JP2024517809A

JP2024517809A - 未成熟終止コドン媒介障害を処置するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2024517809A
Application number: JP2023567899A
Authority: JP
Inventors: ピーターエム．エイモン; ショーンマクファーランド
Original assignee: テバードバイオサイエンシズインコーポレイテッド
Priority date: 2021-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2024-04-23
Also published as: AU2022269633A9; CN117693586A; CA3217460A1; BR112023022805A2; KR20240025507A; EP4334450A1; AU2022269633A1; WO2022235861A1

Abstract

本発明は、概して、第1、第2、および／または第3の修飾されたtRNAを含む発現ベクターおよび薬学的組成物に関連し、かつ、未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させるための、および／または未成熟終止コドンにより媒介される障害、例えばドラベ症候群を処置するための、発現ベクターおよび薬学的組成物の使用に関連する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる、2021年5月5日に出願された米国仮特許出願第63/184,514号の恩典および優先権を主張する。

配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2022年4月26日に作成された前記ASCIIコピーは、名称がTVD-004WO_SL.txtであり、サイズが402,848バイトである。

発明の分野
本発明は、概して、未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる遺伝子産物を発現させるための、および／または未成熟終止コドンにより媒介される障害を処置するための、方法および組成物に関する。

背景
タンパク質合成は、合成されるタンパク質に組み込まれるアミノ酸をコードする61種類の3塩基対コドンおよびタンパク質の合成を終了させる3種類の3塩基対コドン（停止または終止コドンと称される）を含む遺伝コードが主導する。タンパク質をコードする核酸配列が、次のアミノ酸に対するコドンではなく未成熟終止コドンを含有するよう変異すると、生じるタンパク質は未成熟な段階で終了し、これは多くの場合、非機能性であるか、または非短縮タンパク質もしくは全長タンパク質よりも低機能性である。ナンセンス変異と呼ばれるそのような変異は、多くの場合、多くの異なる遺伝子疾患に関連する、または多くの異なる遺伝子疾患の原因因子となる。

多くの障害が、ナンセンス変異に関連する、またはナンセンス変異により引き起こされる。これらは、てんかん、例えばドラベ症候群、熱性けいれんを伴う遺伝性てんかん（GEFS）、良性家族性乳児てんかん（BFIE）、早期乳児てんかん性脳症（EIEE）、レノックス・ガストー症候群、レット症候群、PPM-X症候群、大田原症候群、反復発作性運動失調症、片麻痺性片頭痛、突発性全般てんかん、FOXG1症候群、多様な焦点を示す家族性焦点性てんかん（FFEVF）、小児期発症てんかん性脳症、SYNGAP1関連知的障害、ピリドキシン依存性てんかん、家族性乳児性ミオクロニーてんかん（FIME）、ミオクロニー失立てんかん、X連鎖知的障害、部分てんかんおよび反復発作性運動失調症、熱性けいれん、聴覚症状を伴う常染色体優性部分てんかん（ADPEAF）、PNPO欠損症、進行性ミオクローヌスてんかん、動作性ミオクローヌス・腎不全（AMRF）、CDKL5欠損障害、ならびに良性家族性乳児けいれん（BFIS）を含む。

例として、ドラベ症候群は、乳児期に始まる希少かつ壊滅的な形態の難治性てんかんである。最初に、患者は長時間のけいれんを経験する。2年目には、さらなるタイプのけいれんが起こり始め、典型的に、おそらく反復的な脳低酸素が原因で、発達低下も同時に起こる。このため、言語および運動能力の発達が不十分になる。（電位開口型ナトリウムチャネルαサブユニットNav1.1をコードする）SCN1A、（電位開口型ナトリウムチャネルβ1サブユニットをコードする）SCN1B、（Nav1.2をコードする）SCN2A、（Nav1.3をコードする）SCN3A、（Nav1.7をコードする）SCN9A、（γ-アミノ酪酸受容体γ2サブユニットをコードする）GABRG2、（γ-アミノ酪酸受容体Δサブユニットをコードする）GABRDおよび／または（プロトカドヘリン-19をコードする）PCDH19遺伝子内の変異が、ドラベ症候群に関連付けられている。

ドラベ症候群は、例えば未成熟終止コドンをもたらし、非短縮タンパク質または機能性タンパク質の欠如または減量をもたらす、SCN1A遺伝子内の、ナンセンス変異により引き起こされ得る。SCN1A遺伝子は、通常、ニューロンの電位開口型ナトリウムチャネルαサブユニットであるNa(V)1.1をコードする。マウスモデルにおいて、SCN1A内の機能喪失変異は、ナトリウム流量の減少および海馬のGABA性介在ニューロンの興奮性の故障をもたらすことが観察されている。

今日までの努力にもかかわらず、ドラベ症候群などの未成熟終止コドンにより媒介される障害を処置するための改善された組成物および方法に対する要望が当技術分野に存在する。

本発明は、一部、単一の発現ベクターを用いて複数の（例えば2つまたは3つの）サプレッサーtRNAを発現させることが可能であるという発見に基づいている。各々のサプレッサーtRNAは、哺乳動物細胞において、遺伝子によりコードされる遺伝子産物中の、そうでなければその遺伝子内の未成熟終止コドン（PTC）に起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする。単一の発現ベクターからの複数のサプレッサーtRNAの発現は、単一の発現ベクターで、同一対象において複数の異なるPTCにより媒介される疾患を処置するおよび／または複数の異なる対象において複数の異なるPTCにより媒介される疾患を処置することを可能にする。本発明はさらに、一部、最大の潜在的患者集団の処置を可能にする最適なサプレッサーtRNAの組み合わせの発見に基づいている。

したがって、1つの局面において、本発明は、（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNAをコードする第1のヌクレオチド配列；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNAをコードする第2のヌクレオチド配列；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAをコードする第3のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。

特定の態様において、第1のアミノ酸はアルギニン、トリプトファン、システイン、セリン、グリシン、およびロイシンから選択される（例えば、第1のアミノ酸はアルギニンである）。特定の態様において、第2のアミノ酸はグルタミン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、リジン、セリン、およびロイシンから選択される（例えば、第2のアミノ酸はグルタミンである）。特定の態様において、第3のアミノ酸はグルタミン、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、およびロイシンから選択される。特定の態様において、第2のアミノ酸と第3のアミノ酸は同じであり、例えば、第2および第3のアミノ酸はグルタミン、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、およびロイシンから選択される。

特定の態様において、（i）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はリジンである；（ii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；（iii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はチロシンである；（iv）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はロイシンである；（v）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はトリプトファンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；または（vi）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はチロシンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である。特定の態様において、（i）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミンである；（ii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；（iii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はリジンである；（iv）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はトリプトファンであり、第3のアミノ酸はグルタミンである；または（v）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミン酸であり、第3のアミノ酸はグルタミンである。特定の態様において、（i）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミンである；（ii）第1のアミノ酸はトリプトファンであり、第2のアミノ酸はグルタミン酸であり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；（iii）第1のアミノ酸はシステインであり、第2のアミノ酸はチロシンであり、第3のアミノ酸はチロシンである；（iv）第1のアミノ酸はセリンであり、第2のアミノ酸はリジンであり、第3のアミノ酸はリジンである；（v）第1のアミノ酸はグリシンであり、第2のアミノ酸はセリンであり、第3のアミノ酸はセリンである；または（vi）第1のアミノ酸はロイシンであり、第2のアミノ酸はロイシンであり、第3のアミノ酸はロイシンである。

特定の態様において、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAは、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む。例えば、(i)第1のアミノ酸がアルギニンである場合、第1のサプレッサーtRNAはSEQ ID NO:6～9、11、16～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含み得る、（ii）第2のアミノ酸がグルタミンである場合、第2のサプレッサーtRNAはSEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含み得る、ならびに／または（iii）第3のアミノ酸がグルタミンである場合、第3のサプレッサーtRNAはSEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。

特定の態様において、発現ベクターは、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を1、2、3、4、または4超のコピー数で含む。

特定の態様において、発現ベクターは、野生型tRNA遺伝子に隣接するゲノムDNA配列に対応するヌクレオチド配列を含む。例えば、特定の態様において、発現ベクターは、表4に示されるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、表4に示されるヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:869～888から選択される。特定の態様において、表4に示されるヌクレオチド配列は、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結される。特定の態様において、発現ベクター内で、表4に示されるヌクレオチド配列は、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列の5’側にある。特定の態様において、発現ベクター内で、表4に示されるヌクレオチド配列は、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列のすぐ5’側にある（すなわち、隣接する）。

特定の態様において、発現ベクターはウイルスベクター、例えばDNAウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。

別の局面において、本発明は、上記発現ベクターのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物を提供する。

別の局面において、本発明は、（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNA；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNA；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAを含む薬学的組成物を提供する。

特定の態様において、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAは、例えば、5-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルバモイル-メチル-2-O-メチルウリジン、5-メトキシ-カルボニルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、1-メチルアデノシン、およびイノシンから選択される1つまたは複数の自然発生のヌクレオチド修飾を含む。特定の態様において、tRNAは、別の部分、例えば担体粒子、例えばアミノ脂質粒子とコンジュゲートも結合もされない。特定の態様において、組成物は、ナノ粒子および／またはアミノ脂質送達化合物を含まない。

別の局面において、本発明は、未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させる方法を提供し、該方法は、有効量の上記発現ベクターまたは薬学的組成物のいずれかを、細胞に接触させる工程であって、それによって、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする、工程を含む。

別の局面において、本発明は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させる方法を提供し、該方法は、有効量の以下：（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現ベクター；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現ベクター；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む第3の発現ベクターを、細胞に接触させる工程であって、それによって、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする、工程を含む。

別の局面において、本発明は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させる方法を提供し、該方法は、有効量の以下：（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNA；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNA；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAを、細胞に接触させる工程であって、それによって、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする、工程を含む。

上記方法のいずれかの特定の態様において、第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAは、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む。例えば、(i)第1のアミノ酸がアルギニンである場合、第1のサプレッサーtRNAはSEQ ID NO:6～9、11、16～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含み得る、（ii）第2のアミノ酸がグルタミンである場合、第2のサプレッサーtRNAはSEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含み得る、ならびに／または（iii）第3のアミノ酸がグルタミンである場合、第3のサプレッサーtRNAはSEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。

上記方法のいずれかの特定の態様において、遺伝子は表5または表6に示される遺伝子である。特定の態様において、遺伝子はSCN1Aまたはジストロフィン遺伝子である。

上記方法のいずれかの特定の態様において、細胞はヒト細胞である。特定の態様において、細胞は中枢神経系細胞、例えばニューロンである。特定の態様において、tRNAは細胞内でアミノアシル化される。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象（または対象の集団）において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法を提供し、該対象は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、該方法は、有効量の上記発現ベクターのいずれかまたは上記薬学的組成物のいずれかを、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程を含む。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象（または対象の集団）において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法を提供し、該対象は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、該方法は、有効量の以下：（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現ベクター；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現ベクター；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む第3の発現ベクターを、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程を含む。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象（または対象の集団）において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法を提供し、該対象は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、該方法は、有効量の以下：（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNA；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNA；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAを、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程を含む。

上記方法のいずれかの特定の態様において、障害は表5または表6に示される障害である。特定の態様において、障害はドラベ症候群またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象（または対象の集団）においてドラベ症候群を処置する方法を提供し、該対象は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有するSCN1A遺伝子を有し、該方法は、以下：（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNAをコードする第1のヌクレオチド配列；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNAをコードする第2のヌクレオチド配列；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAをコードする第3のヌクレオチド配列を含む有効量の発現ベクターを、該対象に投与する工程であって、それによって該対象においてドラベ症候群を処置する、工程を含む。特定の態様において、（i）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はリジンである；（ii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；（iii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はチロシンである；（iv）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はロイシンである；（v）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はトリプトファンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；または（vi）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はチロシンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象（または対象の集団）においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法を提供し、該対象は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有するジストロフィン遺伝子を有し、該方法は、（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNAをコードする第1のヌクレオチド配列；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNAをコードする第2のヌクレオチド配列；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAをコードする第3のヌクレオチド配列を含む有効量の発現ベクターを、該対象に投与する工程であって、それによって該対象においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する、工程を含む。特定の態様において、（i）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミンである；（ii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はグルタミン酸である；（iii）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミンであり、第3のアミノ酸はリジンである；（iv）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はトリプトファンであり、第3のアミノ酸はグルタミンである；または（v）第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はグルタミン酸であり、第3のアミノ酸はグルタミンである。

