KR20210040358A

KR20210040358A - 안젤만 증후군의 치료에서 mir-92a 또는 mir-145의 사용

Info

Publication number: KR20210040358A
Application number: KR1020217001109A
Authority: KR
Inventors: 매튜 듀링
Original assignee: 오비드 테라퓨틱스 인크.
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-04-13
Also published as: AU2019285298A1; US10704048B2; JP2021527087A; MX2020013667A; IL279391A; WO2019241624A1; EP3793567A1; US20190382761A1; CN112739353A; CA3103267A1; EP3793567A4; US20200332294A1; US11130952B2

Abstract

SNHG14 유전자의 활성(activity)을 음성(negatively) 조절하는(regulate) 마이크로RNA들의 발현이 안젤만 증후군의 치료에서 사용될 수 있다. 이러한 마이크로RNA들은, 예를 들어, 안젤만 증후군의 치료에서 사용을 위한, MIR-92a 및/또는 MIR-145, 더불어 그것의 유사체들(analogues) 및 변이체들(variants)을 포함한다. 예를 들어, AAV 벡터들과 같은 발현 벡터들은 안젤만 증후군의 치료를 위하여 타겟 조직들로 MIR-92a 및/또는 MIR-145의 도입(introduction)을 위하여 세포들을 형질도입하는데(transduce) 사용될 수 있다.

Description

안젤만 증후군의 치료에서 MIR-92A 또는 MIR-145의 사용

본 공개는 일반적으로 안젤만 증후군(Angelman Syndrome)의 치료에 사용을 위한 SNHG14 유전자의 활성을 음성(negatively) 조절하는 마이크로RNA들(micoRNAs)의 발현에 대한 것이다. 이러한 마이크로RNA들은, 예를 들어, 안젤만 증후군의 치료에 사용을 위하여, MIR-92a 및/또는 MIR-145 에 더하여 그것의 유사체들(analogues) 및 변이체들(variants)을 포함한다. 더 구체적으로, 본 공개는, 예를 들어, 안젤만 증후군의 치료를 위하여 타겟 조직으로 MIR-92a 및/또는 MIR-145의 도입(introduction)을 위하여 세포들을 형질도입하는데(transduce) 사용될 수 있는 AAV 벡터들과 같은, 발현 벡터들의 사용에 대한 것이다.

안젤만 증후군(Angelman syndrome)" (AS)은 심각한 발달지연(developmental delay) 또는 지적장애(intellectual disability), 심각한 언어장애(speech impairment), 보행 운동실조(gait ataxia) 및/또는 팔다리의 떨림(tremulousness of the limbs), 발작들(seizures), 소두증(microcephaly) 및 흥분(excitability), 미소(smiling), 물에 대한 친근감(affinity), 및 빈번한 웃음(frequent laughing)을 포함하는 부적절한 행복한 태도(inappropriate happy demeanor)에 의해 특징되는 신경발달 장애(neurodevelopmental disorder)이다. 소두증 및 발작들 또한 흔하다. 발달지연들은 나이(age) 육 개월 쯤에 처음 알아차려진다(noted); 그러나 안젤만 증후군의 독특한 임상적 특징들은 나이 한 살 이후까지 분명해지지 않고, 정확한 임상 진단이 명백하기 전에 몇 년이 걸릴 수 있다.

안젤만 증후군의 특유의 특징들 중 많은 것들이 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질(protein) 리가제(ligase) E3A (UBE3A) 유전자를 인코드(encodes)하는 UBE3A 로 불리는 유전자의 기능의 상실로 생긴다.(Kishino, T. et al. Nat Genet (1997) 12:385-395). 사람들은 보통 각 부모로부터 UBE3A 유전자의 한 개 카피(copy)를 물려받는다. 이 유전자의 카피들 둘 다 신체의 조직들 중 많은 것에서 턴 온(turned on) (활성(active)) 되지만, 그러나, 뇌의 특정 구역들(areas)에서는, 사람의 어머니로부터 물려받은 카피만이 (모계(maternal)의 카피) 활성(active)이다. 이 부모-특이적 유전자 활성화(activation)는 게놈 각인(genomic imprinting)이라 불리는 현상에 의하여 야기된다. UBE3A는 뇌에서 모계로(maternally) 각인되어, 그것은 모계의 염색체(maternal chromosome)로부터 거의 독점적으로(exclusively) 발현되지만 부계의 염색체(paternal chromosome)는 후성적으로(epigenetically) 침묵된다(silenced). (Albrecht, U. et al., Nat Genet (1997) 17:75-78). 만약 염색체 변화(change) 또는 유전자 돌연변이 때문에 UBE3A 유전자의 모계(maternal) 카피가 손실되면(lost), 사람은 뇌의 일부 부분들(parts)에서 유전자의 활성인(active) 카피들을 갖지 않을 것이다.

몇몇 다른 유전적 메커니즘들이 UBE3A 유전자의 모계 카피를 결실(delete) 또는 불활성화(inactivate) 시킬 수 있다. 안젤만 증후군의 대부분의 케이스들은 (약 70 퍼센트) 이 유전자를 포함하는 모계(maternal) 염색체 15 의 세그먼트(segment)가 결실될(deleted) 때 발생한다. 다른 케이스들에서 (약 11 퍼센트), 안젤만 증후군은 UBE3A 유전자의 모계 카피에서 돌연변이에 의하여 야기된다.

대신 UBE3A-ATS으로 알려진, 작은 핵인(Small nucleolar) RNA 숙주(host) 유전자(gene) 14 (SNHG14)는 UBE3A 유전자로 안티센스(antisense)를 확장하고(extends) 이렇게 하여 각인(imprinting) 및 부계(paternal) UBE3A 발현의 억제(suppression)에서 잠재적인(potential) 역할을 한다. 어떻게 UBE3A의 단백질 산물의 부족(insufficiency)이 안젤만 증후군에서 관찰되는 관찰된 신경발달(neurodevelopmental) 결손들(deficits)을 야기하는지에 대하여 많은 것들이 이해되어야 한다. 따라서, 안젤만 증후군으로 진단된 대상들을 치료하기 위한 개선된 및/또는 추가의 요법들(therapies)에 대한 필요성이 남아 있다.

관련된 출원에 대한 상호-참조

이 출원은 그 전체가 참조로 여기에 포함된, 2018년 6월 14일 출원된 U.S. Provisional Application No. 62/684,774에 대한 이익 및 우선권을 주장한다.

개요

SNHG14 유전자의 활성(activity)을 음성적으로(negatively) 조절하는 조성물의 유효량(effective amount)을 환자에게 전달(delivering)하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자에서 안젤만 증후군(Angelman Syndrome) (AS)을 치료하는 방법이 제공된다. 치료의 이러한 방법들은 환자의 중추신경계에서 마이크로RNA(microRNA)-145 및/또는 마이크로RNA-92a 분자들의 수준을 증가시키는 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함한다. 여기에 개시된 방법은 SNHG14 유전자의 활성을 음성적으로 조절하도록 설계된다.

환자의 중추신경계의 세포들에서 마이크로RNA-145 및/또는 마이크로RNA-92a 분자들의 수준을 증가시키는 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자에서 안젤만 증후군(Angelman Syndrome)을 치료하는 방법이 제공된다. 환자에게 마이크로RNA-145, pri-miRNA145 또는 pre-miRNA145 을 인코딩하는(encoding) 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자에서 안젤만 증후군(Angelman Syndrome)을 치료하는 방법이 제공된다. 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miRNA92a 를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자에서 안젤만 증후군을 치료하는 방법이 제공된다. 구현예들(embodiments)에서, 마이크로RNA-145 또는 마이크로RNA-92a의 증가된 수준들은 안젤만 증후군의 하나 이상의 증상(symptoms)에서 개선을 야기한다.

