CN115894706A

CN115894706A - 靶向PD-L1和FasL的融合蛋白、核苷酸序列及其应用

Info

Publication number: CN115894706A
Application number: CN202111162221.5A
Authority: CN
Inventors: 王杰; 遇奇; 宋瑞; 邢玉华; 李良
Original assignee: Beijing Konruns Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Konruns Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明提供了一种能够同时靶向PD‑L1及FasL的融合蛋白，其包括(a)作为主体的人IgG1抗体的Fc段；(b)连接在所述人IgG1抗体的Fc段的N端或C端且能够特异性地结合PD‑L1的第一蛋白部分，以及(c)连接在人IgG1抗体Fc段的N端或C端且能够特异性结合FasL的第二蛋白部分；其中，Fc段选自野生型的Fc段及其截短体或突变体；第一蛋白部分和第二蛋白部分独立地选自PD‑1胞外结构域和Fas胞外结构域或其截短体或突变体，且所述第一蛋白部分与所述第二蛋白部分彼此不相同。本发明的融合蛋白同时包括能够结合PD‑L1的部分和特异性结合FasL的部分，这种双功能融合蛋白分子能够产生协同作用，发挥高效的抗肿瘤的作用。

Description

靶向PD-L1和FasL的融合蛋白、核苷酸序列及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种靶向PD-L1及FasL的融合蛋白，以及编码该融合蛋白的核苷酸序列。本发明还涉及该融合蛋白在肿瘤免疫疗法用于癌症的治疗中的应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗研究领域的热点。人体正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但肿瘤细胞能够采用一系列策略，使人体的免疫系统受到抑制，不能正常的杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存，称为免疫逃逸。不同肿瘤可以通过不同环节的异常抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤从而产生免疫耐受，甚至促进肿瘤的发生、发展。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。

目前，肿瘤免疫治疗领域最广泛的应用是开发针对抑制T细胞活化的调节性免疫检查点分子的靶向单克隆抗体，其中以阻断程序性死亡蛋白1和阻断程序性死亡配体蛋白1(PD-1/PD-L1)的药物为主要代表。PD-1起作用在免疫反应的效应阶段，其表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞，其有两个配体，即程序性死亡分子配体PD-L1和PD-L2。PD-L1/L2在抗原提呈细胞都有表达。另外，PD-L1在多种组织也有表达。PD-1与PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，抑制T细胞的杀伤功能，对人体免疫应答起到负调节作用。陈列平实验室首先发现PD-L1在肿瘤组织高表达，而且抑制肿瘤浸润CD8+T细胞的功能，是肿瘤细胞免疫逃逸的一个重要机制。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤有重要的意义。PD-1/PD-L1抑制剂能够特异性地和肿瘤细胞上的PD-L1结合来抑制其表达，从而能够使功能受抑制的T细胞恢复对肿瘤细胞的识别功能，从而实现通过自身免疫系统达到抗癌作用。目前，针对PD-1/PD-L1的肿瘤免疫疗法实现更高的客观缓解率同时显著降低了免疫相关副作用，如今已获得FDA批准应用于10多种癌症适应症，促进与其他不同疗法联合使用。PD-1/PD-L1的肿瘤免疫疗法，靶点作用明确，但是疗效约20％，仍有待提高，因此，在此基础上开发更高效且更广泛的免疫疗法具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：

(a)作为主体的人IgG1抗体的Fc段；

(b)连接在人IgG1抗体的Fc段的N端或C端且能够特异性地结合PD-L1的第一蛋白部分，以及

(c)连接在人IgG1抗体的Fc段的N端或C端且能够特异性结合FasL的第二蛋白部分；

其中，Fc段选自野生型的Fc段及其截短体或突变体；所述第一蛋白部分和所述第二蛋白部分各自独立地选自PD-1胞外结构域和Fas胞外结构域、所述PD-1胞外结构域或所述Fas胞外结构域的截短体或突变体，且所述第一蛋白部分与所述第二蛋白部分彼此不相同。

细胞凋亡(apoptosis)指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。Fas/FasL信号通路是细胞凋亡的一个重要的信号通路。Fas又称CD95，是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与其配体FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可表达于多种细胞表面，但FasL通常只表达于活化的T细胞和NK细胞。随着进一步的研究，人们发现FasL与肿瘤发展密切相关，FasL可以抑制免疫微环境中CD8+T细胞的活性；肿瘤表达FasL可以诱导肿瘤浸润性T淋巴细胞凋亡；肿瘤部位的FasL高表达导致T细胞数目减少，因此肿瘤特性更倾向变成冷肿瘤；另外有研究表明肿瘤部位FasL的过表达促进了肿瘤的转移及发展。

在本发明中，通过在人IgG1抗体的Fc段的N端或C端连接PD-1胞外结构域(PD-1-ECD)和Fas胞外结构域(Fas-ECD)，形成双功能融合蛋白，使双功能融合蛋白能够同时结合PD-L1和FasL，同时发挥抑制PD-L1和FasL的作用。PD-1胞外结构域或Fas胞外结构域也可以是截短体或突变体。

另外，对于含有胞外结构域(ECD)的融合蛋白(例如，Fas-ECD或PD-1-ECD等)，由于ECD源于人自身，因此本发明的融合蛋白在理论上不易引起免疫原性，从而具有更高的安全性。

在本发明的一个实施方案中，所述PD-1胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且PD-1胞外结构域由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行编码。

