CN113905768A

CN113905768A - 优化的苯丙氨酸羟化酶表达

Info

Publication number: CN113905768A
Application number: CN202080040373.5A
Authority: CN
Inventors: T·拉胡森; 肖玲芝; C·D·保扎
Original assignee: American Gene Technologies International Inc
Current assignee: American Gene Technologies International Inc
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2022-01-07
Also published as: WO2020243717A1; IL288400A; EP3976076A1; BR112021024124A2; AU2020283069A1; EP3976076A4; JP2022535745A; US20220162643A1; CA3137698A1; KR20220068954A; AU2020283069A8

Abstract

公开了用于表达慢病毒颗粒的慢病毒载体系统。该慢病毒载体系统包括治疗载体。该慢病毒载体系统产生编码密码子优化的PAH的慢病毒颗粒，用于上调患有苯丙酮尿症(PKU)的对象的细胞中PAH的表达。

Description

优化的苯丙氨酸羟化酶表达

优先权和通过引用纳入

本申请要求于2019年5月31日提交的美国临时申请第62/855,506号题为“密码子优化的苯丙氨酸羟化酶”的优先权，其通过引用全文纳入本文。

技术领域

本公开的方面涉及用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的基因药物。更具体地，本公开的方面涉及慢病毒载体，包括含有密码子优化的PAH的慢病毒载体。

背景技术

苯丙酮尿症(PKU)指一组异质性疾病，如果不进行治疗，其可以导致受影响儿童的生长发育受损，智力障碍，癫痫和行为问题。高苯丙氨酸血症导致智力障碍的机制反映了高剂量苯丙氨酸令人惊讶的毒性，并且涉及神经系统组织的髓鞘过少或脱髓鞘。在北美洲，PKU的平均报告发病率为每12,000人中有1人，对男性和女性的影响相同。该疾病最常见于欧洲或美洲原住民血统的人，并在地中海东部地区达到更高的水平。

已在出生后一个月内证实了PKU患者的神经变化，而成年PKU患者的磁共振成像(MRI)显示了大脑中的白质病灶。这些病灶的大小和数量与血液苯丙氨酸浓度相关。相较于对照对象，患有PKU的青少年和成年人的认知特征(cognitive profile)可能包括IQ、处理速度、运动控制和抑制能力显著降低，以及注意力测试的表现降低。

大多数的PKU由肝苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏所导致。PAH是一种多聚体肝酶，其在分子氧和催化量的四氢生物蝶呤(BH₄)(它的非蛋白质辅因子)存在的情况下催化苯丙氨酸(Phe)羟基化为酪氨酸(Tyr)。在没有表达足够PAH的情况下，血液中的苯丙氨酸水平升高，导致高苯丙氨酸血症以及对PKU患者的有害副作用。PAH活性降低或缺失可能会导致缺乏酪氨酸及其下游产物，包括黑色素，1-甲状腺素和儿茶酚胺神经递质，其包括多巴胺。

PKU可能由PAH中的突变和/或PAH辅因子(即BH₄)合成或再生中的缺陷所导致。值得注意的是，已经证明多种PAH突变将影响内质网中的蛋白质折叠，由于蛋白质结构中减弱或在很大程度上消除酶催化活性的小缺失(13％)和错义突变(63％)，这将导致降解和/或聚合加速。

通常，根据血浆Phe水平，对Phe的饮食耐受性以及对治疗的潜在反应性，使用三个主要表型组对PKU进行分类。这些组包括经典PKU(Phe＞1200μM)，非典型或轻度PKU(Phe为600-1200μM)和永久性轻度高苯丙氨酸血症(HPA，Phe 120-600μM)。

PKU的检测依赖于通用新生儿筛查(NBS)。在美国所有50个州中都必须进行的筛查中，测试收集自后脚跟(heel stick)的一滴血液的苯丙氨酸水平。

当前，对Phe和BH₄补充的终生饮食限制是对PKU仅有的两种可用治疗选择，其中早期治疗干预对于确保受影响婴儿的最佳临床结局而言至关重要。然而，昂贵的药物和特殊的低蛋白食品给患者带来沉重负担，尤其是在个人健康保险未完全涵盖这些产品的情况下，其可能导致营养不良，社会心理或神经认知并发症。此外，BH₄疗法主要对于与BH₄生物合成缺陷相关的轻度高苯丙氨酸血症有效，然而仅有20-30％的轻度或经典PKU患者对此有反应。因此，迫切需要的新PKU治疗方式，以替代繁重的Phe限制饮食。

基因药物有可能有效治疗PKU。出于疾病治疗或预防目的，基因药物可能涉及递送和表达遗传构建体。遗传构建体的表达可以通过各种启动子、增强子和/或其组合来调节。

发明内容

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含修饰的PAH序列或其变体，用于调节苯丙氨酸羟化酶(PAH)表达。在其他方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含用于增强PAH表达的密码子优化的PAH序列或其变体，以及可选地启动子和肝特异性增强子，其中所述PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在实施方式中，病毒载体包含密码子优化的PAH序列或其变体，具有与SEQ ID NO：70至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列相同性。在实施方式中，病毒载体包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含SEQ ID NO：70的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的PAH序列或其变体具有与SEQ ID NO：71至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：71的序列。在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的PAH序列或其变体具有与SEQ ID NO：72至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：72的序列。在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在实施方式中，肝特异性增强子包含凝血酶原增强子。在实施方式中，凝血酶原增强子包含具有与SEQ ID NO：3至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。在实施方式中，凝血酶原增强子包含SEQ ID NO：3的序列。

在实施方式中，启动子包含肝特异性启动子。在实施方式中，肝特异性启动子包含hAAT启动子。在实施方式中，hAAT启动子包含具有与SEQ ID NO：4至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。在实施方式中，hAAT启动子包含SEQ ID NO：4的序列。

在实施方式中，治疗性载物部分还包含β珠蛋白内含子。在实施方式中，β珠蛋白内含子包含具有与SEQ ID NO：5或6至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。在实施方式中，β珠蛋白内含子包含SEQ ID NO：5或6的序列。

在实施方式中，治疗性载物部分还包含至少一个肝细胞核因子结合位点。在实施方式中，肝细胞核因子结合位点包含具有与SEQ ID NO：7(1XHNF1)、SEQ ID NO：8(5XHNF1)、SEQ ID NO：9(1XHNF1/4)或SEQ ID NO：10(3XHNF1/4)至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。在实施方式中，肝细胞核因子结合位点包含SEQ ID NO：7、8、9或10的序列。

在实施方式中，至少一个肝细胞核因子结合位点置于凝血酶原增强子的下游。

在实施方式中，治疗性载物部分还包含至少一种小RNA序列。在实施方式中，至少一种小RNA序列包含具有与SEQ ID NO：11或12至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。在实施方式中，至少一种小RNA序列受控于第一启动子，而PAH序列受控于第二启动子。在实施方式中，第一启动子是H1启动子。在实施方式中，第二启动子是肝特异性启动子。

在实施方式中，病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒载体。在实施方式中，病毒载体是慢病毒载体或另一种病毒载体或适合递送本文所述的密码子优化的PAH序列的非病毒系统。一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含与SEQ ID NO：70共享超过95％序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：70。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：71至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：71。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：72至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的序列或其变体包含SEQ ID NO：72。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：73至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：73的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：74至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：74的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：75至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：75的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：76至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：76的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：73至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：73的序列。在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：74至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：74的序列。在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，以及进一步包含启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：75至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的序列或其变体包含SEQ ID NO：75。在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，以及进一步包含启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：76至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。在实施方式中，密码子优化的序列或其变体包含SEQ ID NO：76。在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，以及进一步包含启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

一方面，公开了由包装细胞生产的能够感染靶细胞的慢病毒颗粒。在实施方式中，所述慢病毒颗粒包含如本文所详述的病毒载体和能够感染靶细胞的包膜蛋白。

一方面，公开了一种治疗对象苯丙酮尿症(PKU)的方法。该方法涉及给予对象如本文所详述的治疗有效量的慢病毒颗粒。

一方面，提供了密码子优化的PAH序列或其变体用于治疗对象PKU的用途。另一方面，提供了密码子优化的PAH序列或其变体在配制用于治疗对象PKU的药物中的用途。

一方面，提供了用于治疗对象PKU的密码子优化的PAH序列或其变体。另一方面，提供了用于配制治疗对象PKU的药物的密码子优化的PAH序列或其变体。

附图简要说明

图1显示环化形式的示例性3-载体慢病毒载体系统。

图2显示环化形式的示例性4-载体慢病毒载体系统。

图3显示4个示例性慢病毒载体的线性图谱，所述示例性慢病毒载体包含凝血酶原增强子和hAAT启动子的变异以调节PAH表达。

图4A-4B显示转导hPAH和多种形式的密码子优化的PAH序列后比较Hepa1-6细胞中PAH水平的免疫印迹数据。图4A比较了hPAH与OPT2密码子优化的PAH。图4B比较了hPAH与OPT3、OPT2/3和OPT3/2版本的密码子优化的PAH。

图5显示使用表达hPAH和多种密码子优化版本的PAH的慢病毒载体转导的Hepa1-6细胞中PAH RNA表达。

图6A-6B显示了比较凝血酶原增强子上游具有HNF1和HNF1/4结合位点的密码子优化PAH水平的免疫印迹数据。图6A显示了Hepa1-6细胞的免疫印迹数据。图6B显示了Hep3B细胞的免疫印迹数据。

图7显示了比较带有调控序列(包含凝血酶原增强子/hAAT启动子/小鼠细小病毒内含子或hAAT增强子/转甲状腺素蛋白启动子/小鼠细小病毒内含子)的密码子优化PAH水平的免疫印迹数据。

图8显示了比较带有调控序列(包含突变WPRE序列或短WPRE(WPREs)序列、或PAH或白蛋白3’UTR序列)的密码子优化的PAH水平的免疫印迹数据。

具体实施方式

概述

本公开涉及治疗载体以及递送同一载体至细胞。一方面，治疗载体是病毒载体，其包含治疗性载物部分：其中治疗性载物部分包含：密码子优化的PAH序列或其变体；启动子；和肝特异性增强子，其中所述PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。在实施方式中，载体包含密码子优化的PAH序列或其变体，和/或肝特异性增强子。在实施方式中，载体包含调节宿主(即，内源性)PAH蛋白表达的小RNA。一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。

定义

除非另作说明，本公开所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。此外，除非上下文要求另作别解，单数术语包涵复数含义且复数术语包涵单数含义。通常，本文中细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且常用的。除非另有说明，本发明的方法和技术总体遵循如本领域熟知并如各种通识或专题参考文献中所述的常规方法进行，本文全文多处引用并论及此类参考文献。参见例如：Sambrook J.和Russell D.《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(2000)；Ausubel等，《精编分子生物学方案：现行分子生物学方案的方法纲要》(Short Protocolsin Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology)，Wiley，John&Sons出版公司(2002)；Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)；纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(1998)；和Coligan等，《精编蛋白质科学方案》(Short Protocols in Protein Science)，威利约翰父子出版公司(Wiley，John&Sons)(2003)。各种酶促反应或纯化技术按照生产商的说明如本领域常规实践或本文所述进行。本文所述分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且常用的。

如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”可互换使用并且也包括复数形式并且落入每个含义内，除非上下文另有明确说明。本文中，“和/或”表示并涵盖列出的一个或多个事项的任意及所有可能以及按照或选(“或”)解释时组合的缺失。

所有数字标记，例如百分比、pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，可以包括例如0.1％或0.1的增量变化(+)或(-)。应理解，尽管并非均为明示，所有指定数值之前都有“约”。还应理解，尽管并非均为明示，本文述及的试剂仅仅是示例性的，其等同物是本领域所知的。

