JP2021101710A - 新規抗ccr8抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、腫瘍に浸潤するCD4陽性Treg細胞は、抗腫瘍免疫応答を強力に阻害している可能性があり、効果的な癌治療の大きな障害となりうる。
CD4陽性FoxP3陽性Treg細胞が媒介する腫瘍免疫抑制は、動物腫瘍モデルで十分に立証されており、腫瘍内も含めた全身性のTreg細胞除去により抗腫瘍効果が得られるが、一方で50%程度の腫瘍内浸潤Treg細胞除去では効果が認められないことが報告されている(非特許文献2)。
非特許文献14には、3B10、2D10及び5B11で示される抗CCR8抗体が開示されている。また、BioLegend社から、品番L263G8の抗CCR8抗体が販売されている。R&D社から、品番191704の抗CCR8抗体が販売されている。しかし、該抗体のCDR配列は開示されていない。また、抗CCR8抗体が抗腫瘍活性を有し、癌治療に有用であることは示されていない。
特許文献5及び非特許文献15〜19には、CCR8が癌の病態に関与していることが記載されている。
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識する、CCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
(2)中和抗体である、(1)記載の抗体又はその抗体断片。
(3)さらに、配列番号1で示されるアミノ酸配列の94位から107位の中の1以上のアミノ酸を認識する、(1)又は(2)記載の抗体又はその抗体断片。
(4)さらに、配列番号1で示されるアミノ酸配列の172位から202位の中の1以上のアミノ酸を認識する、(1)〜(3)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
(5)配列番号1で示されるアミノ酸配列の20位のイソロイシン、22位のセリン、35位のリジン、181位のロイシン、183位のシステイン及び188位のアスパラギンのうち、1以上のアミノ酸を認識する、(1)〜(4)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
(6)ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
(7)1)配列番号2のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号5のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
2)配列番号2のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
3)配列番号2のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号9のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号11のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
(ここで、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の2番目のセリンがトレオニンに置換、
B)配列番号2のアミノ酸配列の3番目のセリンがトレオニンに置換、
C)配列番号2のアミノ酸配列の5番目のセリンがトレオニンに置換、
D)配列番号10のアミノ酸配列の2番目のグルタミンがアスパラギンに置換、
E)配列番号8のアミノ酸配列の1番目のトレオニンがセリンに置換、
F)配列番号6のアミノ酸配列の14番目のアラニンがバリンに置換、
G)配列番号6のアミノ酸配列の18番目のリジンがアルギニンに置換、
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
I)配列番号11のアミノ酸配列の5番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号11のアミノ酸配列の12番目のチロシンがフェニルアラニンに置換);
4)配列番号2のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号12のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号13のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
5)配列番号14のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号15のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号16のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号17のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号18のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号19のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;若しくは
6)配列番号20のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号21のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号22のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号23のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号24のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号25のアミノ酸配列において1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域
を含む、CCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
(8)1)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号5のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域
(ここで、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換
D)配列番号3のアミノ酸配列の5番目のロイシンがイソロイシンに置換
E)配列番号4のアミノ酸配列の4番目のロイシンがイソロイシンに置換
F)配列番号4のアミノ酸配列の6番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
G)配列番号6のアミノ酸配列の16番目のセリンがトレオニンに置換
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換);
2)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
3)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号9のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号11のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
4)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号12のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号13のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
5)配列番号14のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号15のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号16のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号17のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号18のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号19のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;若しくは
6)配列番号20のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号21のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号22のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号23のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号24のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号25のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域
を含む、(7)記載の抗体又はその抗体断片。
(9)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号5のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換;
D)配列番号3のアミノ酸配列の5番目のロイシンがイソロイシンに置換;
E)配列番号4のアミノ酸配列の4番目のロイシンがイソロイシンに置換;
F)配列番号4のアミノ酸配列の6番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
G)配列番号6のアミノ酸配列の16番目のセリンがトレオニンに置換
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
(8)記載の抗体又はその抗体断片。
(10)以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
(9)記載の抗体又はその抗体断片。
(11)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換、
(9)又は(10)記載の抗体又はその抗体断片。
(12)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、さらに、配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがアルギニンに置換されている、(11)記載の抗体又はその抗体断片。
(13)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号9のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号11のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号2のアミノ酸配列の2番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の3番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号2のアミノ酸配列の5番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号10のアミノ酸配列の2番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号8のアミノ酸配列の1番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号6のアミノ酸配列の14番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号6のアミノ酸配列の18番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号11のアミノ酸配列の5番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号11のアミノ酸配列の12番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
(8)記載の抗体又はその抗体断片。
(14)ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、(7)〜(13)のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
(15)配列番号40、42、43、44、45若しくは47のアミノ酸配列又は
配列番号40、42、43、44、45若しくは47のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列又は
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域;
を含む、(14)記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(16)1)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
2)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
3)配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
4)配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
5)配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
6)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
7)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
8)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
9)配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
10)配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
11)配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;若しくは
12)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の34番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換;
D)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の59番目のロイシンがイソロイシンに置換;