在本发明的一个实施方案中，所述Fas胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中，所述Fas胞外结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行编码。

在本发明的一个实施方案中，所述PD-1胞外结构域或所述Fas胞外结构域通过接头序列与人IgG1抗体的Fc段的N端或C端连接。具体而言，PD-1胞外结构域可以连接在人IgG1抗体Fc段的N端，也可以连接在人IgG1抗体Fc段的C端。同样，Fas胞外结构域可以连接在人IgG1抗体Fc段的N端，也可以连接在人IgG1抗体Fc段的C端。在本发明的一个实施方案中，所述PD-1胞外结构域或所述Fas胞外结构域的数量为1-2个。换言之，相同的胞外结构域可以串联在人IgG1抗体Fc段的N端或C端。

在本发明的一些实施方案中，所述接头序列为(G4S)3接头序列，其中，所述(G4S)3接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且所述氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行编码。

本发明还提供一种氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且所述氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行编码，该核苷酸序列编码本发明所述的PD-1胞外结构域。

本发明还提供一种氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，且所述氨基酸序列由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行编码，该核苷酸序列编码本发明所述的Fas胞外结构域。

进一步地，本发明还提供了如上所述的融合蛋白在制备治疗PD-L1和FasL相关的癌症的药物中的应用。所述癌症可以是所述癌症选自尿路上皮癌、小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌中的一种或多种。

本发明基于如下发现：本发明的双功能融合蛋白包括能够结合PD-L1的部分和特异性结合FasL的部分，这种双功能融合蛋白中的两个功能部分协同作用，产生具有高效的抗肿瘤作用。相对于单独给予这两种药物时的效果，该双功能蛋白在癌症治疗中可以显示出明显的协同作用。

附图说明

图1是本发明融合蛋白的一种实施方式的示意图，其包含以人IgG1抗体的Fc部分(Fc段)为骨架(中间部分)，N端(上端)融合人PD-1胞外区域(PD-1-ECD)，C端(下端)融合人Fas胞外区域(Fas-ECD)，其中Fc与Fas之间通过(Gly4Ser)3接头连接。

图2是本发明融合蛋白的另一种实施方式的示意图，其中，在人IgG1抗体Fc段的N端的两侧分别融合一个PD-1-ECD或Fas-ECD。

图3是本发明融合蛋白的另一种实施方式的示意图，其中，在人IgG1抗体Fc段的N端的两侧分别融合两个串联的PD-1-ECD或Fas-ECD。

图4是本发明融合蛋白的另一种实施方式的示意图，其中，在人IgG1抗体Fc段的N端的两侧分别融合两个串联的PD-1-ECD或Fas-ECD，在Fc段的C端的两侧分别融合一个Fas-ECD或PD-1-ECD。

图5是本发明融合蛋白的另一种实施方式的示意图，其中，在人IgG1抗体Fc段的N端的两侧分别融合一个PD-1-ECD或Fas-ECD，在Fc段的C端融合的两侧分别融合两个串联的Fas-ECD或PD-1-ECD。

图6是本发明融合蛋白的另一种实施方式的示意图，其中，在人IgG1抗体的N端的两侧分别融合两个串联的PD-1-ECD或Fas-ECD，在Fc段的C端的两侧分别融合两个串联的Fas-ECD或PD-1-ECD。

图7为本发明实施例2中非还原性SDS-PAGE纯化获得的融合蛋白的纯度，且蛋白稳定性良好。

图8为本发明实施例2中还原性SDS-PAGE纯化获得的融合蛋白的纯度，且蛋白稳定性良好。

图9至图14示出本发明实施例2中SEC-HPLC纯化获得的PD-1/Fas融合蛋白聚集体及降解情况，PD-1/Fas融合蛋白分别由编号为PL001、PL002、PL003、PL007、PL009、PL015的质粒表达，SEC-HPLC检测这些表达获得的融合蛋白的结果分别对应于图9、图10、图11、图12、图13和图14。结果显示蛋白稳定性良好，未出现明显的聚集体和降解。

图15本发明实施例3中PD-1/Fas融合蛋白阻断PD-1/PD-L1信号通路的实验结果。

图16是为本发明实施例4中PD-1/Fas融合蛋白对重组人源游离FasL诱导的T细胞凋亡的抑制实验，结果显示PD-1/Fas融合蛋白可完全阻断Fas L诱导的T细胞凋亡。

图17至图21为本发明实施例5中Annexin-V法测定PD-1/Fas融合蛋白对重组人源游离FasL诱导Jurkat细胞凋亡的抑制作用，结果显示PD-1/Fas可完全阻断Fas L诱导的T细胞凋亡；其中，

图17示出没有加入任何蛋白的Jurkat细胞(空白对照)几乎没有凋亡；

图18示出007融合蛋白不会影响Jurkat细胞的凋亡；

图19示出重组人源游离FasL可以诱导Jurkat细胞凋亡；

图20示出007融合蛋白可以明显抑制重组人源游离FasL诱导的Jurkat细胞凋亡；

图21示出009融合蛋白不能抑制重组人源游离FasL诱导的Jurkat细胞凋亡。

图22为本发明实施例5中Annexin-V法测定PD-1/Fas融合蛋白对重组人源游离FasL诱导Jurkat细胞凋亡的抑制作用的统计图。

图23为本发明实施例6中PD-1/Fas融合蛋白的CDC(补体依赖细胞毒性)活性，结果显示PD-1/Fas融合蛋白可产生CDC作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1