구현예들에서, 마이크로RNA-145, pri-miR145 또는 pre-miR145을 인코딩하는 벡터는 안젤만 증후군을 가진 환자에서 마이크로RNA-145의 증가된 수준들을 야기하고 장애(disorder)의 감소된 증상과 관련된다. 구현예들에서, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a 를 인코딩하는 벡터는 안젤만 증후군을 가진 환자에서 마이크로RNA-92a의 증가된 수준들을 야기하고 장애의 감소된 증상과 관련된다.

특정 측면들에서, 마이크로RNA-145, pri-miR145 또는 pre-miR145을 인코딩하는 핵산들을 포함하는 벡터(vector)는 마이크로RNA-145, pri-miR145 또는 pre-miR145을 인코딩하는 핵산에 작동적으로(operatively) 연결된(linked) 프로모터(promoter)를 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 우드척(woodchuck) 전사-후 조절 요소(post-transcriptional regulatory element) (WPRE)를 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 소(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(growth hormone polyadenylation sequence) (BGHpA)을 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 형광성(fluorescence) 리포터(reporter) 카세트(cassette)를 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스이다. 구현예들에서, 벡터는 렌티바이러스(lentivirus)이다. 구현예들에서, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a을 인코딩하는 핵산에 작동적으로(operatively) 연결된(linked) 프로모터를 포함한다. 구현예들에서, 마이크로RNA-92a를 인코딩하는 핵산은 마이크로RNA-92a-3p이다. 구현예들에서, 벡터는 우드척 전사-후 조절 요소 (WPRE)를 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 소(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(growth hormone polyadenylation sequence) (BGHpA)을 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 형광성(fluorescence) 리포터 카세트를 포함한다. 구현예들에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스이다. 구현예들에서, 벡터는 렌티바이러스(lentivirus)이다. 구현예들에서, 벡터는 AAV 벡터이다.

구현예들에서, 벡터는 환자의 중추신경계에서 타겟(target) 위치(location)로 전달된다(delivered). 구현예들에서, 타겟 위치는 환자의 뇌이다. 구현예들에서, 벡터의 투여(administration)의 루트(route)는 경구(oral), 구강(buccal), 설하(sublingual), 직장(rectal), 국소(topical), 비강 내(intranasal), 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral)이다. 구현예들에서, 벡터는 타겟 위치에 직접적으로 투여된다.

구현예들에서, 초음파(ultrasound)는 환자의 뇌에서 타겟 위치에 적용되어 타겟 위치에서 환자의 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)의 투과성(permeability)을 향상시키고, 이때 마이크로RNA-145 또는 마이크로RNA-92a가 타겟 위치로 전달된다.

상세한 설명

SNGH14 유전자의 활성을 음성적으로(negatively) 조절하는(regulate) 조성물들을 투여하는 단계를 포함하는 안젤만 증후군을 치료하기 위한 방법들 및 조성물들이 여기에서 제공된다. 이러한 조성물들은, 예컨대, 안젤만 증후군을 갖는 환자에게, 마이크로RNA-145, pri-miR145 또는 pre-miR145 를 포함한다. 또한 안젤만 증후군을 갖는 환자에게, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a 을 투여하는 단계를 포함하는 안젤만 증후군을 치료하기 위한 방법들 및 조성물들이 여기에서 기재된다.

구현예들에서, 마이크로RNA-145, pri-miR145 또는 pre-miR145 를 인코딩하는(encoding) 벡터들이 제공된다. 구현예들에서, 마이크로RNA-145, pri-miR145 또는 pre-miR145 을 인코딩하는 벡터들이 안젤만 증후군을 갖는 환자에게 투여되고 이때 환자는 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 보인다. 구현예들에서, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a를 인코딩하는 벡터들이 제공된다. 구현예들에서, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a 를 인코딩하는 벡터들이 안젤만 증후군을 갖는 환자에게 투여되고 이때 환자는 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 보인다.

마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a, 및/또는 pre-miR92a는, 마이크로RNA 또는 마이크로RNA들로 여기에서 총괄하여(collectively) 불린다. 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a, 및/또는 pre-miR92a의 환자에게 투여(administration)는 마이크로RNA 치료(treatment)로 여기에서 총괄하여 불린다. 마이크로RNA 치료는 세포에서 각각의 활성(active) 마이크로RNA 분자들의 수준을 증가시킨다. 증가는 마이크로RNA를 세포에 직접적으로 제공함으로써 일어날 수 있고, 또는 벡터를 통하는 것과 같이, 세포에 마이크로RNA 를 간접적으로 제공함으로써 일어날 수 있다. 마이크로RNA는 추가의 서열들을 또한 포함하는 RNA 또는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 예컨대, 환자의 뇌인, CNS의 세포들에서 각각의 활성 마이크로RNA 분자들의 수준의 증가는 안젤만 증후군의 하나 이상의 증상의 개선과 관련된다.

하나 이상의 pri-miRNA(들)이 여기에 기재된 조성물들 및 방법들에서 사용될 수 있다. pri-mRNA의 임의의 적합한 형태가 사용될 수 있다. pri-mRNA(들)은 세포 내에서(intracellularly) 처리될(processed) 수 있고 그리고 miRNA의 기능(function)을 얻기 위하여 작용할(act) 수 있어, 예컨대 pre-mRNA(들)로 그리고 그 다음 성숙한(mature) 형태로 변환된다(converted). 그렇지 않으면, miRNA는 초기에(initially) miRNA 전구체(precursor)일 수 있다. 구현예들에서, 조성물들 및 방법들은 다이서(Dicer)라 불리는 RNAse III 타입(type) 이중 가닥(double stranded) 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 절단(cleavage)을 겪어, 크기가 약 20-25 뉴클레오타이드들인 불완전한(imperfect) miRNA:miRNA* 듀플렉스(duplex)를 야기하는(resulting in) pre-miRNA를 포함한다. 이 듀플렉스는 성숙한 miRNA 가닥(strand) 및 그것의 반대의(opposite) 상보적인(complementary) miRNA* 가닥을 포함한다. 하나 이상의 pre-miRNA(들)이 여기에서 기재된 조성물들 및 방법들에서 사용될 수 있다. pre-miRNA는 miRNA을 위한 기능을 얻기 위하여 작용할 수 있다. pre-miRNA의 임의의 적합한 형태가 사용될 수 있다. 여기에 기재된 조성물들 및 방법들의 miRNA가 성숙한 miRNA일 수 있다는 것이 또한 고려된다.

마이크로RNA들은 비-발현(non-expression) 벡터 또는 발현(expression) 벡터 방식들(modalities)로 세포들에 전달(deliver)될 수 있다. 발현 벡터 및 벡터는 여기에서 교환가능하게 사용된다. 구현예들에서, 마이크로RNA는 그 다음의 단계에서 사용 전에 단리(isolated)되거나 또는 정제될(purified) 수 있다. 마이크로RNA들은 세포에 도입 전에 단리되거나 또는 정제될 수 있다. 세포에 "도입(introduction)"은 공지된 방법들의 형질주입(transfection), 형질도입(transduction), 감염(infection) 및 세포에 이종 기원의(heterologous) 핵산 또는 발현 벡터를 도입하기 위한 다른 방법들을 포함한다. 주형(template) 핵산 또는 증폭(amplification) 프라이머(primer)는 그것이 전사되거나(transcribed) 또는 증폭되기 전에 단리되거나 또는 정제될 수 있다. 단리(isolation) 또는 정제는 핵산과 관련하여 통상의 기술자에게 알려진 다수의 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 마이크로RNA의 전달은 화학적으로 변형된(modified) 캡슐화(encapsulation)를 통하여 또는 바이러스 또는 비-바이러스(non-viral) 전달 베슬(vessel) 내의 변형되지 않은(unmodified) RNA 모이어티(moiety)를 통하여와 같은, 여러가지 형태들을 통하여 일어날 수 있다. 비-발현 벡터 전달 방식들은 뇌 세포들을 타겟으로(targeted) 할 수 있는, 나노입자들(nanoparticles), 마이크로입자들(microparticles), 리포좀들(liposomes), 폴리머들(polymers), 마이크로스피어들(microspheres), 등을 포함한다. 마이크로RNA는 또한 그것이 그 다음에 세포들에서 RNAi 머시너리(machinery)에 의하여 발현 및 처리되어 성숙한 마이크로RNA를 형성할 수 있는, 플라스미드(plasmid) 또는 미니-벡터(mini-vector) 기반의 발현 시스템으로 전달될 수 있다.