本文中，“约”是本领域普通技术人员所理解的并会视其使用所在的上下文而存在一定程度的差异。如果在使用该术语的文中该术语对于本领域普通技术人员来说是不明确的，则“约”将包括高达值的正负10％的值。“约”在诸如“X”+0.1％或X-0.1％这样“X”的微小改变之外还包括精确的“X”值。

如本文所用，术语“给予”或“施用”表示为向需要治疗的对象提供本发明的任何载体、载体组合物、药学组合物或其他活性剂，其形式为可以治疗有用形式和治疗有效量导入该个体的形式。给予所公开的载体、载体组合物或其他活性剂的方法可以是本文公开的任何方法。

如本文所用，短语“编码序列”描述能够被转录或逆转录的任何病毒载体序列。“编码序列”包括但不限于能够被转录或逆转录的外源序列(例如，已经被转导或转染到细胞中的载体上的序列)。

如本文所用，术语“密码子优化的”是指根据以下至少一项调整编码序列；(i)用保留编码蛋白质的氨基酸序列但改变编码RNA的组成和/或结构的替代性密码子取代天然存在的密码子序列；(ii)相对于编码序列的天然存在的鸟苷胞嘧啶含量调整编码序列的鸟苷胞嘧啶含量；(iii)相对于天然存在的编码序列中CpG位点的数量调整编码序列的CpG位点数量；(iv)用相对于(ii)鸟苷胞嘧啶含量和/或(iii)CpG位点数量的替代性密码子取代天然存在的密码子序列。密码子优化可以包括在特定组织中tRNA表达的背景下调整密码子和/或可以包括用于逃避天然、组织特异性shRNA或miRNA作用的方法。

如本文所用，术语“包括”或“包含”意为所述组合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。当用以定义组合物和方法时，“基本由......组成”表示排除对于该组合物和方法具有任何本质意义的其它要素。“由......组成”表示对于要求保护的组合物和基本方法步骤，排除其他成分中的微量元素。通过各个这些转换术语定义的实施方式在本发明范围内。因此，应当认为，所述方法和组合物可以包括另外的步骤和组分(包含...)或者可选性地包括不重要的步骤和组合物(基本上由...组成)或者仅包括明示的方法步骤或组合物(由...组成)。

如本文所用，“CpG位点”是指胞嘧啶核苷酸以碱基线性顺序沿其5’到3’方向后随一个鸟嘌呤核苷酸的DNA区域。CpG位点在称为CpG岛(或CG岛)的基因组区域中高频出现。CpG双核苷酸中的胞嘧啶可被甲基化，形成5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中，70％至80％的CpG胞嘧啶被甲基化。基因内胞嘧啶的甲基化可改变其表达。

如本文所用，术语“UTR”通常指在RNA剪接完成后保留的信使RNA(mRNA)的非翻译区。如本文所用，“3’UTR”指紧随翻译终止密码子的mRNA的非翻译区。3′UTR不被翻译成产生的蛋白质。

如本文所用，术语“腺相关病毒载体”是指利用腺相关病毒的结构组分将治疗性DNA载物递送至细胞或组织中的合成递送系统。术语“腺相关病毒载体”在本文中还可以称之为“AAV载体”。

本文所用术语“腺相关病毒”指产生轻度免疫反应的小病毒，能够在宿主细胞中沉积自身的染色体外DNA拷贝，偶尔将DNA拷贝整合到宿主基因组中，并且相对无致病性。如本文所述，腺相关病毒包括多种天然和合成血清型，包括但不限于AAV2。

本文所用术语“AAV/DJ”(本文也称之为“AAV-DJ”)是工程改造自不同AAV血清型的AAV载体的血清型，其介导比野生型AAV血清型更高的转导和感染率。

本文所用术语“AAV2”(本文也称之为“AAV/2”或“AAV-2”)是天然存在的AAV血清型。

本文所用术语“ApoE增强子”是指载脂蛋白E增强子。

如本文所用，“表达”、“表达的”或“编码”指多核苷酸转录成mRNA或逆转录成DNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。表达可以包括真核细胞中的mRNA剪接或其他形式的转录后修饰或翻译后修饰。

本文所用术语“基因药物”或“遗传药物”通常指聚焦于遗传靶标以治疗临床疾病或表现的治疗剂或治疗策略。术语“基因药物”涵盖了基因治疗等。

本文所用术语“hAAT”指hAAT启动子。

本文所用术语“肝细胞核因子”指主要在肝脏中表达的转录因子。肝细胞核因子的类型包括但不限于肝细胞核因子1、肝细胞核因子2、肝细胞核因子3和肝细胞核因子4。

本文所用术语“HNF”指肝细胞核因子。因此，HNF1指的是肝细胞核因子1，HNF2指的是肝细胞核因子2，HNF3指的是肝细胞核因子3，HNF4指的是肝细胞核因子4。

本文所用术语“HNF结合位点”指HNF转录因子可以结合的DNA区域。因此，HNF1结合位点是HNF1可以结合的DNA区域，HNF4结合位点是HNF4可以结合的DNA区域。

本文所用术语“人β珠蛋白内含子”指人β珠蛋白基因内的核酸区段，该区段在RNA成熟期间被剪接掉，并且不编码蛋白质。

如本文所用，术语“个体”、“对象”和“患者”本文中可互换使用，并且指任何个体哺乳动物对象，例如，鼠、猪、牛、犬、猫、马、非人灵长类动物或人。

本文所用术语“LV”通常指“慢病毒”。作为非限制性的示例，述及“LV-PAH”指代含有PAH序列并表达PAH的慢病毒。PAH序列可以是hPAH序列或密码子优化的PAH序列。

本文所用术语“LV-Pro-hAAT-PAH”指包含凝血酶原增强子、hAAT启动子和PAH序列的LV载体。

本文中，“包装细胞系”指可用于表达慢病毒颗粒的任何细胞系。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，本文所用术语“百分比相同性”或“百分比序列相同性”是指，当进行比较并以最大对应性比对时，两个或更多个具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分比的序列或子序列，如使用下述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其他算法)或通过视觉检查所测量。取决于应用，“百分比相同性”或“百分比序列相同性”可以存在于被比较的序列区域上，例如，在功能域上，或者，存在于待比较的两个序列的全长上。对于序列比较，一般将一条序列作为参比序列，测试序列则与之比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机，视必要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算一条或多条测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。

本文中所用的术语“药学上可接受的”是指合理医疗判断范围内的这些化合物、材料、组合物和/或剂型，其适用于接触人体和动物的组织、器官和/或体液而不会产生过度毒性、刺激性、过敏反应或与合理的效益/风险比相适应的其它问题或并发症。

本文所用术语“苯丙氨酸羟化酶”在本文中还可以称之为PAH。术语苯丙氨酸羟化酶包含所有野生型、变体和密码子优化的PAH序列(含PAH序列的片段)的核苷酸和肽序列。出于非限制性的目的，术语苯丙氨酸羟化酶包括SEQ ID NO：1、2和70-76，并且还包括与其具有至少约75％相同性的变体。

如本文所用，术语“hPAH”指衍生自人或人源的PAH序列，其密码子还没有被合成方式地改变。

本文所用术语“苯丙酮尿症”在本文中还称之为“PKU”，其指苯丙氨酸羟化酶的慢性缺乏，以及与之相关的所有症状，包括轻度和经典形式的疾病。因此，“苯丙酮尿症”的治疗可能涉及与PKU相关的所有或部分症状的治疗。

如本文所用，术语“凝血酶原增强子”是凝血酶原基因上可以被蛋白质结合的区域，其导致凝血酶原基因的转录。

如本文所用术语“Pro”指凝血酶原增强子。

本文所用术语“兔β珠蛋白内含子”指兔β珠蛋白基因内的核酸区段，该区段在RNA成熟期间被剪接掉，并且不编码蛋白质。

如本文所用术语“小RNA”指非编码RNA，长度通常约200个核苷酸或更短，且具有沉默或干扰功能。在其他实施方式中，小RNA长度为约175个核苷酸或更短，约150个核苷酸或更短，约125个核苷酸或更短，约100个核苷酸或更短，或约75个核苷酸或更短。此类RNA包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)和短发卡RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)和小核仁RNA(snoRNA)。本公开的小“RNA”应能够抑制或敲减靶基因的基因表达，通常通过会导致靶基因mRNA降解的途径或阻止靶基因mRNA翻译的途径。

如本文所用，术语“shPAH”指靶向PAH的小发夹RNA。

本文中，“SEQ ID NO”与“序列ID No.”同义。

本文所用术语“甲状腺素结合球蛋白”是在血流中负责携带甲状腺激素的转运蛋白。本文所用缩写“TBG”指甲状腺素结合球蛋白。

本文中，“治疗有效量”指在合适的组合物中、在合适的剂型中、就治疗或避免给定异常、损伤、疾病或病症的患者中所见症状、进展或并发症发生而言足够量的本文活性剂。治疗有效量取决于患者病症状态或其严重程度、所治疗对象的年龄、体重等。治疗有效量可以根据许多因素中的任何一种而变化，包括例如给药途径，对象的状况，以及本领域技术人员理解的其他因素。

如本文所用，术语“治疗载体”包括但不限于，慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。此外，如本文所用指慢病毒载体系统，术语“载体”与术语“质粒”同义。例如，3-载体和4-载体系统，包括2-载体和3-载体包装系统，也可以称为3-质粒和4-质粒系统。

本文所用术语“处理”或“治疗”一般指试图改变接受治疗的对象的自然进程的干预，并且可以用于预防进行或在临床病理过程中进行。理想的效果包括但不限于避免疾病的发生或复发，缓解症状，遏制、减少或抑制疾病的各种直接或间接病理后果，改善或平息疾病状态，以及引起缓解或改善预后。述及“治疗/处理”旨在靶向疾病状态并对其进行对抗，即改善或预防疾病状态。因此，特定治疗/处理将取决于待靶向的疾病状态以及药物治疗和治疗方法的当前或未来状态。治疗可能具有相关的毒性。

本文所用术语“截短的”在本文中还称之为“缩短的”或“不具有......的”。

如本文所用，术语“变体”是指当与参考序列相比时，核苷酸序列包含以下至少一个：单核苷酸多态性、单核苷酸变异、转变、倒位、重复、缺失、或取代。“变体”包括源自“变体”核苷酸序列的氨基酸序列，以及对其的转录后和翻译后修饰。

本文所考虑的是，用于比较的序列的最佳对齐可以例如采用Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源算法、采用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、采用Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似度检索法、采用这些算法的计算机运行(威斯康星遗传软件软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(遗传计算机集团，美国威斯康星州麦迪逊市科学路(ScienceDrive)575))或通过目测检查(总体见Ausubel等，见前文)来进行。

适用于确定序列相同性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。

本文中的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，例如由此鉴定相关序列。这样的检索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(得分＝100，字长＝12)来获取与本文中核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(得分＝50，字长＝3)来获取与本文中蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以用于比较目的，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402所述利用缺口BLAST。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。

方面和实施方式的描述

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和增强子。

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体和启动子。

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体和增强子。

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和肝特异性增强子。

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，启动子，和肝特异性增强子，其中密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体和启动子，其中密码子优化的PAH序列或其变体由启动子操作性地控制。

一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体和增强子，其中密码子优化的PAH序列或其变体由增强子操作性地控制。在实施方式中，增强子是肝特异性增强子。

在实施方式中，本文所述的任何启动子是组织特异性启动子、组成型启动子和合成型启动子的至少其中之一。

在实施方式中，组织特异性启动子是肝特异性启动子。在实施方式中，肝特异性启动子是hAAT启动子。在实施方式中，hAAT启动子包含具有与SEQ ID NO：4至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列。例如，在实施方式中，hAAT启动子包含的序列为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：4相同。在实施方式中，hAAT启动子包含SEQ ID NO：4的序列。

