucleico. Un parvovirus que se replica en una célula de mamífero típicamente tiene dos secuencias ITR. Es, sin embargo, posible manipular una ITR de modo que los sitios de unión estén en ambas hebras de las regiones A y las regiones D se localicen simétricamente, una a cada lado del palíndromo. En un molde de ADN circular bicatenario (por ejemplo, un plásmido) , la replicación del ácido nucleico asistida por Rep78 o Rep68 prosigue en ambas direcciones y una ITR única es suficiente para la replicación de parvovirus de un vector circular. De esta manera, se puede usar una secuencia de nucleótidos de ITR en el contexto de la presente invención. Preferiblemente, sin embargo, se usan dos u otro número par de ITR regulares. Los más preferiblemente, se usan - - dos secuencias ITR. Según esto, en la invención, sé puede usar al menos una ITR, es decir se puede usar una ITR, aunque más típicamente se usarán dos ITR.

En una forma de realización preferida, el genoma de AAV de la invención comprende un polinucleótido que comprende un cásete de expresión formado por el promotor específico de hígado, la secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo, la señal de poliadenilación, en donde dicho cásete de expresión está flanqueado por ITR de AAV. En una forma de realización aún más preferida, el promotor específico de hígado es un promotor híbrido que comprende el potenciador de albúmina y la región promotora de alfa 1-antitripsina .

El genoma vírico de la invención puede ser un vector parvoviral monocatenario, tal como un vector AAV. En una realización preferida, el vector AAV es un AAV monocatenario (ssAAV) . La expresión "vector parvoviral monocatenario", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido monocatenario (típicamente ADN) empaquetado en una cápside AAV. Tal y como se usa en el presente documento, el término "monocatenario", cuando se usa en referencia a una molécula de ácido nucleico, se refiere a una molécula de ácido nucleico que no está hibridada con otra molécula de ácido nucleico y que no tiene regiones que se hibridarán intramolecularmente, ni bajo condiciones fisiológicas ni bajo condiciones estrictas. Esto está en contraste con la diana bicatenaria que existe como dos cadenas de ácido nucleico que se mantienen juntas por interacciones entre pares de bases intercadena. La molécula de ácido nucleico monocatenaria es tanto una cadena sentido como antisentido, ya que ambas - 4 - cadenas son igualmente infecciosas.

El genoma vírico de la invención puede además ser un vector parvovirus duplicado como se describe en la publicación de patente internacional WO 01/92551 y McCarty et al., (2003) Gene Therapy 10:2112-2118. En el contexto de la presente invención los términos "vector parvoviral bicatenario" y "vector parvoviral duplicado" tienen el mismo significado y se utilizan indistintamente a lo largó de la descripción. En una realización particular el vector parvoviral es un vector AAV, preferiblemente un AAV bicatenario. Además la cápside o genoma vector de AAV puede contener otras modificaciones, incluyendo inserciones, deleciones y/o sustituciones. El vector rAAV comprende una cápside derivada de, sin limitación una cápside AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV12, incluyendo formas modificadas de las mismas. Opcionalmente, la cápside puede ser una cápside AAV2, AAV3 o AAV6 o una forma modificada de las mismas, por ejemplo cápside modificadas usando técnicas de mezcla y librerías de cápsides de AAV.

En formas de realización representativas de la invención, el genoma vírico es un vector de parvovirus duplicado, en donde el genoma del vector recombinante comprende las repeticiones terminales 5' y 3' de AAV (que son resolubles), la secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica IGF-I o una variante funcional del mismo y una repetición terminal no resoluble, Los vectores de parvovirus duplicados y su producción se describen en la publicación de patente internacional WO 01/92551 y McCarty et al., (2003) Gene Therapy 10:2112-2118.

- - Tipicamente, el genoma del vector rAAV sólo retiene la(s) secuencia (s) mínima (s) de la repetición terminal (cada una 145 bases) de modo que se maximice el tamaño del transgén que se puede empaquetar eficazmente por el vector.

En general, los vectores de parvovirus duplicados son polinucleótidos diméricos autocomplementarios (típicamente, ADN) empaquetados en una cápside AAV. En algunos aspectos, el genoma vírico recombinante que está empaquetado en la cápside es esencialmente un intermedio de replicación de AAV "atrapado" que no se puede resolver para producir las hebras de polaridad más y menos. Los vectores de parvovirus duplicados parecen evitar la necesidad para la síntesis del ADN complementario mediado por la célula huésped inherente en los vectores rAAV convencionales, solucionando por lo tanto una de las limitaciones de los vectores rAAV.

Los vectores de parvovirus duplicados son fundamentalmente diferentes de los vectores rAAV convencionales, y del AAV parental, en que el ADN vírico puede formar una estructura en horquilla bicatenaria debido al apareamiento de bases intra-hebra, y las hebras de ADN de ambas polaridades están encapsidadas . De esta manera, el vector de parvovirus duplicado es funcionalmente similar a vectores de virus de ADN bicatenario más que al AAV del que se derivó. Esta característica soluciona un defecto previamente reconocido de la transferencia génica mediada por rAAV, que es la limitada propensión de la célula diana deseada a sintetizar ADN complementario al genoma monocatenario normalmente encapsidado por AAV.

Sin querer estar ligado por ninguna teoría particular de la invención, es posible que el genoma del virión se retenga - - en forma monocatenaria mientras está empaquetado en la cápside vírica. Tras la liberación de la cápside durante la infección vírica, parece que la molécula dimérica "se revuelve" o se aparea para formar una molécula bicatenaria por emparejamiento de bases intra-hebra, con la secuencia TR no resoluble formando una estructura en horquilla cerrada de forma covalente en un extremo. Este ADN vírico bicatenario evita la necesidad de la síntesis de la segunda hebra mediada por la célula huésped, que se ha postulado que es un paso limitante de la velocidad para la transducción de AAV.

En el caso de células de tejido hepático, los vectores de parvovirus duplicados pueden ser ventajosos porque pueden proporcionar un inicio más rápido de la expresión génica y/o niveles más altos de expresión génica, permitiendo ,de esta manera dosis menores, que a su vez pueden producir una probabilidad y/o extensión reducida de inflamación en los tejidos diana.

El genoma del vector de parvovirus duplicado generalmente comprende en la dirección 5' a 3' , (i) una repetición terminal AAV resoluble, (ii) una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés (hebra codificante o no codificante), (iii) una repetición terminal no resoluble, (iv) una secuencia complementaria o secuencia sustancialmente complementaria (por ejemplo, al menos alrededor del 90%, del 95%, del 98%, del 99% o más) a la secuencia heteróloga de nucleótidos de interés de (ii), y (v) una repetición terminal AAV resoluble. Los expertos en la materia apreciarán que el genoma del vector puede comprender otras secuencias (por ejemplo, secuencias intermedias entre las secuencias específicamente descritas anteriormente) .

- - En formas de realización particulares, las secuencias en cada mitad del genoma del vector (por ejemplo la sepuencia entera o las secuencias entre la repetición terminal AAV y la repetición terminal no resoluble) son sustancialmente complementarias (es decir, al menos alrededor del 90%, del 95%, del 98%, del 99% de complementariedad de secuencia de nucleótidos o más) , de modo que el genoma del vector puede formar moléculas bicatenarias debido al emparejamiento de bases entre las secuencias complementarias. En otras palabras, el genoma del vector es esencialmente una repetición invertida con las dos mitades unidas por la repetición terminal no resoluble. En formas de realización particulares, las dos mitades del genoma del vector (es decir, la secuencia entera o las secuencias entre las repeticiones terminales AAV y la repetición terminal no resoluble) son esencialmente completamente autocomplementarias (es decir, contienen un número insignificante de bases mal apareadas) o completamente autocomplementarias.

En otras formas de realización, las dos hebras de la secuencia heteróloga de nucleótidos de interés (con o sin elementos reguladores) son sustancialmente complementarias (es decir, al menos alrededor del 90%, del 95%, del 98%, del 99% de complementariedad de secuencia de nucleótidos o más) . En formas de realización particulares, las dos hebras de la(s) secuencia (s) heteróloga ( s ) de nucleótidos son esencialmente completamente autocomplementarias (es decir, contienen un número insignificante de bases mal apareadas) o completamente autocomplementarias .

En general, el genoma del vector de parvovirus duplicado - - puede contener posiciones o regiones de no complementariedad hasta el punto que la expresión de la(s) secuencia (s) heteróloga ( s ) de nucleótidos del vector de parvovirus duplicado aumenta (por ejemplo, inicio más temprano y/o niveles de expresión más altos) respecto a un vector rAAV correspondiente. Los parvovirus duplicados de la presente invención proporcionan a la célula huésped una molécula bicatenaria que soluciona uno de los inconvenientes , de los vectores rAAV, es decir, la necesidad de la célula huésped de convertir el ADN monocatenario del virión rAAV en un ADN bicatenario. La presencia de cualquier región sustancial de no complementariedad en el ADN del virión, en particular, dentro de la(s) secuencia (s) heteróloga (s) de nucleótidos puede ser reconocido por la célula huésped, y puede producir mecanismos de reparación de ADN que se reclutan para corregir las bases mal apareadas, contrarrestando por ello las características ventajosas de los vectores de parvovirus duplicados, por ejemplo reducción o eliminación , de la necesidad de que la célula huésped procese el molde vírico.

Se puede producir una repetición terminal AAV no resoluble mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, una inserción en la repetición terminal desplazará el sitio de corte (es decir, trs) y producirá una repetición terminal no resoluble. La designación de las diferentes regiones o elementos en la repetición terminal son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Fields et al., Virology, volumen 2, capítulo 69, Figura 5, 3a ed. , Lippincott-Raven Publishers y Figura 6 de WO01/925551) . También se puede hacer una inserción en la secuencia del sitio terminal de resolución (trs) . De forma alternativa, se - - puede hacer una inserción en un sitio entre el elemento de unión de Rep (RBE) dentro del elemento A y el trs (ver la Figura 6 de O 01/925551) . La secuencia núcleo del sitio trs de AAV es conocida en la técnica y se ha descrito (Snyder et al., (1990) Cell, 60:105; Snyder et al., (1993) J. Virology 67:6096; Brister y Muzyczka, (2000) J. Virology 74:7762; Brister y Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325. Por ejemplo, Brister y Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325, describen una secuencia núcleo de trs de 3 ' -CCGGT/TG-5 ' adyacente al elemento D. Snyder et al., (1993) J. Virology 67:6096 identifican la secuencia trs mínima como 3 ' -GGT/TGA-5' que sustancialmente se solapa con la secuencia identificada por Brister y Muzyczka.

La inserción puede ser de cualquier longitud adecuada que reduzca sustancialmente (por ejemplo, en al menos alrededor del 50%, del 60%, del 70%, del 80%, del 90%, del 95%, del 98% o más) o elimine la resolución de la repetición terminal. La inserción puede ser de al menos alrededor de 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20 ó 30 nucleótidos o más. No hay límites superiores particulares al tamaño de la secuencia insertada, mientras se alcancen niveles adecuados de replicación y empaquetamiento víricos (por ejemplo, la inserción puede ser tan larga como 50, 100, 200 ó 500 nucleótidos o mayor) .

Como otra aproximación, se puede hacer la replicación terminal no resoluble mediante deleción de el sitio trs. Las deleciones pueden abarcar 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30 nucleótidos o más pasado el sitio trs, mientras que el molde retenga las funciones deseadas. Además del sitio trs, se puede delecionar parte o todo el elemento D (ver, por ejemplo, McCarty et al., (2003) Gene Therapy 10:2112-2118; y - - O 01/92551) . Las deleciones se pueden extender además en el elemento A; sin embargo los expertos en la materia apreciarán que puede ser ventajoso retener el RBE en el elemento A, por ejemplo, para facilitar el empaquetamiento eficaz. Las deleciones en el elemento A pueden ser de 2, 3, 4, 5, 8, 10 ó 15 nucleótidos de longitud o más, mientras la repetición terminal no resoluble retenga cualquier otra función deseada. Además, se pueden delecionar algunas o todas las secuencias víricas que van más allá del elemento D fuera de la secuencia de la repetición terminal (por ejemplo, a la derecha del elemento D en la figura 6 de la publicación de PCT WO01/92551) para reducir o prevenir el proceso de conversión génica para corregir la repetición terminal alterada.

En todavía una alternativa adicional, la secuencia en el sitio de corte se puede mutar de modo que la resolución por la proteína Rep se reduzca o elimine sustancialmente . Por ejemplo, se pueden sustituir las bases A y/o C por bases G y/o T en o cerca del sitio de corte. Se han descrito los efectos de sustituciones en el sitio de resolución terminal sobre el corte de Rep por Brister y Muzyczka, (1999) J. Virology 73: 325.

Como una alternativa adicional, también se pueden usar las sustituciones de nucleótidos en las regiones que rodean el sitio de corte, que se han postulado que forman una estructura de tallo-lazo, para reducir el corte de Rep en el sitio terminal de resolución. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden seleccionar las alteraciones en la repetición terminal no resoluble de modo que se mantengan las funciones deseadas, si hay alguna, de la repetición terminal alterada (por ejemplo, empaquetamiento, reconocimiento de - - Rep, y/o integración especifica de sitio, y similares) .

Además, la repetición terminal no resoluble se puede hacer resistente al proceso de conversión génica como describen Samulski et al., (1983) Cell 33:135. La conversión génica en la repetición terminal no resoluble restablecerá el sitio trs, que generará una repetición terminal resoluble. La conversión génica resulta de la recombinación homologa entre la repetición terminal resoluble y la repetición terminal alterada. Una estrategia para reducir la conversión génica es producir virus usando una linea celular (por ejemplo, de mamífero) que sea deficiente para reparación de ADN, como se conoce en la técnica, porque estas líneas celulares estarán deterioradas en su capacidad para corregir mutaciones introducidas en el molde vírico.

De forma alternativa, se pueden generar moldes que tienen una tasa sustancialmente reducida de conversión génica introduciendo una región de no homología en la repetición terminal no resoluble. La no homología en la región qüe rodea el elemento trs entre la repetición terminal no resoluble y la repetición terminal no alterada en el molde reducirá o incluso eliminará sustancialmente la conversión génica. Se puede introducir cualquier inserción o deleción adecuada en la repetición terminal no resoluble para generar una región de no homología, mientras la conversión génica se reduzca o elimine sustancialmente. Las estrategias que emplean deleciones para crear no homología son preferidas. Se prefiere además que la deleción no dañe excesivamente la replicación y empaquetamiento del molde. En el caso de una deleción, la misma deleción puede ser suficiente para dañar la resolución del sitio trs así como para reducir la - - conversión génica.

Como una alternativa más, la conversión génica se puede reducir mediante inserciones en la repetición terminal no resoluble, o de forma alternativa, en el elemento A entre el sitio RBE y el trs. La inserción es típicamente de al menos alrededor de 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20 ó 30 nucleótidos o más nucleótidos de longitud. No hay limite superior particular al tamaño de la secuencia insertada, que puede ser tan larga como 50, 100, 200 ó 500 nucleótidos o más, sin embargo, en general, la inserción se selecciona de modo que no dañe excesivamente la replicacion y el empaquetamiento del genoma del vector.

Las repeticiones terminales no resolubles y los vectores de parvovirus duplicados se describen en la publicación de patente internacional WO 01/92551 y cCarty et al., (2003) Gene Therapy 10:2112-2118).

El vector rAAV de la invención también puede comprender una señal de terminación de la transcripción. Mientras que se puede incluir cualquier señal de terminación de la transcripción en el vector de la invención, preferiblemente, la señal de terminación de la transcripción es la señal de terminación de la transcripción de SV40.

También se pueden usar secuencias "AAV" modificadas en el contexto de la presente invención, por ejemplo, para la producción de vectores rAAV en células de insecto. Tales secuencias modificadas, por ejemplo incluyen secuencias que tienen al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 75%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 85%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, o más identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos (por - - ejemplo, una secuencia que tienen alrededor del 75-99% de identidad de secuencia de nucleótidos) a una ITR, Rep o VP de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 , AA 8 o AAV9, se pueden usar en lugar de secuencias salvajes de ITR, Rep o VP de AAV.

Aunque similar a otros serotipos de AAV en , muchos aspectos, AAV5 se diferencia de otros serotipos de AAV humanos y de simio más que otros serotipos humano's y de simios conocidos. En vista de ello, la producción de rAAV5 puede diferir de la producción de otros serotipos en células de insecto. Donde se emplean los métodos de la invención para producir rAAV5, se prefiere que una o más construcciones que comprenden, colectivamente en el caso de más de una construcción, una secuencia de nucleótidos que comprende una ITR de AAV5, una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica Rep de AAV (es decir, una secuencia de nucleótidos comprende una Rep78 de AAV5) . Tales secuencias ITR y Rep se pueden modificar como se desee para obtener producción eficaz de vectores rAAV5 o rAAV5 pseudotipado en células de insecto. Por ejemplo, se puede modificar él codón de iniciación de las secuencias Rep, se pueden modificar o eliminar los sitios de ayuste de VP, y/o se puede modificar el codón de iniciación de VP1 y nucleótidos cercanos para mejorar la producción de vectores rAAV en la célula de insecto .

Viriones Recombinantes En otro aspecto, la invención se refiere a viriones obtenibles expresando un genoma vírico de la invención en una célula empaquetadora adecuada.

- - El término "virión", "partícula de virus recombinante" y "vector viral" se usan aquí de forma intercambiable y se refiere a una partícula de virus infecciosa, deficiente en replicación que comprende el genoma vírico empaquetado en una cápside y, como pueda ser el caso, una envuelta lipídica rodeando la cápside.

Los viriones de la invención pueden ser un virión de polioma y, más preferiblemente, un virión SV40. Un virión SV40 según la invención comprende un genoma de ADN circular bicatenario de 5,2 kb y una cápside vírica, que rodea el mini-cromosoma vírico, compuesta de tres proteínas codificadas por el virus, VP1, VP2 y VP3.