miRNA 발현을 위한 핵산 구조체들(constructs)은 재조합적으로(recombinantly) 생산될 수 있다. 이러한 발현 벡터들이 여기에서 제공된다. 발현 벡터들은 핵산 서열이 그것이 복제될 수 있는 세포 내로 도입을 위하여 삽입될(inserted) 수 있는, 캐리어(carrier) 핵산이다. 발현 벡터들은 플라스미드들, 코스미드들(cosmids), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) (AAV)과 같은, 재조합 바이러스들, 아데노바이러스들(adenoviruses), 레트로바이러스들(retroviruses), 폭스바이러스들(poxviruses), 및 업계에 알려진 다른 바이러스들 (박테리오파지(bacteriophage), 동물 바이러스들, 및 식물 바이러스들), 및 인공 염색체들(chromosomes) (예컨대, YAC들)을 포함한다. 통상의 기술자는 표준 재조합 기술들을 통하여 발현 벡터들을 구축할(construct) 능력이 잘 있다. 구현예들에서, 마이크로RNA를 갖는 발현 벡터는 환자의 세포들에 전달된다. 핵산 분자들은 그것들이 취해질(taken up) 수 있고 유리하게 발현되어 치료적으로(therapeutically) 효과적인 수준들이 달성될 수 있는 형태로 환자의 세포들에 전달된다.

여기에서 개시된 벡터들에서 사용을 위한 핵산 분자들은 포유동물의 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a, 또는 pre-miR92a 를 인코딩하는 것들을 포함한다. 이러한 핵산들은 업계에 잘 알려져 있으며 공개적으로(publically) 이용가능하다. 본 발명의 구현예에서, 인간 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a, 또는 pre-miR92a 서열들이 벡터에서 사용된다. 마이크로RNA-92a-3p 으로도 불리는, 인간 마이크로RNA-92a를 위한 성숙한 서열은 하기이다:

(서열번호: 1) 5'-UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU-3'

마이크로RNA-145-5p 로도 불리는 인간 마이크로RNA-145를 위한 성숙한 서열은 하기이다: (서열번호: 2) 5’GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3'

야생형 마이크로RNA-145 및 마이크로RNA-92a 를 인코딩하는 핵산들에 더하여, 상기 핵산들의 변이체들(variants) 또한 본 발명의 방법들에서 사용될 수 있다. 이러한 변이체들은, 예컨대, 세포 내에서 마이크로RNA의 위치화(localization)에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 변이체들은 세포질(cytoplasmic) 위치화의 증가와 함께 마이크로RNA의 핵 위치화의 감소를 야기할 수 있다. 본 발명의 측면에서, 마이크로RNA-145 및 마이크로RNA-92a 미믹들(mimics)이 또한 안젤만 증후군을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 미믹들은 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, Sigma Aldrich, 참조).

통상의 기술자에게 알려진 임의의 적합한 발현 벡터가 중추신경계의 세포들에서 타겟 위치로 여기의 마이크로RNA(들)을 전달하는데 이용될 수 있다. 이러한 전달 시, 타겟 위치들에서 세포들은 마이크로RNA(들)로 형질주입되고(transfected), 이로써 환자의 뇌에서 이들 마이크로RNA(들)의 수준들을 증가시킨다. 형질도입(Transducing) 바이러스 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 벡터들은, 특히 감염의 그것들의 높은 효율 및 안정적인 통합(integration) 및 발현 때문에, 체세포 유전자 요법(therapy)을 위하여 사용될 수 있다.

구현예들에서, 발현 벡터는 안정적인 통합(integrating) 벡터 또는 안정적인 비통합(nonintegrating) 벡터일 수 있다. 적합한 벡터들의 예들은 렌티바이러스들 및 아데노-관련 바이러스들(AAV)이다. 렌티바이러스들은 레트로바이러스들의 서브클래스이다. 렌티바이러스들은 뉴런들과 같은 비-분열(non-dividing) 세포들의 게놈 내로 통합될 수 있다. 렌티바이러스들은 고-효율 감염, 이식유전자들(transgenes)의 장기적인(long-term) 안정적인 발현 및 낮은 면역원성(immunogenicity)에 의하여 특징된다. 구현예들에서, 렌티바이러스 벡터들은 마이크로RNA(들)을 뇌로 전달하기 위하여 이용될 수 있다.

AAV는 많은 세포 타입들을 감염시키는 것을 알려진 결함이 있는(defective) 파보바이러스(parvovirus)이며, 인간들에 비병원성(nonpathogenic)이다. AAV는 분열(dividing) 및 비-분열 세포들 둘 다를 감염시킬 수 있다. 구현예들에서, AAV 벡터들은 뇌로 마이크로RNA(들)을 전달하기 위하여 여기에서 이용될 수 있다. 알려진 아데노-관련 바이러스들 (AAV) 중 임의의 것이 여기에서 이용될 수 있고, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 및 AAVRec3이 뉴런들과 관련하여 이용될 수 있다. 여기에서 개시된 방법들에서 사용을 위한 AAV 벡터들은 그 전체가 여기에 참조로 포함된, US Serial No. U.S. Provisional Patent Application No. 62/550,458 에 기재된 것들을 포함한다. 추가적인 적합한 AAV 혈청형들(serotypes)이 슈도타입핑(pseudotyping), 즉, 다른 바이러스 혈청형으로부터의 게놈 및 캡시드(capsid)을 혼합하는 것,을 통하여 개발되어 왔다. 따라서, 예컨대, AAV2/7은 혈청형 7로부터의 캡시드에 포장된(packaged) 혈청형 2의 게놈을 포함하는 바이러스를 나타낸다. 다른 예들은 AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9, 등이다. 하이브리드(Hybrid) AAV 캡시드 혈청형들 rec1, rec2, rec3 및 rec4 는 AAV8과 모든 세 비-인간 영장류(primate) AAV 혈청형들 cy5, rh20 및 rh39에서 매치되는(matched) 캡시드 서열들의 단편들을 셔플링(shuffling)함으로써 만들어졌다(generated). Charbel et al., PLoS One. 2013 Apr 9;8(4):e60361 참조. 용어 rec3AAV 및 AAVRec3은 여기에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 자기-상보적(Self-complementary) 아데노-관련 바이러스 (scAAV)는 또한 벡터로 이용될 수 있다. AAV가 DNA의 단일 가닥을 포장하고 두 번째-가닥(second-strand) 합성의 과정을 요구하는 반면, scAAV는 함께 어닐링(anneal) 하여 이중 가닥 DNA를 형성하는 가닥들 둘 다를 포장한다. 두 번째 가닥 합성을 생략함으로써 scAAV는 세포에서 빠른 발현을 가능하게 한다.

적합한 벡터들이 알려진 기술들을 이용하여 통상의 기술자에 의하여 구축될 수 있을 것이다. 적합한 벡터들이, 프로모터 서열들, 터미네이터(terminator) 단편들, 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열들, 마커 유전자들 및 적절한 다른 서열들을 포함하는, 적절한 조절(regulatory) 서열들을, 마이크로RNA(들)에 더하여, 포함하여, 구축 또는 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 프로모터 서열들, 터미네이터 단편들, 폴리아데닐화 서열들, 마커 유전자들 및 다른 적합한 서열들을 포함하는, 적절한 조절 서열들을 잘 안다.

여기에서 발현 벡터들은 타겟이 된 숙주 세포에서 그것의 발현을 촉진하기 위하여 ORF 또는 코딩(coding) 서열에 작동가능하게(operably) 연결된(linked) 적절한 서열들을 포함한다. "작동가능하게 연결된(Operably linked)" 서열들은 바랐던 산물의 발현을 통제하기 위하여 말단으로(distally) 또는 트랜스로(in trans) 작용하는(act) 발현 통제(control) 서열들 및 코딩 서열들과 근접한(contiguous) 프로모터들과 같은 발현 통제 서열들 둘 다를 포함한다.

