CN108997489B - 干扰素突变体及干扰素突变体融合抗体及其制备方法、应用 - Google Patents
干扰素突变体及干扰素突变体融合抗体及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种靶向人血管内皮生长因子（VEGFR2，亦称KDR）的抗体与一种干扰素α（IFNα）突变体的融合抗体anti‑VEGFR2‑IFNαmut、其制备方法及用途。本发明还公开了融合抗体anti‑VEGFR2‑IFNαmut的重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列。该融合抗体在体外可以抑制人静脉内皮细胞（HUVEC）及部分肿瘤细胞的增殖，且抑制程度高于野生型IFNα与anti‑VEGFR2的融合抗体anti‑VEGFR2‑IFNα。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与人VEGFR2特异结合的高亲和力全人源融合抗体。
背景技术
肿瘤细胞的发生发展离不开新生血管的营养供给，而新生血管的生长离不开各种细胞因子及其受体的相互作用。现有研究表明，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体(VEGF/VEGFR)信号通路对于新生血管的生成具有关键性的调节作用。VEGFR2作为VEGF的主要受体，调节血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和通透性的改变。
人血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2，也称为VEGFR2或KDR、Flk-1，本文称作“VEGFR2”)是230kDa的跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶超家族，是血管生长因子(VEGF)的主要功能受体，主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，VEGF刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成，主要通过结合和激活VEGFR2来实现，同时VEGFR2在一些肿瘤细胞表面也有表达。靶向VEGFR2药物主要有两类：一类是直接作用于受体细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要包括Sunitinib、Ceritinib等；另一类是阻断配体结合到受体胞外功能域的单克隆抗体(mAb)，包括雷莫卢单抗(Ramucirumab)等。
干扰素(interferon,IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，它具有广谱的抗病毒、抗肿瘤活性，同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，是目前主要的抗肿瘤生物制品之一。但是干扰素因半衰期短、系统性毒副作用强等缺点限制了其在临床上的应用。借助基因重组技术将干扰素与靶向VEGFR2的全长抗体偶联，既可以延长干扰素体内半衰期，同时可以借助抗体的靶向作用将干扰素富集于肿瘤及肿瘤新生血管部位，降低其系统毒副作用，令其更有效地发挥抗肿瘤及免疫调节作用。本发明已经基于该原理表达出这种具有抗血管生成活性和抗肿瘤活性的融合抗体anti-VEGFR2-IFNα。
发明内容
发明目的
本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人VEGFR2的融合抗体。本发明蛋白的特征为特异性结合人VEGFR2胞外区，偶联的IFNα突变体其抗病毒、抑增殖及免疫调节功能强于野生型IFNα，在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖及部分肿瘤细胞的增殖，且效果强于融合抗体anti-VEGFR2-IFNα。
技术方案
一种IFNα突变体蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ NO.1。
一种干扰素突变体融合抗体，其特征在于：所述的融合抗体由anti-VEGFR2
和权利要求1所述的IFNα突变体蛋白通过柔性肽连接形成。
所述的anti-VEGFR2的重链与IFNα突变体蛋白以柔性肽连接构成，所述的重链的氨基酸序列为SEQ NO.2；anti-VEGFR2的轻链的氨基酸序列为SEQ NO.3，所述柔性肽的氨基酸序列为SEQ NO.4。
一种核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求2或3的干扰素突变体融合抗体。
一种表达载体，含有权利要求4所述的核酸。
一种宿主细胞，含有权利要求5所述的表达载体。
所述的干扰素突变体融合抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
干扰素突变体融合抗体在制备选择性与VEGFR2结合，或抑制VEGFR2与VEGFR2配体的结合，或中和VEGFR2药物中的应用。
含有本发明血管内皮生长因子受体2融合抗体基因的表达载体和宿主细胞属于本发明的保护范围。扩增本发明融合抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗血管内皮生长因子受体2抗体的方法。
Western Blot鉴定分离纯化得到的anti-VEGFR2-IFNαmut；检测anti-VEGFR2-IFNαmut对人静脉内皮细胞HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用；流式细胞术检测anti-VEGFR2-IFNαmut诱导肿瘤细胞凋亡的能力；SPR技术检测anti-VEGFR2-IFNαmut与IFNAR1的亲和能力。
