CN108530517A

CN108530517A - 刺激免疫细胞活化的多肽、融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN108530517A
Application number: CN201710117498.3A
Authority: CN
Inventors: 李晓雨; 韩化敏; 田雨佳
Original assignee: Bai Si O J (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Bai Si O J (beijing) Biotechnology Co Ltd; Biocells Beijing Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2017-03-01
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本申请提供了刺激免疫细胞活化的多肽，其包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本申请还提供了包含上述多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和宿主细胞，以及生产上述融合蛋白的方法。此外，本申请还涉及上述多肽和融合蛋白的医学和生物学用途。

Description

刺激免疫细胞活化的多肽、融合蛋白及其制备方法

技术领域

本申请大体涉及生物学和免疫学领域，具体而言，本申请提供了刺激免疫细胞活化的多肽、融合蛋白及其制备方法，以及其医学和生物学用途。

背景技术

生物细胞免疫治疗是从患者体内提取免疫细胞在实验室中进行培养后获得的一群抑制细胞，该细胞对肿瘤细胞识别能力很强，如同细胞导弹能精确点射肿瘤细胞，被誉为绿色疗法。细胞免疫治疗技术被称为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方法：通过采集患者自身免疫细胞，经过体外培养扩增，再回输至患者体内以杀灭癌细胞、病原体，激活人体免疫能力，从而预防肿瘤复发和转移，可在一定程度上解决患者放化疗后免疫力差、生活质量下降的弊端。细胞免疫疗法在国际上已逐渐成为治疗癌症的新趋势。

在生物多细胞免疫治疗之前，免疫治疗中回输到患者体内的“抗肿瘤细胞”主要是树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)两种。现在，用于患者治疗的“抗肿瘤细胞”增加到了6种：高纯度DC、CIK、自然杀伤细胞(NK)、CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和自然杀伤T细胞(NKT)。目前，NKT细胞是从人外周血或脐带血经体外分离获得单个核细胞，经刺激后连续培养而获得的。NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4、IFN-γ、GM-CSF、IL-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。

发明内容

第一方面，本申请提供了多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的且具有刺激免疫细胞活化功能的序列。

在一些实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本申请的多肽由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

在本文中，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽被命名为NKTP肽。

在一些实施方案中，本申请的多肽序列为由上述(a)所述的序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸后得到的序列，而且经过上述取代、缺失或添加得到的多肽仍具有刺激免疫细胞活化功能。

第二方面，本申请提供了融合蛋白，其包含第一方面所述的多肽以及一个或多个融合伴侣；任选地，所述融合蛋白还包含连接子。

在一些实施方案中，所述融合伴侣包含选自β2-微球蛋白(简称β2M)、Fc区或其部分、免疫球蛋白重链恒定区、蛋白标签、神经酰胺样糖脂抗原中的一个或多个。

在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸/丝氨酸间隔子。

在一些实施方案中，所述融合伴侣包含β2-微球蛋白、和/或Fc区或其部分、和/或蛋白标签。

在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在一些实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：5所示的序列相差至少一个氨基酸的取代、缺失或添加且具有刺激免疫细胞活化功能的蛋白。

第三方面，本申请了提供了多核苷酸，其编码第一方面所述的多肽。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，本申请的多核苷酸由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成。

第四方面，本申请提供了核酸分子，其编码第二方面所述的融合蛋白。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成。

第五方面，本申请提供了重组载体，其包含第三方面所述的多核苷酸或第四方面所述的核酸分子。

在一些实施方案中，本发明的重组载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。

第六方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸分子或第五方面所述的重组载体。

第七方面，本申请提供了第二方面所述的融合蛋白的制备方法，包括：

将第四方面所述的核酸分子转入宿主细胞中，培养所述宿主细胞；以及收获所述融合蛋白。

在一些实施方案中，所述制备方法还包括纯化所述融合蛋白。

第八方面，本申请提供了第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸，或第四方面所述的核酸分子在制备用于调节个体免疫反应、或在制备用于细胞免疫疗法的药物中的用途。

附图说明

图1为融合蛋白的编码序列的结构示意图。

图2为载体pcDNA3.1(+/-)的结构示意图。

图3为酶切后的编码β2M+连接子1的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DL1,000 DNA Marker(条带大小：a为1000bp、b为700bp、c为500bp、d为400bp、e为300bp、f为200bp和g为100bp)，泳道2为酶切后的编码β2M+连接子1的DNA片段。

图4为酶切后的编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DL 1kb DNA Marker(条带大小：a为5000bp、b为4000bp、c为3000bp、d为2000bp和e为1000bp)，泳道2为酶切后的编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段。

图5为重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白使用XbaI和BamHI双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DL1,000 DNA Marker(条带大小：a为1000bp、b为700bp、c为500bp和d为400bp)，泳道2为酶切后的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-1，泳道3为酶切后的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-2，泳道4为酶切后的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-3，泳道5为1kb DNA Marker(条带大小：a为7000bp、b为6000bp、c为5000bp、d为4000bp、e为3000bp、f为2000bp和g为1000bp)。

图6为重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白使用HindIII和BamHI双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为酶切后的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-1，泳道2为酶切后的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-2，泳道3为酶切后的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-3，泳道4为1kb的DNA Marker(条带大小：a为6000bp、b为5000bp、c为4000bp、d为3000bp、e为2000bp和f为1000bp)。

图7为转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞扩增编码NKTP肽+hIgG1的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DNA Marker(条带大小：a为6000bp、b为5000bp、c为4000bp、d为3000bp、e为2000bp和f为1000bp)，泳道2为未转染重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞的扩增产物，泳道3为转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞的扩增产物，泳道4为阴性对照。

