CN102676516B

CN102676516B - microRNA 145的新用途

Info

Publication number: CN102676516B
Application number: CN201110311076.2A
Authority: CN
Inventors: 马洁; 袁伟
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Pwc Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: CN102676516A

Abstract

本发明公开了一种microRNA 145的新用途。本发明提供了一种如下1)-3)中任一所述物质在制备具有促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭的产品中的应用：1)microRNA 145；2)含有microRNA 145的编码基因的重组载体；3)含有microRNA 145的编码基因的重组病毒；4)含有microRNA 145的编码基因的重组病毒载体。本发明的实验证明，microRNA 145过表达后并未能影响HCT-8细胞的生长，但可显著增强高转移性大肠癌细胞的侵袭和迁移能力，在大肠癌转移过程中可能起重要作用，因此说明，microRNA 145与大肠癌转移相关。

Description

microRNA 145的新用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种microRNA 145的新用途。

背景技术

micro RNAs(miRNAs)，是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，通常在转录后水平调控蛋白表达(最近发现micro RNA也能在转录水平调控基因表达)。随着对micro RNA研究的不断深入，越来越多的证据表明micro RNA分子在肿瘤发生发展的各个环节中发挥着原癌基因或抑癌基因的作用。

最早由Michael等应用micro RNA克隆和Northern blot技术在大肠癌和周围正常粘膜组织中检测micro RNAs表达谱，发现miR-145(micro RNA145，Genebank number：NR_029686.1)在癌组织中表达较正常组织中明显降低(microRNA 145在癌组织中的表达水平是正常组织的4倍)，同时证实大肠癌细胞系CaCo-2、LIM1863中microRNA 145表达亦降低。在随后对microRNA 145的多项研究中发现，它与肿瘤的发生发展密切相关，其在肿瘤中的表达呈现多样性的特点。microRNA 145在包括大肠癌在内的几种肿瘤(乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、鼻咽癌等)组织和细胞内表达明显降低，但在早发性大肠癌中其表达升高。Akao研究组和Schepeler研究组等分别应用肿瘤细胞系和小鼠原位移植瘤模型证实了microRNA 145能够有效抑制乳腺癌、大肠癌和肺癌细胞的生长。人们推测microRNA 145在肿瘤发生发展中可能通过抑制细胞增殖扮演肿瘤抑制基因的角色。

目前现有对microRNA 145的研究主要集中在对其抑制癌细胞增殖的能力方面，对microRNA 145其他方法的研究报道几乎没有。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种如下1)-3)中任一所述物质在制备具有促进肿瘤功能的产品中的应用：

1)microRNA 145；

2)含有microRNA 145的编码基因的重组载体；

3)含有microRNA 145的编码基因的重组病毒；

4)含有microRNA 145的编码基因的重组病毒载体。

所述促进肿瘤功能为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭。

所述肿瘤为大肠癌。

所述产品为药物；

所述micro RNA145的核苷酸序列为序列表中的序列1。

本发明的第二个目的是提供一种重组细胞。

本发明提供的重组细胞，为将所述microRNA 145、所述含有microRNA 145的编码基因的重组载体、所述含有microRNA 145的编码基因的重组病毒或含有microRNA 145的编码基因的重组病毒载体导入出发细胞中得到的重组细胞。

所述出发细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤细胞具体为大肠癌细胞。

所述的重组细胞在筛选和/或制备抑制肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭药物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种具有促进肿瘤功能的产品。

本发明提供的产品，其活性成分为所述microRNA 145、所述含有microRNA 145的编码基因的重组载体、所述含有microRNA 145的编码基因的重组病毒或含有microRNA145的编码基因的重组病毒载体。

所述促进肿瘤为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭。

所述肿瘤为大肠癌；

所述产品为药物。

抑制microRNA 145活性或者表达的物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用也是本发明保护的范围。

所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭，所述肿瘤具体为大肠癌。

本发明的实验证明，microRNA 145过表达后并未能影响HCT-8细胞的生长，但可显著增强高转移性大肠癌细胞的侵袭和迁移能力，在大肠癌转移过程中可能起重要作用，因此说明，microRNA 145与大肠癌转移相关。

附图说明

图1为荧光显微镜下观察慢病毒载体介导GFP-MIR-145在HCT-8细胞中的表达情况

图2为利用CCK-8绘制HCT-8mir-145，HCT-8nc的生长曲线

图3为microRNA 145对HCT-8细胞迁移能力的影响

图4为microRNA 145对HCT-8细胞侵袭能力的影响

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、稳定高表达microRNA 145的转移性大肠癌细胞系的获得

一、大肠癌细胞系的获得

大肠癌细胞系HCT-8(ATCC，CCL-244)，其培养基为含有10％的胎牛血清(Hyclone)和浓度为0.2％的青链霉素(Invitrogen)的1640培养基(Invitrogen，11875-093)。

