JP2020054367A - 改変ｇ６ｐｃをコードするアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用 - Google Patents

改変ｇ６ｐｃをコードするアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ホスホヒドロラーゼ活性が増大している改変Ｇ６ＰＣ（グルコース−６−ホスファターゼ、触媒サブユニット）核酸およびグルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）酵素の提供。【解決手段】改変グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）をコードする単離された核酸分子であって、前記改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αがセリンからシステインへの置換を特定のアミノ酸配列からなるヒトＧ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸２９８に含む、単離された核酸分子。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年１２月２３日に出願された米国仮出願第６２／０９６，４００号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
本開示は、糖原病（ＧＳＤ）およびＧＳＤに伴う合併症を処置するためなどの、活性が増大した改変グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６ＰＣ）酵素をコードする遺伝子療法ベクターおよびその使用に関する。
糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａまたはフォン・ギールケ病、ＭＩＭ２３２２００）は、主に肝臓、腎臓、および腸において発現する酵素であるグルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−αまたはＧ６ＰＣ）の欠損によって引き起こされる（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、Ｇ６ＰＣ遺伝子によりコードされる、９つの膜貫通へリックスによって小胞体（ＥＲ）内に係留された疎水性タンパク質である（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。この酵素は、グリコーゲン分解および糖新生の最終ステップにおけるグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）からグルコースおよびリン酸への加水分解を触媒する。ＧＳＤ−Ｉａに罹患している患者は、グルコース恒常性を維持することができず、空腹時性低血糖、成長遅延、肝腫大、腎肥大症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症（ｌａｃｔｉｃ ａｃａｄｅｍｉａ）を示す（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。
現在のところ、ＧＳＤ−Ｉａは治癒しない。低血糖症は、食事療法を使用して管理することができ（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９４巻：４２３〜４２５頁、１９７６年；Ｃｈｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１０巻：１７１〜１７５頁、１９８４年）、これにより、患者がほぼ正常な成長および思春期発育を達成することが可能になる。しかし、長期間の臨床的合併症、およびそれらの基礎をなす病理学的プロセスは修正されないままである。最も重要な慢性リスクのうちの１つは肝細胞腺腫（ＨＣＡ）であり、これは２５歳を超えるＧＳＤ−Ｉ患者の７０〜８０％で発生する（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年；Ｌａｂｒｕｎｅら、Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ２４巻：２７６〜２７９頁、１９９７年；Ｒａｋｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １６１巻（補遺１）：Ｓ２０〜Ｓ３４頁、２００２年）。ＧＳＤ−Ｉａ患者におけるＨＣＡは、小さく、多発性であり、非被包性であり、局所圧迫および腫瘍内出血を含めた合併症を伴う。ＧＳＤ−Ｉａ患者の１０％で、ＨＣＡは悪性転換して肝細胞癌（ＨＣＣ）になる（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年；Ｒａｋｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １６１巻（補遺１）：Ｓ２０〜Ｓ３４頁、２００２年；Ｆｒａｎｃｏら、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２８巻：１５３〜１６２頁、２００５年）。
ＧＳＤ−Ｉａの動物モデルにおいて、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用した遺伝子療法試験が以前実施されたが、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏の完全な補正は誰にもできていない。そのため、ＧＳＤ−Ｉａおよびその関連する合併症の処置のための遺伝子療法ベクターの改善に対する必要性がある。
Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２０１０年）６巻：６７６〜６８８頁 Ｇｒｅｅｎｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９７６年）２９４巻：４２３〜４２５頁 Ｃｈｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９８４年）３１０巻：１７１〜１７５頁
イヌＧ６Ｐａｓｅ−α酵素がヒトＧ６Ｐａｓｅ−α酵素よりも活性であることが本明細書に開示されている。２つのタンパク質のアミノ酸配列アラインメントは、それらが主に１８残基で異なっていることを明らかにした。ホスホヒドロラーゼ活性が増大したヒトＧ６Ｐａｓｅ−α変異体を同定するために、イヌＧ６Ｐａｓｅ−α由来の１つまたは２つの対応するアミノ酸を含有する変異体が生成された。
本発明では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする単離された核酸分子が提供される。一部の実施形態では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、配列番号８の改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αのように、セリンからシステインへの置換をヒトＧ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸２９８に含む。いくつかの例では、核酸分子は、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
改変ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αをコードする開示されている核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのベクターがさらに提供される。いくつかの例では、ベクターは、ヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）などのプロモーターをさらに含む。
改変ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αをコードする核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）も提供される。さらに、本明細書に開示されている核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。例えば、単離された宿主細胞は、ｒＡＡＶの増殖に適した細胞であってよい。
開示されている核酸分子、ベクターおよびｒＡＡＶを含む組成物は、本開示によりさらに提供される。
糖原病と診断された被験体を処置する方法がさらに提供される。一部の実施形態では、方法は、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）の被験体を選択するステップと、被験体に、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶを含む組成物を投与するステップとを含む。
Ｇ６Ｐａｓｅ−αの欠乏を有する被験体において、被験体に治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む組成物を投与することによって、グルコース恒常性を促進する；低血糖を阻害する；ＨＣＡの発症を阻害するもしくは予防する；ＨＣＣの発症を阻害するもしくは予防する；腎臓の機能障害もしくは不全を阻害するもしくは予防する；またはＧＳＤ−Ｉａに伴う任意の他の合併症を処置する方法も提供される。
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進める以下の発明の詳細な説明からより明白なものになろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
改変グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）をコードする単離された核酸分子であって、前記改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αがセリンからシステインへの置換をヒトＧ６Ｐａｓｅ−α（配列番号２）のアミノ酸２９８に含む、単離された核酸分子。
（項目２）
前記改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸配列が、配列番号８を含むまたはそれからなる、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）
配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含む、項目１または項目２に記載の単離された核酸分子。
（項目４）
項目１から３までのいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目５）
前記改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする前記核酸分子がプロモーターに作動可能に連結されている、項目４に記載のベクター。
（項目６）
前記プロモーターがＧ６ＰＣプロモーターを含む、項目５に記載のベクター。
（項目７）
前記Ｇ６ＰＣプロモーターが配列番号４のヌクレオチド１８２〜３０４５または配列番号５のヌクレオチド１８２〜３０４５を含む、項目６に記載のベクター。
（項目８）
配列番号４のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号５のヌクレオチド１８２〜４４４１を含む、項目４から７までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目９）
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目４から８までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目１０）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターである、項目９に記載のベクター。
（項目１１）
配列番号４のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号５のヌクレオチド１７〜４８１９を含む、項目９または項目１０に記載のベクター。
（項目１２）
項目１から３までのいずれか一項に記載の核酸分子または項目４から１１までのいずれか一項に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
（項目１３）
項目１から３までのいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
（項目１４）
前記ｒＡＡＶがｒＡＡＶ８である、項目８に記載のｒＡＡＶ。
（項目１５）
薬学的に許容される担体中に項目１３または項目１４に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
（項目１６）
