KR20100093523A - 세포투과성 ｒｕｎｘ３ 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 - Google Patents

세포투과성 ｒｕｎｘ３ 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 거대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질, 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 발현벡터, 및 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 RUNX3 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질은 종양 및 전이 억제인자인 RUNX3 를 세포 내로 고효율로 도입하여 세포주기를 억제하는 TGF근 신호전달 기작을 재활성화시킴으로써 다양한 암의 형성 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포투과성 RUNX3 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물{CELL PERMEABLE RUNX3 RECOMBINANT PROTEINS, POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME, AND ANTICANCER COMPOSITIONS INCLUDING THE SAME}
본 발명은 종양 및 전이 억제인자(tumor and metastasis suppressor) RUNX3에 거대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질, 상기 세포투과성RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 발현벡터 및 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 RUNX3 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물에 관한 것이다.
위암은 한국, 일본 등의 아시아 국가에서 발생하는 가장 흔한 암으로서, 전세계적으로 사망률 2 위를 나타낸다. 따라서 위암의 조기진단이 매우 중요하다. 그러나 위암의 진행 초기에는 그 증상이 모호할 뿐만 아니라 위암에만 나타나는 특이적인 증상이 없어 진단과 치료가 늦어지는 경우가 많다. 이에 위암의 발병기전에 대한 규명을 통해 근본적인 치료를 모색하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
최근에 위암 발병의 원인으로 Runt-관련 전사인자(Runt-related transcription factor)인 RUNX3 의 발현 감소가 연관되어 있음이 보고되었다(Li 등, Cell 109: 113-124, 2002). 이 보고에 따르면, RUNX3 의 유전자 기능을 밝혀내기 위해 RUNX3 결손 또는 기능이 상실된 마우스 모델에서 표현형을 분석한 결과, RUNX3 의 기능상실로 인해 위암이 발병됨을 확인하였다.
일반적으로 정상세포는 늙고 병들면 제거되고, 그 자리에 새로운 세포가 생겨나는데, RUNX3 가 결손된 마우스에서는 이러한 비정상 세포들이 죽지 않고 계속 증가하게 되어 세포증식의 증가와 세포사멸의 감소로 인한 과증식증(hyperplasia)이 나타난다. 그러나, RUNX3 가 정상일 때 p53 만 결손시킨 마우스의 세포에서는 암이 형성되지 않았다(Li 등, Cell 109: 113-124, 2002), 이러한 결과는 RUNX3 가 세포증식을 조절하는 과정에서 중요한 역할을 하고 있으며, RUNX3 의 불활성화가 인간 위암의 원인이라는 중요한 증거를 제공하고 있다. 실제로 RUNX3 의 위암 억제효과를 확인하기 위해 실시된 위암 세포주와 인체 위암 조직의 분석 결과는 RUNX3 와 위암 사이에 밀접한 상관관계가 있음을 나타낸다. 구체적으로, 46 명의 위암환자의 조직을 분석한 결과, 30％의 환자에서는 RUNX3 의 반접합체 결손(hemizygous deletion)이 나타났고, 약 45∼60％의 환자에서는 RUNX3 의 프로모터(promoter) 부위에 존재하는 CpG 섬(CpG island)의 과메틸화에 의해 RUNX3 가 불활성화되어 있음이 관찰되었다(Li 등, Cell 109: 113-124,2002, Waki 등, Cancer Sci. 94: 360-364,2003).
폴리오마바이러스 증강 결합 단백질 1/코어 결합 인자(polyomavirus enhancer binding protein 1/corc binding factors, PEBP2/CBF)로 밝혀진 전사인자인 Runt 패밀리는 RUNX1(PEBP2αB/CBFA2/AML1), RUNX2(PEBP2αA/CBFA1/AML3) 및 RUNX3(PEBP2αC/CBFA3/AML2)로 구성되어 있다. RUNT 패밀리는 정상적인 발달 및 종양화 과정에서 중요한 역할을 담당하는데, TGF-β 와 그 신호전달을 중재하는 하위인자인 Smad 패밀리의 전사 조절인자로서 기능한다. RUNX1 은 포유류의 조혈작용에, RUNX2 는 골 형성에 주요한 역할을 하며, RUNX3 은 주로 과립성 위 점막세포에서 발현되고, 위 상피의 세포분화를 저해하는 역할을 한다. 이들 세 유전자는 염색체 1p, 6p 와 21q 의 유전자자리(locus)에 위치하고 있는데, 이중 RUNX3 의 염색체 유전자자리는 1p36.11-1p36.13이다. 상기 RUNX3의 유전자자리는 위암뿐만 아니라 췌장암, 폐암, 대장암, 간암 등 다양한 종류의 암에서 손실되거나 반접합체 결손 등의 영향을 받는 위치 중 하나이다. 뿐만 아니라, RUNX3 는 상기한 다양한 종류의 암에서 불활성화되어 있는 것으로 밝혀져, 항암제 개발의 새로운 타겟으로 각광받고 있다.
이처럼 RUNX3 는 암의 형성을 억제하는 종양 억제인자로 작용할 뿐만 아니라, 암 전이를 억제한다고도 알려져 있다. RUNX3 는 암이 전이되는데 필수적인 혈관을 형성하는 혈관생성인자인 VEGF 를 저해하고(Keping Xie 등, Cancer Res. 65:4809-5816, 2006), RUNX3 유전자가 도입된 마우스 모델에서는 대조군에 비해 다른 기관으로의 암 전이가 저해됨이 확인되었다(Hagiwara 등, Clin Cancer Res. 11(18): 6479-6488,2005).
RUNX3 의 세포 내 기작을 살펴보면, RUNX3 은 먼저 TGF-β 신호전달 경로를 자극하고, 자극받은 TGF-β 는 세포 내 Smad2/3 단백질의 활성화를 유도한다. 활성화된 Smad2/3 은 Smad4 와 복합체를 이루어 핵내로 이동하게 되고, 곧이어 p300 및 RUNX3 와 결합함으로써 표적 유전자의 전사를 유도하고, 결과적으로 세포사멸을 유도하게 된다.
TGF-β 는 다양한 기능을 갖는 세포성장 조절인자로 많은 발생과정과 생리활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. TGF-β 수용체와 이의 신호전달 단백질인 Smad 는 다양한 암에서 불활성화되어 있다(Cohen 등, Am. J. Med. Genet. 116A: 1-10,2003). Smad와 결합하여 TGF-β 신호전달경로에 관여하는 p300 또한 다양한 암에서 돌연변이되어 있음이 보고되었다(Gayther 등, Nat. Genet. 24: 300-303, 2000). 세포의 핵 내에 존재하는 RUNX3 는 TGF-β 신호전달 경로상의 단백질인 Smad 및 p300 모두와 결합하여 종양 억제인자로서 협조적으로 작용한다(Hanai 등, J. Biol. Chem. 274: 31577-1582. 1999; Kitabayashi 등, EMBO J. 17: 2994-3004. 1998; Lee 등, Mol. Cell. Biol. 20: 8783-8792,2000; Zhang 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 97: 10549-10554, 2000).
TGF-β 는 또한 세포주기에서 G1 기를 차단함으로써 세포증식 억제를 유도한다(Sherr 등, Science 274: 1672-677, 1996; Weinberg등, Cell 81: 323-30, 1995), 결국 RUNX3 이 TGF-β 신호전달 경로를 거쳐 핵 내에서 Smad2, Smad4, p300 등과 복합체를 형성하면, 세포주기를 저해하는 p21 의 발현은 증가하는 반면, 세포주기를 진행하는 사이클린(Cyclin) A, 사이클린 E, PCNA 및 Rb의 인산화뿐만 아니라 암 전이에 관여하는 VEGF의 발현은 억제됨으로써 암 전이(metastasis)를 저해한다.
이에 본 발명자들은 체내에서 RUNX3 의 과발현을 유도하거나 RUNX3 단백질을 직접 체내에 고효율로 전달할 수 있다면 암 형성 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고, 이를 이용하여 신규한 항암제의 개발을 위해 예의 연구 노력하였다.
한편, 합성화합물 또는 천연물의 작은 분자들(small molecules)은 세포 안으로 전달될 수 있으나, 단백질, 펩티드, 핵산 같은 거대분자들(macromolecules)은 세포 안으로 전달될 수 없다. 이들은 분자량 500 이상의 거대분자로 살아있는 세포의 원형질막(plasma membrane), 즉 이중 지질막 구조(lipid bilayer structure)를 통과할 수 없음이 널리 알려져 있다. 이를 극복하기 위한 방법으로 "거대분자 세포 내 전달기술(macromolecule intracellular transduction technology: MITT)"이 개발되었는데(Jo 등, Nat. Biotech. 19: 929-33, 2001), 이는 질병 치료성거대분자의 생체 내 전달을 가능케 함으로써 기존의 의약품 개발 기술로는 불가능했던 펩티드, 단백질, 유전자 자체 등으로 바이오 신약물의 개발을 가능하게 한다. 이 기술에 따르면, 거대분자들은 "소수성 거대분자 전달 도메인(hydrophobic macromolecule transduction domain, MTD)"과 다른 여러 가지 세포 내 운반체들과 융합되어 재조합 단백질 형태로 합성 또는 발현, 정제되고 세포 내로 전달된 후, 특정 위치로 정확하고 빠르게 운반되어 필요한 여러 가지 역할을 효과적으로 발휘할 수 있다. 이처럼 거대분자 전달 도메인(MTD)은 펩티드, 단백질, DNA, RNA, 합성화합물 등과 융합되어 세포 내로 들어갈 수 없는 많은 불투과성 물질들의 전달을 가능케 한다.
이에 본 발명자들은 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 거대분자 전달 도메인을 융합시켜 세포투과성을 부여한 RUNX3 재조합 단백질을 제조하고 이 재조합 단백질이 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 환경 하에서도 세포 외부로부터 대량의 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 을 세포 내로 효과적으로 전달하여 인간의 다양한 암에서 발생되는 RUNX3 결손 또는 기능 상실을 치료할 수 있는 항암제로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 세포투과성을 부여하여 이를 세포 내로 고효율로 도입함으로써 인간의 위암에서 발생되는 RUNX3 결손 또는 기능 상실을 치료할 수 있는 항암제로서 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 와 거대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 RUNX3 를 세포 내로 고효율로 도입하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 상기 RUNX3 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 세포투과성 RUNX3 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질은 종양 및 전이 억제인자인 RUNX3 를 세포 내로 고효율로 도입하여 세포주기를 억제하는 TGF-β 신호전달 기작을 재활성화시킴으로써 다양한 암의 형성 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 는 본 발명에 따라 전장 형태 및 결절 형태로 고안된 kFGF4-유래 MTD가 융합된 RUNX3 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고,
도 1b 는 본 발명에 따라 전장 형태로 고안된 JO-57, JO-85, JO-13 및 JO-108 MTDs 가 각각 융합된 RUNX3 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고,
도 2a 는 본 발명에 따라 전장 형태 및 결절 형태로 고안된 kFGF4-유래 MTD가 융합된 RUNX3 재조합 단백질을 PCR로 증폭한결과이고,
도 2b 는 본 발명에 따라 전장 형태로 고안된 JO-57, JO-85, JO-13 및 JO-108 MTDs 가 각각 융합된 RUNX3 재조합 단백질을 PCR 로 증폭한 결과이고,
도 3a 는 pGEM-T Easy 벡터에 PCR 증폭산물을 서브클로닝(subcloning)하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 3b 및 3c 는 각각 본 발명에 따라 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단백질의 PCR 증폭산물이 pGEM-T Easy 벡터에 서브클로닝되었음을 나타낸 것이고,
도 4a 는 본 발명에 따라 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편을 pET-28a(+) 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4b 및 4c 는 각각 본 발명에 따라 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편이 pET-28a(+) 벡터에 클로닝되었음을 나타낸 것이고,
도 5a 는 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 발현을 다양한 숙주세포를 대상으로 조사한 결과이고,
도 5b 는 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 발현을 단백질 발현 유도제인 IPTG 의 존재(+) 또는 부재(-) 하에서 조사한 결과이고,
도 6a 및 6b 는 각각 본 발명의 재조합 발현벡터가 형질전환된 세균으로부터 발현된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3, HR3M1, HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3)을 정제한 결과이고,
도 7a 및 7b 는 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3, HR3M1, HM1R3M1 및 HM3R3)의 세포투과성을 유세포분석기(flow cytometry)로 분석한 결과이고,
도 8 은 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3, HR3M1, HM1R3M, HM2R3 및 HM3R3)의 세포투과성을 마우스 섬유아세포에서 동초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)으로 관찰한 결과이고,
도 9 는 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)의 세포투과성을 다양한 마우스 조직에서 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰한 결과이고,
도 10a 및 10b 는 각각 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3)의 세포 내 기능을 웨스턴블롯팅(western blotting)으로 분석한 결과이고,
도 11 은 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3)의 세포사멸 유도효과를 세포 내 DNA 함량 분석(cellular DNA contcntassay)을 통해 조사한 결과이고,
도 12a 및 12b 는 각각 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3)의 암세포 이동 억제효과를 상처치유(wound healing) 분석으로 조사한 결과이고,
도 13a 및 13b 는 각각 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R3)을 종양이 형성된 마우스에 피하 주사로 26 일간 처리하면서 매일 종양 크기와 몸무게의 변화를 측정한 결과이고,
도 14 는 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)이 피하 주사로 21 일간 투여된 마우스에서 종양 크기의 변화를 대조군과 비교하여 나타낸 사진이고,
도 15 은 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)이 피하 주사로 투여된 마우스의 폐와 종양조직에서 세포주기와 전이억제효과를 면역조직학적(Immunohistochemistry) 염색으로 관찰한 결과이고,
도 16 은 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R3)이 피하 주사로 투여된 마우스의 종양조직에서 세포사멸 유도효과를 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석으로 관찰한 결과이고,
도 17 은 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R3)이 피하 주사로 투여된 마우스의 종양조직에서 세포사멸 유도효과를 아폽태그(ApopTag) 분석으로 관찰한 결과이고,
도 18 은 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)이피하 주사로 투여된 마우스의 종양조직에서 유전자 발현의 변화를 마이크로어레이(Microarray)로 분석한 결과이다.
