CN107636153B - 编码经修饰的g6pc的腺相关病毒载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

描述了经修饰的G6PC(葡萄糖‑6‑磷酸酶，催化亚单位)核酸和具有增加的磷酸水解酶活性的葡萄糖‑6‑磷酸酶‑α(G6Pase‑α)酶。还描述了载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，以及表达经修饰的G6Pase‑α的重组AAV。所公开的AAV载体和rAAV可用于糖原贮积病(特别是Ia型糖原贮积病(GSD‑Ia))，及其并发症的治疗中的基因治疗应用。

Description

编码经修饰的G6PC的腺相关病毒载体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2014年12月23日的美国临时申请No.62/096,400的权益，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及编码具有增强的活性的经修饰的葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6PC)酶的基因治疗载体及其用途，诸如用于治疗糖原贮积病(GSD)和与GSD相关的并发症。
发明背景
Ia型糖原贮积病(GSD-Ia或肝糖原累积症(von Gierke disease)，MIM232200)是由葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α或G6PC)中的缺陷引起的，葡萄糖-6-磷酸酶-α是主要在肝、肾和肠中表达的酶(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。G6Pase-α由G6PC基因编码，是通过九个跨膜螺旋锚定在内质网(ER)中的疏水性蛋白质(Chou等人，NatRev Endocrinol6:676-688,2010)。这种酶在糖原分解和糖异生的最后步骤中催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)水解成葡萄糖和磷酸。受GSD-Ia影响的患者不能维持葡萄糖体内平衡，并且表现为患有空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾肥大、高脂血症、高尿酸血症和乳酸血症(lactic academia)(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。
GSD-Ia目前尚无治愈方法。可以使用使患者能够达到接近正常生长和青春期发育的膳食疗法来管理低血糖(Greene等人，N Engl J Med 294:423-425,1976；Chen等人，NEngl J Med 310:171-175,1984)。然而，较长期的临床并发症以及它们的根本病理过程仍然保持未矫正。其中最重大的慢性风险之一是肝细胞腺瘤(HCA)，HCA在70-80％的25岁以上GSD-I患者中发展(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010；Labrune等人，JPediatr Gastroenterol Nutr 24:276-279,1997；Rake等人，Eur J Pediatr 161(增补版1):S20-S34,2002)。GSD-Ia患者的HCA是消毒、多个和无包膜的，并发症包括局部压迫和肿瘤内出血。在10％的GSD-Ia患者中，HCA经历恶性转化而变成肝细胞癌(HCC)(Chou等人，NatRev Endocrinol 6:676-688,2010；Rake等人，Eur J Pediatr 161(增补版1):S20-S34,2002；Franco等人，J Inherit Metab Dis 28:153-162,2005)。
虽然先前已经在GSD-Ia的动物模型中进行了使用携带G6Pase-α的重组腺相关病毒(AAV)的基因治疗研究，但是没有一个能够完全矫正肝脏G6Pase-α缺陷。因此，存在对用于治疗GSD-Ia及其相关并发症的改进基因治疗载体的需要。
发明内容
在本文中公开，犬G6Pase-α酶比人G6Pase-α酶更具活性。两种蛋白质的氨基酸序列比对显示它们的主要差异在于18个残基。为了鉴定具有增加的磷酸水解酶活性的人G6Pase-α突变体，产生含有来自犬G6Pase-α的一个或两个对应氨基酸的突变体。
本文提供了编码经修饰的G6Pase-α的分离的核酸分子。在一些实施方案中，经修饰的G6Pase-α包括在人G6Pase-α的氨基酸298处的丝氨酸取代为半胱氨酸的取代，例如SEQID NO:8的经修饰的G6Pase-α。在一些示例中，核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO:6或SEQID NO:7。
还提供了载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，其包括所公开的编码经修饰的人G6Pase-α的核酸分子。在一些示例中，载体还包含启动子，诸如人G6PC启动子/增强子(GPE)。
还提供了包含编码经修饰的人G6Pase-α的核酸分子的重组AAV(rAAV)。还提供了包含本文公开的核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，分离的宿主细胞可以是适用于rAAV增殖的细胞。
本公开进一步提供了包含所公开的核酸分子、载体和rAAV的组合物。
还提供了治疗被诊断患有糖原贮积病的受试者的方法。在一些实施方案中，该方法包括选择患有Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)的受试者，以及给该受试者施用治疗有效量的本文公开的rAAV或包含所述rAAV的组合物。
还提供了通过给受试者施用治疗有效量的本文公开的rAAV或包含所述rAAV的组合物，在患有G6Pase-α缺陷的受试者中促进葡萄糖体内平衡，抑制低血糖，抑制或预防HCA的发展，抑制或预防HCC的发展，抑制或预防肾功能紊乱或肾衰竭，或治疗与GSD-Ia相关的任何其它并发症的方法。
附图说明
从以下参照附图进行的详细描述，本发明的前述和其它目的、特征和优点将变得更加明显。
图1是犬(SEQ ID NO:1)和人(SEQ ID NO:2)G6Pase-α蛋白序列的比对。犬和人序列之间不同的18个氨基酸残基用箭头指示。
图2示出了人G6Pase-α，其通过9个螺旋H1至H9锚定至内质网膜中(Pan等人J BiolChem 273:6144-6148,1998)。列出了人与犬G6Pase-α之间的氨基酸差异。
图3是示出在2周龄时用重组AAV8-GPE载体转导的4周龄GSD-Ia(G6pc-/-)小鼠中的肝微粒体G6Pase-α活性的图，所述重组AAV8-GPE载体(1013vg/kg)表达人G6PC(AAV-G6PC)、密码子优化(co)的人G6PC(AAV-co-G6PC)、人G6PC-S298C突变体(AAV-G6PC-S298C)或co-人G6PC-S298C突变体(AAV-co-G6PC-S298C)。4周龄野生型小鼠中的肝微粒体G6Pase-α活性平均为227.5±17.6nmol/min/mg。数据表示为平均值±SEM。**P<0.005。
图4示出了G6PC cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)，其中指出了18个人G6PC突变中的每一个的位置。对于定点诱变，设计了20个核苷酸的正义和反义引物，以使得要突变的密码子位于每个引物的中间。
图5是示出在10天龄时用5×1011vg/kg的AAV-co-G6PC载体(n＝3)或rAAV8-co-G6PC-S298C载体(n＝3)转导的24天龄G6pc-/-小鼠中的肝G6Pase-α的活性的图。野生型肝G6Pase的活性平均为7.7±1.1nmol/min/mg。数据表示为平均值±SEM。**P<0.005。
图6A-6E示出了证明rAAV-G6PC对肝G6Pase-α缺陷的矫正的数据。将L-G6pc-/-小鼠在10周龄时用1×1012vg/kg的rAAV-G6PC治疗，然后在18周龄时分析。图6A是示出对照(n＝7)、L-G6pc-/-(n＝7)和AAV小鼠(n＝8)中的肝G6Pase-α活性的图。图6B示出了对照、L-G6pc-/-和AAV小鼠的代表性H&E染色的肝脏的图像。图6C是示出对照(n＝13)、L-G6pc-/-(n＝6)和AA小鼠(n＝8)的空腹葡萄糖耐量(FGT)的图。图6D是示出对照、L-G6pc-/-和AAV小鼠(n＝8)的肝重的图。图6E是示出对照、L-G6pc-/-和AAV小鼠(n＝8)的肝脏糖原和甘油三酯含量的图。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.005。
序列表