보통, 벡터는 타겟 세포 내에서 마이크로RNA(들)의 발현을 용이하게 하기(facilitate) 위하여 프로모터를 포함한다. 프로모터는 뇌에서 선택된 이식유전자의 발현을 추진시킬(drive) 수 있는 다수의 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터들로부터 선택될 수 있다. 구성적 프로모터들의 예들은 CMV 즉시 초기 인핸서(immediate early enhancer)/닭 베타-액틴(chicken beta-actin) (CBA) 프로모터-엑손(exon) 1-인트론(intron) 1 요소(element), RSV LTR 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, CMV 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase) (DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나제 (phosphoglycerol kinase) (PGK) 프로모터를 포함한다.

특이성은 예컨대, 조직 또는 영역(region) 특이적 프로모터를 이용하여, 오로지(exclusively) 수용체(receptor)의 영역의(regional) 그리고 세포-타입 특이적 발현에 의하여 달성될 수 있다. 바이러스 유전자 프로모터 요소들은 마이크로RNA(들)을 발현하는 세포들의 타입을 결정하는(dictate) 것을 도울 수 있다. 몇몇 프로모터들은 비특이적이지만 (예컨대, CAG, 합성(synthetic) 프로모터), 다른 것들은 뉴런(neuronal)-특이적이다. CAG 프로모터는 발현의 높은 수준들을 추진하는데 사용될 수 있는 강한 합성 프로모터이다. CAG 프로모터는 1) 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) (CMV) 초기(early) 인핸서 요소, 2) 프로모터, 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론, 및 3) 토끼 베타-글로빈(globin) 유전자의 스플라이스(splice) 액셉터(acceptor)로 구성된다. 구현예들에서 프로모터는 CAG 프로모터이다. 뉴런 특이적 프로모터들은 (예컨대, 시냅신(synapsin); hSyn), 또는 특정 뉴런 타입들에 우선적인(preferential), 예컨대, 디노르핀(dynorphin), 엔세팔린(encephalin), 성상세포들(astrocytes)에 우선적인 GFAP (신경교 섬유성 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein)), 또는 피질(cortical) 글루타메이트성(glutamatergic) 세포들에 우선적이지만 또한 피질하부의(subcortical) GABA성(GABAergic) 세포들을 또한 타겟으로 할 수 있는, CaMKIIa를 포함한다. 구현예들에서, 프로모터는 전뇌(forebrain)에서 발현을 추진할 수 있는, CamkIIa (알파 CaM 키타제 II 유전자(alpha CaM kinase II gene))이다. 다른 뉴런 세포 타입-특이적 프로모터들은 NSE 프로모터, 티로신(tyrosine) 하이드록실라제(hydroxylase) 프로모터, 마이엘린(myelin) 염기성(basic) 단백질 프로모터, 신경교 섬유성 산성 단백질 프로모터, 및 뉴로필라멘트들(neurofilaments) 유전자 (무거운(heavy), 중간(medium), 가벼운(light)) 프로모터들을 포함한다.

발현 통제 서열들은 또한 적절한 전사 개시, 종결 및 인핸서 서열들; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호들과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호들(signals); 세포질 mRNA를 안정시키는 서열들; 번역 효율을 향상시키는 서열들 (예컨대, Kozak 컨센서스(consensus) 서열); 핵산 또는 단백질 안정성을 향상시키는 서열들; 및 바라면, 산물 프로세싱(processing) 및/또는 분비를 향상시키는 서열들을 포함할 수 있다. 본래의(native) 그리고 본래가 아닌(non-native), 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적을 포함하는, 많은 다양한 발현 통제 서열들이 업계에 알려져 있으며 바라는 발현의 타입에 따라 여기에서 이용될 수 있다.

프로모터에 더하여, 진핵(eukaryotic) 세포들을 위한 발현 통제 서열들은 보통 면역글로불린(immunoglobulin) 유전자, SV40, CMV, 등으로부터 유래된 것과 같은, 인핸서, 및 스플라이스(splice) 도너(donor) 및 액셉터(acceptor) 부위들(sites)을 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 코딩 서열에 3' 그리고 3' ITR 서열에 5' 삽입된다. 여기에서 벡터에서 사용될 수 있는 polyA 신호들의 실례가 되는 예들은 polyA 서열 (예컨대, AATAAA, ATTAAA, 또는 AGTAAA), 소 성장 호르몬 polyA 서열 (BGHpA), 토끼 베타-글로빈 polyA 서열 (rβgpA), 또는 업계에 알려진 또다른 적합한 이종 기원의 또는 내생(endogenous) polyA 서열을 포함한다.

여기에서 유용한 조절 서열들은 또한 프로모터/인핸서 서열 및 코딩 서열 사이에 위치되는 것과 같은, 인트론을 포함할 수 있다. 하나의 유용한 인트론 서열은 SV40으로부터 유래되고, 그리고 SV40 T 인트론 서열로 나타내어진다. 또다른 것은 우드척 간염 바이러스 전사-후 요소(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional element) (WPRE)를 포함한다. WPRE는, 전사될(transcribed) 때, 발현을 향상시키는 삼차(tertiary) 구조를 만들어내는 DNA 서열이다.

여기에서 벡터들은 예컨대, 형광단들을 인코드하는 것들인, 리포터(reporter) 유전자들을 포함할 수 있다. 형광단(fluorophore)은 보통 특정 주파수들(frequencies)에서, 여기(excitation) 시 빛을 재-방사(re-emit)할 수 있는 형광성(fluorescent) 화합물이다. 그것들은 예컨대, 단백질에 부착되어(attached) 단백질이 위치를 찾아내어지는(located) 것을 가능하게 할 수 있는, 마커 또는 태그로 사용될 수 있다. 많은 적합한 형광단들이 업계에 알려져 있다. 그것들은 그것들이 방사하는(emit), 예컨대, 파랑, 청록(cyan), 녹색, 노랑, 오렌지, 빨강 등인, 색깔에 의하여 분류될 수 있다. 예컨대, mCherry, mRasberry, mTomato 및 mRuby 는 빨강 형광단 단백질들이다; 레몬빛(citrine), 비너스(venus), 및 EYFP는 노랑 형광단 단백질들이다. 녹색 형광성 단백질(Green fluorescent protein) (GFP)은 흔히 사용되는 형광단이다.

여기에서 기재된 마이크로RNA들은, 발현 벡터에 의하여든 또는 비-발현 벡터 방식들에 의하여 전달되든, 안젤만 증후군을 치료하기 위하여 사용된다. 안젤만 증후군의 증상은 지적 장애(intellectual disability), 언어능력의 부족(lack of speech), 발작들(seizures) 및 특유의 행동(behavioral) 프로파일(profile)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 안젤만 증후군의 행동 특징들은 행복한 태도(demeanor), 쉽게 유발되는(provoked) 웃음(laughter), 짧은 주의 지속시간(attention span), 하이퍼모터릭(hypermotoric) 행동(behavior), 물건들의 입으로 말하기(mouthing of objects), 수면장애(sleep disturbance), 및 물에 대한 친근감(affinity)을 포함한다. 여기에서 치료의 방법들은 앞서 말한 증상 중 하나 이상에서 개선을 제공하는 것을 포함할 수 있다.

특정 측면들에서, 안젤만 증후군을 야기하는 유전적(genetic) 결함(defect)을 갖는 것으로 의심되는 환자는 이러한 결함의 존재를 검출(defect)하고 확인(confirm)하기 위하여 치료 전에 테스트될 수 있다. 한 예에서, 환자는 UBE3A 유전자에서 결함들을 검출하기 위하여 테스트될 수 있다. 분자의 유전적 테스트 (메틸화 테스트 및 UBE3A 서열 분석)은 개인들의 거의 90%에서 변화들(alterations)을 확인(identifying)할 수 있다.

