BR112021005788A2 - Métodos e composições para aumentar a expressão de proteínas e/ou tratar um distúrbio de haploinsuficiência - Google Patents

Métodos e composições para aumentar a expressão de proteínas e/ou tratar um distúrbio de haploinsuficiência Download PDF

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Abstract

métodos e composições para aumentar a expressão de proteínas e/ou tratar um distúrbio de haploinsuficiência. trata-se de um trna que hibridiza com um códon não ideal, que pode ser usado para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene que contém o códon não ideal ou para tratar um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito que tem um gene haploinsuficiente que contém o códon não ideal.

Description

M TODOS E COMPOSI ES PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS E/OU TRATAR UM DISTÚRBIO DE HAPLOINSUFICI NCIA PEDIDO RELACIONADO
[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório US 62/736.847, depositado em 26 de setembro de 2018, cuja matéria é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] Esta divulgação se refere geralmente a métodos e composições para aumentar a expressão de um produto gênico codificado por um gene que contém um códon não ideal e/ou tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito.
ANTECEDENTES
[0003] A haploinsuficiência ocorre quando um alelo do gene é inativado e a quantidade de produto do gene expresso a partir do alelo ativo remanescente é insuficiente para o funcionamento adequado do gene. Vários distúrbios estão associados ou são causados por haploinsuficiência.
[0004] Um exemplo de distúrbio de haploinsuficiência é a síndrome de Dravet. A síndrome de Dravet é uma forma rara e catastrófica de epilepsia intratável que começa na infância. Inicialmente, os pacientes apresentam convulsões prolongadas. No segundo ano, tipos adicionais de convulsão começam a ocorrer, que geralmente coincidem com um declínio do desenvolvimento, possivelmente devido à hipóxia cerebral repetida. Isso leva a um fraco desenvolvimento da linguagem e das habilidades motoras. Mutações nos genes SCN1A (codificando a subunidade do canal de s dio dependente de voltagem), SCN1B (codificando a subunidade 1 do canal de s dio dependente de voltagem), SCN2A, SCN3A, SCN9A, GABRG2 (codificando a subunidade 2 do receptor de cido -aminobutírico), GABRD (codificando a subunidade do receptor do cido -aminobutírico) e/ou PCDH19 foram associadas à síndrome de Dravet.
[0005] Por exemplo, a síndrome de Dravet pode ser causada por uma mutação no gene SCN1A resultando na inativação de um alelo do gene SCN1A e uma falta ou quantidade reduzida do produto do gene SCN1A funcional. O gene SCN1A normalmente codifica para a subunidade do canal de sódio dependente de voltagem, Na (V) 1.1. Em modelos de camundongos, mutações de perda de função em SCN1A foram observadas resultando em uma diminuição nas correntes de sódio e excitabilidade prejudicada de interneurônios GABAérgicos do hipocampo.
[0006] Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de composições e métodos melhorados para aumentar a expressão de proteínas e tratar doenças mediadas por haploinsuficiência, incluindo a síndrome de Dravet.
SUMÁRIO
[0007] Esta divulgação se refere geralmente a métodos e composições para aumentar a expressão de um produto gênico codificado por um gene que contém um códon não ideal e/ou tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito. A presença de um códon não ideal em um gene de interesse resulta em uma desestabilização do transcrito de mRNA do gene, o que pode impactar a produção da proteína funcional codificada pelo gene. Em tais situações, a desestabilização do transcrito de mRNA pode ocorrer quando, por exemplo, a abundância de uma molécula de tRNA aminoacilada específica que hibridiza com o códon não ideal é menor do que outros tRNAs diferentes disponíveis em uma célula que são aminoacilados com o mesmo aminoácido. Surpreendentemente, foi descoberto que aumentar a abundância de tal tRNA em uma célula em relação a outros tRNAs naturalmente mais abundantes pode promover a expressão e/ou quantidade de proteína funcional produzida pela célula. A expressão de um produto gênico, por exemplo, uma proteína, pode ser aumentada e/ou seletivamente aumentada (ou seja, a expressão do produto gênico pode ser aumentada mais do que outro produto gênico ou mais do que qualquer outro produto gênico) pela introdução na célula de um número mínimo (por exemplo, 1, 2 ou 3) de tRNAs que decodificam códons não ideais no gene.
[0008] Da mesma forma, para um sujeito que tem um gene que contém um códon não ideal, a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um tRNA que decodifica o códon não ideal pode aumentar a expressão de um produto gênico do gene no sujeito. Por conseguinte, a administração do tRNA ao sujeito pode tratar uma doença no sujeito que é mediada pela expressão insuficiente do produto gênico, por exemplo, um distúrbio de haploinsuficiência. Além disso, as características dos métodos e composições aqui descritos os tornam desejáveis para uso no tratamento de distúrbios, por exemplo, distúrbios de haploinsuficiência, em sujeitos humanos. Por exemplo, os tRNAs são relativamente pequenos em tamanho e podem ser produzidos de forma recombinante, e os métodos e composições aqui descritos podem tratar um distúrbio de haploinsuficiência independentemente da mutação ou mecanismo pelo qual um alelo foi inativado.
[0009] Por conseguinte, em um aspecto, esta divulgação fornece um método para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene que contém um primeiro códon não ideal. O método inclui a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um primeiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do primeiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o primeiro tRNA exógeno.
[0010] Em certas modalidades, o gene contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um segundo tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do segundo tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o segundo tRNA exógeno. Em certas modalidades, o gene contém um terceiro códon não ideal e o método compreende ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um terceiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do terceiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o terceiro tRNA exógeno.
[0011] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene contendo um primeiro códon não ideal. O método inclui a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar um primeiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do primeiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o primeiro tRNA exógeno.
[0012] Em certas modalidades, o gene contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um segundo vetor de expressão capaz de expressar um segundo tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do segundo tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o segundo tRNA exógeno. Em certas modalidades, o gene contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um terceiro vetor de expressão capaz de expressar um terceiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do terceiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o terceiro tRNA exógeno.
[0013] Em certas modalidades, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão são iguais. Em certas modalidades, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão são um vetor viral, por exemplo, um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
[0014] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos anteriores para aumentar a expressão, a célula é uma célula humana. Em certas modalidades, a célula é uma célula do sistema nervoso central, por exemplo, um neurônio.
[0015] Em certas modalidades, o gene é selecionado a partir de AGGF1, ARHGAP31, BMPR2, CHD7, COL2A1, COL3A1, CTLA4, CTNNB1, DLL4, EHMT1, ELN, ENG, FAS, FBN1, FOXG1, GATA3, GLI3, GRN, IRF6, JAG1, KCNQ4, LMX1B, MBD5, MED13L, MITF, MNX1, MYCN, NFIA, NFIX, NOTCH1, NSD1, PAX3, PHIP, PRKAR1A, RAI1, RBPJ, RPS14, RUNX2, SALL4, SCN1A, SETBP1, SHANK3, SHH, SHOX, SLC2A1/GLUT1, SOX10, SYNGAP1, TBX1, TBX3, TBX5, TCF4, TCOF1, TGIF1, TNXB, TRPS1, WT1 e ZIC2. Em certas modalidades, o gene é SCN1A.
[0016] Em um outro aspecto, esta divulgação fornece um método de tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o sujeito tem um gene haploinsuficiente que contém um primeiro códon não ideal. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um primeiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, desse modo, para tratar o distúrbio de haploinsuficiência no sujeito.
[0017] Em certas modalidades, o gene haploinsuficiente contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um segundo tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal,
e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido. Em certas modalidades, o gene haploinsuficiente contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um terceiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido.
[0018] Em um outro aspecto, esta divulgação fornece um método de tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o sujeito tem um gene haploinsuficiente que contém um primeiro códon não ideal. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar um primeiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, para tratar, assim, o distúrbio de haploinsuficiência no sujeito.
[0019] Em certas modalidades, o gene haploinsuficiente contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um segundo vetor de expressão capaz de expressar um segundo tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido. Em certas modalidades, o gene haploinsuficiente contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um terceiro vetor de expressão capaz de expressar um terceiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido.
[0020] Em certas modalidades, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão são iguais. Em certas modalidades, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão são um vetor viral, por exemplo, um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
[0021] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos de tratamento anteriores, o sujeito é um humano.
[0022] Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é selecionado de síndrome 5q, síndrome de Adams-Oliver 1, síndrome de Adams-Oliver 3, síndrome de Adams-Oliver 5, síndrome de Adams- Oliver 6, síndrome de Alagille 1, síndrome linfoproliferativa autoimune tipo IA, síndrome linfoproliferativa autoimune tipo V, surdez autossômica dominante-2A, malformações cerebrais com ou sem defeitos do trato urinário (BRMUTD), complexo de Carney tipo 1, síndrome CHARGE, displasia cleidocraniana, síndrome de Currarino, síndrome de Denys-Drash/síndrome de Frasier, atraso no desenvolvimento, deficiência intelectual, obesidade e características dismórficas (DIDOD), síndrome de DiGeorge (associada a TBX1), síndrome de Dravet, síndrome do raio Duane-radial, síndrome de Ehlers-Danlos (tipo clássico), síndrome de Ehlers-Danlos (tipo vascular), síndrome de Feingold 1, degeneração lobar frontotemporal com inclusões de TDP43 (FTLD-TDP), síndrome de deficiência de GLUT1 relacionada a GRN, síndrome de Greig cefalopolissindactilia, Telangiectasia hemorrágica hereditária tipo 1, Holoprosencefalia 3, Holoprosencefalia 4, Holoprosencefalia 5, síndrome de Holt-Oram, Hipoparatireoidismo, surdez neurossensorial e doença renal (HDR), síndrome de Kleefstra 1, síndrome de Klippel-Trenaunay (relacionada a AAGF), discondrose de Leri-Weillental, síndrome de retardo mental de Marfan e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos (MRFACD), retardo mental autossômico dominante 1, retardo mental autossômico dominante 19, retardo mental autossômico dominante 29, síndrome de unha-patela (NPS), síndrome de Phelan-McDermid, síndrome de Pitt-Hopkins, hipertensão pulmonar primária 1, síndrome de Rett (variante congênita), síndrome de Smith-Magenis (associada a RAI1), síndrome de Sotos 1, síndrome de Sotos 2, síndrome de Stickler tipo I, estenose aórtica supravalvar, deficiência intelectual relacionada a SYNGAP1, síndrome de Treacher Collins, Síndrome tricorrinofalangeana tipo I, síndrome ulnar-mamária, síndrome de van der Woude 1, síndrome de Waardenburg tipo 1, síndrome de Waardenburg tipo 2A e síndrome de
Waardenburg tipo 4C. Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é a síndrome de Dravet.
[0023] Em certas modalidades, o gene haploinsuficiente é selecionado a partir de AGGF1, ARHGAP31, BMPR2, CHD7, COL2A1, COL3A1, CTLA4, CTNNB1, DLL4, EHMT1, ELN, ENG, FAS, FBN1, FOXG1, GATA3, GLI3, GRN, IRF6, JAG1, KCNQ4, LMX1B, MBD5, MED13L, MITF, MNX1, MYCN, NFIA, NFIX, NOTCH1, NSD1, PAX3, PHIP, PRKAR1A, RAI1, RBPJ, RPS14, RUNX2, SALL4, SCN1A, SETBP1, SHANK3, SHH, SHOX, SLC2A1/GLUT1, SOX10, SYNGAP1, TBX1, TBX3, TBX5, TCF4, TCOF1, TGIF1, TNXB, TRPS1, WT1 e ZIC2. Em certas modalidades, o gene haploinsuficiente é SCN1A.
[0024] Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é um distúrbio listado na TABELA 1 ou TABELA 2 abaixo, e o gene haploinsuficiente é um gene listado na linha correspondente da TABELA 1 ou TABELA 2 abaixo.
[0025] Em certas modalidades, o método compreende ainda a administração de DIACOMIT® (estiripentol), EPIODOLEX® (canabidiol), uma dieta cetogênica, ONFI® (clobazam), TOPAMAX® (topiramato) ou ácido valproico ao sujeito.
[0026] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos anteriores, o gene é um gene listado na TABELA 1 ou TABELA 2 abaixo, e o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é um códon listado na linha correspondente da TABELA 1 ou TABELA 2 abaixo. Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é um distúrbio listado na TABELA 1 ou TABELA 2 abaixo, e o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é um códon listado na linha correspondente da TABELA 1 ou TABELA 2 abaixo.
[0027] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos anteriores, o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é selecionado a partir de ATA, GTA e AGA.
[0028] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos anteriores, o primeiro, segundo e/ou terceiro tRNA é selecionado a partir de um tRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.
[0029] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um primeiro, segundo e/ou terceiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido. Em certas modalidades, o vetor de expressão compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, o vetor de expressão compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e/ou SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o vetor de expressão é um vetor viral, por exemplo, um vetor viral de DNA, por exemplo, um vírus adenoassociado (AAV). Em outro aspecto, esta divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos vetores de expressão anteriores e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0030] Estes e outros aspectos e características da invenção são descritos na descrição detalhada e nas reivindicações a seguir.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0031] A invenção pode ser mais completamente entendida com referência aos seguintes desenhos.
[0032] A FIGURA 1 é uma representação esquemática de transcritos de mRNA de SCN1A contendo códons não ideais que desestabilizam o transcrito de mRNA. Códons não ideais são indicados como regiões mais escuras no transcrito cinza. A expressão dos tRNAs indicados estabiliza o transcrito do mRNA e facilita a expressão aumentada da proteína.
[0033] A FIGURA 2A é uma estrutura secundária de tRNA de consenso. A numeração dos resíduos é baseada no sistema de numeração de tRNA descrito em Steinberg et al. (1993) NUCLEIC ACIDS RES. 21: 3.011 a 3.015. A FIGURA 2B é uma tabela que mostra o perfil de modificação para sequências de tRNA do citosol de certos organismos eucarióticos. As razões na tabela indicam a frequência de ocorrência do nucleotídeo listado na posição numerada mostrada na FIGURA 2A. As abreviaturas para os resíduos modificados são definidas em Motorin et al. (2005) Transfer RNA Modification, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, John Wily & Sons, Inc.
[0034] A FIGURA 3 é um gráfico que mostra a quantificação dos níveis de mRNA de SCN1A e GAPDH em células HEK293 após a expressão de tRNAATA, tRNAGTA e tRNAAGA. Os valores indicados foram calculados em relação às células que expressam SCN1A, mas nenhum tRNA, pelo método Ct. + indica 100 ng de DNA para cada tRNA; ++ indica 200 ng de DNA para cada tRNA; e +++ indica 300 ng de DNA de cada tRNA.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0035] Esta divulgação se refere geralmente a métodos e composições para aumentar a expressão de um produto gênico codificado por um gene que contém um códon não ideal e/ou tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito. A presença do códon não ideal no gene de interesse resulta em uma desestabilização do transcrito de mRNA do gene, o que pode impactar a produção da proteína funcional codificada pelo gene. Em tais situações, a desestabilização do transcrito de mRNA pode ocorrer quando, por exemplo, a abundância de uma molécula de tRNA aminoacilada específica que hibridiza com o códon não ideal é menor do que outros tRNAs diferentes disponíveis em uma célula que são aminoacilados com o mesmo aminoácido. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que, dada a menor abundância de tRNAs específicos, pode demorar mais para que os tRNAs disponíveis alcancem e sejam captados pelo ribossomo durante a síntese de proteínas do que outros tRNAs mais abundantes, que, por sua vez, pode criar um atraso na síntese da proteína durante a incorporação do aminoácido necessário naquela posição. Acredita-se que o atraso na taxa de síntese de proteínas induz uma desestabilização correspondente do transcrito de mRNA, que pode resultar na redução da produção da proteína codificada pelo transcrito de mRNA. Foi descoberto que aumentar a abundância de tais tRNAs na célula de interesse em relação aos outros tRNAs naturalmente mais abundantes pode promover a expressão e/ou quantidade de proteína funcional produzida pela célula.
[0036] A expressão de um produto gênico, ou seja, um produto que resulta da expressão de um gene, por exemplo, um transcrito de mRNA codificado pelo gene, uma proteína codificada pelo gene, etc., pode ser aumentada e/ou seletivamente aumentada (por exemplo, a expressão do produto gênico pode ser aumentada mais do que outro produto gênico ou mais do que qualquer outro produto gênico) pela introdução na célula de um número mínimo (por exemplo, 1, 2 ou 3) de tRNAs que decodificam códons não ideais no gene.