本発明のこれらおよび他の局面ならびに特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に記載される。

本発明は、以下の図面を参照することでより完全に理解することができる。

短縮タンパク質産物（例えば、ドラベ症候群を有する対象におけるタンパク質産物）をもたらす未成熟終止コドン（PTC）を含有する転写物（例えば、SCN1A転写物）の概要図である。ネイティブの終止コドンが影付きの丸で示され、未成熟終止コドンが影なしの丸で示されている。その同族アミノ酸（A.A.）を負荷したサプレッサーtRNA（例えば、アンチコドン修飾アルギニンtRNA）の発現は、PTCのリードスルー（read-through）を可能にし、全長タンパク質の発現を促進する。共通tRNA二次構造である。残基の番号は、Steinberg et al. (1993) NUCLEIC ACIDS RES. 21:3011-15に記載されるtRNA番号体系に基づく。特定の真核生物の細胞質ゾル由来のtRNA配列の修飾プロファイルを示す表である。表中の比は、図2Aに示される番号の位置における列挙されているヌクレオチドの出現頻度を示す。修飾残基の略称は、Motorin et al. (2005) “Transfer RNA Modification,” ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, John Wily & Sons, Incで定義されている。ナンセンス変異の全体頻度を示す棒グラフである。データは、ClinVarにおける病原性ナンセンス変異に関する約16,000個のエントリーに由来する。 SCN1Aにおけるナンセンス変異の頻度を示す棒グラフである。データは、ClinVarおよび広州（Guangzhou）SCN1A変異データベースに由来する。デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィーにおけるナンセンス変異の頻度を示す棒グラフである。データは、ライデン（Leiden）データベースに由来する。 3つの異なる未成熟終止コドン（PTC）のリードスルーを促進する3つのサプレッサーtRNAをコードする例示的な発現ベクターの模式図である。アルギニンコドン（CGA）の代わりにPTC（TGA）を有する例示的なEGFPレポーターおよびサプレッサーtRNAを示す。ネイティブ終止コドンは影付きの丸で示され、未成熟終止コドンは影なしの丸で示されている。示されている例において、（CGAに結合するアンチコドンを有する）標準的なアルギニンtRNAは、EGFPにおいてPTCのリードスルーをもたらさず、非機能性短縮EGFPタンパク質を生じるであろう。Arg＞TGAサプレッサーtRNA（TGA/UGAに結合する修飾アンチコドンを有するアルギニンtRNA）は、EGFPにおいてPTCのリードスルーを可能にし、全長の機能性EGFPタンパク質を生じる。（i）トリストップ（Tristop）サプレッサーをコードするプラスミドおよび（ii）アルギニンコドン（CGA）の代わりにPTC（TGA）を有するEGFPレポーター（「R96*TGA」）、グルタミンコドン（CAG）の代わりにPTC（TAA）を有するEGFPレポーター（「Q69*TAA」）、またはグルタミンコドン（CAG）の代わりにPTC（TAG）を有するEGFPレポーター（「Q69*TAG」）のいずれかをコードするプラスミドを一過的に共トランスフェクトされたHEK293細胞におけるEGFPレポーター発現の蛍光画像を示す。トリストップサプレッサーのリードスルー活性を、アルギニン→TGA（R＞TGA）サプレッサー（「R→TGAサプレッサー（115）」）のみ、グルタミン→TAA（Q＞TAA）サプレッサー（「Q→TAAサプレッサー（157）」）のみ、およびグルタミン→TAG（Q>TAG）サプレッサー（「Q→TAGサプレッサー（196）」）のみをコードする個別の発現ベクターの活性と比較した。図8に関して記載されたようにして共トランスフェクトされたHEK293細胞におけるEGFP発現を示す。EGFP発現はフローサイトメトリーにより分析され、リードスルー活性は、バックグラウンドを上回るEGFPを発現する生細胞の比率として表されている。（いかなるサプレッサーtRNAも含まない）対照が右側に示され、「R96*TGA」はアルギニンコドンの代わりにPTC（TGA）を有するEGFPレポーターを示し、「Q69*TAA」はグルタミンコドンの代わりにPTC（TAA）を有するEGFPレポーターを示し、「Q69*TAG」はグルタミンコドンの代わりにPTC（TAG）を有するEGFPレポーターを示し、「EGFP」は野生型EGFPレポーターを示す。示されているサプレッサーtRNAをトランスフェクトされた細胞における細胞生存率を示す棒グラフである。「モック」は、モックをトランスフェクトされた細胞を示し、「対照」は、サプレッサーtRNAを含有しない発現ベクターをトランスフェクトされた細胞を示す。

詳細な説明
本発明は、一部、単一の発現ベクターを用いて複数の（例えば2つまたは3つの）サプレッサーtRNAを発現させることが可能であるという発見に基づいている。各々のサプレッサーtRNAは、哺乳動物細胞において、遺伝子によりコードされる遺伝子産物中の、そうでなければその遺伝子内の未成熟終止コドン（PTC）に起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする。単一の発現ベクターからの複数のサプレッサーtRNAの発現は、単一の発現ベクターで、同一対象において複数の異なるPTCにより媒介される疾患を処置するおよび／または複数の異なる対象において複数の異なるPTCにより媒介される疾患を処置することを可能にする。本発明はさらに、一部、最大の潜在的患者集団の処置を可能にする最適なサプレッサーtRNAの組み合わせの発見に基づいている。

特定の態様において、発現ベクターは、順に（例えば、5’から3’への方向に）、（i）第1のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列、および第3のヌクレオチド配列；（ii）第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、および第2のヌクレオチド配列；（iii）第2のヌクレオチド配列、第1のヌクレオチド配列、および第3のヌクレオチド配列；（iv）第2のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、および第1のヌクレオチド配列；（v）第3のヌクレオチド配列、第1のヌクレオチド配列、および第2のヌクレオチド配列；または（vi）第3のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列、および第1のヌクレオチド配列、を含む。

上記方法のいずれかの特定の態様において、細胞は、tRNAを有さない細胞よりも少ない短縮遺伝子産物を含有する。例えば、特定の態様において、細胞は、tRNAを有さない細胞との比較で約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、または約90％未満の短縮遺伝子産物を含有する。特定の態様において、細胞は、tRNAを有さない細胞との比較で約5％～約80％、約5％～約60％、約5％～約40％、約5％～約20％、約5％～約10％、約10％～約80％、約10％～約60％、約10％～約40％、約10％～約20％、約20％～約80％、約20％～約60％、約20％～約40％、約40％～約80％、約40％～約60％、または約60％～約80％の短縮遺伝子産物を含有する。特定の態様において、細胞内に検出可能な短縮遺伝子産物が存在しない。短縮遺伝子産物の量または発現は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ウェスタンブロットまたはELISAにより測定され得る。

特定の態様において、細胞は、tRNAを有さない細胞よりも多い量の機能性遺伝子産物を含有する。例えば、特定の態様において、この方法は、細胞、組織、または対象内の機能性遺伝子産物の量を、tRNAを有さない細胞、組織、または対象との比較で約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約100％、約110％、約120％、約130％、約140％、約150％、約160％、約170％、約180％、約190％、約200％、約250％、約300％、約350％、約400％、約450％、または約500％増加させる。特定の態様において、この方法は、細胞、組織、または対象内の機能性遺伝子産物の量を、tRNAを有さない細胞、組織、または対象との比較で約20％～約200％、約20％～約180％、約20％～約160％、約20％～約140％、約20％～約120％、約20％～約100％、約20％～約80％、約20％～約60％、約20％～約40％、約40％～約200％、約40％～約180％、約40％～約160％、約40％～約140％、約40％～約120％、約40％～約100％、約40％～約80％、約40％～約60％、約60％～約200％、約60％～約180％、約60％～約160％、約60％～約140％、約60％～約120％、約60％～約100％、約60％～約80％、約80％～約200％、約80％～約180％、約80％～約160％、約80％～約140％、約80％～約120％、約80％～約100％、約100％～約200％、約100％～約180％、約100％～約160％、約100％～約140％、約100％～約120％、約120％～約200％、約120％～約180％、約120％～約160％、約120％～約140％、約140％～約200％、約140％～約180％、約140％～約160％、約160％～約200％、約160％～約180％、または約180％～約200％増加させる。機能性遺伝子産物の量または発現は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ウェスタンブロットまたはELISAにより測定され得る。

特定の態様において、tRNAは、遺伝子産物中の、未成熟終止コドンに対応する位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする（すなわち、tRNAは、未成熟終止コドンのリードスルーを可能にする）が、tRNAは、遺伝子産物中の、ネイティブの停止コドンに対応する位置に、実質的な量のアミノ酸が組み込まれることは可能にしない（すなわち、tRNAは、ネイティブの停止コドンのリードスルーは可能にしない）。例えば、特定の態様において、開示されるtRNAは、細胞、組織、もしくは対象においてネイティブの停止コドン（もしくは全てのネイティブの停止コドン）のリードスルーを増加させない、またはtRNAと接触していない細胞、組織、もしくは対象との比較で、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、もしくは約50％未満、リードスルーを増加させる。ネイティブの停止コドンのリードスルーは、当技術分野で公知の任意の方法、例えばリボソームプロファイリングにより測定され得る。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象（または対象の集団）において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法を提供し、該対象は、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、該方法は、有効量の（a）第1の未成熟停止コドン（例えば、TGA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第1のサプレッサーtRNA；（b）第2の未成熟停止コドン（例えば、TAG）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第2のサプレッサーtRNA；および任意で（c）第3の未成熟停止コドン（例えば、TAA）にハイブリダイズするアンチコドンを含みかつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる第3のサプレッサーtRNAを、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程を含む。

I. tRNAおよびサプレッサーtRNA
タンパク質合成時に、トランスファーRNA（tRNA）は、伸長するタンパク質（ポリペプチド）鎖への組み込みのためにアミノ酸をリボソームに送達する。tRNAは、典型的に、約70～100ヌクレオチド長であり、活性tRNAは、3' CCA配列を含有し、これはその合成に間にtRNAに転写され得るかまたは後の転写後プロセシングの間に添加され得る。アミノアシル化の際、そのtRNA分子に付加されるアミノ酸は、3’末端リボースの2’または3’ヒドロキシル基に共有結合により付加され、アミノアシル-tRNA（aa-tRNA）を形成する。アミノ酸は2’-ヒドロキシル基から3’-ヒドロキシル基へとまたはその逆へと自発的に移動し得るが、それは3’-OH位からリボソーム上の伸長するタンパク質鎖に組み込まれると理解されている。折り畳まれたaa-tRNA分子の他端にあるループは、アンチコドンとして公知の3塩基の配列を含有する。このアンチコドン配列が、リボソームに結合したメッセンジャーRNA（mRNA）内の相補的な3塩基コドン配列とハイブリダイズするまたは塩基対を形成すると、aa-tRNAはリボソームに結合し、そのアミノ酸が、そのリボソームにより合成されているポリペプチド鎖に組み込まれる。特定のコドンと塩基対を形成する全てのtRNAが、単一の特定のアミノ酸でアミノアシル化されるので、tRNAにより遺伝子コードの翻訳がなされる。mRNA内の61種類の非終止コドンの各々が、その同族aa-tRNAの結合およびリボソームにより合成されている伸長するポリペプチド鎖への単一の特定のアミノ酸の付加を手引きする。

tRNAは一般に高度に保存されており、多くの場合、種をまたいで機能する。したがって、細菌tRNA、非哺乳動物真核生物tRNA、または哺乳動物（例えば、ヒト）tRNA由来のtRNAが、本発明の実施に有用であり得る。天然に存在するヒトtRNAをコードするヌクレオチド配列は公知であり、一般に、Genbank等のソースを通じて当業者に利用可能となっている。Sprinzl et al. (2005) NUCLEIC ACIDS RES. 33: D139-40；Buckland et al. (1996) GENOMICS 35(1):164-71；Schimmel et al. (Eds.) (1979) “Transfer-RNA: Structure, Properties, and Recognition,” Cold Spring Harbor Laboratory；Agris (1983) "The Modified Nucleosides of Transfer RNA, II,” Alan R. Liss Inc.も参照のこと。tRNAは一般に高度に保存されており、多くの場合、種をまたいで機能する。

サプレッサーtRNAは、タンパク質をコードする遺伝子内の変異部位、例えばPTCに適切なアミノ酸を挿入する修飾tRNAである。サプレッサーの下でのこの語の使用は、特定の環境下で、この修飾tRNAがコード変異の表現型効果を「抑制（suppress）」するという事実に基づいている。サプレッサーtRNAは典型的に、コドン特異性を変化させるようアンチコドン内に、またはtRNAのアミノアシル化特性を変更するいくつかの位置に、のいずれかに、変異（修飾）を含む。

特定の態様において、tRNA（例えば、サプレッサーtRNA）は、修飾アンチコドン領域を含有し、修飾アンチコドンは、対応する天然に存在するアンチコドンと異なるコドンにハイブリダイズする。特定の態様において、修飾アンチコドンは、終止コドン、例えばPTCにハイブリダイズし、その結果、tRNAは、タンパク質合成を終了させるのではなく、遺伝子産物にアミノ酸を組み込む。特定の態様において、修飾アンチコドンは未成熟終止コドンにハイブリダイズし、その結果、tRNAは、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸を組み込む。

特定の態様において、tRNAは、UAG（すなわち、「アンバー」終止コドン）、UGA（すなわち、「オパール」終止コドン）、およびUAA（すなわち、「オーカー」終止コドン）から選択されるコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む。特定の態様において、アンチコドンは、UGA～UAAから選択されるコドンにハイブリダイズする。特定の態様において、アンチコドンは、UGAにハイブリダイズする。特定の態様において、tRNAは、非標準終止コドン、例えば、4-ヌクレオチドコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む（例えば、Moore et al. (2000) J. MOL. BIOL. 298:195、およびHohsaka et al. (1999) J. AM. CHEM. SOC. 121:12194を参照のこと）。

特定の態様において、tRNAは、任意の天然アミノ酸でアミノアシル化されるまたはアミノアシル化されることができる。例えば、tRNAは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンでアミノアシル化されることができるものであり得る。特定の態様において、tRNAは、セリン、ロイシン、グルタミン、またはアルギニンでアミノアシル化されることができる。特定の態様において、tRNAは、グルタミンまたはアルギニンでアミノアシル化されることができる。特定の態様において、tRNAは、アルギニンでアミノアシル化されることができる。

特定の態様において、tRNAは、（i）表1に示されるコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ii）表1に示されるアミノ酸でアミノアシル化されるまたはアミノアシル化されることができる。

特定の態様において、tRNAは、表2に示されるヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、表2に示されるヌクレオチド配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:19～21、37、39、40、44、179、181、182、および186から選択されるヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:19～21、37、39、40、44、179、181、182、および186から選択されるヌクレオチド配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。本明細書（例えば表2および3、ならびに配列表）を通して、tRNAが1つまたは複数のチミン（T）を含むヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる各例において、tRNAは、1つまたは複数のチミン（T）に代えてウラシル（U）を、または全てのチミン（T）に代えてウラシル（U）を含む同じヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなることも想定されていることが理解される。同様に、tRNAが1つまたは複数のウラシル（U）を含むヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる各例において、tRNAは、1つまたは複数のウラシル（U）に代えてチミン（T）を、または全てのウラシル（U）に代えてチミン（T）を含むヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなることも想定されている。

特定の態様において、tRNAは、表3に示されるヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、表3に示されるヌクレオチド配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:6～9、11、16～18、22、35、36、38、45、178、180、および187から選択されるヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:6～9、11、16～18、22、35、36、38、45、178、180、および187から選択されるヌクレオチド配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。

特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:16のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:17のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:19のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:21のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:22のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:35のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:36のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:37のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:38のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:39のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:40のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:45のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:178のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:179のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:180のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:181のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:182のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:186のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。特定の態様において、tRNAは、SEQ ID NO:187のヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる。