본 발명은 종양 및 전이 억제인자(tumor and metastasis suppressor) RUNX3와 거대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 RUNX3 를 세포 내로 고효율로 도입하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(CP-RUNX3) 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 특징은 세포 내로의 도입이 용이하지 않은 거대분자인 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 특정한 거대분자 전달 도메인(이하, "MTD"로 약칭함)을 융합시켜 세포투과성을 부여함으로써 RUNX3 를 세포내로 고효율로 전달하는 것이다. 이때 거대분자 전달 도메인은 종양 및 전이 억제인자인 RUNX3 의 한쪽 말단에만 융합되거나, 또는 그의 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있다.
본 발명에서는 종양 및 전이 억제인자인 RUNX3 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인(MTD)으로서 세포 내로 거대분자의 전달을 가능케 하는 펩티드 도메인에 상기 RUNX3 를 융합하여 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질을 개발하였다.
본 발명에서 "세포투과성 RUNX3 재조합 단백질" 이란 거대분자 전달 도메인과 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 을 포함하며, 이들의 유전적 융합이나 화학적 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 여기서 "유전적 융합" 이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형의 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
암 형성신호에 반응하여 세포주기를 제어하고 세포사멸을 유도하는 p21 의 활성화와 암 전이를 유발하는 VEGF의 억제에 작용하는 RUNX3는 서열번호: 1 의 염기서열 및 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 종양 및 전이 억제인자로서 TGF-β 신호전달 경로 내에서 중요한 표적 단백질로 작용한다.
종양 및 전이 억제인자 RUNX3 는 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 번부터 53 번까지의 아미노산을 포함하는 N-말단 도메인, 54번부터 182번까지의 아미노산을 포함하는 R-말단 도메인, 및 183 번부터 414 번까지의 아미노산을 포함하는 PST-풍부(proline/scrine/threonine-rich)도메인으로 구성된다(도 1a 참조).
상기 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인으로는 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성을 갖는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 상기 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열 중의 어느 하나를 갖는 거대분자 전달 도메인은 세포막을 관통하여 폴리펩타이드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 포함하는 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 유입을 매개할 수 있는 세포투과성 폴리펩타이드이다. 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인은 N-말단 영역, 소수성 영역 및 C-말단의 분비 단백질 전달 부위(secreted protein cleavage site)의 3 부분으로 이루어진 시그널 펩타이드(signal peptides)에서 헬릭스(helix)를 형성해 세포막 표적(targeting) 활성을 부여하는 소수성 영역을 갖도록 고안된 것이다. 이러한 거대분자 전달 도메인은 세포에 손상을 주지 않으면서 직접 세포막을 관통함으로써 표적 단백질을 세포내로 이동시켜 목적하는 기능을 발휘하게 할 수 있다.
본 발명에 따라 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 융합될 수 있는 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 거대분자 전달 도메인을 하기 표 1a 내지 1i 에 나타내었다.
[표 1a]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
[표 1b]
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 1c]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 1d]
Figure pct00009
Figure pct00010
[표 1e]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
[표 1f]
Figure pct00014
Figure pct00015
[표 4g]
Figure pct00016
Figure pct00017
[표 1h]
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
[표 1i]
Figure pct00021
Figure pct00022
본 발명의 바람직한 실시태양에서는, 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인으로 카포시 섬유아세포 성장인자(kaposi fibroblast growth factor 4, kFGF4)로부터 유래된 서 열번호: 3 의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD(이하, "MTD1"로 약칭함), 살모넬라엔테리카 아종(Salmonella enterica subsp.)으로부터 유래된 가상 단백질(hypothetical screted protein)인 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 갖는 JO-57 MTD(이하, "MTD2"로 약칭함), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor)로부터 유래된 펩타이드 결합백질(peptide binding protein)인 서열번호: 88 의 아미노산 서열을 갖는 JO-85 MTD(이하, "MTD3"으로 약칭함), 스트렙토마이세스 코엘리콜러로부터 유래된 추정 단백질(putative secreted protein)인 서열번호: 16 의 아미노산 서열을 갖는 JO-13 MTD(이하, "MTD4"로 약칭함), 및 인간(Homo sapiens)으로부터 유래된 세포 억제자(cellular repressor)인 서열번호: 111 의 아미노산 서열을 갖는 JO-108 MTD (이하, "MTD5"로 약칭함)를 사용한다.
본 발명의 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질은 거대분자 전달 도메인으로 상기 5 종의 MTD(kFGF4-유래 MTD: MTD1, JO-57: MTD2, JO-85: MTD3, JO-13: MTD4, JO-108: MTDs) 중의 어느 하나가 종양 및 전이억제인자 RUNX3 의 한쪽 또는 양쪽 말단에 융합되고, 이 융합컨스트럭트의 한쪽 말단에 서열번호: 197 의 아미노산 서열을 갖는 SV40 거대 T 항원(SV40 large T antigen) 유래 세포핵 배치 서열(nuclear localization scquence: NLS)과 용이한 정제를 위해 히스티딘-표지(histidine-tag, His-Tag) 친화성 도메인이 융합되어 있는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서는, kFGF4-유래 MTD 를 이용한 RUNX3 재조합 단백질로서 3 개의 전장 형태(full-length forms)와 6 개의 결절형태(truncated forms)를 고안한다.
본 발명에서 용어 "전장 형태"는 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 의 N-말단, R-말단 및 PST-풍부 도메인 모두를 포함하는 형태를 의미하고, 용어 "결절 형태"는 N-말단, R-말단 및 PST-풍부 도메인 중 어느 하나 또는 2개의 도메인이 결실된 형태를 의미한다.
도 1a 를 참고로 하면, 본 발명에 따른 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질은
1) 전장의 RUNX3N-말단에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HM1R3,
2) 그의 C-말단에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HR3M1, 및
3) 그의 양 말단에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HM1R3M1 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있다.
상기 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HM1R3 은 서열번호: 199 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 198 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M1 은 서열번호: 201 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 200 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM1R3M1은 서열번호: 203 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 202 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
또한, 본 발명에 따른 결절 형태의 RUNX3 재조합 단백질은
1) R-말단 및 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3의 N-말단 도메인에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HR3NM1,
2) N-말단 및 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3의 R-말단 도메인에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HR3RM1,
3) N- 및 R-말단 도메인이 결실된 RUNX3 의 PST-풍부 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3PM1,
4) PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3 의 N- 및 R-말단 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3NRM1, 및
5) N-말단 도메인이 결실된 RUNX3 의 R-말단 및 PST-풍부 도메인에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HR3RPM1, 및
6) N-말단 도메인이 결실되고 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 68 번부터 200 번까지의 R-말단 및 일부 PST-풍부 도메인을 포함하는 RUNX3 의 PST-풍부 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3CRM1 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있다.
상기 결절 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HR3NM1 은 서열번호: 205 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 204 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3RM1 은 서열번호: 207 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 206 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3PM1 은 서열번호: 209 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 208 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3NRM1 은 서열번호: 211 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 210 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3RPM1 은 서열번호: 213 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 212 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3CRM1 은 서열번호: 215 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 214 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 발명의 다른 실시형태에서는, 거대분자 전달 도메인으로 JO-57 MTD, JO-85 MTD, JO-13 MTD 및 JO-108 MTD 를 이용한 RUNX3 재조합 단백질로서 각각 3개의 전장 형태를 고안한다.
도 1b 를 참고로 하면, 본 발명에 따른 전장 형태의 RUNX3 에 JO-57 MTD 가 융합된 재조합 단백질은
1) 전장의 RUNX3N-말단에 JO-57 MTD 가 융합된 HM2R3,
2) 그의 C-말단에 JO-57 MTD가 융합된 HR3M2, 및
3) 그의 양 말단에 JO-57 MTD 가 융합된 HM2R3M2 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있다.
또한 본 발명에 따른 전장 형태의 RUNX3 에 JO-85 MTD 가 융합된 재조합 단백질은
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-85 MTD 가 융합된 HM3R3,
2) 그의 C-말단에 JO-85 MTD 가 융합된 HR3M3, 및
3) 그의 양 말단에 JO-85 MTD 가 융합된 HM3R3M3 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있다.
또한 본 발명에 따른 전장 형태의 RUNX3 에 JO-13 MTD 가 융합된 재조합 단백질은
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-13 MTD 가 융합된 HM4R3,
2) 그의 C-말단에 JO-13 MTD 가 융합된 HR3M4, 및
3) 그의 양 말단에 JO-13 MTD 가 융합된 HM4R3M4 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있다.
또한 본 발명에 따른 전장 형태의 RUNX3 에 JO-108 MTD 가 융합된 재조합 단백질은
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-108 MTD 가 융합된 HM5R3,
2) 그의 C-말단에 JO-108 MTD 가 융합된 HR3M5, 및
3) 그의 양 말단에 JO-108 MTD 가 융합된 HM5R3M5 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있다.
상기 JO-57 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HM2R3 은 서열번호: 217 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 216 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M2 는 서열번호: 219 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 218 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM2R3M2 는 서열번호: 221 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 220 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
상기 JO-85 MTD가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HM3R3 은 서열번호: 223 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 222 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M3 은 서열번호: 225 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 224 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM3R3M3 은 서열번호: 227 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 226 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
상기 JO-13 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HM4R3 은 서열번호: 229 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 228 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M4 는 서열번호: 231 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 230 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM4R3M4 는 서열번호: 233 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 232 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩 된다.
상기 JO-108 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HM5R3 은 서열번호: 235 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 234 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M5 은 서열번호: 237 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 236 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM5R3M5 은 서열번호: 239 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 238 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 발명에서는 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지와 NLS 만이 융합된 RUNX3 재조합 단백질 HR3 을 제조한다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 241 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 240 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
또한 본 발명은 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.
본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA 를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 달성될 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에 사용가능한 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈(initiation codon), 종결코돈(termination codon), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)와 같은 발현조절서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열(signal sequence) 또는 리더서열(leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현벡터는 예를 들면, pHR3M1 일 수 있다. 상기 재조합 발현벡터 pHR3M1 은 pET-28a(+) 벡터(Novagen, Germany)의 다중 클로닝 부위(multi cloning site, MCS) 중 NdeI 제한효소 부위에, 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질로서 전장의 RUNX3 의 C-말단에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 재조합 단백질 HR3M1 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 단백질의 정제를 용이하게 할 목적으로 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 N-말단 부위에 인위적으로 6 개의 히스티딘-표지(histidine-tag)를 포함시켜 발현시키기 위하여, His-Tag 서열을 가지고 있는 pET-28a(+) 벡터(Novagen, Germany)에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝한다.