随附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写示出，并且氨基酸的三个字母代码如37C.F.R.1.822中所定义。仅示出了每个核酸序列的一条链，但互补链被理解为以任何引用方式包括于所显示的链上。该序列表作为ASCII文本文件提交，创建于2015年12月22日，为52.8KB，其以引用方式并入本文。在随附序列表中：
SEQ ID NO:1是犬G6Pase-α蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是人G6Pase-α蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是具有以下特征的pTR-GPE-人G6PC的核苷酸序列：
ITR——核苷酸17-163
G6PC启动子/增强子——核苷酸182-3045
填充片段——核苷酸3051-3184
内含子——核苷酸3185-3321
填充片段——核苷酸3322-3367
G6PC编码序列——核苷酸3368-4441
ITR——核苷酸4674-4819。
SEQ ID NO:4是具有以下特征的pTR-GPE-人G6PC-S298C的核苷酸序列：
ITR——核苷酸17-163
G6PC启动子/增强子——核苷酸182-3045
填充片段——核苷酸3051-3184
内含子——核苷酸3185-3321
填充片段——核苷酸3322-3367
G6PC编码序列——核苷酸3368-4441
S298C突变——核苷酸4259-4261(TCT至TGC)
ITR——核苷酸4674-4819。
SEQ ID NO:5是具有以下特征的pTR-GPE-密码子优化(co)G6PC-S298C的核苷酸序列：
ITR–核苷酸17-163
G6PC启动子/增强子——核苷酸182-3045
填充片段——核苷酸3051-3184
内含子——核苷酸3185-3321
填充片段——核苷酸3322-3367
密码子优化的G6PC编码序列——核苷酸3368-4441
S298C突变——核苷酸4259-4261(AGC至TGC)
ITR——核苷酸4674-4819。
SEQ ID NO:6是编码S298C G6Pase-α的经修饰的人G6PC的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是经密码子优化、编码S298C G6Pase-α的修饰的人G6PC的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是经修饰的人S298C G6Pase-α的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是经修饰的人S298C/A301V G6Pase-α的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是基于人和犬G6Pase-α比对的氨基酸共有序列
SEQ ID NO:11是人G6PC编码区的核苷酸序列。
发明详述
I.缩写
AAV 腺相关病毒
CBA 鸡β-肌动蛋白
CMV 细胞巨化病毒
co 密码子优化的
FGT 空腹葡萄糖耐量
G6P 葡萄糖-6-磷酸
G6Pase-α 葡萄糖-6-磷酸酶-α
G6PC 葡萄糖-6-磷酸酶，催化亚基
G6PT 葡萄糖-6-磷酸转运蛋白
GPE G6PC启动子/增强子
GSD 糖原贮积病
HCA 肝细胞腺瘤
HCC 肝细胞癌
ITR 反向末端重复序列
ORF 开放读框
rAAV 重组AAV
SEM 平均值的标准误差
vg 病毒基因组
vp 病毒颗粒
WT 野生型
II.术语和方法
除非另有说明，技术术语是按照常规用法使用的。常用分子生物学术语的定义可见于由Oxford University Press出版的Benjamin Lewin,Genes V,1994(ISBN 0-19-854287-9)；由Blackwell Science Ltd.出版的Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia ofMolecular Biology,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及由VCH Publishers,Inc.出版的Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference,1995(ISBN 1-56081-569-8)中。
为了便于查看本公开的各个实施方案，提供了以下具体术语说明：
腺相关病毒(AAV)：一种感染人类和其他灵长类物种的小型、复制缺陷型无包膜病毒。不知道AAV是否会引起疾病，并且AAV引起非常温和的免疫应答。利用AAV的基因治疗载体可以感染正在分裂的细胞和静止期细胞，并且可以在染色体外状态下保留，而无需整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使AAV成为一种有吸引力的基因治疗病毒载体。目前有11种公认的AAV血清型(AAV1至AAV11)。
施用/施用(Administration/Administer)：通过任何有效的途径给受试者提供或给予受试者药剂(agent)如治疗剂(例如重组AAV)。示例性施用途径包括但不限于注射(诸如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、管内、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。
密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已被改变的核酸序列，使得密码子对于在特定系统(诸如特定物种或物种组)中的表达是最佳的。例如，可以针对在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种(诸如人细胞)中表达来优化核酸序列。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。
增强子：通过增加启动子的活性来增加转录速率的核酸序列。
G6PC：位于人染色体17q21上的基因，编码葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α)。G6Pase-α是具有9个螺旋的357个氨基酸的疏水性蛋白质，该9个螺旋将其锚定在内质网中(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。G6Pase-α描述于图2中。G6Pase-α蛋白质在糖异生和糖原分解的最终步骤中催化葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖和磷酸，并且是葡萄糖体内平衡中的关键酶。G6PC基因中的有害突变引起Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)，其是以与肝脏和肾脏中的糖原和脂肪积累相关的严重的空腹低血糖为特征的代谢紊乱。
糖原贮积病(GSD)：一组由肌肉、肝脏和其他组织中糖原合成或分解的过程中的缺陷引起的疾病。GSD可以是遗传或后天获得的。遗传性GSD是由这些过程中所涉及的任何新陈代谢先天性障碍引起的。目前有11种公认的糖原贮积病(GSD类型I、II、III、IV、V、VI、VII、IX、XI、XII和XIII)。GSD-I由两种常染色体隐性遗传病GSD-Ia和GSD-Ib组成(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。GSD-Ia是由葡萄糖-6-磷酸酶-α缺陷引起的。葡萄糖-6-磷酸转运蛋白(G6PT)的缺陷是GSD-Ib的原因。
Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)：也称为Geirke疾病，GSD-Ia是最常见的糖原贮积病，发病率约为100,000名活产婴儿中约1例。GSD-Ia是由酶葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α)缺陷导致的遗传性疾病。G6Pase-α缺陷会损害肝脏从糖原和从糖异生产生游离葡萄糖的能力。受GSD-Ia影响的患者不能维持葡萄糖体内平衡，并且表现为患有空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾肥大、高脂血症、高尿酸血症和乳酸血症(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。GSD-Ia目前尚无治愈方法。
内含子：基因中不含有蛋白质编码信息的一段DNA。内含子在翻译信使RNA之前被去除。
反向末端重复序列(ITR)：腺相关病毒基因组中用于有效复制的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的两端。ITR用作病毒DNA合成的复制起点，并且是用于生成AAV整合载体的必需顺式组分。