特定の態様において、tRNAは、参照tRNA配列（例えば、本明細書に開示されるtRNA）との比較で1つまたは複数の変異（例えば、ヌクレオチド置換、欠失、または挿入）を含み得る。特定の態様において、tRNAは、単一の変異、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個の、もしくは15個超の変異の組み合わせを含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得る。tRNAが1～15、1～10、1～7、1～6、1～5、1～4、1～3、1～2、2～15、2～10、2～7、2～6、2～5、2～4、2～3、3～15、3～10、3～7、3～6、3～5、または3～4個の変異を含み得る、該変異からなり得る、または該変異から本質的になり得ることが想定されている。

配列同一性は、当技術分野の技術である様々な方法で、例えば、公衆利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを用いて決定され得る。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより採用されるアルゴリズムを用いるBLAST（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Basic Local Alignment Search Tool））分析（Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268；Altschul (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300；Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402）は、配列類似性検索用に設計されている。配列データベースの検索における基本的事項の議論については、Altschul et al. (1994) NATURE GENETICS 6:119-129を参照のこと。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ヒストグラム、記述、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告する統計的有意性のしきい値）、カットオフ、行列およびフィルターに関する検索パラメータは、デフォルト設定のものである。blastp、blastx、tblastn、およびtblastxにより使用されるデフォルトのスコア行列は、BLOSUM62行列である（Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919）。4つのblastnパラメータは、以下のように調整され得る：Q=10（ギャップ形成ペナルティ）；R=10（ギャップ延長ペナルティ）；wink=1（クエリーに沿ってwink番目の位置ごとにワードヒットを生成する）；およびgapw=16（ギャップを含むアラインメントを生成するウィンドウ幅を設定する）。同等のBlastpパラメータ設定は、Q=9；R=2；wink=1；およびgapw=32であり得る。検索はまた、NCBI（国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information））BLASTアドバンスドオプションパラメータ（例えば、-G、ギャップを広げるコスト［整数］：デフォルト=ヌクレオチドについては5／タンパク質については11；-E、ギャップを延長するコスト［整数］：デフォルト=ヌクレオチドについては2／タンパク質については1；-q、ヌクレオチド不一致のペナルティ［整数］：デフォルト=-3；-r、ヌクレオチド一致のリワード［整数］：デフォルト=1；-e、期待値［実数］：デフォルト=10；-W、ワードサイズ［整数］：デフォルト=ヌクレオチドについては11／megablastについては28／タンパク質については3；-y、ビット単位のblast延長についてのドロップオフ（X）：デフォルト=blastnについては20／その他については7；-X、ギャップを含むアラインメントについてのXドロップオフ値（ビット単位）：デフォルト=全てのプログラムについて15、blastnに適用不可；ならびに-Z、ギャップを含むアラインメントについての最終Ｘドロップオフ値（ビット単位）：blastnについては50、その他については25）を用いて行われ得る。ペアワイズタンパク質アラインメントのためのClustalWも使用され得る（デフォルトパラメータは、例えば、Blosum62行列ならびにギャップオープンペナルティ = 10およびギャップ延長ペナルティ = 0.1を含み得る）。GCGパッケージバージョン10.0で利用可能な配列間のBestfit比較は、GAP=50（ギャップ形成ペナルティ）およびLEN=3（ギャップ延長ペナルティ）のDNAパラメータを使用し、タンパク質比較における同等な設定は、GAP=8およびLEN=2である。

tRNAが1つまたは複数の修飾を含み得ることが想定されている。例示的な修飾tRNAは、アシル化tRNA；アルキル化tRNA；アデニン、シトシン、グアニン、もしくはウラシル以外の1つもしくは複数の塩基を含有するtRNA；特異的なリガンドまたは抗原性、蛍光性、親和性、反応性、スペクトル性、もしくは他のプローブ部分の付加により共有結合的に修飾されたtRNA；メチル化されたもしくはそれ以外の修飾がなされた1つもしくは複数のリボース部分を含有するtRNA；試薬のキャリア、特異的なリガンド、もしくは抗原性、蛍光性、反応性、親和性、スペクトル性、もしくは他のプローブとして機能する非天然アミノ酸を含む、20種の天然アミノ酸以外のアミノ酸でアミノアシル化されたaa-tRNA；またはこれらの組成物の任意の組み合わせを含む。例示的な修飾tRNA分子は、Soll et al. (1995) “tRNA: Structure, Biosynthesis, and Function,” ASM Press；El Yacoubi et al. (2012) ANNU. REV. GENET. 46:69-95；Grosjean et al. (1998) “Modification and Editing of RNA.” ASM Press；Hendrickson et al. (2004) ANNU. REV. BIOCHEM. 73:147-176, 2004；Ibba et al. (2000) ANNU. REV. BIOCHEM. 69:617-650; Johnson et al. (1995) COLD SPRING HARBOR SYMP. QUANT. BIOL. 60:71-82；Johnson et al. (1982) J. MOL. BIOL. 156:113-140；Crowley et al. (1994) CELL 78:61-71；Beier et al. (2001) NUCLEIC ACIDS RES. 29:4767-4782；Torres et al. (2014) TRENDS MOL. MED. 20:306-314；Bjork et al. (1987) ANNU. REV. BIOCHEM. 56:263-287；Schaffrath et al. (2017) RNA BIOL. 14(9):1209-1222；およびJohansson et al. (2008) MOL. CELL. BIOL. 28(10):3301-12に記載されている。

特定の態様において、tRNAは、天然に存在するヌクレオチド修飾を含む。天然に存在するtRNAは、例えば、Machnicka et al. (2014) RNA BIOLOGY 11(12): 1619-1629に記載される、および図2Bに示される残基の1つまたは複数を含む、幅広い様々な転写後修飾されたヌクレオチドを含有する。特定の態様において、tRNAは、0位の2'-O-メチルグアノシンまたはG；1位のプソイドウリジンまたはU；4位の2'-O-メチルアデノシン、A、2'-O-メチルウリジン、U、2'-O-メチルシチジン、C、2'-O-メチルグアノシン、またはG；6位のN2-メチルグアノシンまたはG；7位のN2-メチルグアノシンまたはG；9位の1-メチルアデノシン、A、1-メチルグアノシン、G、または修飾G；10位のN2-メチルグアノシンまたはG；12位のN4-アセチルシチジンまたはC；13位のプソイドウリジン、U、2'-O-メチルシチジン、またはC；14位の1-メチルアデノシン、A、または修飾A；16位のジヒドロウリジン（D）またはU；17位のDまたはU；18位の2'-O-メチルグアノシンまたはG；20位の3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、D、またはU；20a位の3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、D、プソイドウリジン、U、または修飾U；20b位のD、プソイドウリジン、またはU；25位のプソイドウリジンまたはU；26位のプソイドウリジン、U、N2,N2-ジメチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、G、または修飾G；27位のプソイドウリジン、U、N2,N2-ジメチルグアノシン、またはG；28位のプソイドウリジンまたはU；30位のプソイドウリジンまたはU；31位のプソイドウリジンまたはU；32位の2'-O-メチルプソイドウリジン、2'-O-メチルウリジン、プソイドウリジン、U、2'-O-メチルシチジン、3-メチルシチジン、C、または修飾C；34位のイノシン、A、2-チオウリジン、2'-O-メチルウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2'-O-メチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、プソイドウリジン、U、修飾U、2'-O-メチルシチジン、5-ホルミル-2'-O-メチルシチジン、5-メチルシチジン、C、修飾C、ケウオシン、マンノシル-ケウオシン、ガラクトシル-ケウオシン、2'-O-メチルグアノシン、またはG；35位のプソイドウリジンまたはU；36位のプソイドウリジン、U、または修飾U；37位の1-メチルイノシン、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、A、修飾A、1-メチルグアノシン、ペルオキシワイブトシン、ワイブトシン、G、または修飾G；38位のプソイドウリジン、U、5-メチルシチジン、C、または修飾C；39位の1-メチルプソイドウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、2'-O-メチルウリジン、プソイドウリジン、U、2'-O-メチルグアノシン、またはG；40位のプソイドウリジン、U、5-メチルシチジン、またはC；44位の2'-O-メチルウリジン、U、または修飾U；e11位のプソイドウリジンまたはU；e12位のプソイドウリジンまたはU；e14位のプソイドウリジンまたはU；e2位の3-メチルシチジンまたはC；46位の7-メチルグアノシンまたはG；47位のD、U、または修飾U；48位のD、U、5-メチルシチジン、C、または修飾C；49位のA、修飾A、5-メチルシチジン、C、または修飾C；50位のプソイドウリジン、U、5-メチルシチジン、またはC；54位の5,2'-O-ジメチルウリジン、5-メチルウリジン、プソイドウリジン、またはU；55位のプソイドウリジンまたはU；58位の1-メチルアデノシン、A、または修飾A；64位の2'-O-リボシルアデノシン（ホスフェート）、A、2'-O-リボシルグアノシン（ホスフェート）、G、または修飾G；65位のプソイドウリジンまたはU；67位のプソイドウリジン、U、N2-メチルグアノシン、またはG；68位のプソイドウリジンまたはU；および72位のプソイドウリジン、U、5-メチルシチジン、またはCからなる群より選択される残基の1つまたは複数を含む。A、C、G、およびUは、それぞれ、非修飾アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルを表す。残基の番号は、Steinberg et al., (1993) NUCLEIC ACIDS RES. 21:3011-15に記載されるtRNA番号体系に基づく。

特定の態様において、tRNAは、5-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルバモイル-メチル-2-O-メチルウリジン、5-メトキシ-カルボニルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、1-メチルアデノシン、およびイノシンから選択される1つまたは複数のヌクレオチド修飾を含む。

II. tRNAを作製する方法
本発明の実施において有用なtRNA分子（例えば、サプレッサーtRNA）は、合成化学法による細胞外産生、組み換えDNA法による細胞内産生、または天然供給源からの精製を含む、当技術分野で公知の方法により製造され得ることが想定されている。

例えば、tRNAをコードするDNA分子は、化学的にまたは組み換えDNA法により合成され得る。例えば、tRNAの配列は、適切な合成核酸プライマーを用いて、従来的なハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によりライブラリから合成またはクローン化され得る。得られたtRNAをコードするDNA分子は、tRNAをコードする従来的な遺伝子発現構築物（すなわち、発現ベクター）を製造するために、例えば発現制御配列を含む、他の適切なヌクレオチド配列とライゲートされ得る。定義された遺伝子構築物の製造は、当技術分野の技術常識内である。所望のtRNAをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、以下の節に記載される発現ベクターに組み込まれ得（ライゲートされ得）、この発現ベクターが従来的なトランスフェクションまたは形質転換技術を通じて宿主細胞に導入され得る。例示的な宿主細胞は、大腸菌（E.coli）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Hep G2）、および骨髄細胞である。形質転換された宿主細胞は、その宿主細胞がtRNAをコードする遺伝子を発現できる条件下で生育され得る。具体的な発現および精製条件は、用いられる発現システムに依存して異なるであろう。

あるいは、tRNAは、当技術分野で公知の方法により化学的に合成または天然供給源から精製され得る。細胞への導入または対象への投与の前にtRNAがアミノアシル化される場合、tRNAは、化学的または酵素的アミノアシル化を含む、当技術分野で公知の任意の方法により所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。

III. 発現ベクター
関心対象のtRNAは、関心対象のtRNAをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むことにより、関心対象の細胞において発現され得る。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを表す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によりまたはインビトロ発現システムで供給され得る。発現ベクターは、関心対象の組み換えポリヌクレオチドを組み込んだ、当技術分野で公知の全てのもの、例えば、コスミド、（例えば、裸のまたはリポソーム内に含有される）プラスミド、レトロトランスポゾン（例えば、ピギーバック（piggyback）、スリーピングビューティ（sleeping beauty））、ならびにウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む。

特定の態様において、発現ベクターはウイルスベクターである。「ウイルス」という用語は、タンパク質合成またはエネルギー生成機構を有さない絶対細胞内寄生体を表すよう本明細書中で使用される。例示的なウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス（EBV）ベクター、ポリオーマウイルスベクター（例えば、サル空胞ウイルス40（SV40）ベクター）、ポックスウイルスベクター、およびプソイド型ウイルスベクターを含む。

ウイルスは、（RNAから構成されるゲノムを有する）RNAウイルスまたは（DNAから構成されるゲノムを有する）DNAウイルスであり得る。特定の態様において、ウイルスベクターはDNAウイルスベクターである。例示的なDNAウイルスは、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、アデノウイルス、アスファウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1および2（HSV-1およびHSV-2）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、サイトメガロウイルス（CMV））、パピローマウイルス（例えば、HPV）、ポリオーマウイルス（例えば、サル空胞ウイルス40（SV40））、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、鶏痘ウイルス、羊痘ウイルス、粘液腫ウイルス）を含む。特定の態様において、ウイルスベクターはRNAウイルスベクターである。例示的なRNAウイルスは、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コロナウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス（例えば、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、ポリオウイルス、呼吸器多核体ウイルス（RSV）、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス-1（HIV-1））およびトロウイルスを含む。

特定の態様において、発現ベクターは、tRNAをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列またはプロモーターを含む。「機能的に連結」という用語は、機能的関係下でのポリヌクレオチドエレメントの連結を表す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的関係下に置かれているとき、「機能的に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、遺伝子に機能的に連結されている。機能的に連結されたヌクレオチド配列は、典型的に、近接している。しかし、エンハンサーは通常、プロモーターから数キロ塩基離れていても機能し、イントロン配列は様々な長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、機能的に連結されているが、直接隣接しておらず、異なる対立遺伝子または染色体からさえイントランスで機能し得る。

tRNA遺伝子は、好ましくは、様々な細胞型において活性である強プロモーターを有する。真核生物tRNA遺伝子に対するプロモーターは、典型的に、tRNA分子をコードする構造配列自体の中に存在する。転写活性を調節するエレメントは5’上流領域内に存在するが、活性な転写ユニットの長さは500塩基対よりずっと短いものであり得る。

使用され得るさらなる例示的なプロモーターは、レトロウイルスLTR、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、U6プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、細胞性プロモーター、例えば、ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない、真核生物細胞性プロモーター）を含むがこれらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、TKプロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを含むがこれらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明らかであろう。

特定の態様において、発現ベクターは、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなるtRNAをコードするtRNAコード配列を含む。特定の態様において、発現ベクターは、表2または表3に示されるヌクレオチド配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％を有するヌクレオチド配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなるtRNAをコードするtRNAコード配列を含む。