En otra forma de realización, si el virión se obtiene empaquetando un vector AAV de la invención, el virión de la invención es un "virión AAV recombina'nte" . El término, "virión AAV recombinante" o "virión rAAV", como se usa aquí, se refiere a un virus infeccioso, deficiente en replicación compuesto de un armazón proteico de AAV encapsidando una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés que está flanqueada en ambos extremos por ITR de AAV y una o más proteínas Rep.

El término "proteína Cap", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de la una proteína Cap nativa de AAV (por ejemplo, VP1, VP2, VP3) . Ejemplos de actividades funcionales de proteínas Cap (por ejemplo, VP1, VP2, VP3) incluyen la capacidad de inducir la formación de una cápside, facilitar la acumulación de ADN monocatenario, facilitar el empaquetamiento de ADN de AAV en cápsides (es decir, encapsidación) , unión a receptores celulares, y facilitar la entrada del virión en las células - - huésped. En una forma de realización preferida, la secuencia de polinucleotidos que codifica el gen cap corresponde al gen cap de AAV8. El armazón de un virión AAV muestra simetría icosaédrica y normalmente contiene una proteína Cap principal, normalmente la menor de la proteína Cap y una o dos proteína o proteínas Cap minoritarias.

El término "proteína Rep", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína Rep nativa de AAV (por ejemplo, Rep ,40, 52, 68, 78) . Una "actividad funcional" de una proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada con la función fisiológica de la proteína, incluyendo facilitar la replicación del ADN mediante reconocimiento, unión y corte del origen de replicación de ADN de AAV así como actividad ADN helicasa. Funciones adicionales incluyen la modulación de la transcripción de promotores de AAV (u otro heterólogo) e integración específica de sitio de ADN de AAV en un cromosoma huésped. En una forma de realización preferida, la secuencia de polinucleótidos que codifica el gen rep corresponde al gen rep de AAVl.

El experto en la materia entenderá que los viriones AAV de la invención pueden comprender proteínas de cápside de cualquier serotipo de AAV. Sin embargo, debido al diferente tropismo de los serotipos conocidos de AAV por diferentes células, los viriones AAV contendrán una proteína de la cápside que es más adecuada para la distribución a las células hepáticas. Para la transducción de células hepáticas los viriones rAAV con proteínas de la cápside de AAVl, AAV8 y AAV5 son preferidos (Nathwani et al., 2007, Blood 109: 1414-1421; Kitajima et al., 2006, Atherosclerosis 186:65-73).

- - Además, los genomas AAV de la invención también incluyen genomas AAV que se han preparado mediante mezcla de ADN como describen Stemmer, W. P. C, (Nature 270:389-391, 1994); Schmidt-Dannert et al., (Nat. Biotech. 18:750-753, 2000) y Oreneis et al., (Nat. Struct. Biol. 9:238-242, 2001). La mezcla de ADN o genes implica la creación de fragmentos aleatorios de miembros de una familia de genes y su recombinación para dar muchas combinaciones nuevas. Para mezclar genes de cápside de AAV, se deben considerar varios parámetros, incluyendo: implicación de las tres proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 y diferentes grados de homología entre 8 serotipos. Para aumentar la probabilidad de obtener un vector rcAAV viable con un tropismo específico de célula o tejido, por ejemplo, se prefiere un protocolo de mezcla que produce una gran diversidad y un gran número de permutaciones. Un ejemplo de un protocolo de mezcla de ADN para la generación de rcAAV quimérico es la quimeragénesis aleatoria en moldes transitorios (RACHITT) , Coco et al., Nat. Biotech. 19:354-358, 2001.

El método RACHITT se puede usar para recombinar dos fragmentos de PCR derivados de genomas AAV de dos serotipos diferentes (por ejemplo, AAV1 y AAV2) . Por ejemplo, se pueden mezclar las regiones conservadoras del gen cap, segmentos que son más del 85% idénticos, que abarcan aproximadamente 1 kbp e incluyen codones de iniciación para los tres genes (VP1, VP2 y VP3) usando un protocolo RACHITT u otro de mezcla de ADN, incluyendo protocolos de mezcla in vivo (Patente de EE.UU. No. 5093257; Volkov et al., NAR 27:el8, 1999; y Wang P. L., Dis. Markers 16:3-13, 2000). Se puede clonar una librería combinatoria resultante en un vector AAV que - - contiene TR adecuado (por ejemplo, pTR-AAV2) para cambiar el fragmento respectivo del genoma salvaje de AAV. Se pueden secuenciar clones aleatorios y alinearlos con los genomas parentales usando la aplicación AlignX del software Vector NTI 17 Suite. De la secuenciación y alineamiento, se puede determinar el número de entrecruzamientos de recombinación por cada 1 kbp de gen. De forma alternativa, se puede mezclar el dominio variable de genomas AAV usando métodos de la invención. Por ejemplo, se pueden generar mutaciones en dos grupos de aminoácidos (aminoácidos 509-522 y 561-591), de AAV que probablemente forman un lazo en la superficie1 de la partícula en VP3. Para mezclar este dominio de baja homología, se pueden utilizar protocolos de recombinación que sean independientes de la homología parental. (Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-1209, 1999; Lutz et al,, Proc. Nat. Acad. Sci. 98:11248-11253, 2001) y Lutz et al., (NAR 29:E16, 2001) o un protocolo RACHITT modificado para hibridar y recombinar fragmentos de ADN de baja homología.

También se pueden construir librerías combinatorias usando inserciones de oligonucleótidos cortos aleatorizados en ciertas posiciones de los genes de la cápside que probablemente forman un lazo y están expuestos a una superficie de partícula que interacciona con un receptor de la superficie celular (por ejemplo, aminoácidos 509-522 y 561-591 en AAV2 ) (Xie et al, 2002, Proc. Nati . Acad . Sci . USA, 99:10405-10410). Tales librerías se pueden usar para seleccionar viriones con nuevos tropismos de célula/te ido. La selección de viriones implica el protocolo descrito en las Figs. IB y 1C.

También se pueden usar métodos de hacer mutantes de - - cápside de AAV además de la síntesis de oligonucleótidos degenerados, inserción aleatoria de péptidos, y métodos RATCHITT. Ejemplos de métodos alternativos incluyen mutagénesis dirigida (Wu et al., J. Virol. 72:5919-5926); apareamiento molecular, mezcla de ácido nucleico, éxón, y familia de ADN (Soong et al., Nat . Genet . 25:436-439:, 2000; Coco et al., Nature Biotech. 2001; 19:354; y patentes de EE.UU. Nos. 5837458; 5811238; y 6180406; Kolkman y Stemmer, Nat. Biotech. 19:423-428, 2001; Fisch et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 93:7761-7766,, 1996; Christians et al., Nat. Biotech. 17:259-264, 1999); inserciones de ligandos (Girod et al. Nat. Med. 9:1052-1056, 1999); y mutagénesis con cásete (Rueda et al. Virology 263:89-99, 1999; Boyer et al., J. Virol. 66:1031-1039, 1992). Para análisis mutacional de los genes de la cápside de AAV, ver Wu et al., J. Virol. 74:8635-8647, 2000 y Rabinowitz et al., Virology 265:274-285, 1999.

También se pueden usar secuencias "AAV" modificadas en el contexto de la presente invención, por ejemplo, para la producción de vectores rAAV en células de insecto. Tales secuencias modificadas, por ejemplo, incluyen secuencias que tienen al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 75%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 85%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95% o más de identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos (por ejemplo, una secuencia que tienen alrededor del 75-99% de identidad de secuencia de nucleótidos) a una ITR, Rep o VP de AAV1, AAV2, AAV3 , AAV , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, se pueden usar en lugar de secuencias salvajes de ITR, Rep o VP de AAV.

- - Las secuencias que codifican Rep (Rep78/68 y Rep52/40) pueden ser de cualquier serotipo de AAV, pero preferiblemente derivan de AAV1, AAV2 y/o AAV . Las secuencias que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 para su uso en el contexto de la presente invención se pueden sin embargo tomar de cualquiera de los 42 serotipos conocidos,, más preferiblemente de AAV1, AAV2, AAV5, AAV6 o AAV8.

La invención también contempla viriones que comprenden una cápside y un genoma vírico recombinante, en donde se ha insertado o sustituido una secuencia exógena de direccionamiento en la cápside nativa. El virión se¡ dirige preferiblemente (es decir, dirigida a un tipo ó tipos particulares de célula) mediante la sustitución o inserción de la secuencia exógena de direccionamiento en la cápside. Expresado de forma alternativa, la secuencia exógena de direccionamiento preferiblemente confiere un tropismo alterado al virión. Como una exposición adicional alternativa, la secuencia de direccionamiento aumenta la eficacia de distribución del vector dirigido a una célula.

La(s) secuencia (s) exógena (s) de direccionamiento pueden cambiar o sustituir parte de o toda una subunidad de la cápside, alternativamente, más de una subunidad de la cápside. Como una alternativa adicional, se puede introducir más de una secuencia exógena de direccionamiento (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias) en la cápside del virión. En formas de realización alternativas, se prefieren las inserciones y sustituciones en las subunidades minoritarias de la cápside (por ejemplo, VP1 y VP2 de AAV) . Para cápsides AAV, las inserciones o sustituciones en VP2 y VP3 también son preferidas.

- - En formas de realización más preferidas, la secuencia exógena de direccionamiento puede ser una secuencia de aminoácidos que codifica un péptido o proteina, que se inserta o sustituye en la cápside del virión para cambiar el tropismo del virión. El tropismo del virión nativo sé puede reducir o eliminar mediante inserción o sustitución de la secuencia de aminoácidos. Alternativamente, la inserción o sustitución de la secuencia exógena de aminoácidos puede dirigir el virión a un tipo de células particular. La secuencia exógena de direccionamiento puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que codifique una proteina o péptido que cambia el tropismo del virión. En formas de realización particulares, el péptido o proteina de direccionamiento puede ser natural o, de forma alternativa, completa o parcialmente sintética. Péptidos y proteínas ejemplares incluyen ligandos y otros péptidos que se unen a receptores de la superficie celular presentes en células de hígado incluyen ligandos capaces de unirse al receptor Sr-Bl para apolipoproteína E, lectinas específicas de galactosa y lactosa, ligandos del receptor de lipoproteínas de baja densidad, ligandos de asialoglicoproteína (galactosa-terminal) y similares.

De forma alternativa, la secuencia exógena de direccionamiento puede ser un anticuerpo o un grupo de reconocimiento del antígeno del mismo. El término "anticuerpo" como se usa aquí se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas , incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier especie de origen, incluyendo (por ejemplo) ratón, rata, concejo, caballo, o ser humano, o pueden ser anticuerpos quiméricos. El término "anticuerpo" también - - abarca anticuerpos biespecificos o "de puente" conocidos por los expertos en la materia. Los fragmentos de anticuerpos dentro del ámbito de la presente invención incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')2 y Fe, y los fragmentos correspondientes obtenidos de anticuerpos diferentes de IgG. Tales fragmentos se pueden producir por técnicas conocidas.

La secuencia exógena de aminoácidos insertada en la cápside del virión puede ser una que facilite la purificación o detección del virión. Según este aspecto de la invención, no es necesario que la secuencia exógena de aminoácidos también cambie el virión del parvovirus modificado. Por ejemplo, la secuencia exógena de aminoácidos puede incluir una secuencia de poli-histidina que es útil para purificar el virión sobre una columna de níquel, como saben los expertos en la materia o se puede emplear un péptido o proteína antigénicos para purificar el virión mediante técnicas estándar de inmunopurificación . Alternativamente, la secuencia de aminoácidos puede codificar un ligando de receptor o cualquier otro péptido o proteína que se puede usar para purificar el virión modificado mediante purificación de afinidad o cualquier otro método conocido en la técnica (por ejemplo técnicas de purificación basadas en tamaño, densidad, carga, o punto isoeléctrico diferencial, cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de péptidos) .

Se prefiere insertar la secuencia exógena de aminoácidos en las subunidades Cap minoritarias del parvovirus, por ejemplo en las subunidades VP1 y VP2 de AAV. De forma alternativa, se prefieren las inserciones en VP2 o VP3.

Los viriones AAV preferidos se modifican para reducir la - - respuesta del huésped, revisado por Russell (2000, j. Gen. Virol. 81:2573-2604), o descrito en US20080008690 y en Zaldumbide y Hoeben (Gene Therapy, 2008:239-246).

En una forma de realización preferida, los viriones de la invención comprenden un genoma vírico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unido a un promotor específico de hígado. En aún otra forma de realización, el promotor específico de hígado comprende la región potenciadora del gen de la albúmina y el promotor de alfa 1-antitripsina . En otra forma de realización, el IGF-I corresponde a IGF-I humano.

Métodos Terapéuticos Los autores de la presente invención han observado que la administración de los vectores virales a animales que padecen cirrosis inducida por CCI4 produce una , mejora significativa de la función hepática medida mediante pruebas bioquímicas del hígado (descenso de AST, ALT, ALP y bilirrubina en suero y aumento de albúmina en suero) y observación histoquímica (ver ejemplos 3 y 10) . Además, los viriones de la invención producen una inducción de fibrolisis en el hígado cirrótico (ver ejemplos 4 y 11) y una reducción de factores profibrogénicos (ver ejemplos 5 y 12) .

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un virión de la invención para su uso como un medicamento. En otro aspecto, la invención concierne a una composición farmacéutica que comprende un virión como se ha definido aquí anteriormente. La composición farmacéutica preferiblemente comprende además un soporte farmacéuticamente aceptable. Se - - puede usar cualquier soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable en las presentes composiciones (ver, por ejemplo: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) ack Publishing Company, Abril 1997) . Las formas farmacéuticas preferidas estarían en combinación con solución salina, solución dextrosa, o solución tamponada estériles, u otros líquidos estériles farmacéuticamente aceptables. Alternativamente, se puede usar un soporte sólido tal como, por ejemplo, bolas microsoporte .

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención o profilaxis de cirrosis hepática o fibrosis hepática que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de un virión de la invención .

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un virión según la invención para la producción 1 de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de cirrosis hepática o fibrosis hepática.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un virión según la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de cirrosis hepática o fibrosis hepática.

El término "cirrosis hepática", como se usa aquí, se refiere a una afección en la que el hígado se deteriora lentamente y funciona mal debido a que el tejido hepático se cambia por tejido cicatricial fibroso y nodulos regenerativos . Esto produce un bloqueo parcial en el flujo de sangre a través del hígado así como un deterioro de la capacidad del hígado de controlar infecciones, eliminar bacterias y toxinas de la sangre, procesar nutrientes, hormonas y fármacos, hacer proteínas que regulan la - - coagulación de la sangre y producir bilis para ayudar a absorber las grasas -incluyendo colesterol- y vitaminas liposolubles . El método terapéutico de la invención es adecuado para el tratamiento de cirrosis de diferentes causas, incluyendo cirrosis relacionada con alcohol, hepatitis B, C o D crónica, esteatosis hepática no alcohólica (EHNA) , hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria o i secundaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedades heredadas tal como fibrosis quistica, deficiencia en alfa-1 antitripsina, hemocromatosis , enfermedad de Wilson, galactosemia y enfermedades del almacenamiento de gludógeno.

El término "fibrosis hepática", como se usa aquí, se refiere a una afección caracterizada por una acumulación aumentada en el hígado de proteínas de la matriz extracelular , incluyendo colágeno e incluye grados de fibrosis de 1 (cicatrización mínima), 2 (la cicatrización se ha producido y se extiende fuera de la áreas en el hígado que contienen vasos sanguíneos), 3 (fibrosis puente se extiende y conecta con otras áreas que contienen fibrosis) ó 4 (cirrosis o cicatrización avanzada del hígado) según el sistema de escala metavir; o una puntuación de 1-4, 5-8, 9-12 ó 13-18 según la escala Knodell.

La cantidad de viriones y el tiempo de administración de tales composiciones estarán en el alcance del experto en la materia que tiene el beneficio de la presente enseñanza. De hecho, los inventores contemplan que la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de viriones de la invención se pueda alcanzar mediante una única administración, tal como por ejemplo, una única inyección de un número suficiente de partículas infecciosas para - - proporcionar beneficio terapéutico al paciente que se somete a tal tratamiento. De forma alternativa, en algunas circunstancias, puede ser deseable proporcionar administraciones múltiples o sucesivas de las composiciones de viriones, bien durante un periodo de tiempo relativamente corto o relativamente prolongado, como puede ser determinado por el médico que supervisa la administración de tales composiciones. Por ejemplo, el número de partículas infecciosas administrado a un mamífero puede ser del orden de alrededor de 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, o incluso mayor, partículas infecciosas/ml dadas como una dosis única, o divididas en dos o más administraciones como se pueda requerir para alcanzar la terapia de la enfermedad o trastorno particular que se va a tratar. De hecho, en ciertas formas de realización, puede ser deseable administrar dos o más composiciones de diferentes de vectores de viriones, bien solas o en combinación con uno o más fármacos para alcanzar los efectos deseados de la pauta terapéutica particular. En la mayoría de las pautas de terapia génica basada en viriones, los inventores creen que el uso de un promotor específico de hígado para controlar la expresión de IGF-I o la variante equivalente funcional del mismo resultará en que se requerirá un título menor de partículas infecciosas cuando se usan los viriones según la invención que comparado con protocolos de terapia génica convencionales.

En formas de realización particularmente preferidas de la invención, la secuencia de nucleótidos de interés se administra al hígado del sujeto. La administración al hígado se puede alcanzar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a administración - - intravenosa, administración intraportal, administración intrabiliar, administración intra-arterial , e inyección directa en el parénquima del hígado. En una forma de realización preferida, el virión se administra por vía intra-arterial. En una forma de realización aún más preferida, la administración intra-arterial se lleva a cabo a través de la arteria hepática.