分离的：“分离的”生物组分(诸如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经与生物体的细胞或组织中的其他生物组分或该生物体本身基本上分离或从其纯化，其中该组分天然存在，诸如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞。已经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
修饰的：在本公开的情境中，“修饰的”G6PC或G6Pase-α是指与野生型序列相比(例如与如SEQ ID NO:3的核苷酸3368-4441所示的人G6PC编码序列相比，或者相对于如SEQ IDNO:2所示的人G6Pase-α氨基酸序列)，包含至少一个核酸或氨基酸取代、缺失或插入的G6PC核酸序列或G6Pase-α氨基酸序列。
可操作连接的：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区时在相同的阅读框中。
药学上可接受的载体：可用于本公开的药学上可接受的运载体(载剂(vehicle))是常规的。E.W.Martin所著的Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton,PA，第15版(1975)描述了适于药学递送一种或多种治疗性化合物、分子或试剂的组合物和配制物。
一般来说，载体的性质将取决于所采用的具体施用模式。例如，肠胃外配制物通常包含可注射流体作为载剂，该可注射流体包括药学和生理上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡的盐溶液、水性右旋糖、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体可以包括例如药品等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，待施用的药物组合物可以含有少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂，防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病(诸如GSD-Ia)是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后改善该疾病或病理病症的病征或症状的治疗性处置。“改善”是指减少疾病的病征或症状的数量或严重程度。
启动子：指导/起始核酸(例如基因)转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列。通常，启动子位于它们所转录的基因附近。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或其它活性化合物是全部或部分从天然相关蛋白质和其他污染物分离出的那些。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其它粗制备物中分离并且经受分级分离以去除初始制备物的各种组分如蛋白质、细胞碎片和其他组分的肽、蛋白质、病毒或其它活性化合物。
重组：重组核酸分子是具有不是天然存在的序列或具有通过两个在其他情况下是分离的序列区段的人工组合制成的序列的核酸分子。这种人工组合可以通过化学合成或通过人工操纵核酸分子的分离片段来实现，诸如通过基因工程技术。
类似地，重组病毒是包含非天然存在或通过人工组合不同来源的至少两个序列制成的序列(诸如基因组序列)的病毒。术语“重组”还包括已经仅通过添加、取代或缺失天然核酸分子、蛋白质或病毒的部分而改变的核酸、蛋白质和病毒。如本文所用，“重组AAV”是指其中包装了重组核酸分子(诸如编码G6Pase-α的重组核酸分子)的AAV颗粒。
序列相同性：两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的相同性或相似性以序列之间的相同性或相似性表示。序列相同性可以用百分比相同性来测量；该百分比越高，序列越相同。序列相似性可以用百分比相似性(其考虑到了保守氨基酸取代)来测量；该百分比越高，序列越相似。当使用标准方法进行比对时，核酸或氨基酸序列的同系物或直系同源物具有相对高程度的序列相同性/相似性。相较于相关性更远的物种(如人和秀丽线虫(C.elegans)序列)，当直系同源蛋白或cDNA源自相关性更密切的物种(如人和小鼠序列)时，这种同源性更加显著。
用于比较的序列比对方法是本领域中众所周知的。各种程序和比对算法描述于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人，Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang等人，Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；以及Pearson等人，Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994中。Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10,1990介绍了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可从若干来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI)和互联网，用于结合序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用。另外的信息请参见NCBI网站。
血清型：通过抗原特征集合来区分的一组密切相关的微生物(诸如病毒)。
填充序列：是指包含在较大核酸分子(诸如载体)中的核苷酸序列，通常用于在两个核酸特征(feature)之间(诸如在启动子和编码序列之间)产生所需间隔，或延伸核酸分子以使其具有期望长度。填充序列不含有蛋白质编码信息，并且可以具有未知/合成来源和/或与较大核酸分子内的其他核酸序列不相关。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，该范畴包括人和非人哺乳动物。
合成的：通过人工手段在实验室中产生的，例如合成的核酸可以在实验室中化学合成。
治疗有效量：指定药物或治疗剂(例如重组AAV)的量，足以在用该药剂治疗的受试者或细胞中实现期望效果。药剂的有效量将取决于若干因素，包括但不限于所治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的施用方式。
载体：载体是允许插入外来核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可以包含允许载体在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可以包含一个或多个选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是含有允许插入的一个或多个基因进行转录和翻译所需的调控序列的载体。在本文中的一些实施方案中，载体是AAV载体。
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有如由与本公开所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。术语“a”、“an”和“the”包括多个指代物，除非上下文明确指出不是这样。“包括A或B”是指包括A，或B，或A和B。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并且提供用于说明。尽管类似于或等同于本文所描述的那些的方法和材料可以用于实践或测试本公开，但是适当的方法和材料描述于下文中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全文以引用方式并入。在发生冲突的情况下，以本专利说明书(包括术语说明)为准。此外，这些材料、方法和示例仅是说明性的，而并非旨在限定。
III.介绍
Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)是与由葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α或G6PC)缺陷引起的，与危及生命的低血糖、肝恶性肿瘤以及肾衰竭相关的遗传性代谢紊乱，并且主要影响肝和肾。目前的治疗方法不能预防许多患者的长期并发症，包括生长不足、痛风、肺动脉高压、具有肾衰竭风险的肾功能紊乱、骨质疏松、以及可以经历恶性转化而变成肝细胞癌的肝细胞腺瘤(HCA)(Chou等人，Curr Mol Med 2:121-143,2002；Chou等人，Nat Rev Endocrinol6:676-688,2010)。因此，开发新的疗法，诸如基因治疗，作为GSD-Ia的潜在治愈性治疗是合乎情理的(Chou等人，Expert Opin Biol Ther11:1011-1024,2011)。
