JP2013538051A - Dccの第5フィブロネクチンタイプiiiドメインの組換えfc融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、DCC融合タンパク質、DCC融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにそれらの生産方法、及び結腸直腸癌、NSCLC及び転移性乳癌等の癌の治療におけるそれらの使用に関する。また本発明は、DCC融合タンパク質を投与することにより、結腸直腸癌、NSCLC及び転移性乳癌等の癌を治療する方法に関する。
Description
本発明は、Deleted in Colorectal Cancer(DCC)の第5フィブロネクチンドメイン(5-フィブロネクチンドメイン)と抗体Fc部分を含むDCC融合タンパク質、これをコードする核酸分子及びその生産と癌治療のための使用に関する。
ネトリン-1はネトリンファミリーのメンバーであり、誘引及び反発の双方の形で、軸索ナビゲーションキューを示し、神経系の発達に主要な役割を担っている(Serafini, 1996, Cell 87: 1001-1014)。ネトリン-1に対する主要レセプターはDCC(Deleted in Colorectal Cancer)及びUNC5H(UNC5H1、UNC5H2、UNC5H3)であり、これらは全ていわゆる依存性受容体ファミリーに属している(Keino-Masu, 1996, Cell 87: 175-185;Ackermann, 1997, Nature 386: 838-842;Hong, 1999, Cell 97: 927-941;Mehlen, 1998, Nature 395: 801-804)。依存性受容体は、それらの各リガンドの非存在下でアポトーシスを誘導する能力を共有しており、よって、この能力は各リガンドの結合の際にブロックされる(Mehlen, 2004, Cell Mol Life Sci 61: 1854-1866;Bredesen, 2005, Cell Death Differ 12: 1031-1043)。
ヒトの様々な癌において、DCCの発現の低減又は損失、よってDCC誘導性アポトーシスの低減又は損失が観察されている(Kinzler, 1996, Proc Natl Acad Sci 100: 4173-4178)。さらに、UNC5H遺伝子がほとんどの結腸直腸腫瘍においてダウンレギュレーションしていることも観察されており、これは、依存性受容体UNC5Hの損失が腫瘍細胞の選択的利点であることを示している(Bernet, 2007, Gastroenterology 133: 1840-1848; Shin, 2007, Gastroenterology 133: 1849-1857)。しかしながら、依存性受容体DCC及びUNC5Hのダウンレギュレーションが、様々な腫瘍細胞の生存率を高めるばかりでなく、それらのリガンドであるネトリン-1の自己分泌発現もまた観察されている。特に、大半の乳腺腫瘍、すなわち転移性乳癌はネトリン-1の増加した発現を示すことが示されている(Fitamant, 2008, Proc Natl Acad Sci 105: 4850-4855)。今日まで、DCCの細胞外部分のどのサブドメインがネトリン-1の結合の原因であるか、未だ明らかではない。第5フィブロネクチンタイプIIIドメイン(Geisbrecht, 2003, J Biol Chem 278: 32561-32568)及び第4フィブロネクチンタイプIIIドメイン(Kruger, 2004, J Neurosci 24: 10826-10834)の2つのサブドメインがこの文脈で検討されている。
過去に示されているように、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとのDCC-5-フィブロネクチン融合タンパク質(ネトリン-1デコイタンパク質として作用;ここではDCC-5Fbn-GSTとも称す)によるネトリン-1の中和が、依存性受容体DCC及びUNC5Hを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しうる(欧州特許出願公開第1989546号)。FLAGタグ化DCC-5-フィブロネクチン融合タンパク質(DCC-5Fbn-GST)は、大腸菌中で組換え的に調製することができ、2週の期間にわたって肺への乳癌細胞の転移を低減することができる(Fitamant, 前掲)。さらに、DCC-5Fbn-GSTは、高レベルのネトリン-1を発現する非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株の細胞死率を増加させることが証明されている(Delloye-Bourgeois, 2009, J Natl Cancer Inst 101: 237-247)。
しかしながら、DCC-5Fbn-GSTは、今もなお、いくつかの弱点を有しており、効果的であるためには、腫瘍内注射されなければならない。これは、おそらく、短い血漿半減期や速い分泌のような不利な薬理学的特性のためである。従って、依存性受容体誘導性アポトーシスの低減又は損失に関連した癌性疾患を治療するのに適したより効果的な化合物が必要とされている。
この技術的課題は、ここで提供される実施態様及び特許請求の範囲に提供される解決手段により解決される。
この技術的課題は、ここで提供される実施態様及び特許請求の範囲に提供される解決手段により解決される。
本発明は、Deleted in Colorectal Cancer(DCC)の第5フィブロネクチンドメイン(5-フィブロネクチンドメイン;Fn5)と抗体Fc部分、特にヒトIgG1のFcとを含むDCC融合タンパク質(ここではFn5-Fc融合タンパク質とも命名される)に関する。本発明で意外にも見出されたことは、DCCの第5フィブロネクチンタイプIIIドメインへのヒトIgG1分子のFc部のC末端融合により、従来技術のDCC融合タンパク質と比較して、DCC融合タンパク質の薬理学的特性の改善が得られることである。特に、ここで提供されるDCC融合タンパク質は、DCC-5Fbn-GSTタンパク質と比較して、ネトリン-1に対して増加した親和性を示す。
さらに、ここで詳述され、例証されるように、本発明のDCC融合タンパク質は、一過性発現でHEK293細胞中において高効率で生産され得る(>80mg/l)。さらに、本発明のDCC融合タンパク質はDCCの第5フィブロネクチンタイプIIIドメインの適切な折り畳みを可能にし、これが、DCC-5Fbnと比較して、ネトリン-1に対するDCC融合タンパク質の良好な結合を生じせしめる(本発明のDCC融合タンパク質のKDは、DCC-5Fbn-GST融合タンパク質よりも2倍以上低い、Keino-Masu, 1996, Cell 87(2):175-85を参照)。
一般的に、本発明で提供されるDCC融合タンパク質は、DCCの第5フィブロネクチンドメイン(5-フィブロネクチンドメイン又はFn5-ドメインとも称される)とヒトIgG1のFc部を含む結合分子である。特に、本発明は配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。配列番号2のアミノ酸1から19はシグナルペプチド配列を示す。配列番号2並びに配列番号3のアミノ酸20から353は成熟DCC融合タンパク質を示す。従って、本発明は配列番号3のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質(Fn5変異体1とも称される)に関する。配列番号2のアミノ酸20及び21、並びに配列番号3のアミノ酸1及び2は、Fn-5ドメインの隣接天然アミノ酸を表す。配列番号2のアミノ酸22から118並びに配列番号3のアミノ酸3から99は、DCCの第5フィブロネクチンドメイン(5-フィブロネクチンドメイン又はFn5-ドメイン)を表す。配列番号2のアミノ酸119から122、並びに配列番号3のアミノ酸100から103は、Fn-5ドメインの隣接天然アミノ酸を表す。配列番号2のアミノ酸123から252、並びに配列番号3のアミノ酸104から233は、ヒトIgG1のFc部分を表す。