Métodos para la prevención y/o tratamiento de cirrosis y fibrosis hepática usando vectores parvovirales que codifican IGF-I Los resultados proporcionados por los autores de la presente invención han mostrado que la administración de viriones parvovirales recombinantes que comprenden la secuencia codificante de IGF-I producen una mejora de la función hepática en un modelo animal de cirrosis (ver los ejemplos 3-6 y 10-13) . Además, los resultados observados con otros vectores virales indican que IGF-I puede retrasar la evolución de la enfermedad si se aplica antes del desarrollo de la enfermedad. De esta manera, los viriones de la presente invención también son adecuados para prevenir el desarrollo de cirrosis o fibrosis hepática.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un parvovirus recombinante que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo para su uso en medicina, y más preferiblemente para su uso en el tratamiento y/o prevención de cirrosis o fibrosis hepática .

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un parvovirus recombinante que comprende una secuencia que - - codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de cirrosis o fibrosis hepática.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de cirrosis o fibrosis hepática que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de un parvovirus recombinante que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

El término "tratamiento", como se usa aquí, se refiere al acto de revertir, mejorar o inhibir la evolución del trastorno o afección para el que se aplica tal término, o uno o más síntomas de tal trastorno o afección.

El término "prevención", como se usa aquí, se refiere al acto de evitar que se produzca, exista, o de forma alternativa retrasar el inicio o reaparición de una enfermedad, trastorno o afección para la cual se aplica tal término, o uno o más de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección.

Los términos "cirrosis hepática" y "fibrosis hepática" se han descrito previamente en detalle.

El término "parvovirus" también se ha descrito en detalle anteriormente en relación con los vectores virales de la invención. Preferiblemente, el parvovirus es Un virus adenoasociado . Aún más preferiblemente, el AAV comprende un genoma que comprende la secuencia que codifica IGF-I o la variante funcionalmente equivalente del mismo flanqueado por ITR, en donde dichas ITR son de AAV1, AAV2 y/o AAV . En una forma de realización aún más preferida, el AAV es un AAV1, AAV5, AAV6 o AAV8 pseudotipados con AAV1, AAV2 ylo AAV4, es - - decir, contiene las proteínas cap de AAV1, AAV5, AAV6 o AAV8. En una realización preferida el parvovirus recombinante es un parvovirus monocatenario, preferiblemente, un AAV monocatenario . En otra realización preferida el parvovirus recombinante es un parvovirus bicatenario, preferiblemente un AAV bicatenario.

El término "IGF-I" se ha descrito en detalle anteriormente al referirse a los vectores virales de la invención. En una forma de realización preferida, el IGF-I corresponde al IGF-I humano.

La secuencia que codifica IGF-I o la variante funcionalmente equivalente del mismo puede estar operativamente unida a una región promotora. Los promotores adecuados para su uso en los viriones para su uso en los métodos terapéuticos de la invención incluyen cualquier promotor que sea capaz de activar la transcripción de secuencias en 3' en células de hígado, incluyendo promotores constitutivos así como promotores específicos de hígado. Los promotores constitutivos adecuados para la expresión de secuencias heterologas en hígado incluyen, sin limitación, un promotor de la hipoxantina fosforribosil transferasa (HPTR) , un promotor de la adenosina desaminasa, un promotor de la piruvato quinasa, un promotor de la ß-actina, un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1), un promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK), un promotor de ubiquitina (Ubc) , un promotor de albúmina, promotores de filamentos intermediarios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, y similares) y otros promotores constitutivos. Los promotores víricos ejemplares que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, la región promotora - - temprana de SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A. 7,8:1441-1445) .

En una forma de realización preferida, el promotor que está operativamente unido a la secuencia que codifica IGF-I o la variante funcionalmente equivalente del mismo ' es un promotor específico de hígado. En una forma de realización más preferida, el promotor específico de hígado es un promotor híbrido que comprende la región potenciadora del gen de la albúmina y el promotor de la alfal-antitripsina . En otra forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor inducible específico de hígado.

El método terapéutico de la invención implica la administración de viriones parvovirales que codifican IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo transducciendo las células mediante incubación con los viriones/partículas víricas. Las células pueden estar presentes en un organismo, en cuyo caso las células son alcanzables mediante inyección con aguja, inyección a chorro o bombardeo de partículas. Por otra parte, las células a ser transducidas también se pueden aislar de un organismo, ser infectadas fuera del organismo y después devueltas al organismo de nuevo. A tales células se refiere como células autólogas. Además, con respecto al organismo también es posible usar células alogénicas para la transducción . En este sentido, es favorable para estas células pertenecer a un tipo - - de HLA correspondiente al organismo. El experto en la materia conoce métodos para proporcionar células con un cierto tipo de HLA. El titulo preferible de la preparación del virión está normalmente entre 107 y 109 virus infecciosos/ml .

La presente invención encuentra uso tanto en aplicaciones veterinarias como médicas. Los sujetos adecuados incluyen tanto aves como mamíferos, siendo preferidos los mamíferos. El término "ave" como se usa aquí incluye, pero no está limitado a, pollos, patos, gansos, codorniz, pavos y faisanes. El término "mamífero" como se usa aquí incluye, pero no está limitado a, seres humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los sujetos humanos son los más preferidos. Los sujetos humanos incluyen sujetos fetales, neonatales, lactantes, juveniles y adultos .

Por lo tanto, el objeto de la presente invención también se refiere a un medicamento que contiene una partícula parvoviral según la invención, más preferiblemente una partícula AAV. Aquí, el medicamento puede contener además un soporte farmacéuticamente aceptable. Los soportes adecuados y las formulaciones de tales medicamentos son conocidos para el experto en la materia. Los soportes adecuados comprenden, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo emulsiones aceite/agua, agentes humectantes, soluciones estériles, etc. El tipo de soporte depende en cómo administrar el plásmido de empaquetamiento del vector parvoviral y/o partícula parvoviral según la invención. Se determina la dosis adecuada por el médico y depende de varios factores, por ejemplo, la edad, sexo y peso del paciente, la gravedad de la enfermedad, el tipo de - - administración, etc. Ha resultado que por medio de plásmidos y/o partículas de empaquetamiento de vectores parvovirales inventivos es posible obtener altas tasas de transducción con las células más diferentes, por ejemplo, células primarias del epitelio de la córnea o células musculares.

La administración de partículas de parvovirus de la presente invención a un sujeto humano o un animal en necesidad de las mismas puede ser por cualquier medio conocido en la técnica para administrar vectores de virus. Modos ejemplares de administración incluyen administración oral, rectal, transmucosa, tópica, transdérmica, inhalación, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraarticular ) y similares, así como inyección directa al tejido u órgano, alternativamente, inyecciones intratecal, intramuscular directa, intraventricular , intravenosa, intraperitoneal , intranasal, o intraocular. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, bien como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. De forma alternativa, se puede administrar el virus en una manera local más que sistémica, por ejemplo, en una formulación en depósito o de liberación sostenida.

En formas de realización particularmente preferidas de la invención, la secuencia de nucleótidos de interés se administra al hígado del sujeto. La administración al hígado se puede alcanzar por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, administración intravenosa, administración intraportal, administración intrabiliar, administración intra-arterial , e inyección - - directa en el parénquima del hígado. En una forma de realización preferida, el virión se administra por vía intra-arterial. En una forma de realización aún más preferida, la administración intra-arterial se lleva a cabo a través de la arteria hepática.

Las dosis de las partículas inventivas de parvovirus dependerán del modo de administración, el estado individual del paciente, el vector viral particular, y el gen a ser administrado, y se puede determinar de una manera rutinaria. Las dosis ejemplares para alcanzar efectos terapéuticos son títulos de virus de al menos alrededor de 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 unidades de transducción o más, preferiblemente alrededor de 108-1013 unidades de transducción, aún más preferiblemente 1012 unidades de transducción.

En formas de realización particulares de la invención, se puede emplear más de una administración (por ejemplo, dos, tres, cuatro, o más administraciones) para alcanzar niveles terapéuticos de expresión génica. Según esta forma de realización, y como se ha descrito anteriormente, se prefiere usar vectores de parvovirus que tienen diferentes propiedades antigénicas para cada administración para evitar los efectos de anticuerpos neutralizantes.

Métodos para preparar viriones AVV recombinantes .

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para producir viriones AAV recombinantes que comprende poner en contacto la célula con (a) una primera secuencia de ácido nucleico que comprende - - ii. un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor especifico de hígado y iii. una 5'-ITR y una 3' -ITR de AAV flanqueando el cásete de expresión definido en, (i) (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína rep de AAV (c) una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína cap de AAV, y, opcionalmente, (d) una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica funciones víricas y/o celulares de las que depende AAV para la replicación en condiciones adecuadas para la entrada de los tres o cuatro componentes en la célula y recuperar el virión AAV recombinante de las células.

El paso (i) del método para producir iriones recombinantes comprende poner en contacto una célula con (a) una primera secuencia de ácido nucleico que comprende ii. un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor específico de hígado y iii. una 5' -ITR y una 3' -ITR de AAV flanqueando el cásete de expresión definido en (i) (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína rep de AAV - - (c) una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina cap de AAV, y, opcionalmente , (d) una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica funciones víricas y/o celulares de las que depende AAV para la replicación en condiciones adecuadas para la entrada de los tres o cuatro componentes en la célula.

Los elementos que forman la primera secuencia de ácido nucleico son esencialmente como se han descrito previamente en el contexto de los vectores virales de la invención. En una forma de realización preferida, la primera secuencia de ácido nucleico además comprende una señal de poliadenilacion en dirección 3' de la secuencia que codifica IGF-I o la variante funcionalmente equivalente del mismo. Las señales de poliadenilacion adecuadas se han descrito previamente. A modo de ejemplo la señal de poliadenilacion es la señal de poliadenilacion de SV40.

El promotor específico de hígado puede ser cualquier promotor definido anteriormente. En una forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor híbrido que comprende la región potenciadora de la albúmina y el promotor de la al-antitripsina . En otra forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor inducible específico de hígado.

Para facilitar el empaquetamiento, el genoma del vector recombinante es generalmente de alrededor del 80% hasta alrededor del 105% del tamaño del genoma salvaje y comprende una señal de empaquetamiento adecuada. Para facilitar el empaquetamiento en una cápside AAV, el genoma es preferiblemente aproximadamente 5,2 kb de tamaño o menos. En - - otros formas de realización, el genoma es preferiblemente mayor de alrededor de 3,6, 3,8, 4,0, 4,2 ó 4,4 kb de longitud ylo menos de alrededor de 5,4, 5,2, 5,0 ó 4,8 kb de longitud. Dicho de forma alternativa, la(s) secuencia (s) heteróloga ( s ) de nucleótidos serán típicamente de menos de alrededor, de 5,0 kb de longitud (más preferiblemente menos de alrededor de 4,8 kb, todavía más preferiblemente menos de alrededor de 4,4 kb de longitud, aún más preferiblemente menos de alrededor de 4,2 kb de longitud) para facilitar el empaquetamiento del genoma recombinante por la cápside de AAV.

La segunda y tercera secuencias de ácido nucleico necesarias para la producción de un virión de la invención son las denominadas "funciones auxiliares de ÁAV" y comprenden una, o ambas de las ORF principales de AAV, es decir las regiones que codifican rep y cap, u hdmólogos funcionales de las mismas. Secuencias de ácido nucleico adecuadas que codifican las proteínas rep y cap para su uso en el método de la invención se han descrito en detalle anteriormente en relación con los viriones de la invención.

El experto en la materia apreciará, sin embargo, que la primera, segunda y tercera secuencias de ácido nucleico se pueden proporcionar en dos o más vectores en varias combinaciones. Como se usa aquí, el término "vector" incluye cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, cromosoma artificial, virus, virión, etc., que es capaz de replicación cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias de genes entre células. De esta manera, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.

- - Los genes rep y/o cap de AAV se pueden proporcionar de forma alternativa por una célula empaquetadora que expresa estos genes establemente (ver, por ejemplo, Gao et al., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue et al., (1998) J. Virol. 72:7024; patente de EE.UU. No. 5837484; WO 98/27207; patente de EE.UU. No. 5658785; WO 96/17947).

En una forma de realización preferida, el segundo y tercer polinucleótidos se pueden proporcionar en un vector individual, al que normalmente se refiere como un vector de función auxiliar de AAV. Ejemplos de vectores adecuados para su uso con la presente invención incluyen pHLP19, descrito en la patente de EE.UU. No. 6001650, y el vector pRep6cap6, descrito en la patente de EE.UU. No. 6156303, la divulgación de las cuales se incorpora aquí mediante referencia en su totalidad.

En otras formas de realización particulares, la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico están en forma de un virus adenovirus auxiliar que puede ser un virus auxiliar híbrido que codifica las proteínas Rep y/o de la cápside de AAV. Los vectores híbridos ayudantes Ad/AAV que expresan los genes rep y/o cap de AAV y métodos para producir las reservas de AAV usando estos reactivos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. No. 5589377; y patente de EE.UU. No. 5871982, patente de EE.UU. No. 6251677; y patente de EE.UU. No. 6387368). Preferiblemente, el Ad híbrido de la invención expresa las proteínas de la cápside de AAV (es decir, VP1, VP2 y VP3) . De forma alternativa, o adicional, el adenovirus híbrido puede expresar una o más de las proteínas Rep de AAV (es decir, Rep40, Rep52, Rep68 y/o Rep78) . Las secuencias de AAV pueden estar operativamente - - asociadas con un promotor especifico de tejido o inducible.

En otra realización particular, la célula utilizada para la preparación de un virión AAV recombinante es una célula de insecto y la primera, segunda y tercera secuencias de ácido nucleico están comprendidas en un vector baculoviral.

En una realización preferida el virión recombinante AAV producido por este método es un virión AAV monocatenario . En otra realización preferida el virión recombinante AAV producido es un virión AAV bicatenario.

Las diferentes secuencias de ácido nucleico se ponen en contacto con la célula en condiciones adecuadas para la entrada de dichas secuencias de ácido nucleico en la célula. En general son conocidas en la técnica un número de métodos de transfección adecuadas para este fin e incluyen coprecipitación con fosfato de calcio, microinyección directa en células cultivadas, electroporación, transferencia génica mediada por liposomas, transducción mediada por lipidos y administración de ácidos nucleicos usando microproyectiles de alta velocidad.

El componente (d) puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica funciones víricas no derivadas de AAV y/o celulares de las que AAV depende para la replicación (es decir, "funciones accesorias") . Las funciones accesorias incluyen aquellas funciones requeridas para la replicación de AAV, incluyendo, sin limitación, aquellos grupos implicados en la activación de la transcripción génica de AAV, ayuste de ARNm de AAV específico de fase, replicación de ADN de AAV, síntesis de productos de expresión de cap, y ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones accesorias basadas en virus pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares - - conocidos tal como adenovirus, herpesvirus (diferentes del virus del herpes simple de tipo 1), y virus de la vacuna.

De forma alternativa, las secuencias de ácido nucleico del componente (d) las puede llevar la célula empaquetadora, episomalmente y/o integrada en el genoma de la célula empaquetadora. Las funciones accesorias se pueden distribuir entre un cuarto ácido nucleico (componente (d) ) como se ha descrito anteriormente y la célula empaquetadora.

Los adenovirus abarcan un número de subgrupos diferentes, aunque el tipo 5 de adenovirus del subgrupo C (Ad5) es el más normalmente usado. Se conocen numerosos adenovirus de origen humano, mamífero no humano y aviar y están disponibles de depósitos tal como la ATCC.

También es posible proporcionar la cuarta secuencia de nucleótidos como una secuencia de ADN vírico, al que normalmente se refiere como "virus auxiliar". Se describen virus auxiliares adecuados según la invención en la solicitud alemana de patente 196 (44 500.0-41, por ejemplo, y comprenden por ejemplo también las secuencias de ADN divulgadas en esta solicitud de patente del plásmido pTG9585 que como secuencia de ADN de virus auxiliar comprende la secuencia completa del adenovirus 5 con la excepción de la región El.

La secuencia que forma el ADN del virus del herpes se puede incorporar a un vector, al que normalmente se refiere como "el plásmido de empaquetamiento del vector AAV" . El plásmido de empaquetamiento también puede comprender secuencias de ADN de virus auxiliar que son diferentes de aquellas en pTG9585 en que tienen una deleción en el gen estructural Ll de la secuencia de Ad5, en particular en la región de nucleótidos 16614-18669.

- - Las secuencias de ADN de virus accesorias derivan preferiblemente del virus del herpes o de adenovirus,, siendo preferido adenovirus 5 (Ad5) .

En una forma de realización particularmente preferida, el plásmido de empaquetamiento del vector AAV según la invención contiene como secuencias de ADN de virus áuxiliar los genes E2A, E4 y VA de Ad5, que pueden deriyar del plásmido pDG descrito en la solicitud alemana de patente 196 44 500.0-41, por ejemplo, y que están controladas por el promotor original respectivo o por promotores heterólogos.

Además, el plásmido de empaquetamiento del vector AAV puede contener un gen que codifica un marcador fenotipico detectable para demostrar la introducción con éxito del plásmido de empaquetamiento del vector AAV en la célula diana. En una forma de realización aún más preferida, el plásmido de empaquetamiento del vector AAV según la invención contiene de esta manera además un cásete de expresión para la expresión de una proteina marcadora, preferiblemente una proteina fluorescente. En relación a esto, el término "cásete de expresión" se refiere a una combinación de un gen que codifica, por ejemplo, un gen fluorescente y un promotor adecuado que controla este gen y una señal de poliadenilación . Esto demuestra fácilmente la transfección de la célula diana deseada. Ejemplos de genes adecuados que codifican proteínas fluorescentes son los genes RFP-(rojo), GFP- (verde), CFP-(cian) y YFP- (amarillo) , siendo preferido RFP-(rojo) (Dsred-ADNc) ; Clontech) . Ejemplos de promotores adecuados son el promotor RSV (virus del sarcoma de rous), promotor CMV (citomegalovirus) y promotores tk de HSV (virus del herpes simple) , siendo preferido el promotor RSV. Este - - casete de expresión se inserta en el plásmido de empaquetamiento del vector AAV en un sitio adecuado que puede ser fácilmente determinado por el experto en la materia, preferiblemente entre el extremo 3' del gen cap y el inicio del gen adenovirico VA, por ejemplo, en el sitio de corte de Clal. Este sitio de corte Clal está presente en pDG.