本发明得到的抗血管内皮生长因子受体2与人静脉内皮细胞HUVEC表面血管内皮生长因子受体2具有高特异性结合，体外抑制HUVEC及部分肿瘤细胞生长实验结果表明，本发明得到的融合抗体可以明显抑制HUVEC及部分肿瘤细胞的生长，且抑制效果强于anti-VEGFR2-IFNα。凋亡实验表明本发明得到的融合抗体能够诱导肿瘤细胞的凋亡，且诱导凋亡的能力强于anti-VEGFR2-IFNα；SPR结果表明其与IFNAR1的亲和常数高于anti-VEGFR2-IFNα。本发明为治疗和诊断以血管内皮生长因子受体2抗原的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。
有益效果
I型IFN主要包括IFNα和IFNβ，其中IFNα又有13亚型，IFNα2是唯一被用来在临床上治疗肿瘤的。各亚型之间的氨基酸有70-80％的相似性，且结构保守，均含有5个螺旋(Ahelix、B helix、C helix、D helix、E helix)，以及2个链间二硫键(C1-C99、C29-C139)，这5个螺旋由1个长loop和3个短loop连接。Phe36,Tyr122,and Tyr129这3个氨基酸残基对于IFN空间结构的维持起重要作用。其中B、C、D螺旋参与和IFNAR1的相互作用，而位于相反的一侧的，AB loop、A螺旋的末端、E螺旋则参与和IFNAR2的相互作用。无结构的C端尾部可以任意旋转，与IFNAR2的结合中起重要作用。IFN中参与与IFNAR2的结合位点有：Leu26，Phe27，Arg33，Asp35，Glu146和Arg149。因此如果对Leu26，Phe27，Arg33，Asp35，Glu146和Arg149这些结合位点进行相应突变，可能会使IFN与IFNAR2的亲和力发生改变，从而改变IFN的功能。本发明中首次对野生型IFNα在H57Y、E58N、Q61S三个氨基酸位点进行突变、可以提高其与IFNAR1的亲和力，同时对其在R144I、A145S、M149Y、E159K、S160R、R162K六个氨基酸位点进行突变，可以增强与IFNAR2的亲和力，这样使得到的融合抗体anti-VEGFR2-IFNαmut可以同时增强与2个受体的亲和力，从而使anti-VEGFR2-IFNαmut的抗肿瘤及抗病毒效果优于anti-VEGFR2-IFNα。
本发明所述的抗体以anti-VEGFR2抗体和野生型干扰素为基础，通过突变干扰素，提高其与干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力，从而发挥更好的抗肿瘤效果。该抗体不仅能抑制人血管内皮生长因子受体2的活化，从而抑制肿瘤新生血管的生成，而且通过靶向作用使IFN富集于肿瘤及肿瘤新生血管部位，且不产生毒副作用；更重要的是，通过对干扰素进行进一步突变，在保证其活性不发生改变的前提下，其与干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力大大提高，发挥更强的肿瘤杀伤作用和免疫调节作用，是一种具有抗血管生成活性和抗肿瘤活性的基因工程抗体。
附图说明
图1是anti-VEGFR2-IFNαmut结构示意图。
图2是anti-VEGFR2-IFNαmut-H chain质粒大量提取的核酸凝胶电泳图。Lane1、Lane2分别为anti-VEGFR2-IFNα-H chain和anti-VEGFR2-IFNαmut-H chain。
图3显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut分别通过ProteinA亲和层析柱进行分离纯化的结果。Lane1为anti-VEGFR2-IFNα，Lane2为anti-VEGFR2-IFNαmut。
图4展示利用Western Blot鉴定纯化后的anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut。其中图A、图B分别为用HRP偶联的羊抗人Fc段的抗体检测，得到的anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2。
图C、图D分别为用兔抗人κ链的抗体为一抗，HRP偶联的羊抗兔二抗得到的anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2。
图E、图F分别为用鼠抗人IFNα的抗体为一抗，HRP偶联的羊抗鼠二抗得到的anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2。
图5是一曲线图，描述anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut对HUVEC细胞的生长抑制作用。
图6是一曲线图，描述anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut对HCT-116和SW620这两种肿瘤细胞在常氧条件下的生长抑制作用。
图7是流式图，描述anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、IFNα诱导肿瘤细胞HCT-116和SW620凋亡的作用。
图8显示通过BIACORE X100仪器检测，得出的anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut与IFNAR1的亲和力常数。
图9是体内活性图，图A描述anti-VEGFR2-IFNα、anti-VEGFR2-IFNαmut、IFNα、IFNα+anti-VEGFR2在裸鼠皮下移植瘤模型中抑制肿瘤生长的肿瘤体积曲线图，图B描述不同给药组，肿瘤瘤子拍照图，图C描述不同给药组瘤重分析图。