환자에서 안젤만 증후군과 관련된 비정상적인 활동(activity)의 의심되는 위치(location)의 위치의 결정이 이루어지면, 본 공개에 따른 타겟된 치료가 시행될 수 있다. 뇌, 또는 추가적으로 영향받은 뉴런 조직에서 비정상적인 활성의 위치를 결정하는 방법들은 업계에 잘 알려져 있다. 구현예들에서, 비정상적인 활성의 기원(origin)의 부위(site)로 결정된 범위들(areas)이 타겟이 될 수 있다.

몇몇 구현예들에서, 여기에서 개시된 벡터들은 예컨대, 뇌 또는 척수인, 중추신경계에 직접적으로 투여된다. 중추신경계에 직접적으로 벡터들을 투여하기 위하여 업계에서 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 벡터들은 척수, 뇌간(brainstem) (연수 (medulla oblongata, 뇌교(pons)), 중뇌(midbrain) (시상하부(hypothalamus), 시상(thalamus), 시상상부(epithalamus), 뇌하수체(pituitary gland), 흑질(substantia nigra), 송과선(pineal gland)), 소뇌(cerebellum), 종뇌(telencephalon) (선조체(corpus striatum), 후두(occipital), 측두(temporal), 두정(parietal) 및 전두(frontal) 엽들(lobes)을 포함하는 대뇌(cerebrum), 피질(cortex), 기저핵(basal ganglia), 해마(hippocampus) 및 편도체(amygdala)), 변연계(limbic system), 신피질(neocortex), 선조체(corpus striatum), 대뇌(cerebrum), 및 인페리어 콜리쿨루스(inferior colliculus)에 도입될(introduced) 수 있다. 벡터들은 예컨대, 요추 천자(lumbar puncture)에 의하여, 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에 전달될 수 있다. 게다가, 투여가 정맥안으로(intravenously) 수행될 때, 벡터들의 흡수(uptake)를 위한 타겟 위치에서 환자의 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)의 투과성(permeability)을 향상시키기 위하여 초음파가, 환자의 뇌에서 타겟 위치에 적용될 수 있다. 환자의 혈액 뇌 장벽의 투과성을 향상시키기 위한 초음파의 적용은 Serial No. 62/471,635에 개시되어 있고, 그것의 내용은 그 전체가 여기에서 포함된다.

뇌와 같은, 타겟 위치들로 직접적으로 물질들(materials)을 투여하기 위한 방법들이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 예컨대, Burr 구멍(hole)인 구멍이 두개골(skull) 내로 구멍뚤릴 수 있고(drilled) 그리고 적절한 크기인 바늘(needle)이 타겟 위치로 벡터 또는 비-벡터(non-vector) 비히클(vehicle)을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 구현예들에서, 타겟 위치에 또는 가까이에 경막(dura matter)을 노출하기 위하여 (개두술(craniotomy)) 두개골의 일부(portion)가 제거될 수 있고 벡터 또는 비-벡터 비히클이 타겟 위치에 직접적으로 투여될 수 있다. 구현예들에서, 벡터 또는 비-벡터 비히클이 주변의 조직에 최소의 손상을 갖고 바라는 범위(area)에 벡터 또는 비-벡터 비히클의 정확한 전달을 위하여 정위방법의(stereotaxic) 좌표들(coordinates), 마이크로피펫(micropipette) 및 자동화된 펌프를 사용하여 두개내로(intracranially) 주사된다(injected).

특정 측면들에서, 마이크로펌프(micropump)가 뇌에서 타겟 범위들(areas)에 마이크로RNA(들)을 포함하는 벡터 또는 비-벡터 비히클을 포함하는 제약 조성물들(pharmaceutical compositions)을 전달하기 위하여 이용될 수 있다. 조성물들은 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그보다 많은 분(minutes)이 넘게, 시간의 연장된 기간이 넘게 또는 즉시(immediately) 전달될 수 있다. 뇌에서 타겟 위치로 벡터 전달 후 충분한 시간이 흐르는 것이 가능해질 수 있어 타겟 위치에서 마이크로RNA(들)의 발현을 가능하게 한다.

특정 측면들에서, 여기에서 벡터들 또는 비벡터(nonvector) 전달 비히클들은 전신적으로(systemically) 투여될 수 있다. 전신(Systemic) 전달은 투여의 경구(oral), 구강(buccal), 설하(sublingual), 직장(rectal), 국소(topical), 비강내(intranasal), 질(vaginal) 및 비경구(parenteral) 모드들(modes)을 포함한다. 투여의 비경구 모드들의 예들은 투여의 정맥으로 들어가는(intravenous), 복강내의(intraperitoneal), 근육내의(intramuscular) 및 피하의(subcutaneous) 모드들을 포함한다. 구현예들에서, 벡터들 또는 비벡터 전달 비히클들은, 그것들이 마이크로RNA(들)을 전달하거나 또는 마이크로RNA(들)이 발현되고 예컨대, 네트워크 형성(formation)을 돕고 그리고/또는 뉴런 신호전달(signaling) 네트워크들을 조절하도록(modulate) 작용하게 하는, 뇌를 포함하는, CNS에서 타겟 위치(들)과 그것들이 접촉할 때까지, 순환할(circulate) 것이다.

마이크로RNA(들)이 환자들에서 안젤만 증후군에 대하여(against) 효과적인 양으로 사용된다. 유효 성분(active ingredient)의 투여량(dosage)은 환자의 연령, 무게, 및 개인적인 컨디션(condition), 개인의 약물동력학적(pharmacokinetic) 데이터, 및 투여의 모드에 따라 결정된다. 약 70 kg의 체중(bodyweight)을 갖는 개별적인 인간의 경우에 마이크로RNA의 일일(daily) 도즈(dose)는 단일 도즈로 또는 몇몇 도즈들로 투여되는, 예컨대, 0.1 mg/kg 체중부터 50 mg/kg 체중까지, 1 mg/kg 부터 20 mg/kg 체중까지인, 0.01 mg/kg 체중부터 100 mg/kg 체중까지일 수 있다.

구현예들에서, 초음파 치료는 혈액 뇌 장벽을 파열시킴(disrupting)으로써 뇌에서 타겟 위치들에서 마이크로RNA(들)의 전달을 향상시키는데 사용된다. 여기에서 집중된(focused) 초음파 에너지의 사용은 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 마이크로RNA(들), 및/또는 뇌 조직 자체에 부정적으로(adversely) 영향을 미치지 않고 BBB를 파열시킨다(disrupt). 여기에서 초음파 에너지의 사용은 뇌에서 타겟 위치들로 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)의 전달의 속도를 증가시킬 수 있고, 뇌에서 타겟 위치들로 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)의 전달과 관련될 수 있는 부작용들(side effects)을 감소시킬 수 있고, 타겟 위치에서 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)을 집중시키는(concentrating) 동안 투여량을 감소시킬 수 있고 그리고 타겟 위치에서 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)의 양의 통제된 방출(release)을 가능하게 할 수 있다. 두개골을 통해 초음파 에너지를 전달하는 방법들은 업계에 알려져 있다. 예컨대, US Pat. No. 5,752,515 및 US Publication No. 2009/0005711 참조, 둘 다 그것들 각각의 전체가 참조로서 여기에서 포함된다. 또한 Hynynen et al., NeuroImage 24 (2005) 12-120 참조.

본 공개에 따라, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 1 시간 초과 동안 안젤만 증후군의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공한다. 구현예들에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 2 시간 초과 동안 장애(disorder)의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공한다. 구현예들에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 3 시간 초과 동안 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공한다. 구현예들에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 4 시간 초과 동안 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공한다. 구현예들에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 6 시간 초과 동안 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공한다. 구현예들에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 시간 초과 동안 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공한다. 구현예들에서, 환자에게 투여 후 12 시간 동안 적어도 하나의 증상에서 개선이 본 공개에 따라 제공된다. 구현예들에서, 마이크로RNA 치료는 환자의 다음날 기능(next day functioning)의 개선을 제공한다. 예를 들어, 마이크로RNA는 밤잠(night of sleep)에서 깨어남(waking) 및 투여 후 약, 예컨대, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 10 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간 또는 24 시간 초과 동안 장애의 하나 이상의 증상에서 개선을 제공할 수 있다.