A、细胞复苏

(1)取出HCT-8(ATCC，CCL-244)的冻存管，立即放入37℃-40℃水浴中，快速摇晃直至完全融化。

(2)将细胞悬液转入10ml冷PBS中，放入15ml离心管中，用水平离心机离心细胞(1000转/分钟，8分钟)后弃上清。

(3)用适量新鲜培养基悬浮细胞，将细胞悬液转入培养瓶中，置37℃二氧化碳培养箱中培养。

B、细胞培养

将大肠癌细胞系放入培养基中，于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况，每天或者隔天更换新鲜培养基，细胞浓度约为培养瓶培养面积80％-90％时进行传代。

C、细胞冻存

(1)选取处于指数生长期的细胞，冻存前1天给细胞换液1次。

(2)贴壁细胞以常规方法消化，制备成单细胞悬液。收集悬液，离心(1000转/分钟，8分钟)。

(3)弃上清，用冻存管重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁶/mL。

(4)将细胞悬液移入冻存管，扭紧管盖，注明细胞名称和冻存日期，放入冻存盒，置于-86℃冰箱16小时后，移至液氮中保存。

D、细胞传代

(1)倒掉培养瓶中的培养基，加入37℃PBS轻轻洗涤细胞，吸出PBS，加入胰蛋白酶(25cm²培养瓶加500微升胰酶，75cm²和10cm直径培养皿加入1毫升胰酶)，在显微镜下观察消化过程，待细胞变圆、细胞间连接断开。

(2)加入十倍于胰酶体积的PBS，用一次性吸管将细胞轻轻吹打，成细胞悬液。

(3)收集悬液于15或者50mL离心管中，离心(1000转/分钟，5分钟)。

(4)用新鲜培养基重悬细胞，按1∶2移入新的培养平或培养皿，得到传代后HCT-8细胞。

二、细胞转染

1、转染

GFP-MIR-145慢病毒表达系统(其中外源基因为microRNA 145，Genebank号为NR_029686.1，即为序列1，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，为能表达microRNA145的慢病毒颗粒)，根据该公司的操作指南进行细胞转染：

1)、分别将生长良好的步骤一得到的传代后HCT-8细胞于转染前一天接种到96孔板中(正常培养，37℃，5％CO₂培养箱)，转染时细胞密度达到30％。

2)、每孔中弃去原培养液，加入100ul培养基及1ul慢病毒试剂(GFP-MIR-145慢病毒表达系统)，温和混匀。

3)、37℃培养24小时后，换正常培养基终止转染。

4)、然后37℃培养72小时后，得到HCT-8^high细胞系。

采用同样的方法将NC慢病毒表达系统(购自上海上海吉凯基因化学技术有限公司，其与GFP-MIR-145慢病毒表达系统相比没有外源基因microRNA 145)转染HCT-8细胞，得到HCT-8(NC)。

2、检测细胞中microRNA 145的表达

1、荧光显微镜观察

将上述获得的HCT-8^high细胞系和HCT-8(NC)分别置于荧光倒置显微镜下，检测其表达microRNA 145情况，结果如图1所示，miR-145为HCT-8^high细胞系，NC为HCT-8(NC)，从图中可以看出，HCT-8^high细胞系稳定高表达microRNA 145(有荧光反应)。

荧光显微镜下观察到其转染效率高达80％(通过流式细胞仪计数得到)。

2、RT-PCR检测

利用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取上述获得的HCT-8^high细胞系和HCT-8(NC)细胞总RNA，以提出的总RNA为模板，microRNA 145引物(购买自Qiagen，货号为MS00003528)，进行RT-PCR，以RNU6B为内参(引物购买自Qiagen，货号为MS00033740)；以未转染病毒的HCT-8细胞和HCT-8(NC)细胞为对照。

结果如下：HCT-8^high细胞系的microRNA 145的相对表达率为2200；

HCT-8(NC)的microRNA 145的相对表达率为1；

未转染病毒的HCT-8细胞中的microRNA 145的相对表达率为1；

可以看出，microRNA 145在HCT-8^high细胞系中稳定过表达。

实施例2、HCT-8^high细胞系稳定高表达microRNA 145的功能研究

1、细胞生长曲线

(1)取转染后24小时，生长状态良好的由实施例1得到的HCT-8^high，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。计数，精准地将细胞种在96孔板中，每孔细胞总数要求一致(2000个/孔)，加入培养剂的量也要一致，并设置空白对照(即同样体积的培养基)，每孔终体积为100ul。置37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时。