ここに記載され、例証されるように、本発明のDCC融合タンパク質はネトリン-1に対して高い結合親和性を有する。従って、本発明のDCC融合タンパク質は、ネトリン-1に結合するデコイ分子として作用することができ、よって、ネトリン-1及びネトリン-1受容体、例えばDCC及びUNC5H(UNC5H1、UNC5H2、UNC5H3)の相互作用を阻害することができる。よって、本発明は、医薬として使用されるための、ここで提供されるDCC融合タンパク質に関する。特に、本発明は、癌の治療に使用されるための、ここで提供されるDCC融合タンパク質に関する。好ましくは、治療される癌は、癌細胞が表面上に依存性受容体DCC及び/又はUNC5Hを発現し、又はDCC(Deleted in Colorectal Carcinoma)遺伝子発現(DCCタンパク質コードするhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geneからの遺伝子ID1630(2010年8月10日にアップデート)(UniProt ID/バージョン:P43146(2010年5月18日の配列バージョン2、2010年8月10日のファイルバージョン109)))及び/又はUNC5H1(UNC5A)遺伝子発現(遺伝子ID90249(2010年6月26日にアップデート))、及び/又はUNC5H2(UNC5B)遺伝子発現(遺伝子ID219699(2010年7月2日にアップデート))、及び/又はUNC5H3(UNC5C)遺伝子発現(遺伝子ID8633(2010年8月7日にアップデート))、及び/又はUNC5H4(UNC5D)遺伝子発現(遺伝子ID137970(2010年7月2日にアップデート))で、UNC-5ホモログタンパク質をコードするhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geneからのもの(UniProt ID/バージョン:Q6ZN44(エントリーバージョン74、配列バージョン3)、O08722(エントリーバージョン75、配列バージョン1)、O08747(エントリーバージョン79、配列バージョン1)、及びQ6UXZ4(エントリーバージョン69、配列バージョン1)の有意なアップレギュレーションを示すことを特徴とする。与えられた細胞が依存性受容体DCC及び/又はUNC5Hを表面に発現するかどうかを決定する方法は、当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、IHC(免疫組織化学)又はFACS(蛍光標示式細胞分取)、定量的PCR(例えば、六量体初回刺激cDNAを用いる)、又は別法として発色性染料ベースのタンパク質検出技術(例えば、銀又はクーマシーブルー染色)と対のウエスタンブロット又は溶液及びゲル、ブロット及びマイクロアレにおけるタンパク質のための蛍光及び発光ベースの検出方法、例えば免疫染色、並びに免疫沈降、ELISA、マイクロアレイ、及び質量分析を含む。本発明の文脈において、本発明のDCC融合タンパク質により治療される癌の例は、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病で、上述の癌の任意の難治性型、又は上述の癌の一又は複数の組合せである。本発明のDCC融合タンパク質により治療される癌の特定の例は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及び転移性乳癌である。
従って、本発明は、癌を治療するために使用される配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、癌を治療するために使用される配列番号3のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、結腸直腸癌を治療するために使用される配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、NSCLCを治療するために使用される配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、転移性乳癌を治療するために使用される配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、結腸直腸癌を治療するために使用される配列番号3のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、NSCLCを治療するために使用される配列番号3のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。本発明は、転移性乳癌を治療するために使用される配列番号3のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質に関する。
本発明は、ここに記載され提供されるDCC融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。従って、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子に関する。また本発明は、配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸分子に関する。特に、本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子に関する。配列番号1のヌクレオチド16から1074は、配列番号2のアミノ酸配列をコードするORFを表す。従って、本発明は、配列番号1のヌクレオチド16から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子に関する。配列番号1のヌクレオチド73から1074は、配列番号3のアミノ酸配列をコードするORFを表す。従って、本発明は、配列番号1のヌクレオチド73から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子に関する。
本発明の核酸分子は、DNA分子又はRNA分子でありうる。またそれらは核酸アナログ、例えばチオリン酸オリゴヌクレオチド、置換リボ−オリゴヌクレオチド、LNA分子、PNA分子、GNA(グリコール核酸)分子、TNA(トレオース核酸)分子、モルホリノポリヌクレオチド、又はアンタゴmir(コレステロールコンジュゲート)核酸分子、又は当該技術分野で知られているそれらの任意の修飾体(例えば、修飾体の例については、米国特許第5525711号、米国特許第4711955号、米国特許第5792608号、又は欧州特許出願公開第302175号を参照)。本発明の核酸分子は、天然に生じる核酸残基、又は人工的に生産される核酸残基でありうる。核酸残基の例は、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U)、キサンチン(X)、及びヒポキサンチン(HX)である。本発明の文脈において、チミン(T)及びウラシル(U)は、核酸分子のそれぞれのタイプに応じて交換可能に使用されうる。例えば、当業者がよく知っているように、DNAの一部としてのチミン(T)は、対応する転写されたmRNAの一部としてのウラシル(U)に対応する。本発明の核酸分子は一本鎖又は二本鎖、直鎖状又は環状、天然又は合成であり得、他の定義がなされない場合は、何ら大きさの制限はない。また核酸分子は、以下にさらに詳述するようにプロモーターを含みうる。プロモーターは相同性又は異種性でありうる。特定の実施態様では、ここに提供される核酸分子は、このプロモーターのコントロール下にある。
一般的に、ここで使用される場合、ここに提供される配列の核酸配列を含むポリヌクレオチドはまた前記核酸配列からなるポリヌクレオチドでありうる。
さらに、本発明によれば、本発明の核酸分子はベクター中にクローニングされうる。ここで使用される「ベクター」なる用語は、特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝操作で一般的に使用されている他のベクターを意味する。好ましい実施態様では、これらのベクターは、細胞、真菌細胞等の真核細胞、微生物の細胞、例えば酵母又は原核細胞の形質転換に適している。特に好ましい実施態様では、このようなベクターは、例えば本発明の核酸分子を転写するための、細菌細胞の安定した形質転換に適している。例えば、ベクターは、図2に示され、ここの実施例1に記載されたpUC18又は7800でありうる。よって、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、例えばpUC18又は7800に関する。よって、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクター、例えばpUC18又は7800に関する。また本発明は、配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクター、例えばpUC18又は7800に関する。特に、本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むベクター、例えばpUC18又は7800に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド16から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むベクター、例えばpUC18又は7800に関する。さらに本発明は、配列番号1のヌクレオチド73から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むベクター、例えばpUC18又は7800に関する。一般的に、ベクターは真核宿主細胞において前記核酸分子を発現可能でありうる。