静脈内投与用に製剤化されている、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）を有する被験体を選択するステップと、前記被験体に、治療有効量の項目１３もしくは項目１４に記載のｒＡＡＶまたは項目１５もしくは項目１６に記載の組成物を投与するステップとを含む、方法。
（項目１８）
グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）の欠乏を有する被験体において、前記被験体に、治療有効量の項目１３もしくは項目１４に記載のｒＡＡＶまたは項目１５もしくは項目１６に記載の組成物を投与するステップを含む、グルコース恒常性を促進する；低血糖を阻害する；肝細胞腺腫（ＨＣＡ）の発症を阻害するもしくは予防する；肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を阻害するもしくは予防する；または腎臓の機能障害もしくは不全を阻害するもしくは予防する方法。
（項目１９）
Ｇ６Ｐａｓｅ−αの欠乏を有する前記被験体がＧＳＤ−Ｉａを有する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ｒＡＡＶを静脈内に投与する、項目１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ｒＡＡＶを約１×１０１０から約１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの用量で投与する、項目１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ｒＡＡＶを投与するステップが単回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１７から２１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記ｒＡＡＶを投与するステップが複数回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１７から２１までのいずれか一項に記載の方法。
図１は、イヌ（配列番号１）およびヒト（配列番号２）Ｇ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列のアラインメントである。イヌ配列とヒト配列との間で異なっている１８個のアミノ酸残基は、矢印によって示されている。
図２は、９つのヘリックス、Ｈ１からＨ９によって小胞体膜に係留されたヒトＧ６Ｐａｓｅ−αを示す（Ｐａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３巻：６１４４〜６１４８頁、１９９８年）。ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αとイヌＧ６Ｐａｓｅ−αとの間のアミノ酸差異は列挙されている。
図３は、２週齢時にヒトＧ６ＰＣ（ＡＡＶ−Ｇ６ＰＣ）、コドン最適化（ｃｏ）ヒトＧ６ＰＣ（ＡＡＶ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ）、ヒトＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ変異体（ＡＡＶ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ）またはｃｏ−ヒトＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ変異体（ＡＡＶ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ）を発現する組換えＡＡＶ８−ＧＰＥベクター（１０１３ｖｇ／ｋｇ）を形質導入された４週齢ＧＳＤ−Ｉａ（Ｇ６ｐｃ−／−）マウスでの肝臓ミクロソームのＧ６Ｐａｓｅ−α活性を示すグラフである。４週齢野生型マウスでの肝臓ミクロソームのＧ６Ｐａｓｅ−α活性は平均２２７．５±１７．６ｎｍｏｌ／分／ｍｇであった。データは平均±ＳＥＭとして示されている。＊＊Ｐ＜０．００５。
図４は、１８個のヒトＧ６ＰＣ変異体それぞれの位置が示されているＧ６ＰＣ ｃＤＮＡ（配列番号１１）のヌクレオチド配列を示す。部位特異的変異誘発について、２０個のヌクレオチドセンスおよびアンチセンスプライマーは、変異されたコドンが各プライマーの中央に位置付けられるように設計された。
図５は、１０日齢時に５×１０１１ｖｇ／ｋｇ ＡＡＶ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣベクター（ｎ＝３）またはｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃベクター（ｎ＝３）で形質導入した２４日齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスでの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を示すグラフである。野生型肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性は、平均１７４±１８．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇであった。データは平均±ＳＥＭを示している。＊＊Ｐ＜０．００５。
図６Ａ〜６Ｅは、ｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣによる肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏の補正を実証するデータを示す。Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−マウスは１０週齢時に１×１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣで処置され、１８週齢時に分析された。図６Ａは、対照（ｎ＝７）、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−（ｎ＝７）およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）における肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を示すグラフである。図６Ｂは、対照、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−およびＡＡＶマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色肝臓の画像である。図６Ｃは、対照（ｎ＝１３）、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−（ｎ＝６）およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）の空腹時耐糖能（ＦＧＴ）を示すグラフである。図６Ｄは、対照、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）の肝臓重量を示すグラフである。図６Ｅは、対照、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）のグリコーゲンおよびトリグリセリドの肝臓含有量を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭを示している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。 図６Ａ〜６Ｅは、ｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣによる肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏の補正を実証するデータを示す。Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−マウスは１０週齢時に１×１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣで処置され、１８週齢時に分析された。図６Ａは、対照（ｎ＝７）、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−（ｎ＝７）およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）における肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を示すグラフである。図６Ｂは、対照、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−およびＡＡＶマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色肝臓の画像である。図６Ｃは、対照（ｎ＝１３）、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−（ｎ＝６）およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）の空腹時耐糖能（ＦＧＴ）を示すグラフである。図６Ｄは、対照、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）の肝臓重量を示すグラフである。図６Ｅは、対照、Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−およびＡＡＶマウス（ｎ＝８）のグリコーゲンおよびトリグリセリドの肝臓含有量を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭを示している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいずれの言及にも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、２０１５年１２月２２日に作成された、５２．８ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、これは、参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表では：
配列番号１は、イヌＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、以下の特徴を有するｐＴＲ−ＧＰＥ−ヒトＧ６ＰＣのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ−ヌクレオチド１７〜１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー−ヌクレオチド１８２〜３０４５
スタッファー−ヌクレオチド３０５１〜３１８４
イントロン−ヌクレオチド３１８５〜３３２１
スタッファー−ヌクレオチド３３２２〜３３６７
Ｇ６ＰＣコード配列−ヌクレオチド３３６８〜４４４１
ＩＴＲ−ヌクレオチド４６７４〜４８１９
配列番号４は、以下の特徴を有するｐＴＲ−ＧＰＥ−ヒトＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ−ヌクレオチド１７〜１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー−ヌクレオチド１８２〜３０４５
スタッファー−ヌクレオチド３０５１〜３１８４
イントロン−ヌクレオチド３１８５〜３３２１
スタッファー−ヌクレオチド３３２２〜３３６７
Ｇ６ＰＣコード配列−ヌクレオチド３３６８〜４４４１
Ｓ２９８Ｃ変異−ヌクレオチド４２５９〜４２６１（ＴＣＴからＴＧＣ）
ＩＴＲ−ヌクレオチド４６７４〜４８１９
配列番号５は、以下の特徴を有するｐＴＲ−ＧＰＥ−コドン最適化（ｃｏ）Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ−ヌクレオチド１７〜１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー−ヌクレオチド１８２〜３０４５
スタッファー−ヌクレオチド３０５１〜３１８４
イントロン−ヌクレオチド３１８５〜３３２１
スタッファー−ヌクレオチド３３２２〜３３６７
コドン最適化Ｇ６ＰＣコード配列−ヌクレオチド３３６８〜４４４１
Ｓ２９８Ｃ変異−ヌクレオチド４２５９〜４２６１（ＡＧＣからＴＧＣ）
ＩＴＲ−ヌクレオチド４６７４〜４８１９