En otra forma de realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a un plásmido de empaquetamiento del vector AAV, las secuencias de ADN del vector de expresión de AAV que contienen una secuencia de ADN que codifica HPV16-L1 bajo el control de un promotor CMV. Tal plásmido de empaquetamiento del vector AAV al que se refiere como pDS2-Lhl se depositó como DSM 14406 con DSMZ [colección alemana de microorganismo y cultivos de células], Braunschweig, Alemania, según las provisiones del Tratado de Budapest del 17 de julio de 2001. Tal plásmido puede llevar todas las funciones accesorias requeridas o sólo algunas de las funciones necesarias en cuyo caso las funciones accesorias restantes pueden ser proporcionadas por la célula empaquetadora .

En un método alternativo, los viriones AAV de la invención se pueden producir mediante un método que comprende los pasos de (i) poner en contacto una primera secuencia de ácido nucleico que comprende i. un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor especifico de hígado y - - ii. una 5'-ITR y una 3' -ITR de AAV flanqueando el cásete de expresión definido én (i) con una composición que comprende las proteínas de la cápside de AAV y (ii) recuperar los viriones AAV recombinantes de la mezcla.

Un método alternativo para la producción de viriones AAV es el uso de un sistema basado en células de insecto. El sistema de expresión de baculovirus es bien conocido por su uso como un vector de clonación y expresión eucariótico (King, L. A., y R. D. Possee, 1992, "The baculovirus expression system", Chapman y Hall, Reino Unido; O'Reilly, D. R., et al., 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman.). Las ventajas del sistema de expresión de baculovirus son, entre otras, que las proteínas expresadas son casi siempre solubles, están correctamente plegadas y son biológicamente activas. Las ventajas adicionales incluyen altos niveles de expresión de proteína, producción más rápida, idoneidad para la expresión de proteínas grandes e idoneidad para la producción a gran escala.

El sistema de expresión de baculovirus se ha usado con éxito para la producción de vectores recombinantes de virus adenoasociados (AAV) (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; US 6723551 y US 20040197895). Este sistema fue descrito por Urabe y col., (2002, supra) que desarrollaron un sistema de producción de AAV en células de insecto.

En este sistema, se generan las siguientes secuencias de ácido nucleico: (i) una primera secuencia de ácido nucleico - - que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor especifico de hígado y una 5'-ITR y una 3'-ITR de AAV flanqueando dicho cásete de expresión, (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína rep de AAV y (iii) una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína cap de AAV.

Las tres secuencias de ácido nucleico típicamente las llevan vectores que son vectores compatibles con células de insecto. Las secuencias se pueden llevar en uno, dos' o tres vectores. Como se ha explicado anteriormente, la primera secuencia de nucleótidos comprende al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. La segunda secuencia de nucleótidos típicamente comprenderá un marco abierto de lectura (ORF) que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV operativamente unida a al menos una secuencia de control de la expresión para expresión en una célula de insecto. La tercera secuencia de nucleótidos típicamente comprende un marco abierto de lectura que codifica una secuencia codificante de Rep52 o Rep40 y una secuencia codificante de Rep78 o Rep68 unida operativamente a al menos una secuencia de control de expresión para la expresión en una célula de insecto. Las proteínas Rep pueden estar codificadas por un único marco abierto de lectura.

El método para generar viriones AAV comprende introducir las secuencias de ácido nucleico, por ejemplo comprendidas en - - uno, dos o tres vectores compatibles con células de insecto (típicamente baculovirus) , en una célula de insecto y mantener la célula de insecto en condiciones tales que se produzca AAV. AAV se puede recuperar después.

Para la producción de AAV en células de insecto pueden ser necesarias algunas modificaciones para alcanzar la estequiometria correcta de las tres proteínas de la cápside de AAV (VP1, VP2 y VP3), que se basa en una combinación del uso alternado de dos sitios aceptores de ayuste y la utilización subóptima de un codón de iniciación ACG para VP2 que no se reproduce exactamente en células de insecto. Para mimetizar la estequiometria correcta de las proteínas de la cápside en células de insecto Urabe y col. (2002, supra) propusieron el uso de una construcción que se transcribe en un mensajero policistrónico único que es capaz de expresar las tres proteínas VP sin requerir ayuste y en donde él codón de iniciación más 5' se cambia por el codón de iniciación subóptimo ACG. WO2007/046703 divulga mejoras adicionales de la infectividad de los vectores rAAV producidos en baculovirus basado en la producción mediante la optimización de la estequiometria de las proteínas de la cápside de AAV producidas en células de insecto.

Para la expresión de las proteínas Rep de AAV en el sistema de expresión de AAV en células de insecto como se desarrolló inicialmente por Urabe y col. (2002, supra), se usa una construcción de baculovirus recombinante que lleva dos unidades independientes de expresión de Rep (una para Rep78 y una para Rep52), cada una bajo el control de un promotor separado de célula de insecto, los promotores 5IE1 y PolH, respectivamente.

- - Kohlbrenner et al. (2005, Mol. Ther. 12: 1217^-25; WO 2005/072364) describieron que la construcción de baculovirus para la expresión de las dos proteínas Rep, usado por Urabe y col., padece inestabilidad inherente. Separando la orientación palindrómica de los dos genes Rep en el, vector original de Urabe y diseñando dos vectores de baculovirus separados para expresar Rep52 y Rep78, Kohlbrenner y col. (2005, supra) aumentaron la estabilidad de pase del vector. Sin embargo, a pesar de la expresión consistente de Rep78 y Rep52 de las dos construcciones de baculovirus de Rep independientes en células de insecto durante al menos 5 pases, el rendimiento del vector rAAV es de 5 a 10 veces menor comparado con la construcción original de Rep en baculovirus diseñada por Urabe y col. (2002, supra) .

En WO2007/148971, se alcanzó una estabilidad significativamente mejorada de la producción del vector rAAV en células de insecto usando una única secuencia codificante para las proteínas Rep78 y Rep52 en donde se usa un codón de iniciación subóptimo para la proteína Rep78 que es parcialmente evitado por lo ribosomas que barren para permitir que la iniciación de la traducción también se produzca más abajo en el codón de iniciación de la proteína Rep52.

Todas las modificaciones descritas anteriormente se pueden usar en un método de la invención como se describe aquí .

En las células de insecto de la invención la primera, segunda y tercera secuencias de ácido nucleico están preferiblemente comprendidas en vectores de ácidos nucleicos - pueden estar en el mismo o en vectores diferentes. La - - célula de insecto puede comprender tres construcciones de ácido nucleico separadas, una para cada una de la primera y segunda y tercera secuencias de nucleótidos, o la célula de insecto puede comprender un único tipo de construcción de ácido nucleico o dos vectores que comprendan la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos distribuidas de forma apropiada (por ejemplo, la primera secuencia de ácido nucleico puede estar localizada en un primer vector y la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico pueden estar localizadas en un segundo vector) .

Preferiblemente, la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico están operativamente unidas a secuencias de control de la expresión para la expresión en una célula de insecto. Estas secuencias de control de la expresión incluirán al menos un promotor que sea activo en células de insecto. Se pueden usar técnicas conocidas por los expertos en la matera para expresar los genes exógenos para practicar la invención. La metodología para la manipulación molecular y expresión de polipéptidos en células de insecto se describe por ejemplo, en Summers y Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. En Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors1 Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. y R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman y Hall, Reino Unido; O'Reilly, D. R. , L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York; W. H. Freeman y Richardson, C. D., 1995, Baculovirus - - Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volumen 39; US 4745051; US2003148506 ; y O 03/074714. Los promotores adecuados para la transcripción de la primera y segunda secuencias de nucleótidos de la invención incluyen, por ejemplo, los promotores de poliedro (PolH) , PIO, p35, IE-I o d??-l y promotores adicionales descritos en las referencias anteriores. Puesto que se sabe que en células de mamíferos una expresión menos abundante de Rep78 comparada con Rep52 favorece rendimientos altos del vector (Li et al., 1997, J Virol. 71: 5236-43; Grimm et al., 1998, Hum Gene Ther. 9, 2745-2760), preferiblemente se usa un promotor más débil para dirigir la expresión de la proteína Rep78 ó 68 que el promotor usado para la expresión de la proteína Rep52 ó 40. Por ejemplo, el promotor de poliedro más fuerte se puede usar para la expresión de la proteína Rep52 ó 40, el promotor d??-1, un promotor mucho más débil que el promotor PolH, se puede elegir para dirigir la expresión de la proteína Rep78 ó 68. Preferiblemente, la elección de promotores para la proteína Rep52 ó 40 y la proteína Rep78 ó 68, respectivamente, es tal en una célula de insecto de modo que en la célula de insecto se produce una proporción molar de Rep78/68 a Rep52/40 en el intervalo de 1:10 a 10:1, de 1:5 a 5:1, ó de 1:3 a 3:1, preferiblemente a alrededor de 20-40 tras la infección, más preferiblemente a alrededor de 30-40 horas tras la infección, usando expresión en baculovirus. La proporción molar de Rep78 y Rep52 se puede determinar por medio de inmunotransferencia , preferiblemente usando un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo común tanto de Rep78/68 como de Rep52/40, o usando por ejemplo un anticuerpo anti-Rep de ratón (303.9, Progen, Alemania; dilución 1:50) .

- - Preferiblemente las construcciones de ácidos nucleicos para la expresión de la segunda y tercera secuencias de nucleótidos de la invención en células de insecto son vectores compatibles con células de insecto. Un "vector compatible con células de insecto" o un "vector" se entiende que es una molécula de ácido nucleico capaz de transformación productiva o transfección de un insecto o célula de insecto. Los vectores biológicos ejemplares incluyen plásmidos, moléculas lineales de ácido nucleico, y virus recombinantes . Se puede emplear cualquier vector mientras sea compatible con células de insecto. El vector se puede integrar en el genoma de las células de insecto pero el vector también puede ser episomal. La presencia del vector en la célula de insecto no necesita ser permanente y también se incluyen vectores episomales transitorios. Los vectores se pueden introducir por cualquier medio conocido, por ejemplo mediante tratamiento químico de las células, electroporación o infección. En una forma de realización preferida, el vector es un baculovirus, un vector viral, o un plásmido. En una forma de realización más preferida, el vector es un baculovirus, es decir, la construcción es un vector de baculovirus. Los vectores de baculovirus y los métodos para su uso se describan en las referencias citadas anteriormente sobre manipulación molecular de células de insecto.

La célula de insecto puede ser cualquier célula que es adecuada para la producción de proteínas heterólogas. Preferiblemente la célula de insecto permite la replicación de los vectores baculovirales y se pueden mantener en cultivo. Más preferiblemente la célula de insecto también permite la replicación de vectores parvovirales - - recombinantes , incluyendo vectores rAAV. Por ejemplo, la línea celular usada puede ser de Spodoptera f ugiperda , líneas celulares de Drosophila, o líneas celulares de mosquito, por ejemplo, líneas celulares derivadas de Aedes albopictus . La células o líneas celulares de insecto preferidas son de especies de insecto que son susceptible de infección por baculovirus, incluyendo, por ejemplo, Se301, SeIZD2109, SeUCRl, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1- , MG-I, Tn368, HzAmI, Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, EE.UU.) y expresSF+® (US 6,103,526; Protein Sciences Corp., CT, EE.UU. ) .

Una línea de insecto preferida para su uso en el método de la invención es una célula de insecto para la producción de vectores parvovirales recombinantes . Esta célula de insecto adicionalmente comprende, además de la secuencias de ácido nucleico "segunda" y "tercera", una primera construcción de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (ITR) de parvovirus y una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo qüe está operativamente unido a un promotor específico de hígado.

El número de construcciones de ácido nucleico empleadas (para administrar las tres secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente) en la célula de insecto para la producción del vector parvoviral recombinante (rAAV) no es limitante en la invención. Por ejemplo, se pueden emplear una, dos, tres, cuatro, cinco o más construcciones separadas para producir rAAV en células de insecto según los métodos de la presente invención. Si se emplean cinco construcciones, una construcción codifica VP1 de AAV, otra construcción - - codifica VP2 de AAV, aún otra construcción codifica VP3 de AAV, todavía otra construcción codifica la proteína Rep como se ha definido anteriormente y una construcción' final comprende al menos una ITR de AAV. Si se usan menos de cinco construcciones, las construcciones pueden comprender1 varias combinaciones de al menos una ITR y las secuencias codificantes de las proteínas VPl, VP2, VP3 y Rep de AAV.

"Empaquetamiento" como se usa aquí se refiere a una serie de sucesos subcelulares que producen el ensamblaje y encapsidación de un vector viral, particularmente un vector rAAV. De esta manera, cuando un vector adecuado se introduce en una línea celular empaquetadora en las condiciones apropiadas, se puede ensamblar en una partícula viral. Las funciones asociadas con el empaquetamiento de vectores virales, particularmente vectores rAAV, se describen aquí y en la técnica.

El paso (ii) del método para producir viriones AAV comprende la recuperación de los viriones de las células empaquetadoras. Para este fin, la muestra que contiene el virus se somete a uno o más pasos de purificación, incluyendo separación en gradiente de densidad y cromatografía.

Un ejemplo de un método para purificar viriones rAAV incluye varios pasos. Primero, se suministra una pluralidad de células infectadas con viriones rAAV. De estas células infectadas, se recogen los viriones rAAV. Estos viriones se someten después a un paso de separación de gradiente de densidad tal como el que usa un gradiente de yodixanol. Un gradiente de yodixanol en pasos típico contiene un paso de yodixanol al 15%, un paso de yodixanol al 25%, un paso de yodixanol al 40%, y un paso de yodixanol al 60%. El paso de - - yodixanol puede incluir además NaCl 1 M. El paso de yodixanol que contiene el virus se centrifuga, y la muestra resultante que contiene el virión se recoge del paso de gradiente de yodixanol. Esta muestra se somete entonces a un paso de cromatografía, tal como un paso de cromatografía de intercambio iónico o de hidroxiapatita .

Los métodos de purificación de la invención son particularmente útiles para purificar viriones que tienen cápsides que contienen proteínas de los serotipos 1 y 5 de AAV porque estos serotipos no se unen a columnas de héparina. Para purificar viriones rAAVl y rAAV5, se emplean protocolos de purificación que emplean centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol seguido por cromatografía de intercambio aniónico o de hidroxiapatita. El yodixanol es un medio de gradiente de densidad yodado originalmente producido como un compuesto de contraste de rayos X para inyección en seres humanos. Diferente a los gradientes de densidad hiperosmóticos de sal inorgánica (CsCl) y sacarosa normalmente usados para el fraccionamiento de macromoléculas , las soluciones de yodixanol se pueden hacer isosmóticas a todas las densidades. Esta propiedad hace el yodixanol un medio ideal para el análisis y pasos de purificación posteriores. Además, el yodixanol tiene la capacidad de separar proteínas libres de la cápside y cápsides vacías de cápsides que contienen el genoma del vector (llenas) . Aunque se prefiere el uso de yodixanol en la invención, se pueden sustituir por otros medios de gradiente de densidad adecuados .

Tras la centrifugación del gradiente de densidad, los vectores rAAV se purifican mediante cromatografía en columna, - - Se puede usar cualquier método de cromatografía que permita la purificación de viriones rAAV. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico es un método que se basa 1 en la interacciones de carga entre la proteína de interés y la matriz de intercambio iónico, que generalmente está compuesta de resinas, tal como agarosa, dextrano, y celulosa y agarosa entrecruzadas, que están covalentemente unidas a un grupo cargado. Los grupos cargados se clasifican según el tipo (catiónico y aniónico) y la fuerza (fuerte o débil) . Las técnicas cromatográficas de intercambio iónico en general tienen lugar en varios pasos: equilibrio de la columna a pH y condiciones iónicas ideales para la unión de la proteína diana, adsorción reversible de la muestra a la columna mediante desplazamiento de contraiones, introducción de condiciones de elución que cambian el pH o la fuerza iónica del tampón para desplazar las proteína unidas a la columna, y elución de las sustancias de la columna en orden de fuerza de unión (las proteínas unidas débilmente eluyen primero). La cromatografía de intercambio iónico es directamente adaptable desde un nivel a pequeña escala a un nivel a gran escala. La cromatografía de intercambio aniónico es un tipo de cromatografía de intercambio iónico en la que una resina negativamente cargada se unirá a proteínas con uña carga neta positiva. Ejemplos de resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente incluyen HiTrapQ de Pharmacia; MonoQ, MonoS, MiniQ, Source 15Q, 30Q, Q Sepharose, DEAE, y Q Sepharose High Performance de Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.); P PEI, WP DEAM, y WP QUAT de J. T. Baker (St. Louis, Mo.); Hydrocell DEAE, e Hydrocell QA de Biochrom - - Labs (Terre Haute, Ind.); UNOsphere Q, Macro-Prep DEAE, y Macro-Prep HighQ de Bio-Rad (Hercules, Calif.); Ceramic HyperD Q, Ceramic HyperD S, Ceramic HyperD DEAE, Trisacryl DEAE, Trisacryl LS . DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA Spherosil, y QMA M Spherosil de Ciphergen (Fremont, Calif.); DO EX MONOSPHERE de Dow Liquid Separations (Midland, Mich . ) ; , Matrex Q500, Matrex A500, Matrex Q800, Matrex A800, y Matrex A200 de Millipore (Bedford, Mass.); Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD DEAE, y Fractogel EMD DMAE de Novagen (Madison, Wis.); Amberlite Intercambiadores Aniónicos Fuertes de Tipo I, Amberlite Intercambiadores Aniónicos Fuertes de Tipo II, DOWEX Intercambiadores Aniónicos Fuertes de Tipo I, DOWES Intercambiadores Aniónicos Fuertes de Tipo II, Diaion Intercambiadores Aniónicos Fuertes de Tipo I, Diaion Intercambiadores Aniónicos Fuertes de Tipo II, Amberlite Intercambiadores Aniónicos Débiles, y DOWEX Intercambiadores Aniónicos Débiles de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo . ) ; TSK Gel DEAE-5PW-HR, TSK Gel DEAE-5PW, TSK Gel Q-5PW-HR, y TSK Gel Q-5PW de Tosoh Biosep (Montgomeryville, PA) ; y QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D y Express-Ion Q de Whatman (Kent, QK) . Para la purificación de viriones rAAVl y rAAV5, la cromatografía de intercambio aniónico es preferida.