[0037] Da mesma forma, para um sujeito que tem um gene que contém um códon não ideal, a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um tRNA que decodifica o códon não ideal pode aumentar a expressão de um produto gênico do gene no sujeito. Por conseguinte, a administração do tRNA ao sujeito pode tratar uma doença no sujeito que é mediada pela expressão insuficiente do produto gênico, por exemplo, um distúrbio de haploinsuficiência. Além disso, as características dos métodos e composições aqui descritos podem torná-los desejáveis para uso no tratamento de distúrbios, por exemplo, distúrbios de haploinsuficiência, em sujeitos humanos. Por exemplo, os tRNAs são relativamente pequenos em tamanho e podem ser produzidos de forma recombinante, e os métodos e composições aqui descritos podem tratar um distúrbio de haploinsuficiência independentemente da mutação ou mecanismo pelo qual um alelo foi inativado.
[0038] Por conseguinte, em um aspecto, esta divulgação fornece um método para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene que contém um primeiro códon não ideal. O método inclui a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um primeiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do primeiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o primeiro tRNA exógeno.
[0039] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene contendo um primeiro códon não ideal. O método inclui a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar um primeiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do primeiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto do gene em relação a uma célula semelhante sem o primeiro tRNA exógeno.
[0040] É ainda contemplado que, em qualquer um dos métodos anteriores, o gene pode conter um códon não ideal adicional (por exemplo, um segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono ou décimo códon não ideal), e o método pode compreender ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um tRNA exógeno ou vetor de expressão adicional (por exemplo, um segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono ou décimo tRNA exógeno ou vetor de expressão) para aumentar expressão do produto do gene.
[0041] Por exemplo, em certas modalidades, se o gene contiver um segundo e/ou terceiro códon não ideal, o método compreende ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um segundo e/ou terceiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo e/ou terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do segundo e/ou terceiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o segundo e/ou terceiro tRNA exógeno. Em certas modalidades, se o gene contiver um segundo e/ou terceiro códon não ideal, o método compreende ainda a introdução na célula de uma quantidade eficaz de um segundo e/ou terceiro vetor de expressão capaz de expressar um segundo e/ou terceiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo e/ou terceiro códon não ideal, e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do segundo e/ou terceiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o segundo e/ou terceiro tRNA exógeno.
[0042] Em certas modalidades, o método aumenta a expressão do produto gênico em uma célula, tecido ou sujeito em pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150%, cerca de 160%, cerca de 170%, cerca de 180%, cerca de 190%, cerca de 200%, cerca de 250%, cerca de 300%, cerca de 350%, cerca de 400%, cerca de 450%, cerca de 500%, cerca de 600%, cerca de 700%, cerca de 800%, cerca de 900%, cerca de
1.000% ou mais em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno. Em certas modalidades, o método aumenta a expressão do produto gênico em uma célula, tecido ou sujeito em cerca de 20% a cerca de 200%, cerca de 20% a cerca de 180%, cerca de 20% a cerca de 160%, cerca de 20% a cerca de 140%, cerca de 20% a cerca de 120%, cerca de 20% a cerca de 100%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca 200%, cerca de 40% a cerca de 180%, cerca de 40% a cerca de 160%, cerca de 40% a cerca de 140%, cerca de 40% a cerca de
120%, cerca de 40% a cerca de 100%, cerca de 40% a cerca de 80%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 200%, cerca de 60% a cerca de 180%, cerca de 60% a cerca de 160%, cerca de 60% a cerca de 140%, cerca de 60% a cerca de 120%, cerca de 60% a cerca de 100%, cerca de 60% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 200%, cerca de 80% a cerca de 180%, cerca de 80% a cerca de 160%, cerca de 80% a cerca de 140%, cerca de 80% a cerca de 120%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 100% a cerca de 200%, cerca de 100% a cerca de 180%, cerca de 100% a cerca de 160%, cerca de 100% a cerca de 140%, cerca de 100% a cerca de 120%, cerca de 120% a cerca de 200%, cerca de 120% a cerca de 180%, cerca de 120% a cerca de 160%, cerca de 120% a cerca de 140%, cerca de 140% a cerca de 200%, cerca de 140% a cerca de 180%, cerca de 140% a cerca de 160%, cerca de 160% a cerca de 200%, cerca de 160% a cerca de 180%, ou cerca de 180% a cerca de 200% em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno.
Em certas modalidades, o método aumenta a expressão do produto gênico em uma célula, tecido ou sujeito em cerca de 100% a cerca de 1.000%, cerca de 100% a cerca de 900%, cerca de 100% a cerca de 800%, cerca de 100% a cerca de 700%, cerca de 100% a cerca de 600%, cerca de 100% a cerca de 500%, cerca de 100% a cerca de 400%, cerca de 100% a cerca de 300%, cerca de 100% a cerca de 200%, cerca de 200% a cerca de 1.000%, cerca de 200% a cerca de 900%, cerca de 200% a cerca de 800%, cerca de 200% a cerca de 700%, cerca de 200% a cerca de 600%, cerca de 200% a cerca de 500%, cerca de 200% a cerca de 400%, cerca de 200% a cerca de 300%, cerca de 300% a cerca de 1.000%, cerca de 300% a cerca de 900%, cerca de 300% a cerca de 800%, cerca de 300% a cerca de 700%, cerca de 300% a cerca de 600%, cerca de 300% a cerca de 500%, cerca de 300% a cerca de 400%, cerca de 400% a cerca de 1.000%, cerca de 400% a cerca de 900%, cerca de 400% a cerca de 800%, cerca de 400% a cerca de 700%, cerca de 400% a cerca de 600%, cerca de 400% a cerca de 500%, cerca de 500% a cerca de 1.000%, cerca de 500% a cerca de 900%, cerca de 500% a cerca de 800%, cerca de 500% a cerca de 700%, cerca de
500% a cerca de 600%, cerca de 600% a cerca de 1.000%, cerca de 600% a cerca de 900%, cerca de 600% a cerca de 800%, cerca de 600% a cerca de 700%, cerca de 700% a cerca de 1.000%, cerca de 700% a cerca de 900%, cerca de 700% a cerca de 800%, cerca de 800% a cerca de 1.000%, cerca de 800% a cerca de 900%, ou cerca de 900% a cerca de 1.000% em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno. A expressão do produto gênico ou da proteína pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, Western blot ou ELISA.
[0043] Em certas modalidades, o método aumenta a estabilidade de um transcrito de gene (mRNA) codificado pelo gene em uma célula, tecido ou sujeito em relação a uma célula, tecido ou sujeito semelhante sem o tRNA exógeno. Por exemplo, em certas modalidades, o método aumenta a estabilidade do mRNA na célula, tecido ou sujeito em pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150%, cerca de 160%, cerca de 170%, cerca de 180%, cerca de 190%, cerca de 200%, cerca de 250%, cerca de 300%, cerca de 350%, cerca de 400%, cerca de 450%, cerca de 500%, cerca de 600%, cerca de 700%, cerca de 800%, cerca de 900%, cerca de
1.000% ou mais em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno. Em certas modalidades, o método aumenta a estabilidade do mRNA na célula, tecido ou sujeito em cerca de 20% a cerca de 200%, cerca de 20% a cerca de 180%, cerca de 20% a cerca de 160%, cerca de 20% a cerca de 140%, cerca de 20% a cerca de 120%, cerca de 20% a cerca de 100%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca de 200%, cerca de 40% a cerca de 180%, cerca de 40% a cerca de 160%, cerca de 40% a cerca de 140%, cerca de 40% a cerca de 120%, cerca de 40% a cerca de 100%, cerca de 40% a cerca de 80%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 200%, cerca de 60% a cerca de 180%, cerca de 60% a cerca de 160%, cerca de 60% a cerca de 140%, cerca de 60% a cerca de
120%, cerca de 60% a cerca de 100%, cerca de 60% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 200%, cerca de 80% a cerca de 180%, cerca de 80% a cerca de 160%, cerca de 80% a cerca de 140%, cerca de 80% a cerca de 120%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 100% a cerca de 200%, cerca de 100% a cerca de 180%, cerca de 100% a cerca de 160%, cerca de 100% a cerca de 140%, cerca de 100% a cerca de 120%, cerca de 120% a cerca de 200%, cerca de 120% a cerca de 180%, cerca de 120% a cerca de 160%, cerca de 120% a cerca de 140%, cerca de 140% a cerca de 200%, cerca de 140% a cerca de 180%, cerca de 140% a cerca de 160%, cerca de 160% a cerca de 200%, cerca de 160% a cerca de 180%, ou cerca de 180% a cerca de 200% em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno. Em certas modalidades, o método aumenta a estabilidade do mRNA na célula, tecido ou sujeito em cerca de 100% a cerca de 1.000%, cerca de 100% a cerca de 900%, cerca de 100% a cerca de 800%, cerca de 100% a cerca de 700%, cerca de 100% a cerca de 600%, cerca de 100% a cerca de 500%, cerca de 100% a cerca de 400%, cerca de 100% a cerca de 300%, cerca de 100% a cerca de 200%, cerca de 200% a cerca de
1.000%, cerca de 200% a cerca de 900%, cerca de 200% a cerca de 800%, cerca de 200% a cerca de 700%, cerca de 200% a cerca de 600%, cerca de 200% a cerca de 500%, cerca de 200% a cerca de 400%, cerca de 200% a cerca de 300%, cerca de 300% a cerca de 1.000%, cerca de 300% a cerca de 900%, cerca de 300% a cerca de 800%, cerca de 300% a cerca de 700%, cerca de 300% a cerca de 600%, cerca de 300% a cerca de 500%, cerca de 300% a cerca de 400%, cerca de 400% a cerca de 1.000%, cerca de 400% a cerca de 900%, cerca de 400% a cerca de 800%, cerca de 400% a cerca de 700%, cerca de 400% a cerca de 600%, cerca de 400% a cerca de 500%, cerca de 500% a cerca de 1.000%, cerca de 500% a cerca de 900%, cerca de 500% a cerca de 800%, cerca de 500% a cerca de 700%, cerca de 500% a cerca de 600%, cerca de 600% a cerca de 1.000%, cerca de 600% a cerca de 900%, cerca de 600% a cerca de 800%, cerca de 600% a cerca de 700%, cerca de 700% a cerca de
1.000%, cerca de 700% a cerca de 900%, cerca de 700% a cerca de 800%,
cerca de 800% a cerca de 1.000%, cerca de 800% a cerca de 900%, ou cerca de 900% a cerca de 1.000% em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno. O transcrito do gene ou a estabilidade do mRNA podem ser medidos por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, Northern blot.
[0044] Em certas modalidades, a célula é uma célula humana. Em certas modalidades, a célula é uma célula do sistema nervoso central, por exemplo, um neurônio.
[0045] Em certas modalidades, o gene é selecionado a partir de AGGF1, ARHGAP31, BMPR2, CHD7, COL2A1, COL3A1, CTLA4, CTNNB1, DLL4, EHMT1, ELN, ENG, FAS, FBN1, FOXG1, GATA3, GLI3, GRN, IRF6, JAG1, KCNQ4, LMX1B, MBD5, MED13L, MITF, MNX1, MYCN, NFIA, NFIX, NOTCH1, NSD1, PAX3, PHIP, PRKAR1A, RAI1, RBPJ, RPS14, RUNX2, SALL4, SCN1A, SETBP1, SHANK3, SHH, SHOX, SLC2A1/GLUT1, SOX10, SYNGAP1, TBX1, TBX3, TBX5, TCF4, TCOF1, TGIF1, TNXB, TRPS1, WT1 e ZIC2. Em certas modalidades, o gene é SCN1A.
[0046] Em certas modalidades, o método não aumenta substancialmente a expressão de um produto gênico de um gene de referência. Por exemplo, em certas modalidades, o método aumenta a expressão do produto gênico do gene de referência em menos de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40% ou cerca de 50%. Em certas modalidades, não há aumento detectável na expressão do gene de referência. Em certas modalidades, o gene de referência é selecionado de GAPDH, BAD e TRAPPC6A. Em certas modalidades, o gene de referência é GAPDH.
[0047] Em certas modalidades, em que o gene é um gene SCN1A, o método aumenta a atividade do canal de sódio dependente de voltagem em uma célula, tecido ou sujeito em pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150%, cerca de 160%, cerca de
170%, cerca de 180%, cerca de 190%, cerca de 200%, cerca de 250%, cerca de 300%, cerca de 350%, cerca de 400%, cerca de 450%, cerca de 500%, cerca de 600%, cerca de 700%, cerca de 800%, cerca de 900%, cerca de 1.000% ou mais em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno.
Em certas modalidades, o método aumenta a atividade do canal de sódio dependente de voltagem em uma célula, tecido ou sujeito em cerca de 20% a cerca de 200%, cerca de 20% a cerca de 180%, 20% a cerca de 160%, cerca de 20% a cerca de 140%, cerca de 20% a cerca de 120%, cerca de 20% a cerca de 100%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca de 200%, cerca de 40% a cerca de 180%, cerca de 40% a cerca de 160%, cerca de 40% a cerca de 140%, cerca de 40% a cerca de 120%, cerca de 40% a cerca de 100%, cerca de 40% a cerca de 80%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 200%, cerca de 60% a cerca de 180%, cerca de 60% a cerca de 160%, cerca de 60% a cerca de 140%, cerca de 60% a cerca de 120%, cerca de 60% a cerca de 100%, cerca de 60% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 200%, cerca de 80% a cerca de 180%, cerca de 80% a cerca de 160%, cerca de 80% a cerca de 140%, cerca de 80% a cerca de 120%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 100% a cerca de 200%, cerca de 100% a cerca de 180%, cerca de 100% a cerca de 160%, cerca de 100% a cerca de 140%, cerca de 100% a cerca de 120%, cerca de 120% a cerca de 200%, cerca de 120% a cerca de 180%, cerca de 120% a cerca de 160%, cerca de 120% a cerca de 140%, cerca de 140% a cerca de 200%, cerca de 140% a cerca de 180%, cerca de 140% a cerca de 160%, cerca de 160% a cerca de 200%, cerca de 160% a cerca de 180%, ou cerca de 180% a cerca de 200% em relação a uma célula, tecido ou sujeito sem o tRNA exógeno.
A atividade do canal de sódio dependente de voltagem pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em Kalume et al. (2007) J.
NEUROSCI. 27(41): 11.065 a 11.074, Yu et al. (2007) NAT.
NEUROSCI. 9(9): 1.142 a 1.149, e Han et al. (2012) NATURE 489(7416): 385 a 390.
[0048] Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é um distúrbio listado na TABELA 1 ou TABELA 2, e o gene haploinsuficiente é um gene listado na linha correspondente da TABELA 1 ou TABELA 2. Em certas modalidades, o gene é um gene listado na TABELA 1 ou TABELA 2, e o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é um códon listado na linha correspondente da TABELA 1 ou TABELA 2. Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é um distúrbio listado na TABELA 1 ou TABELA 2, e o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é um códon listado na linha correspondente da TABELA 1 ou TABELA 2.
TABELA 1
TABELA 2
[0049] Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é um distúrbio listado em qualquer uma das TABELAS 4, 5, 6 ou 7 abaixo, juntamente com o gene haploinsuficiente associado a cada distúrbio. Em certas modalidades, o gene é um gene listado nas TABELAS 4, 5, 6 ou 7, e o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é um códon listado na linha correspondente das TABELAS 4, 5, 6 ou 7. Em certas modalidades, o distúrbio de haploinsuficiência é um distúrbio listado nas TABELAS 4, 5, 6 ou 7, e o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é um códon listado na linha correspondente das TABELAS 4, 5, 6 ou 7. A TABELA 4 e a TABELA 5 mostram, respectivamente, os três e dez códons menos ideais e mais super- representados nos genes indicados, conforme calculado com base na porcentagem de uso de códons e no índice adaptativo de tRNA (tAI). A TABELA 6 e a TABELA 7 mostram, respectivamente, os três e dez códons menos ideais e mais super-representados nos genes indicados, conforme calculado com base na porcentagem de uso de códons e em um valor de tAI modificado com base em uma quantificação direta dos níveis de tRNA em células HEK293 em vez de estimativas dos níveis de tRNA com base no número de cópias do gene tRNA.