在实施方式中，本文所述的任何肝特异性增强子是天然存在的增强子和合成型增强子的至少其中之一。

在实施方式中，肝特异性增强子是凝血酶原增强子。在实施方式中，凝血酶原增强子包含具有与SEQ ID NO：3至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。例如，在实施方式中，凝血酶原增强子包含的序列为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：3相同。在实施方式中，凝血酶原增强子包含SEQID NO：3。

在实施方式中，病毒载体包含位于启动子5’端的增强子。在实施方式中，病毒载体包含位于启动子3’端的增强子。

在实施方式中，任何密码子优化的PAH序列或其变体是天然存在的PAH序列的变体。在实施方式中，任何密码子优化的PAH序列或其变体是合成的PAH序列的变体。

在实施方式中，病毒载体包含密码子优化的PAH序列或其变体，包含具有与SEQ IDNO：70至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：70相同。在实施方式中，病毒载体包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含SEQ ID NO：70的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：70序列相同性的序列。

在实施方式中，本文所述的任何治疗性载物部分进一步包含内含子。在实施方式中，内含子衍生自任何植物或动物物种。在实施方式中，内含子是β珠蛋白内含子。在实施方式中，β珠蛋白内含子是人β珠蛋白内含子。在实施方式中，β珠蛋白内含子是兔β珠蛋白内含子。在实施方式中，β珠蛋白内含子包含具有与SEQ ID NO：5或6至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。例如，在实施方式中，β珠蛋白内含子为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：5或6相同。在实施方式中，β珠蛋白内含子包含SEQ ID NO：5或6的序列。

在实施方案中，本文所述的任何治疗性载物部分还包含能够被核受体结合的位点。在实施方式中，核受体在肝中表达。在实施方案中，该位点是肝细胞核因子结合位点。

在实施方式中，肝细胞核因子结合位点包含具有与SEQ ID NO：7、8、9或10至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。例如，在实施方式中，肝细胞核因子结合位点为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQID NO：7、8、9或10相同。在实施方式中，肝细胞核因子结合位点包含SEQ ID NO：7、8、9或10的序列。

在实施方式中，本文所述的任何肝细胞核因子结合位点置于凝血酶原增强子的下游。在实施方式中，本文所述的任何肝细胞核因子结合位点置于凝血酶原增强子的上游。如本文所用，下游指的是沿功能性RNA的转录方向在连续核苷酸位置测量的距离。上游指的是与功能性RNA的转录方向相反的连续位置测量的距离。

在实施方式中，本文所述的任何治疗性载物部分还包含至少一种小RNA序列，其能够结合至少一种预定的PAH mRNA序列。

在实施方式中，本文所述的任何至少一种小RNA是小核RNA。在实施方式中，至少一种小RNA序列为小核仁RNA。在实施方式中，至少一种小RNA为微小RNA。在实施方式中，至少一种小RNA序列是小干扰RNA。在实施方式中，至少一种小RNA序列是短发夹RNA。

在实施方式中，至少一种小RNA序列包含具有与SEQ ID NO：11或12至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同性的序列。例如，在实施方式中，至少一种小RNA序列为与SEQ ID NO：11或12有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在实施方式中，至少一种小RNA序列包含SEQ ID NO：11或12的序列。

在实施方式中，本文所述的任何病毒载体为慢病毒载体和AAV载体的至少其中之一。在另一些实施方式中，还可以根据本公开的方面使用以下病毒载体：单纯疱疹病毒1型；腺病毒，莫洛尼鼠白血病病毒；基于致癌逆转录病毒(oncoretrovirus)的载体，包括但不限于HTLV-1和HTLV-2；基于马传染性贫血病毒猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、或梅迪/维斯纳慢病毒(Visna maedi lentivirus)的慢病毒载体；麻疹病毒载体；腮腺炎病毒载体；虫媒病毒载体；马传染性贫血病毒载体；和基于沙粒病毒的载体。一方面，根据本公开的基因递送可导致互补基因拷贝在编码PAH的基因之外的位置处的整合，可导致产生编码PAH的染色体外DNA或RNA元件，可通过同源重组取代天然PAH基因，可以利用基因组编辑在正常PAH基因处或远处插入互补基因序列，或利用基因转换来修改染色体PAH基因的序列。在另一方面，可以通过分离的肝细胞或植入肝脏的肝细胞干细胞的DNA转染肝脏以环状或线性形式递送互补DNA。在另一方面，可以通过分离的肝细胞或植入肝脏的肝细胞干细胞转染肝脏来递送互补RNA。另一方面，可以直接递送分离的DNA或RNA以完成PAH基因的基因转换，在附近或远端的基因座插入互补基因，或以调节PAH基因的负互补染色体等位基因的表达。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的序列或其变体具有与SEQ ID NO：71至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：71相同。在实施方式中，密码子优化的序列或其变体包含SEQ ID NO：71的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：71序列相同性的序列。

在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在实施方式中，病毒载体还包含治疗性载物部分，其包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和增强子。

在实施方式中，启动子可以是本文所述的任何启动子。在实施方式中，增强子可以是本文所述的任何增强子。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的序列或其变体具有与SEQ ID NO：72至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：72相同。在实施方式中，密码子优化的序列或其变体包含SEQ ID NO：72的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：72序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的PAH序列或其变体具有与SEQ ID NO：73至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：73相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：73的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：73序列相同性的序列。

在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体、启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的PAH序列或其变体具有与SEQ ID NO：74至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：74相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：74的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：74序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的PAH序列或其变体具有与SEQ ID NO：75至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：75相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：75的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96-4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：75序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含密码子优化的PAH序列或其变体，其中密码子优化的PAH序列或其变体具有与SEQ ID NO：76至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：76相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：76的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：73序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含与SEQ ID NO：70共享超过90％序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体与SEQ ID NO：70为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：70。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：70序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：71至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：71相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：71。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：71序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：72至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：72相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：72。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：72序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：73至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：73相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：73。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：73序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：74至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：74相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：74。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：74序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：75至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：75相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：75的序列。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：75序列相同性的序列。

在一方面，提供了病毒载体，其包含治疗性载物部分，其中治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，其包含具有与SEQ ID NO：76至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列相同性的序列。例如，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：76相同。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含SEQ ID NO：76。在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体包含具有90.0％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91.0％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92.0％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95.0％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％.95.7％、95.8％、95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％与SEQ ID NO：76序列相同性的序列。

在实施方式中，病毒载体进一步包含治疗性载物部分，治疗性载物部分包含密码子优化的PAH序列或其变体，以及进一步包含启动子和肝特异性增强子，其中所述密码子优化的PAH序列或其变体由启动子和肝特异性增强子操作性地控制。

一方面，公开了一种治疗对象苯丙酮尿症的方法。该方法涉及给予对象如本文所详述的治疗有效量的慢病毒颗粒。

一方面，提供了增强PAH序列表达的慢病毒载体。在实施方式中，PAH序列或PAH 3'UTR序列至少其中之一被修饰。在另一些实施方式中，这种修饰改变了PAH序列的mRNA转录物的二级结构。在另一些实施方式中，这种修饰包含改变mRNA PAH二级结构序列和mRNA 3’UTR二级结构序列的至少其中之一。在另一些实施方式中，这种修饰改变PAH mRNA的编码区和3'UTR区的相互作用。在另一些实施方式中，这种修饰抑制PAH二级结构对PAH蛋白生产的负调控作用。

在实施方式中，被调整的PAH序列包括其中天然存在的PAH序列已被修饰的任何序列，所述修饰包括天然存在的PAH序列(含其任何变体)的任何一个或多个核苷酸的任何添加、缺失、取代或修饰。在实施方式中，修饰包括调整天然存在序列的一种或多种鸟苷胞嘧啶含量、天然存在序列的一种或多种密码子、或天然存在序列的一种或多种CpG位点。在实施方式中，修饰包含密码子优化的PAH序列。PAH密码子优化的序列可以是任何合适的PAH密码子优化序列，包含本文阐述和描述的那些。在实施方式中，编码修饰的PAH序列(包含密码子优化序列)的载体相对于编码未修饰的(未密码子优化的)PAH序列的载体导致更高的PAH表达。

在实施方式中，修饰的PAH序列包含与SEQ ID NO：1、70、71或72中的任一个具有至少70％、75％、80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列相同性的序列。在实施方式中，修饰的PAH包含SEQ ID NO：70、71或72中任一个的序列。

在实施方式中，被调节的PAH 3'UTR序列包括其中天然存在的PAH3'UTR序列已被修饰的任何序列，所述修饰包括天然存在的PAH 3'UTR序列(含其任何变体)的任何一个或多个核苷酸的任何添加、缺失、取代或修饰。在实施方式中，被调节的PAH 3’UTR序列包括其一个或多个核苷酸的取代或缺失的至少其中之一。在另一些实施方式中，所有或基本上所有的3’UTR核苷酸被取代或缺失。

在实施方式中，修饰的3'UTR包含衍生自不同基因的3'UTR序列的3'UTR序列。在实施方式中，用不同基因的3'UTR序列取代PAH的3'UTR序列。在实施方式中，3'UTR序列包含白蛋白3'UTR。在实施方式中，白蛋白3'UTR包含与SEQ ID NO：86具有至少70％、75％、80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列相同性的序列。在实施方式中，白蛋白3'UTR包含SEQ ID NO：86的序列。

在实施方式中，编码包含修饰的PAH 3'UTR序列的PAH序列的慢病毒载体比编码PAH序列中PAH 3'UTR不受破坏的慢病毒载体导致更高的PAH表达。

在实施方式中，编码修饰的PAH 3'UTR和修饰的PAH序列(包含密码子优化序列)的慢病毒载体相对于编码任何未修饰的PAH3'UTR或未修饰的(例如未密码子优化的)PAH序列的载体导致更高的PAH表达。

苯丙酮尿症

据信PKU是由PAH中的突变和/或PAH辅因子(即BH₄)合成或再生中的缺陷所导致。值得注意的是，已经证明多种PAH突变将影响内质网中的蛋白质折叠，由于蛋白质结构中减弱或在很大程度上消除酶催化活性的小缺失(约13％)和错义突变(约63％)，这将导致降解和/或聚合加速。由于存在可能影响PAH功能的许多突变，因此，用于治疗PKU的一种有效治疗方法将需要解决异常PAH以及可以给予和/或产生替代PAH的方式。

通常，根据诊断时测量的Phe水平，对Phe的饮食耐受性以及对治疗的潜在反应性，将PKU分为三个主要表型组。这些组包括经典PKU(约Phe＞1200μM)，非典型或轻度PKU(Phe为约600-1200μM)和永久性轻度高苯丙氨酸血症(HPA，Phe 120-600μM)。

PKU的检测依赖于通用新生儿筛查(NBS)。在美国所有50个州中都必须进行且在大多数发达国家经常使用的筛查中，测试收集自后脚跟(heel stick)的一滴血液的苯丙氨酸水平。

基因药物

基因药物包括出于疾病治疗和预防的目的用于递送遗传构建体至宿主细胞的病毒载体。

基因构建体可以包括但不限于，修正或补足现有缺陷的功能性基因或基因的部分，编码调节性蛋白的DNA序列，编码调节性RNA分子的DNA序列，所述调节性RNA分子包括反义，短发夹RNA，短同源RNA，长非编码RNA，小干扰RNA等，以及编码旨在竞争重要的细胞因子以改变疾病状态的RNA或蛋白质的诱饵序列(decoy sequence)。在实施方式中，基因药物涉及递送这些治疗性遗传构建体至靶细胞以提供特定疾病的治疗或缓解。