特定の態様において、tRNAコード配列に加えて、発現ベクターは、野生型tRNA遺伝子に隣接するゲノムDNA配列（すなわち、野生型tRNA遺伝子と同じゲノム由来であり、そのゲノム内で野生型tRNA遺伝子の5’または3’側にある、例えば、そのゲノム内で野生型tRNA遺伝子のすぐ5’または3’側にあるDNA配列）に対応するヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、tRNAコード配列に加えて、発現ベクターは、外因性プロモーターに対応するヌクレオチド配列を含む。

特定の態様において、発現ベクターは、表4に示されるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、発現ベクターは、表4に示されるヌクレオチド配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、発現ベクター内で、表4に示されるヌクレオチド配列は、tRNAをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結される。特定の態様において、発現ベクター内で、表4に示されるヌクレオチド配列は、tRNAをコードするヌクレオチド配列の5’または3’側（例えば、すぐ5’側またはすぐ3側）にある。特定の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO:869～888から選択されるヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:869～888から選択される配列に対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター
特定の態様において、発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。AAVは、ディペンドパルボウイルス属およびパルボウイルス科の小さな、非エンベロープ型の二十面体ウイルスである。AAVは、およそ4.7 kbの一本鎖線状DNAゲノムを有する。AAVは、様々な組織型の分裂細胞および静止細胞の両方に感染することができ、異なるAAV血清型は異なる組織向性を示す。

AAVは、血清型AAV-1～AAV-12および非ヒト霊長類由来の100を超える血清型を含む多数の血清学的に識別可能なタイプを含む（例えば、Srivastava (2008) J. CELL BIOCHEM., 105(1): 17-24、およびGao et al. (2004) J. VIROL., 78(12), 6381-6388を参照のこと）。本発明において使用されるAAVベクターの血清型は、送達効率、組織向性、および免疫原性に基づき、当業者により選択され得る。例えば、AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5、AAV-8、およびAAV-9は、中枢神経系への送達に使用され得；AAV-1、AAV-8、およびAAV-9は、心臓への送達に使用され得；AAV-2は、腎臓への送達に使用され得；AAV-7、AAV-8、およびAAV-9は、肝臓への送達に使用され得；AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-9は、肺への送達に使用され得；AAV-8は、膵臓への送達に使用され得、AAV-2、AAV-5、およびAAV-8は、光受容器細胞への送達に使用され得；AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5、およびAAV-8は、網膜色素上皮への送達に使用され得；AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、およびAAV-9は、骨格筋への送達に使用され得る。特定の態様において、AAVカプシドタンパク質は、米国特許第7,198,951号に開示される配列、例えば、非限定的に、AAV-9（米国特許第7,198,951号のSEQ ID NO:1～3）、AAV-2（米国特許第7,198,951号のSEQ ID NO:4）、AAV-1（米国特許第7,198,951号のSEQ ID NO:5）、AAV-3（米国特許第7,198,951号のSEQ ID NO:6）、およびAAV-8（米国特許第7,198,951号のSEQ ID NO:7）を含む。アカゲザルから同定されたAAV血清型、例えば、rh.8、rh.10、rh.39、rh.43、およびrh.74もまた、本発明において想定されている。天然のAAV血清型の他に、送達効率、組織向性、および免疫原性を改善するための修飾AAVカプシドが開発されている。例示的な天然および修飾AAVカプシドは、米国特許第7,906,111号、同第9,493,788号、および同第7,198,951号、ならびにPCT公開公報番号WO2017189964A2に開示されている。

野生型AAVゲノムは、AAVの複製、ゲノムのカプシド化および組み込みを手引きするシグナル配列を含有する、2つの145ヌクレオチド逆位末端反復（ITR）を含有する。ITRに加えて、3つのAAVプロモーターp5、p19、およびp40が、repおよびcap遺伝子をコードする2つのオープンリーディングフレームの発現を推し進める。単一のAAVイントロンの示差的スプライシングと共に、2つのrepプロモーターにより、rep遺伝子から4つのrepタンパク質（Rep 78、Rep 68、Rep 52、およびRep 40）が生成される。repタンパク質は、ゲノム複製を担う。Cap遺伝子は、p40プロモーターから発現され、cap遺伝子のスプライス変種である3つのカプシドタンパク質（VP1、VP2、およびVP3）をコードする。これらのタンパク質が、AAV粒子のカプシドを形成する。

複製、カプシド化、および組み込みのためのシス作用性シグナルはITR内に含有されているので、4.3 kbの内部ゲノムの一部または全てが、外来DNA、例えば、関心対象の外因性遺伝子のための発現カセットと置き換えられ得る。したがって、特定の態様において、AAVベクターは、5' ITRおよび3' ITRに隣接している外因性遺伝子のための発現カセットを含むゲノムを含む。ITRは、カプシドと同じ血清型由来であり得るまたはその派生物であり得る。あるいは、ITRは、カプシドと異なる血清型のものであり得、それによってプソイド型AAVを生成する。特定の態様において、ITRはAAV-2由来である。特定の態様において、ITRはAAV-5由来である。ITRの少なくとも1つは、末端分解部位（terminal resolution site）を変異させるまたは除去するよう修飾され得、それによって自己相補的AAVベクターが生成される。

AAVベクターを生成するために、repおよびcapタンパク質は、イントランスで、例えば、プラスミド上に、提供され得る。AAV複製を許容する宿主細胞株は、repおよびcap遺伝子、ITRに隣接する発現カセット、ならびにヘルパーウイルスにより提供されるヘルパー機能、例えば、アデノウイルス遺伝子E1a、E1b55K、E2a、E4orf6、およびVAを発現しなければならない（Weitzman et al., Adeno-associated virus biology. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols, pp. 1-23, 2011）。AAVベクターを生成および精製する方法は、詳細に記載されている（例えば、Mueller et al., (2012) CURRENT PROTOCOLS IN MICROBIOLOGY, 14D.1.1-14D.1.21, Production and Discovery of Novel Recombinant Adeno-Associated Viral Vectorsを参照のこと）。HEK293細胞、COS細胞、HeLa細胞、BHK細胞、Vero細胞、および昆虫細胞を含む、多数の細胞型が、AAVベクターの産生に適する（例えば、米国特許第6,156,303号、同第5,387,484号、同第5,741,683号、同第5,691,176号、同第5,688,676号、および同第8,163,543号、米国特許公開第20020081721号、ならびにPCT公開公報番号WO00/47757、WO00/24916、およびWO96/17947を参照のこと）。AAVベクターは、典型的に、これらの細胞型において、ITRに隣接する発現カセットを含有する1つのプラスミド、ならびに追加のAAVおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する1つまたは複数の追加のプラスミドにより産生される。

本発明においては、任意の血清型のAAVが使用され得る。同様に、任意のアデノウイルス型が使用され得ること、および当業者は彼らの所望の組み換えAAVベクター（rAAV）の産生に適したAAVおよびアデノウイルス型を特定することができるであろうことが想定されている。AAV粒子は、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオジキサノール勾配、またはCsCl勾配により精製され得る。

AAVベクターは、4.7 kbのサイズである、または5.2 kbという大きなオーバーサイズゲノムもしくは3.0 kbという小さなものを含む4.7 kbよりも大きいもしくは小さい一本鎖ゲノムを有し得る。したがって、AAVベクターから発現させる関心対象の外因性遺伝子が小さい場合、AAVゲノムは、スタッファー配列を含み得る。さらに、ベクターゲノムは、実質的に自己相補性であり得、それによって細胞内での迅速な発現を可能にし得る。特定の態様において、自己相補性AAVベクターのゲノムは、5'から3'へと：5' ITR；関心対象の遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む第1核酸配列；機能性の末端分解部位を有さない修飾ITR；第1核酸配列に相補的または実質的に相補的な第2核酸配列；ならびに3' ITRを含む。全てのタイプのゲノムを含有するAAVが、本発明の方法における使用に適する。

AAVベクターの非限定的な例は、pAAV-MCS（Agilent Technologies）、pAAVK-EF1α-MCS（System Bioカタログ＃AAV502A-1）、pAAVK-EF1α-MCS1-CMV-MCS2（System Bioカタログ＃AAV503A-1）、pAAV-ZsGreen1（Clontechカタログ＃6231）、pAAV-MCS2（Addgeneプラスミド＃46954）、AAV-Stuffer（Addgeneプラスミド＃106248）、pAAVscCBPIGpluc（Addgeneプラスミド＃35645）、AAVS1_Puro_PGK1_3xFLAG_Twin_Strep（Addgeneプラスミド＃68375）、pAAV-RAM-d2TTA::TRE-MCS-WPRE-pA（Addgeneプラスミド＃63931）、pAAV-UbC（Addgeneプラスミド＃62806）、pAAVS1-P-MCS（Addgeneプラスミド＃80488）、pAAV-Gateway（Addgeneプラスミド＃32671）、pAAV-Puro_siKD（Addgeneプラスミド＃86695）、pAAVS1-Nst-MCS（Addgeneプラスミド＃80487）、pAAVS1-Nst-CAG-DEST（Addgeneプラスミド＃80489）、pAAVS1-P-CAG-DEST（Addgeneプラスミド＃80490）、pAAVf-EnhCB-lacZnls（Addgeneプラスミド＃35642）、およびpAAVS1-shRNA（Addgeneプラスミド＃82697）を含む。これらのベクターは、治療的使用に適するよう修飾され得る。例えば、関心対象の外因性遺伝子は、マルチクローニング部位に挿入され得、そして選択マーカー（例えば、ピューロ（puro）または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が除去され得るまたは別の（同じもしくは異なる）関心対象の外因性遺伝子で置き換えられ得る。AAVベクターのさらなる例は、米国特許第5,871,982号、同第6,270,996号、同第7,238,526号、同第6,943,019号、同第6,953,690号、同第9,150,882号、および同第8,298,818号、米国特許公開第2009/0087413号、ならびにPCT公開公報番号WO2017075335A1、WO2017075338A2、およびWO2017201258A1に開示されている。

特定の態様において、発現ベクターは、対象、例えばヒト対象において神経系、例えば中枢神経系を標的とすることができるAAVベクターである。神経系を標的とすることができる例示的なAAVベクターは、AAV9変種であるAAV-PHP.B（例えば、Deverman et al. (2016) NAT. BIOTECHNOL. 34(2):204-209を参照のこと）、AAV-AS（例えば、Choudhury et al. (2016) MOL. THER. 24:726-35を参照のこと）、およびAAV-PHP.eB（例えば、Chan et al. (2017) NAT. NEUROSCI. 20:1172-79を参照のこと）を含む。神経系を標的とするためのさらなる例示的なAAVベースの戦略は、Bedrook et al. (2018) ANNU REV NEUROSCI. 41:323-348に記載されている。特定の態様において、AAVベクターはAAV-PHP.eBベクターである。

レンチウイルスベクター
特定の態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、脾壊死ウイルスベクター、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス等のレトロウイルス由来のベクターを含む。レトロウイルスベクターは、真核細胞生物へのレトロウイルス媒介遺伝子移入を媒介する作用物質として有用である。

特定の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。例示的なレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス-1（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス-2（HIV-2）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、ジェンブラナ病ウイルス（JDV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、およびヤギ関節炎・脳炎ウイルス（CAEV）由来のベクターを含む。

レトロウイルスベクターは典型的に、そのウイルスの構造遺伝子をコードする配列の大部分が取り除かれ、関心対象の遺伝子で置き換えられるよう構築される。多くの場合、構造遺伝子（例えば、gag、pol、およびenv）は、当技術分野で公知の遺伝子操作技術を用いてレトロウイルス骨格から除去される。したがって、最小レトロウイルスベクターは、5'から3'へと：5'長末端反復（LTR）、パッケージングシグナル、任意の外因性プロモーターおよび／またはエンハンサー、関心対象の外因性遺伝子、ならびに3' LTRを含む。外因性プロモーターが提供されない場合、遺伝子発現は、弱プロモーターであり、発現を活性化させるためにTatの存在を必要とする5' LTRにより推し進められる。レンチウイルスの製造のために、構造遺伝子を別のベクターで提供し、それによって産生されるビリオンを複製欠損性にすることができる。詳細に、レンチウイルスに関して、パッケージングシステムは、Gag、Pol、Rev、およびTat遺伝子をコードする単一のパッケージングベクター、エンベロープタンパク質Env（通常、その広い感染性のためにVSV-G）をコードする第3の別のベクターを含み得る。パッケージングシステムの安全性を改善するため、パッケージングベクターは、1つのベクターからRevを、別のベクターからGagおよびPolを発現させるよう分割され得る。5' LTRのU3領域が異種調節エレメントで置き換えられたキメラ5' LTRを含むレトロウイルスベクターを使用することにより、Tatもまたパッケージングシステムから除去され得る。

遺伝子は、様々な一般的方法でプロウイルス骨格に組み込まれ得る。最も直接的な構築物は、レトロウイルスの構造遺伝子が、LTR内のウイルス調節配列の制御下で転写される単一の遺伝子により置き換えられたものである。2つ以上の遺伝子を標的細胞に導入することができるレトロウイルスベクターも構築されている。通常、そのようなベクターにおいて、1つの遺伝子はウイルスLTRの調節制御下にあり、第2の遺伝子はスプライスされたメッセージから発現されるかまたはそれ自身の内部プロモーターの調節下にあるかのいずれかである。

したがって、新しい遺伝子は、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進するよう機能する、それぞれ、5'および3' LTRに隣接させられる。「長末端反復」または「LTR」という用語は、それらの天然配列においては直列反復でありU3、RおよびU5領域を含有する、レトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを表す。LTRは通常、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、促進、開始、および遺伝子転写物のポリアデニル化）ならびにウイルス複製に必須の機能を提供する。LTRは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みに必要とされる配列を含む多くの調節シグナルを含有する。U3領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。U5領域は、プライマー結合部位とR領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。R（反復）領域は、U3およびU5領域に隣接する。特定の態様において、R領域は、ウイルス複製を増進するようトランスアクチベーター（tat）遺伝子エレメントと相互作用するトランス活性化応答（TAR）遺伝子エレメントを含む。このエレメントは、5' LTRのU3領域が異種プロモーターにより置き換えられる態様においては必要とされない。