상기 재조합 발현벡터로부터 발현되는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질은 전장 또는 결절 형태의 RUNX3 에 kFGF4-유래 MTD, JO-57 MTD, JO-85 MTD, JO-13 MTD 및 JO-108 MTD 중의 어느 하나가 융합되고 그의 N-말단 부위에 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 연결된 구조를 갖는다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다. 본 발명의 형질전환 세균은 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 대장균을 본 발명의 재조합 발현벡터, 예를 들면 본 발명에 따른 전장의 RUNX3 C-말단에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 세포투과성 재조합 단백질 HR3M1 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 발현벡터 pHR3M1 을 이용함으로써 많은 양의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떠한 방법에 의해서도 가능하며, 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격 유전자 전달법(elcctroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기의 방법으로 제조된 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-57 MTD 가 융합된 HM2R3 및 JO-85 MTD 가 융합된 HM3R3 각각을 포함하는 재조합 발현벡터로 대장균 DH5α 를 형질전환시켜 수득된 DH5α/HM2R3 및 DH5α/HM3R3 을 2008 년 10 월 29 일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-11408BP 및 KCTC-11409BP 로 기탁하였다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 본 발명의 형질전환 세균에 도입된 재조합 발현벡터에서 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 형질전환 세균을 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 것에 의해 수행된다. 상기 형질전환 세균을 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 형질전환 세균이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 후, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건, 예컨대 유전자 발현 유도제인 아이소프로필-β-티오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)의 존재 하에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양이 완료되면, 상기 배양물로부터 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수할 수 있다. 본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한"은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 숙주세포로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
상기 형질전환 세균에서 발현된 재조합 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 병용하여 이용할 수 있다(Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed,, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Mehtods Enzymology vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990).
한편, 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균에서 발현된 재조합 단백질은 단백질 분리 시 단백질의 특성에 따라 용해성 분획(soluble fraction)과 불용해성 분획(insoluble fraction)으로 구분될 수 있다. 발현된 단백질의 대부분이 용해성 분획에 있을 경우에는 상기에 기술된 방법에 따라 별다른 어려움 없이 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 그러나 발현된 단백질의 대부분이 불용해성 분획, 즉, 봉입체(inclusion body) 형태로 존재하는 경우에는, 우레아, 계면활성제 등의 단백질 변성제가 포함된 용액으로 최대한 단백질을 용해시킨 후 원심분리하여 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행함으로써 정제할 수 있다. 이때, 단백질 변성제가 포함된 용액에 의해 단백질의 구조가 변형되어 그 활성을 잃을 수 있으므로 불용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에는 탈염 및 원상화(refolding) 단계가 필요하다. 즉, 상기 탈염 및 원상화 단계는 단백질 변성제가 포함되지 않은 용액을 이용하여 투석 및 희석을 수행하거나 또는 필터를 이용하여 원심분리를 할 수 있다. 또한, 상기 용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에도 정제 시 사용하는 용액 내의 염 농도가 높을 경우에는 이러한 탈염 및 원상화 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서는, 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질이 봉입체 형태로서 불용해성 분획에 존재함을 확인하고, 불용해성 분획으로부터 이를 정제하기 위하여 불용해성 분획을 트리톤 X-100 과 같은 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액에 용해시킨 다음 초음파로 처리하고 원심분리하여 침전물을 수득한다. 상기 수득한 침전물을 변성제인 우레아가 포함되어 있는 용액에 용해시킨 후 원심분리하여 상층액을 수득한다. 우레아를 이용하여 불용해성 분획으로부터 최대한 용해된 본 발명의 재조합 단백질은 히스티딘-결합 정제 키트를 사용하여 정제하고, 이후 정제된 단백질은 아미콘필터 등을 이용한 원심분리에 의해 염분의 제거 및 단백질 구조의 원상화 과정을 수행함으로써 본 발명의 재조합 단백질을 수득할 수 있다.
아울러 본 발명은 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 RUNX3 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 세포투과성을 갖는 RUNX3 재조합 단백질은 종양 및 전이 억제인자인 RUNX3 가 결손되거나 기능이 상실된 경우에 RUNX3 를 세포 내로 고효율로 도입하여 TGF-β 신호전달 기작을 재활성화시킴으로써 인간의 위암을 포함하는 다양한 암의 형성 및 전이를 예방 및/또는 치료하기 위한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네습 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함한다. 경구 투여용의 경우, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슬, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함하며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 사용할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 조성물은 다양한 비경구 또는 경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신)와 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 투여 경로로는 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사, 정맥 주사, 종양 직접 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1 회 투여 시 5 내지 20 mg의 유효 투여량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 단백질의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 재조합 단백질의 항암제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(CP-RUNX3)의 제조
＜1-1＞ kFGF4-유래 MTD 를 이용한 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 제조
kFGF4-유래 MTD(MTD1)를 이용하여 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 제조하기 위하여 하기와 같이 3 개의 전장 형태와 6 개의 결절형태를 고안하였다(도 1a).
구체적으로, 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서
1) 전장의 RUNX3N-말단에 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HM1R3,
2) 그의 C-말단에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3M1 , 및
3) 그의 양 말단에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HM1R3M1 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해, 이들 각각에 특이적으로 고안된 프라이머 쌍과 인간 RUNX3 cDNA 를 주형으로 사용하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 이때 HM1R3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 244 및 243 의 염기서열을 가지고; HR3M1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 242 및 245 의 염기서열을 가지며; HM1R3M1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 244 및 245 의 염기서열을 갖는다.
또한, 결절 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서,
1) R-말단 및 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3 의 N-말단 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3NM1,
2) N-말단 및 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3 의 R-말단 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3RM1,
3) N- 및 R-말단 도메인이 결실된 RUNX3 의 PST-풍부 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3PM1,
4) PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3 의 N- 및 R-말단 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3NRM1, 및
5) N-말단 도메인이 결실된 RUNX3 의 R-말단 및 PST-풍부 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3RPM1, 및
6) N-말단 도메인이 결실되고 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 68 번부터 200 번까지의 R-말단 및 일부 PST-풍부 도메인을 포함하는 RUNX3 의 PST-풍부 도메인에 kFGF4-유래 MTD 가 융합된 HR3CRM1 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 7 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해, 이들 각각에 특이적으로 고안된 프라이머 쌍과 인간 RUNX3 cDNA 를 주형으로 사용하는 PCR 을 수행하였다. 이때 HR3NM1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 246 및 247 의 염기서열을 가지고; HR3RM1의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 248 및 249 의 염기서열을 가지며; HR3PM1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 250 및 245 의 염기서열을 가지고; HR3NRM1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 246 및 249 의 염기서열을 가지며; HR3RPM1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 248 및 245 의 염기서열을 가지고; HR3CRM1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 251 및 252 의 염기서열을 갖는다.
상기 PCR 반응은 주형으로 인간 RUNX3 cDNA 가 클로닝된 플라스미드 DNA(충북대학교 의과대학 의학과) 100 ng, 각 0.2 mM 의 최종 농도 dNTP 혼합물, 1 μM 의 각 프라이머, 10x Taq 완충액 5 ㎕, 및 Taq 중합효소(Novagen, Germany) 1 ㎕를 포함하는 용액을 최종 부피 50 ㎕반응액으로 하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5 분간 열변성(denaturing)시킨 후 94℃에서 20초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 30 초의 반응을 25 회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 5 분간 증폭하였다. 반응이 끝난 후 1.0％ 아가로즈 겔에 전기영동(electrophoresis)을 수행하여 증폭된 생성물을 확인하였다.
도 2a 에 나타난 바와 같이, 각각의 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편이 목적하는 크기로 증폭되었음을 확인하였다.
아가로즈 겔에서 증폭된 재조합 단편을 회수한 후 이들 각각을 상용의 키트(QIAquick Gel extraction kit; Qiagcn, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 추출한 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)에 삽입한 후(도 3a), 이 벡터를 대장균 DH5α 감응세포(supercompetent cell)에 형질전환시켰다. 이를 100 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 포함된 평판 LB 배지 상에서 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하고, 이를 다시 액체 LB 배지에서 배양한 후, 이로부터 각각의 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편이 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 다량으로 수득하였다.
도 3b 는 pGEM-T Easy 벡터에 삽입된 재조합 단편을 NdeI 제한효소(Enzynomics, Korea)로 분리하여 아가로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 재조합 단편이 상기 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.
상기에서 각각의 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편이 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 제한효소 NdeI 을 사용해 37℃에서 1 시간 동안 절단(digestion)하여 각각의 재조합 단편을 얻었다. 한편, 히스티딘-표지(histidine-tag)와 T7 프로모터를 가진 발현벡터 pET-28(+)a 벡터(Novagen, Germany)를 제한효소 NdeI 을 사용해 상기와 동일한 조건으로 절단하였다. 상기 재조합 단편과 절단된 pET-28a(+) 벡터를 전기영동으로 분리하여 상용의 키트(QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 이들의 혼합물에 T4 DNA 연결효소(ligase; Takara, 일본)를 첨가하고 16℃에서 12 시간 동안 라이게이션(ligation)시킨 후, DH5α 감응세포에 형질전환시켜 재조합 단백질 발현벡터를 수득하였다(도 4a).
도 4b 는 pET-28a(+) 벡터에 삽입된 재조합 단편을 NdeI 제한효소(Enzynomics, Korea)로 분리하여 아가로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편이 pET-28(+)a 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.
이렇게 수득된 재조합 단백질 발현벡터를 각각 pHM1R3, PHR3M1, pHM1R3M1, PHR3NM1, PHR3RM1, pHR3PM1, pHR3NRM1, PHR3RPM1, 및 pHR3CRM1 으로 명명하였다.
염기서열 분석 결과, 상기 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서, HM1R3 은 서열번호: 199 의 아미노산 서열을 가지며,이는 서열번호: 198 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M1 은 서열번호: 201 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 200 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM1R3M1 은 서열번호: 203 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 202 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 확인하였다.
또한, 상기 결절 형태의 RUNX3 재조합 단백질에서, HR3NM1 은 서열번호: 205 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 204 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3RM1 은 서열번호: 207 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 206 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3PM1 은 서열번호: 209 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 208 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3NRM1 은 서열번호: 211 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 210 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3RPM1 은 서열번호: 213 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 212 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, HR3CRM1 은 서열번호: 215 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 214 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 염기서열 분석으로 확인하였다.
본 발명에서는 상기 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지와 NLS 만이 융합된 RUNX3 재조합 단백질 HR3을 제조하였다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 241 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 240 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
＜1-2＞ JO-57, JO-85, JO-13 및 JO-108 MTBs를 이용한 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 제조
JO-57 MTD(MTD2), JO-85 MTD(MTD3), JO-13 MTD(MTD4) 및 JO-108 MTD(MTD5)를 이용하여 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 제조하기 위하여 하기와 같이 각각의 MTD 에 대해 3 개의 전장 형태를 고안하였다.
먼저, JO-57 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단백질로서,
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-57 MTD 가 융합된 HM2R3,
2) 그의 C-말단에 JO-57 MTD 가 융합된 HR3M2, 및
3) 그의 양 말단에 JO-57 MTD 가 융합된 HM2R3M2 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해 상기 실시예 ＜1-1＞과 동일한 방법으로 PCR 을 수행하였다. 이때 HM2RM3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 253 및 243 의 염기서열을 가지고; HR3M2 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 242 및 254 의 염기서열을 가지며; HM2R3M2 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 253 및 254 의 염기서열을 갖는다.
또한, JO-85 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단백질로서,
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-85 MTD 가 융합된 HM3R3,
2) 그의 C-말단에 JO-85 MTD 가 융합된 HR3M3, 및
3) 그의 양 말단에 JO-85 MTD 가 융합된 HM3R3M3 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 친스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해 상기 실시예 ＜1-1＞과 동일한 방법으로 PCR 을 수행하였다. 이때 HM3R3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 255 및 243 의 염기서열을 가지고; HR3M3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 242 및 256 의 염기서열을 가지며; HM3R3M3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 255 및 256 의 염기서열을 갖는다.
또한, JO-13 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단백질로서,
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-13 MTD 가 융합된 HM4R3,
2) 그의 C-말단에 JO-13 MTD 가 융합된 HR3M4, 및
3) 그의 양 말단에 JO-13 MTD 가 융합된 HM4R3M4 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해 상기 실시예 ＜1-1＞과 동일한 방법으로 PCR 을 수행하였다. 이때 HM4R3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 257 및 243 의 염기서열을 가지고; HR3M4 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 242 및 258 의 염기서열을 가지여; HM4R3M4 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 257 및 258 의 염기서열을 갖는다.
또한, JO-108 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단백질로서,
1) 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-108 MTD 가 융합된 HM5R3,
2) 그의 C-말단에 JO-108 MTD 가 융합된 HR3M5, 및
3) 그의 양 말단에 JO-108 MTD 가 융합된 HM5R3M5 으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS 가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해 상기 실시예 ＜1-1＞과 동일한 방법으로 PCR 을 수행하였다. 이때 HM5R3 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 259 및 243 의 염기서열을 가지고: HR3M5 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 242 및 260 의 염기서열을 가지며; HM5R3M5 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 259 및 260 의 염기서열을 갖는다.