通过向肝脏体内传递功能性PAH基因可能重建PAH活性，从而导致正常清除血液中的Phe，因此消除了对于饮食限制或频繁的酶替代疗法的需求。通过针对内源性PAH的shRNA的靶向可以改善这种治疗方法的效果。在本公开的方面之中，如果已经鉴定出胎儿处于对PKU基因型的风险中，那么也可以在子宫内递送功能性PAH基因或其变体。在实施方式中，功能性PAH基因或其变体是密码子优化的PAH基因。在实施方式中，可以进行诊断步骤以确定胎儿是否处于PKU表型的风险中。如果诊断步骤确定胎儿处于PKU表型风险中，之后胎儿可用本文所详述的基因药物治疗。治疗可以在子宫内或体外进行。

慢病毒载体系统

根据本文中多个方面和实施方式，慢病毒病毒体(颗粒)由编码生产病毒体(病毒颗粒)必需病毒蛋白的载体系统表达。在多个实施方式中，提供了一个含有编码慢病毒Pol蛋白的核酸序列(可操作地连接至启动子)的载体，用于逆转录和整合。在另一个实施方式中，Pol蛋白由多个载体表达。在其他实施方式中，提供了含有编码用于形成病毒衣壳的慢病毒Gag蛋白的核酸序列(可操作地连接至启动子)的载体。在实施方式中，该gag核酸序列与至少部分pol核酸序列位于分开的载体上。在其他实施方式中，gag核酸序列与编码pol蛋白的所有pol核酸序列位于分开的载体上。

可以对本文的载体进行各种修饰用于产生进一步将得到野生型回复体的可能性降至最低的颗粒。这些修饰包括但不限于LTR的U3区缺失，tat缺失和基质(MA)缺失。在实施方式中，一个或多个gag、pol和env载体不含称为慢病毒包装序列的包装慢病毒RNA的慢病毒基因组核苷酸。

在实施方式中，一个或多个形成颗粒的载体不含来自表达包膜蛋白的慢病毒基因组的核酸序列。在实施方式中，使用分开的载体，其含有可操作地连接至启动子的编码包膜蛋白的核酸序列。在实施方式中，这种编码包膜蛋白的分开的载体不含慢病毒包装序列。在一个实施方式中，编码包膜核酸序列的序列编码慢病毒包膜蛋白。

另一个实施方式中，包膜蛋白不来自慢病毒，而是来自其他病毒。所得颗粒称为假型颗粒。通过适当选择包膜几乎可以“感染”任何细胞。例如，可以利用编码靶向内吞区室的包膜蛋白的env基因。此类env基因和包膜蛋白可源自的病毒的实例包括：流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒(Isavirus)、夸兰扎病毒(Quaranjavirus)和托高土病毒(Thogotovirus))、水疱病毒(例如印第安纳水疱病毒(Indiana vesiculovirus))、α病毒(例如，西门利克森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴马森林病毒、比巴鲁病毒、卡巴斯欧病毒、盖塔病毒、高地J病毒、特罗卡拉病毒、乌纳病毒、恩杜穆病毒和米德尔伯格(Middleburg)病毒等)、沙粒病毒(例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、马丘波病毒、胡宁病毒和拉沙热病毒)、黄热病毒(例如蜱传脑炎病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、GB病毒、阿波伊病毒、巴格扎病毒)、边山病毒、朱格拉病毒、卡达姆病毒、达喀尔蝙蝠病毒、摩多克病毒、玻瓦桑病毒、乌苏图病毒和萨尔别霍病毒等)、弹状病毒(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)、副粘病毒(例如腮腺炎或麻疹)和正黏病毒(例如流感病毒)。

可优选使用的其他包膜蛋白包括源自内源性逆转录病毒(例如猫科动物内源性逆转录病毒和狒狒内源性逆转录病毒)和密切相关的γ逆转录病毒(gammaretroviruses)(例如莫洛尼白血病病毒、MLV-E、MLV-A、长臂猿白血病病毒、GALV、猫白血病病毒、考拉逆转录病毒、特雷格鸭脾坏死病毒、蝰蛇逆转录病毒、小鸡合胞病毒、加德纳-阿恩斯坦猫肉瘤病毒和猪C型肿瘤病毒等)的病毒。这些γ逆转录病毒可用作用于靶向原代细胞的包膜蛋白和env基因的来源。当宿主细胞是原代细胞时特别优选γ逆转录病毒。

可以选择包膜蛋白以靶向特定所需宿主细胞。例如，可将靶向特定受体如多巴胺受体用于脑递送。另一靶标可以是血管内皮。可以使用衍生自丝状病毒科中任何病毒(例如，奎瓦病毒(Cuevavirus)、滇丝病毒(Dianlovirus)、埃博拉病毒和马尔堡病毒)的包膜蛋白靶向这些细胞。埃博拉病毒的种包括泰森林埃博拉病毒、扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、本迪布焦埃博拉病毒和雷斯顿埃博拉病毒。

此外，在实施方式中，糖蛋白可以经历转录后修饰。例如，在一个实施方式中，埃博拉病毒的GP可以在翻译后被修饰成为GP1和GP2糖蛋白。在另一个实施方式中，可采用具有假型包膜的不同的慢病毒衣壳(例如FIV或SHIV[美国专利号5,654,195])。SHIV假型载体在动物模型例如猴子中很好用。

本文所提供的慢病毒载体通常包含至少一种辅助质粒，其包含gag、pol或rev基因中的至少一种。可以在单独质粒上提供gag、pol和rev基因中的每一个，或者可以在同一质粒上一起提供一个或多个基因。在一个实施方式中，gag、pol和rev基因位于同一质粒上(例如图1)。在另一个实施方式中，gag和pol基因在第一质粒上，rev基因在第二质粒上(例如图2)。因此，3-载体(例如，图1)和4-载体(例如，图2)系统均可用于产生如本文所述的慢病毒。在实施方式中，治疗载体，至少一种包膜质粒和至少一种辅助质粒被转染到包装细胞，例如，包装细胞系中。包装细胞系的非限制性例子是293T/17 HEK细胞系。当治疗载体、包膜质粒和至少一种辅助质粒被转染到包装细胞系中时，最终生产出慢病毒颗粒。本文所提供的慢病毒载体通常包含至少一种辅助质粒，其包含gag、pol或rev基因中的至少一种。可以在单独质粒上提供gag、pol和rev基因中的每一个，或者可以在同一质粒上一起提供一个或多个基因。在一个实施方式中，gag、pol和rev基因位于同一质粒上(例如图1)。在另一个实施方式中，gag和pol基因在第一质粒上，rev基因在第二质粒上(例如图2)。因此，3-载体和4-载体系统均可用于生产如本文所述的慢病毒。在实施方式中，治疗载体，至少一种包膜质粒和至少一种辅助质粒转染到包装细胞，例如，包装细胞系中。包装细胞系的非限制性例子是293T/17 HEK细胞系。当治疗载体、包膜质粒和至少一种辅助质粒被转染到包装细胞系中时，最终生产出慢病毒颗粒。

另一方面公开了用于表达慢病毒颗粒的慢病毒载体系统。该系统包括如本文所述的慢病毒载体；用于表达经优化用于感染细胞的包膜蛋白的包膜质粒；和用于表达gag，pol和rev基因的至少一种辅助质粒，其中当慢病毒载体、包膜质粒和至少一种辅助质粒被转染到包装细胞系中时，慢病毒颗粒由包装细胞系产生，其中慢病毒颗粒能够抑制PAH的产生。

在另一方面，在本文中亦称为治疗载体的慢病毒载体包含下述元件：杂合5’长末端重复(劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子/5’长末端重复(LTR))(SEQ ID NO：13-14)，Psi包装信号(RNA包装位点)(SEQ ID NO：15)，Rev-应答元件(RRE)(SEQ ID NO：16)，中央多聚嘌呤区(cPPT)(多聚嘌呤区)(SEQ ID NO：17)，人α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)(SEQ ID NO：4)，苯丙氨酸羟化酶(PAH)(SEQ ID NO：1、2和70-76)，长土拨鼠转录后调节元件(WPRE)序列(SEQ ID NO：18)，和ΔU33’LTR(SEQ ID NO：19)。在实施方式中，在本文中亦称为治疗载体的慢病毒载体包含下述元件：杂合5’长末端重复(劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子/5’长末端重复(LTR))(SEQ ID NO：13-14)，Psi包装信号(RNA包装位点)(SEQ ID NO：15)，Rev-应答元件(RRE)(SEQ ID NO：16)，中央多聚嘌呤区(cPPT)(多聚嘌呤区)(SEQ ID NO：17)，H1启动子(SEQ ID NO：20)，PAH shRNA(SEQ ID NO：11和12)，人α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)(SEQ IDNO：4)，长土拨鼠转录后调节元件(WPRE)序列(SEQ ID NO：18)，和ΔU33’LTR(SEQ ID NO：19)。在实施方式中，可用通过取代、缺失、添加或突变的序列变异来修饰本文的序列参考本。

在另一方面中，辅助质粒包含下述元件：CMV增强子/鸡β肌动蛋白启动子(SEQ IDNO：21)；HIV组件gag(SEQ ID NO：22)；HIV组件pol(SEQ ID NO：23)；HIV Int(SEQ ID NO：24)；HIV RRE(SEQ ID NO：25)；和HIV Rev(SEQ ID NO：26)。另一方面，可以修饰辅助质粒以包含用于表达gag基因(SEQ ID NO：22)和pol基因(SEQ ID NO：23)的第一辅助质粒，和用于表达rev基因(SEQ ID NO：26)的第二分开的质粒。在实施方式中，可用通过取代、缺失、添加或突变的序列变异来修饰本文的序列参考本。

在另一方面中，包膜质粒包含下述元件：巨细胞病毒(CMV)启动子(SEQ ID NO：27)和水疱性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)(SEQ ID NO：28)。在实施方式中，可用通过取代、缺失、添加或突变的序列变异来修饰本文的序列参考本。

在多个方面中，通过在不丧失载体功能的情况下取代、添加、减去或突变多个元件来修饰用于慢病毒包装的质粒。例如但不限于以下元件可以代替包含包装系统的质粒中的相似元件：延长因子-1α(EF-1α)，和泛素C(UbC)启动子可以替代CMV或CAG启动子。SV40多聚A和bGH多聚A可替换兔β珠蛋白多聚A。在另一个方面，辅助质粒中的HIV序列可由不同的HIV株或进化枝构建。例如，VSV-G糖蛋白可以用膜糖蛋白取代，其衍生自γ逆转录病毒(例如长臂猿白血病病毒，GALV，鼠白血病病毒10A1，MLV，考拉逆转录病毒，特雷格鸭脾坏死病毒，蝰蛇逆转录病毒，鸡合胞病毒，加德纳-阿恩斯坦猫肉瘤病毒和猪C型肿瘤病毒等)，内源性逆转录病毒(例如猫科动物内源性病毒(RD114)，人内源性逆转录病毒如HERV-W和狒狒内源性逆转录病毒，BaEV等)，丽沙病毒(如狂犬病病毒，FUG)，哺乳动物沙粒病毒(mammarenavirus)(如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，LCMV，流感病毒如甲型流感病毒，甲型流感禽瘟病毒，FPV，乙型流感病毒，丙型流感病毒，丁型流感病毒，传染性鲑鱼贫血病毒，夸兰扎病毒(Quaranjavirus)和托高土病毒(Thogotovirus))，甲病毒(例如，罗斯河甲病毒，RRV或埃博拉病毒，EboV，例如苏丹埃博拉病毒，泰森林埃博拉病毒，扎伊尔埃博拉病毒，本迪布焦埃博拉病毒和雷斯顿埃博拉病毒)。

多种慢病毒包装系统可以商业获得(例如，来自马里兰州罗克维尔的OriGene技术公司的Lenti-vpak包装试剂盒)，并且也可以如本文所述进行设计。此外，替代或修改慢病毒包装系统的各个方面以改善任意数量的相关因素(包括慢病毒颗粒的生产效率)属于相关领域技术人员的技能范围之内。