従って、本発明の一態様では、提供されるベクターは発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは文献に広く記載されている。通例、それらは、選択される宿主において複製を可能にする複製起源と選択マーカー遺伝子ばかりでなく、プロモーター、大抵の場合では、転写のための終止シグナルを含む。プロモーターと終止シグナルの間には、好ましくは、発現が所望される核酸配列/分子の挿入を可能にする少なくとも一つの制限部位又はポリリンカーが存在する。
ここで提供されるベクターが、本発明の文脈において用いられるのに適し、例えばここに記載のDCC融合タンパク質の発現に適したプロモーターを既に含む、従来から知られている発現ベクターを利用することにより産生される場合、核酸分子は、得られるベクターが、この発明の文脈で用いられるのに適した一つのプロモーターのみを好ましくは含むようにそのベクター中に挿入される。プロモーターは、一般的には異種性又は相同性でありうる。また、ここに記載のベクターは、一を越えるプロモーターを含んでいてもよく、各それぞれのプロモーターは異種性又は相同性であってもよい。当業者には、このような挿入を如何にして実施できるかは分かる。例えば、プロモーターは、核酸コンストラクトから又はライゲーションの前に発現ベクターから切除されうる。
本発明に係るタンパク質は、好ましくは組換え手段により生産される。好ましくは、タンパク質発現は真核細胞においてなされ、ポリペプチドの続く単離と通常は薬理学的に許容可能な純度までの精製を伴う。タンパク質発現では、そのタンパク質をコードする核酸は、標準的な方法で発現ベクターに挿入される。発現は、適切な安定した真核宿主細胞、例えばCHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞等において実施され、タンパク質は細胞(溶解後の細胞又は上清)から回収される。
さらなる実施態様では、本発明の核酸分子及び/又はここに記載のポリヌクレオチドがクローン化されるベクターは、宿主細胞中に形質導入、形質転換又は形質移入され、又は他の導入がなされうる。例えば、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞、好ましくは真核細胞である。非限定的な例としては、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ここに記載の宿主細胞は、本発明において記載され提供されるDCC融合タンパク質を産生せしめるために特に有用であるものである。
一般的に、上に記載した宿主細胞は、本発明で提供される核酸分子(例えば、配列番号1の配列、配列番号1のヌクレオチド16から1074又は配列番号1のヌクレオチド73から1074を含むか又は該配列からなる)、又はここに記載のベクターを含んでなる原核又は真核細胞、好ましくは真核細胞、又はそのような細胞から誘導され、ここに記載の核酸分子又はベクターを含む細胞でありうる。好ましい実施態様では、宿主細胞は、ゲノムに組み込まれて本発明の核酸分子を含むように、本発明の核酸分子又はここに記載のベクターを含み、つまりこれらを用いて遺伝的に修飾される。例えば、ここに記載のそのような宿主細胞は、ヒト、酵母、又は真菌細胞でありうる。特定の一態様では、宿主細胞は、本発明の核酸分子を転写可能である。ここに記載の宿主細胞を産生せしめるために使用される異なった対応する発現系の例の概説は、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-516, Bitter (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)、Sawers (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、及びGriffiths (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれる。本発明の核酸分子又はここに記載のベクターを用いた宿主細胞の形質転換又は遺伝子操作は、例えばSambrook 及び Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA;Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されているように、標準的な方法により実施されうる。本発明の一態様では、ここで提供される核酸分子又はここに記載のベクターを含む宿主細胞は、HEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞(ヒト胚性腎臓細胞株293、Invitrogen)でありうる。従って、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド16から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド73から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。
本発明は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むここに記載され提供されるpUC18又は7800等のベクターを含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むここに記載され提供されるpUC18又は7800等のベクターを含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるここに記載され提供されるpUC18又は7800等のベクターを含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド16から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むここに記載され提供されるpUC18又は7800等のベクターを含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。また本発明は、配列番号1のヌクレオチド73から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むここに記載され提供されるpUC18又は7800等のベクターを含んでなるHEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞に関する。
本発明は、ここに記載された宿主細胞においてここに記載され提供された核酸分子を発現させ、前記細胞又は細胞培養上清からDCC融合タンパク質を回収する工程を含む、ここに記載され提供されたDCC融合タンパク質を生産する方法に関する。従って、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質を生産する方法であって、宿主細胞(例えば、HEK293細胞又はHEK293-Freestyle細胞)において配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現させ、前記細胞又は細胞上清からDCC融合タンパク質を回収する工程を含む方法に関する。従って、本発明は、配列番号3のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質を生産する方法であって、宿主細胞(例えば、HEK293細胞又はHEK293−Freestyle細胞)において配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現させ、前記細胞又は細胞上清からDCC融合タンパク質を回収する工程を含む方法に関する。本発明は、ここに記載され提供される方法により得られたか又は得ることができるDCC融合タンパク質に関する。