La cromatografía de hidroxiapatita es otro ejemplo de una técnica de cromatografía adecuada. Hidroxiapatita es una forma cristalina de fosfato de calcio. El mecanismo de la cromatografía de hidroxiapatita implica interacciones no específicas entre grupos carboxilo cargados negativamente en las proteínas e iones de calcio cargados positivamente en la resina, y grupos amino cargados positivamente en las proteínas e iones fosfato cargados negativamente en la - - resina. Ejemplos de resinas de hidroxiapatita comercialmente disponibles incluyen resinas cerámicas Bio-Gel HT y CHT de Bio-Rad (Hercules, Calif.); hidroxiapatita de alta resolución e hidroxiapatita de flujo rápido de Calbiochem (San Diego, Calif.); HA Ultrogel de Ciphergen (Fremont, Calif.); e hidroxiapatita de Sigma-Aldrich (St. Louis, o.). Además de por cromatografía de intercambio aniónico, los viriones rAAV5 se purificaron usando cromatografía de hidroxiapatita (Fig. 3B) . Un ejemplo de una resina de hidroxiapatita preferida es hidroxiapatita cerámica de Bio-Rad, Hercules, Calif.,. ya que esta es una forma estable, porosa de hidroxiapatita con una proporción calcio : fosfato mejorada, que supera la baja capacidad de unión debido al exceso de fosfato.

Para la purificación de viriones rAAV2, la cromatografía en heparina-agarosa es preferida. Ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6146874.

Se usa una combinación de un gradiente en pasos de yodixanol seguido por cromatografía de afinidad en heparina (para purificar rAAV2), hidroxiapatita, o intercambio aniónico (para purificar AAV1, 2 y 5) para facilitar el alto rendimiento de varios virus para comparación directa de la eficacia de transducción y especificidad en modelos animales y cultivo de células. La producción de virus aumentada a escala en cultivo de tejido se facilita mediante el uso de fábricas de células, por ejemplo bandejas de plástico con grandes áreas de superficie de cultivo (Nunc, Rochester, N.Y.). De forma más importante, la purificación de los viriones rAAVl, 2 y 5 en Q-Sepharose permite la comparación de los viriones purificados usando el mismo método. Además, el protocolo basado en la fábrica de células produce - - soluciones de viriones con títulos de 1?1012-1?1013 gv/ml purificados de 1*109 células. Estos métodos cromatográficos han añadido el beneficio de que se pueden aumentar a escala fácilmente para purificar virus de 1 ? 1010 células .

Optimizando el protocolo de transfección y el método de purificación, se pueden obtener rutinariamente 100-200 unidades infecciones (UI) por célula. Para una preparación de lxlO9 células, por ejemplo, el rendimiento final de rAAV es aproximadamente l-5xlOn UI o aproximadamente Ixl012-lxl013 genomas de vector.

Los viriones también se purifican usando cromatografía en ausencia de centrifugación en gradiente de densidad. Como ejemplo, los lisados de células infectadas se pueden someter directamente a cromatografía para la purificación de viriones rAAV. Para métodos de producción a gran escala de vectores rAAV que implican cromatografía, ver Potter et al. (Methods Enzymol., 2002, 346:413- 30).

Los viriones recombinantes se pueden usar o se puede incluir un paso adicional de purificación por afinidad de los vectores viriones usando un anticuerpo anti-AAV, preferiblemente un anticuerpo inmovilizado. El anticuerpo anti-AAV preferiblemente es un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo particularmente adecuado es un anticuerpo de camélido de cadena sencilla o un fragmento del mismo, obtenible por ejemplo, de camellos o llamas (ver, por ejemplo, Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302). El anticuerpo para la purificación por afinidad de rAAV preferiblemente es un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de una proteína de la cápside de AAV, en donde el epítopo preferiblemente es un epítopo que está presente en - - proteinas de la cápside de más de un serotipo de AÁV. Por ejemplo el anticuerpo se puede producir o seleccionar en base de la unión especifica a la cápside de AAV2 pero al mismo tiempo también se puede unir específicamente a las cápsides de AAV1, AAV3 y AAV5.

Métodos para preparar viriones SV40 recombinantes .

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preparar un virión SV40 recombinante que comprende (i) poner en contacto un célula con un polinucleótido que comprende un genoma SV40 deficiente para replicación que comprende un cásete de expresión que comprende un secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor específico de hígado y en donde la célula expresa los genes de SV40 que complementan el defecto de replicación en dicho polinucleótido en condiciones adecuadas para la entrada de dicho polinucleótido en la célula y (ii) recuperar el virión SV40 recombinante de las células.

En el paso (i), una célula se pone en contacto con un polinucleótido que comprende un genoma de SV40 deficiente en replicación que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unido a un promotor específico de hígado. Preferiblemente, el genoma de SV40 carece de la región que codifica el antígeno T grande .

- - El genoma de SV40, que carece de la secuencia que codifica el antígeno T grande pero aún contiene las secuencias que codifican las proteínas de la cápside bajo el control del promotor tardío se puede propagar entonces en un vector de clonación convencional. Se puede clonar un transgén bajo el control de un promotor específico de hígado en la región del vector de clonación previamente ocupada por el antígeno T grande. La secuencia de ADN vírica se puede cortar y purificar del vector de clonación y religar para formar un ADN circular. Se pueden producir viriones y ser amplificados transíectando una célula empaquetadora que expresa el antígeno T grande con el ADN de vector viral circular religado. Una célula empaquetadora particularmente preferida es una línea celular que expresa antígenos T de forma constitutiva que puede complementar el vector SV40. Una célula adecuada es la línea celular Cos-1. Sin embargo, se pueden usar otras líneas celulares después de la introducción del gen para el antígeno T grande de SV40.

El promotor específico de hígado puede ser cualquier promotor como se ha definido anteriormente. En una forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor híbrido que comprende la región potenciadora de la albúmina y el promotor de la al-antitripsina . En otra forma de realización preferida, el promotor específico de hígado es un promotor inducible específico de hígado.

La invención se explica mediante los siguientes ejemplos que se deben interpretar como meramente ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.

- - Ej emplos : Evaluación de los efectos de un vector AAV bicatenario que codifica IGF-I (dsAAVIGF-I) en cirrosis hepática Materiales y Métodos Construcción y producción de vector AAV bicatenario. Los plásmidos AAV usados en este estudio contienen un cásete de expresión flanqueado por dos ITR del AAV2 y una secuencia de relleno apropiada para ajustar el tamaño del genoma AAV a la capacidad de empaquetamiento óptima descrita para AAV. El cásete de expresión del transgén tiene los siguientes elementos: la 5' -ITR de AAV2, un promotor especifico de hígado EalbAATp con secuencias reguladoras del potenciador de la albúmina (Kramer et al., 2003, Mol Ther. 7:375-^-85), el ADNc de rata de IGF-I, la poliadenilación de SV40, y la 3'-ITR de AAV2. Con el objetivo de generar un vector AAV bicatenario la 3' -ITR carecía del sitio terminal de resolución, como se describe en McCarty et al. (Gene Therapy 2003; 10: 2112-2118) .

Este plásmido AAV se nombró pAAVIGF-I. Se hizo una construcción similar con un promotor PBGD, que es ubicuo y un gen marcador de luciferasa (acceso de GenBank # M15077) . Este plásmido AAV se nombró pAAVLuc. Se produjeron vectores bicatenarios dsAAV2/l mediante cotransfección mediada por fosfato de calcio en células 293 de tres plásmidos diferentes pAdDeltaF6, p5E18-VD2/8 y el gen terapéutico (pAAVIGF-I) o marcador (pAAVLuc) (Hermens et al, 1999 Hum Gene Ther. 10:1885-91 y Gao et al 2002, Proc Nati Acad Sci USA, 99:11854-9). Brevemente, las células 293 se cotransfectaron - - con pAdDeltaF6, p5E18-VD2/8 y el vector diana mediante fosfato de calcio y el virus se recogió por congelación descongelación de las células, 48 horas después de la transíección . El virus se purificó mediante cromatografía en columna de intercambio iónico y centrifugación en gradiente de yodixanol seguido por filtración y concentración adicional contra solución salina tamponada en fosfato ( PBS ) -sacarosa al 5%. Los títulos de los virus dsAAVIGF-I en términos dé copias de genoma/ml se determinaron mediante Q-PCR realizada en triplicado, análisis de TaqMan (AppliedBiosystem) usando los cebadores pr300fw 5' CCCTGTTTGCTCCTCCGATAA3' (SEQ ID NO: 8) pr301rv 5' GTCCGTATTTAAGCAGTGGATCCA 3' (SEQ ID NO: 9) que amplifican un fragmento de 95 bp de la región promotora hAAT. La composición y pureza de las proteínas se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) .

Modelo de cirrosis hepática establecida. La cirrosis se indujo en ratas Sprague-Dawley machos de 180-200 g, con administraciones intragástricas semanales de tetracloruro de carbono (CC14, Riedel-de Haén) durante 8 semanas, como se ha descrito y 400 mg/1 de fenobarbital en el agua de beber (Runyon BA et al., Gastroenterology . 1991:100:489-493.). Brevemente, la dosis inicial de CC14 fue de 20 µ? por rata. Las dosis posteriores se ajustaron basado en el cambio en el peso corporal 48 horas después de la última dosis (Runyon et al., supra) . Todas las ratas se observaron al menos dos veces al día hasta la muerte. Siguiendo este protocolo, se observó ascitis en algunos de los animales. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital 3, 5 y 8 semanas después de la - - primera administración de CC14. Se midieron las transaminasas (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa y fosfatasa alcalina) , albúmina, y bilirrubina en suero (ABX diagnostics) en un autoanalizador Hitachi (Roche) . Los resultados muestran que las transaminasas alcanzaron los niveles más altos después de 8 semanas de la administración de CC1 .

Administración de vectores virales. Se analizaron cuatro grupos experimentales de animales: ratas sanas (n=19) , ratas cirróticas inyectadas con solución salina (Ci) (n=16) , tratadas con 3,4xl09 partículas virales de dsAAVLuc (Ci+Luc) (n=19) o dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I) (n=23) . El vector se administró mediante inyección en la arteria hepática. Los animales se sacrificaron 4 días (sanos n = 5, Ci n = 4, Ci+Luc n = 4, Ci+IGF-I n = 6) , 2 semanas (sanos n = 4, Ci n = 3, Ci+Luc n = 5, Ci+IGF-I n = 6) , 8 semanas (sanos n = 5, Ci n = 4, Ci+Luc n = 5, Ci+IGF-I n = 5), 16 semanas (sanos n = 5, Ci n = 5, Ci+Luc n = 5, Ci+IGF-I n = 6) o un año (sanos n = 3, salino n = 4, Ci+AAVLuc n = 2, Ci+IGF-I n = 4)' después de la administración del vector. Las ratas sanas también se sacrificaron como controles. Los animales tratados con 10u partículas virales de SVIGF-I y sacrificados 4 días y 8 semanas después de la última administración de CC14 también se incluyeron como controles positivos y se incluyen en la información suplementaria. Se recogieron muestras de sangre antes del sacrificio y se analizaron como se indica anteriormente. Las muestras de hígado se procesaron para histología, y purificación de ARN y proteínas para análisis adicionales.

- - Análisis de los marcadores séricos y del IGF-I en suero.

Se midieron las transaminasas séricas (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa, y fosfatasa alcalina) , albúmina y bilirrubina (ABX diagnostics)1 en un autoanalizador Hitachi (Roche) .

El IGF-I en suero se cuantificó con OCTEIA IGF-I de rata/ratón (IDS) mediante ELISA.

Histología e inmunohis oquimica del hígado. Se evaluó y cuantificó el contenido de colágeno del hígado como está descrito (Vera M. et al., Gene Ther. 2007:14:203-210.). La tinción inmunohistoquímica para la actina a de músculo liso (aSMA) se hizo con el anticuerpo 1A4 (M0851, Dako) diluido 1:100 o 1:400, y para KÍ67 con el anticuerpo SP6 (RM-9106, NeoMarkers) diluido 1:50.

Análisis de proteínas y ARN del hígado. Se midió el IGF-I total de hígado (OCTEIA IGF-I de rata/ratón, Vitro) en extractos de hígado mediante ELISA.

Se midieron HGF (Institute of immunology Co, Ltd) , MMP2 (sistema Biotrak de ensayo de actividad de metaloproteinasa-2 de matriz) y MMP9 (sistema Biotrak de ensayo de actividad de metaloproteinasa-9 de matriz) en extractos de hígado mediante ELISA.

La actividad M P total se evaluó también en extractos de hígado con un sustrato peptídico fluorogénico (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2; R&D systems) (Knight CG et al.. FEBS Lett. 1992; 296:263-266) .

- - Como control positivo se usó MMP-2 humana recombinante (Calbiochem) .

El ARN total se extrajo como se ha descrito previamente (Vera et al., supra) . Se hicieron qRT-PCR como se ha descrito usando los cebadores mostrados en la tabla 1 (Vera et al., supra) .

[Escriba una cita del documento o del resumen de un punto interesante. Puede situar el cuadro de texto en cualquier lugar del documento. Utilice la ficha Herramientas de cuadro de texto para cambiar el formato del cuadro, de texto de la cita . ] - - Aislamiento de células de higado . Se aislaron células de hígado tras la perfusión con pronasa y liberasa (para aislar células estrelladas, de Kupffer y endoteliales ) o colagenasa (para aislar hepatocitos) ( ang SR et al. In Vitro Cell Dev Biol. 1985; 21:526-530). Para el aislamiento de hepatocitos, se centrifugaron células de hígado a 500 rpm durante 4 minutos a 4°C. Se lavó el sedimento de hepatocitos dos veces en medio de William libre de suero y se centrifugó a 500 rpm durante 2 minutos a 4°C. Cuando la viabilidad celular era inferior al 70%, se purificaron los hepatocitos viables en un gradiente de Percoll al 80%. Para aislar células estrelladas, de Kupffer y endoteliales, se desecharon en primer lugar los hepatocitos tras la centrifugación a 50 g durante 5 minutos a 4°C. Se lavó el sobrenadante tres veces en DMEM-F12 libre de suero mediante centrifugación a 450 g durante 7 minutos a 4°C. Entonces, se separaron las células mediante centrifugación en un gradiente de Nycodenz a 1450 g durante 20 minutos a 4°C. Se retiraron las células estrelladas hepáticas de la fase superior del gradiente y se lavaron en DMEM y se centrifugaron a 450 g durante 5 minutos a 4°C. Se recuperaron células de Kupffer y endoteliales a partir de la inferíase del gradiente de Nicodenz y se lavaron en DMEM libre de suero.

Análisis estadístico. Los datos se expresan como medias + desviación estándar. La significación estadística se estimó mediante la prueba t de Student. Un valor de P < 0,05 se consideró significativo (*) . Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con SPSS vll.O (SPSS Inc.).

- - Ejemplo 1. Análisis del modelo de cirrosis hepática establecida Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital 8, 16, 25 y 33 semanas después de la primera administración de CC14 (Fig. 1A) . Se midieron las transaminasas (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa y fosfatasa alcalina) , albúmina y bilirrubina en suero, (ABX diagnostics) en un autoanalizador Hitachi (Roche) . Los resultados muestran que las transaminasas alcanzaron los niveles más altos después de 8 semanas de la administración de CC14 (Fig. IB). Después, las transaminasas descendieron pero los niveles eran mayores que en los animales sanos incluso 33 semanas después de la primera administración de CC14 (Fig. IB) . Los mismos resultados se obtuvieron con bilirrubina (datos no mostrados) . Además, los niveles de albúmina descendieron tras 8 de administración de CCI4 y permanecieron más bajos que en controles sanos 33 semanas después del inicio del protocolo (datos no mostrados) .

Los animales se sacrificaron 16, 21 ó 33 semanas después de la primera administración de CC14 (Fig. 1A) . Las muestras de hígado se fijaron en paraformaldehido al 4%, se embebieron en parafina y se tiñeron con hematoxilina-eosina para evaluar la morfología del hígado (datos no mostrados) . El contenido de colágeno del hígado se evaluó mediante tinción con rojo sirio y se puntuó mediante análisis de imágenes (AnalySIS 3.1, Soft Imaging System) (Vera et al., supra). La fibrosis hepática era aparente a las 16 semanas y se mantuvo 21 y 33 semanas después del inicio del protocolo (Fig. 1C y D) . Se observaron niveles similares en todos los casos como se muestra mediante cuantificación de la tinción con rojo sirio - - (Fig. ID) . No se observaron cambios significativos en el tamaño de los nodulos parenquimatosos en las diferentes muestras .

Ejemplo 2. Transferencia génica de IGF-I al hígado cirrótico Para evaluar el efecto de IGF-I en hígados cirróticos de rata, se indujo cirrosis con CC14 durante 8 semanas (Fig. 2). Las ratas cirróticas se trataron con solución salina o con vectores adenoasociados bicatenarios (dsAAV) recombinantes que codifican luciferasa (dsAAVLuc) o IGF-I (dsAAVIGF-I) mediante administración intra-arterial . Se eligió esta vía ya que experimentos previos con dsAAVLuc habían mostrado buenos niveles de expresión tras la inyección intra-arterial del vector. Además, esta vía tras el cateterismo de la arteria hepática es posiblemente el procedimiento más adecuado a ser usado en pacientes. Los animales tratados se sacrificaron 4 días, 2 semanas, 8 semanas, 16 semanas, y 1 año después de la inyección del virus. También se sacrificaron ratas sanas como controles.