在另一方面中，可以使用腺相关病毒(AAV)载体。在实施方式中，AAV载体是AAV-DJ血清型。在实施方式中，AAV载体是血清型1-11中的任一种。在实施方式中，AAV血清型是AAV-2。在实施方式中，AAV载体是为优化人肝细胞转导而工程化改造的非天然类型。

AAV载体构建。在公开的方面中，将PAH编码序列(SEQ ID NO：1、2和70-76)和凝血酶原增强子(SEQ ID NO：3)以及hAAT启动子(SEQ ID NO：4)插入pAAV质粒(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)，加利福尼亚州圣地亚哥)。通过欧陆基因组学公司(EurofinsGenomics)(肯塔基州路易斯维尔)合成PAH编码序列，侧接EcoRI和SalI限制性位点。pAAV质粒和PAH序列被用EcoRI和SalI酶消化并连接在一起。通过测序验证PAH序列的插入。然后，通过欧陆基因组学公司(肯塔基州路易斯维尔)合成凝血酶原增强子和hAAT启动子，侧接MluI和EcoRI限制性位点。使用MluI和EcoRI酶消化含有PAH编码序列和凝血酶原增强子/hAAT启动子序列的pAAV质粒并连接到一起。通过测序验证凝血酶原增强子/hAAT启动子序列的插入。

此外，用于表达PAH的代表性AAV质粒系统可以包含AAV辅助质粒、AAV质粒和AAVRev/Cap质粒。AAV辅助质粒可包含左ITR(SEQ ID NO：29)、凝血酶原增强子(SEQ ID NO：3)、人抗α胰蛋白酶启动子(SEQ ID NO：4)、PAH元件(SEQ ID NO：1、2和70-76)、多聚A元件(SEQID NO：30)和右ITR(SEQ ID NO：31)。AAV质粒可包含合适的启动子元件(SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27)、E2A元件(SEQ ID NO：32)、E4元件(SEQ ID NO：33)、病毒相关(VA)RNA元件(SEQ ID NO：34)和多聚A元件(SEQ ID NO：30)。AAV Rep/Cap质粒可包含合适的启动子元件(SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27)、Rep元件(SEQ ID NO：35；AAV2 Rep)、Cap元件(SEQ IDNO：36(AAV2 Cap)、SEQ ID NO：37(AAV8 Cap)或SEQ ID NO：38(AAV DJ Cap))和多聚A元件(SEQ ID NO：30)。

在实施方式中，提供了AAV/DJ质粒，其包含凝血酶原增强子和PAH序列(AAV/DJ-Pro-PAH)。在实施方式中，PAH序列是本文所述密码子优化的PAH序列中的任一种。在实施方式中，提供了AAV/DJ质粒，其包含凝血酶原增强子、内含子和PAH序列(AAV/DJ-Pro-内含子-PAH)。在实施方式中，内含子是人β珠蛋白内含子。在实施方式中，内含子是兔β珠蛋白内含子。在实施方式中，提供了AAV/DJ质粒，其包含GFP(AAV/DJ-GFP)。

在实施方式中，提供了AAV2质粒，其包含凝血酶原增强子和PAH序列(AAV2-Pro-PAH)。在实施方式中，PAH序列是本文所述密码子优化的PAH序列中的任一种。在实施方式中，提供了AAV2质粒，其包含凝血酶原增强子、内含子和PAH序列(AAV2-Pro-内含子-PAH)。在实施方式中，内含子是人β珠蛋白内含子。在实施方式中，内含子是兔β珠蛋白内含子。在实施方式中，提供了AAV2，其包含GFP(AAV2-GFP)。

在实施方式中，本文所公开的任何AAV载体可以包含表达调节RNA的编码序列。在实施方式中，调节RNA是lncRNA。在实施方式中，调节RNA是微小RNA。在实施方式中，调节RNA是piRNA。在实施方式中，调节RNA是shRNA。在实施方式中，调节RNA是小RNA序列，其包含与SEQ ID NO：11或12具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％或更高百分比相同性的序列。

AAV颗粒的产生。AAV-PAH质粒可与质粒pAAV-RC2(细胞生物实验室公司)和pHelper(细胞生物实验室公司)组合。pAAV-RC2质粒可包含Rep和AAV-2衣壳基因且pHelper可包含腺病毒E2A、E4和VA基因。AAV衣壳也可包含AAV-8(SEQ ID NO：39)或AAV-DJ(SEQ IDNO：40)序列。为了生产AAV颗粒，这些质粒可以1∶1∶1的比例(pAAV-PAH：pAAV-RC2：pHelper)转染进293T细胞。为了转染150mm培养皿(碧迪(BD Falcon))中的细胞，可以将每种质粒10微克共同加入1ml的DMEM中。在另一个管中，可以将60微升的转染试剂PEI(1微克/ml)(聚合物科学公司(Polysciences))添加到1ml的DMEM中。两个试管可以被混合在一起并允许孵育15分钟。然后转染混合物可以被加入细胞，3天后收集细胞。细胞可以通过在干冰/异丙醇中冷冻/解冻裂解裂解。Benzonase核酸酶(西格玛(Sigma))可以在37摄氏度下加入细胞裂解物30分钟。然后可以通过在4摄氏度以12,000rpm离心15分钟来沉淀细胞碎片。可以收集上清液，然后加入靶细胞。

剂量和剂型

公开的组合物可以用于在疾病的各个阶段治疗PKU患者。本文公开的载体组合物允许目标基因或序列的短期、中期或长期表达以及本文所述载体的游离型维持。因此，给药方案可以根据所治疗的病症和给药方法而不同。

在实施方式中，可以不同剂量向需要的对象给予载体组合物。具体来说，可给予对象约≥10⁶个感染剂量(平均需要1剂量来转导1个靶细胞)。更具体地，可给予对象每公斤体重约≥10⁷、约≥10⁸、约≥10⁹、或约≥10¹⁰、约≥10¹¹或约≥10¹²个感染剂量，或这些数值之间任意数量的剂量。给药的上限针对各个疾病指征来确定，且取决于各产品或产品批次各自的毒性/安全性情况。

另外，本公开的载体组合物可以定期给予，例如一天一次或两次，或任何其他合适时间段。例如，载体组合物可以按照每周一次、隔周一次、三周一次、每月一次、隔月一次、每三个月一次、每六个月一次、每九个月一次、每年一次，每十八个月一次、每两年一次、每三十个月一次、或每三年一次给予有需要的对象。

在实施方式中，所公开的载体组合物以药物组合物的形式给药。在实施方式中，药物组合物可以配制成多种剂型，包括但不限于用于临床应用的鼻、肺、口服、局部或肠胃外剂型。各种剂型都可包含各种增溶剂、崩解剂、表面活性剂、填充剂、增稠剂、粘合剂、稀释剂如润湿剂或其它药学上可接受的赋形剂。药物组合物也可以配制用于注射、吹入、输注或皮内暴露。例如，可注射制剂可将本文所公开的载体包含在合适pH和张力下的水性或非水性溶液中。

所公开的载体组合物可以使用引导注射通过直接注射到肝脏中给予对象。在一些实施方式中，载体可以全身给予，经由动脉或静脉循环。在一些实施方式中，载体组合物可以通过引导插管给予紧邻肝脏(包括脾脏和胰腺)周围的组织。在一些实施方式中，载体组合物可以通过引导插管或针给予肾脏。在一些实施方式中，载体组合物可以通过引导插管或针给予大脑的特定区域，包括黑质。在一些实施方式中，载体组合物可以通过注射到门静脉或门窦中递送，以及可以通过注射到脐静脉中递送。

本文所述载体组合物可以采用各种药学上可接受的方法给药，例如鼻内、口颊、舌下、口服、直肠、眼、胃肠外(静脉内、皮内、肌肉内、皮下、腹膜内)、经肺、阴道内、局部(locally)给药、局部外用(topically)、划开后局部外用、经粘膜给予、通过气溶胶、含于半固介质如琼脂糖或明胶中或通过口颊喷剂或鼻喷剂给药。

此外，本文所述载体组合物可以配制成任何药学上可接受的剂型，例如固体剂型，片剂，丸剂，锭剂，胶囊，液体分散体，凝胶，气溶胶，肺气雾剂，鼻气雾剂，软膏，乳膏，半-固体剂型，溶液，乳剂和悬混剂。此外，药物组合物可以是控释制剂、缓释制剂、速释制剂，或以上之任意组合。并且，药物组合物可以是透皮递送系统。

一些实施方式中，药物组合物可以配制成口服给药的固体剂型，而固体剂型可以是粉末、颗粒剂、胶囊、片剂或丸剂。一些实施方式中，固体剂型可包括一种或多种赋形剂，例如碳酸钙、淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素或明胶。此外，固体剂型在赋形剂外还可包括润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁。在一些实施方式中，口服剂型可以是立即释放或调节释放形式。释放调节型剂型包括控释或延长释放、肠释放等。调节释放调节型剂型中使用的赋形剂是本领域普通技术人员公知的。

在实施方式中，药物组合物可以配制成舌下或口含剂型。这样的剂型包括经舌下给药的舌下片剂或溶液组合物和放置在脸颊和牙龈之间的口颊片剂。

在实施方式中，药物组合物可以配制成鼻腔剂型。本公开的这种剂型包括用于经鼻递送的溶液、悬混剂和凝胶组合物。

在实施方式中，药物组合物可以配制成用于口服给药的液体剂型，例如悬混剂，乳液或糖浆。在实施方式中，液体剂型在常用的简单稀释剂如水和液体石蜡之外还可包括各种赋形剂，如保湿剂、甜味剂、芳香剂或防腐剂。在实施方式中，可将组合物配制成适合向儿科患者给药。

一些实施方式中，药物组合物可以配制成胃肠外给药剂型，例如无菌水性溶液、悬混剂、乳剂、非水溶液或栓剂。在实施方式中，溶液或悬混剂可包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油或可注射的酯如油酸乙酯。

药物组合物的剂量可根据患者的体重、年龄、性别、给药时间和方式、排泄率(exretion rate)和疾病的严重程度而不同。

一些实施方式中，PKU的治疗是用针或血管内插管将本文所公开载体构建体向肝脏内直接引导注射来实现。在实施方式中，载体组合物通过静脉或动脉插管或注射、皮内递送、肌内递送或注射到肝脏附近的引流器官(draining organ)中而施用到脑脊液、血液或淋巴循环中。

给出以下实施例以说明本发明的方面。然而应理解，本发明不局限于这些实施例中所述具体病症或细节。本文引用的所有印刷出版物均通过引用具体纳入本文。

实施例

实施例1.慢病毒载体系统的开发

开发了慢病毒载体系统，如图1所总结(环化形式)。

在293T/17 HEK细胞(购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，弗吉尼亚州玛纳萨斯)中，在用治疗载体、包膜质粒和辅助质粒转染后，生产慢病毒颗粒。293T/17 HEK细胞(由其生产功能性病毒颗粒)的转染使用试剂聚(乙烯亚胺)(PEI)来提高质粒DNA的摄取效率。先将质粒和DNA按照3∶1(PEI比DNA的质量比)的比例分别加入不含血清的培养基中。2-3天后，收集细胞培养基，通过高速离心和/或过滤然后阴离子交换色谱纯化慢病毒颗粒。慢病毒颗粒的浓度可以用转导单位/ml(TU/ml)表示。如下确定TU：测定培养液中的HIV p24水平(p24蛋白包含于慢病毒颗粒内)，定量PCR测定每个转导细胞的病毒DNA拷贝数，或通过感染细胞和采用光学手段(如果载体编码荧光素酶或荧光蛋白标志物)。

设计了一种3-载体系统(即，其包含2-载体慢病毒包装系统)用于生产慢病毒颗粒。3-载体系统的示意图如图1所示。简而言之，并参照图1，最上方的载体是辅助质粒，此例中包含Rev。图1中部的载体是包膜质粒。最下面的载体是治疗载体，如文中所述。