特定の態様において、レトロウイルスベクターは、修飾された5' LTRおよび／または3' LTRを含む。3' LTRの修飾は、多くの場合、ウイルスに複製欠損性を付与することによりレンチウイルスまたはレトロウイルスシステムの安全性を改善するために行われる。特定の態様において、レトロウイルスベクターは、自己不活性化（SIN）ベクターである。本明細書で使用される場合、SINレトロウイルスベクターは、最初のラウンドのウイルス複製を超えるウイルス転写を防ぐよう3' LTRのU3領域が（例えば、欠失または置換により）修飾された複製欠損性レトロウイルスベクターを表す。これは、ウイルス複製の間に3' LTRのU3領域が5' LTRのU3領域のテンプレートとして使用され、したがってU3エンハンサー・プロモーターなしではウイルス転写物が生成できないという理由からである。さらなる態様において、3' LTRは、U5領域が、例えば、理想的なポリアデニル化配列で置き換えられるよう修飾される。LTRに対する修飾、例えば3' LTR、5' LTR、または3' および5'の両LTRに対する修飾は本発明の実施においても有用であることが想定されていることに留意されたい。

特定の態様において、5' LTRのU3領域は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を推し進める異種プロモーターで置き換えられる。使用され得る異種プロモーターの例は、例えば、ウイルスシミアンウイルス40（SV40）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（CMV）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、および単純ヘルペスウイルス（HSV）（チミジンキナーゼ）プロモーターを含む。典型的なプロモーターは、Tat非依存的な様式で高レベルの転写を推し進めることができる。この置換は、ウイルス産生システムの中に完全なU3配列が存在しなくなるため、複製可能ウイルスを発生させる組み換えの可能性を低下させる。

5' LTRの隣は、ゲノムの逆転写のため（tRNAプライマー結合部位）およびウイルスRNAの粒子への効率的なパッケージングのため（プサイ部位）に必要とされる配列である。本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルス粒子形成時のレトロウイルスRNA鎖のカプシド化に必要とされる、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を表す（例えば、Clever et al., 1995 J. VIROLOGY, 69(4):2101-09を参照のこと）。パッケージングシグナルは、ウイルスゲノムのカプシド化に必要とされる最小パッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも称される）であり得る。

特定の態様において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）はさらに、FLAPを含む。本明細書で使用される場合、「FLAP」という用語は、その配列がレトロウイルス、例えばHIV-1またはHIV-2の中央ポリプリントラクトおよび中央終止配列（cPPTおよびCTS）を含む核酸を表す。適切なFLAPエレメントは、米国特許第6,682,907号およびZennou et al. (2000) CELL, 101:173に記載されている。逆転写の間に、cPPTにおける正鎖DNAの中央での開始およびCTSにおける中央での終止は、三本鎖DNA構造：中央DNAフラップを形成させる。何らかの説により束縛されることを望まないが、DNAフラップは、レンチウイルスゲノムの核内搬入のシス作用性決定因子として作用し得るおよび／またはウイルスの力価を増加させ得る。特定の態様において、レトロウイルスベクター骨格は、ベクター内の関心対象の異種遺伝子の上流または下流に1つまたは複数のFLAPエレメントを含む。例えば、特定の態様において、移入プラスミドは、FLAPエレメントを含む。1つの態様において、本発明のベクターは、HIV-1から単離されたFLAPエレメントを含む。

特定の態様において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）はさらに、搬出エレメントを含む。1つの態様において、レトロウイルスベクターは、1つまたは複数の搬出エレメントを含む。「搬出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性の転写後調節エレメントを表す。RNA搬出エレメントの例は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）RRE（例えば、Cullen et al., (1991) J. VIROL. 65: 1053；およびCullen et al., (1991) CELL 58: 423を参照のこと）およびB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（HPRE）を含むがこれらに限定されない。一般に、RNA搬出エレメントは、遺伝子の3' UTR内に配置され、1つまたは複数コピーとして挿入され得る。

特定の態様において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）はさらに、転写後調節エレメントを含む。様々な転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE；Zufferey et al., (1999) J. VIROL., 73:2886を参照のこと）；B型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（HPRE）（Huang et al., MOL. CELL. BIOL., 5:3864）；およびその他（Liu et al., (1995), GENES DEV., 9:1766）が、異種核酸の発現を増加させ得る。転写後調節エレメントは、通常、異種核酸配列の3'末端に配置される。この構成は、その5'部分が異種核酸コード配列を含み、その3'部分が転写後調節エレメント配列を含むmRNA転写物を合成する。特定の態様において、本発明のベクターは、転写後調節エレメント、例えば、WPREまたはHPREを、いくつかの例においてはこれらのエレメントが細胞の形質転換の危険を増加させるおよび／または実質的にもしくは有意にmRNA転写物の量を増加させないもしくはmRNAの安定性を増加させないため、欠いているまたは含まない。したがって、特定の態様において、本発明のベクターは、追加の安全手段としてWPREまたはHPREを欠いているまたは含まない。

異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を主導するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、通常、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。したがって、特定の態様において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）はさらに、ポリアデニル化シグナルを含む。「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化配列」という用語は、本明細書で使用される場合、RNAポリメラーゼHにより新たに形成されるRNA転写物の終止およびポリアデニル化の両方を主導するDNA配列を意味する。ポリアデニル化シグナルを欠く転写物は不安定であり急速に分解されるため、組み換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターにおいて使用され得るポリアデニル化シグナルの具体例は、理想的ポリアデニル化配列（例えば、AATAAA、ATTAAA AGTAAA）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（BGHpA）、ウサギβ-グロビンポリアデニル化配列（rβgpA）、または当技術分野で公知の他の適切な異種もしくは内因性ポリアデニル化配列を含む。

特定の態様において、レトロウイルスベクターはさらに、インシュレーターエレメントを含む。インシュレーターエレメントは、ゲノムDNA中に存在するシス作用性エレメントにより媒介され得、移入された配列の非調節的発現をもたらし得る、組み込み部位効果（integration site effect）（すなわち、位置効果；例えば、Burgess-Beusse et al., (2002) PROC. NATL. ACAD. SCI., USA, 99:16433；およびZhan et al., 2001, HUM. GENET., 109:471を参照のこと）からのレトロウイルス発現配列、例えば、治療遺伝子の保護に寄与し得る。特定の態様において、レトロウイルスベクターは、一方もしくは両方のLTRにまたは細胞ゲノムに組み込まれるベクターの領域内の他箇所にインシュレーターエレメントを含む。本発明における使用に適したインシュレーターは、ニワトリβ-グロビンインシュレーター（Chung et al., (1993). CELL 74:505；Chung et al., (1997) PROC. NATL. ACAD. SCI., USA 94:575；およびBell et al., 1999. CELL 98:387を参照のこと）を含むがこれに限定されない。インシュレーターエレメントの例は、β-グロビン座、例えばニワトリHS4、由来のインシュレーターを含むがこれに限定されない。

レンチウイルスベクターの非限定的な例は、pLVX-EF1alpha-AcGFP1-C1（Clontechカタログ＃631984）、pLVX-EF1alpha-IRES-mCherry（Clontechカタログ＃631987）、pLVX-Puro（Clontechカタログ＃632159）、pLVX-IRES-Puro（Clontechカタログ＃632186）、pLenti6/V5-DEST（商標）（Thermo Fisher）、pLenti6.2/V5-DEST（商標）（Thermo Fisher）、pLKO.1（Addgeneのプラスミド＃10878）、pLKO.3G（Addgeneのプラスミド＃14748）、pSico（Addgeneのプラスミド＃11578）、pLJM1-EGFP（Addgeneのプラスミド＃19319）、FUGW（Addgeneのプラスミド＃14883）、pLVTHM（Addgeneのプラスミド＃12247）、pLVUT-tTR-KRAB（Addgeneのプラスミド＃11651）、pLL3.7（Addgeneのプラスミド＃11795）、pLB（Addgeneのプラスミド＃11619）、pWPXL（Addgeneのプラスミド＃12257）、pWPI（Addgeneのプラスミド＃12254）、EF.CMV.RFP（Addgeneのプラスミド＃17619）、pLenti CMV Puro DEST（Addgeneのプラスミド＃17452）、pLenti-puro（Addgeneのプラスミド＃39481）、pULTRA（Addgeneのプラスミド＃24129）、pLX301（Addgeneのプラスミド＃25895）、pHIV-EGFP（Addgeneのプラスミド＃21373）、pLV-mCherry（Addgeneのプラスミド＃36084）、pLionII（Addgeneのプラスミド＃1730）、pInducer10-mir-RUP-PheS（Addgeneのプラスミド＃44011）を含む。これらのベクターは、治療的使用に適するよう修飾され得る。例えば、選択マーカー（例えば、ピューロ、EGFP、またはmCherry）が除去され得るまたは第2の関心対象の外因性遺伝子で置き換えられ得る。レンチウイルスベクターのさらなる例は、米国特許第7,629,153号、同第7,198,950号、同第8,329,462号、同第6,863,884号、同第6,682,907号、同第7,745,179号、同第7,250,299号、同第5,994,136号、同第6,287,814号、同第6,013,516号、同第6,797,512号、同第6,544,771号、同第5,834,256号、同第6,958,226号、同第6,207,455号、同第6,531,123号、および同第6,352,694号、ならびにPCT公開公報番号WO2017/091786に開示されている。

アデノウイルスベクター
特定の態様において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖線状DNAゲノムから構成される、中型サイズ（90～100 nm）、非エンベロープ型（裸）の、二十面体ウイルスである。「アデノウイルス」という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されないアデノビリダエ属の任意のウイルスを表す。典型的に、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスへの、例えば遺伝子移入のための、非ネイティブ核酸配列の挿入を許容するよう、アデノウイルスのアデノウイルスゲノムに1つまたは複数の変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を導入することによって生成される。

ヒトアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として使用され得る。例えば、アデノウイルスは、サブグループA（例えば、血清型12、18、および31）、サブグループB（例えば、血清型3、7、11、14、16、21、34、35、および50）、サブグループC（例えば、血清型1、2、5、および6）、サブグループD（例えば、血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、および42～48）、サブグループE（例えば、血清型4）、サブグループF（例えば、血清型40および41）、未分類血清グループ（例えば、血清型49および51）、または任意の他のアデノウイルス血清グループもしくは血清型のものであり得る。アデノウイルス血清型1～51は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, Virginia）から入手可能である。非グループCアデノウイルスベクター、非グループCアデノウイルスベクターを作製する方法、および非グループCアデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第5,801,030号、同第5,837,511号、および同第5,849,561号、ならびにPCT公開公報番号WO1997/012986およびWO1998/053087に開示されている。

非ヒトアデノウイルス（例えば、類人猿、サル、トリ、イヌ、ヒツジ、またはウシアデノウイルス）は、アデノウイルスベクターを作製するために（すなわち、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として）使用され得る。例えば、アデノウイルスベクターは、新世界ザルおよび旧世界ザルの両方を含むサルアデノウイルスに基づくものであり得る（例えば、Virus Taxonomy: VHIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2005)を参照のこと）。霊長類に感染するアデノウイルスの系統発生学的分析は、例えば、Roy et al. (2009) PLOS PATHOG. 5(7):e1000503に開示されている。ゴリラアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として使用され得る。ゴリラアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターは、例えば、PCT公開公報番号WO2013/052799、WO2013/052811、およびWO2013/052832に記載されている。アデノウイルスベクターはまた、サブタイムの組み合わせを含み得、したがって、「キメラ」アデノウイルスベクターであり得る。

アデノウイルスベクターは、複製可能、条件付き複製可能、または複製欠損性であり得る。複製可能アデノウイルスベクターは、典型的な宿主細胞、すなわち、典型的にアデノウイルスにより感染されることができる細胞において複製することができる。条件付き複製性アデノウイルスベクターは、既定の条件下で複製するよう操作されたアデノウイルスベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス初期領域によりコードされる遺伝子機能が、誘導性、抑制性、または組織特異的転写制御配列、例えば、プロモーターに機能的に連結され得る。条件付き複製性アデノウイルスベクターは、米国特許第5,998,205号にさらに記載されている。複製欠損性アデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクターが、そのアデノウイルスベクターにより感染させる典型的な宿主細胞、特にヒトの細胞において複製しないようにする1つまたは複数の複製に必須の遺伝子機能または領域の欠損の結果として、複製に必要とされるアデノウイルスゲノムの1つまたは複数の遺伝子機能または領域の補完を必要とするアデノウイルスベクターである。

好ましくは、アデノウイルスベクターは複製欠損性であり、複製欠損性アデノウイルスベクターは、増殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）アデノウイルスゲノムの1つまたは複数の領域の少なくとも1つの複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域（すなわち、E1～E4領域）のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域（すなわち、L1～L5領域）のみ、アデノウイルスゲノムの初期領域および後期領域の両方の1つまたは複数の複製に必須の遺伝子機能、または全てのアデノウイルス遺伝子（すなわち、高キャパシティアデノベクター（HC-Ad））に関して欠損性であり得る。例えば、Morsy et al. (1998) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 95: 965-976、Chen et al. (1997) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 94: 1645-1650、およびKochanek et al. (1999) HUM. GENE THER. 10(15):2451-9を参照のこと。複製欠損性アデノウイルスベクターの例は、米国特許第5,837,511号、同第5,851,806号、同第5,994,106号、同第6,127,175号、同第6,482,616号、および同第7,195,896号、ならびにPCT公開公報番号WO1994/028152、WO1995/002697、WO1995/016772、WO1995/034671、WO1996/022378、WO1997/012986、WO1997/021826、およびWO2003/022311に開示されている。

本発明の複製欠損性アデノウイルスベクターは、その複製欠損性アデノウイルスベクターに存在しないがウイルスの増殖に必要とされる遺伝子機能を、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルで提供する補完細胞株において産生され得る。そのような補完細胞株は公知であり、（例えば、Graham et al. (1977) J. GEN. VIROL. 36: 59-72に記載される）293細胞、（例えば、PCT公開公報番号WO1997/000326ならびに米国特許第5,994,128号および同第6,033,908号に記載される）PER.C6細胞、ならびに（例えば、PCT公開公報番号WO1995/034671およびBrough et al. (1997) J. VIROL. 71: 9206-9213に記載される）293-ORF6細胞を含むがこれらに限定されない。本発明の複製欠損性アデノウイルスベクターを産生する他の適切な補完細胞株は、その発現が宿主細胞におけるウイルス成長を阻害する導入遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを増殖するために作製された補完細胞株（例えば、米国特許公開第2008/0233650号を参照のこと）を含む。さらなる適切な補完細胞は、例えば、米国特許第6,677,156号および同第6,682,929号、ならびにPCT公開公報番号WO2003/020879に記載されている。アデノウイルスベクター含有組成物のための製剤はさらに、例えば、米国特許第6,225,289号および同第6,514,943号、ならびにPCT公開公報番号WO2000/034444に記載されている。