Para evaluar la expresión del transgén de dsAAVIGF-I en hígado de rata, se realizaron qRT-PCR y ELISA de ÍGF-I en muestras de hígado y suero de todos los grupos. Como se esperaba, tanto los niveles de ARNm como de proteína de IGF-I estaban significativamente aumentados en el grupo Ci+IGF-I y disminuidos en los hígados cirróticos control (Ci y Ci+Luc) comparados con ratas sanas (Fig. 3A y B) . Como se ha descrito, IGF-I disminuyó en suero de animales cirróticos comparados con controles sanos 4 días después de la última dosis de CC14 (Fig. 3C) . Sin embargo, los niveles de IGF-I en - - animales cirróticos y sanos eran similares 2 semanas después de la última dosis del hepatóxico. La administración de dsAAVIGF-I no produjo un aumento de IGF-I en suero a ningún tiempo analizado (Fig. 3C) . En conjunto, estos datos indican que el vector dsAAVIGF-I fue capaz de transdúcir el hígado cirrótico y expresar la proteína IGF-I, que se retuvo en el hígado. Se evaluaron los niveles de ARNm de IGF^IBP3 en extractos de hígado mediante qRT-PCR (Fig. 3D) . Los resultados muestran que IGF-I está aumentado en animales tratados con dsAAVIGF-I comparados con los controles. El IGF-I expresado es activo, ya que puede activar la expresión de IGF-IBP3. De esta manera, un año después de la inyección de dsAAVIGF-I todavía pueden detectarse niveles aumentados de IGF-I y IGF-IBP3. Sin embargo, los niveles de estos factores son más bajos que los observados en los primeros tiempos tras la administración del vector.

Ejemplo 3. La transferencia génica de IGF-I al higado cirrótico mejora la función hepática y produce una marcada reducción de la fibrosis hepática Las ratas cirróticas tratadas con dsAAVIGF-I mostraron una mejora significativa en las pruebas bioquímicas del hígado; AST, ALT, ALP y bilirrubina en suero eran significativamente menores que en ratas cirróticas control y similares a los controles sanos (Fig. 4A-B) . Adémás, la albúmina en suero estaba significativamente aumentada en ratas Ci+IGF-I, comparada con animales Ci y Ci+Luc, alcanzando niveles similares a los controles sanos (Fig. 4C) . Estas alteraciones son significativas desde 2 semanas después de la administración del vector. -1 - Estos descubrimientos estaban acompañados por una marcada mejora histológica con intensa reducción de fibrosis y resolución de cirrosis en ratas tratadas con dsAAVIGF-I (Fig. 5A) . La cuantificación de la fibrosis y la medida de la expresión del ARNm de colágeno I y IV mediante qRT-PCR corroboraron la reducción de fibrosis observada en animales tratados con dsAAVIGF-I comparados con controles cirróticos (Fig. 5B-D) . El descenso en fibrosis es significativo desde 2 semanas después de la administración del vector y después de 16 semanas de tratamiento la fibrosis revierte produciendo hígados sanos. Además, el análisis histopatológico del hígado 1 año tras la administración del vector no reveló cirrosis hepática. Esto indica que la cirrosis remite incluso en controles cirróticos un año tras la última dosis de hepatotoxina . La tinción con rojo Sirio de secciones de hígado reveló algunas lesiones fibróticas en controles cirróticos. La cuantificación de la tinción con rojo Sirio indicó que los controles cirróticos muestran más fibrosis que los animales sanos o los animales tratados con dsAAVIGF-I (Fig. 5B) . De manera no sorprendente, los niveles de ARNm de colágeno I y IV son similares en todos los grupos experimentales tras 1 año (Fig. 5C y D) .

Además (datos no mostrados) , se llevó a cabo una necropsia completa y un análisis histopatológico completo en algunos de los animales 1 año tras la administración del vector. Los resultados muestran que los animales tratados con dsAAVIGF-I no tienen diferencias significativas con ratas sanas o controles cirróticos.

- - Ejemplo 4. La expresión génica de IGF-I en el hígado cirrótico induce fibrolisis La resolución virtual de cirrosis observada en animales a los que se habla dado IGF-I requerirla la activación de enzimas capaces de eliminar colágeno, tal como las M P. Usando un ensayo funcional para medir la actividad MMP, se observó que en extractos de hígado de los grupos Ci y Ci+Luc, la actividad MMP estaba reducida comparada con los controles sanos (Fig. 6A) . Por el contrario, la actividad MMP en animales tratados con IGF-I era significativamente mayor que en animales sanos (Fig. 6A) . La actividad MMP se correlacionó con una aumento significativo en la expresión de los ARNm de MMP1, 2, 9 y 14 y proteína MMP2 y MMP9 en los hígados que recibieron dsAAVIGF-I (Fig. 6B a G) . La activación de la expresión y actividad de MMP en animales tratados con dsAAVIGF-I se detecta a partir de 2 semanas tras la administración del vector. Al final del estudio, MMP1, MMP2, MMP9 y MMP14 mostraron niveles similares en todos los grupos (Fig. 6B a G) . Por el contrario, los animales tratados con IGF-I mostraron los niveles más altos de MMP 2 semanas tras la administración del vector. Entonces, los niveles disminuyen hasta alcanzar niveles similares a los controles sanos y cirróticos al final del estudio.

El inhibidor de MMP, TIMP-2 también muestra niveles similares en todos los grupos al final del estudio (Fig. 6E) . Los niveles de TIMP-2 eran constantes en animales sanos y disminuyeron con el tiempo en todos los grupos cirróticos. Los animales tratados con IGF-I mostraron una disminución más rápida que los controles cirróticos, pero mostraron niveles similares a los controles cirróticos al final del estudio.

Ejemplo 5. La expresión génica de IGF-I en hígado cirrótico reduce la expresión de factores profibrogénicos La fibrosis reducida también podría ser resultado de una disminución de las HSC activadas. Según esto, el análisis inmunohistoquímico de muestras de hígado mostró que la expresión de aSMA, un marcador de la activación de HSC, estaba casi ausente en los animales tratados con IGF-I, mientras que era conspicua en los septos que rodeaban los nodulos en animales cirróticos control (Ci y Ci+Luc) (Fig. 7A) . En línea con esta observación se encontró un descenso significativo de los niveles de ARNm de OÍSMA en hígados tratados con IGF-I (Fig. 7B) , indicando que la terapia de IGF-I era capaz de disminuir las HSC activadas. De forma sorprendente el descenso en las HSC activadas se detecta 4 días después de la administración del vector.

Un año después de la administración del vector todavía puede detectarse un pequeño aumento en los niveles de ARNm de aSMA en controles cirróticos comparados con animales sanos y tratados con IGF-I.

A este tiempo tras la administración del vector también se observó expresión reducida de GF de ratas Ci+IGF-I (Fig. 7 C-E) . Puesto que TGF es un potente activador de las HSC y el acelerador más potente de la fibrosis hepática, su regulación por descenso por la terapia génica de IGF-I podría ser un factor clave subyacente al efecto antifibrogénico del tratamiento. El descenso en el ARNm y proteína de, TGF se puede detectar en el hígado (Fig. 7C y D) pero también en - - suero (Fig. 7E) . Además de TGF3, otras moléculas que fomentan el crecimiento de HSC y contribuyen a la fibrosis ihepática tal como el factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y anfirregulina (AR) estaban reguladas por ascenso en hígados cirróticos control pero marcadamente suprimidas en .aquellos tratados con dsAAVIGF-I comparadas con ratas cirróticas control (Fig. 7 F a I) . Otros marcadores de daño e inflamación tal como IL6 y TNFa también disminuyen en dsAAVIGF-I comparado con ratas cirróticas control (Fig. 7J y K) . Muchos de estos marcadores están significativamente disminuidos a los 4 días tras la administración del vector. Los niveles de estos factores fueron similares en animales sanos a todos los tiempos evaluados. En los animales cirróticos, los niveles disminuyeron con el tiempo. Los animales tratados con IGF-I mostraron una disminución más rápida que los controles cirróticos, pero tuvieron niveles similares a los controles cirróticos al final del estudio.

Ejemplo 6. La expresión génica de IGF-I en el hígado cirrótico aumenta la expresión de factores antifxbrogénicos y hepatoprotectores y no estimula proliferación Junto con estos cambios se encontró un aumento significativo en la expresión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en el hígado de ratas Ci+IGF-I comparado con animales control (Fig. 8A) . Puesto que HGF muestra actividades antifibrogénicas potentes, la regulación por aumento de esta molécula puede contribuir a la resolución de la cirrosis hepática observada en ratas tratadas con IGF-I.

- - HGF también se comporta como un factor hepatoprotector y, junto con HNF4a, como un marcador para diferenciación de hepatocitos. HNF4a también se regula por aumento en animales tratados con dsAAVIGF-I 4 dias tras la administración del vector (Fig. 8B) . Por el contrario, WT-1, un marcador de desdiferenciación de hepatocitos, disminuye en animales tratados (Fig. 8C) . Por último, a pesar de que IGF-I es un factor de crecimiento, la proliferación celular medida mediante expresión de PCNA y cuantificación de la tinción de Ki67, también disminuye en animales tratados con dsAAVIGF-I (Fig. 9? y B) . Al final del estudio, los niveles de HNF4a, WT-1 y PCNA fueron similares en todos los grupos experimentales. Sin embargo, el aumento de HGF en presencia de IGF-I todavía se detecta un año después , de la administración del vector IGF-I.

Ejemplo 7. Comparación entre dsAAVIGF-I y SVIGF-I El efecto del SVIGF-I en cirrosis hepática se ha estudiado independientemente (Vera et al., supra) o en paralelo con dsAAVIGF-I. Se llevaron a cabo dos estudios independientes con SVIGF-I como la única fuente de IGF-I, que mostraron resultados reproducibles . Estos resultados son muy similares a los obtenidos cuando se analizó SVIGF-I en paralelo con dsAAVIGF-I. En este último caso, SVIGF-I se analizó sólo 4 días y 8 semanas después de la administración del vector. En general, tanto dsAAVIGF-I como SVIGF-I pueden revertir la cirrosis hepática. Usando cualquiera de los vectores, la funcionalidad del hígado se restablece produciendo niveles similares de transaminasas , bilirrubina y albúmina (datos no mostrados) . Las transaminasas y - - bilirrubina son ligeramente más altas con SVIGF-I que con dsAAVIGF-I pero las diferencias no son significativas (datos no mostrados) . Sin embargo, la fibrosis hepática es significativamente más alta en animales tratados con SVIGF-I que en ratas tratadas con dsAAVIGF-I 8 semanas después de la administración del vector (Fig. 10) . Además, la fibrosis desparece 16 semanas después de la administración del vector dsAAVIGF-I. Esta reducción no se ha observado nunca en animales tratados con SVIGF-I incluso cuando los animales se analizaron 25 semanas después de la administración del vector (Fig. 10B) . Se observan diferencias similares al medir ARNm de colágeno I y IV (Fig. Sup. 10C y 10D) .

La eficacia aumentada de dsAAVIGF-I comparada con SVIGF-I es todavía un misterio. Los niveles de expresión de IGF-I aumentan tanto en animales tratados con SVIGF-I como con dsAAVIGF-I (Fig. 11) y el IGF-I expresado a partir de, SV40 es activo, puesto que puede activar la expresión de IGF-IBP3 (datos no mostrados) . Sin embargo, la administración de dsAAVIGF-I tiende a expresar niveles más altos de IGF-I que la inyección de SVIGF-I a diferentes puntos temporales tras la administración del vector (Fig. 11) . Estas diferencias en la expresión de IGF-I no producen diferencias en la actividad MMP en animales tratados con dsAAVIGF-I y SVIGF-I 4 días u 8 semanas tras la administración del vector (datos no mostrados) . La cantidad de MMP2 y MMP9 medido por ELISA o los niveles de ARNm de MMP1, MP2, MMP9 y MMP14 medidos mediante qRT-PCR son similares en extractos de hígado aislados de animales tratados con dsAAVIGF-I o SVIGF-I (datos no mostrados) . Sin embargo, el tratamiento de dsAAVIGF-I muestra niveles de proteína y ARNm de aSMA disminuidos 4 días después - - de la administración del vector, mientras que SVIGF-I muestra niveles similares a los controles cirróticos (Fig. 12). El descenso en las HSC activadas observado en animales dsAAVIGF-I se correlaciona con un descenso mayor de factores profibrogénicos en estos animales comparados con ratas administradas con SVIGF-I. De esta manera, TGF , CTGF y VEGF disminuyeron en animales tratados con dsAAVIGF-I comprados con ratas tratadas con SVIGF-I y controles cirróticos 4 días después de la administración del vector (Fig. 13) .' También aumentaron factores hepatoprotectores como HGF y HNF4a 4 dias después de la administración de dsAAVIGF-I comparado con controles o administración de SVIGF-I (Fig. 14). No se observaron diferencias significativas en proliferación entre animales tratados con dsAAVIGF-I y con SVIGF-I detectada mediante cuantificación de tinción de i67 (datos no mostrados) .

Ejemplo 8. Evaluación toxicologica de animales tratados con dsAAVIGF-I tras un año de tratamiento.

Se realizó la evaluación comparando animales cirróticos tratados con dsAAVIGF-I o dsAAVLuc, o solución salina, con animales sanos.

Se realizó una necropsia en animales sacrificados 1 año tras la inyección del virus. Se extrajo sangre para evaluar varios parámetros. Se evaluaron el riñon, el pulmón, el intestino delgado, el hígado, el cerebro, el cerebelo, el músculo esquelético, los testículos, el bazo, el estómago, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo y el corazón mediante análisis histopatológico .

- - El peso relativo del bazo, el corazón, los testículos, el riñon y el hígado no mostraron diferencias significativas entre los grupos experimentales estudiados.

Se recogió la orina de todos los animales en jaulas metabólicas 24 horas antes del sacrificio. Se evaluaron varios parámetros, tales como densidad, pH, color y turbidez, y moléculas incluyendo cuerpos cetónicos, glucosa, bilirrubina, proteínas y urobilinógeno . Se cuantificó también la presencia en orina de eritrocitos y leucocitos. Los resultados muestran diferencias no significativas en todos estos parámetros entre todos los grupos experimentales, incluso en algunas cuantificaciones los valores obtenidos muestran alta variabilidad.

Se usó el suero para cuantificar los glóbulos rojos, las plaquetas, los glóbulos blancos, los neutrófilos, los linfocitos, los monocitos, los eosinófilos y los basófilos. Los monocitos, eosinófilos y basófilos mostraron valores similares entre todos los grupos experimentales. Lo mismo era cierto para los glóbulos rojos, las plaquetas, los glóbulos blancos y los linfocitos, incluso si en estos casos había alta variabilidad para algunos de los grupos. La cantidad de neutrófilos era similar en animales sanos y cirróticos tratados con dsAAVLuc, pero inferior que en animales tratados con dsAAVIGF-I.

Se analizaron varias características de células hematopoyéticas . Éstas incluyen la hemoglobina (HGB) , el hematocrito (HCT) , el volumen corpuscular medio, que se calcula dividiendo el número total de glóbulos rojos - - concentrados entre el número total de glóbulos rojos (MCV) , la hemoglobina corpuscular media (MCH) , que es un cálculo de la cantidad promedio de hemoglobina que transporta , oxigeno dentro de un glóbulo rojo y la concentración de hemoglobina celular media (MCHC) . Estos parámetros dieron como resultado valores de variabilidad baja, con diferencias no significativas entre todos los grupos experimentales.

No se observaron diferencias significativas entre todos los grupos experimentales para las transaminasas, la bilirrubina y la albúmina tras 1 año de la administración del vector. Además, se analizaron varios parámetros en suero tras 1 año de la administración del vector (datos no mostrados) . La mayoría de estos parámetros, tales como creatina fosfocinasa, triglicéridos, sodio, cloro, creatinina, potasio, calcio, magnesio y tiempo de protrombina mostraron valores de baja variabilidad, muy similares entre todos los grupos experimentales y su análisis estadístico mostró diferencias no significativas. Tampoco se observaron diferencias significativas entre todos los grupos experimentales para transaminasas y LDH, pero en estos casos la variabilidad era alta. Se observaron resultados similares con diferencias no significativas para proteínas totales, glucosa, fósforo y TCA, pero estos parámetros estaban ligeramente aumentados (proteínas totales y TCA) o disminuidos (glucosa y fósforo) en animales tratados con dsAAVIGF-I .

Tal como se indicó anteriormente, el análisis histopatológico del hígado no reveló cirrosis hepática. Esto indica que la cirrosis remite incluso en controles cirróticos - un año tras la última dosis de hepatotoxina . La tinción con rojo Sirio de secciones de hígado revelaron algunas lesiones fibróticas en controles cirróticos. La cuantificación de la tinción con rojo Sirio indicó que los controles cirróticos mostraban más fibrosis que los animales sanos o los animales tratados con dsAAVIGF-I. Sin embargo, el porcentaje de fibrosis en controles fibróticos era del 15% en puntos de tiempo anteriores y ha disminuido hasta aproximadamente un 5% un año tras la última dosis de hepatotoxina y tratamiento. De manera no sorprendente, los niveles de ARNm de colágeno I y IV son similares en todos los grupos experimentales.

Se evaluaron el riñon, el pulmón, el intestino delgado, el hígado, el cerebro, el cerebelo, el músculo esquelético, los testículos, el bazo, el estómago, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo y el corazón mediante análisis histopatológico . Los testículos, el timo, el cerebro y el cerebelo, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el estómago no mostraron cambios histopatológicos significativos. Algunos controles cirróticos mostraron alteraciones en el corazón, el músculo y el bazo que no se observaron en animales sanos o tratados con dsAAVIGF-I. Todas las alteraciones observadas en animales tratados con dsAAVIGF-I se observaron también en los animales control. Las únicas excepciones se observaron en el riñon, pulmón, hígado e intestino delgado. La mitad o menos de la mitad de los animales mostraron hemorragia en los bronquios pulmonares, inflamación parenquimatosa leve y pequeñas zonas de necrosis en el hígado o agotamiento linfoide en los parches de Peyer del intestino delgado. Se observaron más alteraciones en los - - riñones de animales tratados con dsAAVIGF-I. La mitad o menos de la mitad de los animales mostraron un aumento del tamaño de los glomérulos, contenido acidófilo ocasional en la cápsula de Bowman, nefritis o proliferación circundante a los glomérulos en regeneración. Todos los animales mostraron cierta necrosis tubular que podría explicarse probablemente por el aumento de los niveles de GGT en el suero. Es difícil correlacionar la expresión de IGF-I hepático exógeno con las alteraciones observadas. Deben evaluarse más animales para abordar si este resultado tiene relevancia y significado estadístico .