(2)每孔加入10ul的CCK-8溶液(购自日本同仁化学研究所货号：CK04)。可根据具体情况增加或减少CCK-8溶液的用量。

(3)正常培养条件(37℃，5％CO2培养箱)下培养4小时(培养时间取决于所使用的细胞类型和细胞浓度)。

(4)水平晃动约10秒后用酶标仪测量450nm波长的OD值，保存好数据。

(5)每天依次法测定，共7天。每培养2天要给未计数的细胞换液。

(6)以培养时间为横轴，OD值为纵轴，描绘在半对数座标纸上，连接曲线后即成该细胞的生长曲线。

实验重复三次，结果取平均值。

结果为图2所示，可以看出HCT-8^high在加入CCK-8溶液后1天、3天和5天的96孔板中每孔细胞的OD值分别为1、3.7、10.2。空白对照在加入CCK-8溶液后1天、3天和5天的96孔板中每孔细胞的总数分别为1、3.5、10.1；可以看出，microRNA 145过表达后并未能影响HCT-8细胞的生长。

2、细胞迁移实验

(1)将Transewll小室(购自Corning公司)用无血清1640培养基(Invitrogen，31800-022)平衡至少一个小时或过夜，有助于更好贴附和生长。

(2)实验前一天，将由实施例1得到的HCT-8^high细胞在无血清培养基中饥饿培养。

(3)将Transewll放入24孔板，在Transewll下室中加入600ul含有10％血清的培养基作为趋化因子。

(4)先取转染后24小时并无血清饥饿过的细胞，消化后进行活细胞计数，调整细胞浓度为4×10⁵/mL，再在每个Transewll小室中加入100ul由实施例1得到的HCT-8^high细胞悬液(饥饿培养后，4×10⁴细胞)。每组设三个平行样本。置于孵箱中培养。

(5)24小时后吸去上室液体，用PBS湿润棉签擦去膜上面未穿过聚碳酸酯膜上小孔的细胞，生理盐水漂洗，稍干。

(6)0.5mL甲醇结晶紫溶液染色30分钟，流水冲洗3-5次。

(7)用小刀片将聚碳酸酯膜小心切下，置膜于载玻片上，膜底面朝上，滴树脂后用盖玻片封片，显微镜下随机计数5个视野的细胞数，求和，进行统计学检验，实验重复三次，结果取平均值。

以转染NC的HCT-8(NC)为阴性对照(NC)。

结果如图3所示，其中A为显微镜检测结果图，B为迁移细胞数结果图，从图3A可以看出，miR-145组为HCT-8^high，NC组为HCT-8(NC)，细胞迁移24小时后，miR-145组较NC组相比有更多的细胞，说明有更多细胞迁移到Transwell小室的另一侧。

图3B中，miR-145组的细胞数为162，NC组的细胞数为50，miR-145组大约为NC组的3倍，这说明microRNA 145能够促进细胞的垂直迁移能力。

3、细胞侵袭试验

(1)将枪头、Eppendorf管、Matrigel胶(购自BD公司)、Transwell室、24孔板置于4℃过夜，由实施例1得到的HCT-8^hig细胞换无血清培养基中饥饿培养过夜。消化细胞，无血清培养基吸打，调整细胞浓度在1×10⁶/mL。

(2)4℃溶解Matrigel基质过夜，用预冷的枪头将Matrigel胶混匀。

(3)将培养基置于冰上，预冷枪头取20ul Matrigel胶(1∶3)于Transwell小室的上室，37℃放置30分钟。

(4)预温无血清培养基轻柔洗涤已凝固的Matrigel，加100ul细胞悬液(1×10⁵细胞)，每组设三个平行孔。

(5)下室加入600ul含10％胎牛血清的培养基。

(6)置于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24小时，棉签拭去滤膜上表面未穿透的细胞。

(7)对已穿透的细胞进行固定、结晶紫染色、封片，每个样本均计数5个高倍镜视野，取其平均值。各组细胞穿透滤膜的数量的多少作为评价其侵袭能力的指标。

以转染NC的HCT-8为阴性对照为对照(NC)。

结果如图4所示，其中A为显微镜下结果图，B为侵袭实验结果图，从图4A可以看出，miR-145组为HCT-8^high，NC组为HCT-8(NC)，miR-145组较对照组(NC组)细胞明显增多。

图4B中，miR-145组的细胞数为120，NC组的细胞数为40。

这些体外功能预实验证实microRNA 145过表达可显著增强高转移性大肠癌细胞的侵袭和迁移能力，高度提示其在大肠癌转移过程中可能起重要作用。

Claims

1.如下1）-4）中任一所述物质在制备具有促进肿瘤功能的产品中的应用：

1）microRNA145；

2）含有microRNA145的编码基因的重组载体；

3）含有microRNA145的编码基因的重组病毒；

4）含有microRNA145的编码基因的重组病毒载体；所述促进肿瘤功能为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭；

所述肿瘤为大肠癌；

所述产品为药物；

所述microRNA145的核苷酸序列为序列表中的序列1。