さらなる例示的なアデノウイルスベクターおよび／またはアデノウイルスベクターを生成もしくは増殖する方法は、米国特許第5,559,099号、同第5,837,511号、同第5,846,782号、同第5,851,806号、同第5,994,106号、同第5,994,128号、同第5,965,541号、同第5,981,225号、同第6,040,174号、同第6,020,191号、同第6,083,716号、同第6,113,913号、同第6,303,362号、同第7,067,310号、および同第9,073,980号に記載されている。

市販のアデノウイルスベクターシステムは、Thermo Fisher Scientificから入手可能なViraPower（商標）アデノウイルス発現システム、Agilent Technologiesから入手可能なAdEasy（商標）アデノウイルスベクターシステム、およびTakara Bio USA, Incから入手可能なAdeno-X（商標）発現システム3を含む。

ウイルスベクターの産生
ウイルスベクターを産生する方法は当技術分野で公知である。典型的に、関心対象のウイルスは、感染性ウイルス粒子の産生を可能にする適切な条件下でのトランスフェクトまたは感染させた宿主細胞の培養を含む従来技術を用いて適切な宿主細胞中で産生される。ウイルス遺伝子および／またはtRNAをコードする核酸は、プラスミドに組み込まれ得、従来的なトランスフェクションまたは形質転換技術を通じて宿主細胞に導入され得る。開示されるウイルスの産生に適した例示的な宿主細胞は、HeLa、Hela-S3、HEK293, 911、A549、HER96、またはPER-C6細胞等のヒト細胞株を含む。具体的な産生および精製条件は、用いられるウイルスおよび産生システムに依存して異なるであろう。

特定の態様においては、プロデューサー細胞が対象に直接投与され得るが、他の態様においては、産生後に、感染性ウイルス粒子が培養物から回収され、任意で精製される。典型的な精製工程は、プラーク精製、遠心分離、例えば、塩化セシウム勾配遠心分離、清澄化、酵素処理、例えば、ベンゾナーゼまたはプロテアーゼ処理、クロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはろ過工程を含み得る。

IV. 薬学的組成物
治療的使用のために、tRNAおよび／または発現ベクターは、好ましくは、薬学的に許容されるキャリアと組み合わされる。「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／危険比の下、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、物質、組成物、および／または投薬形態を表す。

「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書で使用される場合、合理的な利益／危険比の下、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、緩衝剤、キャリア、および賦形剤を表す。薬学的に許容されるキャリアは、任意の標準的な薬学的キャリア、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）、および様々なタイプの湿潤剤を含む。組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。キャリア、安定化剤およびアジュバントの例については、例えば、Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]を参照のこと。薬学的に許容されるキャリアは、薬学的投与に適合する緩衝剤、溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。

特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、オスモル濃度、粘性、明瞭性、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸収または浸透性を変化させる、維持するまたは保存するための製剤材料を含有し得る。そのような態様において、適切な製剤材料は、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌物質；抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；バルク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン）；フィラー；単糖；二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色、芳香および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート20、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；等張性増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントを含むがこれらに限定されない（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)を参照のこと）。

特定の態様において、薬学的組成物は、ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子、リポソーム、またはミセルを含有し得る（Anselmo et al. (2016) BIOENG. TRANSL. MED. 1: 10-29を参照のこと）。特定の態様において、組成物は、ナノ粒子または、例えば米国特許公開第2017/0354672号に記載される、アミノ脂質送達化合物を含まない（または実質的に含まない、例えば、組成物は、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％または0.1％未満のそれらを含む）。特定の態様において、細胞に導入されるまたは対象に投与されるtRNAまたは発現ベクターは、別の部分、例えばキャリア粒子、例えばアミノ脂質粒子とコンジュゲートも結合もされていない。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、2つまたはそれ以上の部分に関して使用される場合、これらの部分が直接的にまたは連結剤として機能する1つもしくは複数の追加の部分を介してのいずれかで相互に物理的に結合または接続され、構造物が使用される条件、例えば生理学的条件下でこれらの部分が物理的結合状態を維持するよう十分安定である構造物を形成することを意味する。典型的に、これらの部分は、1つもしくは複数の共有結合によってまたは特異的結合を伴う機構によってのいずれかにより付加される。あるいは、十分数の弱い相互作用が、部分が物理的結合を維持するのに十分な安定性を提供し得る。

特定の態様において、薬学的組成物は、持続または制御送達製剤を含有し得る。持続または制御送達手段、例えば、リポソームキャリア、生物腐食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ注射物を配合する技術もまた、当業者に公知である。持続放出調製物は、例えば、成形物、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の多孔性ポリマー微粒子、または半透過性ポリマーマトリクスを含み得る。持続放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、エチレン酢酸ビニル、またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含み得る。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知任意の様々な方法により調製され得るリポソームを含み得る。

本明細書に開示されるtRNAおよび／または発現ベクターを含有する薬学的組成物は、投薬単位形態で提供され得、任意の適切な方法により調製され得る。薬学的組成物は、その意図されている投薬経路に適合するよう配合されるべきである。投与経路の例は、静脈内（IV）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、髄腔内および直腸投与である。特定の態様において、tRNAおよび／または発現ベクターは、髄腔内投与される。特定の態様において、tRNAおよび／または発現ベクターは、注射により投与される。有用な製剤は、薬学分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)を参照のこと。非経口投与に適した配合成分は、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、EDTA；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および等張性調節剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含む。

静脈内投与の場合、適切なキャリアは、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む。キャリアは、製造および保管条件下で安定であるべきであり、かつ微生物に対して保護されるべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。

一般に、核酸分子を送達する任意の方法を、tRNAと共に使用するのに適合させることができる（例えば、Akhtar et al. (1992) TRENDS CELL. BIOL. 2(5):139-144およびPCT公開公報番号WO94/02595を参照のこと）。tRNAは、インビボでのエンドおよびエキソヌクレアーゼによるtRNAの急速な分解を防ぐよう修飾され得る、あるいは薬物送達システムを用いて送達され得る。tRNA分子は、細胞取り込みを強化し、分解を防ぐよう、親油性基、例えばコレステロールへの化学的コンジュゲートにより修飾され得る。tRNA分子はまた、アプタマーにコンジュゲートまたはそれ以外の方法で結合され得る。tRNAはまた、薬物送達システム、例えば、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムを用いて送達され得る。正に荷電したカチオン性送達システムは、（負に荷電した）tRNA分子の結合を促進し、また細胞によるtRNAの効率的取り込みを可能にするよう、負に荷電した細胞膜との相互作用を強化する。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、RNA、例えばtRNAに結合されるか、またはRNAを包囲する小胞もしくはミセル（例えば、Kim et al. (2008) JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE 129(2):107-116を参照のこと）を形成するよう誘導されるかのいずれかであり得る。カチオン性RNA複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Sorensen et al. (2003) J. MOL. BIOL 327:761-766；Verma et al. (2003) CLIN. CANCER RES. 9:1291-1300；Arnold et al. (2007) J. HYPERTENS. 25:197-205を参照のこと）。RNA、例えばtRNAの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例は、DOTAP（Sorensen et al. (2003) 前記；Verma et al. (2003), 前記）、オリゴフェクタミン、固相核酸脂質粒子（Zimmermann et al. (2006) NATURE 441:111-114）、カルジオリピン（Chien et al. (2005) CANCER GENE THER. 12:321-328; Pal et al. (2005) INT J. ONCOL. 26:1087-1091）、ポリエチレンイミン（Bonnet et al. (2008) PHARM. RES. 25(12):2972-82；Aigner (2006) J. BIOMED. BIOTECHNOL. 71659）、Arg-Gly-Asp（RGD）ペプチド（Liu (2006) MOL. PHARM. 3:472-487）、およびポリアミドアミン（Tomalia et al. (2007) BIOCHEM. SOC. TRANS. 35:61-67；Yoo et al. (1999) PHARM. RES. 16:1799-1804）を含む。特定の態様において、tRNAは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。RNAおよびシクロデキストリンの投与方法および薬学的組成物は、米国特許第7,427,605号において見出され得る。

薬学的製剤は、好ましくは、滅菌性である。滅菌は、任意の適切な方法、例えば、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、ろ過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。

本明細書に記載される組成物は、局所的または全身的に投与され得る。投与は、通常、非経口投与であろう。好ましい態様において、薬学的組成物は皮下投与され、さらにより好ましい態様においては静脈内投与される。非経口投与のための調製物は、滅菌性の、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。

一般に、活性成分、例えば、tRNAおよび／または発現ベクターの治療有効量は、0.1 mg/kg～100 mg/kg、例えば、1 mg/kg～100 mg/kg、1 mg/kg～10 mg/kgの範囲である。特定の態様において、ウイルス発現ベクターの治療有効量は、10²～10¹⁵プラーク形成単位（pfu）、例えば、10²～10¹⁰、10²～10⁵、10⁵～10¹⁵、10⁵～10¹⁰、または10¹⁰～10¹⁵プラーク形成単位の範囲である。投与される量は、処置される疾患または症状のタイプおよび程度、患者の全般的健康、抗体のインビボ効能、薬学的配合、ならびに投与経路等の変動要因に依存し得る。初期用量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上限レベルを超えて増量され得る。あるいは、初期用量は、その最適量よりも少ないものであり得、その一日用量は、処置過程の間に徐々に増量され得る。ヒト用量は、例えば、0.5 mg/kg～20 mg/kgで実施されるよう設計された従来的な第I相用量漸増試験において最適化され得る。投薬頻度は、投与経路、投薬量、血清半減期、および処置される疾患等の要因に依存して異なり得る。例示的な投薬頻度は、1日1回、1週間に1回および2週間に1回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。特定の態様において、ポリペプチドおよび／または多量体タンパク質は凍結乾燥され、その後、投与時に緩衝化生理食塩水で再構成される。

特定の態様において、tRNAまたは発現ベクターは、別の部分、例えば、キャリア粒子、例えば、アミノ脂質粒子にコンジュゲートも結合もされていない。特定の態様において、tRNAまたは発現ベクターは、ナノ粒子を欠く投薬形態で細胞に導入されるまたは対象に投与される。特定の態様において、tRNAまたは発現ベクターは、例えば米国特許公開第2017/0354672号に記載される、アミノ脂質送達化合物を欠く投薬形態で細胞に導入されるまたは対象に投与される。

V. 治療的使用
本明細書に開示される組成物および方法は、対象において未成熟終止コドン（PTC）媒介障害を処置するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「PTC媒介障害」という用語は、遺伝子内のPTCにより媒介される、亢進される、悪化する、もしくはそれ以外の様式で促進される、または遺伝子内のPTCに関連する障害を表す。

本発明は、その必要がある対象においてPTC媒介障害を処置する方法を提供する。この方法は、対象においてPTC媒介障害を処置するために、有効量のtRNAおよび／または発現ベクター、例えば、本明細書に開示されるtRNAおよび／または発現ベクターを、単独でまたは別の治療剤と組み合わせてのいずれかで対象に投与する工程を含む。

特定の態様において、未成熟終止コドン媒介障害は、以下の表5に列挙される障害である、および／または未成熟終止コドンを有する遺伝子は、以下の表5の対応する行に列挙される遺伝子である。

特定の態様において、未成熟終止コドン媒介障害は、以下の表6に列挙される障害である、および／または未成熟終止コドンを有する遺伝子は、以下の表6の対応する行に列挙される遺伝子である。

特定の態様において、PTC媒介障害はてんかん（例えば、ドラベ症候群）であり、前記方法は、対象におけるけいれん頻度、けいれん重篤度、および／または認知機能障害を軽減する。例えば、特定の態様において、前記方法は、例えば1日、1週間、または1ヵ月の期間、対象におけるけいれん頻度を少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％軽減する。特定の態様において、前記方法は、例えば1日、1週間、または1ヵ月の間、けいれん重篤度を50％軽減する。

特定の態様において、PTC媒介障害はドラベであるおよび／または未成熟終止コドンを有する遺伝子はSCN1Aである。特定の態様において、SCN1A遺伝子内の未成熟終止コドンは、c.5745C>G、c.5713G>T、c.5701C>T、c.5677C>T、c.5641C>T、c.5629C>T、c.5623C>T、c.5503A>T、c.5473G>T、c.5437G>T、c.5428C>T、c.5403G>A、c.5402G>A、c.5383G>T、c.5371G>T、c.5049T>G、c.4921G>T、c.4900C>T、c.4873C>T、c.4779del、c.4778G>A、c.4774G>T、c.4761T>G、c.4648G>T、c.4540C>T、c.4516A>T、c.4514C>A、c.4508T>G、c.4488C>G、c.4471G>T、c.4300A>T、c.4269G>A、c.4268G>A、c.4233T>A、c.4222G>T、c.4191G>A、c.4190G>A、c.4186C>T、c.4159A>T、c.4155C>A、c.3964del、c.3952C>T、c.3825G>A、c.3824G>A、c.3819G>A、c.3818G>A、c.3795T>A、c.3789T>G、c.3779G>A、c.3750C>G、c.3724G>T、c.3700C>T、c.3697C>T、c.3657dup、c.3624G>A、c.3604C>T、c.3582G>A、c.3578G>A、c.3574C>T、c.3463C>T、c.3454del、c.3424G>T、c.3422C>A、c.3406G>T、c.3328G>T、c.3273C>A、c.3262G>T、c.3073C>T、c.3060T>A、c.2844T>A、c.2749C>T、c.2695C>T、c.2645T>A、c.2560C>T、c.2551C>T、c.2546C>A、c.2462G>A、c.2298del、c.2228G>A、c.2181G>A、c.2180G>A、c.2101C>T、c.2038A>T、c.1958T>A、c.1837C>T、c.1834C>T、c.1804G>T、c.1795G>T、c.1738C>T、c.1702C>T、c.1660C>T、c.1624C>T、c.1516C>T、c.1378C>T、c.1363C>T、c.1354A>T、c.1348C>T、c.1345G>T、c.1344dup、c.1306G>T、c.1278C>A、c.1278C>G、c.1151G>A、c.1129C>T、c.1118T>A、c.942del、c.751del、c.644T>A、c.327C>G、c.249C>A、c.121A>T、c.4846_4850dup、c.4787_4788del、c.4578_4612dup、c.4211_4212del、c.4125_4130delinsATAATCATACTGATTGCCTAAAACTAAT、c.3690_3693del、c.3338_3339del、c.1247_1248insGTAGA、c.825_826insGTATA、およびc.278_279dupから選択される変異、または変異の組み合わせによりもたらされる。特定の態様において、SCN1A遺伝子内の未成熟終止コドンは、c.58G>T、c.575G>A、c.664C>T、c.962C>G、c.1095dupT、c.1129C>T、c.1315C>T、c.1348C>T、c.1366G>T、c.1492A>T、c.1537G>T、c.1624C>T、c.1738C>T、c.1804G>T、c.1837C>T、c.2134C>T、c.2370T>A、c.2495G>A、c.2593C>T、c.2635delC、c.2904C>A、c.3295G>T、c.3311C>A、c.3452C>G、c.3637C>T、c.3656G>A、c.3733C>T、c.3783C>A、c.3829C>T、c.3985C>T、c.4359T>G、c.4547C>A、c.4573C>T、c.4721C>G、c.4954G>T、c.5641G>T、c.5656C>T、およびc.5734C>Tから選択される変異、または変異の組み合わせによりもたらされる。特定の態様において、SCN1A遺伝子内の未成熟終止コドンは、c.664C>T、c.1129C>T、c.1492A>T、c.1624C>T、c.1738C>T、c.1837C>T、c.2134C>T、c.2593C>T、c.3637C>T、c.3733C>T、c.3985C>T、c.4573C>T、c.5656C>T、およびc.5734C>Tから選択される変異によりもたらされる。特定の態様において、SCN1A遺伝子内の未成熟終止コドンは、c.1738C>Tおよびc.3985C>Tから選択される変異によりもたらされる。