已经描述了编码功能性G6Pase-α的重组AAV(rAAV)载体(综述于Chou和Mansfield，Expert Opin Biol Ther 11:1011-1024,2011中)。使用GSD-Ia小鼠模型的先前研究已经证明，由CBA启动子/CMV增强子(Ghosh等人，Gene Ther 13:321-329,2006)、犬G6PC启动子(Koeberl等人，Gene Ther13:1281-1289,2006)或在G6PC 5'侧翼区的核苷酸-298至+128处的人G6PC启动子(Koeberl等人，Mol Ther 16:665-672,2008)指导表达G6Pase-α的重组AAV将G6Pase-α转基因递送到肝脏，并实现对这种病症的延长矫正。然而，虽然这些研究已经显示出希望，但没有一个能够完全矫正肝G6Pase-α缺陷。
一个先前研究的示例由Koeberl等人描述(Mol Ther 16:665-672,2008)，Koeberl等人开发出了能够治疗GSD-Ia小鼠和GSD-Ia犬的双链rAAV载体(rAAV-G6Pase)。此外，Yiu等人(Mol Ther 18:1076-1084,2010)和Lee等人(Hepatology 56:1719-1729,2012)描述了类似有效的单链rAAV载体rAAV-GPE-G6PC的开发。这两个载体在若干方面有所不同。第一，rAAV-GPE-G6PC是单链rAAV载体，而rAAV-G6Pase是双链rAAV载体。开发双链rAAV载体，以通过将单链DNA基因组转化为双链DNA基因组来规避AAV生命周期中的限速步骤(Chou等人，Expert Opin Biol Ther 11:1011-1024,2011)。第二，rAAV-G6Pase中G6Pase-α的表达由在核苷酸-382至-1处的人G6PC最小启动子/增强子指导(Koeberl等人，Mol Ther 16:665-672,2008)。rAAV-GPE-G6PC中G6Pase-α的表达由在核苷酸-2864至-1处的人G6PC启动子/增强子(GPE)指导(Yiu等人，Mol Ther 18:1076-1084,2010；Lee等人，Hepatology 56:1719-1729,2012)。第三，rAAV-GPE-G6PC载体含有rAAV-G6Pase载体所缺少的内含子的。两种载体均有效地将G6Pase-α转基因递送至肝并校正鼠GSD-Ia(Koeberl等人，Mol Ther 16:665-672,2008；Yiu等人，Mol Ther 18:1076-1084,2010；Lee等人，Hepatology 56:1719-1729,2012)。
进行比较研究以确定哪种载体治疗GSD-Ia更有效，rAAV-G6Pase还是rAAV-GPE-G6PC。结果明确地表明，rAAV-GPE-G6PC载体在矫正鼠GSD-Ia方面比rAAV-G6Pase载体更有效。确定了，G6PC最小启动子上游的增强子元件是有效的肝转基因表达所需要的(Lee等人，Mol Genet Metab 10:275-280,2013)。进行另外的研究以确定rAAV-GPE-G6PC载体中含有的内含子是否在指导肝G6Pase-α表达中起作用。生成双链rAAV载体(称为rAAV-miGPE-G6PC)，其在核苷酸-382至-1处的人G6PC最小启动子的指导下表达人G6Pase-α并且含有存在于rAAV-GPE-G6PC载体中的内含子。结果表明，rAAV-GPE-G6PC载体在治疗鼠GSD-Ia方面比rAAV-miGPE-G6PC载体更有效，支持了以下结论：G6PC最小启动子上游的增强子元件是有效的肝转基因表达所需要的(Lee等人，Mol Genet Metab 10:275-280,2013)。
包含G6PC启动子/增强子(GPE)元件的重组AAV载体进一步描述于PCT公开No.WO2015/081101中，该PCT公开以引用方式并入本文。重组载体包含GPE、合成内含子和G6PC编码区。G6PC编码区任选地经密码子优化以用于在人细胞中表达。重组载体还包含位于G6PC启动子/增强子和内含子之间以及内含子和G6PC编码序列之间的填充核酸序列；以及5′和3′反向末端重复(ITR)序列。
在PCT公开No.WO 2015/081101中公开了，与具有替代启动子/增强子(即鸡β-肌动蛋白启动子/CMV增强子)的另一种表达G6Pase-α的重组AAV相比，具有G6PC启动子/增强子、表达G6Pase-α的重组AAV(rAAV-GPE-G6PC)在指导体内肝转基因表达方面显著更有效。在24周的研究时期，用rAAV-GPE-G6PC治疗的G6PC缺陷小鼠(GSD-Ia的模型)表现出肝G6PC缺陷的完全正常化，所述正常化通过正常水平的血糖、血液代谢物、肝糖原和肝脂证明(同样参见Yiu等人，Mol Ther 18:1076-1084,2010)。此外，对用rAAV-GPE-G6PC治疗的G6pc-/-小鼠的长期研究表明，由rAAV-GPE-G6PC介导的基因治疗对小鼠有效达至少70至90周，表达超过3％的肝G6Pase-α。具体地，用rAAV-GPE-G6PC治疗的小鼠表现出正常的肝脂肪贮存、正常的血液代谢物和葡萄糖耐量曲线、降低的空腹血胰岛素水平并且没有肝脏异常如肝细胞腺瘤的迹象(同样参见Lee等人，Hepatology 56:1719-1729,2012)。
在PCT公开No.WO 2015/081101中进一步公开的发现是，在GSD-Ia动物模型中，G6PC启动子的上游增强子元件对于最佳G6PC表达是关键的。具体地，已证实，在GSD-Ia小鼠模型中，相较于仅含有383bp的最小G6PC启动子/增强子、表达G6Pase-α的重组AAV，使用包含在核苷酸-2684至-1(相对于G6PC起始位点)处的G6PC启动子/增强子的rAAV-GPE-G6PC进行治疗产生了显著更高水平的肝G6Pase-α表达，实现了肝糖原积累的更大减少，并且导致更好的空腹耐受性(同样参见Lee等人，Mol Genet Metab.110(3):275-280,2013)。
在PCT公开No.WO 2015/081101中还公开了以下发现：存在于G6PC启动子/增强子和内含子之间以及内含子和G6PC编码序列之间的填充核苷酸序列对于肝转导和G6Pase-α表达是重要的。具体地讲，从质粒UF11-K29-G6PC产生的重组AAV缺乏填充序列，其表现出7.3nmol/min/mg的G6Pase活性。相比之下，由质粒UF11-GPE-G6PC产生的重组AAV显示出33.0nmol/min/mg的G6Pase活性。
此外，PCT公开No.WO 2015/081101中公开的数据证明，对G6PC编码序列的密码子优化使翻译效率增加为约1.5至2.5倍，导致相较于施用编码野生型G6PC的rAAV-GPE-G6PC，在施用rAAV-co-GPE-G6PC(含有密码子优化的G6PC核酸序列)后，肝脏中的G6Pase-α表达显著更高。
因此，包含在核苷酸-2684至-1处的G6PC启动子/增强子、合成内含子、内含子侧翼的填充序列以及G6PC编码区(野生型或经密码子优化的)的重组AAV是有效的肝转基因表达和活体内治疗GSD-Ia的重要特征。
本公开第一次证明了可以修饰人G6PC的特定位置以增强所编码的G6Pase-α酶的磷酸水解酶活性。经修饰的G6Pase-α编码序列能够被结合到rAAV基因治疗载体中来增强治疗糖原贮积病的功效。
IV.对若干实施方案的概述
在本文中公开了，犬G6Pase-α酶比人G6Pase-α酶更具活性。两种蛋白质的氨基酸比对显示它们的主要序列差异在于18个残基。为了鉴定具有增加的磷酸水解酶活性的人G6Pase-α突变体，产生含有来自犬G6Pase-α的至少一个对应氨基酸的突变体。
本文提供了可在基因治疗应用中用于治疗糖原贮积病，特别是GSD-Ia的重组核酸分子、AAV载体和重组AAV。
在一些实施方案中，提供了编码经修饰的G6Pase-α的分离核酸分子，其中该经修饰的G6Pase-α包含在人G6Pase-α(野生型人G6Pase-α的氨基酸序列，在本文中如SEQ IDNO:2所示)的氨基酸298处的丝氨酸取代为半胱氨酸的取代。经修饰的G6Pase-α可以包括在另外的残基处的修饰，只要蛋白质保留酶活性即可。例如，经修饰的G6Pase-α可以包括在犬和人G6Pase-α序列之间不同的其他残基处的取代，此类残基包括人G6Pase-α(如SEQ IDNO:2所示)的位置3、54、139、196、199、242、247、292、301、318、324、332、347、349、350和/或353。图1示出了人和犬G6Pase-α蛋白序列的比对，并且表2提供了对人与犬G6Pase-α之间的氨基酸差异的总结。本公开设想了在以上和表2中列出的残基中的一个或多个处改变氨基酸序列的核苷酸取代。
在一些示例中，该核酸分子编码经修饰的G6Pase-α，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性并且在氨基酸298处具有丝氨酸取代为半胱氨酸的取代。在具体示例中，经修饰的G6Pase-α的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8(人S298C G6Pase-α)或由SEQ ID NO:8组成。在其他具体示例中，经修饰的G6Pase-α的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9(人S298C/A301VG6Pase-α)或由SEQ ID NO:9组成。在非限制性示例中，分离核酸分子包含核苷酸序列SEQID NO:6(经修饰的人G6PC编码S298C G6Pase-α)或SEQ ID NO:7(经密码子优化的、经修饰的人G6PC编码S298CG6Pase-α)。