II. RNAS DE TRANSFERÊNCIA QUE DECODIFICAM CÓDONS NÃO IDEAIS A. RNAS DE TRANSFERÊNCIA
[0050] Durante a síntese de proteínas, um tRNA entrega um aminoácido a um ribossomo para inserção em uma cadeia crescente de proteína (polipeptídeo). Os tRNAs têm tipicamente cerca de 70 a 100 nucleotídeos de comprimento. Os tRNAs ativos contêm uma sequência de CCA 3 que pode ser transcrita no tRNA durante sua s ntese ou pode ser adicionada posteriormente durante o processamento pós-transcricional. Durante a aminoacilação, o aminoácido que é ligado a uma dada molécula de tRNA é covalentemente ligado ao grupo hidro ila 2 ou 3 da ribose 3 -terminal para formar um aminoacil-tRNA (aa-tRNA). Entende-se que um aminoácido pode migrar espontaneamente do grupo 2 -hidroxila para o grupo 3 -hidroxila e vice- versa, mas é incorporado a uma cadeia proteica crescente no ribossomo a partir da posi o 3 -OH. Uma alça na outra extremidade da molécula de aa-tRNA contém uma sequência de três bases conhecida como anticódon. Quando esta sequência de anticódon hibridiza ou pares de bases com uma sequência de códon de três bases complementar em um transcrito de mRNA ligado ao ribossomo, o aa-tRNA se liga ao ribossomo e seu aminoácido é incorporado na cadeia polipeptídica que está sendo sintetizada pelo ribossomo. Uma vez que todos os tRNAs que emparelham com um códon específico são aminoacilados com um único aminoácido específico, a tradução do código genético é efetuada por tRNAs. Cada um dos 61 códons de não terminação em um mRNA direciona a ligação de seu aa-tRNA cognato e a adição de um único aminoácido específico à proteína crescente ou cadeia polipeptídica sendo sintetizada pelo ribossomo.
[0051] Os tRNAs são, em geral, altamente conservados e frequentemente funcionais entre as espécies. Consequentemente, um tRNA derivado de um tRNA bacteriano, um tRNA eucariótico não mamífero ou um tRNA de mamífero (por exemplo, humano) pode ser útil na prática das composições e métodos descritos neste documento. As sequências de nucleotídeos que codificam tRNAs humanos de ocorrência natural são conhecidas e geralmente estão disponíveis para aqueles versados na técnica através de fontes como Genbank. Veja também Sprinzl et al. (2005) NUCLEIC ACIDS RES. 33: D139 a D40; Buckland et al. (1996) GENOMICS 35(1): 164 a 171; Schimmel et al. (Eds.) (1979) "Transfer-RNA: Structure, Properties, and Recognition," Cold Spring Harbor Laboratory; Agris (1983) "The Modified Nucleosides of Transfer RNA, II," Alan R. Liss Inc. tRNAs são geralmente altamente conservados e são frequentemente funcionais entre as espécies.
[0052] Em certas modalidades, o tRNA é aminoacilado ou é capaz de ser aminoacilado com qualquer aminoácido natural. Por exemplo, um tRNA pode ser capaz de ser aminoacilado com alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico,
glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Em certas modalidades, o aminoácido é selecionado de serina e arginina.
[0053] Em certas modalidades, um tRNA compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de nucleotídeos com 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[0054] A identidade de sequência pode ser determinada de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) que usa o algoritmo empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87: 2.264 a 2.268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290 a 300; Altschul et al., (1997)NUCLEIC ACIDS RES. 25: 3.389 a 3.402, incorporado por referência) são adaptados para pesquisa de similaridade de sequência. Para uma discussão de questões básicas na busca de bancos de dados de sequência, ver Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119 a 129, que é totalmente incorporado por referência. Os versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Os parâmetros de pesquisa para histograma, descrições, alinhamentos, expectativa (ou seja, o limiar de significância estatística para relatar correspondências com sequências de banco de dados), corte, matriz e filtro estão nas configurações padrão. A matriz de pontuação padrão usada por blastp, blastx, tblastn e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 10.915 a
10.919, totalmente incorporado por referência). Quatro parâmetros de blastn podem ser ajustados da seguinte forma: Q = 10 (penalidade de criação de intervalo); R = 10 (penalidade de extensão de intervalo); wink = 1 (gera ocorrências de palavras em cada posição wink.sup.th ao longo de consulta); e gapw = 16 (define a largura da janela dentro da qual os alinhamentos com intervalo são gerados). As configurações de parâmetro Blastp equivalentes podem ser Q=9; R=2; wink=1; e gapw=32. As pesquisas também podem ser conduzidas usando o parâmetro da opção avançada BLAST do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (por exemplo: -G, Custo para abrir intervalo [Número Inteiro]: padrão = 5 para nucleotídeos/11 para proteínas; -E, Custo para estender intervalo [Número Inteiro]: padrão = 2 para nucleotídeos/1 para proteínas; -q, Penalidade para incompatibilidade de nucleotídeo [Número Inteiro]: padrão = -3; -r, recompensa para correspondência de nucleotídeo [Número Inteiro]: padrão = 1; -e, valor esperado [Real]: padrão = 10; -W, tamanho da subsequência [número inteiro]: padrão = 11 para nucleotídeos/28 para megablast/3 para proteínas; -y, valor limite (X) para extensões de blast em bits: padrão = 20 para blastn/7 para outros; -X, valor limite de X para alinhamento com intervalo (em bits): padrão = 15 para todos os programas, não aplicável a blastn; e Z, valor de queda de X final para alinhamento com intervalo (em bits): 50 para blastn, 25 para outros). ClustalW para alinhamentos de proteínas em pares também pode ser usado (os parâmetros padrão podem incluir, por exemplo, matriz Blosum62 e Penalidade de abertura de intervalo = 10 e Penalidade de extensão de intervalo = 0,1). Uma comparação Bestfit entre sequências, disponível no pacote GCG versão 10.0, usa INTERVALO de parâmetros de DNA = 50 (penalidade de criação de intervalo) e LEN = 3 (penalidade de extensão de intervalo) e as configurações equivalentes em comparações de proteínas são INTERVALO = 8 e LEN = 2.
[0055] É contemplado que um tRNA possa compreender uma ou mais modificações. Exemplos de tRNAs modificados incluem: tRNA acilado; tRNA alquilado; um tRNA contendo uma ou mais bases diferentes de adenina, citosina, guanina ou uracila; um tRNA covalentemente modificado pela ligação de um ligante específico ou porção química de sonda antigênica, fluorescente, de afinidade, reativa, espectral ou outra; um tRNA contendo uma ou mais porções químicas de ribose que são metiladas ou de outra forma modificadas; aa-tRNAs que são aminoacilados com um aminoácido diferente dos 20 aminoácidos naturais, incluindo aminoácidos não naturais que funcionam como um transportador para reagentes, ligantes específicos, ou como uma sonda antigênica, fluorescente, reativa, de afinidade, espectral ou outra; ou qualquer combinação dessas composições. Exemplos de moléculas de tRNA modificadas são descritos em Soll et al. (1995) tRNA: Structure, Bios nthesis, and Function, ASM Press; El Yacoubi et al. (2012) ANNU. REV. GENET. 46: 69 a 95; Grosjean et al. (1998) Modification and Editing of RNA. ASM Press; Hendrickson et al. (2004) ANNU. REV. BIOCHEM. 73: 147 a 176, 2004; Ibba et al. (2000) ANNU. REV. BIOCHEM. 69: 617 a 650; Johnson et al. (1995) COLD SPRING HARBOR SYMP. QUANT. BIOL. 60: 71 a 82; Johnson et al. (1982) J. MOL. BIOL. 156: 113 a 140; Crowley et al. (1994) CELL 78: 61 a 71; Beier et al. (2001) NUCLEIC ACIDS RES. 29: 4.767 a 4.782; Torres et al. (2014) TRENDS MOL. MED. 20: 306 a 314; e Bjork et al. (1987) ANNU. REV. BIOCHEM.56: 263 a 287.
[0056] Em certas modalidades, um tRNA compreende uma modificação de nucleotídeo de ocorrência natural. Os tRNAs de ocorrência natural contêm uma grande variedade de nucleotídeos modificados pós-transcricionalmente, que são descritos, por exemplo, em Machnicka et al. (2014) RNA BIOLOGY 11(12): 1.619 a 1.629, e incluem um ou mais dos resíduos como mostrado na FIGURA 2B. Em certas modalidades, o tRNA compreende um ou mais dos resíduos selecionados do grupo que consiste em: 2'-O-metilguanosina ou G na posição 0; pseudouridina ou U na posição 1; 2'-O-metiladenosina, A, 2'-O-metiluridina, U, 2'-O-metilcitidina, C, 2'-O- metilguanosina ou G na posição 4; N2-metilguanosina ou G na posição 6; N2- metilguanosina ou G na posição 7; 1-metiladenosina, A, 1-metilguanosina, G ou uma G modificada na posição 9; N2-metilguanosina ou G na posição 10; N4- acetilcitidina ou C na posição 12; pseudouridina, U, 2'-O-metilcitidina ou C na posição 13; 1-metiladenosina, A ou uma A modificada na posição 14; di- hidrouridina (D) ou U na posi o 16; D ou U na posi o 17; 2 -O-metilguanosina ou G na posição 18; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, D ou U na posição 20; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, D, pseudouridina, U ou uma U modificada na posição 20a; D, pseudouridina ou U na posição 20b; pseudouridina ou U na posição 25; pseudouridina, U, N2,N2-dimetilguanosina, N2-metilguanosina, G ou uma G modificada na posição 26; pseudouridina, U, N2, N2-dimetilguanosina ou G na posição 27; pseudouridina ou U na posição 28; pseudouridina ou U na posição 30; pseudouridina ou U na posição 31; 2'-O-metilpseudouridina, 2'-O- metiluridina, pseudouridina, U, 2'-O-metilcitidina, 3-metilcitidina, C ou uma C modificada na posição 32; inosina, A, 2-tiouridina, 2 -O-metiluridina, 5-(carboxi- hidroximetil)uridina éster metílico, 5-carbamoilmetiluridina, 5- carboximetilaminometil-2 -O-metiluridina, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5- meto icarbonilmetiltiouridina, pseudouridina, U, uma U modificada, 2 -O- metilcitidina, 5-formil-2 -O-metilcitidina, 5-metilcitidina, C, uma C modificada, queuosina, manosil-queuosina, galactosil-queuosina, 2 -O-metilguanosina ou G na posição 34; pseudouridina ou U na posição 35; pseudouridina, U ou uma U modificada na posição 36; 1-metilinosina, 2-metiltio-N6- treonilcarbamoiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-metil-N6- treonilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, A, uma A modificada,1-metilguanosina, peroxiwybutosina, wybutosina, G ou uma G modificada na posição 37; pseudouridina, U, 5-metilcitidina, C ou uma C modificada na posição 38; 1-metilpseudouridina, 2'-O-metilpseudouridina, 2'-O- metiluridina, pseudouridina, U, 2'-O-metilguanosina ou G na posição 39; pseudouridina, U, 5-metilcitidina ou C na posição 40; 2'-O-metiluridina, U ou uma U modificada na posição 44; pseudouridina ou U na posição e11; pseudouridina ou U na posição e12; pseudouridina ou U na posição e14; 3-metilcitidina ou C na posição e2; 7-metilguanosina ou G na posição 46; D, U ou uma U modificada na posição 47; D, U, 5-metilcitidina, C ou uma C modificada na posição 48; A, uma A modificada, 5-metilcitidina, C ou uma C modificada na posição 49;
pseudouridina, U, 5-metilcitidina ou C na posição 50; 5,2'-O-dimetiluridina, 5- metiluridina, pseudouridina ou U na posição 54; pseudouridina ou U na posição 55; 1-metiladenosina, A, ou uma A modificada na posição 58; 2'-O- ribosiladenosina (fosfato), A, 2'-O-ribosilguanosina (fosfato), G ou uma G modificada na posição 64; pseudouridina ou U na posição 65; pseudouridina, U, N2-metilguanosina ou G na posição 67; pseudouridina ou U na posição 68; e pseudouridina, U, 5-metilcitidina ou C na posição 72. A numeração dos resíduos é baseada no sistema de numeração de tRNA descrito em Steinberg et al., (1993) NUCLEIC ACIDS RES. 21: 3.011 a 3.015.
[0057] Em certas modalidades, o tRNA compreende uma ou mais modificações de nucleotídeos selecionadas de 5-metil uridina, pseudouridina, di-hidrouridina e 1-metiladenosina.
B. CÓDONS NÃO IDEAIS
[0058] tRNAs úteis nas composições e métodos aqui descritos compreendem um anticódon que hibridiza com um códon não ideal.
[0059] A síntese de proteínas é dirigida por um código genético que inclui 61 códons de três pares de bases que codificam para aminoácidos que são incorporados na proteína que está sendo sintetizada e 3 códons de três pares de bases (referidos como códons de parada ou terminação) que terminam a síntese de uma proteína. A degenerescência do código genético é uma consequência matemática baseada nas 61 combinações de códons de três pares de bases que codificam para 20 aminoácidos. Códons sinônimos referem-se a códons de três pares de bases que codificam o mesmo aminoácido. Em geral, acredita-se que as substituições de códons sinônimos são silenciosas e não têm impacto na expressão gênica ou na quantidade de produto gênico funcional resultante. No entanto, parece que códons sinônimos são diferencialmente reconhecidos pelo aparelho de tradução. Este conceito é conhecido como otimização de códons. Conceitualmente, a otimização de códons reflete o equilíbrio entre o fornecimento de moléculas de tRNA aminoaciladas e sua demanda imposta pela concentração de códons envolvidos na tradução. Assim, o ribossomo decodifica alguns códons rapidamente porque seus tRNAs cognatos são relativamente mais abundantes, enquanto outros códons são lidos mais lentamente porque suas concentrações de tRNA são relativamente menos abundantes (Tuller et al. (2010) CELL141(2): 344 a 354; Novoa et al. (2012) TRENDS GENET. 28(11): 574 a 581). Além disso, a otimização do códon é baseada um pouco na precisão das interações tRNA anticódon/códon, que podem influenciar a taxa de decodificação (Akashi (1994)GENETICS 136(3): 927 a 935; Drummond et al. (2008) CELL 134(2): 341 a 352).
[0060] Foi demonstrado que a otimização de códons dentro de um transcrito de mRNA influencia a estabilidade do transcrito de mRNA e a taxa na qual o transcrito de mRNA é traduzido pelo ribossomo (Presnyak et al. (2015) CELL 160(6): 1.111 A 1.124; Radhakrishnan et al. (2016) CELL 167 (1): 122 A 132) Consequentemente, como usado aqui, o termo "códon não ideal" refere-se a um códon em um transcrito de mRNA que é reconhecido por um tRNA que é menos abundante na célula do que um tRNA diferente que reconhece outro códon para o mesmo aminoácido. Frequentemente, a substituição de um códon não ideal por um códon diferente que codifica para o mesmo aminoácido (ou seja, um códon sinônimo), mas que é lido por um tRNA que é mais abundante na célula, aumenta a estabilidade do transcrito de mRNA, e/ou a taxa na qual o transcrito do mRNA é traduzido pelo ribossomo. Como resultado, um códon não ideal é qualquer códon cuja superexpressão de seu tRNA cognato aumenta a estabilidade, abundância e/ou alongamento de tradução do mRNA.
[0061] A otimização do códon pode ser medida ou quantificada por uma ou mais das seguintes abordagens, incluindo o índice de adaptação de tRNA (tAI), eficiência de tradução normalizada (nTE), índice de adaptação de tRNA específico da espécie (sTAI), índice de adaptação de códon
(CAI), gCAI, e o coeficiente de correlação estabilidade (CSC) entre ocorrência de códon e mRNA.
[0062] O tAI é uma estimativa da otimização de códons para cada códon que leva em consideração as estimativas da concentração celular de tRNA (com base nos números de cópias do gene do tRNA) e as eficiências de decodificação. O tAI é descrito, por exemplo, em dos Reis et al. (2004) NUCLEIC ACIDS RES. 32 (17): 5.036 a 5.044 e Mahlab et al. (2014) PLOS COMPUT. BIOL. 10(1): e1003294. Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor tAI menor do que o valor tAI mediano de todos os códons para uma dada espécie, por exemplo, humanos.
[0063] Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor de 0,47 ou inferior, conforme determinado pelo tAI. Por exemplo, em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado a partir de CTA (Leu), TCA (Ser), CAT (His), AGT (Ser), TTA (Leu), GTA (Val), ATA (Ile), CGC (Arg), TCG (Ser), TTT (Phe), AGA (Arg), CGA (Arg), ACA (Thr), CCG (Pro), GGT (Gly), AGG (Arg), CGG (Arg), CAA (Gln), CGT (Arg), GAT (Asp), TAT (Tyr), ACC (Thr), TCC (Ser), ACG (Thr), CCC (Pro), CTC (Leu), GTC (Val), TGG (Trp), CCA (Pro), GCG (Ala), TTG (Leu), AGC (Ser), GGA (Gly), CTG (Leu), ACT (Thr), CAC (His), TCT (Ser), GCA (Ala), CCT (Pro), CTT (Leu), GTT (Val), GGG (Gly), GAA (Glu), TTC (Phe), GAG (Glu), TGT (Cys), TAC (Tyr), GGC (Gly), AAT (Asn), GAC (Asp) e qualquer combinação dos mesmos.