En conclusión, los animales cirróticos que expresan IGF-I hepático exógeno durante 1 año son similares a los controles sanos y cirróticos. La mayoría de los parámetros en suero y orina analizados y los estudios histopatológicos no muestran diferencias significativas reproducibles entre controles y animales tratados con AAVIGF-I. Sin embargo, algunos parámetros tales como los niveles séricos de GGT y los cambios histopatológicos en el riñon deben volverse a evaluar con grupos más grandes en los estudios toxicólógicos que preceden a los ensayos clínicos.

De manera interesante, la expresión de IGF-I puede detectarse todavía tras un año de administración de dsAAVIGF-I. La expresión de IGF-I se correlaciona con el aumento de los niveles de IGFIBP3 y HGF, tal como se observa en animales sanos. Sin embargo, en este punto de tiempo no se detectan cambios en metaloproteinasas, factores inflamatorios y profibrogénicos . - 11 - Evaluación de los efectos de un vector AAV monocatenario que codifica para I6F-I (ssAAVIGF-I) en la cirrosis hepática Material Y Métodos Construcción y producción del vector AAV monocatenario .

Se usó el genoma de AAV2 y se sometió el virus a pseudotipado con AAVl . Los vectores ssAAV son idénticos en estructura génica a los vectores dsAAV (descritos anteriormente) con la excepción del cásete de luciferasa, que tiene un promotor alAT idéntico al del vector IGF-I. Además, las regiones 5' y 3' ITR que flanquean el cásete de expresión son de AAV2 salvaje.

Construcción del plásmido pVD204 Para la generación de pVD204, se clonó mediante PCR la secuencia génica del IGF1 usando el kit de pfx ADN polimerasa Accuprime™ (Stratagene; ref: 12344-024). Los cebadores usados para la amplificación de la secuencia génica fueron el cebador directo 373 (5' -GGTA CCAT GTC G TC T TCACATCTC - 3') (SEQ ID NO: 56) y el cebador inverso 374 (5' - GCGGCCGCGAATGTTTACTT - 3') (SEQ ID NO: 57) . El cebador 373 contiene un sitio Kpnl en el lado 5' y el cebador 374 contiene un sitio Noti en el lado 5' . Para la amplificación se usó el plásmido de molde monocatenario AAV-IGF1 (obtenido externamente) . Se visualizó el producto de la PCR en gel de agarosa al 1% y luego se usó directamente para ligar el producto de la PCR en el vector pCR® II-Blunt-TOPO® del kit de clonación por PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen) . Tras la reacción de ligamiento, se transformó entonces - - químicamente el vector TOPO recombinante en células Stabl III y se hizo crecer durante la noche en placas de agar LB con kanamicina. Al día siguiente se recogieron 6 colonias individuales y se usaron directamente para una PCR de colonias para examinar las cepas que portaban el vector T0PO-IGF recombinante. Para esta PCR se usó el kit de PCR Multiplex (QIAGEN) y los cebadores 373 y 374 para verificar la presencia del producto de la PCR dentro del vector TOPO. Luego se seleccionó 1 colonia positiva y se hizo crecer durante la noche en 250 mi de medio LB que contenia kanamicina. Tras realizar una maxiprep, se cortaron 20 pg del plásmido TOPO-IGF aislado con 100 unidades de Notl y se cortaron 20 g de pVD158 con 100 unidades de Nhel . tras una inactivación por calor de 20 min. a 80°C, se obtuvieron extremos romos de ambos constructos linealizados añadiendo 4 µ? de fragmento grande de Klenow (Westburg) que se añadió a ambas reacciones y se incubaron durante 15 min. a 25°C. Tras añadir 20 µ? de EDTA (100 µ?) y 20 min. de inactivación por calor a 75°C, se realizó el aislamiento del ADN de ambas reacciones usando un kit de PCR-purificación Qiaquick que dio 11,4 µg de TOPO-IGF lineal y 7,2 µg de pVD157 lineal. Entonces se llevó a cabo la segunda reacción de digestión cortando tanto 11,4 µg de TOPO-IGF como 7,2 µg de pVD157 con 100 U de Kpnl. La separación de los fragmentos se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa (1,0%) y se aislaron el fragmento de inserto de 600 pb del vector TOPO-IGF y el fragmento de 10900 pb del vector pVD157 del gel usando un kit de extracción de gel QiaQuick. El ligamiento del vector y el ADN del inserto se llevó a cabo usando ligamiento rápido (NEB) basado en una razón molar de - 1 0- vector/inserto de 3:1. Tras un tiempo de incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, se realizó la transformación en células SURE II químicamente competentes (Stratagene) , tal como se describe en el manual del fabricante. Se seleccionaron 2 colonias positivas y se examinaron mediante PCR de colonias. Entonces el clon positivo se amplificó y se realizó una maxiprep y se almacenó a -20°C.

Generación de reservas de baculovirus . Se producen reservas de baculovirus usando un sistema de expresión en baculovirus: El plásmido pVD204 de transporte dirigido se cotransfecta en ADN genómico linealizado de baculovirus usando Cellfectine en células de insecto SF9 de S. frugiperda , donde la secuencia de interés se transferirá al genoma de baculovirus mediante recombinación homologa. Los baculovirus recombinantes producidos se identificaron y se purificaron usando un procedimiento de ensayo en placa convencional. Se recogió una placa de virus bien aislada y se usó para crear reservas virales infectando cultivos cada vez más grandes de células de insecto, alcanzando P2 o superior, que se almacenaron a -170°C. Estas reservas se examinaron para determinar la estabilidad del ADN insertado y la presencia de impurezas de baculovirus de tipo natural. Para la producción de AAVr, se usaron tres reservas diferentes de baculovirus: 1) Baculovirus que albergaban un cásete de expresión de AAV2-Rep78/52 ; Bac.Rep 2) baculovirus que albergaban un cásete de expresión de serotipo 1 de AAV-Cap; Bac.Cap y 3) baculovirus que presentaban el genoma de vector flanqueado por las ITR AAV2 (Bac.VD204) que iba a - - empaquetarse en la partícula de AAV.

Amplificaciones de baculovir s para la producción de 1 1 de AAVr. Se descongeló una reserva de baculovirus congelados a 37°C y luego se añadió a 1,7 x 106 de cultivo de células Sf9 (3 µ? por mi de cultivo celular) . Tras 72 ± 5 horas, se recogió la suspensión infectada centrifugando 15 min. a 1900 g. El sobrenadante se aisló y se almacenó a 4°C en la oscuridad hasta su uso. Para una producción de AAVr de 1,0 1, se prepararon tres amplificaciones de baculovirus y se administró una cantidad igual de Bac.Rep P5; Bac.Cáp P5 y Bac.VD204 P3 a las células en producción.

Producción de AAVr. Se pusieron en marcha dos agitadores que contenían cada uno 400 mi de cultivo de Sf9 a 1,0 x 105 células 20 horas antes de la infección. En el día de la infección, se monitoriza la densidad celular que es de 2,0 x 106 células/ml y la viabilidad que es superior al 98%. Los baculovirus recogidos (Bac.Rep, Bac.Cap (proteínas virales de AAV1) y Bac.VD204 (cásete de expresión AAV-IGF1)) se añadieron al cultivo del agitador. Tras 72 ± 5 horas, se recogió el AAVr añadiendo 45 mi de (10X) tampón de Tris-lisis en cada matraz de agitación. Tras 1 hora de incubación a 28°C, se añadieron 4000 unidades de benzonasa a cada agitador y se incubaron 1 hora a 37°C en una incubadora con agitación a 128 rpm.

- - Puriflcaczón de AAVr: La masa lisada en bruto se centrifugó a 3000 g y el sobrenadante se filtró hasta 0,45 µ?t? usando un filtro Millipak 60 (Millipore) . Se llevó : a cabo cromatografía de afinidad usando un sistema de cromatografía AKTA-Explorer equipado con una columna XK-16 empaquetada con un volumen de lecho de 5 mi de medio de afinidad AVB Sepharose High performance (todo de GE healthcare, Piscataway, NJ) . Tras el procesamiento, se recogió la fracción de elución (~ 50 mi) en un recipiente que contenía 25 mi [0,1] de Tris-HCl (pH 7,5). Posteriormente, se realizó el intercambio de tampón usando un módulo de diafiltración de flujo cruzado. El eluato se sometió a diafiltración y se filtró hasta 0,22 µ?. El producto se almacenó congelado a -80°C.

Modelo de cirrosis hepática establecida. Se indujo cirrosis en ratas Sprague-Da ley macho con administraciones intragástricas semanales de CC14 durante 8 semanas tal como se describió para el estudio dsAAVIGF-I anteriormente.

Administración de vectores virales. Los animales sanos estaban sin tratar (sanos), o se usaron para inducir cirrosis hepática. Se incluyeron como controles un grupo de ratas sanas tratadas con solución salina (sanas), y también un grupo de ratas no tratadas cirróticas (Ci). Una semana tras el final de la inducción de la cirrosis, se trataron los animales cirróticos con - - - solución salina (Ci); un vector viral adenoasociado monocatenario recombinante (ssAAV) que codifica para luciferasa (ssAAV- Luc) , a una dosis de 9,7 x 109 pv/rata (dosis muy baja), 4,8 x 1010 pv/rata (dosis baja), 2,4 x 1011 pv/rata (dosis media) o alternativamente 1,2 x 1012 pv/rata (dosis alta); un ssAAV recombinante que codifica para IGF-I ( ssAAVIGF-I ) , también a dosis de 9,7 x 109 (dosis muy baja), 4,8 x 1010 (dosis baja), 2,4 x 1011 (dosis media) o alternativamente 1,2 x 1012 pv/rata (dosis alta); - un vector viral adenoasociado bicatenario (dsAAV) que codifica para luciferasa (dsAAVLuc) , a una dosis de 3,4 x 109 pv/rata; o - un dsAAV que codifica para IGF-I (dsAAVIGF-I ) , a una dosis de 3,4 x 109 pv/rata.

Se eligió la vía de administración intraarterial para el tratamiento. Experimentos previos con dsAAVLuc mostraron buenos niveles de expresión cuando se realizó la inyección intraarterial. Probablemente, la administración mediante cateterismo de la arteria hepática es también el procedimiento más adecuado que ha de usarse en los pacientes.

Se extrajeron muestras de sangre para el análisis bioquímico de factores y proteínas séricos a los 4 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, y 8 semanas, 12 semanas y 1 año tras la infección (tratamiento) .

Se evaluaron algunos animales (n = 4) tratados con - - dsAAVIGF-I o la dosis media de ssAAVLuc durante 2 meses y entonces se sacrificaron para aislar diferentes poblaciones de células de hígado en las que se midió la expresión de luciferasa .

En diferentes momentos tras la infección, se seleccionaron algunos animales, se sacrificaron y se recogieron muestras hepáticas para su evaluación: - 4 días (sanos n = 4, solución salina n = 4, dsÁAVLuc n = 4, dsAAVIGF-I n = 5, ssAAVLuc, dosis alta n = 4, dosis media n = 4, dosis baja n = 4 y dosis muy baja n = 4 y ssAAVIGF-I, dosis alta n = 6, dosis media n = 5, dosis baja n = 4 y dosis muy baja n = 5) ; 8 semanas (sanos n = 5, solución salina n = 4, dsAAVLuc n = 3, dsAAVIGF-I n = 6, ssAAVLuc, dosis alta n = 5, dosis media = 4, dosis baja n = 6 y dosis muy baja n = 6 y ssAAVIGF-I, dosis alta n = 6, dosis media n = 4, dosis baja n = 6 y dosis muy baja n = 6) ; - 16 semanas (sanos n = 6, solución salina n = 6, dosis baja de ssAAVLuc n = 6, dosis baja de ssAAVIGF-I n = 6) ; y - 1 año (sanos n = 4, solución salina n = 4, dosis alta de ssAAVLuc n = 4, dosis alta de ssAAVIGF-I n = 6) tras la administración del vector.

Todos los métodos analíticos y de procedimiento se realizaron tal como se explicó para la evaluación de los efectos de dsAAVIGF-I.

- - Ejemplo 9. La transferencia génica de I6F-I al hígado cirrótico .

Se evaluó el ARNm de IGF-I en extractos de hígado mediante qRT-PCR 4 días, 8 semanas tras la inoculación del vector (Fig. 15A) . Para el tratamiento con la dosis inferior de ssAAVLuc y ssAVVIGF-I, se evaluó adicionalmente el ARNm de IGF-I 16 semanas tras la administración del vector (Fig. 15 C) . Se evaluó la proteína IGF-1 hepática total mediante ELISA 4 días y 8 semanas tras la administración del vector (Fig. 15 B) .

Los resultados mostraron que se redujo el ARNm de IGF-I en animales cirróticos en comparación con controles sanos. Los niveles de IGF-I estaban aumentados en animales tratados con IGF-I (ssAAVIGF-I o dsAAVIGF-I) en comparación con controles sanos y cirróticos. Los niveles aumentados de IGF-I eran ya visibles a los 4 días tras la administración de los vectores de expresión de IGF-I. Entonces, los niveles de proteína IGF-I aumentaron a las 8 semanas tras la administración de AAVIGF-I y permanecieron constantes hasta el final del estudio. Además, se observaron niveles superiores de IGF-I cuando se usaron dosis superiores de ssAAVIGF-I .

Se evaluó IGF-I en suero 4 días, 2 semanas y 8 semanas tras la administración del vector. Los resultados muestran que 4 días tras el tratamiento los niveles totales de IGF-I son más bajos en todos los grupos cirróticos que én los animales sanos (Fig. 15D) . Sin embargo, la proteína IGF-I libre aumenta en el suero de animales a los que se les - - inyectó la dosis media y alta de ssAAVIGF-I. A lasi 2 y 8 semanas tras la administración del vector, el IGF-I tanto total como libre (datos no mostrados) son similares en todos los grupos. Seria posible que el IGF-I libre sérico aumentado en los animales tratados con las dosis más altas de ssAAVIGF-I se convierta en IGF-I total en puntos de tiempo posteriores induciendo un aumento de la expresión de proteínas de 'unión a IGF-I.

Además, el IGF-I expresado a partir de los vectores es activo, ya que puede activar la expresión de IGF^IBP3 e IGF-IR, que aumentan en animales que expresan IGF-I a los que se les inyectaron los vectores durante 4 días, 8 semanas y 16 semanas (Fig. 15 F-H) .

Ejemplo 10. La transferencia génica de IGF-I al hígado cirrotico mejora la función del hígado y provoca una marcada reducción de la fibrosis hepática.

Las transaminasas a los 4 días tras la inoculación del vector eran similares en todos los grupos cirróticos y más altas que en animales sanos (Fig. 16A) . Sin embargo, los animales tratados con vectores ssAAVIGF-I o dsAAVIGF-I mostraron niveles de transaminasas más bajos que los controles cirróticos a las 2 semanas tras la administración del vector. En estos últimos puntos de tiempo, los niveles de transaminasas disminuyeron adicionalmente en animales tratados con IGF-I y 8 semanas tras la administración del vector los niveles de transaminasas en animales tratados con vectores ssAAVIGF-I o dsAAVIGF-I eran similares a los - - animales sanos (Fig. 16B) . Se observó lo mismo en animales tratados con la dosis baja de ssAAVIGF-I 12 semanas tras la administración del vector (Fig. 16C) . De manera interesante, se observaron efectos similares en animales tratados con dsAAVIGF-I y aquéllos tratados con ssAAVIGF-I a la dosis baja. Sin embargo, el efecto era menor en animales tratados con la dosis más alta de ss-AAVl-IGF-I (Fig. 16D) .

La bilirrubina era similar en todos los animales cirróticos y más alta que en controles sanos en el día 4 tras la inoculación del vector (Fig. 17A) . Sin embargo, los animales tratados con ambos, dsAAVIGF-I o ssAAVIGF-I, mostraron niveles de bilirrubina más bajos que los controles cirróticos 2 semanas tras la administración del vector. En estos últimos puntos de tiempo, los niveles de bilirrubina disminuyen adicionalmente en animales tratados con AAVIGF-I (tanto monocatenario como bicatenario) , y 8 semanas tras la administración del vector, los niveles de bilirrubina en animales tratados con AAVIGF-I eran similares a los animales sanos (Fig. 17B) . Se observó lo mismo en animales tratados con la dosis baja de ssAAVIGF-I 12 semanas tras la administración del vector (Fig. 17C) . Se encontraron resultados similares 1 año tras la administración en animales tratados con la dosis alta de ssAAVIGF-I y su análisis estadístico mostró diferencias no significativas. De manera interesante, se observaron efectos similares en animales tratados con dsAAVIIGF-I o dosis bajas de ssAAVlIGF-I. Sin embargo, el efecto era inferior en animales tratados con la dosis alta de ssAAVIGF-I (Fig. 17D) .

La albúmina era similar en todos los animales cirróticos - - y más baja que en controles sanos en el día 4 y 2 semanas tras la inoculación del vector (Fig. 18 A, B) . Sin embargo, los animales tratados con AAVIGF-I (monocatenario o bicatenario) mostraron un aumento de los niveles de albúmina en comparación con los controles cirróticos 8 semanas tras la administración del vector (Fig. 18B) . Se observó lo mismo en animales tratados con la dosis baja de ssAAVIGF-I 121 semanas tras la administración del vector (Fig. 18C) . Se encontraron resultados similares 1 año tras la administración en animales tratados con ssAAVIGF-I a la dosis alta y su análisis estadístico mostró diferencias no significativas (Fig., 18D) .