图8为鉴定融合蛋白的Western blot实验结果。其中，泳道1为重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白转染293T细胞的上清，泳道2为蛋白预染Marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd和e为55kd)，泳道3为未转染重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞的上清。

图9为2-9号转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的CHO-K1细胞培养液上清的Western blot实验结果。其中，泳道1为蛋白预染Marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd、e为55kd和f为36kd)，泳道2为2号细胞培养液上清，泳道3为3号细胞培养液上清，泳道4为4号细胞培养液上清，泳道5为9号细胞培养液上清，泳道6为5号细胞培养液上清，泳道7为6号细胞培养液上清，泳道8为7号细胞培养液上清，泳道9为8号细胞培养液上清。

图10为采用Protien A柱进行纯化融合蛋白的图，其中方框所示即为融合蛋白纯化峰。

图11为融合蛋白纯化样品的Western blot实验结果。其中，泳道1为蛋白预染Marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd和e为55kd)，泳道2为融合蛋白纯化样品。

图12为鉴定生物素化的融合蛋白的Western blot实验结果。其中，泳道1为和泳道2为不同批次纯化收集的融合蛋白样品，泳道3为蛋白预染Marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd、e为55kd、f为36kd和g为28kd)。

发明详述

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

定义

如本文所用术语“免疫细胞”，是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。

如本文所用术语“免疫细胞活化”，是指免疫细胞通过抗原或刺激因子的刺激进行增殖并分化的现象。

如本文所用术语“融合蛋白”，是指通过DNA重组技术得到的基因重组后的表达产物，例如将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物。

如本文所用术语“融合伴侣”，是指基本上不抑制目的多肽的活性并且具有一定功能的任何合适的部分。融合伴侣可以具有下述至少一项作用：增强多肽的稳定性和/或效力，实现多肽的多价化和/或有利于多肽的纯化，有助于多肽引入功能化基团，增强或参与多肽的作用等。

如本文所用术语“蛋白标签”，是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。常用的蛋白标签包含Avi-tag、TrxHis标签、Flag标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签、HA标签、c-Myc标签、eGEP标签、eYFP标签、eCFP标签、SNAP-Tag、Halo Tag、泛素样修饰蛋白(SUMO)标签等。

如本文所用术语“连接子”，又称接头序列(Linker)。接头序列设计为融合蛋白制备中的常用技术，即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条肽链，其中起连接作用的氨基酸称为连接子。

具体实施方式

(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，以及

本申请发明人将NKTP肽用于人外周血或脐带血经体外分离获得的单个核细胞的连续培养，然后通过流式细胞术检测，结果表明，NKTP肽能够激活单个核细胞中的NKT细胞。活化后的NKT细胞能够快速、大量地分泌Th1(IFN-7等)、Th2(IL4等)类细胞因子，从而强有力地影响免疫反应类型，实现对免疫应答和自身免疫的调节。因此，本申请发明人经实验证实了本申请多肽刺激免疫细胞活化的功能。

在一些实施方案中，本申请的多肽序列为由上述(a)所述的序列经过取代、缺失或添加一个或几个，例如1个～10个，优选1个～5个，更优选1个～3个氨基酸后得到的序列。

在一些实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。

在一些实施方案中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的变体与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％以上的同源性。

在一些实施方案中，多肽变体与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。

本文所述的“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。

在一些实施方案中，NKTP肽序列的C端或N端区域还可以被截短或添加约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的变体是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中包含一个或几个保守性氨基酸取代的序列，其中经取代后的序列具有与NKTP肽类似的功能。

被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。

本申请中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一个取代这些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，反之亦然；用苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)取代这些芳香族氨基酸中的任何另外一个；以及用甲硫氨酸(M)取代半胱氨酸(C)，反之亦然。其他的取代也可以被视为是保守性的，这取决于特定氨基酸环境和它在蛋白三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，如同丙氨酸(A)和缬氨酸(V)可以互换。相对疏水的甲硫氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，以及有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常在以下位置互换：其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，以及这两种氨基酸残基的不同pK并不明显。

在一些具体的实施方案中，所述β2-微球蛋白(简称β2M)包含或由如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，所述Fc区或其部分包含IgA、IgD或IgG区(铰链-CH2-CH3)；更进一步地，所述Fc区或其部分包含IgG Fc区，例如IgG1 Fc区或IgG4 Fc区。

在一些具体的实施方案中，所述Fc区为人IgG1 Fc区(简称hIgG1)。

在一些具体的实施方案中，所述Fc区或其部分包含或由如SEQ ID NO：3所示的序列组成。

在一些具体的实施方案中，所述蛋白标签为实现蛋白质生物素化的标签，例如BriA tag。

在一些具体的实施方案中，所述蛋白标签包含或由如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成。

本发明的多肽以及一个或多个融合伴侣可经由连接子(即柔性分子连接，如柔性多肽链)连接。连接子可为不影响多肽功能的任何合适的连接子，其长度可以为，例如：至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个氨基酸。

在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸/丝氨酸间隔子。

在一些实施方案中，合适的连接子的实例包括但不限于包含一个或多个(例如2、3、4、5或6个)G4S基序的连接子。

在一些实施方案中，所述融合蛋白可具有下述任一种构型：(融合伴侣)-(任选的连接子)-(本申请的多肽)、(本申请的多肽)-(任选的连接子)-(融合伴侣)、(第一融合伴侣)-(任选的连接子)-(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)、(第一融合伴侣)-(任选的第一连接子)-(本申请的多肽)-(任选的第二连接子)-(第三融合伴侣)、(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)-(任选的连接子)-(第三融合伴侣)、(第一融合伴侣)-(任选的第一连接子)-(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)-(任选的第二连接子)-(第三融合伴侣)。