配列番号６は、Ｓ２９８Ｃ Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする改変ヒトＧ６ＰＣのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、Ｓ２９８Ｃ Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードするコドン最適化、改変ヒトＧ６ＰＣのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、改変ヒトＳ２９８Ｃ Ｇ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸配列である。
配列番号９は、改変ヒトＳ２９８Ｃ／Ａ３０１Ｖ Ｇ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ヒトおよびイヌＧ６Ｐａｓｅ−αのアラインメントに基づくアミノ酸コンセンサス配列である。
配列番号１１は、ヒトＧ６ＰＣコード領域のヌクレオチド配列である。
詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルス
ＣＢＡ ニワトリβ−アクチン
ＣＭＶ サイトメガロウイルス
ｃｏ コドン最適化
ＦＧＴ 空腹時耐糖能
Ｇ６Ｐ グルコース−６−リン酸
Ｇ６Ｐａｓｅ−α グルコース−６−ホスファターゼ−α
Ｇ６ＰＣ グルコース−６−ホスファターゼ、触媒サブユニット
Ｇ６ＰＴ グルコース−６−リン酸トランスポーター
ＧＰＥ Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー
ＧＳＤ 糖原病
ＨＣＡ 肝細胞腺腫
ＨＣＣ 肝細胞癌
ＩＴＲ 末端逆位配列
ＯＲＦ オープンリーディングフレーム
ｒＡＡＶ 組換えＡＡＶ
ＳＥＭ 標準誤差
ｖｇ ウイルスゲノム
ｖｐ ウイルス粒子
ＷＴ 野生型
ＩＩ．用語および方法
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学において一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊、１９９４年（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、１９９４年（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．刊、１９９５年（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
本開示の種々の実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提示する：
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染する、小さな、複製欠損性の、エンベロープを有さないウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、また、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用した遺伝子療法ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染させることができ、宿主細胞のゲノムに組み込まずに、染色体外の状態で持続させることができる。これらの特徴により、ＡＡＶは遺伝子療法のための魅力的なウイルスベクターになっている。現在、１１種類のＡＡＶの血清型（ＡＡＶ１〜１１）が認識されている。
投与／投与する：被験体に治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）などの薬剤を任意の有効な経路によって提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、これだけに限定されないが、注射経路（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、および静脈内注射など）、経口経路、管内経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路および吸入経路が挙げられる。
コドン最適化された：「コドン最適化された」核酸とは、コドンが特定の系（特定の種または種の群など）における発現に最適なものになるように変更された核酸配列を指す。例えば、核酸配列を、哺乳動物細胞における発現または特定の哺乳動物種（ヒト細胞など）における発現のために最適化することができる。コドン最適化により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変更されない。
エンハンサー：プロモーターの活性を増大させることによって転写の速度を増大させる核酸配列。
Ｇ６ＰＣ：ヒト染色体１７ｑ２１に位置する、グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）をコードする遺伝子である。Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、３５７アミノ酸の疎水性タンパク質であり、それを小胞体内に固定する９つのへリックスを有する（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、図２に描示されている。Ｇ６Ｐａｓｅ−αタンパク質は、糖新生およびグリコーゲン分解の最終ステップにおけるグルコース６−リン酸からグルコースおよびリン酸への加水分解を触媒し、また、グルコース恒常性において重要な酵素である。Ｇ６ＰＣ遺伝子の欠失変異により、肝臓および腎臓におけるグリコーゲンおよび脂肪の蓄積に伴う重度の空腹時性低血糖を特徴とする代謝障害である糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）が引き起こされる。
糖原病（ＧＳＤ）：筋肉、肝臓および他の組織内でのグリコーゲンの合成または分解のプロセシングの欠損に起因する疾患の群である。ＧＳＤは、遺伝的なものか、または後天性のもののいずれかであり得る。遺伝的ＧＳＤは、これらのプロセスに関与する代謝の任意の先天的なエラーによって引き起こされる。現在１１種の糖原病（ＧＳＤ Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型、ＸＩＩ型およびＸＩＩＩ型）が認識されている。ＧＳＤ−Ｉは、２つの常染色体劣性障害、ＧＳＤ−ＩａおよびＧＳＤ−Ｉｂからなる（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。ＧＳＤ−Ｉａは、グルコース−６−ホスファターゼ−αの欠損によって生じる。グルコース−６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）の欠損はＧＳＤ−Ｉｂの原因となる。
糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）：フォン・ギールケ病としても知られているＧＳＤ−Ｉａは、最も一般的な糖原病であり、発生率は出生数１００，０００人に約１人である。ＧＳＤ−Ｉａは、酵素であるグルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）の欠損によって生じる遺伝子疾患である。Ｇ６Ｐａｓｅ−αの欠損により、グリコーゲンから、および糖新生から遊離のグルコースを産生する肝臓の能力が損なわれる。ＧＳＤ−Ｉａに罹患している患者は、グルコース恒常性を維持することができず、空腹時性低血糖、成長遅延、肝腫大、腎肥大症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症を示す（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。現在、ＧＳＤ−Ｉａは治癒できない。
イントロン：タンパク質のコード情報を含有しない遺伝子内のひと続きのＤＮＡである。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。
末端逆位配列（ＩＴＲ）：効率的な複製のために必要な、アデノ随伴ウイルスのゲノム内の対称的な核酸配列である。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡの合成のための複製起点としての機能を果たし、また、ＡＡＶ組み込みベクターを生成するために必須のシス成分である。
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞など）は、生物の細胞もしくは組織内の他の生物学的成分、または、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞などの成分が天然に存在する生物自体から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質とは、標準の精製方法によって精製されたものを含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質も包含する。
改変：本開示の内容では、「改変」Ｇ６ＰＣまたはＧ６Ｐａｓｅ−αは、野生型配列と比較して（配列番号３のヌクレオチド３３６８〜４４４１として記載のヒトＧ６ＰＣコード配列と比較して、または配列番号２として記載のヒトＧ６Ｐａｓｅ−αアミノ酸配列と比べてなど）少なくとも１つの核酸またはアミノ酸置換、欠失または挿入を含むＧ６ＰＣ核酸配列またはＧ６Ｐａｓｅ−αアミノ酸配列を指す。
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、必要であれば、同じ読み枠内の２つのタンパク質コード領域をつないでいる。
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ著、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）には、１種または複数の治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口用製剤は、通常、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的かつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセルの形態）に関しては、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの非毒性の補助物質を微量に含有してよい。
疾患を予防すること、処置することまたは好転させること：疾患（ＧＳＤ−Ｉａなど）を「予防すること」とは、疾患の完全な発生を阻害することを指す。「処置すること」とは、疾患または病的状態の徴候または症状を、それが発生し始めた後に好転させる治療介入を指す。「好転させる」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度を低減することを指す。
プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を指向／開始するＤＮＡの領域である。プロモーターは、転写の開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。一般には、プロモーターは、転写させる遺伝子の近くに位置する。プロモーターは、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を求めるものではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物とは、天然に付随するタンパク質および他の混入物から全体的にまたは部分的に単離されたものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離し、分画に供して最初の調製物の種々の成分、例えば、タンパク質、細胞破片（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｂｒｉｓ）、および他の成分などを除去したペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を指す。
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するもの、または、そうでなければ分離している２つの配列のセグメントの人工的な組合せによってできた配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成によって、または単離された核酸分子のセグメントを人工的に操作することによって、例えば、遺伝子工学の技法などによって成し遂げることができる。
同様に、組換えウイルスは、天然に存在しないまたは起源が異なる少なくとも２つの配列の人工的な組合せによってできた配列（ゲノム配列など）を含むウイルスである。「組換え」という用語は、単に天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によって変更された核酸、タンパク質およびウイルスも含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」とは、組換え核酸分子（Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする組換え核酸分子など）がパッケージングされたＡＡＶ粒子を指す。