Se tiñeron muestras de hígado con rojo Sirio y se cuantificó la fibrosis hepática (Fig. 19A) . Los resultados mostraron que los hígados cirróticos son fibróticos y que la fibrosis disminuye en animales tratados con AAVIGF-I (monocatenario o bicatenario) . De manera sorprendente, la dosis alta de AAVIGF-I es menos eficaz que el resto. Se observaron resultados similares cuando se cuantificaron los niveles de expresión de ARNm de colágeno I y IV mediante qRT-PCR (Fig. 19 B, C) . Tras 16 semanas de tratamiento con ssAAVIGF-I a la dosis baja, la fibrosis y los niveles de expresión de ARNm de colágeno eran idénticos a los de animales sanos, lo que indica una remisión total de la cirrosis hepática (Fig. 19 D-F) . No se detectó ARNm de colágeno II y los niveles de ARNm de colágeno III no mostraron diferencias entre los grupos (datos no mostrados) . Se esperaba esto ya que no se acumulan en la fibrosis hepática.

- - Ejemplo 11. La expresión génica de IGF-I dentro del hígado cirrótico induce fibrolisis .

La reducción de la fibrosis con el vector AAVIGF-I podría resultar de la degradación de la deposición de la matriz preexistente. Las MMP pueden degradar el colágeno extracelular y por tanto se evaluó la expresión de MMP en los hígados de todos los grupos experimentales.

Se determinaron los niveles de expresión de ARNm de MMP1, MMP2, MMP9 y MMP14 (Fig. 20 A-D e I-M) y los niveles de proteína MMP2 y MMP9 (Fig. 20 F, G) mediante qRT-PCR y ELISA, respectivamente, 8 semanas y 16 semanas tras la inoculación del vector.

Los resultados mostraron que la expresión de todas estas MMP disminuye en animales cirróticos en comparación con controles sanos. Sin embargo, los niveles de estos factores aumentan drásticamente en comparación con animales tanto cirróticos como sanos en ratas tratadas con un vector AAVIGF-I (monocatenario o bicatenario) . Este aumento no se detectó a los 4 días tras el tratamiento sino a las 8 ó 16 semanas tras la administración del vector AAVIGF-I. Incluso si los niveles de MMP en animales tratados con AAVIGF-I disminuyen con el tiempo, son todavía más altos que los observados en animales sanos a las 16 semanas tras la administración del vector AAVIGF-I.

Se observó el patrón inverso para la expresión de TIMP-2 (Fig. 20 E y M) . Las proteínas TIMP son inhibidores de la actividad MMP. Por tanto, es esencial que los niveles de TIMP se reduzcan para una actividad MMP alta. La expresión de ARNm -1 - de TIMP-2 aumentó en animales cirróticos en comparación con controles sanos. Se redujeron los niveles de TIMP-2 en comparación con controles cirróticos en ratas tratadas con vectores AAVIGF-I. Esta disminución se detectó á las 8 semanas tras la administración del vector AAVIGF-I y los niveles de TI P-2 disminuyeron adicionalmente con el tiempo, pero tras 16 semanas de tratamiento, estaban todavía por encima de los niveles observados en animales sanos. El equilibrio de aumento de MMP y disminución de TIMP se correlaciona con el aumento de actividad MMP. Dé manera sorprendente, la dosis más alta de AAVIGF-I induce menos actividad y expresión de MMP que el resto.

Ejemplo 12. La expresión génica de IGF-I dentro del hígado cirrótico reduce la expresión de factores profibrogénicos .

La reducción de la fibrosis también podría resultar de una disminución de las células profibrogénicas . Las células estrelladas hepáticas (HSC) activadas, marcadas mediante la actina de músculo liso (OÍSMA) , son los principales productores de colágeno extracelular. Por tanto, se evaluó la cantidad de HSC activadas mediante inmunohistoquímica con anticuerpo contra SMA (Fig. 21 A) o mediante cuantificación de ARNm de aSMA (Fig. 21 B, C) .

Los resultados mostraron altos niveles de células que expresan aSMA en animales cirróticos. 8 semanas tras la administración del vector AAVIGF-I (mono o bicatenario) , hubo una marcada disminución del nivel de expresión de ARNm de - - OÍSMA y células que expresan OÍSMA. 8 semanas más tarde, la expresión de ARNm de OÍSMA disminuyó en animales cirróticos, pero era superior que en controles sanos. Sin embargo, los niveles de ARNm de SMA en animales tratados con ssAAVIGF-I eran similares a los niveles observados en animales sanos. La reducción de aSMA en animales tratados con la dosis alta de ssAAVIGF-I era menos drástica.

La activación, proliferación, migración y síntesis de colágeno a partir de HSC están mediadas por factores profibrogénicos tales como ?Gß, VEGF, PDGF, anfirregulina (AR) o CTGF. Esta respuesta se ve favorecida en un entorno inflamatorio marcado mediante la expresión de IL-6 y TNFa. Por tanto, se evaluó la expresión en el hígado de estos factores 8 semanas y 16 semanas tras la inoculación del vector (Fig. 22) . Estos factores aumentaron mucho en todos los controles cirróticos en comparación con los animales sanos y tendían a disminuir con el tiempo. Sin embargo, todos estos factores disminuyeron drásticamente en animales cirróticos tratados con AAVIGF-I, alcanzando niveles que no eran significativamente diferentes de los observados en animales sanos. La única excepción fue la IL6, que era similar en todos los animales. La reducción de los factores profibrogénicos e inflamatorios era menos evidente cuando se usó la dosis alta de ssAAVIGF-I.

Ejemplo 13. La expresión génica de IGF-I dentro del hígado cirrótico aumenta la expresión de factores antifibrogénicos y hepatoprotectores y no estimula la - - proliferación .

La mejora de la función hepática con el tratamiento con AAVIGF-I podría resultar de la activación de factores hepatoprotectores tales como HGF o HNF4a. Por tanto, se midió en primer lugar la expresión de ARNm y proteína de HGF (Fig. 23) .

Los niveles de HGF se redujeron en controles cirróticos en comparación con ratas sanas. Sin embargo, los ;animales tratados con AAVIGF-I (mono o bicatenario) mostraron niveles de HGF similares a las ratas sanas 4 días tras la administración de este vector. Los niveles de HGF en estos animales eran superiores en estos últimos puntos de tiempo y aumentaron mucho en comparación con los niveles observados en controles sanos. El aumento de HGF fue menos evidente cuando se usó la dosis alta de ssAAVIGF-I.

Los resultados observados para HGF eran muy similares a los observados para el ARNm de HNF4OÍ (Fig. 24 A-C) . Esto es muy interesante puesto que HNF4a es un factor de maduración. De hecho, IGF-I es un factor de crecimiento y, por tanto, podría activar la proliferación de células con el receptor de IGF-I. Además, IGF-I activa HGF, que es también un factor de crecimiento. Aunque los hepatocitos no expresan el receptor de IGF-I en hígados sanos, se deseaba someter a ensayo la proliferación y diferenciación de células hepáticas tras el tratamiento con AAVIGF-I. Se usó como marcador de diferenciación del hígado WT-1, que se expresa en hígados fetales y no en tejido adulto. Los niveles de ARNm de WT-1 aumentaron drásticamente en animales cirróticos en - - comparación con ratas sanas (Fig. 24 D, E) . De manera interesante, las ratas tratadas con AAVIGF-I mostraron niveles de ARNm de WT-1 similares a los de animales sanos. Estos efectos fueron menos evidentes cuando se usó la dosis alta de ssAAVIGF-I.

Se sometió a ensayo la proliferación mediante la cuantificación de los niveles de expresión de ARNm de PCNA y mediante tinción con el marcador de proliferación Ki67 (Fig. 25) . Tras la tinción, se contaron las células positivas en todos los grupos experimentales y se representaron gráficamente los resultados en gráficas que miden la proliferación de células hepáticas. Los niveles de proliferación eran los más altos en controles cirróticos en comparación con los controles sanos o con animales tratados con AAVIGF-I. No se observaron diferencias en los niveles de Ki67 entre animales cirróticos y tratados con AAVIGF-I 4 días tras la administración del vector. Sin embargo, los ¡animales que expresan IGF-I mostraron niveles inferiores de Ki67 a las 8 semanas tras la administración del vector (Fig. 25A) , y niveles inferiores de ARNm de PCNA a los 4 días, 8 semanas o 16 semanas tras la administración del vector (Fig. 25 B-D) . Los niveles de estos factores de proliferación en animales tratados con IGF-I eran similares a los observados en controles sanos. La única excepción se observó en animales tratados con la dosis más alta de AAVIGF-I, que mostraron niveles de proliferación más altos que los animales sanos pero más bajos que los controles cirróticos.

- - Ejemplo 14. Evaluación toxicológica en animales tratados con ssAAVIGF-I (dosis alta) tras un año de tratamiento.

Se realizó la evaluación comparando animales cirróticos tratados con la dosis alta de ssAAVIGF-I o ssAAVLuc, o solución salina, con animales sanos.

Se realizó una necropsia en animales sacrificadós 1 año tras la inyección del virus. Se extrajo sangre para! evaluar varios parámetros. Se evaluaron el riñon, el pulmón, el intestino delgado, el hígado, el cerebro, el cerebelo, el músculo esquelético, los testículos, el bazo, el estómago, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo y el corazón mediante análisis histopatológico.

El peso relativo del bazo, el corazón, los testículos, el riñon y el hígado no mostraron diferencias significativas entre los grupos experimentales estudiados.

Se usó el suero para cuantificar los glóbulos rojos, las plaquetas, los glóbulos blancos, los neutrófilós, los linfocitos, los monocitos, los eosinófilos y los basófilos. Todas las células mostraron valores similares entre todos los grupos experimentales.

Se analizaron varias características de células hematopoyéticas . Éstas incluyen la hemoglobina (HGB) , el hematocrito (HCT) , el volumen corpuscular medio, que se calcula dividiendo el número total de glóbulos rojos concentrados entre el número total de glóbulos rojos (MCV) , la hemoglobina corpuscular media (MCH) , que es un cálculo de la cantidad promedio de hemoglobina que transporta oxígeno - - dentro de un glóbulo rojo y la concentración de hemoglobina celular media (MCHC) . Estos parámetros dieron como resultado valores de variabilidad baja, con diferencias no significativas entre todos los grupos experimentales.

Se analizaron varios parámetros en el suero. Éstos incluyen las transaminasas (AST, ALT y ALP) (Fig. 16D) , la bilirrubina (Fig. 17D) , la albúmina (Fig. 18D) , la gamma glutamil transpeptidasa (GGT) , la creatinina, el potasio, el calcio, el fósforo, el magnesio, el sodio y el cloro. Estos parámetros mostraron valores similares entre todos los grupos experimentales y su análisis estadístico mostró diferencias no significativas. Las mediciones en algunos casos tales como bilirrubina, albúmina o GGT mostraron alta variabilidad.

Se evaluó la coagulación mediante la medición del tiempo de protrombina (TP) , el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y el fibrinógeno. Estas mediciones mostraron alta variabilidad, pero medias similares entre todos los grupos experimentales. El análisis estadístico mostró diferencias no significativas.

Se evaluó la fibrosis hepática mediante la cuantificación de la tinción con rojo Sirio de secciones de hígado (Fig. 19D) . El resultado, junto con el análisis histopatológico del hígado, no reveló cirrosis hepática en ninguno de los grupos experimentales. Esto indica que la cirrosis remite incluso en controles cirróticos un año tras la última dosis de hepatotoxina .

Se evaluaron el riñon, el pulmón, el intestino delgado, el hígado, el cerebro, el cerebelo, el músculo esquelético, - - los testículos, el bazo, el estómago, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo y el corazón mediante análisis histopatológico . El cerebro, el cerebelo, el músculo esquelético, los testículos, el estómago, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el timo no mostraron cambios histopatologicos significativos. Algunos controles cirroticos muestran alteraciones en el pulmón, el intestino delgado, el hígado y el bazo que no se observan en animales sanos o tratados con ssAAVIGF-I. De manera interesante éstos incluyen dos tumores en animales cirroticos control,, uno en el hígado y otro en el pulmón. Todas las alteraciones observadas en animales tratados con ssAAVIGF-I se observan también en los animales control. La única excepción es una enteritis leve observada en 2 de los 6 animales tratados con ssAAVIGF-I .

En conclusión, los animales cirroticos que expresaban IGF-I hepático exógeno mediante el tratamiento con ssAAVIGF-I) son similares a los controles sanos y cirroticos 1 año tras el tratamiento. Todos los parámetros séricos analizados y los estudios histopatologicos no muestran diferencias significativas reproducibles entre animales tratados con ssAAVIGF-I y los controles.

Claims (34)

REIVI DICACIONES

1. Un genoma vírico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo qué está operativamente unido a un promotor específico de hígado.

2. Un genoma vírico como se define en la reivindicación 1 que es un vector parvoviral o un vector de virus del polioma.

3. Un genoma vírico como se define en la reivindicación 2 en donde el vector de virus del polioma es un vector basado en SV40.

4. Un genoma vírico como se define 1 en la reivindicación 2 en donde el vector parvoviral es un AAV.

5. Un genoma vírico como se define en la reivindicación 4 en donde el vector AAV es un AAV1, AAV2, AAV5 o AAV8.

6. Un genoma vírico como se define en las reivindicaciones 4 ó 5 en donde el vector AAV es un AAV monocatenario .

7. Un genoma vírico como se define en las reivindicaciones 4 ó 5 en donde el vector AAV es un AAV bicatenario .

8. Un genoma vírico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el promotor específico de hígado comprende la región potenciadora del gen de la albúmina y el promotor de alfal-antitripsina .

9. Un genoma vírico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde IGF-I corresponde a un IGF-I humano.

10. Un virión obtenible expresando un genoma vírico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en una célula empaquetadora adecuada .

11. Un virión según la reivindicación 10 para su uso como medicamento.

12. Una composición farmacéutica que comprende un virión como se define en la reivindicación 11 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

13. Un método para el tratamiento y/o prevención de cirrosis hepática o fibrosis hepática que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de un virión como se define en la reivindicación 10 ó 9.

14. Un método para el tratamiento y/o prevención de cirrosis hepática o fibrosis hepática que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de un parvovirus recombinante que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

15. Un método como se define en la reivindicación 14 en donde el parvovirus recombinante es AAV.

16. Un método como se define en la reivindicación 15 en donde el AAV es AAV1, AAV2, AAV5 o AAV8.

17. Un método como se define en las reivindicaciones 15 ó 16 en donde el AAV es un AAV monocatenario .

18. Un método como se define en las reivindicaciones 15 ó 16 en donde el AAV es un AAV bicatenario .

19. Un método como se define en las reivindicaciones 15 a 18 en donde el AAV es un AAV1, AAV5 ó AAV8 pseudotipado con AAV8.

20. Un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 en donde la secuencia que codifica IGF-I está operativamente unida a un promotor especifico de hígado.

21. Un método como se define en la reivindicación 20 en donde el promotor específico de hígado comprende la región potenciadora del gen de la albúmina y el promotor de alfal-antitripsina .

22. Un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 en donde IGF-I corresponde a un IGF-I humano.

23. Un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22 en donde el virión o el parvovirus recombinante se administra por vía intra-arterial .

24. un método como se define en la reivindicación 23 en donde la administración intra-arterial se lleva a cabo a través de la arteria hepática.

25. Un método para preparar un virión AAV recombinante que comprende los pasos de (i) poner en contacto una célula con (a) una primera secuencia de ácido nucleico que comprende i . un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor espeqífico de higado y ii. una 5'-ITR y una 3'-ITR de AAV flanqueando el cásete de expresión definido en (i) (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina rep de AAV (c) una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina cap de AAV y, opcionalmente, (d) una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica funciones víricas y/o celulares de las que AAV es dependiente para replicación en condiciones adecuadas para la entrada de los tres componentes en la célula y (ii) recuperar el virión AAV recombinante de las células.

26. Un método como se define en la reivindicación 25 en donde la célula usada en la etapa (i) es una célula de insecto y en donde la primera, segunda y tercera secuencias están comprendidas en un vector baculoviral

27. Un método como se define en las reivindicaciones 25 o 26 en donde el virión AAV recombinante es un virión AAV monocatenario .

28. Un método como se define en las reivindicaciones 25 o 26 en donde el virión AAV recombinante es un virión AAV bicatenario.

29. Un método como se define n las reivindicaciones 25 a 28 en donde el cásete de expresión (a) comprende una señal de poliadenilación en dirección 3' de la secuencia que codifica IGF-I o el equivalente funcional del mismo.

30. Un método como se define en las reivindicaciones 25 a 29 en donde el componente (b) comprende el gen que codifica el gen rep de AAV2 y/o el componente (c) comprende el gen cap de AAVl, AAV2, AAV5 o AAV8.

31. Un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30 en donde el promotor especifico de hígado comprende la región potenciadora del gen de la albúmina y el promotor de alfal-antitripsina .

32. Un método para preparar un virión SV40 recombinante que comprende (i) poner en contacto una célula con un polinucleótido que comprende un genoma de SV40 deficiente para replicación que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia que codifica IGF-I o una variante funcionalmente equivalente del mismo que está operativamente unida a un promotor específico de hígado y en donde la célula expresa los genes de SV40 que complementan el defecto en replicación en dicho polinucleótido en condiciones adecuadas para la entrada en la célula de dicho polinucleótido y (ii) recuperar el virión SV40 recombinante de las células.

33. Un método como se define en la reivindicación 32 en donde el genoma de SV40 deficiente en replicación carece de la secuencia que codifica el antígeno T grande y la célula empaquetadora expresa el antígeno T grande.

34. Un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33 en donde el promotor especifico de hígado comprende la región potenciadora del gen de la albúmina y el promotor de alfal-antitripsina .