本発明は、ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び/又はここに記載の宿主細胞を含む組成物に関する。ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び/又はここに記載の宿主細胞を含む組成物は、薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤をさらに含みうる。従って、本発明は、場合によっては薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤と共に、医薬として使用されるための、ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び/又はここに記載の宿主細胞に関する。従って、本発明は、ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び/又はここに記載の宿主細胞を含有し、場合によっては、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤をさらに含む薬学的組成物に関する。一般的に、適切な薬学的担体の例は当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝食塩水、水、エマルション、例えば油/水エマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等を含む。このような担体を含有する薬学的組成物は、よく知られている一般的な方法により処方することができる。これらの薬学的組成物は、被験者に適切な用量、すなわち癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌が治療される被験者の体重当たり、少なくとも1mg/kg体重、例えば約10mg/kg体重から約100mg/kg体重、投与することができる。組成物の投与は、様々な方法、例えば経腸的、経口的(例えば、丸薬、錠剤、頬用、舌下用で、崩壊可能なカプセル、薄膜、液体溶液又は懸濁剤、粉剤、固形結晶又は液体)、直腸的(例えば、座薬、浣腸)、注射を介して(例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は経皮的)、吸入を介して(例えば、気管支的)、局所的、経膣的、皮膚的、経鼻的になされ又は投与されうる。投薬レジメンは主治医及び臨床要因により決定されるであろう。医療分野でよく知られているように、任意の一患者への投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時投与される他の薬剤に依存する。ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター及び/又は宿主細胞と、場合によってはここに記載の薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有する組成物及び薬学的組成物は、局所的又は全身的に投与されうる。投与は、好ましくは静脈内又は皮下的になされる。組成物及び薬学的組成物は、また、例えば内部又は外部の標的部位への微粒子銃での送達により、又は動脈内の部位へのカテーテルにより、標的部位に直接投与されうる。非経口投与のための調製物は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性/水性溶液、エマルション又は懸濁液、例えば生理食塩水及び緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油を含む。静脈内用ビヒクルは、流体及び栄養補液、電解質補充液(例えば、リンゲルデキストロースをベースとするもの)等を含む。保存料及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等が存在していてもよい。さらに、特に上述の要因を考慮して、上述した例示的範囲より下又は上の用量も考えられる。
既に記載したように、ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び/又はここに記載の宿主細胞を含んでなるここに記載の組成物は、被験者の癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌を治療するために使用できる。従って、本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用されるここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び/又はここに記載の宿主細胞を含む薬学的組成物に関する。既に記載したように、薬学的組成物は、上述したような薬理学的に許容可能な担体、賦形剤、及び/又は希釈剤をさらに含有しうる。よって本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤とを含有してなる薬学的組成物に関する。よって本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号3のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるDCC融合タンパク質と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号1のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号1のヌクレオチド16から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号1のヌクレオチド73から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含んでなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号1のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなる上述したベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号1のヌクレオチド16から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなる上述したベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号1のヌクレオチド73から1074のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなる上述したベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌の治療に使用される、ここで提供され記載される核酸分子又はベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。
本発明は、癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌を治療する医薬を製造するための、ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター又は宿主細胞の使用に関する。また本発明は、ここで提供されるDCC融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター又は宿主細胞を、それを必要とする被験者に投与することによる、被験者の癌、特に結腸直腸癌、NSCLC又は転移性乳癌を治療する方法に関する。
一般的に、上述したように被験者に投与されるここに記載され提供される化合物及び組成物の投薬量は、ここで特定され記載されるそれぞれのまた全ての薬剤実施態様及び使用に対して選択されうる。
一般的に、本発明において治療される被験者は哺乳動物であり得、好ましくはヒトである。
実施例1:Fn5-Fc融合タンパク質
プラスミド構築
Sambrook, J.等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているような標準的な方法を使用し、DNAを操作した。製造者の使用説明書に従って分子生物学的試薬を使用した。所望の遺伝子セグメントを遺伝子合成により調製した。合成された遺伝子断片を特定の発現ベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定により確認した。
プラスミド構築