[0064] Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor de 0,25 ou inferior, conforme determinado pelo tAI. Por exemplo, em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado a partir de CTA (Leu), TCA (Ser), CAT (His), AGT (Ser), TTA (Leu), GTA (Val), ATA (Ile), CGC (Arg), TCG (Ser), TTT (Phe), AGA (Arg), CGA (Arg), ACA (Thr), CCG (Pro), GGT (Gly), AGG (Arg), CGG (Arg), CAA (Gln), CGT (Arg), GAT (Asp), TAT (Tyr), ACC (Thr), TCC (Ser), ACG (Thr), CCC (Pro), CTC (Leu), GTC (Val), TGG (Trp), CCA (Pro), GCG (Ala), TTG (Leu), AGC (Ser) e qualquer combinação dos mesmos.
[0065] Em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado de CTA (Leu), TCA (Ser), CAT (His), AGT (Ser), TTA (Leu), GTA (Val), ATA (Ile), CGC (Arg), TCG (Ser), TTT (Phe), AGA (Arg), CGA (Arg), ACA (Thr), CCG (Pro), GGT (Gly), AGG (Arg), CGG (Arg), CAA (Gln), CGT (Arg), GAT (Asp) e qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado de CTA (Leu), TCA (Ser), CAT (His), AGT (Ser), TTA (Leu), GTA (Val), ATA (Ile), CGC (Arg), TCG (Ser), TTT (Phe) e qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado de CTA (Leu), TCA (Ser), CAT (His), AGT (Ser), TTA (Leu) e qualquer combinação dos mesmos.
[0066] A otimização do códon também pode ser medida por uma versão modificada de tAI que é baseada em uma quantificação direta dos níveis de tRNA em uma determinada célula no lugar de estimativas baseadas no número de cópias do gene tRNA. Os níveis de tRNA podem ser determinados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em Zheng et al. (2015) NAT. METHODS. 12(9): 835 a 837. Por exemplo, em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado a partir de AGA (Arg), CTC (Leu), ATA (Ile), CCC (Pro), CTA (Leu), CTT (Leu), TAT (Tyr), CCT (Pro), TGT (Cys), CGC (Arg), GCA (Ala), TCC (Ser), TAC (Tyr), GCG (Ala), AGG (Arg), CGT (Arg), CCG (Pro), GGA (Gly), CCA (Pro), TGC (Cys), TCT (Ser), TCG (Ser), TTG (Leu), AGT (Ser), TTT (Phe), ACG (Thr), AAT (Asn), ACA (Thr), GAA (Glu), ATC (Ile), TGG (Trp) e qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado de AGA (Arg), CTC (Leu), ATA (Ile), CCC (Pro), CTA (Leu), CTT (Leu), TAT (Tyr), CCT (Pro), TGT (Cys), CGC (Arg), GCA (Ala), TCC (Ser), TAC (Tyr), GCG (Ala), AGG (Arg), CGT (Arg), CCG (Pro), GGA (Gly), CCA (Pro), TGC (Cys) e qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado de AGA (Arg), CTC (Leu), ATA (Ile), CCC (Pro), CTA (Leu), CTT (Leu), TAT (Tyr), CCT (Pro), TGT (Cys), CGC (Arg) e qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades,
um códon não ideal é selecionado de AGA (Arg), CTC (Leu), ATA (Ile), CCC (Pro), CTA (Leu) e qualquer combinação dos mesmos.
[0067] Em certas modalidades, o valor médio de tAI dos códons no gene está entre cerca de 0,15 e cerca de 0,5, cerca de 0,15 e cerca de 0,45, cerca de 0,15 e cerca de 0,4, cerca de 0,15 e cerca de 0,35, cerca de 0,15 e cerca de 0,3, cerca de 0,15 e cerca de 0,25, cerca de 0,15 e cerca de 0,2, cerca de 0,2 e cerca de 0,5, cerca de 0,2 e cerca de 0,45, cerca de 0,2 e cerca de 0,4, cerca de 0,2 e cerca de 0,35, cerca de 0,2 e cerca de 0,3, cerca de 0,2 e cerca de 0,25, cerca de 0,25 e cerca de 0,5, cerca de 0,25 e cerca de 0,45, cerca de 0,25 e cerca de 0,4, cerca de 0,25 e cerca de 0,35, cerca de 0,25 e cerca de 0,3, cerca de 0,3 e cerca de 0,5, cerca de 0,3 e cerca de 0,45, cerca de 0,3 e cerca de 0,4, cerca de 0,3 e cerca de 0,35, cerca de 0,35 e cerca de 0,5, cerca de 0,35 e cerca de 0,45, cerca de 0,35 e cerca de 0,4, cerca de 0,4 e cerca de 0,5, cerca de 0,4 e cerca de 0,45 e cerca de 0,45 e cerca de 0,5. Em certas modalidades, o valor tAI médio dos códons no gene é inferior a cerca de 0,15, cerca de 0,2, cerca de 0,25, cerca de 0,3, cerca de 0,35, cerca de 0,4, cerca de 0,45 ou cerca de 0,5.
[0068] stAI é uma estimativa da otimização do códon para cada códon que leva em consideração as estimativas da concentração celular de tRNA e eficiências de decodificação, e pondera a eficiência de decodificação de uma maneira específica da espécie. stAI é descrito, por exemplo, em Sabi et al. (2014) DNA RES. 21(5): 511 a 525. Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor stAI menor do que o valor stAI mediano de todos os códons para uma determinada espécie, por exemplo, humanos.
[0069] nTE é uma estimativa da otimização de códons para cada códon que leva em consideração as estimativas da concentração celular de tRNA, eficiências de decodificação e uso de códons no agrupamento de mRNA celular. nTE é descrito, por exemplo, em Pechman et al. (2013) NAT. STRUCT. MOL. BIOL. 20(2): 237 a 243. Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor nTE menor do que o valor nTE mediano de todos os códons para uma dada espécie, por exemplo, humanos.
[0070] O CAI estima a otimização do códon marcando a frequência do códon em genes altamente expressos. Consequentemente, a otimização do códon como estimada por CAI pode mudar dependendo do conjunto de genes designado como altamente expresso. CAI é descrito, por exemplo, em Sharp et al. (1987) NUCLEIC ACIDS RES. 15(3): 1.281 a
1.295. gCAI é semelhante ao CAI, mas usa todo o transcriptoma expresso de uma determinada célula. Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor CAI menor do que o valor CAI mediano de todos os códons para uma determinada espécie, por exemplo, humanos.
[0071] O CSC estima a otimização do códon correlacionando a ocorrência do códon com as medições da meia-vida do mRNA. CSC é descrito, por exemplo, em Presnyak et al. (2015) CELL 160(6):
1.111 A 1.124. Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor de CSC menor do que o valor de CSC mediano de todos os códons para uma determinada espécie, por exemplo, humanos. Em certas modalidades, um códon não ideal tem um valor de 0 ou inferior, conforme determinado pelo CSC.
[0072] Em certas modalidades, um códon não ideal é selecionado a partir de ATA, GTA e AGA e qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o códon não ideal é ATA. Em certas modalidades, o códon não ideal é GTA. Em certas modalidades, o códon não ideal é AGA. Em certas modalidades, os códons não ideais são ATA e GTA. Em certas modalidades, os códons não ideais são ATA e AGA. Em certas modalidades, os códons não ideais são GTA e AGA. Em certas modalidades, os códons não ideais são ATA, GTA e AGA.
[0073] Em certas modalidades, cerca de 20% a cerca de 70%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 50%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 20% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 30% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de
30% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca de 70%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 40% a cerca de 50%, cerca de 50% a cerca de 70%, cerca de 50% a cerca de 60% ou cerca de 60% a cerca de 70% dos códons no gene são códons não ideais. Em certas modalidades, mais do que cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60% ou cerca de 70% dos códons no gene são códons não ideais. Em certas modalidades, mais do que cerca de 40% ou cerca de 50% dos códons no gene são códons não ideais.
III. MÉTODOS DE FAZER RNAS DE TRANSFERÊNCIA
[0074] É contemplado que as moléculas de tRNA úteis na prática das composições e métodos aqui descritos podem ser produzidas por métodos conhecidos na técnica, incluindo produção extracelular por métodos químicos sintéticos, produção intracelular por métodos de DNA recombinante ou purificação de fontes naturais.
[0075] Por exemplo, as moléculas de DNA que codificam tRNAs podem ser sintetizadas quimicamente ou por metodologias de DNA recombinante. Por exemplo, as sequências dos tRNAs podem ser sintetizadas ou clonadas a partir de bibliotecas por técnicas de hibridização convencionais ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), usando os iniciadores de ácido nucleico sintéticos apropriados. As moléculas de DNA resultantes que codificam os tRNAs podem ser ligadas a outras sequências de nucleotídeos apropriadas, incluindo, por exemplo, sequências de controle de expressão para produzir construtos de expressão de genes convencionais (isto é, vetores de expressão) que codificam os tRNAs. A produção de construtos de genes definidos está dentro dos conhecimentos de rotina na técnica. Os ácidos nucleicos que codificam os tRNAs desejados podem ser incorporados (ligados) em vetores de expressão, tais como os vetores de expressão descritos na seção a seguir, que podem ser introduzidos em células hospedeiras através de técnicas convencionais de transfecção ou transformação. Exemplos de células hospedeiras são células de E. coli, células de ovário de hamster chinês (CHO),
células de rim embrionário humano 293 (HEK 293), células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma. As células hospedeiras transformadas podem ser cultivadas em condições que permitem que as células hospedeiras expressem os genes que codificam os tRNAs. As condições de expressão e purificação específicas irão variar dependendo do sistema de expressão utilizado.
[0076] Alternativamente, os tRNAs podem ser quimicamente sintetizados ou purificados a partir de fontes naturais por métodos conhecidos na técnica. Quando um tRNA é aminoacilado antes da introdução na célula ou administração ao sujeito, o tRNA pode ser aminoacilado com um aminoácido desejado por qualquer método conhecido na técnica, incluindo aminoacilação química ou enzimática.
IV. VETORES DE EXPRESSÃO
[0077] Os tRNAs de interesse podem ser expressos em uma célula de interesse incorporando um gene que codifica um tRNA de interesse em um vetor de expressão. Tal como aqui utilizado, "vetor de expressão" refere-se a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas), retrotransposons (por exemplo, do tipo piggyback, ou do tipo bela adormecida (Sleeping Beauty)) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.
[0078] Em certas modalidades, o vetor de expressão é um vetor viral. O termo "vírus" é utilizado neste documento para se referir a qualquer um dos parasitas intracelulares obrigatórios sem mecanismo de síntese de proteínas ou de geração de energia. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais (por exemplo, vetores lentivirais), vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores do vírus da herpes, vetores do vírus epstein- barr (EBV), vetores de poliomavírus (por exemplo, vetores do vírus vacuolante de símio 40 (SV40)), vetores de poxvírus e vetores de vírus de pseudótipo.
[0079] O vírus pode ser um vírus de RNA (que tem um genoma composto por RNA) ou um vírus de DNA (que tem um genoma composto por DNA). Em certas modalidades, o vetor viral é um vetor viral de DNA. Vírus de DNA exemplares incluem parvovírus (por exemplo, vírus adenoassociados), adenovírus, asfarvírus, herpesvírus (por exemplo, vírus herpes simplex 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2), vírus epstein-barr (EBV), citomegalovírus (CMV)), papilomovírus (por exemplo, HPV), poliomavírus (por exemplo, vírus vacuolante símio 40 (SV40)) e poxvírus (por exemplo, vírus vaccinia, vírus da varíola bovina, vírus da varíola, vírus da varíola aviária, vírus da varíola caprina, vírus mixoma). Em certas modalidades, o vetor viral é um vetor viral de RNA. Exemplos de vírus de RNA incluem bunyavírus (por exemplo, hantavírus), coronavírus, ebolavírus, flavivírus (por exemplo, vírus da febre amarela, vírus do nilo ocidental, vírus da dengue), vírus da hepatite (por exemplo, vírus da hepatite A, vírus da hepatite C, vírus da hepatite E), vírus influenza (por exemplo, vírus influenza tipo A, vírus influenza tipo B, vírus influenza tipo C), vírus do sarampo, vírus da caxumba, norovírus (por exemplo, vírus de Norwalk), poliovírus, vírus sincicial respiratório (RSV), retrovírus (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1)) e torovírus.
[0080] Em certas modalidades, o vetor de expressão compreende uma sequência reguladora ou promotora operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica o tRNA. O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma ligação de elementos polinucleotídicos em uma relação funcional. Uma sequência de ácido nucleico está "operacionalmente ligada" quando é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a um gene se afetar a transcrição do gene. As sequências de nucleotídeos operacionalmente ligadas são tipicamente contíguas. No entanto, como os intensificadores geralmente funcionam quando separados do promotor por várias quilobases e as sequências intrônicas podem ser de comprimentos variáveis, alguns elementos polinucleotídicos podem ser operativamente ligados, mas não flanqueados diretamente, e podem até funcionar in trans de um alelo ou cromossomo diferente.
[0081] Os genes do tRNA têm, de preferência, promotores fortes que são ativos em uma variedade de tipos de células. Os promotores para genes de tRNA eucarióticos estão tipicamente presentes nas sequências estruturais que codificam a própria molécula de tRNA. Embora e istam elementos que regulam a atividade transcricional dentro da regi o 5 a montante, o comprimento de uma unidade transcricional ativa pode ser consideravelmente menor do que 500 pares de bases.
[0082] Exemplos adicionais de promotores que podem ser empregados incluem, mas não estão limitados a, a LTR retroviral, o promotor SV40, o promotor de citomegalovírus humano (CMV), o promotor U6, ou qualquer outro promotor (por exemplo, promotores celulares, tais como promotores celulares eucarióticos incluindo, mas não se limitando a, os promotores histona, pol III e -actina). Outros promotores virais, que podem ser empregados, incluem, mas não estão limitados a, promotores de adenovírus, promotores de TK e promotores de parvovírus B19. A seleção de um promotor será evidente para os versados na técnica a partir dos ensinamentos contidos neste documento.
[0083] Em certas modalidades, um vetor de expressão compreende uma sequência de codificação de tRNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO:
3, ou uma sequência de nucleotídeos tendo 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3.
[0084] Em certas modalidades, além de uma sequência de codificação de tRNA, o vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos correspondente à sequência de DNA genômico que flanqueia um gene de tRNA de tipo selvagem correspondente. Por exemplo, em certas modalidades, um vetor de expressão compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, ou uma sequência de nucleotídeos que tem 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
VETORES DE VÍRUS ADENOASSOCIADOS (AAV)
[0085] Em certas modalidades, um vetor de expressão é um vetor de vírus adenoassociado (AAV). AAV é um pequeno vírus icosaédrico sem envelope do gênero Dependoparvovirus e família Parvovirus. AAV tem um genoma de DNA linear de fita simples de aproximadamente 4,7 kb. O AAV é capaz de infectar células em divisão e quiescentes de vários tipos de tecido, com diferentes sorotipos de AAV exibindo tropismo de tecido diferente.
[0086] AAV inclui vários tipos sorologicamente distinguíveis, incluindo sorotipos AAV-1 a AAV-12, bem como mais de 100 sorotipos de primatas não humanos (ver, por exemplo, Srivastava (2008) J. CELL BIOCHEM., 105(1): 17 a 24, e Gao et al. (2004) J. VIROL., 78(12), 6.381 a 6.388). O sorotipo do vetor AAV usado nas composições e métodos descritos neste documento pode ser selecionado por um versado na técnica com base na eficiência de entrega, tropismo de tecido e imunogenicidade. Por exemplo, AAV-
1, AAV-2, AAV-4, AAV-5, AAV-8 e AAV-9 podem ser usados para entrega ao sistema nervoso central; AAV-1, AAV-8 e AAV-9 podem ser usados para entrega ao coração; AAV-2 pode ser usado para entrega ao rim; AAV-7, AAV-8 e AAV-9 podem ser usados para entrega ao fígado; AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-9 podem ser usados para entrega ao pulmão, AAV-8 pode ser usado para entrega ao pâncreas, AAV-2, AAV-5 e AAV-8 podem ser usados para entrega às células fotorreceptoras; AAV-1, AAV-2, AAV-4, AAV-5 e AAV-8 podem ser usados para entrega ao epitélio pigmentar da retina; AAV-1, AAV-6, AAV-7, AAV-8 e AAV-9 podem ser usados para entrega ao músculo esquelético. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV compreende uma sequência conforme divulgado na Patente US No. 7.198.951, tal como, mas não se limitando a, AAV-9 (SEQ ID NOs: 1 a 3 da Patente US No. 7.198.951), AAV-2 (SEQ ID NO: 4 da Patente US 7.198.951), AAV-1 (SEQ ID NO: 5 da Patente US
7.198.951), AAV-3 (SEQ ID NO: 6 da Patente US 7.198.951) e AAV-8 (SEQ ID NO: 7 da Patente US No. 7.198.951). Os sorotipos AAV identificados de macacos rhesus, por exemplo, rh.8, rh.10, rh.39, rh.43 e rh.74, também são contemplados. Além dos sorotipos naturais de AAV, capsídeos de AAV modificados foram desenvolvidos para melhorar a eficiência de entrega, tropismo de tecido e imunogenicidade. Exemplos de capsídeos de AAV naturais e modificados são divulgados nas Patentes US Nos. 7.906.111, 9.493.788 e 7.198.951 e na Publicação PCT No. WO2017189964A2.