이로부터 증폭된 각각의 재조합 단편을 상기 실시예 ＜1-1＞과 동일한 방법으로 pGEM-T Easy 벡터에 삽입하여 서브클론(subclone)을 확보한 후, 이를 다시 pET-28(+)a 벡터에 삽입하여 각각의 재조합 단백질 발현벡터를 수득하였다. pGEM-T Easy 벡터 및 pET-28(+)a 벡터로의 각각의 재조합 단편의 삽입은 도 3c 및 4c 에서 확인하였다.
이렇게 수득된 재조합 단백질 발현벡터를 각각 pHM2R3, pHR3M1, pHM2R3M2, pHM3R3, pHR3M3, pHM3R3M3, pHM4R3, pHR3M4, pHM4R3M4, pHM5R3, pHR3M5 및 pHM5R3M5 로 명명하였다.
이들 중에서 전장의 RUNX3 N-말단에 JO-57 MTD가 융합된 HM2R3 및 JO-85 MTD 가 융합된 HM3R3 각각을 포함하는 재조합 발현벡터로 대장균 DH5α 를 형질전환시켜 수득된 DH5α/HM2R3 및 DH5α/HM3R3 을 2008 년 10 월 29 일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-11408BP 및 KCTC-11409BP 로 기탁하였다.
염기서열 분석 결과, 상기 JO-57 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서, HM2R3 은 서열번호: 217 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 216 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, HR3M2 는 서열번호: 219 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 218 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM2R3M2 는 서열번호: 221 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 220 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 확인하였다.
상기 JO-85 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서, HM3R3 은 서열번호: 223 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 222 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M3 은 서열번호: 225 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 224 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM3R3M3 은 서열번호: 227 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 226 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
염기서열 분석 결과, 상기 JO-13 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서, HM4R3 은 서열번호: 229 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 228 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M4 는 서열번호: 231 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 열번호: 230 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM4R3M4 는 서열번호: 233 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 232 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 확인하였다.
상기 JO-108 MTD 가 융합된 전장 형태의 RUNX3 재조합 단백질로서, HM5R3 은 서열번호: 235 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 234 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HR3M5 은 서열번호: 237 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 236 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, HM5R3M5 은 서열번호: 239 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 238 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
상기 실시예 ＜1-1＞ 및 ＜1-2＞에서 각각의 MTD 가 융합된 RUNX3 재조합 단편의 증폭을 위해 사용된 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 하기 표 2 에 정리하였다.
[표 2]
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 2: 재조합 단백질의 발현
＜2-1＞ 최적의 숙주균주 선발
세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 발현유도에 가장 적합한 숙주균주를 선발하기 위하여, LacI 프로모터를 갖는 대장균 BL21(DE3), BL21 Gold(DE3), BL21 CodonPlus(DE3) 및 BL21 Gold(DE3) pLysS(Stratagene, USA)를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 ＜1-1＞에서 제조된 재조합 발현벡터 pHM1R3, pHR3M1, pHM1R3M1 및 pHR3(대조군) 각각을 상기 대장균 균주 BL21(DE3), BL21 Gold(DE3), BL21 CodonPlus(DE3) 및 BL21 Gold(DE3) pLysS 각각에 열 충격(heat shock) 방법으로 형질전환시킨 후 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 1 ㎖, LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 100 ㎖ LB 배지에 접종하고 37℃에서 OD600 이 0.5 에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 0,5 mM 의 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가하고 37℃에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이로부터 배양액 1 ㎖을 채취하여 상온에서 분당 회전수 13,000 rpm 으로 1 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 시료 로우딩 완충액(2×sample loading buffer: 125 mM Tris-HCl, 20 ％ 글리세롤, 2 ％ β-머캅토에탄올, 0.04％ 브로모페놀 블루, 4％ SDS, pH 6.8)에 현탁한 후 100℃에서 5 분간 끓여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 분당 회전수 13,000 rprm로 1분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용해성 분획을 분리, 회수하였다. 이로부터 분리된 용해성 분획과 불용해성 분획 각각을 SDS-PASE 에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다.
도 5a 에 나타난 바와 같이, 다양한 숙주균주를 대상으로 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 조사한 결과, BL21 CodonPlus(DE3) 균주에서 가장 높은 발현량이 확인되어 이를 재조합 단백질의 발현을 위한 최적의 균주로 선택하였다.
＜2-2＞ 재조합 단백질의 발현 유도
상기 실시예 ＜2-1＞에서 최적의 균주로 확인된 대장균 BL21 CodonPlus(DE3)에 재조합 발현벡터 pHR3(대조군), pHM1R3, pHR3M1, pHM1R3M1, pHM2R3 및 pHM3R3 각각을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 1 ㎖ LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 100 ㎖ LB 배지에 접종하고 37℃에서 OD600 이 0.5 에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 0.5 mM 의 IPTG 를 첨가하거나(+) 첨가하지 않고(-) 37℃에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이로부터 배양액 1 ㎖을 채취하여 상온에서 분당 회전수 13,000 rpm 으로 1 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 2x 시료 로우딩 완충액(125 mM Tris-HCl, 20％ 글리세롤, 2％ β-머캅토에탄올, 0.04％ 브로모페놀 블루, 4％ SDS, pH 6.8)에 현탁한 후 100℃에서 5분간 끓여 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄물을 분당 회전수 13,000 rpm 로 1 분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용해성 분획을 분리, 회수하였다. 이로부터 분리된 용해성 분획과 불용해성 분획 각각을 SDS-PAGE 에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다.
도 5b 에 나타난 바와 같이, 약 47.5 kDa 의 크기를 갖는 본 발명의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질은 봉입체 형태로 대부분 불용해성 분획에 포함되어 있으며, IPTG 무처리 배양액(-)에 비해 IPTG 처리 배양액(+)에서 목적 단백질의 발현이 현저히 증가됨을 확인하였다.
실시예 3: 재조합 단백질의 정제
본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질은 봉입체 형태로 불용해성 분획에 존재하므로 이를 정제하기 위해 강력한 변성제로서 계면활성제인 SDS 를 이용하였다.
먼저, 본 발명의 재조합 발현벡터 pHM1R3, pHR3M1, pHM1R3M1, pHM2R3 및 pHM3R3 각각으로 형질전환된 BL21 CodonPlus(DE3) 균주를 상기 실시예 2에서와 같이 1ℓ의 LB 배지에 배양하였다. 각각의 배양액을 원심분리하여 수득한 균체를 100 ㎖의 세척 완충액(100 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0)에 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 현탁하고, 상온에서 15 분간 정치하였다. 이어서 상기 세포 현탁액에 0.1 g 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)를 첨가하고, 균질하게 혼합될 수 있도록 피펫팅(pipetting)하였다. 이를 마이크로팁(microtip)이 장착된 초음파 균질기를 이용하여 저온에서 균체를 파쇄하였다. 이때, 처리시간은 장치의 출력을 최대출력의 27％로 설정하고, 30 초 처리 후 10 초 방치를 10 분간 반복하였다. 충분히 용균된 봉입체를 4℃에서 8,000 xg 로 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 100 ㎖의 세척 완충액(100 mM Tris-HCl, 0.1 ％ 소디움 데옥시콜레이트, 5 mM EDTA, pH 8.0)에 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 현탁한 후, 다시 4℃에서 8,000 xg 로 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 회수하였다. 이상의 세척 과정을 두 번 반복한 다음 회수된 침전물을 -20℃에서 12 내지 16 시간 동안 보관하였다. 그 후 회수된 침전물을 30 ㎖의 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, 0.1 ％ SDS, 1 mM DTT, pH 8.0)에 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 현탁하고, 마이크로팁이 장착된 초음파 균질기를 이용하여 저온에서 균체를 파쇄하였다. 이때, 처리시간은 장치의 출력을 최대출력의 27％로 설정하고, 30 초 처리 후 10 초 방치를 5 분간 반복하였다. 충분히 용균된 봉입체를 4℃에서 8,000 xg 로 10 분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액을 나이트릴로트라이아세트산 아가로스(nitrilotriacetic acid agarose)에 Ni 를 부여한 Ni-NTA 아가로스 레진에 로우딩하였다. 이때 Ni-NTA 아가로스는 미리 용해 완충액으로 여러 번 세척하여 평형화시킨 후 사용하였다. 상층액을 상온에서 1 시간 이상 진탕기로 천천히 교반하면서 레진에 흡착시켰다. 재조합 단백질이 포함된 봉입체가 흡착된 레진을 4℃의 분당 회전수 1,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여 반응액을 제거하였고, 비특이적 흡착 물질을 제거하기 위해 레진을 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, 0.1 ％ SDS, 1 mM DTT, pH 8.0)을 이용하여 1 회 세척하였다. 세척된 레진에 레진 용적2 배의 용출 완충액(elution buffer: 250 mM 이미다를 함유)을 로우딩하고 진탕기에서 1 시간 이상을 상온에서 교반하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 12％ SDS-PAGE 겔에서 전기영동을 수행한 후 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R(coomassie brilliant blue R)로 가볍게 진탕하면서 염색하고, 목적 단백질의 밴드가 명확해질 때까지 탈색액을 이용하여 탈색하였다.
그 결과, 도 6a 및 6b 에 나타난 바와 같이, 마커 단백질의 영동위치와 비교하여 kFGF4-유래 MTD, JO-57 MTD 및 JO-85 MTD 가 각각 융합된 모든 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질이 약 47.5 kDa 부위에서 단일 밴드로 검출되어 불용해성 분획으로부터 순수하게 정제되었음을 확인하였다.
실시예 4: 세포투과성 실험
＜4-1＞ 유세포 분석
본 발명에 따른 RUNX3 재조합 단백질의 세포투과성을 검증하기 위해 마우스의 대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포(한국세포주은행, 서울, 대한민국)를 대상으로 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3, HR3M1, HM1R3M1, HM3R3)을 이용한 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다.
먼저, 상기 RUNX3 재조합 단백질에 FITC(fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe)를 이용하여 형광을 표지하였다. 2 내지 20 mg의 재조합 단백질에 대해 333 mg/㎖ 농도의 FITC 1 ㎕를 사용하며, 빛을 피해 상온에서 1시간 동안 진탕하면서 결합시켰다. 형광으로 표지된 RUNX3 재조합 단백질은 4℃에서 1일간 DMEM 배지에 대해 투석하여 표지되지 않은 FITC를 제거하였고, 이로부터 회수된 재조합 단백질은 브래드포드(Bradford) 단백질 정량법으로 그 농도를 분석하였다. 그 결과 각각의 재조합 단백질의 농도는 약 1 ㎍/㎕로 측정되었다.
RAW 264.7 세포를 10％ 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS) 및 5％ 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지에서 배양한 후, FITC가 결합된 각각의 재조합 단백질을 10 μM 농도로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 종결된 후, 단백질이 처리된 RAW 264.7 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 FITC를 제거하기 위해 트립신/EDTA(T/E)를 처리하고, 저온의 PBS로 3번 세척한 후 FACS Calibun(Beckton-Dickinson)의 셀꿰스트 프로 소프트웨어(CellQuest Pro software) 프로그램을 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b 에 나타난 바와 같이, kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 경우, MTD가 융합되지 않은 대조군(HR3)에 비해 N-말단에 상기 MTD가 융합된 HM1R3 및 C-말단에 상기 MTD가 융합된 HR3M1의 세포투과성이 뚜렷이 나타났다. JO-85 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 경우에는, MTD가 융합되지 않은 대조군(HR3)에 비해 N-말단에 상기 MTD가 융합된 HM3R3에서 세포투과성이 우수하였다. 도 7a 및 7b 에서 회색의 곡면은 세포 단독 대조군, 검은색 곡선은 FITC 단독 대조군, 파랑색 곡선은 MTD가 융합되지 않은 HR3 대조군 단백질, 빨간색 곡선은 각각 MTD1 이 N-말단에 융합된 HM1R3, MTD1 이 C-말단에 융합된 HR3M1, MTD1 이 양 말단에 융합된 HM1R3M1, 및 MTD3 이 N-말단에 융합된 HM3R3을 나타낸다.