구현예들에서, 여기에서 기재된 방법들은 안젤만 증후군의 하나 이상의 다른 임상적(clinical) 증상을 감소, 지연(delay) 또는 예방(prevent)하는데 효과적이다. 예를 들어, 뇌를 포함하여, 중추신경계의 타겟 위치에서 마이크로RNA 치료의 환자에서 효과(effect)는 치료 전 환자의 컨디션, 또는 치료받지 않은(untreated) 환자와 비교될 수 있다. 구현예들에서, 증상, 약리학의(pharmacologic), 및/또는 생리적(physiologic) 지표(indicator)가 치료 전, 그리고 치료가 개시된 후 한 번 이상 다시, 환자에서 측정된다. 구현예들에서, 대조군은 치료될 질병(disease) 또는 질환(condition)을 갖지 않은 하나 이상의 환자들(예컨대, 건강한 환자들)에서 증상, 약리학의, 또는 생리적 지표를 측정한 것에 기초하여 결정된 평균, 또는 참조(reference) 수준(level)이다. 구현예들에서, 치료 전 뇌 조직에서 miR-145 및/또는 miR-92a의 양은 치료 후 뇌 조직에서 miR-145 및/또는 miR-92a의 양과 비교된다. 구현예들에서, 치료의 효과는 통상의 기술자의 이해의 범위 내인 종래의 치료와 비교된다.

여기에서 개시된 대로 안젤만 증후군의 효과적인 치료는 기준치(baseline)와 비교된 시간 기간 후 증상의 심각도(severity) 또는 빈도(frequency)에서 감소 (예컨대 10%, 20%, 30% 40% 또는 50% 초과)를 보임으로써 확립될 수 있다. 예를 들어, 1 달의 기준치 기간 후, 마이크로RNA 치료를 가진 환자들은, 2 달의 이중맹검(double-blind) 기간 동안, 표준 요법들(standard therapies)에 대한 부가적 요법(add-on therapy)으로서 플라시보(placebo)를 무작위로 할당받을 수 있다. 일차(Primary) 결과(outcome) 측정들은 기준치와 비교된 이중맹검 기간의 두 번째 달 동안 증상의 적어도 10% 내지 50% 감소를 경험한 것으로 정의되는, 플라시보에 그리고 마이크로RNA에 대한 응답자들의 퍼센트(percentage)를 포함할 수 있다.

구현예들에서, 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)을 포함하는 제약 조성물들이 종래의 방출 또는 변형된(modified) 방출(release) 프로파일들로 제공될 수 있다. 제약 조성물들은 안전하고 효과적인 것으로 간주되는 물질들로 이루어진 약학적으로(pharmaceutically) 허용가능한 "담체(carrier)"를 사용하여 제조될(prepared) 수 있다. "담체"는 활성 물질(active substance) 또는 성분들(ingredients) 외 제약 포뮬레이션(formulation)에 존재하는 모든 성분들(components)을 포함한다. 용어 "담체"는 희석제들(diluents), 바인더들(binders), 윤활제들(lubricants), 붕해제들(disintegrants), 필러들(fillers), 및 코팅(coating) 조성물들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 이러한 담체들을 사용하여 제약 조성물들을 혼합하는(compounding) 방법들 및 이러한 제약적 담체들을 잘 안다.

구현예들에서, 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들 및/또는 마이크로RNA(들)을 포함하는 제약 조성물들은 예컨대, 근육내(intramuscular) (i.m.), 정맥 안으로(intravenous) (i.v.), 피하의(subcutaneous) (s.c.), 복강내(intraperitoneal) (i.p.), 또는 척수강내(intrathecal) (i.t.)를 포함하는, 비경구 투여에 적합하다. 비경구 조성물들은 신체 내로 주사(injection), 주입(infusion) 또는 이식(implantation)에 의한 투여를 위하여 무균(sterile)이어야 하며 단일-도즈(dose) 또는 멀티(multi)-도즈(dose) 용기들(containers)에 포장될 수 있다. 구현예들에서, 환자에게 비경구 투여를 위한 액체 제약 조성물들은 상기 기재된 각각의 양들 중 임의의 것으로, 예컨대, 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)인, 활성 물질(active substance)을 포함한다. 구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물들은 약, 예컨대, 0.1 ml, 0.25 ml, 0.5 ml, 0.75 ml, 1 ml, 1.25 ml, 1.5 ml, 1.75 ml, 2 ml, 2.25 ml, 2.5 ml, 2.75 ml, 3 ml, 3.25 ml, 3.5 ml, 3.75 ml, 4 ml,4.25 ml, 4.5 ml, 4.75 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml, 또는 500 ml 의 총 부피로 만들어진다(formulated). 구현예들에서, 발현 벡터들을 포함하는 제약 조성물들의 부피는 마이크로리터(microliter) 양들이다. 예를 들어, 0.1 마이크로리터(microliters) 내지 10 이상의 마이크로리터가 주사될(injected) 수 있다. 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.25, 3.5, 3.75, 4.0, 4.25, 4.5, 4.75, 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 8.25, 8.5, 8.75, 9.0, 9.25, 9.5, 9.75, 또는 10 마이크로리터. 구체예들에서, 조성물들은 마이크로피펫, 백(bag), 유리 바이알(vial), 플라스틱 바이알, 또는 병(bottle)에 들어 있다.

구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물들이 상기 기재된 각각의 양들을 포함한다. 구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물들은 약 0.0001 mg 내지 약 500 mg 활성 물질, 예컨대, 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)을 포함한다. 구현예들에서, 환자에게 비경구 투여를 위한 제약 조성물들은 약 0.001 mg/ml 내지 약 500 mg/ml의 각각의 농도(concentration)에서 활성 물질, 예컨대, 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들), 을 포함한다. 구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물은 예컨대, 약 0.005 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 또는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 의 각각의 농도에서 활성 물질을 포함한다. 구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물은 예컨대, 약 0.05 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.25 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 7 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 약 15 mg/ml의 각각의 농도에서 활성 물질을 포함한다.

구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물이 제공되고 이때 제약 조성물은 적어도 육 개월 동안 안정적이다. 구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물들이 적어도, 예컨대, 3 달 또는 6 달 동안 활성 물질에서 약 5% 이하 감소(decrease)를 보인다. 구현예들에서, 벡터 또는 비-벡터 비히클의 양은 약, 예컨대, 2.5%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하로 분해된다(degrades). 구현예들에서, 분해(degradation)는 적어도 육 개월 동안 약, 예컨대, 5%, 2.5%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1% 미만이다.

구현예들에서, 비경구 투여를 위한 제약 조성물들이 제공되고 이때 제약 조성물은 계속 가용성(soluble)이다. 구현예들에서, 안정적, 가용성, 국소 부위 적합성(local site compatible) 및/또는 즉시-사용-가능한(ready-to-use) 비경구 투여를 위한 제약 조성물들이 제공된다. 구현예들에서, 여기에서 제약 조성물들은 그것을 필요로 하는 환자에게 직접적인 투여를 위하여 즉시-사용-가능하다.

여기에서 제공되는 비경구 투여를 위한 제약 조성물들은 예컨대, 용매들(solvents), 용해도(solubility) 향상제들(enhancers), 현탁화제들(suspending agents), 버퍼제들(buffering agents), 등장제들(isotonicity agents), 안정제들(stabilizers) 또는 항미생물(antimicrobial) 방부제들(preservatives)인, 하나 이상의 부형제들(excipients)을 포함할 수 있다. 사용될 때, 비경구 조성물들의 부형제들은 조성물에서 사용되는, 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)의 안정성, 생체이용률(bioavailability), 안전성 및/또는 효능(efficacy)에 부정적으로 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 비경구 조성물들이 제공되고 이때 제형(dosage form)의 성분들(components) 중 임의의 것 사이에 배합금기(incompatibility)가 없다.