[0087] O genoma de AAV de tipo selvagem contém duas repetições terminais invertidas de 145 nucleotídeos (ITRs), que contêm sequências de sinal que direcionam a replicação de AAV, encapsidação do genoma e integração. Além das ITRs, três promotores de AAV, p5, p19 e p40, conduzem a expressão de duas fases de leitura aberta que codificam genes rep e cap. Dois promotores rep, juntamente com o splicing diferencial do único íntron AAV, resultam na produção de quatro proteínas rep (Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40) a partir do gene rep. As proteínas rep são responsáveis pela replicação genômica. O gene Cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica três proteínas do capsídeo (VP1, VP2 e VP3) que são variantes de splice do gene cap. Essas proteínas formam o capsídeo da partícula AAV.
[0088] Como os sinais de ação cis para replicação, encapsidação e integração estão contidos nas ITRs, alguns ou todos os genomas internos de 4,3 kb podem ser substituídos por DNA estranho, por exemplo, um cassete de expressão para um gene exógeno de interesse. Por conseguinte, em certas modalidades, o vetor AAV compreende um genoma que compreende um cassete de expressão para um gene exógeno flanqueado por uma ITR 5 e uma ITR 3 . As ITRs podem ser derivadas do mesmo sorotipo que o capsídeo ou um derivado do mesmo. Alternativamente, as ITRs podem ser de um sorotipo diferente do capsídeo, gerando assim um AAV pseudotipado. Em certas modalidades, as ITRs são derivadas de AAV-2. Em certas modalidades, as ITRs são derivadas de AAV-5. Pelo menos uma das ITRs pode ser modificada para mutar ou excluir o local de resolução terminal, permitindo assim a produção de um vetor AAV autocomplementar.
[0089] As proteínas rep e cap podem ser fornecidas em trans, por exemplo, em um plasmídeo, para produzir um vetor AAV. Uma linha celular hospedeira permissiva à replicação de AAV deve expressar os genes rep e cap, o cassete de expressão flanqueado por ITR e funções auxiliares fornecidas por um vírus auxiliar, por exemplo, os genes adenovirais E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 e VA (Weitzman et al., Adeno-associated virus biology. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols, pp. 1 a 23, 2011). Métodos para gerar e purificar vetores AAV foram descritos em detalhes (ver, por exemplo, Mueller et al., (2012) CURRENT PROTOCOLS IN MICROBIOLOGY, 14D.1.1 a 14D.1.21, Production and Discovery of Novel Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors). Numerosos tipos de células são adequados para a produção de vetores AAV, incluindo células HEK293, células COS, células HeLa, células BHK, células Vero, bem como células de inseto (ver, por exemplo, as patentes US Nos. 6.156.303, 5.387.484, 5.741.683, 5.691.176, 5.688.676 e 8.163.543, Publicação de Patente US No 20020081721 e Publicação PCT Nos.
WO00/47757, WO00/24916 e WO96/17947). Os vetores AAV são tipicamente produzidos nestes tipos de células por um plasmídeo contendo o cassete de expressão flanqueada por ITR e um ou mais plasmídeos adicionais que fornecem os genes adicionais de AAV e vírus auxiliares.
[0090] AAV de qualquer sorotipo pode ser usado nas composições e métodos descritos neste documento. Da mesma forma, é contemplado que qualquer tipo de adenoviral pode ser usado, e um versado na técnica será capaz de identificar AAV e tipos adenovirais adequados para a produção de seu vetor AAV recombinante (rAAV) desejado. As partículas de AAV podem ser purificadas, por exemplo, por cromatografia de afinidade, gradiente iodixanal ou gradiente de CsCl.
[0091] Os vetores AAV podem ter genomas de fita simples com 4,7 kb de tamanho, ou maiores ou menores que 4,7 kb, incluindo genomas superdimensionados que são tão grandes quanto 5,2 kb ou tão pequenos quanto 3,0 kb. Assim, quando o gene exógeno de interesse a ser expresso a partir do vetor AAV é pequeno, o genoma de AAV pode compreender uma sequência stuffer. Além disso, os genomas do vetor podem ser substancialmente autocomplementares, permitindo assim uma rápida expressão na célula. Em certas modalidades, o genoma de um vetor AAV autocomplementar compreende de 5 a 3 : uma ITR 5 ; uma primeira sequ ncia de ácido nucleico compreendendo um promotor e/ou intensificador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de um gene de interesse; uma ITR modificada que não possui um local de resolução de terminal funcional; uma segunda sequência de ácido nucleico complementar ou substancialmente complementar à primeira sequência de ácido nucleico; e uma ITR 3 . Os vetores AAV que contêm genomas de todos os tipos são adequados para uso nos métodos descritos neste documento.
[0092] Exemplos não limitativos de vetores AAV incluem pAAV-MCS (Agilent Technologies), pAAVK-EF1 -MCS (Catálogo System Bio número AAV502A-1), pAAVK-EF1 -MCS1-CMV-MCS2 (Catálogo
System Bio número AAV503A-1), pAAV-ZsGreen1 (Catálogo Clontech número 6231), pAAV-MCS2 (Plasmídeo Addgene número 46954), AAV-Stuffer (Plasmídeo Addgene número 106248), pAAVscCBPIGpluc (Plasmídeo Addgene número 35645), AAVS1_Puro_PGK1_3xFLAG_Twin_Strep (Plasmídeo Addgene número 68375), pAAV-RAM-d2TTA::TRE-MCS-WPRE-pA (Plasmídeo Addgene número 63931), pAAV-UbC (Plasmídeo Addgene número 62806), pAAVS1-P-MCS (Plasmídeo Addgene número 80488), pAAV-Gateway (Plasmídeo Addgene número 32671), pAAV-Puro_siKD (Plasmídeo Addgene número 86695), pAAVS1-Nst-MCS (Plasmídeo Addgene número 80487), pAAVS1-Nst-CAG-DEST (Plasmídeo Addgene número 80489), pAAVS1-P- CAG-DEST (Plasmídeo Addgene número 80490), pAAVf-EnhCB-lacZnls (Plasmídeo Addgene número 35642), and pAAVS1-shRNA (Plasmídeo Addgene número 82697). Esses vetores podem ser modificados para serem adequados para uso terapêutico. Por exemplo, um gene exógeno de interesse pode ser inserido em um local de clonagem múltipla e um marcador de seleção (por exemplo, puro ou um gene que codifica uma proteína fluorescente) pode ser excluído ou substituído por outro gene exógeno (igual ou diferente) de interesse. Outros exemplos de vetores AAV são divulgados nas Patentes US Nos.
5.871.982, 6.270.996, 7.238.526, 6.943.019, 6.953.690, 9.150.882 e 8.298.818, Publicação de Patente US No. 2009/0087413 e Publicação PCT Nos. WO2017075335A1, WO2017075338A2 e WO2017201258A1.
[0093] Em certas modalidades, o vetor de expressão é um vetor AAV capaz de atingir o sistema nervoso, por exemplo, o sistema nervoso central, em um sujeito, por exemplo, um sujeito humano. Os vetores AAV exemplares que podem atingir o sistema nervoso incluem as variantes AAV9 AAV-PHP.B (Ver, por exemplo, Deverman et al. (2016)NAT. BIOTECHNOL. 34(2): 204 a 209), AAV-AS (Ver, por exemplo, Choudhury et al. (2016) MOL. THER. 24: 726 a 735) e AAV-PHP.eB (Ver, por exemplo, Chan et al. (2017) NAT. NEUROSCI. 20: 1.172 a 1.179). Estratégias baseadas em AAV exemplares adicionais para direcionar o sistema nervoso são descritas em Bedrook et al. (2018) ANNU REV NEUROSCI. 41: 323 a 348.
VETORES DE LENTIVÍRUS
[0094] Em certas modalidades, o vetor viral pode ser um vetor retroviral. Exemplos de vetores retrovirais incluem vetores do vírus da leucemia murina moloney, vetores do vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovírus, tais como vírus do sarcoma de rous, vírus do sarcoma de harvey, vírus da leucose aviária, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário. Os vetores retrovirais são úteis como agentes para mediar a transferência de genes mediada por retrovirais para células eucarióticas.
[0095] Em certas modalidades, o vetor retroviral é um vetor lentiviral. Exemplos de vetores lentivirais incluem vetores derivados do vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1), vírus da imunodeficiência humana- 2 (HIV-2), vírus da imunodeficiência símia (SIV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da imunodeficiência bovina (BIV), vírus da doença de jembrana (JDV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e vírus da artrite encefalite caprina (CAEV).
[0096] Os vetores retrovirais são tipicamente construídos de modo que a maioria das sequências que codificam os genes estruturais do vírus sejam deletadas e substituídas pelo gene (ou pelos genes) de interesse. Mais frequentemente, os genes estruturais (isto é, gag, pol e env) são removidos da estrutura retroviral usando técnicas de engenharia genética conhecidas na técnica. Isto pode incluir digestão com a endonuclease de restrição apropriada ou, em alguns casos, com a exonuclease Bal 31 para gerar fragmentos que contêm porções apropriadas do sinal de empacotamento. Consequentemente, um vetor retroviral mínimo compreende de 5 a 3 : uma repeti o terminal longa 5 (LTR), um sinal de empacotamento, um promotor exógeno opcional e/ou potenciador, um gene exógeno de interesse e uma LTR
3 . Se nenhum promotor exógeno for fornecido, a expressão do gene é conduzida pela LTR 5 , que um promotor fraco e requer a presen a de Tat para ativar a expressão. Os genes estruturais podem ser fornecidos em vetores separados para a fabricação do lentivírus, tornando os vírions produzidos defeituosos na replicação. Especificamente, com respeito ao lentivírus, o sistema de empacotamento pode compreender um único vetor de empacotamento que codifica os genes Gag, Pol, Rev e Tat, e um terceiro vetor separado que codifica a proteína Env do envelope (geralmente VSV-G devido à sua ampla infecciosidade). Para melhorar a segurança do sistema de empacotamento, o vetor de empacotamento pode ser dividido, expressando Rev de um vetor, Gag e Pol de outro vetor. Tat também pode ser eliminado do sistema de empacotamento usando um vetor retroviral compreendendo uma LTR 5 quim rica, em que a regi o U3 da LTR 5 substitu da por um elemento regulador heterólogo.
[0097] Esses novos genes podem ser incorporados à estrutura proviral de várias maneiras gerais. As construções mais simples são aquelas em que os genes estruturais do retrovírus são substituídos por um único gene que, em seguida, é transcrito sob o controle das sequências regulatórias virais dentro da LTR. Também foram construídos vetores retrovirais que podem introduzir mais de um gene nas células alvo. Normalmente, em tais vetores, um gene está sob o controle regulatório da LTR viral, enquanto o segundo gene é expresso em uma mensagem submetida a splicing ou está sob a regulação de seu próprio promotor interno.
[0098] Consequentemente, o novo gene (ou os novos genes) s o flanqueados por LTRs 5 e 3 , que servem para promover a transcrição e poliadenilação dos RNAs do vírion, respectivamente. O termo "repetição terminal longa" ou "LTR" refere-se a domínios de pares de bases localizados nas extremidades de DNAs retrovirais que, em seu contexto de sequência natural, são repetições diretas e contêm regiões U3, R e U5. As LTRs geralmente fornecem funções fundamentais para a expressão de genes retrovirais (por exemplo, promoção, iniciação e poliadenilação de transcritos de genes) e para a replicação viral. A LTR contém vários sinais regulatórios, incluindo elementos de controle da transcrição, sinais de poliadenilação e sequências necessárias para a replicação e integração do genoma viral. A região U3 contém os elementos potenciadores e promotores. A região U5 é a sequência entre o local de ligação do iniciador e a região R e contém a sequência de poliadenilação. A região R (repetição) é flanqueada pelas regiões U3 e U5. Em certas modalidades, a região R compreende um elemento genético de resposta de transativação (TAR), que interage com o elemento genético transativador (tat) para aumentar a replicação viral. Este elemento não é necessário em modalidades em que a regi o U3 da LTR 5 substitu da por um promotor heterólogo.
[0099] Em certas modalidades, o vetor retroviral compreende uma LTR 5 e/ou LTR 3 modificada. As modifica es do LTR 3 s o frequentemente feitas para melhorar a segurança dos sistemas lentivirais ou retrovirais, tornando os vírus defeituosos na replicação. Em modalidades específicas, o vetor retroviral é um vetor de autoinativação (SIN). Tal como aqui utilizado, um vetor retroviral SIN refere-se a um vetor retroviral com defeito de replica o, no qual a regi o LTR 3 U3 foi modificada (por exemplo, por deleção ou substituição) para prevenir a transcrição viral além da primeira rodada de replicação viral. Isso ocorre porque a regi o LTR 3 U3 usada como um template para a regi o LTR 5 U3 durante a replica o viral e, assim, a transcrição viral não pode ser feita sem o intensificador-promotor U3. Em uma outra modalidade, o LTR 3 modificado de modo que a regi o U5 seja substituída, por exemplo, por uma sequência de poliadenilação ideal. Deve-se notar que modificações nas LTRs, como modifica es na LTR 3 , na LTR 5 , ou ambas dentre LTR 3 e 5 , tamb m s o descritas neste documento.
[00100] Em certas modalidades, a regi o U3 do LTR 5 é substituída por um promotor heterólogo para conduzir a transcrição do genoma viral durante a produção de partículas virais. Exemplos de promotores heterólogos que podem ser usados incluem, por exemplo, vírus símio viral 40 (SV40) (por exemplo, precoce ou tardio), citomegalovírus (CMV) (por exemplo, de início imediato), vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), promotores do vírus do sarcoma de Rous (RSV) e do vírus herpes simplex (HSV) (timidina quinase). Os promotores típicos são capazes de conduzir altos níveis de transcrição de uma maneira independente de Tat. Essa substituição reduz a possibilidade de recombinação para gerar vírus competente para replicação, porque não há sequência U3 completa no sistema de produção de vírus.
[00101] Adjacente LTR 5 est o as sequ ncias necessárias para a transcrição reversa do genoma (o local de ligação do tRNA iniciador) e para o empacotamento eficiente do RNA viral em partículas (o local Psi). Tal como aqui utilizado, o termo "sinal de empacotamento" ou "sequência de empacotamento" refere-se a sequências localizadas dentro do genoma retroviral que são necessárias para a encapsidação de fitas de RNA retrovirais durante a formação de partícula viral (ver, por exemplo, Clever et al., 1995 J. VIROLOGY, 69 (4): 2.101 a 2.109). O sinal de empacotamento pode ser um sinal de empacotamento m nimo (tamb m referido como a sequ ncia psi [ ]) necessário para encapsidação do genoma viral.
[00102] Em certas modalidades, o vetor retroviral (por exemplo, vetor lentiviral) compreende ainda um FLAP. Tal como aqui utilizado, o termo "FLAP" refere-se a um ácido nucleico cuja sequência inclui o trato central de polipurina e as sequências de terminação central (cPPT e CTS) de um retrovírus, por exemplo, HIV-1 ou HIV-2. Exemplos de elementos FLAP são descritos na Patente US No 6.682.907 e em Zennou et al. (2000) CELL 101:173. Durante a transcrição reversa, a iniciação central do DNA de fita positiva no cPPT e a terminação central no CTS levam à formação de uma estrutura de DNA de três fitas: um DNA flap central. Embora não se deseje estar limitado por qualquer teoria, o DNA flap pode atuar como um determinante cis ativo da importação nuclear do genoma lentiviral e/ou pode aumentar a concentração do vírus. Em modalidades particulares, as estruturas do vetor retroviral compreendem um ou mais elementos FLAP a montante ou a jusante dos genes heterólogos de interesse nos vetores. Por exemplo, em modalidades particulares, um plasmídeo de transferência inclui um elemento FLAP. Em uma modalidade, um vetor descrito no presente documento compreende um elemento FLAP isolado do HIV-
1.