本文还提供了包含编码经修饰的G6Pase-α的分离核酸分子的载体。在一些实施方案中，编码经修饰的G6Pase-α的核酸分子与启动子，诸如G6PC启动子可操作地连接。在一些示例中，G6PC启动子与SEQ ID NO:4的核苷酸182-3045(人G6PC启动子/增强子)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性，或者与SEQ ID NO:5的182-3045(人密码子优化的G6PC启动子/增强子)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性。在非限制性示例中，G6PC启动子包含SEQ ID NO:4的核苷酸182-3045或SEQ ID NO:5的核苷酸182-3045。
在一些示例中，载体包含与SEQ ID NO:4的核苷酸182-4441或SEQ ID NO:5的核苷酸182-4441具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性的核苷酸序列。在具体的非限制性示例中，载体包含SEQ ID NO:4的核苷酸182-4441或SEQ ID NO:5的核苷酸182-4441。
在一些实施方案中，载体是AAV载体。AAV血清型可以是用于将转基因递送至受试者体内的任何合适的血清型。在一些示例中，AAV载体是血清型8AAV(AAV8)。在其他示例中，AAV载体是血清型1、2、3、4、5、6、7、9、10、11或12载体(即，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12)。在其他示例中，AAV载体是两种或更多种AAV血清型的杂合体(诸如但不限于AAV2/1、AAV2/7、AAV2/8或AAV2/9)。AAV血清型的选择将部分取决于基因治疗所靶向的细胞类型。对于GSD-Ia的治疗，肝和肾是相关的靶器官。
当使用AAV载体时，载体可以包括反向末端重复序列(ITR)。在一些示例中，AAV载体包含与SEQ ID NO:4的核苷酸17-4819或SEQ ID NO:5的核苷酸17-4819具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性的核苷酸序列。在一些示例中，AAV载体包含SEQ ID NO:4的核苷酸17-4819或SEQ ID NO:5的核苷酸17-4819。
本文还提供了包含本文公开的核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，分离宿主细胞可以是适用于制备重组AAV(rAAV)的细胞(或细胞系)。在一些示例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如HEK-293、BHK、Vero、RD、HT-1080、A549、Cos-7、ARPE-19或MRC-5细胞。
还提供了包含本文公开的核酸分子的rAAV。在一些实施方案中，rAAV是rAAV8和/或rAAV2。然而，AAV血清型可以是任何其他合适的AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12，或者两种或更多种AAV血清型的杂合体(诸如但不限于AAV2/1、AAV2/7、AAV2/8或AAV2/9)。本公开还提供了包含本文所公开的rAAV的组合物和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，将组合物配制用于静脉内或肌内施用。用于施用rAAV的合适的药物配制物可见于例如美国专利申请公开No.2012/0219528(以引用方式并入本文)中。
还提供了治疗被诊断患有糖原贮积病的受试者的方法，该方法包括选择患有GSD-Ia的受试者，以及给该受试者施用治疗有效量的本文所公开的rAAV(或包含rAAV的组合物)。
本公开还提供了在具有葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α)缺陷的受试者中促进葡萄糖体内平衡，抑制低血糖，抑制或预防肝细胞腺瘤(HCA)发展，抑制或预防肝细胞癌(HCC)发展，抑制或预防肾功能紊乱或肾衰竭，抑制或预防生长迟缓，抑制或预防肝肿大，抑制或预防肾肥大，抑制或预防高脂血症，制或预防肺动脉高压，或者治疗、预防或抑制与GSD-Ia相关的任何其他并发症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的本文公开的rAAV(或包含rAAV的组合物)。在一些实施方案中，具有G6Pase-α缺陷的受试者是患有GSD-Ia的受试者。因此，在一些实施方案中，该方法包括选择患有GSD-Ia的受试者。
在本文所公开的方法的一些实施方案中，rAAV是静脉内施用的。
在一些实施方案中，rAAV是以约1×1010至约1×1014个病毒颗粒(vp)/kg的剂量施用的。在一些示例中，rAAV是以约1×1011至约8×1013vp/kg或约1×1012至约8×1013vp/kg的剂量施用的。在其他示例中，rAAV是以约1×1013至约6×1013vp/kg的剂量施用的。在具体的非限制性示例中，rAAV是以至少约1×1010、至少约5×1010、至少约1×1011、至少约5×1011、至少约1×1012、至少约5×1012、至少约1×1013、至少约5×1013、或至少约1×1014vp/kg的剂量施用的。在其他非限制性示例中，rAAV是以不大于约1×1010、不大于约5×1010、不大于约1×1011、不大于约5×1011、不大于约1×1012、不大于约5×1012、不大于约1×1013、不大于约5×1013、或不大于约1×1014vp/kg的剂量施用的。在一个非限制性示例中，rAAV是以约1×1012vp/kg的剂量施用的。在另一个非限制性示例中，rAAV是以约1×1011vp/kg的剂量施用的。根据所需治疗结果的需要，rAAV可以以单剂或多剂(诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10剂)施用。
V.经修饰的人G6PC/G6Pase-α序列
在本文中公开，犬G6Pase-α酶比人G6Pase-α酶更具活性。如图1和表2中所示，两种蛋白质的序列差异在于18个残基。使用定点诱变鉴定具有增加的磷酸水解酶活性的人G6Pase-α突变体。所产生的人G6Pase-α突变体在SEQ ID NO:2的位置3、54、139、196、199、242、247、292、298、301、318、324、332、347、349、350和/或353处含有来自犬G6Pase-α的一个或多个相应氨基酸。人G6Pase-α序列和人/犬G6Pase-α共有序列如下所述。
人G6Pase-α(SEQ ID NO:2)：
Figure GDA0002662199680000171
人/犬G6Pase-α共有序列(SEQ ID NO:10)：
Figure GDA0002662199680000172
在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:10的经修饰G6Pase-α，其中氨基酸残基3处的X＝K或E；氨基酸残基54处的X＝R或Q；氨基酸残基139处的X＝R或Q；氨基酸残基142处的X＝K或I；氨基酸残基196处的X＝R或S；氨基酸残基199处的X＝Q或H；氨基酸残基242处的X＝R或Q；氨基酸残基247处的X＝R或Q；氨基酸残基292处的X＝F或L；氨基酸残基298处的X＝C或S；氨基酸残基301处的X＝V或A；氨基酸残基318处的X＝T或V；氨基酸残基324处的X＝T或V；氨基酸残基332处的X＝A或V；氨基酸残基347处的X＝R或Q；氨基酸残基349处的X＝F或L；氨基酸残基350处的X＝D或G；或氨基酸残基353处的X＝D或H，或者它们的组合。
在具体示例中，经修饰的G6Pase-α序列包含S298C突变，或包含S298C和A310V突变，如下所述。在非限制性示例中，经修饰的G6Pase-α序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9，或由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9组成。
人G6Pase-αS298C(SEQ ID NO:8)：
Figure GDA0002662199680000181
人G6Pase-αS298C/A310V(SEQ ID NO:9)：
Figure GDA0002662199680000182
在一些实施方案中，包含S298C突变的经修饰的G6Pase-α由如下所述的核酸序列编码。
人G6PC S298C(SEQ ID NO:6)：
Figure GDA0002662199680000183
Figure GDA0002662199680000191