在一些具体的实施方案中，融合伴侣可以是β2-微球蛋白(简称β2M)、Fc区或其部分、或蛋白标签。融合伴侣例如β2-微球蛋白可以增强或参与目的多肽的生物活性(例如免疫反应)，或者增强多肽的稳定性和/或效力；Fc区或其部分可以实现多肽的多价化和/或有利于多肽的纯化；蛋白标签有助于多肽引入功能化基团。

在一些具体的实施方案中，上述第一融合伴侣为β2-微球蛋白，第二融合伴侣为Fc区或其部分，第三融合伴侣为蛋白标签。

在一些具体实施方案中，所述融合蛋白的构型如下：(第一融合伴侣)-(任选的第一连接子)-(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)-(任选的第二连接子)-(第三融合伴侣)。

在一些具体的实施方案中，第一连接子为β2-微球蛋白与NKTP肽之间的连接子，命名为连接子1。

在一些具体的实施方案中，所述连接子1包含或由如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成，记为(G4S)₃。

在一些具体的实施方案中，所述第二连接子为hIgG1与BriA tag之间的连接子，命名为连接子2。

在一些具体的实施方案中，连接子2包含或由如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成，记为(G4S)₃。

在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白的构型如下：β2M-连接子1-NKTP肽-hIgG1-连接子2-BriA tag。

上文中，所述免疫细胞可以选自自然杀伤T细胞、外周血单个核细胞、脐带血单个核细胞或CD8+T细胞。

在一些实施方案中，上述多核苷酸编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列即NKTP肽，或其功能等同变体。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸与编码NKTP肽及其功能等同变体的多核苷酸具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同源性。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸由与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与编码NKTP肽及其功能等同变体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者由与编码NKTP肽及其功能等同变体的核苷酸序列特异性杂交且编码与NKTP肽在功能上等同的多肽的核苷酸序列组成。

本领域技术人员可以常规选择DNA杂交的严格条件。通常较长的探针需要较高的温度，以便进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于其解链温度的环境时变性DNA的重退火能力。探针与可杂交序列之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。于是，较高的相对温度往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反应严格条件的详细描述，可参阅Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。

在一些实施方案中，DNA杂交采用的严格条件包括：1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；2)杂交时采用甲酰胺等变性剂，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚二烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或3)在42℃下过夜杂交，杂交溶液含50％甲酰胺，5x SSC缓冲液(0.75M氯化钠，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5xDenhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精子DNA(50.mu.g/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2x SSC缓冲液(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，再以含有EDTA的0.1x SSC缓冲液于55℃进行高严格度洗涤。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核酸时的严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些序列的核酸杂合体的T_m越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的T_m)以下列顺序递减：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。优选地，可杂交核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。

第四方面所述的核酸分子包含第三方面所述的多核苷酸(SEQ ID NO：6)、编码所述β2M的DNA序列(SEQ ID NO：9)、编码所述hIgG1的DNA序列(SEQ ID NO：10)、编码所述BriAtag的DNA序列(SEQ ID NO：11)、编码所述连接子1的DNA序列(SEQ ID NO：12)和编码所述连接子2的DNA序列(SEQ ID NO：13)。

核酸分子的总长度优选地受预期重组DNA方案中制备和使用的便利性的限制。可以利用本领域内已知的和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多肽及其融合物。例如，编码本发明的多肽或融合蛋白的多核苷酸序列可以用于重组DNA分子中以指导多肽或融合蛋白在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码子固有的简并性，编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列也可以用于本发明中，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽或蛋白。

在一些实施方案中，本申请的第三方面所述的多核苷酸或第四方面所述的核酸分子可以通过人工合成产生，例如直接的化学合成或酶合成。在可选的实施方案中，上述多核苷酸或核酸分子通过重组技术产生。

在一些具体的实施方案中，通过重叠PCR(overlap-PCR)、酶切和连接的方法，将编码β2M的核苷酸序列、编码连接子1的核苷酸序列、编码第一方面所述多肽的核苷酸序列、编码hIgG1的核苷酸序列、编码连接子2的核苷酸序列和编码BriA tag的核苷酸序列串联重复在一起。

本发明所述的“重组载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。

在一些实施方案中，用于构建所述重组载体的表达载体为pcDNA3.1(-)、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL、pKSV-10、pBPV-1、pml2d、pTDT1、pMIG、pLL3.7、pDC315、AAV，或者是本领域熟知的其它载体。

在一个具体的实施方案中，用于克隆本文第四方面所述的核酸分子的表达载体为质粒载体，例如pcDNA3.1(-)。

在一些实施方案中，利用本领域的技术人员熟知的方法构建编码第二方面所述的融合蛋白的核酸分子和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,aLaboratory Manual,cold SpringHarbor Laboratory.New York,1989)。核苷酸序列可操作地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性实例包括：CMV立即早期启动子、大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。

在一个具体的实施方案中，通过T₄连接酶将重组核苷酸序列连接到载体中，例如将第四方面所述的核酸分子连接到表达载体pcDNA3.1(-)中，命名为重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的G418(遗传霉素)抗性、新霉素抗性、二氢叶酸还原酶以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

在一个具体的实施方案中，包含第四方面所述的核酸分子的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的构建方法如下：

1)采用引物primer1 F(SEQ ID NO：14)/primer2 R(SEQ ID NO：15)扩增编码部分β2M+连接子1的DNA片段；

2)采用引物primer1 F/primer3 R(SEQ ID NO：16)以步骤1)的产物为模版扩增编码完整β2M+连接子1的DNA片段；

3)采用引物primer4 F(SEQ ID NO：17)/primer5 R(SEQ ID NO：18)扩增编码NKTP肽的DNA片段；

4)采用引物primer6 F(SEQ ID NO：19)/primer7 R(SEQ ID NO：20)扩增编码hIgG1的DNA片段；

5)按照下述DNA序列直接合成连接子2+BriA tag的DNA序列：

ggtggtgggg gttcgggcgg cgggggctcg ggaggagggg gatcg ggcctcaacgacatcttcga agcacaaaaa atcgaatggc ac