配列同一性：２つもしくはそれ超の核酸配列、または２つもしくはそれ超のアミノ酸配列の間の同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性に関して表現される。配列同一性は、同一性の百分率の単位で測定することができ、百分率が高いほど、配列の同一性が大きい。配列類似性は、類似性の百分率の単位で（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）測定することができ、百分率が高いほど、配列の類似性が大きい。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準の方法を使用してアラインした場合に、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より密接に関連する種に由来する場合（ヒト配列とマウス配列など）、関連性がより遠い種（ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列など）と比較してより有意である。
比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻：４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８５巻：２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻：２３７〜４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５巻：１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６巻：１０８８１〜９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．２４巻：３０７〜３１頁、１９９４年に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年には、配列アラインメント方法および相同性の算出に関する詳細な考察が示されている。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含めたいくつかの供給源から、インターネット上で入手可能である。追加的な情報は、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる。
血清型：特徴的な抗原のセットによって区別される、密接に関連する微生物の群（ウイルスなど）である。
スタッファー配列：一般には、２つの核酸特徴の間（プロモーターとコード配列の間など）に所望の間隔を作るため、または核酸分子を所望の長さになるように伸長させるために使用される、より大きな核酸分子（ベクターなど）内に含有されるヌクレオチドの配列を指す。スタッファー配列は、タンパク質コード情報を含有せず、起源不明／合成起源であってよく、かつ／または、より大きな核酸分子内の他の核酸配列と無関係なものであってよい。
被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物である。
合成：実験室において人工的な手段によって作製されたものであり、例えば、合成核酸は、実験室において化学的に合成することができる。
治療有効量：指定の医薬品または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の、その剤を用いて処置する被験体、または細胞において所望の効果を実現するために十分な数量である。剤の有効量は、これだけに限定されないが、処置される被験体または細胞、および治療用組成物の投与様式を含めたいくつかの因子に左右される。
ベクター：ベクターは、ベクターが複製し、かつ／または宿主細胞に組み込む能力を乱すことなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝エレメントも含み得る。発現ベクターは、挿入される遺伝子（複数可）の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含有するベクターである。本明細書の一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
特に説明がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数の用語「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明らかでない限り、複数の言及を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａを含む、またはＢを含む、あるいはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値はおよそのものであり、説明のために提示されている。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、本明細書が用語の説明を含め、支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
ＩＩＩ．導入
糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）は、グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−αまたはＧ６ＰＣ）の欠乏によって生じる生命を脅かす低血糖、肝臓悪性疾患および腎不全に関連する代謝の遺伝性障害であり、主に肝臓および腎臓を侵す。現在の治療法は、成長不全、痛風、肺高血圧症、腎不全の危険がある腎機能障害、骨粗鬆症および、悪性転換して肝細胞癌になる場合がある肝細胞腺腫（ＨＣＡ）を含む長期合併症を多くの患者において予防できない（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２巻：１２１〜１４３頁、２００２年、Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。したがって遺伝子療法などの新規治療法の開発は、ＧＳＤ−Ｉａのための根治的処置の可能性として正当化される（Ｃｈｏｕら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １１巻：１０１１〜１０２４頁、２０１１年）。
機能性Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは記載されている（ＣｈｏｕおよびＭａｎｓｆｉｅｌｄ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １１巻：１０１１〜１０２４頁、２０１１年に総説されている）。ＧＳＤ−Ｉａのマウスモデルを使用した以前の試験では、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶは、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサー（Ｇｈｏｓｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年）、イヌＧ６ＰＣプロモーター（Ｋｏｅｂｅｒｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３巻：１２８１〜１２８９頁、２００６年）、またはＧ６ＰＣ ５’フランキング領域のヌクレオチド−２９８〜＋１２８にあるヒトＧ６ＰＣプロモーター（Ｋｏｅｂｅｒｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）により導かれ、Ｇ６Ｐａｓｅ−α導入遺伝子を肝臓に送達し、この障害の長期の修正を実現することが示されている。しかし、これらの試験で見込みは示されたが、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠損の完全な修正は誰にもできていない。
先行研究の一例は、ＧＳＤ−ＩａマウスおよびＧＳＤ−Ｉａイヌ（ｄｏｇ）を処置できた２本鎖ｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−Ｇ６Ｐａｓｅ）を開発したＫｏｅｂｅｒｌらによって記載されている（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）。さらにＹｉｕら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）およびＬｅｅら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年）は、同様に効果的な１本鎖ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣの開発を記載している。２つのベクターは、いくつかの点で異なっている。第１にｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣは１本鎖ｒＡＡＶベクターである一方で、ｒＡＡＶ−Ｇ６Ｐａｓｅは２本鎖ｒＡＡＶベクターである。２本鎖ｒＡＡＶベクターは、１本鎖ＤＮＡゲノムを２本鎖ＤＮＡゲノムに転換することによってＡＡＶのライフサイクルにおける律速ステップを回避するために開発された（Ｃｈｏｕら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １１巻：１０１１〜１０２４頁、２０１１年）。第２にｒＡＡＶ−Ｇ６ＰａｓｅでのＧ６Ｐａｓｅ−αの発現は、ヌクレオチド−３８２から−１のヒトＧ６ＰＣ最小プロモーター／エンハンサーによって導かれる（Ｋｏｅｂｅｒｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）。ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣでのＧ６Ｐａｓｅ−αの発現は、ヌクレオチド−２８６４から−１のヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）によって導かれる（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年、Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年）。第３にｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクターはｒＡＡＶ−Ｇ６Ｐａｓｅベクターに存在しないイントロンを含有している。両方のベクターは、Ｇ６Ｐａｓｅ−α導入遺伝子を肝臓に効率的に送達し、マウスＧＳＤ−Ｉａを補正した（Ｋｏｅｂｅｒｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年、Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年、Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年）。
比較研究は、どちらのベクター、ｒＡＡＶ−Ｇ６ＰａｓｅまたはｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣが、ＧＳＤ−Ｉａを処置することにより効果的であるかを決定するために実施された。結果は、マウスＧＳＤ−Ｉａを補正することにおいてｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクターがｒＡＡＶ−Ｇ６Ｐａｓｅベクターよりも効率的であったことを明白に示した。Ｇ６ＰＣ最小プロモーターの上流のエンハンサーエレメントは効率的な肝臓導入遺伝子発現のために必要であったことが決定された（Ｌｅｅら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ １０巻：２７５〜２８０頁、２０１３年）。ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクター内に含有されたイントロンが肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現を導く役割を演じるかどうかを決定するために追加的研究が実行された。ヌクレオチド−３８２から−１のヒトＧ６ＰＣ最小プロモーターによって導かれ、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクター中に存在するイントロンを含有するヒトＧ６Ｐａｓｅ−αを発現する２本鎖ｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥ−Ｇ６ＰＣと称される）が生成された。結果は、マウスＧＳＤ−Ｉａを処置することにおいてｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクターがｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクターよりも効率的であったことを示し、Ｇ６ＰＣ最小プロモーターの上流のエンハンサーエレメントが効率的な肝臓導入遺伝子発現のために必要であるという結論を支持している（Ｌｅｅら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ １０巻：２７５〜２８０頁、２０１３年）。