人密码子优化G6PC S298C(SEQ ID NO:7)：
Figure GDA0002662199680000192
VI.用于基因治疗应用的重组AAV
AAV属于细小病毒(Parvoviridae)科和依赖病毒(Dependovirus)属。AAV是一种小型、无包膜的病毒，其包装线性、单链的DNA基因组。AAV DNA的正义链和反义链以相同的频率包装到AAV衣壳中。
AAV基因组的特征在于位于两个开放读框(ORF)侧面的两个反向末端重复序列(ITR)。例如，在AAV2基因组中，ITR的前125个核苷酸是回文的，其自身折叠以最大化碱基配对并形成T形发夹结构。ITR的另外20个碱基被称为D序列，该20个碱基保持不配对。ITR是对AAV DNA复制重要的顺式作用序列；ITR是复制起点并且用作通过DNA聚合酶进行第二链合成的引物。在此合成期间形成的双链DNA被称为复制形式的单体，其用于第二轮自引发复制并形成复制形式的二聚体。这些双链中间体通过链置换机制进行加工，得到用于包装的单链DNA和用于转录的双链DNA。位于ITR内的是Rep结合元件和末端拆分位点(terminalresolution site,TRS)。病毒调控蛋白Rep在AAV复制过程中使用这些特征来处理双链中间体。除了它们在AAV复制中的作用之外，ITR对于AAV基因组的包装、转录、非容许条件下的负调控以及位点特异性整合也是必要的(Daya和Berns，Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)。
AAV的左ORF含有Rep基因，该Rep基因编码四种蛋白质——Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。右ORF含有Cap基因，Cap基因产生三种病毒衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)。AAV衣壳包含排列成二十面体对称的60个病毒衣壳蛋白。VP1、VP2和VP3以1:1:10的摩尔比存在(Daya和Berns，Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)。
AAV是目前基因治疗最常用的病毒之一。虽然AAV感染人类和一些其他灵长类物种，但仍不知道其会引起疾病，并且其引起非常温和的免疫应答。利用AAV的基因治疗载体可以感染正在分裂的细胞和静止期细胞，并且在染色体外状态下保留，而无需整合到宿主细胞的基因组中。由于AAV的有利特征，本公开设想将AAV用于本文所公开的重组核酸分子和方法。
AAV具有用于基因治疗载体的若干个理想特征，包括结合并进入靶细胞、进入细胞核的能力，在细胞核中长时间表达的能力，以及低毒性。然而，AAV基因组的小尺寸限制了可以并入的异源DNA的大小。为了最小化这个问题，已经构建了不编码Rep和整合效率元件(IEE)的AAV载体。保留ITR是因为它们是包装所需的顺式信号(Daya和Berns，ClinMicrobiol Rev 21(4):583-593,2008)。
用于制备适用于基因治疗的rAAV的方法是本领域中熟知的(参见例如美国专利申请No.2012/0100606；No.2012/0135515；No.2011/0229971；以及No.2013/0072548；以及Ghosh等人，Gene Ther 13(4):321-329,2006)，并且可以与本文所公开的重组核酸分子、载体和方法一起使用。
提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方案。
实施例
实施例1：构建和表征用于AAV介导的基因治疗的人G6PC(G6Pase-α)突变体
此实施例描述了18种人G6PC突变体的产生以及对具有增加的磷酸水解酶活性的特异性G6Pase-α突变体的鉴定。
构建G6PC突变体
为了构建人G6PC突变体，使用包含人G6PC cDNA的核苷酸1至1074(整个编码区，其中起始密码子ATG在核苷酸1-3处；SEQ ID NO:11)的pSVL载体作为模板。对于PCR定向诱变，使用两个外部PCR引物扩增模板，所述外部引物匹配核苷酸1至20(正义)和1055至1074(反义)，位于有20个核苷酸长的正义和反义突变引物的外侧(flanked)，其中要突变的密码子在所述突变引物中间(参见图4和下表1)。hG6PC-S298C/A301V双突变体的模板是pSVL-hG6PC-S298C突变体。将突变序列克隆到pSVL中，并通过DNA测序进行验证。
表1.人G6PC突变体中的核苷酸变化
突变 核苷酸/密码子变化 人G6PC中的序列
R3K GAA(R)→AAA(K) 核苷酸7-9
Q54R CAG(Q)→CGT(R) 核苷酸160-162
Q139R CAG(Q)→CGG(R) 核苷酸415-417
I142K ATA(I)→AAA(K) 核苷酸424-426
S196R AGC(S)→CGC(R) 核苷酸586-588
H199Q CAC(H)→CAG(Q) 核苷酸595-597
Q242R CAG(Q)→AGG(R) 核苷酸724-726
Q247R CAG(Q)→CGG(R) 核苷酸739-741
L292F CTC(L)→TTC(F) 核苷酸874-876
S298C TCT(S)→TGC(C) 核苷酸892-894
A301V GCC(A)→GTG(V) 核苷酸901-903
V318T GTC(V)→ACT(T) 核苷酸952-954
V324T GTC(V)→ACC(T) 核苷酸970-972
V332A GTA(V)→GCA(A) 核苷酸994-996
Q347R CAG(Q)→CGG(R) 核苷酸1039-1041
L349F CTG(L)→TTC(F) 核苷酸1045-1047
G350D GGC(G)→GAC(D) 核苷酸1048-1050
H353D CAC(H)→GAC(D) 核苷酸1057-1059
COS-1细胞中的表达和磷酸水解酶测定
使COS-1细胞于37℃下在补充有4％胎牛血清的HEPES缓冲Dulbecco改良最小必需培养基中生长。通过DEAE-葡聚糖/氯喹法将G6PC构建体转染入COS-1细胞。在37℃下温育2天后，收获转染的培养物以测定磷酸水解酶活性。简而言之，如前所述，将含有50mM二甲胂酸盐缓冲液，pH6.5，10mM G6P和适量的细胞匀浆的反应混合物(50μl)在37℃下温育10分钟(Lei等人，Science 262:580-583,1993)。
统计分析
使用GraphPad Prism Program第4版(GraphPad Software,San Diego,CA)进行未配对t检验。在p<0.05时，值被认为具有统计意义上的显著性。
结果
通过体外表达测定比较人和犬G6Pase-α的磷酸水解酶活性。结果表明，犬源酶活性是人源酶活性的约5倍。犬序列和人序列的序列比对显示，两种酶的差异在于18个氨基酸残基(图1和表2)。
表2.人和犬G6Pase-α之间的氨基酸差异
氨基酸 氨基酸 氨基酸 氨基酸 氨基酸
犬 K3 R54 R139 K142 R196
人 E3 Q54 Q139 I142 S196
犬 Q199 R242 R247 F292 C298
人 H199 Q242 Q247 L292 S298
犬 V301 T318 T324 A332 R347
人 A301 V318 V324 V332 Q347
犬 F349 D350 D353
人 L349 G350 H353
为了确定哪些氨基酸取代导致了犬G6Pase-α的酶活性增加，通过定点诱变构建了18个人G6PC突变体。每个突变体携带来自犬G6Pase-α的相应氨基酸中的一种氨基酸。通过瞬时表达测定检查18个人G6Pase-α突变体的磷酸水解酶活性。结果表明，人G6PC-S298C构型是最具活性的，活性是G6PC-WT构建体活性的2.14倍(表3)。G6PC-A301V突变体也比G6PC-WT更具活性，是G6PC-WT活性的1.35倍。接着，构建双重S298C/A301V突变体(hG6PC-S298C/A301V)。此双重突变体与单一hG6PC-S298C突变体具有同样的活性(表3)。
表3.人G6PC突变体的磷酸水解酶活性
Figure GDA0002662199680000231
用pSVL载体中的人(h)G6PC野生型(WT)或hG6PC突变构建体转染的COS-1细胞的磷酸水解酶活性。数据表示为平均值±SEM。H，L和C分别表示螺旋1至9、腔环1至4或胞内环1至4中的突变位置(图2)。括号中的数字是hG6PC-WT的活性％。一式两份地进行磷酸水解酶测定。
先前已经证明，跨膜螺旋的结构完整性对于G6PC的稳定性和酶活性至关重要，并且非螺旋突变在G6PC的稳定性方面没有重要作用(Shieh等人，J Biol Chem 277:5047-5053,2002)。根据这些先前观测，G6PC的螺旋8中氨基酸残基的突变明显改变了酶活性。
为了进一步证实hG6PC-S298C构建体的功效，比较了两种人G6PC构建体pSVL-G6PC-WT和pSVL-G6PC-S298C的磷酸水解酶活性。瞬时表达测定显示，pSVL-G6PC-S298C构建体的有效性是pSVL-G6PC构建体的1.7倍(表4)。