参照图1，辅助+Rev质粒包含：CMV增强子/鸡β肌动蛋白启动子(SEQ ID NO：21)；鸡β肌动蛋白内含子(SEQ ID NO：39)；HIV Gag(SEQ ID NO：22)；HIV Pol(SEQ ID NO：23)；HIV整合酶(SEQ ID NO：24)；HIV RRE(SEQ ID NO：25)；HIV Rev(SEQ ID NO：26)；和兔β珠蛋白多聚A(SEQ ID NO：40)。

包膜质粒包含CMV启动子(SEQ ID NO：27)；β珠蛋白内含子(SEQ ID NO：5或6)；VSV-G包膜糖蛋白(SEQ ID NO：28)；和兔β珠蛋白多聚A(SEQ ID NO：40)。

公开了3-载体系统的合成，其包含含有辅助质粒(+Rev)和包膜质粒的2-载体慢病毒包装系统。

材料和方法：

辅助质粒的构建：辅助质粒的构建先从pNL4-3 HIV质粒(美国国立卫生研究院艾滋病试剂计划(NIH Aids Reagent Program))PCR扩增含有Gag、Pol和整合酶基因的DNA片段。设计引物以用EcoRI和NotI限制性位点扩增片段，其可用于插入pCDNA3质粒(英杰公司(Invitrogen))中的相同位点。正向引物是(5'-TAAGCAGAATTCATGAATTTGCCAGGAAGAT-3’)(SEQ ID NO：41)，反向引物是(5'-CCATACAATGAATGGACACTAGGCGGCCGCACGAAT-3’)(SEQ IDNO：42)。

Gag、Pol、整合酶片段的序列如下所示：

然后，由欧陆基因组学公司合成含有Rev、Rev和兔β珠蛋白多聚A序列及两侧XbaI和Xmal限制性位点的DNA片段。然后将该DNA片段在XbaI和XmaI限制性位点插入质粒。该DNA序列如下所示：

最后，用CAG启动子(CMV增强子，鸡β肌动蛋白启动子加鸡β肌动蛋白内含子序列)替换pCDNA3.1的CMV启动子。由欧陆基因组学公司合成含有CAG增强子/启动子/内含子序列及两侧MluI和EcoRI限制性位点的DNA片段。然后将DNA片段在MluI和EcoRI限制性位点处插入质粒。该DNA序列如下所示：

构建VSV-G包膜质粒：

由欧陆基因组学公司合成两侧带有EcoRI限制性位点的疱疹性口炎印第安纳病毒糖蛋白(VSV-G)序列。然后将该DNA片段在EcoRI限制性位点处插入pCDNA3.1质粒(英杰公司)，并用CMV特异性引物测序确定取向正确。

该DNA序列如下所示：

还用本文所述的方法和材料设计并生产了4-载体系统，其包含3-载体慢病毒包装系统。4-载体系统的示意图如图2所示。简而言之，并参照图2，最上方的载体是辅助质粒，此例中不含Rev。第二个载体是分开的Rev质粒。第三个载体是包膜质粒。最下面的载体是治疗载体，如文中所述。

参照图2，辅助质粒包含：CMV增强子/鸡β肌动蛋白启动子(SEQ ID NO：21)；鸡β肌动蛋白内含子(SEQ ID NO：39)；HIV Gag(SEQ ID NO：22)；HIV Pol(SEQ ID NO：23)；HIV整合酶(SEQ ID NO：24)；HIV RRE(SEQ ID NO：25)；和兔β珠蛋白多聚A(SEQ ID NO：40)。

Rev质粒包含RSV启动子和HIV Rev(SEQ ID NO：46)；以及兔β珠蛋白多聚A(SEQ IDNO：40)。

在一个方面中，表达PAH的治疗性慢病毒载体包含图3载体A中所示的所有元件。在另一个方面中，表达PAH的治疗性慢病毒载体包含图3载体B中所示的所有元件。在另一个方面中，表达PAH的治疗性慢病毒载体包含图3载体C中所示的所有元件。在另一个方面中，表达PAH的治疗性慢病毒载体包含图3载体D中所示的所有元件。

公开了4-载体系统的合成，其包含含有辅助质粒、Rev和包膜质粒的3-载体慢病毒包装系统。

材料和方法：

无Rev辅助质粒的构建：

通过插入含有RRE和兔β珠蛋白多聚A序列的DNA片段构建不含Rev的辅助质粒。该序列由欧陆基因组学公司合成，侧接XbaI和XmaI限制性位点。然后将RRE/兔多聚Aβ珠蛋白序列在XbaI和XmaI限制性位点处插入辅助质粒。

该DNA序列如下所示：

Rev质粒的构建：

由欧陆基因组学公司将RSV启动子和HIV Rev序列合成为单个DNA片段，侧接Mfel和XbaI限制性位点。然后将该DNA片段在MfeI和XbaI限制性位点处插入pCDNA3.1质粒(英杰公司)中，以RSV启动子替换CMV启动子。该DNA序列如下所示：

用于包装系统的质粒可以用类似的元件修饰，并且可能地，可以去除内含子序列而不丢失载体功能。例如，可用以下元件替换包装系统中的类似元件：

启动子：延长因子-1α(EF-1α)启动子(SEQ ID NO：47)，磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子(SEQ ID NO：48)，甲状腺素结合球蛋白启动子(SEQ ID NO：60)，和泛素C(UbC)启动子(SEQ ID NO：49)可替换CMV启动子(SEQ ID NO：27)或CMV增强子/鸡β肌动蛋白启动子(SEQID NO：21)。这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。

多聚A序列：SV40多聚A(SEQ ID NO：50)和bGH多聚A(SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：51)可替换兔β珠蛋白多聚A(SEQ ID NO：40)。这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。

HIV Gag、Pol和整合酶序列：辅助质粒中的HIV序列可由不同的HIV株或进化枝构建。例如，HIV Gag(SEQ ID NO：22)，HIV Pol(SEQ ID NO：23)；和来自Bal株的HIV Int(SEQID NO：24)可与辅助质粒/辅助质粒+Rev质粒中所包含的gag、pol和int序列互换，如本文所述。这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。

包膜：VSV-G糖蛋白可以由来自下述病毒的膜糖蛋白取代：猫科动物内源性病毒(RD114)包膜(SEQ ID NO：52)、长臂猿白血病病毒(GALV)包膜(SEQ ID NO：53)、狂犬病毒(FUG)包膜(SEQ ID NO：54)，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)包膜(SEQ ID NO：55)，甲型流感禽瘟病毒(FPV)包膜(SEQ ID NO：56)，罗斯河甲病毒(RRV)包膜(SEQ ID NO：57)，鼠白血病病毒10A1(MLV 10A1)包膜(SEQ ID NO：58)，或埃博拉病毒(EboV)包膜(SEQ ID NO：59)。这些包膜的序列在本文序列部分中确定。此外，这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。

总之，可以对3-载体对比4-载体系统进行如下所述的比较和对比。3-载体慢病毒载体系统可包含：(1)辅助质粒：HIV Gag、Pol、整合酶片段(SEQ ID NO：43)、RRE和Rev；(2)包膜质粒：VSV-G包膜；和(3)治疗载体：RSV、5'LTR、Psi包装信号、RRE、cPPT、凝血酶原增强子、α1抗-胰蛋白酶启动子、苯丙氨酸羟化酶、WPRE和3'ΔLTR。4-载体慢病毒载体系统可包含：(1)辅助质粒：HIV Gag、Pol、整合酶片段(SEQ ID NO：43)和RRE；(2)Rev质粒：Rev；(3)包膜质粒：VSV-G包膜；和(4)治疗载体：RSV、5'LTR、Psi包装信号、RRE、cPPT、凝血酶原增强子、α1抗-胰蛋白酶启动子、苯丙氨酸羟化酶、WPRE和3'ΔLTR。与上述元件相对应的序列在本文序列表部分中确定。

实施例2.治疗载体

示例性治疗载体已经被设计和开发为，例如，如图3所示。

首先参照图3的载体A，从左到右，关键遗传元件如下所示：杂合5’长末端重复(RSV/LTR)，Psi序列(RNA包装位点)，RRE(Rev-应答元件)，cPPT(聚嘌呤区)，凝血酶原增强子，hAAT启动子，PAH序列(包括，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体，如本文所详述)，土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，和在U3区域有缺失的LTR。

然后参照图3的载体B，从左到右，关键遗传元件如下所示：杂合5’长末端重复(RSV/LTR)，Psi序列(RNA包装位点)，RRE(Rev-应答元件)，cPPT(聚嘌呤区)，一个位于凝血酶原增强子上游的HNF1/HNF4(肝细胞核因子)结合位点，hAAT启动子，PAH序列(包括，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体，如本文所详述)，土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，和在U3区域具有缺失的LTR。

然后参照图3的载体C，从左到右，关键遗传元件如下所示：杂合5’长末端重复(RSV/LTR)，Psi序列(RNA包装位点)，RRE(Rev-应答元件)，cPPT(聚嘌呤区)，三个位于凝血酶原增强子上游的HNF1/4(肝细胞核因子)结合位点，hAAT启动子，PAH序列(包括，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体，如本文所详述)，土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，和在U3区域具有缺失的LTR。

然后参照图3的载体D，从左到右，关键遗传元件如下所示：杂合5’长末端重复(RSV/LTR)，Psi序列(RNA包装位点)，RRE(Rev-应答元件)，cPPT(聚嘌呤区)，五个位于凝血酶原增强子上游的HNF1(肝细胞核因子)结合位点，hAAT启动子，PAH序列(包括，在实施方式中，密码子优化的PAH序列或其变体，如本文所详述)，土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，和在U3区域具有缺失的LTR。

为了产生图3中概括概述的载体，采用了本文所述的方法和材料以及本领域技术人员所理解的其他方法和材料。

抑制性RNA设计：将智人(Homo sapiens)苯丙氨酸羟化酶(PAH)(NM_000277.1)mRNA用于搜寻潜在shRNA候选物以敲减人细胞中的PAH水平。潜在的RNA shRNA序列选自通过siRNA或shRNA设计程序所选择的候选物，例如来自Broad研究所(Broad Institute)主办的GPP网页门户(GPP Web Portal，portals.broadinstitute.org/gpp/public/)或来自赛默飞世尔科学公司(Thermo Scientifc)的BLOCK-iT RNAi设计器(https：//rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)。单独选择的shRNA序列被插入慢病毒载体，紧邻RNA聚合酶III启动子如H1(H1启动子)(SEQ ID NO：20)的3′，以调节shRNA表达。用这些慢病毒shRNA构建体转导细胞并测定特定mRNA水平的变化。

载体构建：为了合成靶向PAH的shRNA，通过欧陆(Eurofins)MWG操纵子合成含有BamHI和EcoRI限制性位点的寡核苷酸序列。将重叠的有义和反义寡核苷酸序列混合并在从70摄氏度冷却至室温的过程中退火。使用限制性酶BamHI和EcoRI在37摄氏度消化慢病毒载体1小时。琼脂糖凝胶电泳纯化经消化的慢病毒载体，并用赛默科技的DNA凝胶提取试剂盒从凝胶中提取经消化的慢病毒载体。测定DNA浓度，并混合载体与寡核苷酸(3∶1比例)，退火，然后连接。用T4 DNA连接酶在室温下进行连接反应30分钟。将2.5微升的连接混合物加入25微升的STBL3感受态细菌细胞中。42摄氏度热激完成转化。将细菌细胞涂布在含有氨苄青霉素的琼脂平板上，回收抗药性菌落(表明存在氨苄青霉素抗性质粒)，然后在LB液体培养基中扩增。为了确认寡核苷酸序列的插入，用赛默飞世尔科技公司的DNA小抽试剂盒(DNAmini prep kit)从收获的细菌培养物中提取质粒DNA。使用调控shRNA表达的启动子的特异性引物进行DNA测序验证shRNA序列在慢病毒载体中的插入。使用以下编码序列，确定示例shRNA序列对PAH的敲低。