融合蛋白PD-1/Fas克隆与表达

将人程序性死亡蛋白1即PD-1蛋白的胞外区作为融合蛋白中调节PD-1/PD-L1免疫检查点部分，将人肿瘤坏死因子蛋白Fas胞外区作为双功能融合蛋白中调控T细胞凋亡的分子部分，形成PD-1/Fas双功能融合蛋白。

质粒构建：设计的分子有两组，一组以人IgG1抗体的Fc段为主体，N端融合1个或2个PD-1ECD，C端融合1个或2个Fas ECD，包括：PD-1-Fc-Fas，PD-1-Fc-2Fas，2PD-1-Fc-Fas，2PD-1-Fc-2Fas；

另外一组以人IgG1抗体的Fc段为主体，Fc段的N端融合1个或2个Fas-ECD，C端融合1个或2个PD-1-ECD，包括：Fas-Fc-PD-1，Fas-Fc-2PD-1，2Fas-Fc-PD-1，2Fas-Fc-2PD-1。其中抗体Fc段的C端串联的PD-1或Fas胞外结构域由(G4S)3接头连接，两个PD-1胞外结构域或两个Fas胞外结构域同样由(G4S)3接头连接。所有序列见附件，其中(G4S)3接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。信号肽序核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，信号肽序氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，信号肽加入Kozak序列(GCCACC)。所有序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化(哺乳动物细胞中表达)后进行全基因合成，目的片段由XbaI和EcoRV酶切后连接入pCDNA3.4表达载体中，测序确认序列的正确性。

SEQ ID NO:5：

GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCC

SEQ ID NO:6：GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:7：

ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACAGGCGTGCACTCC

SEQ ID NO:8：MGWSCIILFLVATATGVHS

进行质粒转化并用无内毒素大提试剂盒提取高纯度质粒(购自天根生化科技，货号DP117)，测序保证质粒序列的正确性。细胞转染试剂均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。细胞转染(以25mL培养液为例)时，在转染前一天按3×10⁶细胞/mL接种ExpiCHO-S细胞，待转染时细胞密度应在6×10⁶细胞/mL，细胞活率要求>95％。转入时首先配置转染复合物，取20μg DNA用1mL无血清培养基稀释，充分混匀，制成DNA稀释液；取80μLExpiFectamine^TMCHO Reagent用920μL无血清培养基稀释，充分混匀，制成转染试剂稀释液。分别室温静置不超过5min。然后充分混匀这两种稀释液，室温静置5min。最后将转染复合物加入到含有25mL细胞和无血清完全培养基的125mL细胞培养摇瓶中，轻柔充分混匀。细胞于95rpm，37℃，90％湿度，8％CO₂细胞培养摇床中继续培养12天。转染18–22小时后加入150μLExpiFectamine^TMCHO Enhancer和6mL ExpiCHO^TMFeed。

实施例2

PD-1/Fas融合蛋白的纯化及稳定性检测

Protein A琼脂糖纯化树脂是亲和类树脂(BBI生命科学，货号C600953)，用于纯化和分离IgG1抗体。其中Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段与哺乳动物的IgG1结合。

蛋白纯化过程在低温层析柜(购自博医康公司)中进行，细胞转染后第5天收集并进行纯化，首先1000rpm，3min离心去除细胞，然后8500rpm，30min去除杂质，0.22μm过滤；蛋白上样前调整其盐离子浓度至20mM；平衡Protein A柱子时，先用10个柱体积去离子水冲洗，再用10个柱体积Binding Buffer(BBI生命科学，货号C600482)冲洗柱子；然后上样，上样后，先用10个柱体积Binding Buffer洗脱，再用Elution Buffer(BBI生命科学，货号C600481)洗脱，3mL每管收集洗脱液，接12管(预先用Neutralization Buffer(BBI生命科学，货号B548142)调整蛋白洗脱液pH值7左右)。收集完样品后，用10个柱体积的BindingBuffer，去离子水冲洗平衡纯化柱，最后用20％乙醇封存与4℃。

蛋白浓缩用合适大小的超滤管3800rpm在4℃进行浓缩，蛋白buffer置换成PBS，NanoDrop(购自美国赛默飞世尔科技)检测蛋白浓度后0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

SDS-PAGE和SEC-HPLC检测蛋白表达情况，结果如图2和图3所示，所有蛋白表达良好，并且条带相对单一，稳定性良好。

图7示出非还原SDS-PAGE的条带，图8示出还原SDS-PAGE的条带。

在图3至图14中，示出了由编号为PL001、PL002、PL003、PL007、PL009、PL015的质粒表达的PD-1/Fas融合蛋白的SEC检测结果。各融合蛋白及其蛋白质的组成和结构如下所示。质粒表达得到的融合蛋白及其编号如下所示。

PD-1-Fc-Fas(融合蛋白编号：001)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接1个PD-1的胞外结构域，C端通过接头序列连接1个Fas胞外结构域。PD-1-Fc-Fas的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码PD-1-Fc-Fas的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

PD-1-Fc(融合蛋白编号：002)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接1个PD-1的胞外结构域。PD-1-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码PD-1-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

Fas-Fc(编号：融合蛋白003)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接1个Fas胞外结构域。Fas-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，编码Fas-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