＜4-2＞ 동초점 레이저 주사 현미경 관찰 Ⅰ
상기 실시예 ＜4-1＞에서 유세포 분석에 의해 1차적으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 RUNX3 재조합 단백질(HM1R3, HR3M1, HM1R3M1, HM2R3, HM3R3)을 MTD가 융합되지 않은 RUNX3 대조군 단백질(HR3)과 함께 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포(한국세포주은행, 서울, 대한민국)에 10 μM의 농도로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다, 사용된 NIH3T3 세포는 배지 총량의 10％ FBS와 5％ 페니실린/스트렙토마이신 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하다. 또한, 재조합 단백질의 FITC 형광표지를 보존하기 위해 10㎕의 중첩 배지(mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15분 후에 관찰하였다. 상기 재조합 단백질이 처리된 세포는 MTD의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 염색하는 PI(propidium iodide) 염색을 통해 핵 내로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였으며, 동초점 레이저 주사 현미경은 노르마스키 필터(normaski filter)를 이용하여 세포의 원형, FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질이 처리된 세포에서 뚜렷한 FITC 형광(연두색) 및 PI(붉은색)로 염색된 핵 내로의 단백질 전달이 관찰되었으며, 상기 결과는 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과와 일치하는 것이다.
＜4-3＞ 동초점 레이저 주사 현미경 관찰 Ⅱ
상기 실시예 ＜4-2＞에서 배양된 세포를 대상으로 세포투과성이 확인된 본 발명에 따른 RUNX3 재조합 단백질이 조직 상태에서도 세포투과성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 이를 위해 7주령의 마우스(Balb/c mice, 중앙실험동물, 서울)를 실험동물로 사용하였다. 상기 마우스에 FITC로 표지된 200 ㎍의 세포 투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)을 복강 주사(intraperitoneal injection)하였다. 2시간 후 각 그룹 마우스를 희생시키고 이로부터 간, 신장, 비장, 폐, 심장, 뇌를 적출하였다. 적출된 조직을 OCT화합물로 봉입하고 냉동시킨 후 마이크로톰(microtome)을 이용하여 두께 14 ㎛로 박절하였다. 조직 절편을 슬라이드 위에 놓고 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 이때, 재조합 단백질의 FITC 형광표지를 보존하기 위하여 10 ㎕의 중첩배지(mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15분 후에 관찰하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질이 투여된 마우스 유래 모든 조직에서 FITC 형광(연두색)으로 뚜렷하게 염색된 핵 내로의 단백질 전달이 관찰되었으며, 상기 결과는 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과와 일치하는 것이다.
상기 실시예 ＜4-1＞ 내지 ＜4-3＞의 결과로부터 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질은 세포투과성이 우수하여 목적하는 RUNX3 단백질을 세포 및 조직 내로 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 세포 내 기능
＜5-1＞ 웨스턴 블롯팅
세포투과성이 입증된 RUNX3 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석을 수행하였다.
본 실험에 이용된 위암 세포주 MKN 28과 NCI-N87은 한국세포주은행(서울, 대한민국)에서 구입하였다. MKN 28과 NCI-N87 세포각각을 RPMI 1640 배지(L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES 및 25 mM NaHCO3 89.3％, 열 불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 한 별당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종하여 37℃에서 1일간 배양한 후, 세포주기를 동일하게 만들기 위해 다시 1일간 혈청이 없는 조건에서 배양하였다. 배지를 제거한 후 MKN 28과 NCI-N87 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3과 대조군 단백질 HR3을 각각 10 μM 농도로 1시간 동안 처리하였다. 단백질을 제거한 후 세포를 PBS로 세척하고 12시간 동안5％ CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포를 200 ㎕의 용해 완충액(20 mM HEPES, pH 7.2, 1％ 트리톤-X, 10％ 글리세롤)을 이용하여 얼음에서 30분간 용해(lysis)시키고 이로부터 수득된 세포 용해물(cell lysate)을 4℃에서 분당 회전수 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 이로부터 상층액을 제거하고 브래드포드 단백질 정량법으로 용해물 용액에 들어있는 단백질을 정량하였으며, 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
웨스턴 블롯팅 분석을 위하여, p21Wafl/Cip1(21 kDa, Cell Signaling Technology), p27(27 kDa, Santa Cruz Biotechnology), PCNA(36 kDa, Santa Cruz Biotechnology), 절단된 캐스페이즈 3(cleaved caspase 3)(17/19 kDa, Cell Signaling), 사이클린 A(54 kDa, Santa Cruz Biotechnology), 사이클린 E(53 kDa, Santa Cruz Biotechnology), 포스포 Rb(Ser807/811, 110 kDa, Santa Cruz Biotechnology) 및 VEGF(15 kDa, Santa Cruz Biotechnology)를 일차항체로 사용하였고, 염소 창-마우스 IgG-HRP(goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) 및 염소 항-토끼 IgG-HRP(goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology)를 이차항체로 사용하였다. 상기에서 정량된 세포 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 100 V로 전기영동을 수행한 후, PVDF 막으로 100 V에서 1시간 동안 전사시켰다. 전사시킨 막은 항체와의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 TBS/T 완충액(10 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05％ 트윈 20)에 용해시킨 5％(w/v) 분유(powdered milk)로 1시간 동안 블로킹(blocking) 처리를 한 후, 상기 일차항체 각각을 첨가하고 4℃에서 1일간 반응시켰다. 이 후 PVDF 막을 TBS/T 완충액으로 3회 세척한 후 이차항체를 첨가하여 실온에서 1시간 정도 반응시켰다. 이후 PVDF 막을 TBS/T 완충액으로 3회 세척하였고, 화학발광 검출용 ECL(enhanced chemilumincscence, GE Healthcare Amersham UK) 시약을 이용하여 항원을 검출하고 분석하였다.
그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, MKN 28 세포에서는 RUNX3로 인해 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 유발하는 p21 및 p27의 발현과 세포자살을 유발하는 절단된 캐스페이즈 3의 발현은 증가한 반면, 암의 세포주기를 활성화시키는 사이클린 A, 사이클린 E, PCNA 및 Rb의 인산화(P-Rb)와 암 전이를 유발하는 VEGF의 발현은 감소하였다.
또한, 도 10b에 나타난 바와 같이, NCI-N87 세포에서는 RUNX3로 인해 세포주기 정지를 유발하는 p21의 발현 및 세포사멸을 유발하는 절단된 캐스페이즈 3의 발현은 증가한 반면, 암 전이를 유발하는 VEGF의 발현은 감소하였다.
특히, 도 10a 및 도 10b의 결과로부터 N-말단에 JO-85 MTD가 융합된 재조합 단백질 HM3R3은 배양된 암세포의 세포주기를 저해하여 종양형성을 감소시키는 세포주기 저해제로서 월등한 기능적 활성을 나타냄을 확인하였다.
＜5-2＞ 세포사멸 유도효과
세포투과성이 입증된 RUNX3 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여, 세포성 DNA 함량 분석(cellular DNA content analysis)을 통해 본 발명에 따른 재조합 단백질의 세포사멸(apoptosis) 유도효과를 조사하였다.
위암 세포주 NCI-N87(한국세포주은행)을 RPMI 1640 배지(L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 89.3％, 열불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종한 후 37℃에서 1일간 배양하였다. 각 웰에 본 발명에 따른 세포투과성 재조합 단백질 HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3과 대조군 단백질 HR3을 각각 5 μM 농도로 처리한 후, 1시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 상기 웰 플레이트를 저온의 PBS로 2회 세척한 후 웰당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 각각 0, 2, 4 및 8시간 동안 추가로 배양하였다. 각각의 배양 시간 경과 후 세포를 저온의 PBS로 2회 세척하고 200 ㎕의 PBS에 부유시킨 다음 이를 4 ㎖의 70％ 에탄올에 조심스럽게 담갔다. 이 세포 부유액을 얼음에서 45분간 방치한 후 -20℃에서 하루 동안 보관하였다. 상기 세포 부유액에 PI(40 ㎍/㎖)와 RNase A(100 ㎍/㎖)를 처리한 후 세포사멸 정도를 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 정량적으로 결정하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 무처리군 및 MTD가 융합되지 않은 대조군 단백질(HR3) 처리군에 비해 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 처리군(HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3)에서 높은 비율로 암세포의 세포주기 진행이 저해되고 세포사멸이 유도됨을 확인하였다. 특히 재조합 단백질을 처리하고 8시간 배양한 경우에서 가장 높은 수준의 세포사멸이 유도되었고, 특히 JO-85 MTD가 융합된 재조합 단백질 HM3R3이 가장 우수한 세포사멸 유도효과를 나타내었다.
＜5-3＞ 암세포 이동 억제효과
세포투과성이 입증된 RUNX3 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 상처 치유 분석(wound healing assay)을 이용하여 재조합 단백질의 암세포 이동 억제효과를 조사하였다.
위암 세포주 MKN 28과 NCI-N87(한국세포주은행)을 각각 RPMI 1640 배지(L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 89.3％, 열불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종한 후 37℃에서 1일간 배양하였다. 각 웰에 본 발명에 따른 세포투과성 재조합 단백질 HM1R3M1, HM2R3 및 HM3R3과 대조군 단백질 HR3을 각각 10 μM 농도로 처리한 후, 1시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 10 ㎕ 피펫팁으로 웰의 중앙 부위에 있는 세포들을 긁어서 제거하였다, 상기 웰 플레이트에 1 ㎖ RPMI 1640 배지를 첨가하고 5％ CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 암세포의 이동(migration) 정도를 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 12a에 나타난 바와 같이, MKN 28 세포에서는 무처리군 및 MTD가 융합되지 않은 대조군 단백질(HR3) 처리군에 비해 kFGF4-유래 MTD가 융합된 HM1R3M1 및 JO-57 MTD가 융합된 HM2R3, JO-85 MTD가 융합된 HM3R3 처리군에서 암세포의 이동이 억제됨을 확인하였다.
또한, 도 12b에 나타난 바와 같이, NCI-N87 세포에서도 무처리군 및 MTD가 융합되지 않은 대조군 단백질(HR3) 처리군에 비해 JO-85 MTD가 융합된 HM3R3 처리군에서 암세포의 이동이 억제됨을 확인하였다.
실시예 6: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 생체 내 기능
＜6-1＞투여 기간 중의 항암효과
세포투과성이 입증된 RUNX3 재조합 단백질의 생체 내 기능을 확인하기 위하여, 하기와 같이 동물모델을 이용하여 항암효과를 검증하였다.
본 실험에서는 면역력이 결핍된 7주령의 누드마우스(Balb/c nu/nu mice, 중앙실험동물, 서울)를 각 그룹당 4마리씩 총 4 그룹으로 나누어 실험하였다. 상기 마우스의 오른쪽 다리에 위암 세포주인 NCI-N87 세포(한국세포주은행)를 1x107 세포수로 주사기(omnican, Germany, B.BRAUH)를 사용하여 피하 주사(subcutaneous injection)하였다. 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 이용하여 종양 크기(너비2×길이/2)가 90 내지 100 ㎟으로 측정된 날부터 0.5 ㎍/㎕ 농도의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 HM2R3(그룹 3) 및 HM3R3(그룹 4)을 각각 100 ㎍씩 26일간 복강 주사(intraperitoneal injection)하였다. 대조군으로 담체(RPMI 1640 배지, 그룹1)와 MTD가 융합되지 않은 RUNX3 단백질 HR3(그룹 2)을 각각 200 ㎕씩 26일간 동일하게 복강 주사하였다. 26일간 단백질을 처리하면서 매일 각 그룹 마우스의 종양 크기와 몸무게의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 13a 및 13b에 나타내었다.
도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 HM2R3 및 HM3R3이 각각 처리된 마우스(그룹 3 및 4)의 종양 크기는 대조군(그룹 1 및 2)에 비해 그 성장이 현저히 억제된 반면, 실험기간 동안 마우스의 몸무게는 대조군과 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 처리군 모두에서 유의미한 변화를 나타내지 않았다. 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 처리한 마우스 그룹에 생성된 종양크기와 몸무게에 대한 평균치의 p값은 0.05 이하로, 이는 결과의 유의성을 나타낸다.
도 14는 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질이 26일간 투여된 마우스에서 투여 전과 투여 종료 후의 종양 크기의 변화를 나타낸 사진으로, 육안으로도 대조군에 비해 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 처리군의 마우스에서 종양 크기가 현저히 감소하였음을 알 수 있다.
＜6-2＞ 투여 기간 후의 항암효과
본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R3)의 투여 후 체내 항암효과의 지속성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 ＜6-1＞에서와 같이 26일간의 단백질 투여 후에 4 그룹에서 각각2마리의 마우스를 선정하고 모든 처리를 중지한 다음 일주일 동안 종양 크기를 관찰하였다.