구현예들에서, 벡터들, 비-벡터 전달 비히클들, 및/또는 마이크로RNA(들)을 포함하는 비경구 조성물들은 적어도 하나의 부형제의 안정화시키는(stabilizing) 양을 포함한다. 예를 들어, 부형제들은 버퍼제들, 가용화제들(solubilizing agents), 긴장성 제제들(tonicity agents), 산화방지제(antioxidants), 킬레이트제들(chelating agents), 항미생물 제제들(antimicrobial agents), 및 방부제(preservative)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 부형제가 하나 이상의 기능을 가질 수 있고 하나 이상의 정의된 그룹에서 분류될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

구현예들에서, 비경구 조성물들은 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들) 및 부형제를 포함하고 이때 부형제는 약, 예컨대, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 또는 0.5% 미만의 중량 퍼센트(weight percent) (w/v)로 존재한다. 구현예들에서, 부형제는 약, 예컨대, 1.0% 내지 10%, 10% 내지 25%, 15% 내지 35%, 0.5% 내지 5%, 0.001% 내지 1%, 0.01% 내지 1%, 0.1% 내지 1%, 또는 0.5% 내지 1% 사이의 중량 퍼센트로 존재한다. 구현예들에서, 부형제는, 약, 예컨대, 0.001% 내지 1%, 0.01% 내지 1%, 1.0% 내지 5%, 10% 내지 15%, 또는 1% 내지 15% 사이의 중량 퍼센트로 존재한다.

구현예들에서, 비경구 조성물들은 필요에 따라, 예컨대, 매일 한 번, 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 여섯 번 또는 그보다 많이, 또는 환자의 필요에 따라 연속적으로(continuously) 투여될 수 있다.

구현예들에서, 활성 물질의 비경구 조성물들이 제공되고, 이때 조성물의 pH는 약 4.0 내지 약 8.0 사이이다. 구현예들에서, 조성물들의 pH는 예컨대, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 8.0 사이이다. 구현예들에서, 조성물들의 pH는 예컨대, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 7.8, 약 7.2 내지 약 7.8, or 약 7.3 내지 약 7.6 사이이다. 구현예들에서, 수용액(aqueous solution)의 pH는 예컨대, 약 6.8, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 또는 약 8.6 이다.

다르게 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 공개가 속하는 업계에서 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 대로 동일한 의미들을 갖는다.

여기에서 사용된 대로 용어 "약(about)" 또는 "거의(approximately)"는 통상의 기술자에 의하여 결정되는 대로의 특정 값에 대하여 허용가능한 오차 범위(error range) 내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계들에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 업계에서 실행에 따라(per the practice) 3 또는 3 초과의 표준편차들(standard deviations) 이내를 의미할 수 있다. 그렇지 않으면, "약"은 주어진 값의 20% 까지, 10% 까지, 5% 까지, 및/또는 1% 까지의 범위를 의미할 수 있다. 그렇지 않으면, 특히 생물학적 시스템들 또는 과정들(processes)에 관하여, 용어는 값의 한 자릿수 내(within an order of magnitude), 바람직하게는 5-배(fold) 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다.

"개선(Improvement)"는 안젤만 증후군의 치료를 나타낸다.

"다음 날 기능의 개선(Improvement in next day functioning)" 또는 "이때 다음 날 기능의 개선이 있다(wherein there is improvement in next day functioning)"는 하룻밤 수면 기간(overnight sleep period)에서 깬 후 개선을 나타내며 이때 환자에게 마이크로RNA 요법(therapy)의 투여의 이로운 효과는 여기에서 장애 또는 증후군의 적어도 하나의 증상에 적용되고 깨어난 후, 예컨대, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 등인, 시간 기간 동안 관찰자에 의하여 객관적으로(objectively) 또는 환자에 의하여 주관적으로(subjectively) 인식가능하다(discernable).

"치료하기(Treating)", "치료(treatment)" 또는 "치료하다(treat)"는 하기를 나타낼 수 있다: 질병 또는 질환으로 괴롭거나(afflicted) 또는 경향이 있을(predisposed) 수 있으나, 아직 질병 또는 질환의 임상적(clinical) 또는 준임상적(subclinical) 증상(symptoms)을 경험하거나 또는 보이지 않은 환자에서 질병 또는 질환의 임상적 증상의 출현(appearance)을 완화시키거나(alleviating) 또는 지연시키는(delaying) 것. 특정 구현예들에서, "치료하기(treating)", "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)"는 질병 또는 질환으로 괴롭거나 또는 경향이 있을 수 있으나, 아직 질병 또는 질환의 임상적(clinical) 또는 준임상적(subclinical) 증상(symptoms)을 경험하거나 또는 보이지 않은 환자에서 질병 또는 질환의 임상적 증상의 출현을 예방하는 것을 나타낼 수 있다. "치료하기(treating)", "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)"는 또한 질병 또는 질환을 억제하는 것, 예컨대, 그것의 발달 또는 그것의 적어도 하나의 임상적(clinical) 또는 준임상적(subclinical) 증상을 감소시키는 것(reducing) 또는 저지하는 것(arresting)을 나타낸다. "치료하기(treating)", "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)"는 더 나아가 질병 또는 질환을 경감하는 것(relieving), 예컨대, 질병 또는 질환 또는 그것의 임상적(clinical) 또는 준임상적(subclinical) 증상 중 적어도 하나의 퇴보(regression)를 야기하는 것을 나타낸다. 치료받는 환자에 대한 이익(benefit)은 통계적으로 유의하거나(significant), 수학적으로 유의하거나, 또는 적어도 환자 및/또는 의사(physician)에게 인지가능(perceptible)할 수 있다. 그렇더라도 예방하는(prophylactic) (예방적인(preventive)) 치료 및 치료상의(therapeutic) (치유력 있는(curative)) 치료는 여기에서 공개의 두 개의 별개의(separate) 구현예들이다.

"약학적으로 허용가능한(Pharmaceutically acceptable)"은 "일반적으로 안전한 것으로 여겨지는(generally regarded as safe)", 예컨대, 인간에게 투여될 때, 급성위연동이상항진(gastric upset) 등과 같은, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 보통 생산하지 않고 그리고 생리적으로 견딜 만한(tolerable), 분자 실체들(molecular entities)을 나타낸다. 구현예들에서, 이 용어는, FDA에 의하여 시판 전 리뷰(ppremarket review) 및 승인(approval)되는, Federal Food, Drug and Cosmetic Act의 section 204(s) 및 409 하 GRAS 리스트, 또는 유사한 리스트들, U.S. Pharmacopeia 또는 동물들, 그리고 더욱 특히 인간들에서 사용을 위하여 또다른 일반적으로 인정되는(recognized) 약전(pharmacopeia)으로서, 연방 또는 주 정부의 규제 기관(regulatory agency)에 의하여 승인되는 조성물들 및 분자 실체들을 나타낸다.

"유효량(Effective amount)" 또는 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 치료되는 증후군(syndrome), 장애(disorder), 질병(disease), 또는 질환(condition)의 하나 이상의 증상을 완화시키거나(alleviate), 또는 그렇지 않으면 바라는 약리학적(pharmacological) 및/또는 생리적(physiologic) 효과를 제공하기에 충분한 투여량(dosage)을 의미할 수 있다. "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 여기에서 교환가능하게 사용될 수 있다.

"과 공동-투여되는(Co-administered with)", "과 조합하여 투여되는(administered in combination with)", "의 조합(a combination of)" 또는 "과 함께 투여되는(administered along with)"은 교환가능하게 사용될 수 있고 둘 이상의 제제들(agents)이 치료 과정(course of therapy)에서 투여되는 것을 의미한다. 제제들은 이격된 간격들(in spaced apart intervals)로 따로 또는 동시에 함께 투여될 수 있다. 제제들은 단일 제형(dosage form)으로 또는 별개의 제형들로 투여될 수 있다.