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）エレメントを含む組換えＡＡＶベクターは、参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０８１１０１号にさらに記載される。組換えベクターは、ＧＰＥ、合成イントロン、およびＧ６ＰＣコード領域を含む。Ｇ６ＰＣコード領域は、必要に応じて、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。組換えベクターは、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーとイントロンの間ならびにイントロンとＧ６ＰＣコード配列の間に置かれたスタッファー核酸配列；および５’および３’末端逆位配列（ＩＴＲ）配列をさらに含む。
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ）を伴う、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける肝臓導入遺伝子の発現の指向に関して、代替プロモーター／エンハンサー（すなわち、ニワトリβ−アクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサー）を有する別のＧ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶよりも著しく効率的であることがＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０８１１０１に開示されている。２４週間の試験期間にわたって、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣを用いて処置したＧ６ＰＣ欠損マウス（ＧＳＤ−Ｉａに関するモデル）では、血中グルコース、血中代謝産物、肝臓グリコーゲンおよび肝臓脂肪のレベルが正常であることによって証明されるように、肝臓Ｇ６ＰＣ欠損の完全な正常化が示された（また、Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年を参照されたい）。さらに、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスの長期試験により、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣによって媒介される遺伝子療法が、３％超の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現するマウスにおいて少なくとも７０〜９０週間にわたって効果的であることが実証された。具体的には、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣで処置したマウスでは、正常な肝臓脂肪の貯蔵、正常な血中代謝産物および耐糖能プロファイル、空腹時血中インスリンレベルの低下が示され、肝細胞腺腫などの肝臓の異常の証拠はなかった（また、Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年を参照されたい）。
さらに、Ｇ６ＰＣプロモーターの上流のエンハンサーエレメントが、ＧＳＤ−Ｉａの動物モデルにおける最適なＧ６ＰＣ発現のために極めて重要であるという所見がＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０８１１０１に開示された。詳細には、ヌクレオチド−２６８４〜−１（Ｇ６ＰＣ開始部位に対して）にＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを含むｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣを用いた処置により、３８３ｂｐの最小Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーのみを含有する、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶと比較して、ＧＳＤ−Ｉａのマウスモデルにおいて、有意に高いレベルの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現が生じ、肝臓グリコーゲン蓄積のより大きな減少が実現され、また、より良好な絶食耐性（ｔｏｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｓｔｉｎｇ）につながることが実証された（また、Ｌｅｅら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．１１０巻（３号）：２７５〜２８０頁、２０１３年を参照されたい）。
ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０８１１０１には、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーとイントロンの間ならびにイントロンとＧ６ＰＣコード配列の間に存在するスタッファーヌクレオチド配列が、Ｇ６Ｐａｓｅ−αの肝臓形質導入および発現のために重要であるという所見も開示された。具体的には、スタッファー配列を欠くプラスミドＵＦ１１−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣから作製した組換えＡＡＶでは、７．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇのＧ６Ｐａｓｅ活性が示された。比較すると、プラスミドＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣから作製した組換えＡＡＶでは、３３．０ｎｍｏｌ／分／ｍｇのＧ６Ｐａｓｅ活性が示された。
さらに、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０８１１０１に開示されているデータは、Ｇ６ＰＣコード配列のコドン最適化により、ｒＡＡＶ−ｃｏ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ（コドン最適化されたＧ６ＰＣ核酸配列を含有する）の投与後には、野生型Ｇ６ＰＣをコードするｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣの投与と比較して翻訳の効率がおよそ１．５〜２．５倍上昇し、その結果、肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅ−α発現が有意に大きくなることを実証した。
したがって、ヌクレオチド−２６８４〜−１におけるＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー、合成イントロン、イントロンに隣接するスタッファー配列、およびＧ６ＰＣコード領域（野生型またはコドン最適化された）を含む組換えＡＡＶが、効率的な肝臓導入遺伝子の発現およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＳＤ−Ｉａの処置のために重要な特徴である。
本開示は、ヒトＧ６ＰＣが、コードされるＧ６Ｐａｓｅ−α酵素のホスホヒドロラーゼ活性を増強するために特異的位置で改変され得ることを初めて示す。改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αコード配列は、糖原病の処置有効性を増強するためにｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターに組み入れられてよい。
ＩＶ．いくつかの実施形態の概要
本明細書では、イヌＧ６Ｐａｓｅ−α酵素がヒトＧ６Ｐａｓｅ−α酵素よりも活性であることが開示される。２つのタンパク質のアミノ酸アラインメントは、それらが１８個の残基で配列において異なっていることを明らかにした。ホスホヒドロラーゼ活性が増大しているヒトＧ６Ｐａｓｅ−α変異体を同定するために、イヌＧ６Ｐａｓｅ−α由来の少なくとも１つの対応するアミノ酸を含有する変異体が生成された。
本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ−Ｉａを処置するための遺伝子療法の適用において使用することができる組換え核酸分子、ＡＡＶベクターおよび組換えＡＡＶが提供される。
一部の実施形態では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする単離された核酸分子であって、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αがセリンからシステインへの置換をヒトＧ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸２９８（野生型ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸配列は本明細書で配列番号２として記載される）に含む単離された核酸分子が提供される。改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、タンパク質が酵素活性を保持している限り追加的残基に改変を含んでよい。例えば改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、イヌＧ６Ｐａｓｅ−α配列とヒトＧ６Ｐａｓｅ−α配列との間で異なる他の残基に置換を含んでよく、そのような残基は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−α（配列番号２として記載）の３、５４、１３９、１９６、１９９、２４２、２４７、２９２、３０１、３１８、３２４、３３２、３４７、３４９、３５０および／または３５３位を含む。図１は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列とイヌＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列のアラインメントを示し、表２は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αとイヌＧ６Ｐａｓｅ−αとの間のアミノ酸差異の要約を提供する。本開示は、上および表２に列挙されている残基の１つまたは複数でアミノ酸配列を変更させるヌクレオチド置換を企図する。
いくつかの例では、核酸分子は、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、アミノ酸２９８にセリンからシステインへの置換を有するアミノ酸配列を有する改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする。具体的な例では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸配列は、配列番号８（ヒトＳ２９８Ｃ Ｇ６Ｐａｓｅ−α）を含むまたはそれからなる。他の具体的な例では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αのアミノ酸配列は、配列番号９（ヒトＳ２９８Ｃ／Ａ３０１Ｖ Ｇ６Ｐａｓｅ−α）を含むまたはそれからなる。非限定的な例では、単離された核酸分子は、配列番号６（Ｓ２９８Ｃ Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする改変ヒトＧ６ＰＣ）または配列番号７（Ｓ２９８Ｃ Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードするコドン最適化改変ヒトＧ６ＰＣ）のヌクレオチド配列を含む。