采用引物primer8 F(SEQ ID NO：21)/primer9 R(SEQ ID NO：22)扩增编码连接子2+BriA tag的DNA片段；

6)采用引物primer6 F/primer9 R以步骤4)、5)的扩增产物为模版，扩增获得编码hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段；

7)采用引物primer4 F/primer9 R以步骤3)、6)的扩增产物为模版，扩增获得编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段；

8)对步骤2)扩增产物用XbaI和BamHI酶切，获得酶切后的编码β2M+连接子1的DNA片段；对步骤7)产物用BamHI和HindIII酶切，获得酶切后的编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段；将载体pcDNA3.1(-)用XbaI和HindIII酶切，获得载体骨架；将酶切后的编码β2M+连接子1的DNA片段、酶切后的编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段和载体骨架采用T₄连接酶进行连接，获得重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白。

所用酶切位点及其序列如下：

XbaI:TCTAGA

BamHI:GGATCC

HindIII：AAGCTT

第六方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸分子或第五方面的所述重组载体。

在一些实施方案中，将编码融合蛋白的核酸分子或含有该核酸分子的表达载体转化或转导入宿主细胞，获得含有该核酸分子或表达载体的基因工程化宿主细胞。

本文所用的宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括真核细胞、原核细胞，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞等。选择合适的宿主细胞在本领域技术人员的能力范围内。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞可以为CHO细胞、293T细胞、JY细胞、BM92细胞、WIN细胞、MOC细胞、MG细胞、NSO细胞、SP2细胞、BHK细胞、COS细胞、Hep G2细胞、A549细胞、HELA细胞、CVI细胞、COS细胞、R1610细胞、BALBC/3T3细胞、HAK细胞、SP2/O细胞、P3x63-Ag3.653细胞、BFA-1c1BPT细胞或RAJI细胞。

可以利用本领域已知的任何技术将表达载体导入宿主细胞中，包括转化、转导、转染、病毒感染、基因枪或Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods inMolecular Biology,(1986))。

在一个具体的实施方案中，所述宿主细胞为CHO-K1细胞，将重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白通过磷酸钙转染法导入宿主细胞中进行培养表达，所述宿主细胞在导入重组载体前本身不含有或不表达本申请所述融合蛋白。

在适于宿主细胞生长或对其进行诱导表达的培养基中进行宿主细胞培养。根据所用的宿主细胞，可以选择各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。优选地，工程化的宿主细胞可以在被修饰适于激活启动子的常规营养培养基中进行培养，以筛选转化子或扩增本发明的多核苷酸。转化合适的宿主细胞并当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，将细胞扩大培养，以允许其生产目的多肽或蛋白。

在一些实施方案中，宿主细胞生产的重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。例如，表达的蛋白可以通过本领域熟知的以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。根据所述融合蛋白的纯化蛋白标签，进行所述融合蛋白的纯化。

在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含人IgG1 Fc区(简称hIgG1)或其部分可以作为纯化蛋白标签，采用proteinA亲和层析或proteinG亲和层析进行纯化。

第八方面，本申请提供了第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸、或第四方面所述的核酸分子在制备用于调节个体免疫反应、或在制备用于细胞免疫疗法的药物中的用途。

本申请所述融合蛋白可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体及其他多聚体。

因此，本申请提供的一种刺激免疫细胞活化的融合蛋白及其制备方法，至少具有以下优势：将本申请的融合蛋白单独地，或与其他物质例如与α-半乳糖神经鞘胺醇、人重组白介素2共同作用于人外周血或脐带血经体外分离获得的单个核细胞，可以快速获得大量活化的NKT细胞。NKT细胞被激活后，分泌大量的IL-4、IFN-γ、GM-CSF和其它细胞因子以及趋化因子(如IL-2、IL-13、IL-17、IL-21、肿瘤坏死因子-α)，发挥免疫调节作用。NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。此外，活化后的NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子，同时还具有与CD8+杀伤性T细胞相同的杀伤靶细胞作用，NKT细胞在免疫调节系统中占有重要位置。因此，本申请的融合蛋白在细胞免疫治疗中具有广阔的发展前景。

实施例

实施例1重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的构建

使用的外周血由志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为：

1)年龄大于18周岁；

2)无HIV、HBV感染；

3)血常规检测正常；

4)非孕妇或哺乳期妇女。

1、分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用Triol试剂盒提取RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，使用引物primer1 F(SEQ ID NO：14)/primer2 R(SEQ ID NO：15)进行第一轮扩增；以第一轮扩增产物为模板，使用引物primer1 F/primer3 R(SEQ ID NO：16)进行第二轮扩增，获得编码β2M+连接子1的DNA片段；

2、分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用Triol提取RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，使用引物primer4F(SEQ ID NO：17)/primer5 R(SEQ ID NO：18)进行扩增，获得编码NKTP肽的DNA片段；

3、以提取的上述志愿者的PBMC细胞的DNA为模板，使用引物primer6 F(SEQ IDNO：19)/primer7R(SEQ ID NO：20)进行扩增，获得编码hIgG1的DNA片段；

4、按照下述DNA序列直接合成连接子2+BriA tag的DNA序列：

使用引物primer8F(SEQ ID NO：21)/primer 9R(SEQ ID NO：22)，以直接合成的连接子2+BriA tag的DNA序列为模板进行扩增，获得编码连接子2+BriA tag的DNA片段；