特定の態様において、SCN1A遺伝子内の未成熟終止コドンは、表7に示される変異、または表7に示される変異の組み合わせによりもたらされる。

遺伝子、例えばSCN1A遺伝子内に未成熟終止コドンを生じる例示的な変異を含む、さらなる例示的な変異は、ClinVar（ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/clinvar/で利用可能)、“A catalog of SCN1A variants” Lossin et al. (2009) BRAIN DEV. 2009 31(2):114-30、SCN1A Registry（ワールドワイドウェブscn1a.net/scn1a-registry/で利用可能）、SCN1A Mutation Database（ワールドワイドウェブgzneurosci.com/scn1adatabaseで利用可能）、およびLeiden Open Variation Database（LOVD v.3.0；ワールドワイドウェブdatabases.lovd.nl/shared/genes/SCN1Aで利用可能）において見出すことができる。それ以外のことが示されていない限り、本明細書に記載されるあらゆるSCN1A変異は、SCN1aアイソフォーム1（NCBI参照配列NM_001165963, SEQ ID NO:863）に対するものである。

別の局面において、本発明は、その必要がある対象においてドラベ症候群を処置する方法を提供し、該対象は、表7の行に示される変異を有するSCN1A遺伝子を有し、該方法は、有効量の、該変異と同じ表7中の行に示されるサプレッサークラスのサプレッサーtRNA、または該tRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、該対象に投与する工程を含む。表7で使用される「サプレッサークラス」（例えば、Arg>TGA）は、サプレッサーtRNAの由来となった内因性tRNAのタイプ（例えば、アルギニンtRNA）および該サプレッサーtRNAにより認識される終止コドン（例えば、TGA）を表す。例示的なArg>TGAサプレッサーtRNAは、SEQ ID NO:6～9、11、16～18、19～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含むtRNAを含む。例示的なGln>TAAサプレッサーtRNAは、SEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含むtRNAを含む。例示的なGln>TAGサプレッサーtRNAは、SEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含むtRNAを含む。

例えば、特定の態様において、前記対象は、c.664C>T、c.3637C>T、c.3733C>T、c.2134C>T、およびc.1837C>Tから選択される未成熟終止コドンを有するSCN1A遺伝子を有し、前記方法は、有効量の、SEQ ID NO:6～9、11、16～18、19～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含むサプレッサーtRNAを、前記対象に投与する工程を含む。特定の態様において、前記対象は、c.3607C>T、c.2782C>T、c.3829C>T、およびc.2893C>Tから選択される未成熟終止コドンを有するSCN1A遺伝子を有し、前記方法は、有効量の、SEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含むサプレッサーtRNAを、前記対象に投与する工程を含む。特定の態様において、前記対象は、c.3106C>T、c.3496C>T、c.5662C>T、c.5461C>T、およびc.3730C>Tから選択される未成熟終止コドンを有するSCN1A遺伝子を有し、前記方法は、有効量の、SEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含むサプレッサーtRNAを、前記対象に投与する工程を含む。

遺伝子がSCN1A遺伝子である特定の態様において、tRNAにより生成されるSCN1A遺伝子産物は、機能性SCN1A遺伝子産物である。特定の態様において、機能性SCN1A遺伝子産物は、短縮SCN1A遺伝子産物よりも高い活性、例えば、高い電位開口型ナトリウムチャネル活性を有する。特定の態様において、前記方法は、細胞、組織、または対象において電位開口型ナトリウムチャネル活性を、tRNAを有さない細胞、組織、または対象との比較で、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約100％、約110％、約120％、約130％、約140％、約150％、約160％、約170％、約180％、約190％、約200％、約250％、約300％、約350％、約400％、約450％、約500％、約600％、約700％、約800％、約900％、または約1000％増加させる。特定の態様において、前記方法は、細胞、組織、または対象において電位開口型ナトリウムチャネル活性を、tRNAを有さない細胞、組織、または対象との比較で、約20％～約200％、約20％～約180％、約20％～約160％、約20％～約140％、約20％～約120％、約20％～約100％、約20％～約80％、約20％～約60％、約20％～約40％、約40％～約200％、約40％～約180％、約40％～約160％、約40％～約140％、約40％～約120％、約40％～約100％、約40％～約80％、約40％～約60％、約60％～約200％、約60％～約180％、約60％～約160％、約60％～約140％、約60％～約120％、約60％～約100％、約60％～約80％、約80％～約200％、約80％～約180％、約80％～約160％、約80％～約140％、約80％～約120％、約80％～約100％、約100％～約200％、約100％～約180％、約100％～約160％、約100％～約140％、約100％～約120％、約120％～約200％、約120％～約180％、約120％～約160％、約120％～約140％、約140％～約200％、約140％～約180％、約140％～約160％、約160％～約200％、約160％～約180％、または約180％～約200％増加させる。電位開口型ナトリウムチャネル活性は、例えばKalume et al. (2007) J. NEUROSCI. 27(41):11065-74、Yu et al. (2007) NAT. NEUROSCI. 9(9): 1142-9、およびHan et al. (2012) NATURE 489(7416): 385-390に記載されるような、当技術分野で公知の任意の方法により測定され得る。

特定の態様において、機能性SCN1A遺伝子産物はNa_v1.1タンパク質である。特定の態様において、機能性SCN1A遺伝子産物は、（各々、SCN1Aの異なるアイソフォームに対応する）以下のアミノ酸配列の任意の1つのアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列の任意の1つに対して80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、該配列から本質的になる、または該配列からなる：

「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、有益または所望の効果を発揮するのに十分な活性剤（例えば、本発明に従うtRNAもしくは発現ベクターまたは併用療法における第2の活性剤）の量を表す。有効量は、1または複数回の投与、適用、または投薬で投与され得、特定の配合または投与経路に限定されることを意図していない。

本明細書で使用される場合、「処置（treat）」、「処置（treating）」および「処置（treatment）」は、対象、例えばヒトにおける疾患の処置を意味する。これは、（a）疾患を抑制すること、すなわち、その進展を止めること；および（b）疾患を緩和すること、すなわち、疾患状態の退行をもたらすこと、を含む。本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載される方法および組成物により処置される生物を表す。そのような生物は、好ましくは、哺乳類（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）を含むがこれらに限定されず、より好ましくはヒトを含む。

本明細書に記載される方法および組成物は、単独でまたは他の治療剤および／もしくは治療様式と組み合わせて使用され得る。「組み合わせて」投与されるという用語は、本明細書で使用される場合、患者に対する処置の効果がある時点で重複するよう、対象が疾患を患っている間に2つ（またはそれ以上の）異なる処置が対象に送達されることを意味すると理解される。特定の態様において、1つの処置の送達は、投与の観点で重複がみられるよう、第2の処置の送達が始まったときでさえも行われている。これはときに、本明細書で、「同時（simultaneous）」または「同時（concurrent）送達」と称される。他の態様において、1つの処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終了する。いずれかの例の特定の態様において、処置は、投与が組み合わされたという理由で、より効果的である。例えば、第2の処置は、その第2の処置が第1の処置の非存在下で投与された場合にみられるよりも効果的である、例えば、より少ない第2の処置により同等の効果がみられる、もしくは第2の処置は、症状をより大きく減少させる、または第1の処置についても同様の状況がみられる。特定の態様において、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメータの減少が、一方の処置が他方の非存在下で送達された場合に観察されるよりも大きくなるような送達である。2つの処置の効果は、部分的に付加的であり得る、全体として付加的であり得る、または付加的を超えるものであり得る。送達は、送達される第1の処置の効果が、第2の処置が送達される際に依然として検出可能であるような送達であり得る。

特定の態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、1つまたは複数の追加の治療剤、例えば、DIACOMIT（登録商標）（スチリペントール）、EPIODOLEX（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ONFI（登録商標）（クロバザム）、TOPAMAX（登録商標）（トピラマート）、フェンフルラミン、またはバルプロ酸と組み合わせて投与される。例えば、ドラベ症候群の処置の間に、本明細書に記載される方法または組成物は、1つまたは複数の追加の治療剤、例えば、DIACOMIT（登録商標）（スチリペントール）、EPIODOLEX（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ONFI（登録商標）（クロバザム）、TOPAMAX（登録商標）（トピラマート）、フェンフルラミン、またはバルプロ酸と組み合わせて投与される。

組成物が特定の成分を有する、含む（including）、もしくは含む（comprising）と記載される、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む（including）、もしくは含む（comprising）と記載される本明細書の全体にわたっては、さらに、言及されている成分から本質的になる、または言及されている成分からなる本発明の組成物が存在すること、および言及されている処理工程から本質的になる、または言及されている処理工程からなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することが、想定されている。

要素または成分が、言及されている要素もしくは成分のリストに含まれるおよび／または要素もしくは成分のリストから選択されると述べられている例において、該要素もしくは成分は、言及されている要素もしくは成分の任意の1つであり得ること、または該要素もしくは成分は、言及されている要素もしくは成分の2つもしくはそれ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。

さらに、本明細書に記載される組成物または方法の要素および／または特徴は、本明細書に明示されているか暗示されているかによらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な様式で組み合わされ得ることが理解されるべきである。例えば、特定の化合物に対する参照がなされている場合、その化合物は、文脈からそうでないことが理解されない限り、本発明の組成物の様々な態様においておよび／または本発明の方法において使用することができる。別の言葉でいうと、本願において、態様は、明確かつ簡潔な例を記述および描写できるように記載され示されているが、態様は本教示および本発明から逸脱することなく様々に組み合わされ得るまたは分離され得ることが意図されており、かつそのように理解されるであろう。例えば、本明細書に記載され示されている全ての特徴は、本明細書に記載され示されている本発明の全ての局面に適用可能であり得ることが理解されるであろう。

「～の少なくとも1つ」という表現は、文脈および用法からそうでないことが理解されない限り、その表現の後に言及されている対象物の各々個々および言及されている対称物の2つまたはそれ以上の様々な組み合わせを含むと理解されるべきである。3つまたはそれ以上の言及されている対象物との関係でいう「および／または」という表現も、文脈からそうでないことが理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。

「含む（include）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（have）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」、「含有する（containing）」という用語の使用は、それらの文法上の同等表現を含めて、そうでないことが具体的に言及されていない限りまたはそうでないことが文脈から理解されない限り、一般にオープンエンド型かつ非限定的である、例えば、追加の言及されていない要素または工程を排除しないことが理解されるべきである。

数量値の前に「約」という用語が使用されている場合、本発明は、そうでないことが具体的に言及されていない限り、その特定の数量値自体も含む。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、そうでないことが示されていない限りまたはそうでないと推認されない限り、表示されている値からの±10％のばらつきを表す。

工程の順番または特定の行為を実施する順番は、本発明が実行可能である限り、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つまたはそれ以上の工程または行為は、同時に実施され得る。

本明細書における任意かつ全ての例、または例示語、例えば、「例えば」または「～を含む」の使用は、本発明をより十分に説明することを意図しているにとどまり、特許請求の範囲に記載されていない限り、本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書中のいかなる語も、本発明の実施に必須である特許請求の範囲に記載されていない何らかの要素を示すものと解釈されるべきでない。

以下の実施例は、例にすぎず、いかなる様式によっても本発明の範囲または内容を限定することを意図していない。

実施例1
この実施例は、患者集団におけるナンセンス変異頻度の分析を記載する。

図3は、「病原性（pathogenic）」、「病原性の可能性あり（likely pathogenic）」、および「病原性／病原性の可能性あり」とアノテートされたClinVarへの全体登録に基づく各ナンセンス変異の相対的シェアを示すプロットである（暗色のカラム）。累積密度プロット（薄灰色の領域）は、最も蔓延しているものから始まり最も蔓延していないものへと続く、各ナンセンス変異を標的とするサプレッサーtRNAの組み合わせを用いて処置することができる可能性がある、ナンセンス変異に起因する障害を有する総患者集団の区分を表している。

図4は、ClinVarおよび広州SCN1A変異データベースにおいて見いだされるSCN1A患者データからの各潜在的ナンセンス変異の相対シェアを示すプロットである。「病原性」、「病原性の可能性あり」、または「病原性／病原性の可能性あり」とアノテートされた全てのClinVarナンセンス変異が含まれる。「幼児における重度ミオクローヌスてんかん」とタグ付けされた全ての広州データベースナンセンス変異が含まれる。