本発明では改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする単離された核酸分子を含むベクターも提供される。一部の実施形態では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする核酸分子は、Ｇ６ＰＣプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの例では、Ｇ６ＰＣプロモーターは、配列番号４（ヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー）のヌクレオチド１８２〜３０４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である、または配列番号５（ヒトコドン最適化Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー）の１８２〜３０４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である。非限定的な例では、Ｇ６ＰＣプロモーターは、配列番号４のヌクレオチド１８２〜３０４５または配列番号５のヌクレオチド１８２〜３０４５を含む。
いくつかの例では、ベクターは、配列番号４のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号５のヌクレオチド１８２〜４４４１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の非限定的な例では、ベクターは、配列番号４のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号５のヌクレオチド１８２〜４４４１を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶ血清型は、導入遺伝子を被験体に送達するのに適した任意の血清型であってよい。いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、血清型８ＡＡＶ（ＡＡＶ８）である。他の例では、ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１または１２ベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２）である。さらに他の例では、ＡＡＶベクターは、２つまたはそれ超のＡＡＶ血清型のハイブリッド（これだけに限定されないが、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９など）である。ＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子療法の標的とされる細胞型（複数可）に一部依存する。ＧＳＤ−Ｉａの処置に関しては、肝臓および腎臓が関連する標的器官である。
ＡＡＶベクターが使用される場合、ベクターは、末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む場合がある。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号４のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号５のヌクレオチド１７〜４８１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、配列番号４のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号５のヌクレオチド１７〜４８１９を含む。
本明細書では、本明細書に開示されている核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞も提供される。例えば、単離された宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を作製するのに適した細胞（または細胞株）であってよい。いくつかの例では、宿主細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、Ａ５４９細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＡＲＰＥ−１９細胞、またはＭＲＣ−５細胞などの哺乳動物細胞である。
さらに、本明細書に開示されている核酸分子を含むｒＡＡＶが提供される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ８および／またはｒＡＡＶ２である。しかし、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２などの任意の他の適切なＡＡＶ血清型、または２つもしくはそれ超のＡＡＶ血清型のハイブリッド（これだけに限定されないが、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９など）であってよい。本明細書に開示されているｒＡＡＶと薬学的に許容される担体とを含む組成物も本開示により提供される。一部の実施形態では、組成物を静脈内投与または筋肉内投与用に製剤化する。ｒＡＡＶを投与するための適切な医薬製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２１９５２８号（参考として本明細書に援用される）に見出すことができる。
さらに、糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、ＧＳＤ−Ｉａの被験体を選択するステップと、被験体に、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶ（またはｒＡＡＶを含む組成物）を投与するステップとを含む方法が提供される。
グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）の欠乏を有する被験体において、グルコース恒常性を促進する；低血糖を阻害する；肝細胞腺腫（ＨＣＡ）の発症を阻害するもしくは予防する；肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を阻害するもしくは予防する；腎臓の機能障害もしくは不全を阻害するもしくは予防する；成長遅延を阻害するもしくは予防する；肝腫大を阻害するもしくは予防する；腎肥大症を阻害するもしくは予防する；高脂血症を阻害するもしくは予防する；肺高血圧症を阻害するもしくは予防する；またはＧＳＤ−Ｉａに伴う任意の他の合併症を処置する、予防するもしくは阻害する方法も、本開示によって提供される。一部の実施形態では、方法は、被験体に、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶ（またはｒＡＡＶを含む組成物）を投与するステップを含む。一部の実施形態では、Ｇ６Ｐａｓｅ−αの欠乏を有する被験体は、ＧＳＤ−Ｉａを有する被験体である。したがって、いくつかの例では、方法は、ＧＳＤ−Ｉａを有する被験体を選択するステップを含む。
本明細書に開示されている方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内に投与される。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶを、約１×１０１０〜約１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの用量で投与する。いくつかの例では、ｒＡＡＶを、約１×１０１１〜約８×１０１３ｖｐ／ｋｇまたは約１×１０１２〜約８×１０１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。他の例では、ｒＡＡＶを、約１×１０１３〜約６×１０１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。特定の非限定的な例では、ｒＡＡＶを、少なくとも約１×１０１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１３ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。他の非限定的な例では、ｒＡＡＶを、約１×１０１０ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０１０ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０１１ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０１１ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０１２ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０１２ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０１３ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０１３ｖｐ／ｋｇ以下、または約１×１０１４ｖｐ／ｋｇ以下の用量で投与する。１つの非限定的な例では、ｒＡＡＶを、約１×１０１２ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。別の非限定的な例では、ｒＡＡＶを、約１×１０１１ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。ｒＡＡＶは、所望の治療結果のために、必要に応じて、単回用量で、または複数回用量（２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量または１０用量など）で投与することができる。
Ｖ．改変ヒトＧ６ＰＣ／Ｇ６Ｐａｓｅ−α配列
イヌＧ６Ｐａｓｅ−α酵素がヒトＧ６Ｐａｓｅ−α酵素よりも活性であることが本明細書に開示されている。図１および表２に示す通り、２つのタンパク質は、１８残基で配列において異なっている。部位特異的変異誘発を使用して、ホスホヒドロラーゼ活性が増大しているヒトＧ６Ｐａｓｅ−α変異体が同定された。生成されたヒトＧ６Ｐａｓｅ−α変異体は、イヌＧ６Ｐａｓｅ−α由来の１つまたは複数の対応するアミノ酸を配列番号２の３、５４、１３９、１９６、１９９、２４２、２４７、２９２、２９８、３０１、３１８、３２４、３３２、３４７、３４９、３５０および／または３５３位（複数可）に含有した。ヒトＧ６Ｐａｓｅ−α配列およびヒト／イヌＧ６Ｐａｓｅ−αコンセンサス配列は、下に記載される。
一部の実施形態では、配列番号１０を含む改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αが本明細書で提供され、式中アミノ酸残基３のＸ＝ＫもしくはＥ；アミノ酸残基５４のＸ＝ＲもしくはＱ；アミノ酸残基１３９のＸ＝ＲもしくはＱ；アミノ酸残基１４２のＸ＝ＫもしくはＩ；アミノ酸残基１９６のＸ＝ＲもしくはＳ；アミノ酸残基１９９のＸ＝ＱもしくはＨ；アミノ酸残基２４２のＸ＝ＲもしくはＱ；アミノ酸残基２４７のＸ＝ＲもしくはＱ；アミノ酸残基２９２のＸ＝ＦもしくはＬ；アミノ酸残基２９８のＸ＝ＣもしくはＳ；アミノ酸残基３０１のＸ＝ＶもしくはＡ；アミノ酸残基３１８のＸ＝ＴもしくはＶ；アミノ酸残基３２４のＸ＝ＴもしくはＶ；アミノ酸残基３３２のＸ＝ＡもしくはＶ；アミノ酸残基３４７のＸ＝ＲもしくはＱ；アミノ酸残基３４９のＸ＝ＦもしくはＬ；アミノ酸残基３５０のＸ＝ＤもしくはＧ；またはアミノ酸残基３５３のＸ＝ＤもしくはＨ、またはこれらの任意の組合せ。
具体的な例では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−α配列は、下に記載の通りＳ２９８Ｃ変異を含む、またはＳ２９８ＣおよびＡ３１０Ｖ変異を含む。非限定的な例では、改変Ｇ６Ｐａｓｅ−α配列は、配列番号８または配列番号９を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、Ｓ２９８Ｃ変異を含む改変Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、下に記載の核酸配列によってコードされる。
ＶＩ．遺伝子療法の適用のための組換えＡＡＶ
ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、直鎖状の一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。ＡＡＶ ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はどちらも同等の頻度でＡＡＶカプシドにパッケージングされる。
ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を特徴とする。ＡＡＶ２ゲノムでは、例えば、ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドはパリンドロームであり、それ自体の上に折り重なって塩基対形成を最大にし、Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。Ｄ配列と称されるＩＴＲの他の２０塩基は対形成しないままである。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要なシス作用性配列であり、ＩＴＲは、複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２の鎖の合成のためのプライマーとしての機能を果たす。複製型単量体と称される、この合成の間に形成される二本鎖ＤＮＡを第２のラウンドの自己プライミング複製に使用し、複製型二量体を形成する。これらの二本鎖中間体は鎖置換機構によってプロセシングされ、その結果、パッケージングのために使用される一本鎖ＤＮＡと転写のために使用される二本鎖ＤＮＡがもたらされる。ＩＴＲ内には、Ｒｅｐ結合性エレメントおよび末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）が位置する。これらの特徴は、ウイルス調節タンパク質Ｒｅｐにより、ＡＡＶ複製の間に二本鎖中間体をプロセシングするために使用される。ＡＡＶ複製における役割に加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムのパッケージング、転写、非許容条件下での負の調節、および部位特異的組み込みにも必須である（ＤａｙａおよびＢｅｒｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１巻（４号）：５８３〜５９３頁、２００８年）。
ＡＡＶの左側のＯＲＦは、４種のタンパク質−Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＲｅｐ遺伝子を含有する。右側のＯＲＦは、３種のウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を産生させるＣａｐ遺伝子を含有する。ＡＡＶカプシドは、正二十面体対称に配置された６０種のウイルスカプシドタンパク質を含有する。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０のモル比で存在する（ＤａｙａおよびＢｅｒｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１巻（４号）：５８３〜５９３頁、２００８年
）。
ＡＡＶは、現在、遺伝子療法のために最も頻繁に使用されているウイルスのうちの１つである。ＡＡＶは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するが、疾患を引き起こすことは知られておらず、また、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用した遺伝子療法ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染させることができ、宿主細胞のゲノムに組み込まずに染色体外の状態で持続させることができる。ＡＡＶの有利な特徴に起因して、本開示は、本明細書に開示されている組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。
ＡＡＶは、標的細胞に結合し、侵入する能力、核に侵入する能力、核内で長期間にわたって発現させる能力、および毒性が低いことを含めた、遺伝子療法ベクターに望ましい特徴をいくつか有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズが小さいことにより、組み入れることができる異種ＤＮＡのサイズが限定される。この問題を最小限にするために、Ｒｅｐおよび組み込み効率エレメント（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターが構築されている。ＩＴＲは、パッケージングのために必要なシスシグナルであるので、保持される（ＤａｙａおよびＢｅｒｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１巻（４号）：５８３〜５９３頁、２００８年）。
遺伝子療法に適したｒＡＡＶを作製するための方法は当技術分野で周知であり（例えば、米国特許出願第２０１２／０１００６０６号；同第２０１２／０１３５５１５号；同第２０１１／０２２９９７１号；および同第２０１３／００７２５４８号；およびＧｈｏｓｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ１３巻（４号）：３２１〜３２９頁、２００６年を参照されたい）、本明細書に開示されている組換え核酸分子、ベクターおよび方法と共に利用することができる。
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載されている特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１：ＡＡＶ媒介遺伝子療法における使用のためのヒトＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）変異体の構築および特徴付け）
この実施例は、１８個のヒトＧ６ＰＣ変異体の生成およびホスホヒドロラーゼ活性が増大した特異的なＧ６Ｐａｓｅ−α変異体の同定を記載する。
Ｇ６ＰＣ変異体の構築
ヒトＧ６ＰＣ変異体を構築するために、ヒトＧ６ＰＣ ｃＤＮＡ（配列番号１１；ヌクレオチド１〜３に開始コドンＡＴＧを含むコード領域全体）のヌクレオチド１から１０７４を含むｐＳＶＬベクターを鋳型として使用した。ＰＣＲ誘導変異誘発のために鋳型を、中央で変異されたコドンを含む２０ヌクレオチド長センスおよびアンチセンス変異体プライマーに隣接したヌクレオチド１から２０（センス）および１０５５から１０７４（アンチセンス）に一致する２つの外側ＰＣＲプライマーを使用して増幅した（図４および下の表１を参照されたい）。ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ／Ａ３０１Ｖ二重変異体のための鋳型はｐＳＶＬ−ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ変異体であった。変異された配列をｐＳＶＬにクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって検証した。
ＣＯＳ−１細胞における発現およびホスホヒドロラーゼアッセイ
ＣＯＳ−１細胞を４％ウシ胎児血清を補充したＨＥＰＥＳ緩衝ダルベッコ改変最小基礎培地において、３７℃で増殖させた。Ｇ６ＰＣ構築物をＤＥＡＥデキストラン／クロロキン法によってＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。３７℃、２日間のインキュベーション後、トランスフェクトした培養物をホスホヒドロラーゼ活性のために回収した。簡潔には、５０ｍＭカコジル酸緩衝液、ｐＨ６．５、１０ｍＭのＧ６Ｐおよび適量の細胞ホモジネートを含有する反応混合物（５０μｌ）を３７℃、１０分間、以前に記載されている通りインキュベートした（Ｌｅｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２巻：５８０〜５８３頁、１９９３年）。
統計分析
独立ｔ検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｏｇｒａｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。値は、ｐ＜０．０５であれば統計学的に有意とみなした。
結果
ヒトおよびイヌＧ６Ｐａｓｅ−αのホスホヒドロラーゼ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ発現アッセイによって比較した。結果はイヌ酵素がヒト酵素の約５倍の活性であったことを実証した。イヌおよびヒト配列の配列アラインメントは、２つの酵素が１８個のアミノ酸残基だけ異なっていることを示した（図１および表２）。
どのアミノ酸置換がイヌＧ６Ｐａｓｅ−αの酵素活性の増大を生じたかを決定するために、１８個のヒトＧ６ＰＣ変異体を部位特異的変異誘発によって構築した。各変異体はイヌＧ６Ｐａｓｅ−α由来の対応するアミノ酸の１つを保有していた。１８個のヒトＧ６Ｐａｓｅ−α変異体のホスホヒドロラーゼ活性を一過性発現アッセイによって調査した。結果は、Ｇ６ＰＣ−ＷＴ構築物の活性より２．１４倍高い活性を有して、ヒトＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ構築物が最も活性であったことを示した（表３）。Ｇ６ＰＣ−Ａ３０１Ｖ変異体もより活性であり、Ｇ６ＰＣ−ＷＴより１．３５倍活性であった。次いで二重Ｓ２９８Ｃ／Ａ３０１Ｖ変異体（ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ／Ａ３０１Ｖ）を構築した。この二重変異体は単一ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ変異体と同等に活性であった（表３）。
ｐＳＶＬベクター中のヒト（ｈ）Ｇ６ＰＣ野生型（ＷＴ）またはｈＧ６ＰＣ変異体構築物でトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のホスホヒドロラーゼ活性。データは平均±ＳＥＭを示している。Ｈ、ＬおよびＣは、それぞれヘリックス１から９、内腔ループ１から４または細胞質性ループ１から４中の変異の位置を記している（図２）。括弧内の数字はｈＧ６ＰＣ−ＷＴ活性に対する％である。ホスホヒドロラーゼアッセイは二連で実施した。
膜貫通ヘリックスの構造的完全性がＧ６ＰＣの安定性および酵素活性に不可欠であり、非ヘリックス性変異体はＧ６ＰＣの安定性に本質的な役割を果たさないことが以前に示されている（Ｓｈｉｅｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７巻：５０４７〜５０５３頁、２００２年）。これらの以前の観察により、Ｇ６ＰＣのヘリックス８中のアミノ酸残基の変異は酵素活性を著しく変更した。
ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ構築物の有効性をさらに確認するために、２つのヒトＧ６ＰＣ構築物、ｐＳＶＬ−Ｇ６ＰＣ−ＷＴおよびｐＳＶＬ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃのホスホヒドロラーゼ活性を比較した。一過性発現アッセイは、ｐＳＶＬ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ構築物がｐＳＶＬ−Ｇ６ＰＣ構築物よりも１．７倍効果的であったことを示した（表４）。
研究は、コドン最適化戦略が翻訳効率を増大できることを示している（Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９巻：１８６７〜１８７７頁、２０１１年）。コドン最適化（ｃｏ）ヒトＧ６ＰＣは、Ｇ６ＰＣ−ＷＴ構築物より１．４６倍活性である（表４）。コドン最適化の影響を調査するために、コドン最適化ヒトＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃを発現するｐＳＶＬ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃを構築した。一過性発現アッセイは、ｐＳＶＬ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ構築物がｐＳＶＬ−Ｇ６ＰＣ−ＷＴ構築物よりも２．９倍有効であったことを示した（表４）。
ｐＳＶＬベクター中のｈＧ６ＰＣ−ＷＴ、ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ、ｃｏ−ｈＧ６ＰＣ、ｃｏ−ｈＧ６ＰＣ−Ｓ２９８ＣまたはイヌＧ６ＰＣ構築物でトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のホスホヒドロラーゼ活性。データは、各構築物の３個の別々のバッチを使用する３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。ホスホヒドロラーゼアッセイを二連で実施した。括弧内の数字はｈＧ６ＰＣ−ＷＴ活性に対する％である。