PAH shRNA序列#1：

PAH shRNA序列#2：

实施例3.肝特异性凝血酶原增强子/hAAT启动子

使用包含肝特异性凝血酶原增强子(SEQ ID NO：3)和人α-1抗胰蛋白酶启动子(SEQ ID NO：4)的慢病毒载体转导Hepa1-6小鼠肝癌细胞和Hep3B人癌细胞，以产生含有凝血酶原增强子和人α-1抗胰蛋白酶启动子的DNA片段。所得DNA序列如下所示：

这些感染的结果在本文其他实施例中详述。

实施例4.带有凝血酶原增强子和肝细胞核因子(HNF)结合位点的hAAT启动子

使用包含肝特异性凝血酶原增强子(SEQ ID NO：3)、人α-1抗胰蛋白酶启动子(SEQID NO：4)和一个或多个肝细胞核因子(HNF)结合位点的慢病毒载体转导Hepa1-6小鼠肝癌细胞和Hep3B人癌细胞。所得的包含含有凝血酶原增强子、人α-1抗胰蛋白酶启动子和五个HNF1结合位点(用下划线指示)的DNA片段的DNA序列如下：

所得的包含含有凝血酶原增强子、人α-1抗胰蛋白酶启动子和一个HNF1/HNF4结合位点(HNF1用下划线指示；HNF4用黑体指示)的DNA片段的DNA序列如下：

所得的包含含有凝血酶原增强子、人α-1抗胰蛋白酶启动子和三个HNF1/HNF4结合位点(HNF1用下划线指示；HNF4用黑体指示)的DNA片段的DNA序列如下：

来自这些载体的密码子优化的PAH表达在本文其他实施例中详述。

实施例5.用于合成含有PAH的载体的材料和方法

智人(Homo sapiens)苯丙氨酸羟化酶(hPAH)mRNA的序列(Gen Bank：NM_000277.1)是由欧陆基因组学公司(肯塔基州路易斯维尔)用位于基因远端和近端的EcoRI和SalI限制性酶位点化学合成的。将使用EcoRI和SalI限制性酶处理的hPAH在杂合启动子的控制下连接到pCDH慢病毒质粒(系统生物学公司(System Biosciences)，加利福尼亚州)中，其包含部分ApoE(NM_000001.11，U35114.1)或凝血酶原(AF478696.1)和hAAT(HG98385.1)基因座控制区。

使用限制性酶BamHI和EcoRI(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)在37摄氏度消化慢病毒载体和hPAH序列2小时。消化的慢病毒载体经琼脂糖凝胶电泳纯化，并用赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)的DNA凝胶提取试剂盒从凝胶中提取。测定DNA浓度，然后与PAH序列以插入物比载体3∶1的比例混合。混合物用T4 DNA连接酶(NEB)在室温下连接30分钟。将2.5微升的连接混合物加入25微升STBL3感受态细菌细胞(赛默飞世尔科技公司)中。42摄氏度热激进行转化。细菌细胞被接种在含有氨苄青霉素的琼脂平板上并在LB液体培养基中扩增集落。为了确认PAH序列的插入，用赛默飞世尔科技公司的DNA小抽试剂盒从收获的细菌培养物中提取质粒DNA。慢病毒载体(LV)中PAH序列的插入通过DNA测序(欧陆基因组学公司)验证。然后，通过欧陆基因组学公司合成带有ClaI和EcoRI限制性位点的ApoE增强子/hAAT启动子或凝血酶原增强子/hAAT启动子序列。含有PAH编码序列和杂合启动子的慢病毒载体用ClaI和EcoRI酶消化并连接到一起。含有杂合启动子的质粒通过DNA测序验证。然后，含有hPAH和杂合启动子序列的慢病毒载体被用于包装慢病毒颗粒以测试它们在被转导的细胞中表达PAH的能力。使用慢病毒转导哺乳动物细胞。3天后收集细胞，并通过针对PAH表达的免疫印迹分析蛋白质。

hPAH序列的调节：

肝特异性增强子-启动子被添加至慢病毒载体以肝特异性方式调节PAH的表达。具体地，慢病毒载体中凝血酶原增强子与人α-1-抗胰蛋白酶启动子组合以调节PAH表达。将转基因表达限制到肝细胞是用于治疗苯丙酮尿症的基因药物的载体安全性和靶向特异性的重要考虑因素。

实施例6.密码子优化的PAH序列的合成

智人(Homo sapiens)苯丙氨酸羟化酶(hPAH)mRNA(Gen Bank：NM_000277.1)序列中的密码子内的某些碱基被改变，以创建OPT2 PAH序列(SEQ ID NO：2)和OPT3 PAH密码子优化的序列(SEQ ID NO：70)。侧接EcoRI和SalI限制性位点的OPT2和OPT3 PAH序列由欧陆基因组学公司和IDT合成，并连接到由EcoRI和SalI消化的慢病毒载体中。

杂合PAH密码子优化的序列通过用StuI(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs))限制性核酸内切酶消化构建。C-端片段是从包含OPT2或OPT3序列的LV-Pro-hAAT-PAH质粒消化所得。C-端OPT3片段被连接回包含N-端OPT2序列的质粒上以创建OPT2/3序列(SEQ ID NO：71)。C-端OPT2序列被连接回包含N-端OPT3序列的质粒上以创建OPT3/2序列(SEQ ID NO：72)。片段的正确取向通过测序验证(欧陆基因组学公司)。

实施例7.用在Hepa1-6细胞中表达密码子优化版本的PAH的LV-Pro-hAAT-hPAH的 PAH表达。

该实施例说明使用含有Pro hAAT和PAH密码子优化版本的慢病毒载体的PAH表达。

如实施例6中所述，hPAH是密码子优化的(赛默飞基因技术(GeneArt Thermo)和IDT)、合成的(IDT和欧陆基因组学公司)，以及插入到含有凝血酶原增强子-hAAT启动子的慢病毒载体中的。通过DNA测序(欧陆基因组学公司)验证序列的插入。

然后，包含hPAH或密码子优化的hPAH的慢病毒载体被用于转导小鼠Hepa1-6细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))。使用感染复数(MOI)为5的慢病毒颗粒转导细胞，并在3天后通过针对PAH表达的免疫印迹分析蛋白质表达。用含有1％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液裂解细胞。细胞裂解物在10000RPM离心15分钟，用蛋白测定试剂(伯乐公司(Bio-Rad))测定蛋白浓度。蛋白质裂解物在4-12％Tris-Bis凝胶(赛默飞世尔科技公司)上分离，并在伯乐转印单元(Bio-Rad transfer unit)中转印12个小时。PAH的表达通过使用抗-PAH抗体(西格玛密理博公司(MilliporeSigma))的免疫印迹检测，并将抗-β肌动蛋白抗体(西格玛密理博公司)用于加样对照。PAH表达由凝血酶原增强子和hAAT启动子驱动。在各种情况下，慢病毒载体纳入了hPAH或hPAH基因的密码子优化版本。

图4A显示了证明在Hepa1-6细胞中来自含有凝血酶原-hAAT PAH和凝血酶原-hAAT密码子优化的PAH(OPT2；SEQ ID NO：2)的慢病毒载体的PAH表达数据。PAH的密码子优化版本(OPT2)的表达比hPAH的表达低44％。图4B通过免疫印迹比较了在Hepa1-6细胞中来自包含凝血酶原-hAAT PAH或PAH三种不同的密码子优化版本的慢病毒载体的PAH蛋白的表达。免疫印迹的第一泳道由未转导的细胞组成，第二泳道是用表达PAH的人版本(hPAH)的慢病毒转导的细胞(设置为1)，第三泳道是用表达密码子优化的PAH的版本3(OPT3；SEQ ID NO：70)的慢病毒转导的细胞(增加2.6倍)，第四泳道是用表达密码子优化的PAH的版本2/3(OPT2/3；SEQ ID NO：71)的慢病毒转导的细胞(增加1.9倍)，最后一条泳道是用表达密码子优化的PAH的版本3/2(OPT3/2；SEQ ID NO：72)的慢病毒转导的细胞(增加1.4倍)。使用Adobe PhotoShop通过密度测定法确定每个免疫印迹的条带强度。

如图4A和4B所示，用密码子优化的OPT3 PAH序列转导导致PAH表达增加：(i)相对于用密码子优化的OPT2(SEQ ID NO：2)、OPT2/3(SEQ ID NO：71)和OPT3/2 PAH(SEQ ID NO：72)序列转导和(ii)相对于用hPAH序列(SEQ ID NO：1)转导。

实施例8.在hPAH和PAH的密码子优化版本转导进Hepa1-6细胞之后测量PAH mRNA 的表达水平

该实施例说明，相对于没有被密码子优化的PAH序列(SEQ ID NO：1)，在用MOI为5的包含凝血酶原-hAAT密码子优化的PAH(OPT3(SEQ ID NO：70)和OPT2/3(SEQ ID NO：71))的慢病毒载体转导的Hepa1-6癌细胞中PAH RNA的表达增加，如图5所示。

hPAH是密码子优化的(赛默飞基因技术)、合成的(IDT和欧陆基因组学公司)，以及插入到含有凝血酶原增强子-hAAT启动子的慢病毒载体中的。通过DNA测序(欧陆基因组学公司)验证序列的插入。然后，包含未优化的PAH或密码子优化的PAH的慢病毒载体被用于转导Hepa1-6小鼠癌细胞(美国典型培养物保藏中心)。用慢病毒颗粒转导细胞，3天后用RNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取RNA并通过qPCR用QuantStudio 3(赛默飞世尔科技公司)分析RNA。hPAH RNA表达通过TaqMan探针和引物(IDT)检测：hPAH FAM TaqMan探针(5'-TCGTGAAAGCTCATGGACAGTGGC-3’：SEQ ID NO：64)和针对hPAH的引物组(PAH TaqMan正向引物：5’-AGATCTTGAGGCATGACATTGG-3’：SEQ ID NO：65；和PAH TaqMan反向引物：5'-GTCCAGCTCTTGAATGGTTCTT-3’：SEQ ID NO：66)。总RNA(100ng)通过肌动蛋白FAM探针(5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3’：SEQ ID NO：67)和引物组(肌动蛋白正向引物：5'-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3’：SEQ ID NO：68；和肌动蛋白反向引物：5’-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3’：SEQ ID NO：69)归一化。

如图5所示，比较了3个组：Hepa1-6细胞被表达PAH的编码区(SEQ ID NO：1)的(柱1)或PAH的密码子优化版本(OPT3(SEQ ID NO：70)和OPT2/3(SEQ ID NO：71，分别为柱2和3)的MOI为5的慢病毒载体转导。PAH RNA水平表示为从表达PAH(SEQ ID NO：1)的Hepa1-6细胞(设置为1)的RNA倍数变化。在表达来自密码子优化的版本的PAH(OPT3：SEQ ID NO：70)的细胞中，与PAH(SEQ ID NO：1)相比，表达增加了4.5倍。在表达来自密码子优化的版本的PAH(OPT2/3：SEQ ID NO：71)的细胞中，与PAH(SEQ ID NO：1)相比，表达增加了2.2倍。