2PD-1-Fc-Fas(融合蛋白编号：004)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接2个PD-1的胞外结构域，C端通过接头序列连接1个Fas胞外结构域。2PD-1-Fc-Fas的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，编码2PD-1-Fc-Fas的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

PD-1-Fc-2Fas(融合蛋白编号：005)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接1个PD-1的胞外结构域，C端通过接头序列连接2个Fas胞外结构域。PD-1-Fc-2Fas的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码PD-1-Fc-2Fas的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

2PD-1-Fc-2Fas(融合蛋白编号：007)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接2个PD-1的胞外结构域，C端通过接头序列连接2个Fas胞外结构域。2PD-1-Fc-2Fas的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，编码2PD-1-Fc-2Fas的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

2PD-1-Fc(编号：融合蛋白009)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接2个PD-1的胞外结构域。2PD-1-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码2PD-1-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。

2Fas-Fc(编号：融合蛋白015)：

以人IgG1抗体的Fc为基础骨架，N端连接2个Fas胞外结构域。2Fas-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，编码2Fas-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。

另外，为了检测融合蛋白的稳定性，纯化后的融合蛋白用SYPRO^TMOrange ProteinGel Stain试剂盒(购自西格玛)检测其Tm值。10μM融合蛋白样品加入染色液配制成25μL反应体系，离心使其混合均匀，尽量避光，放在qPCR仪(购自宏石科技)中运行检测，设置温升速率为0.01℃/s，温度变化区间为25-95℃。以PD-L1单抗为对照，所有蛋白的Tm值均明显高于P-L1单抗，蛋白的Tm1在57℃左右。分析结果见表1。

表1.qPCR检测PD-1/Fas蛋白的Tm值

从表1的结果可以看出，本发明的PD-1/Fas融合蛋白具有很高的稳定性。

实施例3

PD-1/Fas融合蛋白在分子水平阻断PD-1/PD-L1相互作用

使用Cisbio Human PD1/PD-L1 biochemical binding assay(购自PerkinElmer公司，货号64ICP01PEH)检测PD-1/Fas融合蛋白在分子水平阻断作用。使用384孔微孔板(购自康宁公司)进行检测，每孔20μL体系，首先加4μL Tag1-PD-L1蛋白溶液(工作浓度为5nM)，其次加入2μL不同稀释浓度的融合蛋白，每个蛋白样品稀释9个浓度梯度，稀释比为1:5，然后加入4μL Tag2-PD-1蛋白溶液(工作浓度为50nM)，室温静置15min后，加入10μL混合的anti-Tag1-Eu3+and anti-Tag2-XL665溶液(首先稀释成100×储备溶液)，低速离心2min使样品充分混合，室温静置2小时，使用多功能酶标仪(购自BioTek公司)检测样品620nm及665nm荧光值。该实验中，我们使用了PD-L1抗体以及PD-1抗体作为对照品进行了检测，分析结果如图15，PD-1/Fas融合蛋白均能有效地阻断PD-1/PD-L1相互作用，由抑制曲线计算所得IC50浓度见表2。

表2.PD-1/Fas融合蛋白在分子水平阻断PD-1/PD-L1相互作用的IC50浓度

从表2可以看出，融合蛋白009(2PD-1-Fc)和007(2PD-1-Fc-2Fas)的阻断效果比PD-1单抗高3倍，与PD-L1单抗的阻断效果相似，是很不错的候选分子。

实施例4

融合蛋白抑制游离FasL诱导的Jurkat细胞凋亡

Jurkat细胞(人外周血白血病T细胞)使用含10％FBS(购自美国赛默飞世尔科技)及双抗(购自上海碧云天生物技术有限公司)的RPMI-1640培养基(购自美国赛默飞世尔科技)培养，每2-3天传代。取对数生长期的Jurkat细胞，细胞计数后，使用完全培养基调整细胞浓度至1.11×10⁵细胞/mL，接种于黑色96孔培养板(购自美国康宁公司)，每孔90μL(2×10⁴细胞/孔)。向细胞中加入5μL梯度稀释的待测融合蛋白，放入37℃培养箱中预孵育30分钟，随后加入5μL重组人源FasL(美国CST公司，货号5452)，使FasL终浓度为80ng/mL，待测抗体融合蛋白终浓度为500、100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128nM。不含抗体孔作为对照。将培养板置于37℃培养箱中培养24小时，取出放置在室温平衡10分钟，96孔板每孔加入50μL CellTiter-Lumi^TM发光法检测试剂。室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解。室温孵育10分钟，使发光信号趋于稳定，使用多功能酶标仪(购自BioTek公司)进行化学发光检测。

结果如图16所示，PD-1/Fas融合蛋白都通过结合游离FasL，抑制Fas/FasL介导的Jurkat细胞凋亡，从而提高细胞活率。由抑制曲线计算所得IC50浓度见表3。

表3.PD-1/Fas融合蛋白抑制游离FasL诱导的Jurkat细胞凋亡的IC50浓度

从表3可以看出，含有Fas的融合蛋白，比如001、003、007、015等可以明显抑制Fas/FasL介导的Jurkat细胞凋亡，因此认为这些融合蛋白能够明显提高T细胞活率。