具体实施方式
实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体
积百分比。
实施例1 anti-VEGFR2-IFNαmut的重组质粒的构建
根据已有的抗VEGFR2融合抗体anti-VEGFR2-IFNα(参照文献Li Z,Zhu Y,Li C,etal.Anti-VEGFR2-interferon-α2 regulates the tumor microenvironment andexhibits potent antitumor efficacy against colorectal cancer[J].Oncoimmunology,2017,6(3):e1290038.doi:10.1080/2162402X.2017.1290038.)制备构建anti-VEGFR2-IFNαmut的重组质粒；所述的anti-VEGFR2-IFNα为在抗体Fc段的C端通过G4S Linker偶联了IFNα的融合抗体，在其重链表达质粒中，表达IFNα部分的两端含有酶切位点BamHI和PmeI。基于此，我们先是通过对质粒的双酶切获得表达IFNα的序列，然后，以获得IFNα的为模板，设计突变引物，利用overlap PCR获得IFNαmut后，再以获得的IFNαmut为基础，通过设计2段长引物改变其C端的序列，得到进一步突变的IFNαmut。得到的再通过酶切替换掉anti-VEGFR2-IFNα表达载体中的野生型IFNα的序列，得到了表达载体anti-VEGFR2-IFNαmut-H chain。将得到的突变体表达载体以及共有的轻链L chain大量提取，准备转染CHO细胞。
具体步骤如下：
构建引物列表
mut-Fragment1的扩增
以IFNα2a的cDNA为模板，mut_F1、mut_R1为引物进行PCR扩增，得到产物mut-Fragment1。
PCR反应体系(20μL)：
PCR反应条件：
mut-Fragment2的扩增
由于此次突变的6个位点都集中在C端，故设计2条长引物：mut_Flong、mut_Rlong，使其互为模板，设计引物：mut_F2、mut_R2，得到片段mut-Fragment2。PCR反应体系(20μL)：
PCR反应条件：
IFNαmut的扩增
最后以已得到的mut-Fragment1、mut-Fragment2为模板，mut_F1、mut_R2为引物，得到突变体：IFNα-mut。
PCR反应体系(20μL)：
PCR反应条件：
实施例2 anti-VEGFR2-IFNαmut的表达、纯化及SDS鉴定
轻重链瞬时转染CHO细胞，通过加压筛选和两次有限稀释法挑选稳定高产的单克隆细胞株。将稳定高产细胞株扩大培养，收集上清，6000rpm，4℃离心30min后用0.22μm滤膜过滤，Protein A亲和层析柱纯化，洗脱液洗脱蛋白。纯化得到的anti-VEGFR2-IFNαmut与anti-VEGFR2-IFNα分别与非还原型SDS-PAGE上样缓冲液以4:1(20μl:5μl)的比例在Eppendorf管中混合，100℃水浴放置5min后3000rpm离心5min，蛋白样品制备好后待用。配置10％的SDS-PAGE胶，进行电泳，80mA恒流30min、120min恒流30min后停止电泳。卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2h；加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上,每20min更换一次脱色液(10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸馏水)至完全脱净。凝胶成像仪(Tanon 1600B)拍照。
实施例3 anti-VEGFR2-IFNαmut的Western Blot鉴定
纯化得到的anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2-IFNα进行SDS-PAGE电泳，80V恒压30min、120V恒压30min、转印2h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5％MTBS(含有5％脱脂牛奶的TBS)中室温封闭2h；用5％MTBS按1：2000稀释一抗(A&B图为HRP偶联的羊抗人Fc段的抗体，无二抗；C&D图为兔抗人κ链的抗体；E&F图为鼠抗人IFNα的抗体)(购自abcam)，室温孵育1.5h，TBST洗涤三遍，TBS洗涤3遍，每次10min；用5％MTBS按1：5000稀释二抗(C&D图为HRP偶联的羊抗兔的二抗；E&F图为羊抗鼠的二抗)(购自联科生物)，室温孵育1.5h，TBST洗涤三遍，TBS洗涤3遍，每次10min；用DAB显色。
实施例4 anti-VEGFR2-IFNαmut对HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用
将细胞制备成3×104cells/ml细胞悬液,接种96孔细胞培养板，100μl/孔，在37℃5％CO2培养箱中培养24h。共一个对照组和两个实验组。用2％胎牛血清培养基配制药物,共有anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2-IFNα两组，每组设置0.01nM,0.1nM,1nM,10nM,50nM,100nM,200nM共7个浓度。将培养的细胞弃去上清，按照分组加入药物，每孔100μl,每组药物每个浓度设置三个平行孔，继续培养72h，每孔加入11μl的MTT，37℃继续培养4h，小心倾去上清，每孔加入150μl DMSO，在酶标仪570nm/630nm波长处测定光吸收值(OD值)，计算药物对细胞增殖的抑制率。anti-VEGFR2-IFNαmut、anti-VEGFR2-IFNα的生物活性由细胞生长的抑制率评价。抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。