研究已经显示，密码子优化策略可以提高翻译效率(Huston等人，Mol Ther 9:1867-1877,2011)。密码子优化(co)人G6PC的活性是G6PC-WT构建体活性的1.46倍(表4)。为了检查密码子优化的影响，构建pSVL-co-G6PC-S298C，pSVL-co-G6PC-S298C表达密码子优化的人G6PC-S298C。瞬时表达测定显示，pSVL-co-G6PC-S298C构建体的有效性是pSVL-G6PC-WT构建体的2.9倍(表4)。
表4.hG6PC-WT、hG6PC-S298C、co-hG6PC、co-hG6PC-S298C和犬G6PC的磷酸水解酶活性
Figure GDA0002662199680000241
用pSV载体中的LhG6PC-WT、hG6PC-S298C、co-hG6PC、co-hG6PC-S298C、或犬G6PC构建体转染的COS-1细胞的磷酸水解酶活性。数据表示使用三个单独批次的每种构建体进行的三次独立实验的平均值±SEM。一式两份地进行磷酸水解酶测定。括号中的数字是hG6PC-WT的活性％。
构建重组AAV8-GPE-G6PC、AAV8-GPE-co-G6PC、AAV8-GPE-G6PC-S298C和AAV8-GPE-co-G6PC-S298C载体。检查输注了AAV8-GPE-G6PC、AAV8-GPE-G6PC-S298C、AAV8-GPE-co-G6PC、或AAV8-GPE-co-G6PC-S298C载体的GSD-Ia(G6pc-/-)小鼠中的肝G6Pase活性。与体外表达研究一致，体内研究表明用于肝G6PC表达的AAV8-GPE-G6PC-S298C和AAV8-co-G6PC-S298C载体的活性是AAV8-GPE-G6PC载体的活性的3.4倍(图3)。
实施例2：对矫正肝G6Pase-α缺陷所需的最小载体剂量的评估
此实施例描述了用于确定将G6Pase-α活性恢复到阻止HCA/HCC发展并维持葡萄糖体内平衡的水平所需的最小剂量的研究。
GSD-Ia的特征为受损的葡萄糖体内平衡和长期并发症肝细胞腺瘤(HCA)(Chou等人，Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。本发明人先前已经证明了用rAAV8-G6PC治疗的G6pc-/-小鼠表达≥3％的正常肝G6Pase-α活性(其等效于≥5个单位的G6Pase-α活性；1nmol/min/mg被定义为G6Pase-α活性的一个单位)，维持葡萄糖体内平衡至P70-P90周龄并且不发展出HCA(Lee等人，Hepatology 56:1719-1729,2012；PCT公开No.WO2015/081101，其以引用方式并入本文)。
本研究使用纯化的精确确定效价的rAAV8载体(由Dimension Therapeutics,Cambridge,MA供应)进行，用以确定矫正使用G6pc-/-小鼠的肝G6Pase-α缺陷所需的rAAV载体的最小剂量。给十天龄G6pc-/-小鼠输注5×1011vg/kg的rAAV8-co-G6PC或rAAV8-co-G6PC-S298C。在24天龄时(输注后2周时)，用rAAV-co-G6PC-S298C和rAAV8-co-G6PC处理的G6pc-/-小鼠中的肝G6Pase-α活性分别为18.6±1.1和7.7±1.1单位(图5)。
已显示AAV介导的肝基因转移的效率和持续性在发育早期中较低，这是因为与肝生长相关的快速肝细胞增殖速率可以稀释有效感染AAV的细胞数量(Yiu等人，Mol Ther18:1076-1084,2010)。在输注1.5×1013vg/kg的rAAV-G6PC的两周龄G6pc-/-小鼠中，肝G6Pase-α活性在24周龄时为174.0±22.4单位。在输注1×1013vg/kg的rAAV-G6PC的四周龄G6pc-/-小鼠中，肝G6Pase-α活性在24周龄时为335.6±40.2单位，其为在2周龄时使用相同载体剂量输注的小鼠中的G6Pase-α活性的2.9倍。
因此，期望如果将相同剂量的rAAV-co-G6PC-S298C输注到4周龄的G6pc-/-小鼠中，则肝G6Pase-α活性将在24周龄时恢复至53.94(18.6×2.9)单位，远高于维持葡萄糖体内平衡和防止HCA/HCC形成所需的最小肝G6Pase-α活性(5单位)。这还满足了用于治疗GSD-Ia的rAAV介导的人类临床基因治疗试验的需要，治疗GSD-Ia需要施用≤1×1012vg/kg的AAV。
为了比较四种不同载体的相对效力，给10天龄的G6pc-/-小鼠输注5×1011vg/kg的准确确定滴度的rAAV8-G6PC或rAAV8-G6PC-S298C载体，并在24天龄时检查所治疗的G6pc-/-小鼠中的肝G6Pase-α活性。此外，给10天龄的G6pc-/-小鼠输注5×1012vg/kg的准确确定滴度的rAAV8-G6PC、rAAV8-G6PC-S298C、rAAV8-co-G6PC或rAAV8-co-G6PC-S298C，并在12周龄时检查所治疗的G6pc-/-小鼠中的肝G6Pase-α活性。本研究的结果将证明从24天龄到12周龄的转基因表达的稳定性。
未治疗的G6pc-/-小鼠具有短寿命。为了更准确地确定在成年小鼠中矫正肝G6Pase-α缺陷所需的rAAV载体的最小剂量，使用如下所述具有肝特异性G6Pase敲除并存活到成年期的L-G6pc-/-小鼠。
G6pc fx/fx小鼠含有侧面是loxP位点的G6pc基因的外显子3(Peng等人，Genesis47:590-594,2009)。将G6pc fx/fx小鼠与SAcreERT2/w小鼠杂交(Schuler等人，Genesis 39:167-172,2004)，其在血清白蛋白启动子控制下表达它莫西芬依赖性Cre重组酶，从而产生G6pcfx/fx.SAcreERT2/w小鼠。肝特异性G6pc敲除(L-G6pc-/-)是通过它莫西芬介导切除3三周龄G6pcfx/fx.SAcreERT2/w小鼠中的G6pc外显子产生的。期望100％的L-G6pc-/-小鼠将会在54周龄(G6pc基因切除51周后)时发展出HCA/HCC。
将十周龄的L-G6pc-/-小鼠用1012vg/kg的rAAV-G6PC进行治疗。结果表明，18周龄时，肝G6Pase-α活性恢复至68.9±12.8单位(图6A)。用AAV治疗的小鼠(AAV小鼠)除轻度糖原贮积外，未表现出肝组织学异常(图6B)，并且表现出正常的空腹葡萄糖耐量(FGT)谱(profile)(图6C)。此外，AAV小鼠表现出正常化的肝重(图6D)和正常化的糖原和甘油三酯的肝水平(图6E)。这些数据表明，缩小至更优化的剂量用于人临床基因治疗试验中治疗GSD-Ia是可能的。
为了检查矫正肝G6Pase-α缺陷和阻止HCA/HCC发展所需的rAAV8-G6PC、rAAV8-co-G6PC、rAAV8-G6PC-S298C和rAAV8-co-G6PC-S298C的最小剂量，将各种剂量(例如，1×1010、3×1010、1×1011、3×1011、1×1012、3×1012和1×1013)的每种载体输注到10-12周龄大的L-G6pc-/-小鼠体内。在54周龄时，测量G6Pase-α的活性。还测量和/或评估了肝组织学、FGT、肝重以及糖原和甘油三酯的肝水平。
实施例3：使用基于AAV的基因疗法治疗人GSD-Ia
此实施例描述了临床使用编码经修饰的G6PC的AAV载体来治疗GSD-Ia的示例性方法。
选择诊断患有GSD-Ia的患者进行治疗。通常患者至少18岁，并且可以预先暴露于免疫调节或可以不预先暴露于免疫调节。给患者施用治疗有效量的表达经修饰G6PC的重组AAV，诸如包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的rAAV，如本文所述。重组AAV可静脉内施用。合适的治疗剂量可由医师选择。在一些情况下，治疗有效剂量在1×1010至1×1014个病毒颗粒(vp)/kg的范围内，诸如约1×1011或1×1012vp/kg。在大多数情况下，给患者施用单剂。在缺乏免疫调节的情况下，患者可能仅能耐受rAAV的单次输注。如果受试者预先暴露于免疫调节，可以施用两或多剂。可以随时间监测受试者的健康，以确定治疗的有效性。
鉴于本发明的原理可应用于许多可能的实施方案，应当认识到，所说明的实施方案仅是本发明的优选示例，并且不应被认为是限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求书限定。因此，我们认为落入这些权利要求的范围和精神内的都属于本发明。
Figure IWB0000002418010000011
Figure IWB0000002418010000021
Figure IWB0000002418010000031
Figure IWB0000002418010000041
Figure IWB0000002418010000051
Figure IWB0000002418010000061
Figure IWB0000002418010000071
Figure IWB0000002418010000081
Figure IWB0000002418010000091
Figure IWB0000002418010000101
Figure IWB0000002418010000111