实施例5

Annexin V-FITC法测定Fas/PD-1融合蛋白抑制CHO-K1-FasL细胞株诱导Jurkat细胞凋亡

取对数生长期的Jurkat细胞株，胰酶消化贴壁的细胞，使用完全培养基重悬。细胞计数后，离心，使用含10％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度至5×10⁵/mL，接种6孔细胞培养板(购自美国康宁公司)中，每孔2mL。向其中加入200nM稀释的待测抗体及80ng/mL的重组人FasL蛋白(货号CST#4542)。放入37℃培养箱中预孵育2小时，不含抗体孔及加入不含Fas的融合蛋白孔作为对照。将培养板置于37℃培养箱中培养20小时。

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(货号C1062L)。培养结束后，细胞250×g离心5分钟，用PBS洗一次。细胞250×g离心5分钟，加入195μL结合液重悬细胞。加入5μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育10–20min后置于冰浴中，应用Fortessa流式细胞仪(购自BD公司)检测Jurkat细胞的凋亡细胞比例。Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，Annexin-V和PI双阴性细胞即为活细胞群。

如图17-21以及图22的统计结果所示，FasL可以诱导Jurkat细胞凋亡，加入009(2PD-1-Fc)蛋白并不能抑制FasL诱导的Jurkat细胞凋亡，这是因为009蛋白没有融合表达Fas ECD，因此不能靶向FasL，对FasL诱导的Jurkat细胞凋亡没有影响。但是007(2PD1-Fc-2Fas)融合蛋白能够有效地抑制FasL诱导的Jurkat细胞凋亡，这是007蛋白中的Fas ECD可以有效靶向FasL产生的作用。

实施例6

PD-1/Fas融合蛋白CDC活性

取对数生长期的U251细胞株，胰酶消化贴壁的细胞，使用完全培养基重悬。细胞计数后，离心，使用含10％FBS的DMEM培养基调整细胞浓度至5×10⁵/mL，接种于96孔细胞培养板(购自美国康宁公司)中，每孔50μL。向其中加入50μL梯度稀释的待测抗体，待测抗体终浓度分别为500、100、20、4、0.8nM。再向每孔加入50μL人血清(货号Gibco10099-141)，放入37℃培养箱中预孵育4小时。其中同型对照IgG4抗体孔作为对照。

将培养板置于37℃培养箱中培养4小时，取出放置在室温平衡10分钟，96孔板每孔加入50μL CellTiter-Lumi^TM发光法检测试剂。室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解。室温孵育10分钟，使发光信号趋于稳定，使用多功能酶标仪(购自BioTek公司)进行化学发光检测。

结果如图23所示，相对于IgG4对照抗体，本发明中构建的融合蛋白007(2-PD-1-Fc-2Fas)能够明显的引起CDC效应，其EC50值为116.3nM。从上面的实施例可知，本发明的双功能融合蛋白能够同时结合PD-L1和FasL，具有高效抗肿瘤的作用。相对于单独给予这两种药物时的作用，期望该融合蛋白在癌症治疗中显示出明显的协同作用，从而具有更高的疗效。

序列表

<110> 北京康辰药业股份有限公司

<120> 靶向PD-L1和FasL的融合蛋白、核苷酸序列及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

35 40 45

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val

145

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcttagact ccccagacag gccctggaac ccccccacct tctccccagc cctgctcgtg 60

gtgaccgaag gggacaacgc caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc ggagagcttc 120

gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgccttcccc 180

gaggaccgca gccagcccgg ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg 240

cgtgacttcc acatgagcgt ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt 300

ggggccatct ccctggcccc caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg 360

gtgacagaga gaagggcaga agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc 420

ggccagttcc aaaccctggt g 441

<210> 3

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val

1 5 10 15

Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln

20 25 30

Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys

35 40 45

Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg

65 70 75 80

Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg

85 90 95

Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser

100 105 110

Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile

115 120 125

Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly

130 135 140

Ser Arg Ser Asn

145

<210> 4

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caagtgactg acatcaactc caagggattg gaattgagga agactgttac tacagttgag 60

actcagaact tggaaggcct gcatcatgat ggccaattct gccataagcc ctgtcctcca 120

ggtgaaagga aagctaggga ctgcacagtc aatggggatg aaccagactg cgtgccctgc 180

caagaaggga aggagtacac agacaaagcc catttttctt ccaaatgcag aagatgtaga 240

ttgtgtgatg aaggacatgg cttagaagtg gaaataaact gcacccggac ccagaatacc 300

aagtgcagat gtaaaccaaa ctttttttgt aactctactg tatgtgaaca ctgtgaccct 360

tgcaccaaat gtgaacatgg aatcatcaag gaatgcacac tcaccagcaa caccaagtgc 420

aaagaggaag gatccagatc taac 444

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctcc 45

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgggctgga gctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccacaggcgt gcactcc 57