5、以步骤3的编码hIgG1的DNA片段和步骤4的连接子2+BriA tag的扩增产物为模板，使用引物primer6 F/primer 9R进行扩增，获得编码hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段；

6、将步骤2和步骤5获得DNA片段进行混合，使用引物primer4 F/primer9 R进行重叠PCR扩增，获得编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段；

7、对载体pcDNA3.1(-)使用酶XbaI和HindIII酶切，获得载体骨架；对步骤1的编码β2M+连接子1的DNA片段使用XbaI和BamHI酶切，获得酶切后的编码β2M+连接子1的DNA片段，其大小为399bp(图3)；对步骤6的NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段使用BamIH和HindIII酶切，获得酶切后的编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段，其大小为1862bp(图4)；将酶切后的编码β2M+连接子1的DNA片段、酶切后的编码NKTP肽+hIgG1+连接子2+BriA tag的DNA片段和载体骨架采用T₄连接酶进行连接，获得重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白。

对于获得的三个重组载体，分别标记为重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-1、重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-2和重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-3，并分别进行酶切验证，采用XbaI和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，三个重组载体均分别出现大小为399bp，800bp和6411bp的三条带，电泳结果分析酶切片段大小符合预期(图5)；对于获得的三个重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-1、pcDNA3.1(-)-融合蛋白-2和pcDNA3.1(-)-融合蛋白-3分别进行酶切验证，采用HindIII和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，三个重组载体均分别出现大小为1871bp和5800bp的两条带，电泳结果分析酶切片段大小符合预期(图6)。

根据XbaI和BamHI双酶切结果以及HindIII和BamHI双酶切结果证实重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白-1、pcDNA3.1(-)-融合蛋白-2和pcDNA3.1(-)-融合蛋白-3均构建成功。

实施例2融合蛋白的鉴定

提取浓度为1μg/μL的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白，利用磷酸钙转染法将所构建的重组载体转染293T细胞，转染293T细胞48小时后提取RNA，反转录成cDNA，采用引物primer4F(SEQ ID NO：17)和primer7R(SEQ ID NO：20)扩增编码NKTP肽+hIgG1的DNA片段。将扩增后的编码NKTP肽+hIgG1的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳鉴定所构建的重组载体是否能够在真核细胞293T细胞中正确表达。结果如图7所示：转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞的扩增产物中能检测到编码NKTP肽+hIgG1的DNA片段，未转染重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞的扩增产物和阴性对照(转染载体pcDNA3.1(-)的293T细胞)中未检测到编码NKTP肽+hIgG1的DNA片段。

收集转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞培养液上清和未转染重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞培养液上清，进行Western blot实验，具体实验步骤如下：

1)将转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞培养液上清和未转染重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的293T细胞培养液上清进行8％的SDS-PAGE凝胶电泳，上样量均为20μL，预染Marker上样量为5μL。浓缩胶电泳条件为：80V，45分钟；分离胶电泳条件为：120V，45分钟。

2)电泳结束后剥下凝胶，并将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，在凝胶/滤膜外再包滤纸(预先用电转缓冲液浸湿)，进行转膜，转膜缓冲液温度保持在4～6℃，200mA约2小时。

3)转膜结束后，取出硝酸纤维素膜，弃去凝胶。

4)用去离子水洗涤硝酸纤维素膜1次后，用封闭液(8％的脱脂牛奶)进行封闭，37℃进行2小时或4℃过夜。

5)封闭结束后，用PBST洗涤液洗涤硝酸纤维素膜1次，将HRP标记山羊抗人IgG按1:2000稀释于封闭液中，并将硝酸纤维素膜浸泡其中，置于脱色摇床上室温震荡1小时。

6)然后用PBST洗涤液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。用DAB试剂进行避光显色5～10分钟(显色以目的蛋白分子量处出现条带，且没有其他杂带时为最好)，然后加入蒸馏水终止反应。

7)使用Bio-Rad凝胶成像系统进行拍照。

实验结果如图8所示，Western blot实验结果显示，在该融合蛋白的二聚体大小处有明显条带(如图8中泳道1所显示的条带)，证明构建的重组载体可以在293T细胞中正确表达为目的蛋白。

实施例3融合蛋白稳定细胞株的制备

将CHO-K1细胞铺6孔板，过夜培养，采用含10％FBS的F12K培养基进行培养。待第二天细胞融合度达到80％时，采用磷酸钙转染法，用浓度为1μg/μL的重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白转染CHO-K1细胞。转染1周后，添加浓度为700μg/mL的G418进行筛选，筛选10天左右大量细胞死亡，少量细胞由于整合重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白中的抗性基因具有抗性存活，将存活细胞分到96孔板，每孔少于或等于1个细胞。培养20～30天后可以观察到部分96孔板中长满单个细胞，应及时扩大培养。

采用Western blot和ELASIA检测表达融合蛋白的细胞系。

Western blot的实验步骤同实施例2，只是上样样品为2-9号转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的CHO-K1细胞培养液上清，采用6％的SDS-PAGE凝胶进行电泳，其中泳道2为2号细胞培养液上清，泳道3为3号细胞培养液上清，泳道4为4号细胞培养液上清，泳道5为9号细胞培养液上清，泳道6为5号细胞培养液上清，泳道7为6号细胞培养液上清，泳道8为7号细胞培养液上清，泳道9为8号细胞培养液上清。结果如图9所示，9号CHO-K1细胞株可以表达融合蛋白，如图9中泳道5所显示的条带。

将9号CHO-K1细胞株扩大培养，取细胞培养液上清250mL经1000g离心20分钟，收集上清；将收集的上清用15mL的100KD的超滤离心管4000g离心20分钟，收集超滤浓缩液(约30mL)，将超滤浓缩液采用0.45μm的滤膜过滤，得到9号CHO-K1细胞培养液上清浓缩液。将9号CHO-K1细胞培养液上清浓缩液使用Protien A柱进行纯化，收集9号CHO-K1细胞株纯化后的融合蛋白(图10)。