Figure IWB0000002418010000121
Figure IWB0000002418010000131
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Figure IWB0000002418010000181
Figure IWB0000002418010000191
Figure IWB0000002418010000201
Figure IWB0000002418010000211
Figure IWB0000002418010000221
Figure IWB0000002418010000231
Figure IWB0000002418010000241

Claims (22)

1.一种编码经修饰的葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α)的分离的核酸分子，其中所述经修饰的G6Pase-α的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO：9组成。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
3.一种载体，其包含根据权利要求1至2中任一项所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的载体，其中编码所述经修饰的G6Pase-α的核酸分子与启动子可操作地连接。
5.根据权利要求4所述的载体，其中所述启动子包括G6PC启动子。
6.根据权利要求5所述的载体，其中所述G6PC启动子由SEQ ID NO:4的核苷酸182-3045或SEQ ID NO:5的核苷酸182-3045组成。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的载体，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸182-4441或SEQ ID NO:5的核苷酸182-4441。
8.根据权利要求3至6中任一项所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述AAV载体是AAV血清型8(AAV8)载体。
10.根据权利要求8所述的载体，包含SEQ ID NO:4的核苷酸17-4819或SEQ ID NO:5的核苷酸17-4819。
11.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求1至2中任一项所述的核酸分子，或根据权利要求3至10中任一项所述的载体。
12.一种重组AAV(rAAV)，其包含根据权利要求1至2中任一项所述的核酸分子。
13.根据权利要求12所述的rAAV，其中所述rAAV为rAAV8。
14.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据权利要求12或13所述的rAAV。
15.根据权利要求14所述的组合物，其配制用于静脉内施用。
16.权利要求12或13的rAAV或权利要求14或15的组合物在制备用于治疗被诊断患有糖原贮积病的受试者的药物中的用途，其中所述受试者患有Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)。
17.权利要求12或13的rAAV或权利要求14或15的组合物在制备用于在具有葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6Pase-α)缺陷的受试者中促进葡萄糖体内平衡，抑制低血糖，抑制或预防肝细胞腺瘤(HCA)发展，抑制或预防肝细胞癌(HCC)发展，或抑制或预防肾功能紊乱或肾衰竭的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述具有G6Pase-α缺陷的受试者患有GSD-Ia。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其中静脉内施用所述药物。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其中以1×1010至1×1014个病毒颗粒(vp)/kg的所述rAAV的剂量施用所述药物。
21.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其中所述药物单剂施用。
22.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其中所述药物多剂施用。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190367944A1 (en) * 2017-01-30 2019-12-05 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant virus vectors for the treatment of glycogen storage disease
KR102520654B1 (ko) * 2017-03-10 2023-04-10 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 고쿠리츠 세이쿠이료켄큐센타 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 당원병 Ia형 예방 또는 치료용 조성물
JP6884268B2 (ja) 2018-03-09 2021-06-09 第一三共株式会社 糖原病Ｉａ型治療薬
DK3833746T3 (da) * 2018-08-08 2023-05-30 Genethon Mini-gde til behandlingen af glykogenlagringssygdom iii
CA3123841A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for treating glycogen storage diseases
EP3913060A1 (en) 2020-05-22 2021-11-24 Genethon Vectors encoding a glucose-6-phosphatase (g6pase-a) for gene therapy
CN111972355A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 中国医学科学院北京协和医院 GSDIa型糖原累积症小鼠模型及其构建方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
US6627425B1 (en) * 2000-06-02 2003-09-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human glucose-6-phosphatase molecules and uses thereof
US7261544B2 (en) 2003-05-21 2007-08-28 Genzyme Corporation Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
CA2713338C (en) 2008-01-29 2021-10-26 Applied Genetic Technologies Corporation Recombinant virus production using mammalian cells in suspension
WO2010109053A1 (es) 2009-03-27 2010-09-30 Proyeto De Biomedicina Cima, S.L. Métodos y composiciones para el tratamiento de cirrosis y fibrosis hepática
WO2010114948A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (raav) vectors
CA2787827C (en) 2010-01-28 2020-11-10 The Children's Hospital Of Philadelphia A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
ES2690643T3 (es) 2013-11-26 2018-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vectores virales adeno-asociados para el tratamiento de enfermedad de almacenamiento de glucógeno

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