[00103] Em certas modalidades, o vetor retroviral (por exemplo, vetor lentiviral) compreende ainda um elemento de exportação. Em uma modalidade, os vetores retrovirais compreendem um ou mais elementos de exportação. O termo "elemento de exportação" se refere a um elemento regulador pós-transcricional de ação cis que regula o transporte de um transcrito de RNA do núcleo para o citoplasma de uma célula. Exemplos de elementos de exportação de RNA incluem, mas não estão limitados a, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) RRE (ver, por exemplo, Cullen et al., (1991) J. VIROL. 65: 1.053; e Cullen et al., (1991) CELL 58: 423) e o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite B (HPRE). Geralmente, o elemento de e porta o de RNA colocado dentro da UTR 3 de um gene e pode ser inserido como uma ou várias cópias.
[00104] Em certas modalidades, o vetor retroviral (por exemplo, vetor lentiviral) compreende ainda um elemento regulador pós- transcricional. Uma variedade de elementos reguladores pós-transcricionais podem aumentar a expressão de um ácido nucleico heterólogo, por exemplo, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE; ver Zufferey et al., (1999) J. VIROL., 73: 2.886); o elemento regulador pós- transcricional presente no vírus da hepatite B (HPRE) (Huang et al., MOL. CELL. BIOL., 5: 3.864); e semelhantes (Liu et al., (1995), GENES DEV., 9: 1.766). O elemento regulador pós-transcricional é geralmente posicionado na extremidade 3 da sequ ncia de cido nucleico heter loga. Esta configuração resulta na síntese de um transcrito de mRNA cuja por o 5 compreende as sequ ncias de codifica o de cido nucleico heter logas e cuja por o 3 compreende a sequência do elemento regulador pós-transcricional. Em certas modalidades, os vetores aqui descritos não possuem ou não compreendem um elemento regulador pós-transcricional, como um WPRE ou HPRE, porque em alguns casos esses elementos aumentam o risco de transformação celular e/ou não aumentam substancialmente ou a quantidade de transcrito de mRNA ou aumentam a estabilidade do mRNA significativamente. Portanto, em certas modalidades, os vetores descritos no presente documento não possuem ou não compreendem um WPRE ou HPRE como uma medida de segurança adicional.
[00105] Os elementos que direcionam a terminação e poliadenilação eficiente dos transcritos de ácido nucleico heterólogos aumentam a expressão do gene heterólogo. Os sinais de terminação da transcrição são geralmente encontrados a jusante do sinal de poliadenilação. Por conseguinte, em certas modalidades, o vetor retroviral (por exemplo, vetor lentiviral) compreende ainda um sinal de poliadenilação. O termo "sinal de poliadenilação" ou "sequência de poliadenilação", tal como aqui utilizado, denota uma sequência de DNA, que direciona tanto a terminação quanto a poliadenilação do transcrito de RNA nascente pela RNA polimerase H. A poliadenilação eficiente do transcrito recombinante é desejável, pois transcritos sem um sinal de poliadenilação são instáveis e degradam-se rapidamente. Exemplos ilustrativos de sinais de poliadenilação que podem ser usados em um vetor descrito neste documento incluem uma sequência de poliadenilação ideal (por exemplo, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), uma sequência de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BGHpA), uma sequência de poliadenilação de -globina de coelho (r gpA), ou outra sequ ncia de poliadenila o heter loga ou end gena adequada conhecida na técnica.
[00106] Em certas modalidades, um vetor retroviral compreende ainda um elemento isolador. Os elementos isolantes podem contribuir para proteger as sequências expressas por retrovírus, por exemplo, genes terapêuticos, dos efeitos do local de integração, que podem ser mediados por elementos de ação cis presentes no DNA genômico e levar à expressão desregulada de sequências transferidas (ou seja, efeito de posição; ver, por exemplo, Burgess-Beusse et al., (2002) PROC. NATL. ACAD. SCI., EUA, 99: 16.433; e Zhan et al., 2001, ZUMBIR. GENET., 109: 471). Em certas modalidades, o vetor retroviral compreende um elemento isolador em uma ou ambas as LTRs ou em outro lugar na região do vetor que se integra ao genoma celular. Exemplos de isoladores para uso nas composições e métodos descritos neste documento incluem, mas n o est o limitados a, isolador de -globina de frango (ver Chung et al., (1993). CELL 74: 505; Chung et al., (1997) PROC. NATL. ACAD. SCI., EUA 94: 575; e Bell et al., 1999. CELL 98:387). Exemplos de elementos isolantes incluem, mas n o est o limitados a, um isolador de um locus de -globina, como HS4 de frango.
[00107] Exemplos não limitativos de vetores lentivirais incluem pLVX-EF1alpha-AcGFP1-C1 (Catálogo Clontech número 631984), pLVX-EF1alpha-IRES-mCherry (Catálogo Clontech número 631987), pLVX- Puro (Catálogo Clontech número 632159), pLVX-IRES- Puro (Catálogo Clontech número 632186), pLenti6/V5-DESTTM (Thermo Fisher), pLenti6.2/V5-DESTTM (Thermo Fisher), pLKO.1 (Plasmídeo número 10878 da Addgene), pLKO.3G (Plasmídeo número 14748 da Addgene), pSico (Plasmídeo número 11578 da Addgene), pLJM1-EGFP (Plasmídeo número 19319 da Addgene), FUGW (Plasmídeo número 14883 da Addgene), pLVTHM (Plasmídeo número 12247 da Addgene), pLVUT-tTR-KRAB (Plasmídeo número 11651 da Addgene), pLL3.7 (Plasmídeo número 11795 da Addgene), pLB (Plasmídeo número 11619 da Addgene), pWPXL (Plasmídeo número 12257 da Addgene), pWPI (Plasmídeo número 12254 da Addgene), EF.CMV.RFP (Plasmídeo número 17619 da Addgene), pLenti CMV Puro DEST (Plasmídeo número 17452 da Addgene), pLenti-puro (Plasmídeo número 39481 da Addgene), pULTRA (Plasmídeo número 24129 da Addgene), pLX301 (Plasmídeo número 25895 da Addgene), pHIV-EGFP (Plasmídeo número 21373 da Addgene), pLV-mCherry (Plasmídeo número 36084 da Addgene), pLionII (Plasmídeo número 1730 da Addgene), pInducer10-mir-RUP-PheS (Plasmídeo número 44011 da Addgene). Esses vetores podem ser modificados para serem adequados para uso terapêutico. Por exemplo, um marcador de seleção (por exemplo, puro, EGFP ou mCherry) pode ser excluído ou substituído por um segundo gene exógeno de interesse. Outros exemplos de vetores lentivirais são divulgados nas patentes US Nos. 7.629.153,
7.198.950, 8.329.462, 6.863.884, 6.682.907, 7.745.179, 7.250.299, 5.994.136,
6.287.814, 6.013.516, 6.797.512, 6.544.771, 5.834.256, 6.958.226, 6.207.455,
6.531.123, e 6.352.694 e Publicação PCT No. WO2017/091786.
VETORES ADENOVIRAIS
[00108] Em certas modalidades, o vetor viral pode ser um vetor adenoviral. Os adenovírus são vírus icosaédricos de tamanho médio (90 a 100 nm), não envelopados (nus) compostos por um nucleocapsídeo e um genoma de DNA linear de fita dupla. O termo "adenovírus" refere-se a qualquer vírus do gênero Adenoviridiae incluindo, mas não se limitando a, subgêneros de adenovírus humano, bovino, ovino, equino, canino, porcino, murino e símio. Normalmente, um vetor adenoviral é gerado pela introdução de uma ou mais mutações (por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição) no genoma adenoviral do adenovírus de modo a acomodar a inserção de uma sequência de ácido nucleico não nativa, por exemplo, para transferência de genes, para o adenovírus.
[00109] Um adenovírus humano pode ser usado como a fonte do genoma adenoviral para o vetor adenoviral. Por exemplo, um adenovírus pode ser do subgrupo A (por exemplo, sorotipos 12, 18 e 31), subgrupo B (por exemplo, sorotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50), subgrupo C (por exemplo, sorotipos 1, 2, 5 e 6), subgrupo D (por exemplo, sorotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22 a 30, 32, 33, 36 a 39, e 42 a 48), subgrupo E (por exemplo, sorotipo 4), subgrupo F (por exemplo, sorotipos 40 e 41), um sorogrupo não classificado (por exemplo, sorotipos 49 e 51) ou qualquer outro sorogrupo ou sorotipo adenoviral. Os sorotipos adenovirais 1 a 51 estão disponíveis junto à American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). São divulgados vetores adenovirais não pertencentes ao grupo C, métodos de produção de vetores adenovirais não pertencentes ao grupo C e métodos de uso de vetores adenovirais não pertencentes ao grupo C, por exemplo, nas Patentes US 5.801, 030, 5.837.511 e 5.849.561 e na Publicação PCT Nos. WO1997/012986 e WO1998/053087.
[00110] Adenovírus não humanos (por exemplo, adenovírus de macaco, símio, aviário, canino, ovino ou bovino) podem ser usados para gerar o vetor adenoviral (ou seja, como uma fonte do genoma adenoviral para o vetor adenoviral). Por exemplo, o vetor adenoviral pode ser baseado em um adenovírus símio, incluindo macacos do novo e do velho mundo (ver, por exemplo, Virus Taxonomy: VHIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2005)). Uma análise de filogenia de adenovírus que infectam primatas é divulgada em, por exemplo, Roy et al. (2009) PLOS PATHOG. 5(7): e1000503. Um adenovírus de gorila pode ser usado como fonte do genoma adenoviral para o vetor adenoviral. Os adenovírus e vetores adenovirais de gorila são descritos, por exemplo, nas Publicações PCT Nos. WO2013/052799, WO2013/052811 e WO2013/052832. O vetor adenoviral também pode compreender uma combinação de subtipos e, portanto, ser um vetor adenoviral "quimérico".
[00111] O vetor adenoviral pode ser competente para replicação, competente para replicação condicionalmente ou deficiente para replicação. Um vetor adenoviral competente para replicação pode se replicar em células hospedeiras típicas, isto é, células tipicamente capazes de serem infectadas por um adenovírus. Um vetor adenoviral de replicação condicional é um vetor adenoviral que foi projetado para se replicar sob condições predeterminadas. Por exemplo, funções de gene essenciais para replicação, por exemplo, funções de gene codificadas pelas regiões iniciais adenovirais, podem ser operativamente ligadas a uma sequência de controle de transcrição induzível, repressível ou específica de tecido, por exemplo, um promotor. Os vetores adenovirais de replicação condicional são ainda descritos na Patente US No. 5.998.205. Um vetor adenoviral deficiente para replicação é um vetor adenoviral que requer a complementação de uma ou mais funções gênicas ou regiões do genoma adenoviral que são necessárias para a replicação, como resultado de, por exemplo, uma deficiência em uma ou mais funções gênicas essenciais para a replicação ou regiões, de modo que o vetor adenoviral não se replique em células hospedeiras típicas, especialmente aquelas a serem infectadas em um ser humano pelo vetor adenoviral.
[00112] Em algumas modalidades, o vetor adenoviral é deficiente para replicação, de modo que o vetor adenoviral deficiente para replicação requer a complementação de pelo menos uma função do gene essencial para replicação de uma ou mais regiões do genoma adenoviral para propagação (por exemplo, para formar partículas de vetor adenoviral). O vetor adenoviral pode ser deficiente em uma ou mais funções do gene essencial para a replicação apenas das regiões iniciais (ou seja, regiões E1 a E4) do genoma adenoviral, apenas as regiões tardias (ou seja, regiões L1 a L5) do genoma adenoviral, ambas as regiões iniciais e finais do genoma adenoviral ou todos os genes adenovirais (ou seja, um adenovetor de alta capacidade (HC-Ad)). Ver, por exemplo, Morsy et al. (1998) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 95: 965 a 976, Chen et al. (1997) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 94: 1.645 a 1.650 e Kochanek et al. (1999) ZUMBIR. GENE THER. 10(15): 2.451 a 2.459. Exemplos de vetores adenovirais deficientes para replicação são divulgados nas Patentes US Nos.
5.837.511, 5.851.806, 5.994.106, 6.127.175, 6.482.616 e 7.195.896 e Publicações PCT Nos. WO1994/028152, WO1995/002697, WO1995/016772, WO1995/034671, WO1996/022378, WO1997/012986, WO1997/021826 e WO2003/022311.
[00113] O vetor adenoviral deficiente para replicação descrito neste documento pode ser produzido em linhas celulares complementares que fornecem funções gênicas não presentes no vetor adenoviral deficiente para replicação, mas necessárias para a propagação viral, em níveis apropriados, a fim de gerar concentrações elevadas de estoque de vetor viral. Essas linhas de células complementares são conhecidas e incluem,
mas não estão limitadas a, células 293 (descritas em, por exemplo, Graham et al. (1977) J. GEN. VIROL. 36: 59 a 72), células PER.C6 (descritas em, por exemplo, Publicação PCT No. WO1997/000326 e Patentes US Nos. 5.994.128 e 6.033.908), e células 293-ORF6 (descritas em, por exemplo, Publicação PCT No. WO1995/034671 e Brough et al. (1997) J. VIROL. 71: 9.206 a 9.213). Outros exemplos de linhas celulares complementares para produzir o vetor adenoviral deficiente para replicação incluem células complementares que foram geradas para propagar vetores adenovirais que codificam transgenes cuja expressão inibe o crescimento viral em células hospedeiras (ver, por exemplo, Publicação de Patente US 2008/0233650). Exemplos adicionais de células complementares são descritos nas Patentes US Nos. 6.677.156 e 6.682.929, e na Publicação PCT No. WO2003/020879. As formulações para composições contendo vetores adenovirais são ainda descritas, por exemplo, nas Patentes US Nos. 6.225.289 e 6.514.943 e na Publicação PCT No. WO2000/034444.
[00114] Exemplos adicionais de vetores adenovirais e/ou métodos para produzir ou propagar vetores adenovirais são descritos nas Patentes US Nos. 5.559.099, 5.837.511, 5.846.782, 5.851.806, 5.994.106,
5.994.128, 5.965.541, 5.981.225, 6.040.174, 6.020.191, 6.083.716, 6.113.913,
6.303.362, 7.067.310 e 9.073.980.
[00115] Os sistemas de vetor adenoviral comercialmente dispon veis incluem o ViraPower Adenoviral E pression System disponível junto à Thermo Fisher Scientific, o sistema de vetor adenoviral AdEas dispon vel junto Agilent Technologies e o Adeno-X E pression System 3 disponível junto à Takara Bio USA, Inc.
OUTROS VETORES VIRAIS
[00116] Em certas modalidades, o vetor viral pode ser um vetor plasmídeo do vírus Herpes Simplex. O vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) foi demonstrado como um sistema de vetor de entrega de genes potencialmente útil para terapia genética. Os vetores HSV-1 têm sido usados para a transferência de genes para o músculo e têm sido usados para o tratamento de tumores cerebrais murinos. Os vetores minivirais dependentes de vírus auxiliares foram desenvolvidos para uma operação mais fácil e para capacidade de inserção maior (até 140 kb). Os amplicons de HSV incompetentes para replicação foram construídos na técnica. Esses amplicons de HSV contêm grandes deleções do genoma do HSV para fornecer espaço para a inserção de DNA exógeno. Normalmente, eles compreendem o local de empacotamento do HSV-1, o local de replicação do HSV-1 "ori S" e a sequência do promotor IE 4/5. Esses vírions são dependentes de um vírus auxiliar para a propagação.
PRODUÇÃO DE VETORES VIRAIS
[00117] Os métodos para a produção de vetores virais são conhecidos na técnica.Normalmente, um vírus divulgado é produzido em uma linha de células hospedeiras adequadas usando técnicas convencionais, incluindo a cultura de uma célula hospedeira transfectada ou infectada em condições adequadas de modo a permitir a produção de partículas virais infecciosas. Os ácidos nucleicos que codificam genes virais e/ou tRNAs podem ser incorporados em plasmídeos e introduzidos em células hospedeiras através de técnicas convencionais de transfecção ou transformação. Exemplos de células hospedeiras para a produção de vírus divulgados incluem linhas de células humanas, tais como células HeLa, Hela-S3, HEK293, 911, A549, HER96 ou PER-C6. As condições específicas de produção e purificação irão variar dependendo do vírus e do sistema de produção empregado.
[00118] Em certas modalidades, as células produtoras podem ser administradas diretamente a um sujeito, no entanto, em outras modalidades, após a produção, as partículas virais infecciosas são recuperadas da cultura e opcionalmente purificadas. As etapas de purificação típicas podem incluir purificação de placa, centrifugação, por exemplo, centrifugação em gradiente de cloreto de césio, clarificação, tratamento enzimático, por exemplo, tratamento com benzonase ou protease, etapas cromatográficas, por exemplo, cromatografia de troca iônica ou etapas de filtração.
IV. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00119] Para uso terapêutico, um tRNA e/ou vetor de expressão pode ser combinado com um transportador farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, refere- se aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico razoável, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivas ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação risco/benefício razoável.