实施例5 anti-VEGFR2-IFNαmut诱导肿瘤细胞的凋亡
将HCT-116，SW620，分别计数后铺于六孔板内，每孔中约4-5×105个细胞。在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜至细胞完全贴壁。弃原培养基，每孔补加2mL新鲜培养基。设置Control/anti-VEGFR2-IFNα/anti-VEGFR2-IFNαmut/IFNα组，在对应孔中加入PBS/100nManti-VEGFR2-IFNα/100nM anti-VEGFR2-IFNαmut/200nM IFNα溶液。在37℃、5％CO2培养箱中培养48h。用不含EDTA的胰酶消化肿瘤细胞4-5min后收集细胞至1.5mL Ep管内，4℃下1500rpm离心5min。用100μL 1×Binding Buffer重悬肿瘤细胞，每管中先后加入5μLAnnexin V和PI，混匀后室温避光反应10min。加入400μL 1×Binding Buffer并混匀，流式细胞仪检测。
实施例6 anti-VEGFR2-IFNαmut与IFNAR1的亲和力测定
Anti-Human IgG(Fc)antibody由Human Antibody捕捉试剂盒固定于CM5芯片上。CM5芯片捕获野生型IFNα天然受体IFNAR1，目标响应值(RU)A高于2000。野生型IFNα的受体蛋白IFNAR1由pH7.4的HBS-EP流动相缓冲液稀释为不同浓度梯度，于25℃,30μL/min的恒定流速让融合蛋白捕捉IFNAR1蛋白。未捕捉IFNAR1的一号通道芯片作为参考基线。再生缓冲液(3M MgCl2)以30μL/min的恒定流速将芯片捕获的融合蛋白洗脱下来，时间30s。用Biacore X100自带软件将得到的传感图进行分析，得到结合常数(ka)和解离常数(kd)，经计算得到平衡解离常数KD(kd/ka)。
实施例7 anti-VEGFR2-IFNαmut体内抑制肿瘤细胞的生长
在多个T75中培养HCT-116，隔天换液。保证细胞贴壁生长，显微镜下呈石斑状，边缘清晰且透亮。细胞计数并制备成单细胞悬液，植瘤约需肿瘤细胞2.5×108个。待细胞密度长至70-80％处于对数生长期且状态良好时，用PBS润洗并用胰酶消化。血球计数板计数细胞后，用0.9％生理盐水重悬细胞，使其浓度为108细胞/mL。混匀后将细胞悬液置于4℃。植瘤，共需5周龄的健康雌性裸鼠25只，植瘤部位为小鼠右侧腋下。每只小鼠注射100μL单细胞混悬液(即107个肿瘤细胞)。随机将小鼠分为5组，每组各5只。组别设置为：control组，anti-VEGFR2-IFNα组，anti-VEGFR2-IFNαmut组，IFNα组和IFNα+anti-VEGFR2联合给药组。
植瘤后第二天开始给药，给药方式为尾静脉注射，每次每只注射100μL，每周注射两次，剂量如下表所示。其中一次混合新鲜PBMC，剂量为每只小鼠每次5×106个PBMC。
测量瘤体积，植瘤后每天观察肿瘤生长情况。第15天各组均有较明显且便于测量的瘤块，从这一天开始测量小鼠瘤体积，每三天测一次并记录数据。瘤体积的计算方法为V＝(L×W2)/2，其中L代表瘤块最长径，W代表垂直于L方向的最长径。根据瘤体积绘制曲线图。当有小鼠的肿瘤体积超过1500mm3时，用颈椎脱臼法将小鼠全部处死，剥出瘤子进行称重并拍照。如图9A所示，control组小鼠肿瘤体积始终保持最大，至36天时，瘤体积平均值接近1000mm3；anti-VEGFR2-IFNαmut组药效最优，小鼠肿瘤体积始终保持最小且增长缓慢，至36天时，瘤体积平均值小于200mm3；IFNα和IFNα+anti-VEGFR2联合给药组药效相近，但均略逊于anti-VEGFR2-IFNα组。经计算，anti-VEGFR2-IFNαmut组的抑瘤率均为70％以上，其中最大抑瘤率为84.36％；另三个给药组的抑瘤率均低于60％。图9B为各组裸鼠处死后剥下的肿瘤图，各组5个肿瘤组织。Control组肿瘤体积最大，IFNα与IFNα+anti-VEGFR2组肿瘤体积接近，anti-VEGFR2-IFNαmut组肿瘤体积最小。图9C为各组瘤子剥下后进行称重的数量统计图，由图可看出，Control组肿瘤重量最大，IFNα与IFNα+anti-VEGFR2组肿瘤重量接近，且重量重于anti-VEGFR2-IFNα组，而anti-VEGFR2-IFNαmut组肿瘤重量最小。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 干扰素突变体及干扰素突变体融合抗体及其制备方法、应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
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115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Tyr Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg
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Leu Lys Ser Lys Glu
165
<210> 2