实施例9.在Hepa1-6和Hep3B细胞中慢病毒递送的PAH的表达，所述PAH具有密码子优化的PAH序列和凝血酶原增强子，其包含HNF1或HNF1/4结合位点

该实施例说明，当使用包含与凝血酶原增强子和上游HNF1/4结合位点组合的hAAT启动子的慢病毒载体转导时，小鼠Hepa1-6和人Hep3B癌细胞中密码子优化的hPAH的表达增加，如图6A-6B所示。该实施例还表明在Hepa1-6细胞和Hep3B细胞中，密码子优化版本的hPAH编码序列(OPT3)表达多于非密码子优化的hPAH编码区序列。该实施例还说明，表达与凝血酶原增强子组合的肝细胞核因子-1和-4(HNF1和HNF1/4)结合位点的慢病毒载体增加Hepa1-6和Hep3B细胞中的PAH蛋白水平。

合成hPAH(优化的和未优化的)和具有HNF1/4结合位点的凝血酶原增强子的变体(欧陆基因组学公司和IDT)，并插入到含有hAAT启动子的慢病毒载体中。通过DNA测序(欧陆基因组学公司)验证序列的插入。然后将包含验证的PAH序列的慢病毒载体用于转导Hepa1-6小鼠肝癌细胞(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯)。使用MOI为5的慢病毒颗粒转导细胞，并在3天后通过针对PAH表达的免疫印迹分析蛋白质。用含有1％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液裂解细胞。细胞裂解物在10000RPM离心15分钟，用蛋白测定试剂(伯乐公司(Bio-Rad))测定蛋白浓度。蛋白质裂解物在4-12％Tris-Bis凝胶(赛默飞世尔科技公司)上分离，并在伯乐转印单元(Bio-Radtransfer unit)中转印12个小时。PAH的表达通过使用抗-PAH抗体(西格玛密理博公司(MilliporeSigma))的免疫印迹检测，并将抗-β肌动蛋白抗体(西格玛密理博公司)用于加样对照。PAH表达由凝血酶原增强子和hAAT启动子驱动。在各种情况下，慢病毒载体纳入了hPAH基因的密码子优化版本或密码子保持不变的hPAH基因。此外，这些构建体中的PAH表达由包含上游有HNF1或HNF1/4结合位点的肝特异性凝血酶原增强子的hAAT启动子驱动。使用Adobe PhotoShop通过密度测定法确定免疫印迹的条带强度。

如图6A所示，比较了6个组：(1)单独的Hepa1-6细胞(泳道1)，(2)通过凝血酶原增强子/hAAT启动子表达hPAH编码区的慢病毒载体(泳道2)(设置为1)，(3)通过凝血酶原增强子/hAAT启动子表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道3)(增加5.7倍)，(4)通过凝血酶原增强子/hAAT和凝血酶原增强子上游的一个HNF-1和-4结合位点表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道4)(增加5.6倍)，(5)通过凝血酶原增强子上游具有三个HNF-1和-4结合位点的凝血酶原增强子/hAAT表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道5)(增加5.8倍)，和(6)通过凝血酶原增强子上游具有五个HNF-1结合位点的凝血酶原增强子/hAAT表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道6)(增加5.9倍)。用于本实验中使用的hPAH的序列为SEQ ID NO：1。用于本实验中使用的密码子优化的PAH的序列为SEQ ID NO：70。

如图6B所示，比较了6个组：(1)单独的Hep3B细胞(泳道1)，(2)通过凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)表达hPAH编码区(SEQ ID NO：1)的慢病毒载体(泳道2)(设置为1)，(3)通过凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)表达密码子优化的hPAH(OPT3)(SEQ ID NO：70)的慢病毒载体(泳道3)(增加4.1倍)，(4)通过凝血酶原增强子/hAAT启动子和凝血酶原增强子上游的一个HNF-1和-4结合位点(SEQ ID NO：9)表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道4)(增加5.3倍)，(5)通过凝血酶原增强子上游具有三个HNF-1和-4结合位点(SEQ ID NO：10)的凝血酶原增强子/hAAT启动子表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道5)(增加4.8倍)，和(6)通过凝血酶原增强子上游具有五个HNF-1结合位点(SEQ ID NO：8)的凝血酶原增强子/hAAT启动子表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道6)(增加4.5倍)。

图6A和6B证明与用PAH转导的Hepa1-6和Hep3B癌细胞相比，当被含有在凝血酶原增强子的上游具有HNF1或HNF1/4结合位点的PAH的密码子优化版本(OPT3)的慢病毒载体转导时，在Hepa1-6和Hep3B癌细胞中PAH的表达增加。

实施例10.在Huh-7细胞中，用密码子优化的PAH序列和包含hAAT增强子/转甲状腺素蛋白启动子/小鼠细小病毒内含子或凝血酶原增强子/hAAT启动子/小鼠细小病毒内含子的调控序列的慢病毒递送的hPAH表达

该实施例说明，与包含内含子和替代性增强子/启动子组合的替代构建体相比，使用包含肝特异性调控元件的慢病毒载体在人肝细胞癌细胞中增加了密码子优化的人PAH的表达，如图7所示。

与凝血酶原增强子组合的hAAT启动子(SEQ ID NO：61)增加了PAH表达，但来自小鼠细小病毒(SEQ ID NO：80)的内含子序列的加入并没有增强表达。与hAAT启动子(SEQ IDNO：82)和转甲状腺素蛋白增强子(SEQ ID NO：81)相比，凝血酶原增强子和hAAT启动子(SEQID NO：61)与密码子优化的PAH序列(SEQ ID NO：61)的组合导致PAH的表达更高。

肝特异性调控序列是合成(IDT)的，并插入到优化的PAH序列上游的慢病毒载体中。通过DNA测序(欧陆基因组学公司)验证序列的插入。然后使用含有经验证的序列的慢病毒载体转导Huh-7肝细胞癌细胞(日本研究生物资源细胞库(Japanese Collection ofResearch Bioresources Cell Bank))。使用MOI为50的慢病毒颗粒转导细胞，并在3天后通过针对PAH表达的免疫印迹分析蛋白质。用含有1％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液裂解细胞。细胞裂解物在12,000RPM离心15分钟，用蛋白测定试剂(伯乐公司)测定蛋白浓度。蛋白质裂解物在4-12％Tris-Bis凝胶(赛默飞世尔科技公司)上分离，并在伯乐转印单元(Bio-Rad transfer unit)中转印16个小时。PAH的表达通过使用抗-PAH抗体(西格玛密理博公司(MilliporeSigma))的免疫印迹检测，并将抗-β肌动蛋白抗体(西格玛密理博公司)用于加样对照。使用Adobe PhotoShop通过密度测定法确定免疫印迹的条带强度。

如图7所示，比较了4个组：(i)单独的Huh-7细胞(泳道1)；(ii)表达密码子优化的hPAH(OPT3；SEQ ID NO：70)和凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)的慢病毒载体(泳道2)(基线条带强度，设置为1)；(iii)通过凝血酶原增强子/hAAT启动子和小鼠细小病毒的内含子序列(SEQ ID NO：78)表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道3)(条带强度为0.80)；和(iv)通过hAAT启动子/转甲状腺素蛋白增强子和小鼠细小病毒的内含子序列(SEQ ID NO：79)表达密码子优化的hPAH(OPT3)的慢病毒载体(泳道4)(条带强度为0.36)。

结果说明相对于缺乏该内含子序列的慢病毒载体，编码来自小鼠细小病毒的内含子序列的慢病毒载体导致较低的PAH表达(比较图7的泳道2和泳道3)。这一发现是意料之外的，因为之前的研究表明，来自小鼠细小病毒的内含子序列增加了载体的外源基因表达。此外，该实施例出人意料地表明，与包含本文提供的没有额外内含子的凝血酶原增强子/hAAT启动子的特定组合的慢病毒载体相比，包含用于肝脏特异性基因表达的启动子/增强子组合的慢病毒载体导致更低的PAH表达(比较图7的泳道2和泳道4)。

实施例11.在Huh-7细胞中，用带有突变的WPRE序列或短WPRE(WPREs)序列和包含 PAH或白蛋白3’UTR序列的密码子优化的PAH序列的慢病毒递送的hPAH表达

该实施例说明，与包含3'UTR和替代性WPRE序列的替代性载体构建体相比，使用包含肝特异性调控元件的慢病毒载体在人肝细胞癌细胞中增加了密码子优化的人PAH的表达，如图8所示。

当WPRE被修饰为更短的、没有X-蛋白序列(SEQ ID NO：87)的突变版本时，PAH的表达低于但近似于包含野生型WPRE(SEQ ID NO：18)的载体。当来自PAH基因(SEQ ID NO：85)或白蛋白基因(SEQ ID NO：86)的3'UTR序列被添加到PAH编码序列的下游产生PAH优化版本3-PAH 3'UTR序列(SEQ ID NO：83)或PAH优化版本3-白蛋白3'UTR序列(SEQ ID NO：84)时，相对于不含3'UTR的载体，PAH的表达降低。

WPREs和3’UTR序列是合成(IDT)的，并插入到优化的PAH序列上游的慢病毒载体中。通过DNA测序(欧陆基因组学公司)验证序列的插入。然后使用含有经验证的序列的慢病毒载体转导Huh-7肝细胞癌细胞(日本研究生物资源细胞库(Japanese Collection ofResearch Bioresources Cell Bank))。使用MOI为50的慢病毒颗粒转导细胞，并在3天后通过针对PAH表达的免疫印迹分析蛋白质。用含有1％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液裂解细胞。细胞裂解物在12,000RPM离心15分钟，用蛋白测定试剂(伯乐公司)测定蛋白浓度。蛋白质裂解物在4-12％Tris-Bis凝胶(赛默飞世尔科技公司)上分离，并在伯乐转印单元(Bio-Rad transfer unit)中转印16个小时。PAH的表达通过使用抗-PAH抗体(西格玛密理博公司(MilliporeSigma))的免疫印迹检测，并将抗-B肌动蛋白抗体(西格玛密理博公司)用于加样对照。使用Adobe PhotoShop通过密度测定法确定免疫印迹的条带强度。

如图8所示，比较了5个组：(i)单独的Huh-7细胞(泳道1)；(ii)表达密码子优化的hPAH(OPT3；SEQ ID NO：70)、凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)和野生型WPRE(SEQ ID NO：18)的慢病毒载体(泳道2)(基线条带强度，设置为1)；(iii)表达密码子优化的hPAH(OPT3；SEQ ID NO：70)、凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)和突变的缺少X-蛋白表达的WPRE(SEQ ID NO：87)的慢病毒载体(泳道3)(条带强度为0.81)；(iv)表达密码子优化的hPAH(OPT3；SEQ ID NO：70)、凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)和带有PAH 3’UTR(SEQ ID NO：85)的慢病毒载体(泳道4)(条带强度为0.68)；和(V)表达密码子优化的hPAH(OPT3；SEQ ID NO：70)和凝血酶原增强子/hAAT启动子(SEQ ID NO：61)和带有白蛋白3’UTR(SEQ ID NO：86)的慢病毒载体(泳道5)(条带强度为0.85)。

结果说明，用突变型WPRE取代通常使用的野生型WPRE，或添加人PAH基因的天然3’UTR，或添加来自人白蛋白基因的3’UTR，然后被用于细胞转导的慢病毒载体，与包含野生型WPRE且无3’UTR序列的Pro-hAAT-PAH(OPT3)载体相比，导致PAH的表达较低。结果还说明，相对于编码白蛋白PAH 3'UTR的慢病毒载体，使用编码天然人PAH 3'UTR的慢病毒载体对PAH表达有负面影响(比较图8的泳道4和泳道5)。这一发现可能是由于使用白蛋白PAH 3'UTR相比于天然人PAH 3'UTR时PAH mRNA的二级结构发生了变化。二级结构的这种变化可能会减少PAH编码区与3'UTR之间的相互作用，从而导致PAH表达水平更高。此外，如本实施例所示，当使用缺乏3'UTR PAH的慢病毒载体时，PAH的表达水平最高(比较图8的泳道4和泳道5与泳道2)。

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