그 결과, 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, 단백질 처리 중지 후 모든 그룹에서 종양 크기가 증가되는 양상을 보였는데, 단백질 처리기간 동안에 종양 크기가 상당히 억제되었던 HM2R3 처리군(그룹 3)은 대조군과 같이 종양 크기가 급격히 증가한 반면, HM3R3 처리군(그룹 4)에서는 종양 크기의 증가율이 다른 그룹에 비해 현저히 낮은 수준을 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 HM3R3이 단백질 처리 중지 후에도 생체 내에서 안정적으로 그 유효성을 유지하며, 암 전이 및 세포주기의 저해제로서 지속적으로 작용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 면역조직학적 변화 분석
세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 종양조직 내에서의 면역조직학적 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 6의 마우스 동물 모델을 이용하여 면역조직학적(immunohistochemistry) 염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 6에서와 같이 4 그룹(각 그룹당 4마리)의 마우스에 각각 피하 주사로 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R)과, 대조군으로 담체 및 HR3 단백질을 26일간 처리한 후 다시 5일간의 무처리 관찰기간을 거친 다음, 장기 및 유도된 종양조직을 분리, 적출하였다. 각각의 적출된 장기와 종양조직을 포르말린으로 고정하고 세척한 후 포매 센터(embedding center)에서 62℃에 녹인 파라핀을 이용하여 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록을 마이크로등(microtome)을 이용하여 두께 5 ㎛로 박절하여 슬라이드에 부착시킨 후 자일렌(xylene)을 5분씩 3회 처리하여 파라핀을 제거하였다. 이어서 조직 슬라이드를 100％, 100％, 95％, 70％ 및 50％ 에탄올로 각각 3분씩 순차적으로 처리하여 함수시키고 흐르는 물에서 5분간 세척하였다. 조직에서의 항원 표출을 유도하기 위하여 조직 슬라이드를 0.05％ 트립신/EDTA로 처리한 후 37℃에서 20분간 보관하였다. 이어서 조직 슬라이드를 흐르는 물로 5분간 세척하고 1％ 과산화수소수를 10분간 처리한 후 다시 흐르는 물로 5분간 3회 세척하고 TBS (tris buffered saline)로 5분간 세척하였다. 조직 내 비특이 항원을 차단하기 위해 조직 슬라이드를 표준 말 혈청(normal horse serum)과 1시간 동안 반응시켰다. 이 조직 슬라이드를 일차항체로 p21Wafl/Cip1(21 kDa, Cell Signaling Technology) 및 VEGF(15 kDa, Santa Cruz Biotechnology)와 4℃에서 1일간 반응시킨 후 TBS 완충액으로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 염소 항-마우스 IgG-HRP(goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) 및 염소 항-토끼 IgG-HRP(goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology)를 이차항체로 하여 1시간 동안 반응시킨 후 조직 슬라이드를 DAB(diaminobcnzidine tetrahydrochloride, Vector Laboratories, Inc.) 염색시약을 2 내지 3분간 도포하여 발색시켰다. 이어서 조직 슬라이드를 증류수로 세척하고 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색하였다. 그 후 조직 슬라이드를 95％, 95％, 100％ 및 100％ 에탄올로 10초씩 순차적으로 처리하여 탈수시키고 자일렌으로 10초씩 2회의 투영 과정을 거친 후 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 담체와 대조군 단백질(HR3)을 처리한 마우스의 폐와 종양조직에 비교하여 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)을 처리한 마우스의 폐와 종양조직에서는 세포주기를 억제하는 p21의 발현은 증가한 반면, 암 전이를 유발하는 VEGF의 발현은 감소함을 확인하였다.
실시예 8: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 세포사멸 유도효과 분석 Ⅰ
세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 종양조직 내에서 세포사멸 유도효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6의 마우스 동물 모델을 이용하여 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 6에서와 같이 4 그룹(각 그룹당 4마리)의 마우스에 각각 피하 주사로 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R3)과, 대조군으로 담체 및 HR3 단백질을 26일간 처리한 후 다시 5일간의 무처리 관찰기간을 거친 다음, 유도된 종양조직을 분리, 적출하였다. 상기 실시예 7과 같이 적출된 종양조직으로부터 조직 절편을 제작한 후 이를 슬라이드에 부착시켰다. 상기 조직 슬라이드를 자일렌(xylene)으로 5분간 3회 처리하여 파라핀을 제거하였다. 이어서 조직 슬라이드를 무수 에탄올로 5분간 2회, 90％, 80％ 및 70％ 에탄올로 각각 3분간 순차적으로 처리하여 함수시키고 PBS에서 5분간 보관하였다. 이 후 조직 슬라이드를 8분간 0.1％ 구연산나트륨(sodium citrate) 용액에 녹인 0.1％ 트리톤(Trition®) X-100 용액으로 처리하여 세포를 투과시킨 후, PBS로 2분간 2회 세척하였다. TUNEL 반응 완충액(50 ㎕, Roche, USA)을 상기 조직 슬라이드 위에 처리하고 1시간 동안 37℃ 습윤 배양기에서 보관한 후, PBS로 3회 세척하고 형광현미경(fluorescence microscope)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 담체와 대조군 단백질(HR3)을 처리한 마우스의 종양조직에서는 별다른 변화가 관찰되지 않은 반면, 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)을 처리한 마우스의 종양조직에서는 세포사멸 시 붉게 염색되는 변화가 관찰되어 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 세포사멸 유도효과를 육안으로 확인할 수 있었다. 또한, 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 처리한 마우스 그룹에서는 단백질의 투여를 중지한 후에도 여전히 암세포 내에서 세포사멸이 유도됨을 알 수 있었다.
실시예 9: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 세포사멸 유도효과 분석 Ⅱ
세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 종양조직 내에서 세포사멸 유도효과가 유도됨을 면역조직화학적으로 확인하기 위하여, 아폽태그 퍼옥시다제 정위치 세포사멸 검출 키트(ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, Chemicon, S7100)를 이용하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 6에서와 같이 4 그룹(각 그룹당 4마리)의 마우스에 각각 피하 주사로 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM2R3 및 HM3R3)과, 대조군으로 담체 및 HR3 단백질을 26일간 처리한 후 다시 5일간의 무처리 관찰기간을 거친 다음, 유도된 종양조직을 분리, 적출하였다. 상기 실시예 7과 같이 적출된 종양조직으로부터 조직 절편을 제작한 후 이를 슬라이드에 부착시켰다. 상기 조직 슬라이드를 자일렌으로 5분간 3회 처리하여 파라핀을 제거하였다. 이어서 조직 슬라이드를 100％, 90％ 및 70％ 알코올로 순차적으로 3분간 처리하여 함수시킨 후 5분간 PBS에서 보관하였다. 상기 조직 슬라이드를 20 ㎍/㎖ 농도의 단백분해효소 K(proteinase K, Sigma)로 15분간 처리하고, 증류수로 세척한 후, 3％ H2O2(vol/vol, in PBS)로 5분간 처리하여 내인성 단백분해효소(endogenous peroxidase)의 활성을 억제하였다. 이어서 조직 슬라이드를 평형(equilibration) 완충액으로 10초간 처리한 후, 말단 데옥시뉴클레오티드 전이효소(terminal dexoynucleotidyl transferase, TdT)로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 반응이 종결된 후, 상기 조직 슬라이드를 정지(stop) 완충액으로 처리하고 세척하였다. 이어서 조직 슬라이드를 DAB 발색시약으로 5분간 처리하고 메틸그린(methyl green)으로 대조(counter) 염색하였다. 염색 후 탈수과정을 거친 후 조직 슬라이드 위에 덮개 유리(cover slip)를 봉합하고 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 담체와 대조군 단백질(HR3)을 처리한 마우스의 종양조직에서는 별다른 변화가 관찰되지 않은 반면, 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)을 처리한 마우스의 종양조직에서는 세포사멸 시 갈색으로 염색되는 변화가 관찰되어 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 세포사멸 유도효과를 육안으로 확인할 수 있었다. 또한 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 처리한 마우스 그룹에서는 단백질의 투여를 중지한 후에도 여전히 암세포 내에서 세포사멸이 유도됨을 알 수 있었다.
실시예 10: 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질의 투여 후 단백질 발현 양상 비교
세포투과성 RUNX3 재조합 단백질이 투여된 조직에서 단백질 발현 양상의 변화를 확인하기 위하여 하기와 같이 마이크로어레이(microarray)분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 4 그룹의 마우스에 피하 주사로 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질(HM3R3)과 대조군으로 담체 및 HR3 단백질을 26일간 처리한 후 이 처리를 중지하고 5일간 방치하였다. 총 31일 경과 후, 각 그룹의 마우스에서 종양조직을 분리한 후 이를 액체 질소에서 급속 냉각시켰다. 종양조직으로부터 전체 RNA를 트리졸 시약(TRIZOL, Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 분리하고, 이를 무-RNase DNase(RNase-free DNase, Life Technologies, Inc.)로 처리하여 잔존하는 게놈 DNA를 제거하였다.
상기에서 분리된 RNA에 대해, 표적 cRNA 프로브의 합성 및 혼성화를 제조사의 지침에 따라 저 RNA 투압 선형 증폭 키트(Low RNA Input Linear Amplification kit, Agilent Technology)를 이용하여 수행하였다. 간략히 설명하면, 각각의 총 RNA 1 ㎍과 T7 프로모터 프라이머를 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시켰다. 5× 제1 가닥 완충액, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP 믹스, RNase-Out 및 MMLV-RT(역전사 효소)를 혼합하여 cDNA 마스터 믹스(master mix)를 제조한 후 이를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 65℃에서 15분간 반응시켜 역전사 반응 및 dsDNA 합성을 종결시켰다. 제조사의 지침에 따라 4x전사 완충액(transcription buffer), 0.1 M DTT, NTP 믹스, 50％ PEG, RNase-Out, 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase), T7-RNA 중합효소, 및 사이아닌(cyanine, 3/5-CTP)을 이용하여 전사 마스터 믹스를 제조하였다. 이 전사 마스터 믹스를 dsDNA 반응 혼합물에 첨가하고 40℃에서 2시간 동안 반응시켜 dsDNA의 전사를 수행하였다. 증폭되고 표지된 cRNA를 제조사의 지침에 따라 cRNA 클린업 모듈(cRNA Cleanup Module, Agilent Technology) 상에서 정제하였다. 표지된 cRNA 표적을 NB-1000 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies, Inc.)를 이용하여 정량하였다. 표지 효율을 조사한 후, cRNA에 10x 블로킹 제제(blocking agent) 및 25x 분절 완충액(fragmentation buffer)을 첨가하고 60℃에서 30분간 반응시켜 cRNA의 분절화를 수행하였다. 분절된 cRNA를 2x 혼성화 완충액(hybridization buffer)에 재현탁한 후 전체 마우스 게놈 올리고 마이크로어레이(Whole Human Genome Oligo Microarray, 44K) 상에 피펫을 이용하여 직접 적가하였다. 혼성화 오븐(hybridization oven, Agilent Technology)을 이용하여 상기 마이크로어레이를 65℃에서 17시간 동안 혼성화시켰다. 혼성화된 마이크로어레이를 제조사(Agilent Technology)의 세척 지침에 따라 세척하였다.
혼성화 영상을 DNA 마이크로어레이 스캐너(Agilent Technology)를 이용하여 판독하고 특징 추출 소프트웨어(Feature Extraction Software, Agilent Technology)로 정량하였다. 배수-변이된(fold-changed) 유전자들의 모든 데이터 표준화 및 선별은 진 스프링 GX(Gene Spring GX 7.3, Agilent Technology)를 이용하여 수행되었다. 표준화 비율의 평균은 표준화된 신호 채널 강도를 표준화된 대조군 채널 강도로 나누어 계산하였다. 유전자의 기능적 주석은 유전자 온톨로지 컨소시엄(Gene OntologyTM Consortium, http://www.geneontology.org/index.shtml)에 따라 진 스프링 GX에 의해 수행되었다.
상기 마이크로어레이 분석 결과를 도 18 및 하기 표 3 내지 8에 정리하였는데, 표 3은 세포사멸(apoptosis)에 관련된 유전자들의 발현 양상을 나타낸 것이고, 표 4는 세포 부착(cell adhcsion)에 관련된 유전자들의 발현양상을 나타낸 것이고, 표 5는 세포주기(ccll cycle)에 관련된 유전자들의 발현 양상을 나타낸 것이고, 표 6은 세포 성장(cell growth)에 관련된 유전자들의 발현 양상을 나타낸 것이고, 표 7은 세포 증식(cell proliferation)에 관련된 유전자들의 발현 양상을 나타낸 것이고, 표 8은 방어면역(defense immunity)에 관련된 유전자들의 발현 양상을 나타낸 것이다.