ELASIA检测的实验步骤如下：

1)将来自1-10号转染了重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的CHO-K1细胞培养液上清、未转染重组载体pcDNA3.1(-)-融合蛋白的CHO-K1细胞培养液上清(阴性对照)和来自9号CHO-K1细胞株纯化后的融合蛋白样品在37℃包被ELISA板(样品排布见表1)1.5小时，每孔100μL。其中9-1、9-2、9-3和9-4分别为来自9号CHO-K1细胞株的纯化后的融合蛋白样品的平行实验。

2)包被结束后，用TBST洗涤3次，然后在4℃用5％BSA封闭过夜，每孔200μL。

3)封闭结束后，用TBST洗涤3次，然后用1％BSA按照2000:1的比例稀释二抗(HRP标记的山羊抗人IgG)，100μL/孔，37℃孵育50分钟。

4)孵育结束后，用TBST洗涤5次，然后加入TMB显色液，100μL/孔；37℃孵育15分钟后，加入终止液，50μL/孔，在450nm处读取吸光值。实验结果见表1：9号CHO-K1细胞培养液上清的OD值最高，并且对于9号CHO-K1细胞株培养液浓缩后纯化的结果，获得的样品中融合蛋白含量较高。

表1

样品编号	OD₄₅₀	样品编号	OD₄₅₀
				1号	0.073	9号	0.187
2号	0.098	10号	0.107
				3号	0.083	阴性对照	0.130
4号	0.082	阴性对照	0.119
				5号	0.090	9-1	3.781
6号	0.076	9-2	3.259
				7号	0.106	9-3	3.519
8号	0.088	9-4	3.717

根据上述Western blot和ELASIA检测结果，获得了稳定表达融合蛋白的CHO-K1细胞株，命名为9号细胞株。

将9号细胞株扩大培养后，将细胞培养液上清经Protien A柱纯化后获得的融合蛋白纯化样品进行Western Blot实验鉴定(二抗为HRP标记的山羊抗人IgG)，结果如图11所示，融合蛋白纯化样品中存在融合蛋白，大小符合预期，9号细胞株为表达融合蛋白的稳定细胞株。

将Protien A柱纯化后的融合蛋白纯化样品先进行生物素化：各洗脱峰取74μL样品液，每管分别加入10μL的10×Biotin Ligase Buffer A，10μL的10×Biotin LigaseBuffer B，6μL的Biotin Ligase(750U/μL)，共100μL。置于室温，反应过夜(16小时)，得到各洗脱峰生物素化后的样品。随后将各洗脱峰生物素化后的样品进行Western Blot实验鉴定(抗体为HRP标记的链霉亲和素1:1000)。结果如图12所示，纯化后的融合蛋白大小符合预期，9号细胞株为表达融合蛋白的稳定细胞株。

实施例4融合蛋白的功能

将实施例3中9号细胞株的细胞培养液上清纯化后获得的融合蛋白用于人外周血经体外分离获得的单个核细胞的连续培养，然后通过流式细胞术进行检测，结果显示，本申请的融合蛋白能够激活单个核细胞中的NKT细胞。NKT细胞被激活后，分泌了大量的IL-4、IFN-γ、GM-CSF、IL-13、肿瘤坏死因子-α等细胞因子，发挥免疫调节作用。因此，该实施例表明，本申请的融合蛋白具有刺激免疫细胞例如NKT细胞活化的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司

<120> 刺激免疫细胞活化的多肽、融合蛋白及其制备方法

<130> 16C11252CN

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 281

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Val Pro Gln Arg Leu Phe Pro Leu Arg Cys Leu Gln Ile Ser Ser Phe

1 5 10 15

Ala Asn Ser Ser Trp Thr Arg Thr Asp Gly Leu Ala Trp Leu Gly Glu

20 25 30

Leu Gln Thr His Ser Trp Ser Asn Asp Ser Asp Thr Val Arg Ser Leu

35 40 45

Lys Pro Trp Ser Gln Gly Thr Phe Ser Asp Gln Gln Trp Glu Thr Leu

50 55 60

Gln His Ile Phe Arg Val Tyr Arg Ser Ser Phe Thr Arg Asp Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Ala Lys Met Leu Arg Leu Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Gln Val

85 90 95

Ser Ala Gly Cys Glu Val His Pro Gly Asn Ala Ser Asn Asn Phe Phe

100 105 110

His Val Ala Phe Gln Gly Lys Asp Ile Leu Ser Phe Gln Gly Thr Ser

115 120 125

Trp Glu Pro Thr Gln Glu Ala Pro Leu Trp Val Asn Leu Ala Ile Gln

130 135 140

Val Leu Asn Gln Asp Lys Trp Thr Arg Glu Thr Val Gln Trp Leu Leu

145 150 155 160

Asn Gly Thr Cys Pro Gln Phe Val Ser Gly Leu Leu Glu Ser Gly Lys

165 170 175

Ser Glu Leu Lys Lys Gln Val Lys Pro Lys Ala Trp Leu Ser Arg Gly

180 185 190

Pro Ser Pro Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Val Cys His Val Ser Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Lys Pro Val Trp Val Lys Trp Met Arg Gly Glu Gln Glu

210 215 220

Gln Gln Gly Thr Gln Pro Gly Asp Ile Leu Pro Asn Ala Asp Glu Thr

225 230 235 240

Trp Tyr Leu Arg Ala Thr Leu Asp Val Val Ala Gly Glu Ala Ala Gly

245 250 255

Leu Ser Cys Arg Val Lys His Ser Ser Leu Glu Gly Gln Asp Ile Val

260 265 270

Leu Tyr Trp Gly Gly Ser Tyr Thr Ser

275 280

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

35 40 45

Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu

50 55 60

Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile

100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp

115

<210> 3

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Asp Pro Ser Ser Arg Val Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