[00120] O termo "transportador farmaceuticamente aceit vel , como utili ado no presente documento, refere-se a tampões, transportadores e excipientes adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessiva ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício/risco. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer um dos transportadores farmacêuticos padrão, como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, como emulsões de óleo/água ou água/óleo) e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes. Para exemplos de transportadores, estabilizadores e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes, que são compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.
[00121] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação,
adsorção ou penetração da composição. Em tais modalidades, os materiais de formulação incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta- ciclodextrina); cargas; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, cloro- hexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umectantes (tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de aumento da estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes de aumento da tonicidade (tais como halogenetos de metal alcalino, preferencialmente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de entrega; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (Ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (Mack Publishing Company, 1990).
[00122] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode conter nanopartículas, por exemplo, nanopartículas poliméricas, lipossomas ou micelas (ver Anselmo et al. (2016) BIOENG. TRANSL. MED. 1: 10 A 29). Em certas modalidades, a composição não compreende uma nanopartícula ou um composto de entrega de aminolipídeo, por exemplo,
conforme descrito na Publicação de Patente US No 2017/0354672. Em certas modalidades, o tRNA ou vetor de expressão introduzido na célula ou administrado ao sujeito não é conjugado ou associado a outra porção química, por exemplo, uma partícula transportadora, por exemplo, uma partícula aminolipídica. Conforme usado neste documento, o termo "conjugado", quando usado em relação a duas ou mais porções químicas, significa que as porções químicas estão fisicamente associadas ou conectadas entre si, seja diretamente ou por meio de uma ou mais porções químicas adicionais que servem como um agente de ligação, para formar uma estrutura que seja suficientemente estável para que as porções químicas permaneçam fisicamente associadas nas condições em que a estrutura é usada, por exemplo, condições fisiológicas. Normalmente, as porções químicas são ligadas por uma ou mais ligações covalentes ou por um mecanismo que envolve uma ligação específica. Alternativamente, um número suficiente de interações mais fracas pode fornecer estabilidade suficiente para que as porções químicas permaneçam fisicamente associadas.
[00123] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode conter uma formulação de entrega sustentada ou controlada. As técnicas para formular meios de entrega sustentada ou controlada, tais como transportadores de lipossomas, micropartículas bioerodíveis ou microesferas porosas e injeções de depósito, também são conhecidas pelos versados na técnica. As preparações de liberação sustentada podem incluir, por exemplo, micropartículas poliméricas porosas ou matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil- inetacrilato), etileno acetato de vinila ou ácido poli-D( )-3-hidroxibutírico. As composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica.
[00124] As composições farmacêuticas que contêm um tRNA e/ou vetor de expressão divulgados no presente documento podem ser apresentados em uma forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas por qualquer método adequado. Uma composição farmacêutica pode ser formulada para ser compatível com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração são a administração intravenosa (IV), intradérmica, inalatória, transdérmica, tópica, transmucosa, intratecal e retal. Em certas modalidades, um tRNA e/ou vetor de expressão é administrado por via intratecal. Em certas modalidades, um tRNA e/ou vetor de expressão é administrado por injeção. As formulações podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica farmacêutica. Por exemplo, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (Mack Publishing Company, 1990). Os componentes da formulação para administração parenteral incluem um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como EDTA; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose.
[00125] Para administração intravenosa, os veículos incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). O transportador pode ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra micro-organismos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido) e suas misturas adequadas.
[00126] Em geral, qualquer método de entrega de uma molécula de ácido nucleico pode ser adaptado para uso com um tRNA (ver, por exemplo, Akhtar et al. (1992) TRENDS CELL. BIOL. 2(5): 139 a 144 e Publicação PCT No WO94/02595). O tRNA pode ser modificado ou alternativamente entregue usando um sistema de entrega de fármacos para prevenir a rápida degradação do tRNA por endo e exonucleases in vivo.
As moléculas de tRNA podem ser modificadas por conjugação química a grupos lipofílicos, como o colesterol, para aumentar a absorção celular e prevenir a degradação.
As moléculas de tRNA também podem ser conjugadas ou de outra forma associadas a um aptâmero.
Um tRNA também pode ser entregue usando sistemas de entrega de fármacos, como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomas ou um sistema de entrega catiônica.
Os sistemas de entrega catiônica carregados positivamente facilitam a ligação de uma molécula de tRNA (carregada negativamente) e também aumentam as interações na membrana celular carregada negativamente para permitir a absorção eficiente de um tRNA pela célula.
Lipídeos catiônicos, dendrímeros ou polímeros podem ser ligados ao RNA, por exemplo, tRNA, ou induzidos a formar uma vesícula ou micela (ver, por exemplo, Kim et al. (2008) JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE 129(2): 107 a 116) que envolve o RNA.
Métodos para fazer e administrar complexos de RNA catiônico incluem-se nas habilidades de um versado na técnica (ver, por exemplo, Sorensen et al. (2003) J.
MOL.
BIOL 327: 761 a 766; Verma et al. (2003) CLIN.
CANCER RES. 9: 1.291 1.300; Arnold et al. (2007) J.
HYPERTENS. 25: 197 a 205). Alguns exemplos não limitativos de sistemas de entrega de fármacos úteis para entrega sistêmica de RNAs, por exemplo, tRNAs incluem DOTAP (Sorensen et al. (2003) supra; Verma et al. (2003), supra), Oligofectamina, partículas sólidas de lipídios de ácido nucleico (Zimmermann et al. (2006) NATURE 441:111 a 114), cardiolipina (Chien et al. (2005) CANCER GENE THER. 12: 321 a 328; Pal et al. (2005) INT J.
ONCOL. 26: 1.087 a 1.091), polietilenoimina (Bonnet et al. (2008) PHARM.
RES. 25(12): 2.972 a 2.982; Aigner (2006) J.
BIOMED.
BIOTECHNOL. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu (2006) MOL.
PHARM. 3: 472 a 487), e poliamidoaminas (Tomalia et al. (2007) BIOCHEM.
SOC.
TRANS. 35: 61 a 67; Yoo et al. (1999) PHARM.
RES. 16: 1.799 a 1.804). Em certas modalidades, um tRNA forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica.
Métodos para administração e composições farmacêuticas de RNAs e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente US No. 7.427.605.
[00127] As formulações farmacêuticas são preferencialmente estéreis. A esterilização pode ser realizada por qualquer método adequado, por exemplo, filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização por filtro pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição.
[00128] As composições descritas neste documento podem ser administradas local ou sistemicamente. A administração geralmente será a administração parenteral. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via subcutânea e, em uma modalidade, ainda mais preferida por via intravenosa. As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis.
[00129] Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de componente ativo, por exemplo, um tRNA e/ou vetor de expressão, está na faixa de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por exemplo, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg. Em certas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão viral está na faixa de 10 2 a 1015 unidades formadoras de placas (pfus), por exemplo, 10 2 a 1010, 102 a 105, 105 a 1015, 105 a 1010 ou 1010 a 1015 unidades formadoras de placas. A quantidade administrada dependerá de variáveis como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, a saúde geral do paciente, a potência in vivo do anticorpo, a formulação farmacêutica e a via de administração. A dosagem inicial pode ser aumentada além do nível superior para atingir rapidamente o nível sanguíneo ou nível de tecido desejado. Alternativamente, a dosagem inicial pode ser menor do que a ideal e a dosagem diária pode ser aumentada progressivamente durante o curso do tratamento. A dosagem humana pode ser otimizada, por exemplo, em um estudo convencional de escalonamento de dose de Fase I projetado para variar de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A frequência da dosagem pode variar, dependendo de fatores como via de administração, quantidade de dosagem, meia-vida sérica e doença a ser tratada. Exemplos de frequências de dosagem são uma vez por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. Um exemplo de uma via de administração é parenteral, por exemplo, infusão intravenosa.
V. USOS TERAPÊUTICOS
[00130] As composições e métodos divulgados neste documento podem ser usados para tratar um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito. Tal como utilizado neste documento, o termo distúrbio de haploinsuficiência refere-se a um distúrbio que é mediado, intensificado ou de outra forma facilitado por ou associado a uma haploinsuficiência, ou seja, uma condição em que um sujeito diploide tem apenas uma única cópia funcional de um gene e a única cópia funcional do gene não produz um produto gênico suficiente (por exemplo, uma proteína) para o funcionamento adequado do gene. Tal como utilizado neste documento, um gene haploinsuficiente refere-se a um gene que requer ambos os alelos para o funcionamento adequado do gene. Exemplos de distúrbios de haploinsuficiência incluem síndrome 5q, síndrome de Adams-Oliver 1, síndrome de Adams-Oliver 3, síndrome de Adams-Oliver 5, síndrome de Adams-Oliver 6, síndrome de Alagille 1, síndrome linfoproliferativa autoimune tipo IA, síndrome linfoproliferativa autoimune tipo V, surdez autossômica dominante-2A, malformações cerebrais com ou sem defeitos do trato urinário (BRMUTD), complexo de Carney tipo 1, síndrome CHARGE, displasia cleidocraniana, síndrome de Currarino, síndrome de Denys- Drash/síndrome de Frasier, atraso no desenvolvimento, deficiência intelectual, obesidade e características dismórficas (DIDOD), síndrome de DiGeorge (associada a TBX1), síndrome de Dravet, síndrome do raio Duane-radial, síndrome de Ehlers-Danlos (tipo clássico), síndrome de Ehlers-Danlos (tipo vascular), síndrome de Feingold 1, degeneração lobar frontotemporal com inclusões de TDP43 (FTLD-TDP), síndrome de deficiência de GLUT1 relacionada a GRN, síndrome de Greig cefalopolissindactilia, Telangiectasia hemorrágica hereditária tipo 1, Holoprosencefalia 3, Holoprosencefalia 4, Holoprosencefalia 5, síndrome de Holt-Oram, Hipoparatireoidismo, surdez neurossensorial e doença renal (HDR), síndrome de Kleefstra 1, síndrome de Klippel-Trenaunay (relacionada a AAGF), discondrose de Leri-Weillental, síndrome de retardo mental de Marfan e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos (MRFACD), retardo mental autossômico dominante 1, retardo mental autossômico dominante 19, retardo mental autossômico dominante 29, síndrome de unha-patela (NPS), síndrome de Phelan-McDermid, síndrome de Pitt-Hopkins, hipertensão pulmonar primária 1, síndrome de Rett (variante congênita), síndrome de Smith-Magenis (associada a RAI1), síndrome de Sotos 1, síndrome de Sotos 2, síndrome de Stickler tipo I, estenose aórtica supravalvar, deficiência intelectual relacionada a SYNGAP1, síndrome de Treacher Collins, Síndrome tricorrinofalangeana tipo I, síndrome ulnar-mamária, síndrome de van der Woude 1, síndrome de Waardenburg tipo 1, síndrome de Waardenburg tipo 2A e síndrome de Waardenburg tipo 4C. Exemplos de distúrbios de haploinsuficiência, incluindo os genes haploinsuficientes associados, são descritos na TABELA 1 e TABELA 2.
[00131] Esta divulgação fornece um método de tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito em necessidade do mesmo. O método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um tRNA e/ou vetor de expressão, por exemplo, um tRNA e/ou vetor de expressão divulgado neste documento, sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico para tratar o distúrbio de haploinsuficiência no sujeito.
[00132] Em certas modalidades, em que o distúrbio de haploinsuficiência é a síndrome de Dravet, o método reduz a frequência das convulsões, a gravidade das convulsões e/ou o comprometimento cognitivo no sujeito. Por exemplo, em certas modalidades, o método reduz a frequência de convulsões no sujeito em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% durante o período de, por exemplo, um dia, uma semana ou um mês. Em certas modalidades, o método reduz a frequência de convulsões em 50% ao longo do período de, por exemplo, um dia, uma semana ou um mês.
[00133] O termo "quantidade eficaz", tal como utilizado no presente documento, refere-se à quantidade de um agente ativo (por exemplo, polipeptídeo recombinante e/ou proteína multimérica) suficiente para efetuar os resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada a uma formulação ou via de administração particular.
[00134] Tal como utili ado neste documento, tratar , que trata e tratamento significam o tratamento de uma doen a em um sujeito, por exemplo, em um ser humano. Isso inclui: (a) inibir a doença, ou seja, interromper seu desenvolvimento; e (b) aliviar a doença, ou seja, causar a regressão do estado da doença. Conforme usado neste documento, os termos "sujeito" e "paciente" referem-se a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos neste documento. Tais organismos incluem preferencialmente, mas não estão limitados a, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e semelhantes) e, mais preferencialmente, incluem humanos.
[00135] Os métodos e composições aqui descritos podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes e/ou modalidades terapêuticas. O termo administrado "em combinação", tal como utilizado neste documento, é entendido como significando que dois (ou mais) tratamentos diferentes são entregues ao sujeito durante o curso da aflição do sujeito com o distúrbio, de modo que os efeitos dos tratamentos no paciente se sobreponham em um determinado momento. Em certas modalidades, a entrega de um tratamento ainda está ocorrendo quando a entrega do segundo começa, de modo que há sobreposição em termos de administração. Isso às vezes é referido neste documento como "entrega simult nea ou concomitante . Em outras modalidades, a entrega de um tratamento termina antes do início da entrega do outro tratamento. Em certas modalidades de ambos os casos, o tratamento é mais eficaz por causa da administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, um efeito equivalente é visto com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz os sintomas em maior extensão do que seria visto se o segundo tratamento fosse administrado na ausência do primeiro tratamento, ou situação análoga é observada com o primeiro tratamento. Em certas modalidades, a entrega é tal que a redução em um sintoma ou outro parâmetro relacionado ao distúrbio é maior do que o que seria observado com um tratamento entregue na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou mais que aditivo. A entrega pode ser tal que um efeito do primeiro tratamento entregue ainda seja detectável quando o segundo é entregue.
[00136] Em certas modalidades, um método ou composição descrito neste documento é administrado em combinação com uma ou mais terapias adicionais, por exemplo, DIACOMIT® (estiripentol), EPIODOLEX® (canabidiol), uma dieta cetogênica, ONFI ® (clobazam), TOPAMAX® (topiramato) ou ácido valproico. Por exemplo, durante o tratamento da Síndrome de Dravet, um método ou composição descrito neste documento é administrado em combinação com uma ou mais terapias adicionais, por exemplo, DIACOMIT® (estiripentol), EPIODOLEX® (canabidiol), uma dieta cetogênica, ONFI® (clobazam), TOPAMAX® (topiramato) ou ácido valproico.
[00137] Ao longo do relatório descritivo, onde as composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, ou onde os processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é contemplado que, adicionalmente, existem composições da presente invenção que consistem essencialmente em, ou consistem em, os componentes recitados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente em, ou consistem em, as etapas de processamento recitadas.
[00138] No pedido, onde um elemento ou componente é dito incluído e/ou selecionado de uma lista de elementos ou componentes recitados, deve ser entendido que o elemento ou componente pode ser qualquer um dos elementos ou componentes recitados, ou o elemento ou componente pode ser selecionado a partir de um grupo que consiste em dois ou mais dos elementos ou componentes recitados.
[00139] Além disso, deve ser entendido que os elementos e/ou características de uma composição ou um método descrito neste documento podem ser combinados de uma variedade de maneiras sem se afastar do espírito e do escopo da presente invenção, seja explícito ou implícito neste documento. Por exemplo, onde é feita referência a um composto específico, esse composto pode ser usado em várias modalidades de composições da presente invenção e/ou em métodos da presente invenção, a menos que seja entendido de outra forma a partir do contexto. Em outras palavras, dentro deste pedido, as modalidades foram descritas e representadas de uma forma que permite que um pedido claro e conciso seja escrito e desenhado, mas pretende-se e será apreciado que as modalidades podem ser combinadas ou separadas de várias maneiras, sem se separar do presentes ensinamentos e invenção (ou invenções). Por exemplo, será apreciado que todos os recursos descritos e representados neste documento podem ser aplicáveis a todos os aspectos da invenção descrita e representada (ou das invenções descritas e representadas) neste documento.
[00140] Deve ser entendido que a expressão "pelo menos um de" inclui individualmente cada um dos objetos recitados após a expressão e as várias combinações de dois ou mais dos objetos recitados, a menos que seja entendido de outra forma a partir do contexto e uso. A expressão "e/ou" em conexão com três ou mais objetos recitados deve ser entendida como tendo o mesmo significado, a menos que seja entendida de outra forma a partir do contexto.
[00141] O uso do termo incluem", "inclui", que inclui", t m", "tem", que tem", cont m", "cont m" ou que cont m", incluindo seus equivalentes gramaticais, deve ser entendido geralmente como aberto e não limitante, por exemplo, não excluindo elementos ou etapas adicionais não recitadas, a menos que de outra forma especificamente declarada ou entendida a partir do contexto.