[표 3]
Figure pct00025
[표 4]
Figure pct00026
[표 5]
Figure pct00027
[표 6]
Figure pct00028
[표 7]
Figure pct00029
[표 8]
Figure pct00030
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 세포사멸에 관련된 유전자들의 경우에, 대조군 단백질에 비하여 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 투여군에서 인터루킨 알파(interleukin α, IL1A)와 세마포린(semaphorin 6A, SEMA6A)의 발현이 2배 이상 상향-조절(up-regulation)됨을 알 수 있다.
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 세포 부착에 관련된 유전자들의 경우에, 대조군 단백질에 비하여 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 투여군에서 단백질 탈인산가수분해효소 2(protein phosphatase 2 regulatory, PPP2R 1B), RhoGDP 해리 저해제 γ(RhoGDP dissociation inhibitor γ, ARHGDIG) 및 오피오이드 결합 단백질(opioid binding protein, OPCML)의 발현이 2배 이상 하향-조절(down-regualtion)됨을 알 수 있다.
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 세포주기에 관련된 유전자들의 경우에, 대조군 단백질에 비하여 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 투여군에서 단백질 탈인산가수분해효소 2(protein phosphatase 2 regulatory, PPP2R1B)와 플레이오트로핀(pleiotrophin, PTN)의 발현은 2배 이상 하향-조절된 반면, 세포 성장 중지(cell growth arrest)에 관련된 GAS2L1(growth arrest-speciflc 2 like 1) 및 VASH1(vasohibin1)의 발현은 2배 이상 상향-조절됨을 알 수 있다.
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 세포 성장에 관련된 유전자들의 경우에, 대조군 단백질에 비하여 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 투여군에서 c-JUN, 인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF1), 리보솜 단백질 S6 키나아제(ribosomal protein S6 kinase, RPS6KA3) 및 CD28의 발현이 2배 이상 하향-조절됨을 알 수 있다.
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 세포증식에 관련된 유전자들의 경우에, 대조군 단백질에 비하여 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 투여군에서 CD28 및 콜레시스토키닌-B/가스트린 수용체(cholecystokinin-B/gastrin receptor)의 발현이 2-배 이상 하향-조절됨을 알 수 있다.
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 방어 면역에 관련된 유전자들의 경우에, 대조군 단백질에 비하여 본 발명에 따른 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질 투여군에서 백혈구 면역글로불린 수용체(leukocyte immunoglobulin-like receptor, LILRB4) 및 CCDC34(coiled-coil domain containg 34)의 발현은 2배 이상 상향-조절된 반면, CD28의 발현은 2배 이상 하향-조절됨을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11408BP 20081029 한국생명공학연구원 KCTC11409BP 20081029
<110> ProCell Therapeutics, Inc. <120> CELL PERMEABLE RUNX3 RECOMBINANT PROTEINS, POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME, AND ANTICANCER COMPOSITIONS INCLUDING THE SAME <130> KC101016 <150> US60/985,765 <151> 2007-11-06 <160> 260 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1248 <212> DNA <213> human RINX3 cDNA gene <400> 1 atgcgtattc ccgtagaccc aagcaccagc cgccgcttca cacctccctc cccggccttc 60 ccctgcggcg gcggcggcgg caagatgggc gagaacagcg gcgcgctgag cgcgcaggcg 120 gccgtggggc ccggagggcg cgcccggccc gaggtgcgct cgatggtgga cgtgctggcg 180 gaccacgcag gcgagctcgt gcgcaccgac agccccaact tcctctgctc cgtgctgccc 240 tcgcactggc gctgcaacaa gacgctgccc gtcgccttca aggtggtggc attgggggac 300 gtgccggatg gtacggtggt gactgtgatg gcaggcaatg acgagaacta ctccgctgag 360 ctgcgcaatg cctcggccgt catgaagaac caggtggcca ggttcaacga ccttcgcttc 420 gtgggccgca gtgggcgagg gaagagtttc accctgacca tcactgtgtt caccaacccc 480 acccaagtgg cgacctacca ccgagccatc aaggtgaccg tggacggacc ccgggagccc 540 agacggcacc ggcagaagct ggaggaccag accaagccgt tccctgaccg 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Leu Ser Ala Gln Ala Ala Val Gly Pro Gly Gly Arg Ala 35 40 45 Arg Pro Glu Val Arg Ser Met Val Asp Val Leu Ala Asp His Ala Gly 50 55 60 Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe Leu Cys Ser Val Leu Pro 65 70 75 80 Ser His Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro Val Ala Phe Lys Val Val 85 90 95 Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Val Val Thr Val Met Ala Gly 100 105 110 Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Ala Val Met 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu Arg Phe Val Gly Arg Ser 130 135 140 Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Thr Val Phe Thr Asn Pro 145 150 155 160 Thr Gln Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile Lys Val Thr Val Asp Gly 165 170 175 Pro Arg Glu Pro Arg Arg His Arg Gln Lys Leu Glu Asp Gln Thr Lys 180 185 190 Pro Phe Pro Asp Arg Phe Gly Asp Leu Glu Arg Leu Arg Met Arg Val 195 200 205 Thr Pro Ser Thr Pro Ser Pro Arg Gly Ser Leu Ser Thr Thr Ser His 210 215 220 Phe Ser Ser Gln Pro Gln Thr Pro Ile Gln Gly Thr Ser Glu Leu Asn 225 230 235 240 Pro Phe Ser Asp Pro Arg Gln Phe Asp Arg Ser Phe Pro Thr Leu Pro 245 250 255 Thr Leu Thr Glu Ser Arg Phe Pro Asp Pro Arg Met His Tyr Pro Gly 260 265 270 Ala Met Ser Ala Ala Phe Pro Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser 275 280 285 Ile Ser Ser Leu Ser Val Ala Gly Met Pro Ala Thr Ser Arg Phe His 290 295 300 His Thr Tyr Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Ala Pro Gln Asn Gln Ser 305 310 315 320 Gly Pro Phe Gln Ala Asn Pro Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr Gly Thr 325 330 335 Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Phe Ser Met Val Ala Gly Ser Ser Ser Gly 340 345 350 Gly Asp Arg Ser Pro Thr Arg Met Leu Ala Ser Cys Thr Ser Ser Ala 355 360 365 Ala Ser Val Ala Ala Gly Asn Leu Met Asn Pro Ser Leu Gly Gly Gln 370 375 380 Ser Asp Gly Val Glu Ala Asp Gly Ser His Ser Asn Ser Pro Thr Ala 385 390 395 400 Leu Ser Thr Pro Gly Arg Met Asp Glu Ala Val Trp Arg Pro Tyr 405 410 415 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kFGF-4 derived MTD <400> 3 Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> 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Thr Ser Arg Phe His His Thr Tyr Leu Pro Pro Pro 325 330 335 Tyr Pro Gly Ala Pro Gln Asn Gln Ser Gly Pro Phe Gln Ala Asn Pro 340 345 350 Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Phe 355 360 365 Ser Met Val Ala Gly Ser Ser Ser Gly Gly Asp Arg Ser Pro Thr Arg 370 375 380 Met Leu Ala Ser Cys Thr Ser Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Asn 385 390 395 400 Leu Met Asn Pro Ser Leu Gly Gly Gln Ser Asp Gly Val Glu Ala Asp 405 410 415 Gly Ser His Ser Asn Ser Pro Thr Ala Leu Ser Thr Pro Gly Arg Met 420 425 430 Asp Glu Ala Val Trp Arg Pro Tyr Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala 435 440 445 Pro <210> 238 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM5R3M5 polynucleotide <400> 238 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atgaagaaga agaggaaggc gctgctggcg gcgctgctgg cgccgcgtat tcccgtagac 120 ccaagcacca gccgccgctt cacacctccc tccccggcct tcccctgcgg cggcggcggc 180 ggcaagatgg gcgagaacag cggcgcgctg agcgcgcagg cggccgtggg gcccggaggg 240 cgcgcccggc ccgaggtgcg ctcgatggtg gacgtgctgg cggaccacgc aggcgagctc 300 gtgcgcaccg acagccccaa cttcctctgc tccgtgctgc cctcgcactg gcgctgcaac 360 aagacgctgc ccgtcgcctt caaggtggtg gcattggggg acgtgccgga tggtacggtg 420 gtgactgtga tggcaggcaa tgacgagaac tactccgctg agctgcgcaa tgcctcggcc 480 gtcatgaaga accaggtggc caggttcaac gaccttcgct tcgtgggccg cagtgggcga 540 gggaagagtt tcaccctgac catcactgtg ttcaccaacc ccacccaagt ggcgacctac 600 caccgagcca tcaaggtgac cgtggacgga ccccgggagc ccagacggca ccggcagaag 660 ctggaggacc agaccaagcc gttccctgac cgctttgggg acctggaacg gctgcgcatg 720 cgggtgacac cgagcacacc cagcccccga ggctcactca gcaccacaag ccacttcagc 780 agccagcccc agaccccaat ccaaggcacc tcggaactga acccattctc cgacccccgc 840 cagtttgacc gctccttccc cacgctgcca accctcacgg agagccgctt cccagacccc 900 aggatgcatt atcccggggc catgtcagct gccttcccct acagcgccac gccctcgggc 960 acgagcatca gcagcctcag cgtggcgggc atgccggcca ccagccgctt ccaccatacc 1020 tacctcccgc caccctaccc gggggccccg cagaaccaga gcgggccctt ccaggccaac 1080 ccgtccccct accacctcta ctacgggaca tcctctggct cctaccagtt ctccatggtg 1140 gccggcagca gcagtggggg cgaccgctca cctacccgca tgctggcctc ttgcaccagc 1200 agcgctgcct ctgtcgccgc cggcaacctc atgaacccca gcctgggcgg ccagagtgat 1260 ggcgtggagg ccgacggcag ccacagcaac tcacccacgg ccctgagcac gccaggccgc 1320 atggatgagg ccgtgtggcg gccctacgcg ctgctggcgg cgctgctggc gccgtga 1377 <210> 239 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HM5R3M5 recombinant protein <400> 239 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Lys Lys Arg Lys Ala Leu Leu Ala Ala Leu 20 25 30 Leu Ala Pro Arg Ile Pro Val Asp Pro Ser Thr Ser Arg Arg Phe Thr 35 40 45 Pro Pro Ser Pro Ala Phe Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Met Gly 50 55 60 Glu Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ala Gln Ala Ala Val Gly Pro Gly Gly 65 70 75 80 Arg Ala Arg Pro Glu Val Arg Ser Met Val Asp Val Leu Ala Asp His 85 90 95 Ala Gly Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe Leu Cys Ser Val 100 105 110 Leu Pro Ser His Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro Val Ala Phe Lys 115 120 125 Val Val Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Val Val Thr Val Met 130 135 140 Ala Gly Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Ala 145 150 155 160 Val Met Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu Arg Phe Val Gly 165 170 175 Arg Ser Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Thr Val Phe Thr 180 185 190 Asn Pro Thr Gln Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile Lys Val Thr Val 195 200 205 Asp Gly Pro Arg Glu Pro Arg Arg His Arg Gln Lys Leu Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Lys Pro Phe Pro Asp Arg Phe Gly Asp Leu Glu Arg Leu Arg Met 225 230 235 240 Arg Val Thr Pro Ser Thr Pro Ser Pro Arg Gly Ser Leu Ser Thr Thr 245 250 255 Ser His Phe Ser Ser Gln Pro Gln Thr Pro Ile Gln Gly Thr Ser Glu 260 265 270 Leu Asn Pro Phe Ser Asp Pro Arg Gln Phe Asp Arg Ser Phe Pro Thr 275 280 285 Leu Pro Thr Leu Thr Glu Ser Arg Phe Pro Asp Pro Arg Met His Tyr 290 295 300 Pro Gly Ala Met Ser Ala Ala Phe Pro Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly 305 310 315 320 Thr Ser Ile Ser Ser Leu Ser Val Ala Gly Met Pro Ala Thr Ser Arg 325 330 335 Phe His His Thr Tyr Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Ala Pro Gln Asn 340 345 350 Gln Ser Gly Pro Phe Gln Ala Asn Pro Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr 355 360 365 Gly Thr Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Phe Ser Met Val Ala Gly Ser Ser 370 375 380 Ser Gly Gly Asp Arg Ser Pro Thr Arg Met Leu Ala Ser Cys Thr Ser 385 390 395 400 Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Asn Leu Met Asn Pro Ser Leu Gly 405 410 415 Gly Gln Ser Asp Gly Val Glu Ala Asp Gly Ser His Ser Asn Ser Pro 420 425 430 Thr Ala Leu Ser Thr Pro Gly Arg Met Asp Glu Ala Val Trp Arg Pro 435 440 445 Tyr Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Pro 450 455 <210> 240 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3 polynucleotide <400> 240 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atgaagaaga agaggaagcg tattcccgta gacccaagca ccagccgccg cttcacacct 120 ccctccccgg ccttcccctg cggcggcggc ggcggcaaga tgggcgagaa cagcggcgcg 180 ctgagcgcgc aggcggccgt ggggcccgga gggcgcgccc ggcccgaggt gcgctcgatg 240 gtggacgtgc tggcggacca cgcaggcgag ctcgtgcgca ccgacagccc caacttcctc 300 tgctccgtgc tgccctcgca ctggcgctgc aacaagacgc tgcccgtcgc cttcaaggtg 360 gtggcattgg gggacgtgcc ggatggtacg gtggtgactg tgatggcagg caatgacgag 420 aactactccg ctgagctgcg caatgcctcg gccgtcatga agaaccaggt ggccaggttc 480 aacgaccttc gcttcgtggg ccgcagtggg cgagggaaga gtttcaccct gaccatcact 540 gtgttcacca accccaccca agtggcgacc taccaccgag ccatcaaggt gaccgtggac 600 ggaccccggg agcccagacg gcaccggcag aagctggagg accagaccaa gccgttccct 660 gaccgctttg gggacctgga acggctgcgc atgcgggtga caccgagcac acccagcccc 720 cgaggctcac tcagcaccac aagccacttc agcagccagc cccagacccc aatccaaggc 780 acctcggaac tgaacccatt ctccgacccc cgccagtttg accgctcctt ccccacgctg 840 ccaaccctca cggagagccg cttcccagac cccaggatgc attatcccgg ggccatgtca 900 gctgccttcc cctacagcgc cacgccctcg ggcacgagca tcagcagcct cagcgtggcg 960 ggcatgccgg ccaccagccg cttccaccat acctacctcc cgccacccta cccgggggcc 1020 ccgcagaacc agagcgggcc cttccaggcc aacccgtccc cctaccacct ctactacggg 1080 acatcctctg gctcctacca gttctccatg gtggccggca gcagcagtgg gggcgaccgc 1140 tcacctaccc gcatgctggc ctcttgcacc agcagcgctg cctctgtcgc cgccggcaac 1200 ctcatgaacc ccagcctggg cggccagagt gatggcgtgg aggccgacgg cagccacagc 1260 aactcaccca cggccctgag cacgccaggc cgcatggatg aggccgtgtg gcggccctac 1320 tga 1323 <210> 241 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3 recombinant protein <400> 241 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Lys Lys Arg Lys Arg Ile Pro Val Asp Pro 20 25 30 Ser Thr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Pro Ser Pro Ala Phe Pro Cys Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Lys Met Gly Glu Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ala Gln 50 55 60 Ala Ala Val Gly Pro Gly Gly Arg Ala Arg Pro Glu Val Arg Ser Met 65 70 75 80 Val Asp Val Leu Ala Asp His Ala Gly Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser 85 90 95 Pro Asn Phe