"그것을 필요로 하는 환자(Patient in need thereof)"는 안젤만 증후군으로 진단받은, 예컨대, 인간들, 개들(canines), 고양이들(felines), 돼지들(porcines), 설치류들(rodents)과 같은, 포유 동물들(mammals)을 포함할 수 있다. 본 방법들은 예컨대, 이때 환자가 신생아(neonate), 유아(infant), 소아(pediatric) 환자 (6 개월 내지 12 세), 청소년(adolescent) 환자 (연령 12-18 세) 또는 성인(adult) (18 세 초과)인, 임의의 개인(individual)에게 제공될 수 있다. 환자들은 포유동물들을 포함한다. 이러한 환자들은 예를 들어, Ube3a 유전자에서 유전적 결함(genetic defect)으로 진단된 환자들을 포함한다.

"프로드러그(Prodrug)"는 비활성(inactive) (또는 상당히 덜 활성(less active)))인 형태로 환자에게 투여되는 약리학적 물질(pharmacological substance) (약물(drug))을 나타낸다. 투여되면, 프로드러그는 바라던 약리학적 활성을 갖는 화합물로 신체에서 (인 비보(in vivo)) 대사된다(metabolized)).

"유사체(Analog)" 및 "유도체(Derivative)"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고 부모(parent) 화합물과 동일한 코어(core)를 갖지만, 차수(bond order), 하나 이상의 원자들 및/또는 원자들의 그룹들의 존재 또는 부존재(absence), 및 그것의 조합들에서 부모 화합물과 다를 수 있는 화합물을 나타낸다. 거울상이성질체들(Enantiomers)은 유도체들의 예들이다. 유도체들은 예를 들어, 하나 이상의 원자들, 작용기들(functional groups), 또는 서브스트럭쳐들(substructures)을 포함할 수 있는, 코어에 존재하는 하나 이상의 치환기들(substituents)에서 부모 화합물과 다를 수 있다. 일반적으로, 유도체는 화학적 및/또는 물리적(physical) 과정들을 통하여 부모 화합물로부터, 적어도 이론상으로, 형성되는 것으로 상상될 수 있다.

여기에서 사용된 대로, 용어 "약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 부모 화합물이 그것의 산 또는 염기 염들을 만듬으로써 변형되는(modified), 여기에서 정의된 화합물들의 유도체들(derivatives)을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 염들의 예들은 무기 염기들을 갖는 비독성(nontoxic) 염기 부가(addition) 염들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 알칼리 및 알칼리 토금속 염기들과 같은 적합한 무기 염기들은 나트륨(sodium), 포타슘(potassium), 마그네슘(magnesium), 칼슘(calcium) 등과 같은 금속 양이온들을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염들은 종래의 화학적 방법들에 의하여 부모 화합물로부터 합성될 수 있다.

여기에서 제공된 예들 및 구현예들이 예시적인(exemplary) 예들 구현예들이라는 것이 이해되어야 한다. 통상의 기술자는 여기에서 공개의 범위와 일치하는 예들 및 구현예들의 여러가지 변형들을 구상할 것이다. 이러한 변형들은 특허청구범위에 의하여 포함되는 것으로 의도된다.

<110> OVID THERAPEUTICS, INC. DURING, Matthew <120> USE OF MIR-92A OR MIR-145 IN THE TREATMENT OF ANGELMAN SYNDROME <130> 2262-63 PCT <150> US 62/684,774 <151> 2018-06-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: microRNA-92a-3p <400> 1 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: microRNA-145-5p <400> 2 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

Claims

마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR-92a 또는 pre-miRNA-92a 를 인코딩하는(encoding) 핵산을 포함하는 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되고(operably linked), 이때 안젤만 증후군의 하나 이상의 증상들이 개선되는 개선되는, 그것을 필요로 하는 환자에서 안젤만 증후군을 치료하는 방법.
제 1항에 있어서,
투여 후, 환자에서 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR-92a 또는 pre-miRNA-92a의 발현이 안젤만 증후군의 감소된(reduced) 증상들과 관련되는 방법.
제 1항에 있어서,
프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 인간(human) 시냅신(synapsin) 1 유전자(gene) 프로모터 (hSyn), 디노르핀(dynorphin) 프로모터, 엔세팔린(encephalin) 프로모터 및 CaMKII 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서,
프로모터는 CAG 프로모터인 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 우드척 전사-후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element) (WPRE)를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(bovine growth hormone polyadenylation sequence) (BGHpA)을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 형광성(fluorescence) 리포터(reporter) 카세트(cassette)를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) (AAV)인 방법.
제 8항에 있어서,
아데노-관련 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVRec3 인 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 렌티바이러스(lentivirus)인 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 환자의 뇌에서 타겟 위치로 전달되는 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 경구(oral), 구강(buccal), 설하(sublingual), 직장(rectal), 국소(topical), 비강 내(intranasal), 질(vaginal) 및 비경구(parenteral)로 구성되는 군으로부터 선택되는 루트를 통하여 투여되는 방법.
제 1항에 있어서,
벡터는 타겟 위치로 직접적으로 투여되는 방법.
제 1항에 있어서,
방법은 발달지연(developmental delay), 지적장애(intellectual disability), 언어장애(speech impairment), 보행 운동실조(gait ataxia) 및/또는 팔다리의 떨림(tremulousness of the limbs), 발작들(seizures), 소두증(microcephaly), 부적절한 행복한 태도(inappropriate happy demeanor), 빈번한 웃음(frequent laughing), 물에 대한 친근감(affinity), 미소(smiling), 및 흥분(excitability)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 증상에서 개선을 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
환자의 뇌에서 타겟 위치에 초음파를 적용하여 타겟 위치에서 환자의 혈액 뇌 장벽의 투과성을 향상시키는 단계를 더 포함하고, 이때 벡터는 타겟 위치로 전달되는 방법.
환자의 뇌에서 마이크로RNA-145 및/또는 마이크로RNA-92a 분자들의 수준을 증가시키는 제약(pharmaceutical) 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 그것을 필요로 하는 환자에서 안젤만 증후군을 치료하는 방법.
제 16항에 있어서,
조성물은 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, microRNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a 를 포함하는 방법.
제 16항에 있어서,
조성물은 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a을 인코딩하는(encoding) 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 방법.
제 16항에 있어서,
투여하는 단계 후, 환자에서 마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a의 발현이 안젤만 증후군 장애(disorder)의 감소된 증상들과 관련되는 방법.
제 18항에 있어서,
마이크로RNA-145, pri-miR145, pre-miR145, 마이크로RNA-92a, pri-miR92a 또는 pre-miR92a 를 인코딩하는(encoding) 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된(operably linked) 방법.
제 20항에 있어서,
프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 인간(human) 시냅신(synapsin) 1 유전자(gene) 프로모터 (hSyn), 디노르핀(dynorphin) 프로모터, 엔세팔린(encephalin) 프로모터 및 CaMKII 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 우드척 전사-후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element) (WPRE)를 포함하는 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 형광성(fluorescence) 리포터(reporter) 카세트(cassette)를 포함하는 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) (AAV)인 방법.
제 24항에 있어서,
아데노-관련 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVRec3 인 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 렌티바이러스(lentivirus)인 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 환자의 뇌에서 타겟 위치로 전달되는 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 경구(oral), 구강(buccal), 설하(sublingual), 직장(rectal), 국소(topical), 비강 내(intranasal), 질(vaginal) 및 비경구(parenteral)로 구성되는 군으로부터 선택되는 루트를 통하여 투여되는 방법.
제 18항에 있어서,
벡터는 타겟 위치로 직접적으로 투여되는 방법.
제 18항에 있어서,
조성물은 비-바이러스(non-viral) 벡터인 벡터를 포함하는 방법.
제 30항에 있어서,
비-바이러스 벡터는 리포좀(liposome) 매개(mediated) 전달(delivery) 벡터인 방법.