1 5 10 15

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

20 25 30

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

35 40 45

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

50 55 60

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

65 70 75 80

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

85 90 95

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

100 105 110

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

115 120 125

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

130 135 140

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

165 170 175

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

180 185 190

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

195 200 205

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

210 215 220

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

1 5 10

<210> 5

<211> 682

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

35 40 45

Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu

50 55 60

Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile

100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Gln Arg Leu Phe Pro Leu Arg Cys

130 135 140

Leu Gln Ile Ser Ser Phe Ala Asn Ser Ser Trp Thr Arg Thr Asp Gly

145 150 155 160

Leu Ala Trp Leu Gly Glu Leu Gln Thr His Ser Trp Ser Asn Asp Ser

165 170 175

Asp Thr Val Arg Ser Leu Lys Pro Trp Ser Gln Gly Thr Phe Ser Asp

180 185 190

Gln Gln Trp Glu Thr Leu Gln His Ile Phe Arg Val Tyr Arg Ser Ser

195 200 205

Phe Thr Arg Asp Val Lys Glu Phe Ala Lys Met Leu Arg Leu Ser Tyr

210 215 220

Pro Leu Glu Leu Gln Val Ser Ala Gly Cys Glu Val His Pro Gly Asn

225 230 235 240

Ala Ser Asn Asn Phe Phe His Val Ala Phe Gln Gly Lys Asp Ile Leu

245 250 255

Ser Phe Gln Gly Thr Ser Trp Glu Pro Thr Gln Glu Ala Pro Leu Trp

260 265 270

Val Asn Leu Ala Ile Gln Val Leu Asn Gln Asp Lys Trp Thr Arg Glu

275 280 285

Thr Val Gln Trp Leu Leu Asn Gly Thr Cys Pro Gln Phe Val Ser Gly

290 295 300

Leu Leu Glu Ser Gly Lys Ser Glu Leu Lys Lys Gln Val Lys Pro Lys

305 310 315 320

Ala Trp Leu Ser Arg Gly Pro Ser Pro Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu

325 330 335

Val Cys His Val Ser Gly Phe Tyr Pro Lys Pro Val Trp Val Lys Trp

340 345 350

Met Arg Gly Glu Gln Glu Gln Gln Gly Thr Gln Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Pro Asn Ala Asp Glu Thr Trp Tyr Leu Arg Ala Thr Leu Asp Val Val