図5は、ライデンLOVD変異データベースからのヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）症例に関してタグ付けされたナンセンス変異の細分化を示すプロットである。

まとめると、これらのデータは、ナンセンス変異に起因する障害を有する総患者集団の範囲を最大化するよう単一の発現ベクター上にコードされ得る2つまたは3つのサプレッサーtRNAの組み合わせを選択する根拠を提供する。

実施例2
この実施例は、3つの異なる未成熟終止コドン（PTC）のリードスルーを促進する3つのサプレッサーtRNAをコードする発現ベクターの作製を記載する。そのような発現ベクターの模式図は図6に示されている。

サプレッサーtRNAのリードスルー活性は、蛍光発生に必要とされる様々なアミノ酸コドンの代わりにPTC（TAG、TAA、またはTAG）を有するEGFPレポーターを含む構築物を用いて測定した。図7は、アルギニンコドン（CGA）の代わりにPTC（TGA）を有する例示的なEGFPレポーターおよびそれに関連するサプレッサーtRNAを示す。このアプローチは、EGFPオープンリーディングフレーム内の適当なアミノ酸コドンを終止コドンに変換することにより他のクラスのサプレッサーtRNA用のEGFPレポーター構築物を生成するよう一般化することができる。

アルギニン→TGA（R＞TGA）サプレッサー（SEQ ID NO:18を含む）、グルタミン→TAA（Q＞TAA）サプレッサー（SEQ ID NO:39を含む）、およびグルタミン→TAG（Q＞TAG）サプレッサー（SEQ ID NO:178を含む）をコードする（「トリストップ」サプレッサーと命名された）単一の発現ベクターの活性を、（i）このトリストップサプレッサーをコードするプラスミドおよび（ii）アルギニンコドン（CGA）の代わりにPTC（TGA）を有するEGFPレポーター、グルタミンコドン（CAG）の代わりにPTC（TAA）を有するEGFPレポーター、またはグルタミンコドン（CAG）の代わりにPTC（TAG）を有するEGFPレポーターのいずれかをコードするプラスミドを一過的に共トランスフェクトされたHEK293細胞において評価した。トリストップサプレッサーのリードスルー活性を、トリストップサプレッサーに含まれる3つの個々のサプレッサーをコードする個別の発現ベクター：アルギニン→TGA（R>TGA）サプレッサーのみベクター、グルタミン→TAA（Q>TAA）サプレッサーのみベクター、およびグルタミン→TAG（Q＞TAG）サプレッサーのみベクター、の活性と比較した。トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従ってLipofectamine 3000 Transfection Reagentを用いて行った。共トランスフェクションは、等量のサプレッサーtRNAプラスミドおよびEGFPレポータープラスミドを用いて行った。結果が図8（EGFPレポーター発現の蛍光画像）および図9（EGFP発現がフローサイトメトリーにより分析され、リードスルー活性がバックグラウンドを上回るEGFPを発現する生細胞の比率として表されている）に示されている。示されているように、各例において、トリストップ発現構築物はPTCのリードスルーを促進した。

細胞生存に対するトリストップサプレッサーの効果を、アルギニン→TGAサプレッサー（「R→TGA」）のみ、グルタミン→TAAサプレッサー（「Q→TAA」）のみ、およびグルタミン→TAGサプレッサー（「Q→TAG」）のみを含む個別の発現ベクターの効果と比較した。製造元のプロトコルに従ってLipofectamine 3000 Transfection Reagentを用いてHEK293細胞の一過的トランスフェクションを行い、細胞生存を、トランスフェクションから24時間後にPacific Blue Annexin V/SYTOX AADvanced Apoptosis Kit（Thermofisher）を用いて評価した。このキットは、紫色蛍光のPacific Blue色素にコンジュゲートされたアネキシンVを用いてアポトーシス細胞におけるホスファチジルセリンの放出を検出する。死細胞はSYTOX AADvanced染色を用いて検出する。染色後、アポトーシス細胞は紫色蛍光を示し、死細胞は赤色蛍光を示し、生細胞はほとんどまたは全く蛍光を示さない。製造元のプロトコルに従って染色を行い、細胞をフローサイトメトリーにより評価した。結果が図10に示されている。

まとめると、これらの結果は、トリストップサプレッサーtRNAが単一のサプレッサーtRNAのみを含む発現ベクターと同程度にナンセンス変異のリードスルーをもたらすことを示している。加えて、これらの結果は、トリストップサプレッサーtRNAを用いた処置が、個別のサプレッサーtRNAまたは対照ベクターと比較して細胞生存性の減少をともなわないことを示している。

参照による組み入れ
本明細書で参照されている特許および科学文献の各々の全開示は、全ての目的のために参照により組み入れられる。

等価物
本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなく他の具体的形態で具現化され得る。したがって前記態様は、あらゆる面で、例示的なものであり、本明細書に記載される発明に対する限定ではないとみなされるべきである。したがって本発明の範囲は、前記記載によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の趣旨およびその等価物の範囲内でなされる全ての変更が、それに包含されることが意図されている。

Claims

（a）TGA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第1のサプレッサーtRNA
をコードする、第1のヌクレオチド配列；
（b）TAG未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第2のサプレッサーtRNA
をコードする、第2のヌクレオチド配列；および
（c）TAA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第3のサプレッサーtRNA
をコードする、第3のヌクレオチド配列
を含む、発現ベクター。
第1のアミノ酸が、アルギニン、トリプトファン、システイン、セリン、グリシン、およびロイシンから選択される、請求項1記載の発現ベクター。
第1のアミノ酸が、アルギニンおよびトリプトファンから選択される、請求項2記載の発現ベクター。
第1のアミノ酸がアルギニンである、請求項3記載の発現ベクター。
第2のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、リジン、セリン、およびロイシンから選択される、請求項1～4のいずれか一項記載の発現ベクター。
第2のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、およびトリプトファンから選択される、請求項5記載の発現ベクター。
第2のアミノ酸がグルタミンである、請求項6記載の発現ベクター。
第3のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、およびロイシンから選択される、請求項1～7のいずれか一項記載の発現ベクター。
第3のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、およびチロシンから選択される、請求項8記載の発現ベクター。
第1のアミノ酸がアルギニンであり、かつ第2のアミノ酸がグルタミンである、請求項1～9のいずれか一項記載の発現ベクター。
第2のアミノ酸と第3のアミノ酸が同じである、請求項1～10のいずれか一項記載の発現ベクター。
第2および第3のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、およびロイシンから選択される、請求項11記載の発現ベクター。
（i）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がリジンである；
（ii）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミン酸である；
（iii）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がチロシンである；
（iv）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がロイシンである；
（v）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がトリプトファンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミン酸である；または
（vi）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がチロシンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミン酸である、
請求項1～10のいずれか一項記載の発現ベクター。
（i）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミンである；
（ii）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミン酸である；
（iii）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がリジンである；
（iv）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がトリプトファンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミンである；または
（v）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ第3のアミノ酸がグルタミンである、
請求項1～10のいずれか一項記載の発現ベクター。
（i）第1のアミノ酸がアルギニンであり、第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のアミノ酸がグルタミンである；
（ii）第1のアミノ酸がトリプトファンであり、第2のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ第3のアミノ酸がグルタミン酸である；
（iii）第1のアミノ酸がシステインであり、第2のアミノ酸がチロシンであり、かつ第3のアミノ酸がチロシンである；
（iv）第1のアミノ酸がセリンであり、第2のアミノ酸がリジンであり、かつ第3のアミノ酸がリジンである；
（v）第1のアミノ酸がグリシンであり、第2のアミノ酸がセリンであり、かつ第3のアミノ酸がセリンである；または
（vi）第1のアミノ酸がロイシンであり、第2のアミノ酸がロイシンであり、かつ第3のアミノ酸がロイシンである、
請求項1～12のいずれか一項記載の発現ベクター。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAが、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項1～15のいずれか一項記載の発現ベクター。
第1のアミノ酸がアルギニンであり、かつ第1のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:6～9、11、16～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1～16のいずれか一項記載の発現ベクター。
第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第2のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1～17のいずれか一項記載の発現ベクター。
第3のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の発現ベクター。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAをコードするヌクレオチド配列を1、2、3、4、または4超のコピー数で含む、請求項1～19のいずれか一項記載の発現ベクター。
表4に示されるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1～20のいずれか一項記載の発現ベクター。
SEQ ID NO:869～888から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項21記載の発現ベクター。
第1のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列、および第3のヌクレオチド配列が各々、表4に示されるヌクレオチド配列に機能的に連結されている、請求項1～22のいずれか一項記載の発現ベクター。
第1のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列、および第3のヌクレオチド配列が各々、SEQ ID NO:869～888から選択されるヌクレオチド配列に機能的に連結されている、請求項1～23のいずれか一項記載の発現ベクター。
ウイルスベクターである、請求項1～24のいずれか一項記載の発現ベクター。
前記ウイルスベクターがDNAウイルスベクターである、請求項25記載の発現ベクター。
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項25または26記載の発現ベクター。
請求項1～27のいずれか一項記載の発現ベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
（a）TGA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第1のサプレッサーtRNA；
（b）TAG未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第2のサプレッサーtRNA；および
（c）TAA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第3のサプレッサーtRNA
を含む、薬学的組成物。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAが、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項29記載の薬学的組成物。
第1のアミノ酸がアルギニンであり、かつ第1のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:6～9、11、16～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29または30記載の薬学的組成物。
第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第2のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29～31のいずれか一項記載の薬学的組成物。
第3のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29～32のいずれか一項記載の薬学的組成物。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAが、自然発生のヌクレオチド修飾を含む、請求項29～33のいずれか一項記載の薬学的組成物。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAが、5-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルバモイル-メチル-2-O-メチルウリジン、5-メトキシ-カルボニルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、1-メチルアデノシン、およびイノシンから選択される1つまたは複数のヌクレオチド修飾を含む、請求項29～34のいずれか一項記載の薬学的組成物。
前記発現ベクターまたはtRNAが、別の部分とコンジュゲートも結合もされていない、請求項28～35のいずれか一項記載の薬学的組成物。
前記発現ベクターまたはtRNAが、担体粒子とコンジュゲートも結合もされていない、請求項36記載の薬学的組成物。
前記担体粒子がアミノ脂質粒子である、請求項37記載の薬学的組成物。
ナノ粒子を含まない、請求項28～38のいずれか一項記載の薬学的組成物。
アミノ脂質送達化合物を含まない、請求項28～39のいずれか一項記載の薬学的組成物。
以下の工程を含む、未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させる方法：
有効量の請求項1～27のいずれか一項記載の発現ベクターまたは請求項28～40のいずれか一項記載の薬学的組成物を、細胞に接触させる工程であって、それによって、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする、工程。
以下の工程を含む、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させる方法：
有効量の以下：
（a）TGA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第1のサプレッサーtRNA
をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の発現ベクター；
（b）TAG未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第2のサプレッサーtRNA
をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の発現ベクター；および
（c）TAA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第3のサプレッサーtRNA
をコードするヌクレオチド配列を含む、第3の発現ベクター
を、細胞に接触させる工程であって、それによって、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする、工程。
以下の工程を含む、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを含有する遺伝子によりコードされる機能性遺伝子産物を哺乳動物細胞において発現させる方法：
有効量の以下：
（a）TGA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第1のサプレッサーtRNA；
（b）TAG未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第2のサプレッサーtRNA；および
（c）TAA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第3のサプレッサーtRNA
を、細胞に接触させる工程であって、それによって、遺伝子産物中の、そうでなければ未成熟終止コドンに起因して短縮遺伝子産物が生じる位置に、アミノ酸が組み込まれることを可能にする、工程。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAが、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項42または43記載の方法。
第1のアミノ酸がアルギニンであり、かつ第1のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:6～9、11、16～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項42～44のいずれか一項記載の方法。
第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第2のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項42～45のいずれか一項記載の方法。
第3のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項42～46のいずれか一項記載の方法。
前記遺伝子が、表5または表6に示される遺伝子である、請求項41～47のいずれか一項記載の方法。
前記遺伝子が、表5に示される遺伝子である、請求項48記載の方法。
前記遺伝子がSCN1Aまたはジストロフィンである、請求項41～49のいずれか一項記載の方法。
前記細胞がヒト細胞である、請求項41～50のいずれか一項記載の方法。
前記tRNAが前記細胞内でアミノアシル化される、請求項41～51のいずれか一項記載の方法。
その必要がある対象において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法であって、
該対象が、未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、
該方法が、
有効量の請求項1～27のいずれか一項記載の発現ベクターまたは請求項28～40のいずれか一項記載の薬学的組成物を、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程
を含む、
該方法。
その必要がある対象において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法であって、
該対象が、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、
該方法が、
有効量の以下：
（a）TGA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第1のサプレッサーtRNA
をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の発現ベクター；
（b）TAG未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第2のサプレッサーtRNA
をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の発現ベクター；および
（c）TAA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第3のサプレッサーtRNA
をコードするヌクレオチド配列を含む、第3の発現ベクター
を、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程
を含む、
該方法。
その必要がある対象において未成熟終止コドン媒介障害を処置する方法であって、
該対象が、第1、第2、および／または第3の未成熟終止コドンを有する遺伝子を有し、
該方法が、
有効量の以下：
（a）TGA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第1のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第1のサプレッサーtRNA；
（b）TAG未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第2のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第2のサプレッサーtRNA；および
（c）TAA未成熟停止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ第3のアミノ酸でアミノアシル化されることができる、第3のサプレッサーtRNA
を、該対象に投与する工程であって、それによって該対象において該障害を処置する、工程
を含む、
該方法。
第1、第2、および／または第3のサプレッサーtRNAが、表2または表3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項54または55記載の方法。
第1のアミノ酸がアルギニンであり、かつ第1のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:6～9、11、16～22、および35から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項54～56のいずれか一項記載の方法。
第2のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第2のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:178～182、186、および187から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項54～57のいずれか一項記載の方法。
第3のアミノ酸がグルタミンであり、かつ第3のサプレッサーtRNAが、SEQ ID NO:36～40、44、および45から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項54～58のいずれか一項記載の方法。
前記障害が、表5または表6に示される障害である、請求項53～59のいずれか一項記載の方法。
前記障害が、表5に示される障害である、請求項60記載の方法。
前記障害がドラベ症候群またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項53～61のいずれか一項記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項53～62のいずれか一項記載の方法。