Sambrook, J.等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているような標準的な方法を使用し、DNAを操作した。製造者の使用説明書に従って分子生物学的試薬を使用した。所望の遺伝子セグメントを遺伝子合成により調製した。合成された遺伝子断片を特定の発現ベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定により確認した。
発現プラスミド7800
ベクター7800は、例えば人工IgFc融合タンパク質の一過性発現用の発現プラスミドであり、ここで、ヒトDCC(Deleted in Colorectal Cancer)受容体の第5細胞外フィブロネクチンタイプIIIドメインは、何らの修飾又は人工的リンカー配列を導入することなく、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域(Fc定常領域;ヒンジ-CH2-CH3)に融合される;図2参照。
ベクター7800は、例えば人工IgFc融合タンパク質の一過性発現用の発現プラスミドであり、ここで、ヒトDCC(Deleted in Colorectal Cancer)受容体の第5細胞外フィブロネクチンタイプIIIドメインは、何らの修飾又は人工的リンカー配列を導入することなく、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域(Fc定常領域;ヒンジ-CH2-CH3)に融合される;図2参照。
1084bpsのDNAセグメント(配列番号1)を、化学的遺伝子合成及び所望するDCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)(配列番号2)のオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするPCR技術により調製した。DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)は、マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(配列番号2のアミノ酸1から19)、ヒトDCC受容体第5細胞外フィブロネクチンタイプIIIドメイン(配列番号2のアミノ酸22から118;DCC(Deleted in Colorectal Carcinoma)のアミノ酸843から939:UniProt ID:P43146(配列バージョン2)、Fn5ドメインのC末端(配列番号2のアミノ酸119から122)及びN末端(配列番号2のアミノ酸20から21)に第5フィブロネクチンタイプIIIドメイン(Fn5ドメイン)の隣接天然アミノ酸、及びヒトIgG1抗体Fc定常領域(配列番号2のアミノ酸123から353)からなる。Fn5-Fc発現カセットを容易に組み立てるために、化学的に調製されたDNAセグメントは、それぞれ5'及び3'末端での独特のHindIII及びNheI制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接している。Fn5-Fc構造遺伝子(ORF;配列番号1のヌクレオチド16から1074)を、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)及びウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化部位からの最初期エンハンサー及びプロモーターにつなげた。
DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)のための発現カセットの他に、プラスミドは、
− 大腸菌中でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、及び
− 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
− 大腸菌中でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、及び
− 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
TDCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)のコード化配列(例えば、配列番号1)の転写ユニットは、以下のエレメントを含む:
− ヒトサイトメガロウイルスからの最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト抗体生殖遺伝子の5'非翻訳領域、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− Fn5-Fc融合タンパク質コード配列(配列番号1のヌクレオチド16から1074)、及び
− ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
− ヒトサイトメガロウイルスからの最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト抗体生殖遺伝子の5'非翻訳領域、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− Fn5-Fc融合タンパク質コード配列(配列番号1のヌクレオチド16から1074)、及び
− ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
発現プラスミド7800のプラスミドマップを図2に示す。成熟DCC融合タンパク質の(すなわち、シグナル配列がない)アミノ酸配列を配列番号3に示す(Fn5変異体1)。
ベクター7809は、配列番号4に示すように、(配列番号3に示される成熟DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)と比較して)アミノ酸位置107のCisからAlaへの置換を生じる抗体ヒンジ定常領域内の単一点突然変異による、7800の構築に使用されるDCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質;成熟タンパク質に対する配列番号3)とは異なるFn5-Fc融合タンパク質変異体用の発現プラスミドである。
実施例2:一過性形質移入及び発現
実施例1に例証される本発明に係る組換えタンパク質は、懸濁液中で増殖するHEK293-Freestyle細胞(ヒト胚性腎臓細胞株293、Invitrogen)の一過性形質移入により得た。形質移入細胞を、ウルトラ-グルタミン(Biowhittake/Lonza)又はL-グルタミン(Sigma)のいずれかである6mMのグルタミンが補填されたF17培地(Gibco)又はFreestyle293培地(Invitrogen)において、8%のCO2、37℃で、30mlから250mlの培地スケールで振とうフラスコ内で培養した。形質移入では、フェクチン(Fectin)(Invitrogen)を、4:3の試薬(μl)対DNAの比で使用した。細胞培養上清を含むポリペプチドを、形質移入の6〜8日後に収集した。例えばHEK293細胞等におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P.等, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられている。DCC融合タンパク質(配列番号3)は、HEK293-Freestyle細胞中での一過性発現で、少なくとも100mg/Lの比率で高い効率で分泌された。
実施例1に例証される本発明に係る組換えタンパク質は、懸濁液中で増殖するHEK293-Freestyle細胞(ヒト胚性腎臓細胞株293、Invitrogen)の一過性形質移入により得た。形質移入細胞を、ウルトラ-グルタミン(Biowhittake/Lonza)又はL-グルタミン(Sigma)のいずれかである6mMのグルタミンが補填されたF17培地(Gibco)又はFreestyle293培地(Invitrogen)において、8%のCO2、37℃で、30mlから250mlの培地スケールで振とうフラスコ内で培養した。形質移入では、フェクチン(Fectin)(Invitrogen)を、4:3の試薬(μl)対DNAの比で使用した。細胞培養上清を含むポリペプチドを、形質移入の6〜8日後に収集した。例えばHEK293細胞等におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P.等, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられている。DCC融合タンパク質(配列番号3)は、HEK293-Freestyle細胞中での一過性発現で、少なくとも100mg/Lの比率で高い効率で分泌された。