370 375 380

Ala Gly Glu Ala Ala Gly Leu Ser Cys Arg Val Lys His Ser Ser Leu

385 390 395 400

Glu Gly Gln Asp Ile Val Leu Tyr Trp Gly Gly Ser Tyr Thr Asp Pro

405 410 415

Ser Ser Arg Val Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

420 425 430

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

435 440 445

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

450 455 460

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

465 470 475 480

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

485 490 495

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

500 505 510

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

515 520 525

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

530 535 540

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

545 550 555 560

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

565 570 575

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

580 585 590

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

595 600 605

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

610 615 620

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

625 630 635 640

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly

645 650 655

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp

660 665 670

Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

675 680

<210> 6

<211> 843

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

gtcccgcaaa ggcttttccc cctccgctgc ctccagatct cgtccttcgc caatagcagc 60

tggacgcgca ccgacggctt ggcgtggctg ggggagctgc agacgcacag ctggagcaac 120

gactcggaca ccgtccgctc tctgaagcct tggtcccagg gcacgttcag cgaccagcag 180

tgggagacgc tgcagcatat atttcgggtt tatcgaagca gcttcaccag ggacgtgaag 240

gaattcgcca aaatgctacg cttatcctat cccttggagc tccaggtgtc cgctggctgt 300

gaggtgcacc ctgggaacgc ctcaaataac ttcttccatg tagcatttca aggaaaagat 360

atcctgagtt tccaaggaac ttcttgggag ccaacccaag aggccccact ttgggtaaac 420

ttggccattc aagtgctcaa ccaggacaag tggacgaggg aaacagtgca gtggctcctt 480

aatggcacct gcccccaatt tgtcagtggc ctccttgagt cagggaagtc ggaactgaag 540

aagcaagtga agcccaaggc ctggctgtcc cgtggcccca gtcctggccc tggccgtctg 600

ctgctggtgt gccatgtctc aggattctac ccaaagcctg tatgggtgaa gtggatgcgg 660

ggtgagcagg agcagcaggg cactcagcca ggggacatcc tgcccaatgc tgacgagaca 720

tggtatctcc gagcaaccct ggatgtggtg gctggggagg cagctggcct gtcctgtcgg 780

gtgaagcaca gcagtctaga gggccaggac atcgtcctct actggggtgg gagctacacc 840

tcc 843

<210> 7

<211> 2261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60

atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 120

aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 180

aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240

tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300

cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacggaggt 360

ggcggatctg gcggaggtgg ctcgggtggc ggcggatccg tcccgcaaag gcttttcccc 420

ctccgctgcc tccagatctc gtccttcgcc aatagcagct ggacgcgcac cgacggcttg 480

gcgtggctgg gggagctgca gacgcacagc tggagcaacg actcggacac cgtccgctct 540

ctgaagcctt ggtcccaggg cacgttcagc gaccagcagt gggagacgct gcagcatata 600

tttcgggttt atcgaagcag cttcaccagg gacgtgaagg aattcgccaa aatgctacgc 660

ttatcctatc ccttggagct ccaggtgtcc gctggctgtg aggtgcaccc tgggaacgcc 720

tcaaataact tcttccatgt agcatttcaa ggaaaagata tcctgagttt ccaaggaact 780

tcttgggagc caacccaaga ggccccactt tgggtaaact tggccattca agtgctcaac 840

caggacaagt ggacgaggga aacagtgcag tggctcctta atggcacctg cccccaattt 900

gtcagtggcc tccttgagtc agggaagtcg gaactgaaga agcaagtgaa gcccaaggcc 960

tggctgtccc gtggccccag tcctggccct ggccgtctgc tgctggtgtg ccatgtctca 1020

ggattctacc caaagcctgt atgggtgaag tggatgcggg gtgagcagga gcagcagggc 1080

actcagccag gggacatcct gcccaatgct gacgagacat ggtatctccg agcaaccctg 1140

gatgtggtgg ctggggaggc agctggcctg tcctgtcggg tgaagcacag cagtctagag 1200

ggccaggaca tcgtcctcta ctggggtggg agctacacct ccgatccatc ctctagagtc 1260

gacgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagg taagccagcc 1320

caggcctcgc cctccagctc aaggcgggac aggtgcccta gagtagcctg catccaggga 1380

caggccccag ccgggtgctg acacgtccac ctccatctct tcctcagcac ctgaactcct 1440

ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg 1500

gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt 1560

caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca 1620

gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa 1680

tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac 1740

catctccaaa gccaaaggtg ggacccgtgg ggtgcgaggg ccacatggac agaggccggc 1800

tcggcccacc ctctgccctg agagtgaccg ctgtaccaac ctctgtccct acagggcagc 1860

cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg 1920

tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga 1980

gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 2040

ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct 2100

tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc 2160

tgtctccggg taaaggtggt gggggttcgg gcggcggggg ctcgggagga gggggatcgg 2220

gcctcaacga catcttcgaa gcacaaaaaa tcgaatggca c 2261

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60

atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 120

aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 180

aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240

tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300

cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agac 354

<210> 10

<211> 932

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

gatccatcct ctagagtcga cgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 60

tgcccaggta agccagccca ggcctcgccc tccagctcaa ggcgggacag gtgccctaga 120

gtagcctgca tccagggaca ggccccagcc gggtgctgac acgtccacct ccatctcttc 180

ctcagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 240

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 300

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 360

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 420

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 480

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaaggtggg acccgtgggg tgcgagggcc 540

acatggacag aggccggctc ggcccaccct ctgccctgag agtgaccgct gtaccaacct 600

ctgtccctac agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 660

agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 720

tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 780

tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt 840

ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 900

cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 932

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcctcaacg acatcttcga agcacaaaaa atcgaatggc ac 42

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggaggtggcg gatctggcgg aggtggctcg ggtggcggcg gatcc 45

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggtggtgggg gttcgggcgg cgggggctcg ggaggagggg gatcg 45

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtctagaatg tctcgctccg tggccttagc tgtg 34

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctccgccaga tccgccacct ccgtctcgat cccacttaac tatc 44

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgggatccgc cgccacccga gccacctccg ccagatccgc cacctcc 47

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgggatccgt cccgcaaagg cttttcc 27

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggatggat cggaggtgta gctccc 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctacacctcc gatccatcct ctagagtc 28

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cccccaccac ctttacccgg agacagg 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccgggtaaag gtggtggggg ttcgggc 27

<210> 22

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggaagctttt agtgccattc gattttttgt gcttcgaaga tgtcgttgag gcccg 55

Claims

1.多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.融合蛋白，其包含权利要求1所述的多肽以及一个或多个融合伴侣；优选地，所述融合伴侣包含选自β2-微球蛋白、Fc区或其部分、免疫球蛋白重链恒定区、蛋白标签、神经酰胺样糖脂抗原中的一个或多个；任选地，所述融合蛋白还包含连接子，优选地，所述连接子包含甘氨酸/丝氨酸间隔子。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述融合伴侣包含β2-微球蛋白、和/或Fc区或其部分、和/或蛋白标签；

优选地，所述Fc区为IgG1Fc区，例如人IgG1Fc区，和/或所述蛋白标签为实现蛋白质生物素化的标签，例如BriA tag；

更优选地，所述β2-微球蛋白包含或由如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成，和/或所述Fc区或其部分包含或由如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成，和/或所述蛋白标签包含或由如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成。

4.如权利要求2或3所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或者为与SEQID NO：5所示的序列相差至少一个氨基酸的取代、缺失或添加且具有刺激免疫细胞活化功能的蛋白。

5.多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽；

优选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

更优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成。

6.核酸分子，编码权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白；

优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

更优选地，所述核酸分子由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成。

7.重组载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸或权利要求6所述的核酸分子。

8.宿主细胞，其包含权利要求1所述的多肽、权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的重组载体；

优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为CHO细胞、293T细胞、JY细胞、BM92细胞、WIN细胞、MOC细胞、MG细胞、NSO细胞、SP2细胞、BHK细胞、COS细胞、HepG2细胞、A549细胞、HELA细胞、CVI细胞、COS细胞、R1610细胞、BALBC/3T3细胞、HAK细胞、SP2/O细胞、P3x63-Ag3.653细胞、BFA-1c1BPT细胞或RAJI细胞；

更优选地，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。

9.权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白的制备方法，包括：

将权利要求6所述的核酸分子转入宿主细胞中，培养所述宿主细胞；以及收获所述融合蛋白；

优选地，所述制备方法还包括纯化所述融合蛋白。

10.权利要求1所述的多肽、权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的多核苷酸、或权利要求6所述的核酸分子在制备用于调节个体免疫反应、或在制备用于细胞免疫疗法的药物中的用途。