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Pro Pro Ser Trp Asn Ser Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Ala Val Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gly Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gly Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 3
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Pro Pro Ser Trp Asn Ser Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Leu Gln Ser Val Leu
20 25 30
Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
35 40 45
Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn
65 70 75 80
Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser
85 90 95
Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu
100 105 110
Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Ala Ser Val
115 120 125
Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
130 135 140
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
165 170 175
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
180 185 190
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
195 200 205
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
210 215 220
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
225 230 235 240
Thr Glu Cys Ser Ala Ala
245
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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ggatcctgtg atctgcctca 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
gctctagatc attccttact tttc 24
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
ccttgtgcct gggaggttgt cctgtcggaa atctacagat ctttttcttt gtcaacaaa 59
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<212> DNA
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<400> 8
ggtttaaacg ggccctctag atcattcctt act 33
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<211> 20
<212> DNA
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ccttgtgcct gggaggttgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
ggtttaaacg ggccctctag atcattcctt act 33
Claims (8)
1.一种IFNα突变体蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ NO.1。
2.一种干扰素突变体融合抗体，其特征在于：所述的融合抗体由anti-VEGFR2和权利要求1所述的IFNα突变体蛋白通过柔性肽连接形成。
3.根据权利要求2所述的一种干扰素突变体融合抗体，其特征在于：所述的anti-VEGFR2的重链与IFNα突变体蛋白以柔性肽连接构成，所述的重链的氨基酸序列为SEQNO.2；anti-VEGFR2的轻链的氨基酸序列为SEQ NO.3，所述柔性肽的氨基酸序列为SEQNO.4。
4.一种核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求2或3的干扰素突变体融合抗体。
5.一种表达载体，含有权利要求4所述的核酸。
6.一种宿主细胞，含有权利要求5所述的表达载体。
7.权利要求2或3所述的干扰素突变体融合抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤为血管内皮生长因子受体2抗原的阳性表达的肿瘤。
8.根据权利要求7所述的干扰素突变体融合抗体在制备选择性与VEGFR2结合，或抑制VEGFR2与VEGFR2配体的结合，或中和VEGFR2药物中的应用。
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