Leu Cys Ser Val Leu Pro Ser His Trp Arg Cys Asn Lys 100 105 110 Thr Leu Pro Val Ala Phe Lys Val Val Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp 115 120 125 Gly Thr Val Val Thr Val Met Ala Gly Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala 130 135 140 Glu Leu Arg Asn Ala Ser Ala Val Met Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe 145 150 155 160 Asn Asp Leu Arg Phe Val Gly Arg Ser Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr 165 170 175 Leu Thr Ile Thr Val Phe Thr Asn Pro Thr Gln Val Ala Thr Tyr His 180 185 190 Arg Ala Ile Lys Val Thr Val Asp Gly Pro Arg Glu Pro Arg Arg His 195 200 205 Arg Gln Lys Leu Glu Asp Gln Thr Lys Pro Phe Pro Asp Arg Phe Gly 210 215 220 Asp Leu Glu Arg Leu Arg Met Arg Val Thr Pro Ser Thr Pro Ser Pro 225 230 235 240 Arg Gly Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Phe Ser Ser Gln Pro Gln Thr 245 250 255 Pro Ile Gln Gly Thr Ser Glu Leu Asn Pro Phe Ser Asp Pro Arg Gln 260 265 270 Phe Asp Arg Ser Phe Pro Thr Leu Pro Thr Leu Thr Glu Ser Arg Phe 275 280 285 Pro Asp Pro Arg Met His Tyr Pro Gly Ala Met Ser Ala Ala Phe Pro 290 295 300 Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Ile Ser Ser Leu Ser Val Ala 305 310 315 320 Gly Met Pro Ala Thr Ser Arg Phe His His Thr Tyr Leu Pro Pro Pro 325 330 335 Tyr Pro Gly Ala Pro Gln Asn Gln Ser Gly Pro Phe Gln Ala Asn Pro 340 345 350 Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Phe 355 360 365 Ser Met Val Ala Gly Ser Ser Ser Gly Gly Asp Arg Ser Pro Thr Arg 370 375 380 Met Leu Ala Ser Cys Thr Ser Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Asn 385 390 395 400 Leu Met Asn Pro Ser Leu Gly Gly Gln Ser Asp Gly Val Glu Ala Asp 405 410 415 Gly Ser His Ser Asn Ser Pro Thr Ala Leu Ser Thr Pro Gly Arg Met 420 425 430 Asp Glu Ala Val Trp Arg Pro Tyr 435 440 <210> 242 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-5' forward primer <400> 242 ccgcatatga agaagaagag gaagcgtatt cccgtagacc caagcaccag c 51 <210> 243 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-3' reverse primer <400> 243 ccgcatatgt cagtagggcc gccacacggc ctc 33 <210> 244 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM1R-5' forward primer <400> 244 ccgcatatga agaagaagag gaaggcagcc gttcttctcc ctgttcttct tgccgcaccc 60 cgtattcccg tagacccaag caccagc 87 <210> 245 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM1-3' reverse primer <400> 245 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgcgt agggccgcca 60 cacggcctca tccat 75 <210> 246 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-N-5' forward primer <400> 246 ccgcatatga agaagaagag gaagcgtatt cccgtagacc caagcaccag c 51 <210> 247 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-N-M1-3' reverse primer <400> 247 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgcgc gcacctcggg 60 ccgggcgcgc cctcc 75 <210> 248 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-R-5' forward primer <400> 248 ccgcatatga agaagaagag gaagtcgatg gtggacgtgc tggcggacca c 51 <210> 249 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-R-M1-3' reverse primer <400> 249 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgccc gtctgggctc 60 ccggggtccg tccac 75 <210> 250 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-P-5' forward primer <400> 250 ccgcatatga agaagaagag gaagcaccgg cagaagctgg aggaccagac c 51 <210> 251 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-CR-5' forward primer <400> 251 ccgcatatga agaagaagag gaagcgcacc gacagcccca acttcctctg c 51 <210> 252 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-CR-M1-3' reverse primer <400> 252 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgcgt ccccaaagcg 60 gtcagggaac ggctt 75 <210> 253 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM2R-5' forward primer <400> 253 ccgcatatga agaagaagag gaagctgatt gcgctgctgg cggcgccgct ggcgcgtatt 60 cccgtagacc caagcaccag c 81 <210> 254 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM2-3' reverse primer <400> 254 ccgcatatgt cacgccagcg gcgccgccag cagcgcaatc aggtagggcc gccacacggc 60 ctcatccat 69 <210> 255 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM3R-5' forward primer <400> 255 ccgcatatga agaagaagag gaagctgctg gcggcggcgg cggcgctgct gctggcgcgt 60 attcccgtag acccaagcac cagc 84 <210> 256 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM3-3' reverse primer <400> 256 ccgcatatgt cacgccagca gcagcgccgc cgccgccgcc agcaggtagg gccgccacac 60 ggcctcatcc at 72 <210> 257 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM4R-5' forward primer <400> 257 ccgcatatga agaagaagag gaagctggcg gcggcggcgc tggcggtgct gccgctgcgt 60 attcccgtag acccaagcac cagc 84 <210> 258 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM4-3' reverse primer <400> 258 ccgcatatgt cacagcggca gcaccgccag cgccgccgcc gccaggtagg gccgccacac 60 ggcctcatcc at 72 <210> 259 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM5R-5' forward primer <400> 259 ccgcatatga agaagaagag gaaggcgctg ctggcggcgc tgctggcgcc gcgtattccc 60 gtagacccaa gcaccagc 78 <210> 260 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM5-3' reverse primer <400> 260 ccgcatatgt cacggcgcca gcagcgccgc cagcagcgcg tagggccgcc acacggcctc 60 atccat 66

Claims (17)

  1. 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 거대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 있는, 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종양 및 전이 억제인자 RUNX3 단백질이 N-말단, R-말단 및 PST-풍부 도메인으로 구성된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장 형태(full-length form)이거나, 상기 서열에서 적어도 하나의 도메인이 결실된 결절 형태(truncated form)인 것을 특징으로 하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 거대분자 전달 도메인이 서열번호: 4 내지 196으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 거대분자 전달 도메인이 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4(kaposi fibroblast growth factor 4)-유래 MTD, 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 JO-13 MTD, 서열번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 JO-57 MTD, 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 JO-85 MTD 및 서열번호: 111의 아미노산 서열을 갖는 JO-108 MTD 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질의 한쪽 말단에 세포핵 배치 서열(nuclear localization sequence: NLS) 및 히스티딘-표지(histidine-tag) 친화성 도메인이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 단백질이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질:
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 N-말단에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 C-말단에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 양 말단에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질,
    서열번호: 2의 아미노산 서열에서 R-말단 및 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3의 N-말단 도메인에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열에서 N-말단 및 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3의 R-말단 도메인에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열에서 N- 및 R-말단 도메인이 결실된 RUNX3의 PST-풍부 도메인에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열에서 PST-풍부 도메인이 결실된 RUNX3의 N- 및 R-말단 도메인에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열에서 N-말단 도메인이 결실된 RUNX3의 R-말단 및 PST-풍부 도메인에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열에서 N-말단 도메인이 결실되고 68 번부터 200번까지의 R-말단 및 일부 PST-풍부 도메인을 포함하는 RUNX3의 PST-풍부 도메인에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 kFGF4-유래 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 N-말단에 서열번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 JO-57 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 C-말단에 서열번호:60의 아미노산 서열을 갖는 JO-57 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 양 말단에 서열번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 JO-57 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 N-말단에 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 JO-85 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 C-말단에 서열번호:88의 아미노산 서열을 갖는 JO-85 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 양 말단에 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 JO-85 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 N-말단에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 JO-13 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 C-말단에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 JO-13 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 양 말단에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 JO-13 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 N-말단에 서열번호: 111의 아미노산 서열을 갖는 JO-108 MTD가 융합된 재조합 단백질;
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 C-말단에 서열번호: 111의 아미노산 서열을 갖는 JO-108 MTD가 융합된 재조합 단백질; 및
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 RUNX3 양 말단에 서열번호: 111의 아미노산 서열을 갖는 JO-108 MTD가 융합된 재조합 단백질로서,
    상기 모든 재조합 단백질의 N-말단에 히스티딘-표지와 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질이 서열번호: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237 및 239의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질.
  8. 제1항의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236 및 238의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드,
  10. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 발현벡터가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터:
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 198의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM1R3;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 200의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3M1;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 202의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM1R3M1;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 204의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3NM1;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 206의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3RM1:
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 208의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3PM1;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 210의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3NRM1;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 212의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3RPM1;
    kFGF4-유래 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 214의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3CRM1;
    JO-57 MTD MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 216의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM2R3;
    JO-57 MTD MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 218의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3M2;
    JO-57 MTD MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 220의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM2R3M2;
    JO-85 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 222의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM3R3;
    JO-85 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 224의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3M3;
    JO-85 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 226의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM3R3M3;
    JO-13 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 228의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM4R3;
    JO-13 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 230의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3M4;
    JO-13 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 232의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM4R3M4;
    JO-108 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 234의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM5R3;
    JO-108 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 236의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHR3M5; 및
    JO-108 MTD가 융합된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 238의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터 pHM5R3M5.
  12. 제10항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균.
  13. 제12항에 있어서,
    형질전환 세균이 대장균 DH5α/HM2R3(KCTC-11408BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.
  14. 제12항에 있어서,
    형질전환 세균이 대장균 DH5α/HM3R3(KCTC-11409BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.
  15. 하기 단계를 포함하는 제1항의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 생산하는 방법:
    1) 제12항의 형질전환 세균을 배양하여 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
    2) 상기 배양액으로부터 발현된 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 정제하는 단계.
  16. 제1항의 세포투과성 RUNX3 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 RUNX3 결손 또는 기능상실을 치료하기 위한 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 위암, 췌장암, 폐암, 대장암 및 간암으로 구성
    군으로부터 선택되는 암의 형성 및 전이를 예방 또는 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
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