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 9

<211> 537

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

35 40 45

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

145 150 155 160

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

165 170 175

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

180 185 190

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

195 200 205

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala

210 215 220

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

225 230 235 240

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

245 250 255

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

260 265 270

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

275 280 285

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

290 295 300

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

325 330 335

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

340 345 350

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

355 360 365

Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu

385 390 395 400

Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu

405 410 415

His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg

420 425 430

Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro

435 440 445

Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys

450 455 460

Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu

465 470 475 480

Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn

485 490 495

Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys

500 505 510

Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys

515 520 525

Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn

530 535

<210> 10

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcttagact ccccagacag gccctggaac ccccccacct tctccccagc cctgctcgtg 60

gtgaccgaag gggacaacgc caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc ggagagcttc 120

gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgccttcccc 180

gaggaccgca gccagcccgg ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg 240

cgtgacttcc acatgagcgt ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt 300

ggggccatct ccctggcccc caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg 360

gtgacagaga gaagggcaga agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc 420

ggccagttcc aaaccctggt ggacaagacc cacacatgtc ctccatgccc cgccccagag 480

ctgctgggcg ggcctagcgt gttcctgttc ccccctaagc caaaggatac cctgatgatc 540

agccggaccc ctgaagtgac atgcgtggtc gtggatgtgt cccacgaaga tcctgaggtg 600

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagaa 660

gagcagtacg cctctacata tcgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 720

ctcaatggca aagagtacaa gtgcaaggtg tctaacaagg ccctgcctgc ccctatcgag 780

aaaaccatct ctaaagccaa gggacaacct agagagcctc aggtttacac actgccccca 840

agcagagagg aaatgaccaa gaaccaggtg tccctgacat gtctggtgaa gggcttctac 900

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctataagaca 960

accccccctg tgcttgattc tgacggctca ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1020

aaaagcaggt ggcagcaggg caacgtgttt agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcat 1080

aatcactaca cccagaaaag cctgagcctg agccctggca agggtggtgg tggttctggt 1140

ggtggtggtt ctggcggcgg cggctcccaa gtgactgaca tcaactccaa gggattggaa 1200

ttgaggaaga ctgttactac agttgagact cagaacttgg aaggcctgca tcatgatggc 1260

caattctgcc ataagccctg tcctccaggt gaaaggaaag ctagggactg cacagtcaat 1320

ggggatgaac cagactgcgt gccctgccaa gaagggaagg agtacacaga caaagcccat 1380

ttttcttcca aatgcagaag atgtagattg tgtgatgaag gacatggctt agaagtggaa 1440

ataaactgca cccggaccca gaataccaag tgcagatgta aaccaaactt tttttgtaac 1500

tctactgtat gtgaacactg tgacccttgc accaaatgtg aacatggaat catcaaggaa 1560

tgcacactca ccagcaacac caagtgcaaa gaggaaggat ccagatctaa c 1611

<210> 11

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

35 40 45

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

145 150 155 160

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

165 170 175

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

180 185 190

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

195 200 205

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala

210 215 220

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

225 230 235 240

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

245 250 255

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

260 265 270

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

275 280 285

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

290 295 300

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

325 330 335

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

340 345 350

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

355 360 365

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370

<210> 12

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttcttagact ccccagacag gccctggaac ccccccacct tctccccagc cctgctcgtg 60

gtgaccgaag gggacaacgc caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc ggagagcttc 120

gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgccttcccc 180

gaggaccgca gccagcccgg ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg 240

cgtgacttcc acatgagcgt ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt 300

ggggccatct ccctggcccc caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg 360

gtgacagaga gaagggcaga agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc 420

ggccagttcc aaaccctggt ggacaagacc cacacatgtc ctccatgccc cgccccagag 480

ctgctgggcg ggcctagcgt gttcctgttc ccccctaagc caaaggatac cctgatgatc 540

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agcagagagg aaatgaccaa gaaccaggtg tccctgacat gtctggtgaa gggcttctac 900

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aatcactaca cccagaaaag cctgagcctg agccctggca ag 1122

<210> 13

<211> 375

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val

1 5 10 15

Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln

20 25 30

Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys

35 40 45

Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg

65 70 75 80

Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg

85 90 95

Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser

100 105 110

Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile

115 120 125

Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly

130 135 140

Ser Arg Ser Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

145 150 155 160

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

165 170 175

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

180 185 190

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

195 200 205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

210 215 220

Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

225 230 235 240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

245 250 255

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

260 265 270

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

275 280 285

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

290 295 300

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

325 330 335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

340 345 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

355 360 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 14

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caagtgactg acatcaactc caagggattg gaattgagga agactgttac tacagttgag 60

actcagaact tggaaggcct gcatcatgat ggccaattct gccataagcc ctgtcctcca 120

ggtgaaagga aagctaggga ctgcacagtc aatggggatg aaccagactg cgtgccctgc 180

caagaaggga aggagtacac agacaaagcc catttttctt ccaaatgcag aagatgtaga 240

ttgtgtgatg aaggacatgg cttagaagtg gaaataaact gcacccggac ccagaatacc 300

aagtgcagat gtaaaccaaa ctttttttgt aactctactg tatgtgaaca ctgtgaccct 360

tgcaccaaat gtgaacatgg aatcatcaag gaatgcacac tcaccagcaa caccaagtgc 420

aaagaggaag gatccagatc taacgacaag acccacacat gtcctccatg ccccgcccca 480

gagctgctgg gcgggcctag cgtgttcctg ttccccccta agccaaagga taccctgatg 540

atcagccgga cccctgaagt gacatgcgtg gtcgtggatg tgtcccacga agatcctgag 600

gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga 660

gaagagcagt acgcctctac atatcgggtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac 720

tggctcaatg gcaaagagta caagtgcaag gtgtctaaca aggccctgcc tgcccctatc 780

gagaaaacca tctctaaagc caagggacaa cctagagagc ctcaggttta cacactgccc 840

ccaagcagag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga catgtctggt gaagggcttc 900

taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaacggcc agcccgagaa caactataag 960

acaacccccc ctgtgcttga ttctgacggc tcattcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg 1020

gacaaaagca ggtggcagca gggcaacgtg tttagctgca gcgtgatgca cgaggccctg 1080

cataatcact acacccagaa aagcctgagc ctgagccctg gcaag 1125

<210> 15

<211> 699

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

35 40 45

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe

165 170 175

Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr

180 185 190

Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg

195 200 205

Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp

210 215 220

Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro

225 230 235 240

Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp

245 250 255

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

260 265 270

Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala

275 280 285

Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

290 295 300

Phe Gln Thr Leu Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

305 310 315 320

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

325 330 335

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

340 345 350

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

355 360 365

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

370 375 380

Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

385 390 395 400

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

405 410 415

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

420 425 430

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

435 440 445

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

450 455 460

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

465 470 475 480

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

485 490 495

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

500 505 510

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

515 520 525

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

530 535 540

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly

545 550 555 560

Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu

565 570 575

Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly

580 585 590

Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys

595 600 605

Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser

610 615 620

Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu

625 630 635 640

Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys

645 650 655

Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys

660 665 670

Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn

675 680 685

Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn

690 695

<210> 16

<211> 2097

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttcttagact ccccagacag gccctggaac ccccccacct tctccccagc cctgctcgtg 60

gtgaccgaag gggacaacgc caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc ggagagcttc 120

gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgccttcccc 180

gaggaccgca gccagcccgg ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg 240

cgtgacttcc acatgagcgt ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt 300

ggggccatct ccctggcccc caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg 360

gtgacagaga gaagggcaga agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc 420

ggccagttcc aaaccctggt gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggcggcggc 480

ggctccttct tagactcccc agacaggccc tggaaccccc ccaccttctc cccagccctg 540

ctcgtggtga ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca gcttctccaa cacatcggag 600

agcttcgtgc taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc agacggacaa gctggccgcc 660

ttccccgagg accgcagcca gcccggccag gactgccgct tccgtgtcac acaactgccc 720

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gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgccttcccc 180

gaggaccgca gccagcccgg ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg 240

cgtgacttcc acatgagcgt ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt 300

ggggccatct ccctggcccc caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg 360

gtgacagaga gaagggcaga agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc 420

ggccagttcc aaaccctggt gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggcggcggc 480

ggctccttct tagactcccc agacaggccc tggaaccccc ccaccttctc cccagccctg 540

ctcgtggtga ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca gcttctccaa cacatcggag 600

agcttcgtgc taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc agacggacaa gctggccgcc 660

ttccccgagg accgcagcca gcccggccag gactgccgct tccgtgtcac acaactgccc 720

aacgggcgtg acttccacat gagcgtggtc agggcccggc gcaatgacag cggcacctac 780

ctctgtgggg ccatctccct ggcccccaag gcgcagatca aagagagcct gcgggcagag 840

ctcagggtga cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc accccagccc ctcacccagg 900

ccagccggcc agttccaaac cctggtggac aagacccaca catgtcctcc atgccccgcc 960

ccagagctgc tgggcgggcc tagcgtgttc ctgttccccc ctaagccaaa ggataccctg 1020

atgatcagcc ggacccctga agtgacatgc gtggtcgtgg atgtgtccca cgaagatcct 1080

gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 1140

agagaagagc agtacgcctc tacatatcgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1200

gactggctca atggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcta acaaggccct gcctgcccct 1260

atcgagaaaa ccatctctaa agccaaggga caacctagag agcctcaggt ttacacactg 1320

cccccaagca gagaggaaat gaccaagaac caggtgtccc tgacatgtct ggtgaagggc 1380

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactat 1440

aagacaaccc cccctgtgct tgattctgac ggctcattct tcctgtacag caagctgacc 1500

gtggacaaaa gcaggtggca gcagggcaac gtgtttagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1560

ctgcataatc actacaccca gaaaagcctg agcctgagcc ctggcaag 1608

<210> 23

<211> 1608

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Thr Thr Cys Thr Thr Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly

1 5 10 15

Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys

20 25 30

Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala

35 40 45

Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala

50 55 60

Cys Cys Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys

85 90 95

Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Gly Gly

100 105 110

Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala

115 120 125

Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys

130 135 140

Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly

145 150 155 160

Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Thr

165 170 175

Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys

180 185 190

Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr

195 200 205

Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys

210 215 220

Ala Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Gly

225 230 235 240

Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Ala

245 250 255

Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly

260 265 270

Gly Cys Gly Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys

275 280 285

Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly

290 295 300

Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys

305 310 315 320

Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala

325 330 335

Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly

340 345 350

Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Ala

355 360 365

Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly

370 375 380

Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala

385 390 395 400

Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys

405 410 415

Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala

420 425 430

Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly

435 440 445

Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly

450 455 460

Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys

465 470 475 480

Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Gly Ala Cys Thr

485 490 495

Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly

500 505 510

Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys

515 520 525

Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly

530 535 540

Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ala

545 550 555 560

Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys

565 570 575

Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala

580 585 590

Cys Ala Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Gly Thr

595 600 605

Gly Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Cys

610 615 620

Ala Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys

625 630 635 640

Ala Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys

645 650 655

Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys

660 665 670

Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys

675 680 685

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly

690 695 700

Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys

705 710 715 720

Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys

725 730 735

Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly

740 745 750

Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys

755 760 765

Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr

770 775 780

Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr

785 790 795 800

Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Ala Gly

805 810 815

Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys

820 825 830

Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr

835 840 845

Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala

850 855 860

Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys

865 870 875 880

Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys

885 890 895

Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly

900 905 910

Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly

915 920 925

Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly

930 935 940

Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys

945 950 955 960

Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly

965 970 975

Gly Gly Cys Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr

980 985 990

Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Cys Cys Ala

995 1000 1005

Ala Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala

1010 1015 1020

Thr Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala

1025 1030 1035 1040

Ala Gly Thr Gly Ala Cys Ala Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys

1045 1050 1055

Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys Gly

1060 1065 1070

Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala

1075 1080 1085

Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly

1090 1095 1100

Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys

1105 1110 1115 1120

Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala

1125 1130 1135

Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly

1140 1145 1150

Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Thr Cys

1155 1160 1165

Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr

1170 1175 1180

Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly

1185 1190 1195 1200

Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Ala

1205 1210 1215

Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Ala

1220 1225 1230

Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr Ala Thr Cys Gly

1250 1255 1260

Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Ala Ala

1265 1270 1275 1280

Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr

1285 1290 1295

Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Thr

1300 1305 1310

Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly

1315 1320 1325

Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys

1330 1335 1340

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys

1345 1350 1355 1360

Thr Gly Ala Cys Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala

1365 1370 1375

Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys

1380 1385 1390

Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr

1395 1400 1405

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala

1410 1415 1420

Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr

1425 1430 1435 1440

Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly

1445 1450 1455

Thr Gly Cys Thr Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Cys Gly Gly

1460 1465 1470

Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys

1475 1480 1485

Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly

1490 1495 1500

Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala

1505 1510 1515 1520

Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Thr

1525 1530 1535

Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys

1540 1545 1550

Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala

1555 1560 1565

Thr Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala

1570 1575 1580

Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys

1585 1590 1595 1600

Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly

1605

<210> 24

<211> 1614

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

caagtgactg acatcaactc caagggattg gaattgagga agactgttac tacagttgag 60

actcagaact tggaaggcct gcatcatgat ggccaattct gccataagcc ctgtcctcca 120

ggtgaaagga aagctaggga ctgcacagtc aatggggatg aaccagactg cgtgccctgc 180

caagaaggga aggagtacac agacaaagcc catttttctt ccaaatgcag aagatgtaga 240

ttgtgtgatg aaggacatgg cttagaagtg gaaataaact gcacccggac ccagaatacc 300

aagtgcagat gtaaaccaaa ctttttttgt aactctactg tatgtgaaca ctgtgaccct 360

tgcaccaaat gtgaacatgg aatcatcaag gaatgcacac tcaccagcaa caccaagtgc 420

aaagaggaag gatccagatc taacggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 480

ggcggctccc aagtgactga catcaactcc aagggattgg aattgaggaa gactgttact 540

acagttgaga ctcagaactt ggaaggcctg catcatgatg gccaattctg ccataagccc 600

tgtcctccag gtgaaaggaa agctagggac tgcacagtca atggggatga accagactgc 660

gtgccctgcc aagaagggaa ggagtacaca gacaaagccc atttttcttc caaatgcaga 720

agatgtagat tgtgtgatga aggacatggc ttagaagtgg aaataaactg cacccggacc 780

cagaatacca agtgcagatg taaaccaaac tttttttgta actctactgt atgtgaacac 840

tgtgaccctt gcaccaaatg tgaacatgga atcatcaagg aatgcacact caccagcaac 900

accaagtgca aagaggaagg atccagatct aacgacaaga cccacacatg tcctccatgc 960

cccgccccag agctgctggg cgggcctagc gtgttcctgt tcccccctaa gccaaaggat 1020

accctgatga tcagccggac ccctgaagtg acatgcgtgg tcgtggatgt gtcccacgaa 1080

gatcctgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 1140

aagcccagag aagagcagta cgcctctaca tatcgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1200

caccaggact ggctcaatgg caaagagtac aagtgcaagg tgtctaacaa ggccctgcct 1260

gcccctatcg agaaaaccat ctctaaagcc aagggacaac ctagagagcc tcaggtttac 1320

acactgcccc caagcagaga ggaaatgacc aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtg 1380

aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac 1440

aactataaga caaccccccc tgtgcttgat tctgacggct cattcttcct gtacagcaag 1500

ctgaccgtgg acaaaagcag gtggcagcag ggcaacgtgt ttagctgcag cgtgatgcac 1560

gaggccctgc ataatcacta cacccagaaa agcctgagcc tgagccctgg caag 1614

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：

(a)作为主体的人IgG1抗体的Fc段；

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，所述PD-1胞外结构域由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行编码。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fas胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中，所述Fas胞外结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行编码。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1胞外结构域或所述Fas胞外结构域通过接头序列与人IgG1抗体的Fc段的N端或C端连接。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1胞外结构域或所述Fas胞外结构域的数量为1-2个。

6.根据权利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头序列为(G4S)3接头序列，其中，所述(G4S)3接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且所述氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行编码。

8.氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，且所述氨基酸序列由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行编码。

9.根据权利要求1至6任一项所述的融合蛋白在制备治疗PD-L1和FasL相关的癌症的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症选自尿路上皮癌、小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌中的一种或多种。