組換えＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ、ＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ、ＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８ＣおよびＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃベクターを構築した。肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性を、ＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ、ＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ、ＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣまたはＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃベクターの注入を受けたＧＳＤ−Ｉａ（Ｇ６ｐｃ−／−）マウスで調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現研究と一致して、ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８ＣおよびＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８ＣベクターがＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣベクターのものの３．４倍超の肝臓Ｇ６ＰＣ発現を導いたことを示した（図３）。
（実施例２：肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏を補正するために必要な最小ベクター用量の評価）
この実施例は、ＨＣＡ／ＨＣＣ発症を予防し、グルコース恒常性を維持するレベルにＧ６Ｐａｓｅ−α活性を回復させるために必要な最小用量を決定する研究を記載している。
ＧＳＤ−Ｉａは、グルコース恒常性の障害および肝細胞腺腫（ＨＣＡ）の長期合併症を特徴とする（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。本発明者は、正常肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の≧３％を発現する（Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の≧５単位と同等である；１ｎｍｏｌ／分／ｍｇはＧ６Ｐａｓｅ−α活性１単位と定義される）ｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣ処置Ｇ６ｐｃ−／−マウスがＰ７０〜Ｐ９０週齢までグルコース恒常性を維持し、ＨＣＡを発症しないことを以前示した（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０８１１０１号、参照により本明細書に組み入れられる）。
本研究は、Ｇ６ｐｃ−／−マウスを使用して肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏を補正するために必要なｒＡＡＶベクターの最小投与量を決定するために、精製し、正確に力価測定したｒＡＡＶ８ベクター（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡによって供給）を使用して実施した。１０日齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスは５×１０１１ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣまたはｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃの注入を受けた。２４日齢時（注入２週間後）に、ｒＡＡＶ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ−およびｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−処置Ｇ６ｐｃ−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性はそれぞれ１８．６±１．１および７．７±１．１単位であった（図５）。
ＡＡＶに媒介される肝臓の遺伝子移入の効率および持続が、初期発生の間は、肝臓の成長に関連する肝細胞増殖の大きい速度がＡＡＶに有効に感染した細胞の数を希釈し得ることに起因して少ないことが示されている（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．１８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）。１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣの注入を受けた２週齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスでは、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は２４週齢時に１７４．０±２２．４単位であった。１×１０１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣの注入を受けた４週齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスでは、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、同じベクター投与量を２週齢時に注入されたマウスでのＧ６Ｐａｓｅ−α活性より２．９倍高く、２４週齢時に３３５．６±４０．２単位であった。
したがって、ｒＡＡＶ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃの同じ投与量を４週齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスに注入する場合、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、グルコース恒常性を維持し、ＨＣＡ／ＨＣＣ形成を予防するために必要な最小肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性（５単位）を優に上回る、２４週齢時に５３．９４（１８．６×２．９）単位に回復することが予測される。これは≦１×１０１２ｖｇ／ｋｇ ＡＡＶの投与を必要とするＧＳＤ−Ｉａの処置についてのｒＡＡＶ媒介ヒト臨床遺伝子療法治験の要件にも合致する。
４つの異なるベクターの相対有効性を比較するために、１０日齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスに５×１０１１ｖｇ／ｋｇの正確に力価測定したｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣまたはｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃベクターを注入し、処置Ｇ６ｐｃ−／−マウスの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を２４日齢時に調査する。さらに１０日齢Ｇ６ｐｃ−／−マウスに５×１０１２ｖｇ／ｋｇの正確に力価測定したｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣ、ｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃ、ｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣまたはｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃを注入し、処置Ｇ６ｐｃ−／−マウスの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を１２週齢時に調査する。この研究の結果は、２４日齢から１２週齢の導入遺伝子発現の安定性を実証する。
無処置Ｇ６ｐｃ−／−マウスは寿命が短い。成体マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏を補正するために必要なｒＡＡＶベクターの最小投与量をより正確に決定するために、肝臓特異的Ｇ６Ｐａｓｅノックアウトを有し、成体まで生存するＬ−Ｇ６ｐｃ−／−マウスを下に記載の通り使用した。
Ｇ６ｐｃｆｘ／ｆｘマウスは、ｌｏｘＰ部位に隣接したＧ６ｐｃ遺伝子のエクソン３を含有している（Ｐｅｎｇら、Ｇｅｎｅｓｉｓ ４７巻：５９０〜５９４頁、２００９年）。Ｇ６ｐｃｆｘ／ｆｘマウスを、Ｇ６ｐｃｆｘ／ｆｘ．ＳＡｃｒｅＥＲＴ２／ｗマウスを産生するように血清アルブミンプロモーターの制御下にタモキシフェン依存性Ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するＳＡｃｒｅＥＲＴ２／ｗマウスと交配した（Ｓｃｈｕｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓｉｓ ３９巻：１６７〜１７２頁、２００４年）。肝臓特異的Ｇ６ｐｃノックアウト（Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−）を３週齢Ｇ６ｐｃｆｘ／ｆｘ．ＳＡｃｒｅＥＲＴ２／ｗマウスにおけるＧ６ｐｃエクソン３のタモキシフェン媒介除去によって生成した。１００％のＬ−Ｇ６ｐｃ−／−マウスが５４週齢時（Ｇ６ｐｃ遺伝子除去後５１週間）にＨＣＡ／ＨＣＣを発症することが予測される。
１０週齢Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−マウスを１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ−Ｇ６ＰＣで処置した。結果は、１８週齢時に肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性が６８．９±１２．８単位に回復したことを示した（図６Ａ）。ＡＡＶ処置マウス（ＡＡＶマウス）は、軽度のグリコーゲン貯蔵以外は肝臓組織学的異常を示さず（図６Ｂ）、空腹時耐糖能（ＦＧＴ）の正常プロファイルを示した（図６Ｃ）。さらにＡＡＶマウスは、肝臓重量の正常化（図６Ｄ）ならびにグリコーゲンおよびトリグリセリドの肝臓レベルの正常化を示した（図６Ｅ）。これらのデータは、ＧＳＤ−Ｉａの処置のためのヒト臨床遺伝子療法治験のためのより最適な投与量に減らすことができることを示している。
肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠乏を補正し、ＨＣＡ／ＨＣＣ発症を予防するために必要なｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣ、ｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ、ｒＡＡＶ８−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８ＣおよびｒＡＡＶ８−ｃｏ−Ｇ６ＰＣ−Ｓ２９８Ｃの最小投与量を調査するために、各ベクターの種々の用量（例えば１×１０１０、３×１０１０、１×１０１１、３×１０１１、１×１０１２、３×１０１２および１×１０１３）を１０〜１２週齢Ｌ−Ｇ６ｐｃ−／−マウスに注入する。５４週齢時にＧ６Ｐａｓｅ−α活性を測定する。肝組織学、ＦＧＴ、肝臓重量ならびにグリコーゲンおよびトリグリセリドの肝臓レベルも測定および／または評価する。
（実施例３：ＡＡＶに基づく遺伝子療法を使用したヒトＧＳＤ−Ｉａの処置）
この実施例は、改変Ｇ６ＰＣをコードするＡＡＶベクターをＧＳＤ−Ｉａの処置のために臨床使用する例示的な方法を記載している。
ＧＳＤ−Ｉａと診断された患者を処置のために選択する。一般には、患者は少なくとも１８歳であり、免疫調節に前曝露したことがあってもよくまたはなくてもよい。患者に、本明細書に開示されている配列番号４または配列番号５を含むｒＡＡＶなどの、改変Ｇ６ＰＣを発現する組換えＡＡＶを治療有効量で投与する。組換えＡＡＶは、静脈内に投与することができる。適切な治療量は、医師が選択することができる。いくつかの場合には、治療有効用量は、１×１０１０〜１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの範囲、例えば、約１×１０１１または１×１０１２ｖｐ／ｋｇなどである。ほとんどの場合、単回用量を患者に投与する。免疫調節の非存在下では、患者はｒＡＡＶの単回注入のみを許容する可能性がある。被験体が免疫調節に前曝露したことがある場合、２またはそれ超の用量を投与することができる。処置の有効性を決定するために被験体の健康を経時的にモニターすることができる。
開示されている発明の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に本発明の好ましい例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。したがって、これらの請求項の範囲および精神の範囲内に入る発明の全てを特許請求する。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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