実施例3:SDS-PAGEを使用する発現分析
4倍濃度のLDS試料バッファー(4×LDS):4gのグリセロール、0.682gのTRIS(トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン)、0.666gのTRIS-HCl(トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン塩酸塩)、0.8gのLDS(ドデシル硫酸リチウム)、0.006gのEDTA(エチレンジアミン四酸)、0.75mlのServa Blue G250の1重量%(w/w)水溶液、0.75mlのフェノールレッドの1重量%(w/w)水溶液を水に添加して、10mlの全容量にした。
4倍濃度のLDS試料バッファー(4×LDS):4gのグリセロール、0.682gのTRIS(トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン)、0.666gのTRIS-HCl(トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン塩酸塩)、0.8gのLDS(ドデシル硫酸リチウム)、0.006gのEDTA(エチレンジアミン四酸)、0.75mlのServa Blue G250の1重量%(w/w)水溶液、0.75mlのフェノールレッドの1重量%(w/w)水溶液を水に添加して、10mlの全容量にした。
分泌タンパク質を含む培養ブロスを遠心分離に供し、細胞と細胞屑を除去した。清澄にされた上清のアリコートを1/4容量(v/v)の4×LDS試料バッファー及び1/10容量(v/v)の0.5Mの1,4-ジチオスレイトール(DTT)と混合した。ついで、試料を75℃で10分インキュベートし、SDS-PAGEによりタンパク質を分離させた。NuPAGE(登録商標)プレキャストゲル系(Pre-Cast gel system)(Invitrogen)を、製造者の使用説明書に従って使用した。特に、10%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)ビス−トリスプレキャストゲル(pH6.4)及びNuPAGE(登録商標)MESランニングバッファーを使用した。成熟DCC融合タンパク質(Fn5変異体1:配列番号3;及び変異Fn5変異体1:配列番号4)を、クーマシーブルーブリリアント染色を用いた染色後にはっきりと検出することができた。培養上清における発現収量は>100mg/Lであった。これに対して、(プラスミド7801、7802及び7803に基づき上述した実施例1に記載されているようにして同様に発現された)Fn5変異体2(配列番号6)又はFn4+Fn5変異体1及び2(それぞれ配列番号5及び配列番号7)を含んでなる他のコンストラクトの発現収量は、低い発現収量しか示さなかった。結果を表1に示す。
実施例4:アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによるタンパク質の精製
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー
発現され、分泌されたポリペプチドを、プロテインA親和性材料Mabセレクトシュア(MabSelectSure)(GE Healthcare)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡潔に述べると、遠心分離(10000g、10分)及び0.45μmフィルターによる濾過後、ポリペプチドを含む清澄な培養上清を、PBSバッファー(10mMのNa2HPO4、1mMのKH2PO4、137mMのNaCl及び2.7mMのKCl、pH7.4)で平衡化されたMabセレクトシュアカラムに適用した。未結合のタンパク質を、平衡バッファーでの洗浄により除去した。ポリペプチドを0.1Mのクエン酸バッファー、pH3.3で溶離させ、生成物を含む画分を1MのTRIS、pH9.0で中和した。その後、溶液を、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0のバッファーで、4℃で透析し、Amicon Centricon濃縮装置で濃縮し、さらなるプロセシングまで、氷水浴中に保存した。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー
発現され、分泌されたポリペプチドを、プロテインA親和性材料Mabセレクトシュア(MabSelectSure)(GE Healthcare)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡潔に述べると、遠心分離(10000g、10分)及び0.45μmフィルターによる濾過後、ポリペプチドを含む清澄な培養上清を、PBSバッファー(10mMのNa2HPO4、1mMのKH2PO4、137mMのNaCl及び2.7mMのKCl、pH7.4)で平衡化されたMabセレクトシュアカラムに適用した。未結合のタンパク質を、平衡バッファーでの洗浄により除去した。ポリペプチドを0.1Mのクエン酸バッファー、pH3.3で溶離させ、生成物を含む画分を1MのTRIS、pH9.0で中和した。その後、溶液を、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0のバッファーで、4℃で透析し、Amicon Centricon濃縮装置で濃縮し、さらなるプロセシングまで、氷水浴中に保存した。
サイズ排除クロマトグラフィー
ポリペプチドを含む溶液を、同じヒスチジンバッファーで平衡にされたスーパーデックス(Superdex)200高ロードカラム(GE HealthCare)に適用した。画分を収集した。全ての画分を分析用SEC(スーパーデックス200、GE HealthCare)により分析し、純粋な単量体性コンジュゲートを伴う画分をプール化し、−80℃で凍結保存した。
ポリペプチドの完全性は、先の段落に記載されたように、還元剤の存在及び非存在下、クーマシーブリリアントブルーで染色して、SDS-PAGEにより分析した。
ポリペプチドを含む溶液を、同じヒスチジンバッファーで平衡にされたスーパーデックス(Superdex)200高ロードカラム(GE HealthCare)に適用した。画分を収集した。全ての画分を分析用SEC(スーパーデックス200、GE HealthCare)により分析し、純粋な単量体性コンジュゲートを伴う画分をプール化し、−80℃で凍結保存した。
ポリペプチドの完全性は、先の段落に記載されたように、還元剤の存在及び非存在下、クーマシーブリリアントブルーで染色して、SDS-PAGEにより分析した。
実施例5:表面プラズモン共鳴による結合アッセイ
機器:Biacore T100(GE Healthcare)
ソフトウェア:Biacore T100コントロール、バージョン2.02
Biacore T100エバルエーション、バージョン2.02
アッセイフォーマット:チップ:CM5-チップ
DCC融合タンパク質(Fn5変異体1;配列番号3)を、アミンカップリングされた捕捉分子を介して捕捉した。一連の増加濃度のネトリン-1を注射した。
アミンカップリング捕捉分子を単独で含むチップ表面を、可能なバッファー効果又はネトリン−1の非特異的結合の修復のために参照コントロール表面として使用した。
捕捉分子:Fn5変異体1のために抗ヒトIgG抗体(ヤギ由来、Jackson Immuno Research JIR 109-005-098)。
機器:Biacore T100(GE Healthcare)
ソフトウェア:Biacore T100コントロール、バージョン2.02
Biacore T100エバルエーション、バージョン2.02
アッセイフォーマット:チップ:CM5-チップ
DCC融合タンパク質(Fn5変異体1;配列番号3)を、アミンカップリングされた捕捉分子を介して捕捉した。一連の増加濃度のネトリン-1を注射した。
アミンカップリング捕捉分子を単独で含むチップ表面を、可能なバッファー効果又はネトリン−1の非特異的結合の修復のために参照コントロール表面として使用した。
捕捉分子:Fn5変異体1のために抗ヒトIgG抗体(ヤギ由来、Jackson Immuno Research JIR 109-005-098)。
捕捉分子のアミンカップリング
製造者の使用説明書に従っての標準的なアミンカップリング:ランニングバッファー::HBS-Nバッファー、EDC/NHSの混合物により活性化、5000RUのリガンド密度用;捕捉抗体をカップリングバッファーNaAc、pH4.5、c=30μg/mLで希釈した;最終的に残存する活性化カルボキシル基を1Mのエタノールアミンの注入によりブロックした。