[00142] Onde o uso do termo "cerca de" é anterior a um valor quantitativo, a presente invenção também inclui o próprio valor quantitativo específico, a menos que especificamente indicado de outra forma. Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" se refere a uma variação de ± 10% do valor nominal, a menos que indicado ou inferido de outra forma.
[00143] Deve ser entendido que a ordem das etapas ou ordem para realizar certas ações é imaterial, desde que a presente invenção permaneça operável. Além disso, duas ou mais etapas ou ações podem ser realizadas simultaneamente.
[00144] O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem e emplar neste documento, por e emplo, "tal como" ou que inclui", destina-se apenas a ilustrar melhor a presente invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que de outra forma reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.
EXEMPLOS
[00145] Os exemplos seguintes são meramente ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito ou conteúdo da invenção de forma alguma.
EXEMPLO 1 - EXPRESSÃO DE tRNA PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE TRANSCRITO DE SCN1A DO TIPO SELVAGEM
[00146] Neste exemplo, os códons menos ideais e mais sobrerrepresentados em SCN1A foram determinados. Expressão dos tRNAs cognatos para esses códons pode aumentar a expressão de SCN1A e tratar a síndrome de Dravet.
[00147] Primeiro, a porcentagem de uso de códon para cada códon no gene SCN1A foi determinada. Em seguida, a otimização para cada códon no gene SCN1A foi determinada usando o índice adaptativo tRNA (tAI). tAI é uma estimativa da eficiência de tradução para cada códon que leva em consideração estimativas de concentração celular de tRNA (com base nos números de cópias do gene tRNA) e eficiências de decodificação, com um valor de tAI mais alto indicando um códon mais ideal. O tAI é descrito, por exemplo, em dos Reis et al. (2004) NUCLEIC ACIDS RES. 32(17): 5.036 a 5.044 e Mahlab et al. (2014) PLOS COMPUT. BIOL. 10(1): e1003294. Para os cálculos neste exemplo, foi usado um valor de tAI modificado que é baseado em uma quantificação direta dos níveis de tRNA em células HEK293 (conforme fornecido em Zheng et al. (2015) NAT. METHODS 12(9): 835 a 837) no lugar de estimativas baseadas no número de cópias do gene tRNA.
[00148] O valor de uso do códon percentual foi multiplicado pelo inverso do valor de tAI para gerar uma pontuação para cada códon no gene SCN1A. Um resumo dos resultados é mostrado na TABELA 3. Geralmente, os códons com as pontuações mais altas são os menos ideais e mais enriquecidos em SCN1A em relação ao transcriptoma, e tRNAs cognatos para esses códons são os melhores candidatos para aumentar a expressão de SCN1A.
TABELA 3
EXEMPLO 2 - EXPRESSÃO DE tRNA PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE TRANSCRITO DE SCN1A DE TIPO SELVAGEM
[00149] Neste exemplo, foi avaliada a capacidade de entrega ectópica de RNAs de transferência (tRNAs) selecionados para aumentar a expressão de SCN1A de tipo selvagem em células em cultura.
[00150] ATA (Ile), GTA (Val) e AGA (Arg) foram selecionados como códons não ideais exemplares no gene SCN1A. Uma sequência de nucleotídeos que codifica um tRNA ATA (tRNA ATA) é descrita na SEQ ID NO: 1, uma sequência de nucleotídeos que codifica um tRNA GTA (tRNAGTA) é descrita na SEQ ID NO: 2 e uma sequência de nucleotídeos que codifica um tRNA AGA (tRNAAGA) é descrita na SEQ ID NO: 3,
[00151] A fase de leitura aberta de SCN1A foi amplificada por RT-PCR a partir de RNA de cérebro humano (Clontech) usando iniciadores que contêm um local de KpnI no iniciador direto e um local de NotI no iniciador reverso. ORF SCN1A foi então clonado entre o promotor e o local de SV40 poli(A) de pTRE-Tight (Clontech) usando os locais KpnI e NotI.
[00152] As sequências dos genes tRNAATA, tRNAGTA e tRNAAGA (incluindo a sequência de codificação de tRNA juntamente com 200 pares de bases (bp) da sequência de DNA genômico flanqueadora) foram ordenados como gBlocks (IDT) com um local XhoI na e tremidade 5 e um local PciI na extremidade 3 . A sequência do gene tRNAATA (incluindo a sequência codificadora do tRNA juntamente com 200 pb da sequência de DNA genômico flanqueadora) está representada na SEQ ID NO: 6, a sequência do gene tRNAGTA (incluindo a sequência codificadora do tRNA junto com 200 pb da sequência de DNA genômico flanqueadora) é representada na SEQ ID NO: 7, e a sequência do gene tRNAAGA (incluindo a sequência codificadora do tRNA juntamente com 200 pares de bases (pb) da sequência de DNA genômico flanqueadora) é representada na SEQ ID NO: 8.
[00153] Todas as sequências do gene tRNA foram clonadas individualmente em pTRE-Tight (Clontech) usando os locais XhoI e
PciI, de modo que apenas o gene de resistência à ampicilina e a origem Col E1 foram deixados de pTRE-Tight. Sequências inteiras do gene do tRNA foram confirmadas por sequenciamento.
[00154] As células HEK293 foram cultivadas em DMEM com FBS a 10% a 300.000 células por poço de uma placa de 6 poços. 24 horas depois, cada poço sofreu transfecção simulada (sem DNA) ou transfecção com 100 ng de plasmídeo de SCN1A e 0, 100, 200 ou 300 ng de cada tRNA usando 1, 4, 7 ou 10 l de Enhancer e 10 l de Effectene (Qiagen). As células transfectadas foram incubadas durante 24 horas, depois colhidas diretamente para Trizol (ThermoFisher) para preparação de RNA total de acordo com o protocolo do fabricante. 2 g de RNA total de cada condi o foram ent o tratados com 4 U de Turbo DNase (ThermoFisher) e limpos por precipitação com 2,5 M de cloreto de lítio. O cDNA foi preparado a partir de 300 ng de RNA tratado com DNase em um volume de rea o total de 10 l usando SuperScript III First Strand Synthesis Supermix e iniciadores aleatórios (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante. qPCR foi realizada em um volume de reação total de 10 l usando SYBR Advantage qPCR Premix (Takara), iniciadores para SCN1A e GAPDH, e um vigésimo de cDNA por reação em um Step One Real Time PCR System (Applied Biosystems).
[00155] Conforme mostrado na FIGURA 3, em uma faixa de doses, a expressão de tRNA ectópica teve efeito mínimo em um transcrito endógeno, GAPDH. No entanto, a expressão de tRNA ectópica resultou em um aumento aproximadamente linear na expressão de SCN1A, até 7 vezes na dose mais alta de tRNAs testados (FIGURA 3). Não foi observada toxicidade para as células, exceto na concentração mais alta de tRNAs.
[00156] Juntos, esses resultados indicam que a expressão de um transcrito de mRNA, por exemplo, um transcrito SCN1A, pode ser aumentado pela expressão ectópica de tRNAs cognatos a códons não ideais dentro desse transcrito.
EXEMPLO 3 - EXPRESSÃO DE tRNA PARA AUMENTAR
A EXPRESSÃO DE GENES HAPLOINSUFICIENTES
[00157] Neste exemplo, foram determinados os códons menos ideais e mais sobrerrepresentados em uma variedade de genes associados a distúrbios haploinsuficientes. Expressão dos tRNAs cognatos para esses códons pode aumentar a expressão gênica e tratar o distúrbio haploinsuficiente.
[00158] Conforme descrito no Exemplo 1, a porcentagem de uso de códon para cada códon no gene foi determinada. Em seguida, a otimização para cada códon no gene foi determinada usando o índice adaptativo tRNA (tAI). tAI é uma estimativa da eficiência de tradução para cada códon que leva em consideração estimativas de concentração celular de tRNA (com base nos números de cópias do gene tRNA) e eficiências de decodificação, com um valor de tAI mais alto indicando um códon mais ideal. O tAI é descrito, por exemplo, em dos Reis et al. (2004) NUCLEIC ACIDS RES. 32(17): 5.036 a
5.044 e Mahlab et al. (2014) PLOS COMPUT. BIOL. 10(1): e1003294. O valor de utilização do códon percentual foi multiplicado pelo inverso do valor tAI para gerar uma pontuação para cada códon no gene. Geralmente, os códons com as pontuações mais altas são os menos ideais e mais enriquecidos no gene em relação ao transcriptoma, e tRNAs cognatos para esses códons são os melhores candidatos para aumentar a expressão do gene.
[00159] Os três códons menos ideais e mais superrepresentados nos genes indicados são mostrados na TABELA 4, e os dez códons menos ideais e mais superrepresentados nos genes indicados são mostrados na TABELA 5.
TABELA 4
TABELA 5
[00160] Além disso, os códons menos ideais e mais superrepresentados nos genes indicados foram calculados conforme descrito acima, exceto usando um valor de tAI modificado com base em uma quantificação direta dos níveis de tRNA em células HEK293 (conforme dado em
Zheng et al. (2015) NAT. METHODS 12 (9): 835 a 837) em vez de estimativas dos níveis de tRNA com base no número de cópias do gene tRNA.
[00161] Os três códons menos ideais e mais superrepresentados nos genes indicados são mostrados na TABELA 6, e os dez códons menos ideais e mais superrepresentados nos genes indicados são mostrados na TABELA 7.
TABELA 6
TABELA 7
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00162] Toda a divulgação de cada uma das patentes e documentos científicos referidos neste documento é incorporada por referência para todos os fins.
EQUIVALENTES A invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou de suas características essenciais. As modalidades anteriores devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativos, em vez de limitar a invenção descrita no presente documento. O escopo da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas em vez da descrição anterior, e todas as alterações que vêm dentro do significado e intervalo de equivalência das reivindicações se destinam a ser abrangidas nelas.

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene que contém um primeiro códon não ideal, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende a introdução, na célula, de uma quantidade eficaz de um primeiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do primeiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o primeiro tRNA exógeno.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução, na célula, de uma quantidade eficaz de um segundo tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do segundo tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o segundo tRNA exógeno.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução, na célula, de uma quantidade eficaz de um terceiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a introdução do terceiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o terceiro tRNA exógeno.
4. Método para aumentar a expressão em uma célula de mamífero de um produto gênico codificado por um gene que contém um primeiro códon não ideal, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende a introdução, na célula, de uma quantidade eficaz de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar um primeiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do primeiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o primeiro tRNA exógeno.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o gene contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução, na célula, de uma quantidade eficaz de um segundo vetor de expressão capaz de expressar um segundo tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do segundo tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o segundo tRNA exógeno.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda a introdução, na célula, de uma quantidade eficaz de um terceiro vetor de expressão capaz de expressar um terceiro tRNA exógeno que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, em que a expressão do terceiro tRNA exógeno na célula aumenta a expressão do produto gênico em relação a uma célula semelhante sem o terceiro tRNA exógeno.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão são iguais.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão é um vetor viral.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula humana.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o gene é selecionado a partir de AGGF1,
ARHGAP31, BMPR2, CHD7, COL2A1, COL3A1, CTLA4, CTNNB1, DLL4, EHMT1, ELN, ENG, FAS, FBN1, FOXG1, GATA3, GLI3, GRN, IRF6, JAG1, KCNQ4, LMX1B, MBD5, MED13L, MITF, MNX1, MYCN, NFIA, NFIX, NOTCH1, NSD1, PAX3, PHIP, PRKAR1A, RAI1, RBPJ, RPS14, RUNX2, SALL4, SCN1A, SETBP1, SHANK3, SHH, SHOX, SLC2A1/GLUT1, SOX10, SYNGAP1, TBX1, TBX3, TBX5, TCF4, TCOF1, TGIF1, TNXB, TRPS1, WT1 e ZIC2.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o gene é SCN1A.
13. Método de tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o sujeito tem um gene haploinsuficiente que contém um primeiro códon não ideal, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um primeiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, para tratar, assim, o distúrbio de haploinsuficiência no sujeito.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o gene haploinsuficiente contém um segundo códon não ideal, e o método compreende ainda administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um segundo tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o gene haploinsuficiente contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um terceiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido.
16. Método de tratamento de um distúrbio de haploinsuficiência em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o sujeito tem um gene haploinsuficiente que contém um primeiro códon não ideal, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar um primeiro tRNA que (i)
compreende um anticódon que hibridiza com o primeiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido, para tratar, assim, o distúrbio de haploinsuficiência no sujeito.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o gene haploinsuficiente contém um segundo códon não ideal e o método compreende ainda administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um segundo vetor de expressão capaz de expressar um segundo tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o segundo códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o gene haploinsuficiente contém um terceiro códon não ideal, e o método compreende ainda administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um terceiro vetor de expressão capaz de expressar um terceiro tRNA que (i) compreende um anticódon que hibridiza com o terceiro códon não ideal e (ii) é capaz de ser aminoacilado com um aminoácido.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão são iguais.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão é um vetor viral.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado pelo fato de que o gene haploinsuficiente é selecionado a partir de AGGF1, ARHGAP31, BMPR2, CHD7, COL2A1, COL3A1, CTLA4, CTNNB1, DLL4, EHMT1, ELN, ENG, FAS, FBN1, FOXG1, GATA3, GLI3, GRN, IRF6, JAG1, KCNQ4,
LMX1B, MBD5, MED13L, MITF, MNX1, MYCN, NFIA, NFIX, NOTCH1, NSD1, PAX3, PHIP, PRKAR1A, RAI1, RBPJ, RPS14, RUNX2, SALL4, SCN1A, SETBP1, SHANK3, SHH, SHOX, SLC2A1/GLUT1, SOX10, SYNGAP1, TBX1, TBX3, TBX5, TCF4, TCOF1, TGIF1, TNXB, TRPS1, WT1 e ZIC2.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo fato de que o gene haploinsuficiente é SCN1A.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 24, caracterizado pelo fato de que o distúrbio de haploinsuficiência é selecionado a partir de síndrome 5q, síndrome de Adams-Oliver 1, síndrome de Adams-Oliver 3, síndrome de Adams-Oliver 5, síndrome de Adams-Oliver 6, síndrome de Alagille 1, síndrome linfoproliferativa autoimune tipo IA, síndrome linfoproliferativa autoimune tipo V, surdez autossômica dominante-2A, malformações cerebrais com ou sem defeitos do trato urinário (BRMUTD), complexo de Carney tipo 1, síndrome CHARGE, displasia cleidocraniana, síndrome de Currarino, síndrome de Denys-Drash/síndrome de Frasier, atraso no desenvolvimento, deficiência intelectual, obesidade e características dismórficas (DIDOD), síndrome de DiGeorge (associada a TBX1), síndrome de Dravet, síndrome do raio Duane-radial, síndrome de Ehlers-Danlos (tipo clássica), síndrome de Ehlers-Danlos (tipo vascular), síndrome de Feingold 1, degeneração lobar frontotemporal com inclusões de TDP43 (FTLD-TDP), relacionada a GRN, síndrome de deficiência de GLUT1, síndrome de cefalopolissindactilia de Greig, telangiectasia hemorrágica hereditária tipo 1, holoprosencefalia 3, holoprosencefalia 4, holoprosencefalia 5, síndrome de Holt-Oram, hipoparatireoidismo, surdez neurossensorial e doença renal (HDR), síndrome de Kleefstra 1, síndrome de Klippel- Trenaunay (relacionado a AAGF), discondrosteose de Leri-Weill, síndrome de Marfan, retardo mental e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos (MRFACD), retardo mental, autossômico dominante 1, retardo mental, autossômico dominante 19, retardo mental, autossômico dominante 29, síndrome unha-patela (NPS), síndrome de Phelan-McDermid, síndrome de Pitt-Hopkins, hipertensão pulmonar primária 1, síndrome de Rett (variante congênita), síndrome de Smith- Magenis (associada a RAI1), síndrome de Sotos 1, síndrome de Sotos 2, síndrome de
Stickler tipo I, estenose aórtica supravalvar, deficiência intelectual relacionada a SYNGAP1, síndrome de Treacher Collins, síndrome tricorrinofalângica tipo I, síndrome ulnar-mamária, síndrome de van der Woude 1, síndrome de Waardenburg tipo 1, síndrome de Waardenburg tipo 2A e síndrome de Waardenburg tipo 4C.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 25, caracterizado pelo fato de que o distúrbio de haploinsuficiência é a síndrome de Dravet.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de estiripentol, canabidiol, uma dieta cetogênica, clobazam, topiramato ou ácido valproico ao sujeito.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro códon não ideal é selecionado a partir de ATA, GTA e AGA.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro tRNA é selecionado a partir de um tRNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12 ou 16 a 29, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.
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