25℃でのDCC融合タンパク質(Fn5変異体1;配列番号3)に結合するネトリン-1の動態特徴付け
ランニングバッファー:PBS+0.05%(v/v)のトゥイーン20
フローセル2から4でのFn5変異体1の捕捉:流量5μL/分、接触時間72秒、c(Fn5変異体1)=100nM,、ランニングバッファー+1mg/mLのBSAで希釈。
製造者の使用説明書に従っての標準的なアミンカップリング:ランニングバッファー::HBS-Nバッファー、EDC/NHSの混合物により活性化、5000RUのリガンド密度用;捕捉抗体をカップリングバッファーNaAc、pH4.5、c=30μg/mLで希釈した;最終的に残存する活性化カルボキシル基を1Mのエタノールアミンの注入によりブロックした。
25℃でのDCC融合タンパク質(Fn5変異体1;配列番号3)に結合するネトリン-1の動態特徴付け
ランニングバッファー:PBS+0.05%(v/v)のトゥイーン20
フローセル2から4でのFn5変異体1の捕捉:流量5μL/分、接触時間72秒、c(Fn5変異体1)=100nM,、ランニングバッファー+1mg/mLのBSAで希釈。
検体試料:
古典的濃度シリーズを、c=400−1nMの間で5又は6の増加濃度の検体を逐次注入することにより、流量50μL/分で測定した。検体を3分注入し、解離相が20分続いた。異なる製造者からの様々なネトリン-1試料を測定に使用した(ヒトネトリン-1、アレキシス(Alexis)522-100-0000/ヒトメトリン-1Netris Pharma/ニワトリネトリン-1、アレキシス522-106-2010)。
10mMのグリシン、pH1.5、接触時間2分、流量30μL/分を使用し、各サイクル(=各濃度)後に再生を実施した。
古典的濃度シリーズを、c=400−1nMの間で5又は6の増加濃度の検体を逐次注入することにより、流量50μL/分で測定した。検体を3分注入し、解離相が20分続いた。異なる製造者からの様々なネトリン-1試料を測定に使用した(ヒトネトリン-1、アレキシス(Alexis)522-100-0000/ヒトメトリン-1Netris Pharma/ニワトリネトリン-1、アレキシス522-106-2010)。
10mMのグリシン、pH1.5、接触時間2分、流量30μL/分を使用し、各サイクル(=各濃度)後に再生を実施した。
図3は、例えば、様々な濃度の注入されたチキンネトリン-1での、捕捉検体DCC融合タンパク質(Fn5変異体1;配列番号3)の典型的な結合及び解離曲線を示す。
実施例6:H358細胞を用いたカスパーゼ3活性化アッセイ
1日目に細胞を無血清培地に播種した(ウェル当たり1mlの培地を含む6ウェルプレートにウェル当たり2×105細胞)。2日目に培地を、ビヒクル(PBS)のみ、又は1μg/mlの成熟DCC融合タンパク質(Fn5変異体1、配列番号3)、又は1μg/mlのFn5変異体1と150ng/mlのネトリン-1を含んでいる1mlの新鮮な無血清培地で置き換えた。1条件当たり2ウェルにおいて処理を実施した。3日目、2つの同じようにして処理されたウェルから浮遊及び全付着細胞を、一プールとして収集した。細胞ペレットを55μLの溶解バッファーに再懸濁させ、氷で10分、溶解させた。ついで、ライセートを4℃で3分、最高速度で遠心分離することにより事前清浄化した。上清を新しいチューブに収集し、タンパク質濃度の測定中、氷上に保持した。白色の96ウェルプレート中において、30μg容量のタンパク質アリコートを、溶解バッファーを使用して最終容量50μlに調節した。54μLの反応バッファーと1μLのDEVD-AFCと0.5μLのDTTからなる50μLの反応混合物を各ウェルに添加した。蛍光の発生(400nmで励起、510nmで発光)を、5分毎に全体で1時間、動態測定によりモニターした。あるいは、それができない場合は、最初の読み取りを混合物の添加直後に実施し、最終的な測定を37℃での1時間のインキュベート後に実施した(光から保護)。全ての値を、ビヒクルコントロール試料に対して正規化した。結果を図4に示す。
1日目に細胞を無血清培地に播種した(ウェル当たり1mlの培地を含む6ウェルプレートにウェル当たり2×105細胞)。2日目に培地を、ビヒクル(PBS)のみ、又は1μg/mlの成熟DCC融合タンパク質(Fn5変異体1、配列番号3)、又は1μg/mlのFn5変異体1と150ng/mlのネトリン-1を含んでいる1mlの新鮮な無血清培地で置き換えた。1条件当たり2ウェルにおいて処理を実施した。3日目、2つの同じようにして処理されたウェルから浮遊及び全付着細胞を、一プールとして収集した。細胞ペレットを55μLの溶解バッファーに再懸濁させ、氷で10分、溶解させた。ついで、ライセートを4℃で3分、最高速度で遠心分離することにより事前清浄化した。上清を新しいチューブに収集し、タンパク質濃度の測定中、氷上に保持した。白色の96ウェルプレート中において、30μg容量のタンパク質アリコートを、溶解バッファーを使用して最終容量50μlに調節した。54μLの反応バッファーと1μLのDEVD-AFCと0.5μLのDTTからなる50μLの反応混合物を各ウェルに添加した。蛍光の発生(400nmで励起、510nmで発光)を、5分毎に全体で1時間、動態測定によりモニターした。あるいは、それができない場合は、最初の読み取りを混合物の添加直後に実施し、最終的な測定を37℃での1時間のインキュベート後に実施した(光から保護)。全ての値を、ビヒクルコントロール試料に対して正規化した。結果を図4に示す。
実施例7:H358及びA549異種移植のインビボ腫瘍増殖阻害
H358異種移植:
5週齢の雌の胸腺欠損nu/nuマウスに、200μLのPBS中の5.0×106のH358細胞をマウスの左側腹部に皮下注射することにより移植し、マウス当たり1腫瘍を作製した。腫瘍が約100mm3の体積に達したところで、20mg/kgのFn5変異体1融合タンパク質(配列番号3)(n=11匹のマウス)又は等しい容量のバッファー(n=12匹のマウス)を、4連続週にわたり、週1回、腹腔内注射した。腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、式v=0.5(l×w2)(ここで、vは体積であり、lは長さであり、wは幅である)で算出した。
H358異種移植:
5週齢の雌の胸腺欠損nu/nuマウスに、200μLのPBS中の5.0×106のH358細胞をマウスの左側腹部に皮下注射することにより移植し、マウス当たり1腫瘍を作製した。腫瘍が約100mm3の体積に達したところで、20mg/kgのFn5変異体1融合タンパク質(配列番号3)(n=11匹のマウス)又は等しい容量のバッファー(n=12匹のマウス)を、4連続週にわたり、週1回、腹腔内注射した。腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、式v=0.5(l×w2)(ここで、vは体積であり、lは長さであり、wは幅である)で算出した。
A549異種移植:
5週齢の雌の胸腺欠損nu/nuマウスに、A549細胞をその左側腹部に皮下注射することにより移植した。腫瘍が約100mm3の体積に達したところで、20mg/kg用量のFn5変異体1融合タンパク質(配列番号3)又は等しい容量のバッファーを、4連続週にわたり、週1回又は2回、腹腔内注射した(治療群当たりn=10匹のマウス)。腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、式v=0.5(l×w2)(ここで、vは体積であり、lは長さであり、wは幅である)で算出した。図5をまた参照のこと(「トラップ」は変異体1融合タンパク質(配列番号3)を意味する)。
5週齢の雌の胸腺欠損nu/nuマウスに、A549細胞をその左側腹部に皮下注射することにより移植した。腫瘍が約100mm3の体積に達したところで、20mg/kg用量のFn5変異体1融合タンパク質(配列番号3)又は等しい容量のバッファーを、4連続週にわたり、週1回又は2回、腹腔内注射した(治療群当たりn=10匹のマウス)。腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、式v=0.5(l×w2)(ここで、vは体積であり、lは長さであり、wは幅である)で算出した。図5をまた参照のこと(「トラップ」は変異体1融合タンパク質(配列番号3)を意味する)。
本発明で言及される配列
配列番号1
DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)7800をコードするDNA
人工配列
aagcttgccgccaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccagcacccccatgctgcctccagtgggcgtccaggccgtggctctcacacacgacgcagtccgcgtgtcctgggccgataactctgttcccaagaatcagaaaacctcagaagtgagactgtacactgtccgctggcggacatccttctccgcttctgcaaagtataagagtgaagacaccactagcctttcctacaccgccacagggctgaaacctaacaccatgtatgagttttctgtgatggtaacaaagaataggagatcaagcacctggtccatgactgctcatgcaacaacctacgaggccgctccaaaatcttgtgacaaaactcacacatgtccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcacgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggcaaatgagctagcg
配列番号1
DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)7800をコードするDNA
人工配列
aagcttgccgccaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccagcacccccatgctgcctccagtgggcgtccaggccgtggctctcacacacgacgcagtccgcgtgtcctgggccgataactctgttcccaagaatcagaaaacctcagaagtgagactgtacactgtccgctggcggacatccttctccgcttctgcaaagtataagagtgaagacaccactagcctttcctacaccgccacagggctgaaacctaacaccatgtatgagttttctgtgatggtaacaaagaataggagatcaagcacctggtccatgactgctcatgcaacaacctacgaggccgctccaaaatcttgtgacaaaactcacacatgtccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcacgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggcaaatgagctagcg
配列番号2
DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)7800のアミノ酸配列
人工配列
MGWSCIILFLVATATGVHSSTPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)7800のアミノ酸配列
人工配列
MGWSCIILFLVATATGVHSSTPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号3
成熟DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)7800のアミノ酸配列
人工配列
STPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟DCC融合タンパク質(Fn5-Fc融合タンパク質)7800のアミノ酸配列
人工配列
STPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号4
成熟Fn5-Fc融合タンパク質7809のアミノ酸配列
人工配列
STPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟Fn5-Fc融合タンパク質7809のアミノ酸配列
人工配列
STPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号5
成熟Fn4-Fn5-Fc融合タンパク質7801のアミノ酸配列
人工配列
QVPDQPSSLHVRPQTNCIIMSWTPPLNPNIVVRGYIIGYGVGSPYAETVRVDSKQRYYSIERLESSSHYVISLKAFNNAGEGVPLYESATTRSITDPTDPVDYYPLLDDFPTSVPDLSTPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟Fn4-Fn5-Fc融合タンパク質7801のアミノ酸配列
人工配列
QVPDQPSSLHVRPQTNCIIMSWTPPLNPNIVVRGYIIGYGVGSPYAETVRVDSKQRYYSIERLESSSHYVISLKAFNNAGEGVPLYESATTRSITDPTDPVDYYPLLDDFPTSVPDLSTPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSMTAHATTYEAAPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号6
成熟Fn5-Fc融合タンパク質7802のアミノ酸配列
人工配列
STPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSGGGGSGGGGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟Fn5-Fc融合タンパク質7802のアミノ酸配列
人工配列
STPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSGGGGSGGGGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号7
成熟Fn4-Fn5-Fc融合タンパク質7803のアミノ酸配列
人工配列
QVPDQPSSLHVRPQTNCIIMSWTPPLNPNIVVRGYIIGYGVGSPYAETVRVDSKQRYYSIERLESSSHYVISLKAFNNAGEGVPLYESATTRSITDPTDPVDYYPLLDDFPTSVPDLSTPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSGGGGSGGGGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟Fn4-Fn5-Fc融合タンパク質7803のアミノ酸配列
人工配列
QVPDQPSSLHVRPQTNCIIMSWTPPLNPNIVVRGYIIGYGVGSPYAETVRVDSKQRYYSIERLESSSHYVISLKAFNNAGEGVPLYESATTRSITDPTDPVDYYPLLDDFPTSVPDLSTPMLPPVGVQAVALTHDAVRVSWADNSVPKNQKTSEVRLYTVRWRTSFSASAKYKSEDTTSLSYTATGLKPNTMYEFSVMVTKNRRSSTWSGGGGSGGGGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Claims (11)
- 配列番号2又は配列番号3のアミノ酸配列を含んでなるDCC融合タンパク質。
- 請求項1に記載のDCC融合タンパク質をコードする核酸分子。
- 配列番号1のヌクレオチド配列を含んでなる請求項1に記載の核酸分子。
- 請求項2又は3に記載の核酸を含んでなり、該核酸を真核宿主細胞中において発現可能なベクター。
- 請求項2又は3に記載の核酸分子又は請求項4に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 請求項1に記載のDCC融合タンパク質を生産する方法であって、請求項2又は3に記載の核酸を真核宿主細胞中において発現させる工程と、該細胞又は細胞培養上清からDCC融合タンパク質を回収する工程を含んでなる方法。
- 請求項6に記載の方法により得られるDCC融合タンパク質。
- 請求項1に記載のDCC融合タンパク質、請求項2又は3に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、又は請求項5に記載の宿主細胞と;場合によっては薬学的に許容可能な担体を含有してなる薬学的組成物。
- 癌の治療に使用される請求項8に記載の薬学的組成物又は請求項1又は7に記載のDCC融合タンパク質。
- 癌の治療のための医薬の製造のための、請求項8に記載の薬学的組成物又は請求項1又は7に記載のDCC融合タンパク質の使用。
- 請求項1又は7に記載のDCC融合タンパク質を、それを必要とする被験者に投与することにより、被験者の癌を治療する方法。
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