E)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の97番目のロイシンがイソロイシンに置換;
F)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の99番目のチロシンがフェニルアラニンに置換;
G)配列番号41又は46のアミノ酸配列の65番目のセリンがトレオニンに置換;
H)配列番号41又は46のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
(14)又は(15)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(17)以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の34番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換;
D)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の59番目のロイシンがイソロイシンに置換;
E)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の97番目のロイシンがイソロイシンに置換;
F)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の99番目のチロシンがフェニルアラニンに置換;
G)配列番号41又は46のアミノ酸配列の65番目のセリンがトレオニンに置換;
H)配列番号41又は46のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
(16)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(18)配列番号40又は42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換;
D)配列番号40又は42のアミノ酸配列の59番目のロイシンがイソロイシンに置換;
E)配列番号40又は42のアミノ酸配列の97番目のロイシンがイソロイシンに置換;
F)配列番号40又は42のアミノ酸配列の99番目のチロシンがフェニルアラニンに置換;
G)配列番号41のアミノ酸配列の65番目のセリンがトレオニンに置換;
H)配列番号41のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
(17)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(19)以下のいずれかの置換を1以上有する、
配列番号40又は42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
(17)又は(18)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(20)配列番号40又は42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い、
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換、
(17)〜(19)のいずれかに記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(21)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
配列番号42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、配列番号42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがアルギニンに置換されている、
(20)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(22)配列番号59のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、(20)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(23)配列番号54、55若しくは56のアミノ酸配列又は
配列番号54、55若しくは56のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号57若しくは58のアミノ酸配列又は
配列番号57若しくは58のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域;
を含む、(14)記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(24)1)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
2)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
3)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
4)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
5)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
6)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい、
A)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の25番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の26番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の28番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の95番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号57又は58のアミノ酸配列の31番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号57又は58のアミノ酸配列の63番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号57又は58のアミノ酸配列の67番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号57又は58のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号57又は58のアミノ酸配列の99番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号57又は58のアミノ酸配列の105番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
(14)又は(23)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(25)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい、
A)配列番号56のアミノ酸配列の25番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号56のアミノ酸配列の26番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号56のアミノ酸配列の28番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号56のアミノ酸配列の95番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号57のアミノ酸配列の31番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号57のアミノ酸配列の63番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号57のアミノ酸配列の67番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号57のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号57のアミノ酸配列の99番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号57のアミノ酸配列の105番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
(24)記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(26)さらに、配列番号52のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域、及び、
配列番号53のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有し、
配列番号53のC末端にリジンが付加していてもしていなくてもよい、(14)〜(25)のいずれかに記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
(27)(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
(28)CCR8とCCR8リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
(29)中和抗体として用いる、(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
(30)配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識するために用いる、(1)〜(26)のいずれかに記載のCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
(31)CCR8とCCR8リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、(30)記載の医薬組成物。
(32)抗体がADCC活性を有するものである、(27)〜(31)のいずれかに記載の医薬組成物。
(33)抗体がIgG抗体である、(27)〜(31)のいずれかに記載の医薬組成物。
(34)癌を治療するために用いる、(27)〜(33)のいずれかに記載の医薬組成物。
(35)(7)〜(18)のいずれかに記載の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
(36)(35)記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(52)中和抗体である、(51)記載の抗体又はその抗体断片。
(53)ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、(51)又は(52)記載の抗体又は抗体断片。
(55)ヒトCCR8に対し中和活性を有し、ヒトCCR8への結合に関して、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体と競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
(56)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体のエピトープと完全に又は部分的に同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
(57)ヒトCCR8に対し中和活性を有し、ヒトCCR8への結合に関して、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換され、配列番号42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがアルギニンに置換されている抗体と競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
(58)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換され、配列番号42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがアルギニンに置換されている抗体のエピトープと完全に又は部分的に同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
(59)配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識する抗体又はその抗体断片である、(54)〜(58)のいずれかに記載のモノクローナル抗体又は抗体断片。
(60)さらに、配列番号1で示されるアミノ酸配列の94位から107位の中の1以上のアミノ酸を認識する、(59)記載の抗体又はその抗体断片。
(61)さらに、配列番号1で示されるアミノ酸配列の172位から202位の中の1以上のアミノ酸を認識する、(59)又は(60)記載の抗体又はその抗体断片。
(62)配列番号1で示されるアミノ酸配列の20位のイソロイシン、22位のセリン、35位のリジン、181位のロイシン、183位のシステイン及び188位のアスパラギンのうち、1以上のアミノ酸を認識する、(59)〜(61)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
(63)ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、(54)〜(62)のいずれかに記載のモノクローナル抗体又は抗体断片。
(64)上記(54)〜(63)のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
a)WO2007/044756に記載された、414B、414C、414E、433H、459M、464A、464B、433B及び455ALで示される抗CCR8抗体。
b)Quらの論文(J. Exp. Med., (2004), 200(10), 1231-1241)に記載された、3B10、2D10及び5B11で示される抗CCR8抗体。
c)BioLegend社の品番L263G8の抗CCR8抗体。
d)R&D社の品番191704の抗CCR8抗体。
(92)(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
(93)(7)〜(26)のいずれかに記載のCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識する方法。
(94)CCR8とCCR8リガンドのいずれかとの結合を阻害する薬剤を製造するための、(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片の使用。
(95)癌の治療剤を製造するための、(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片の使用。
(96)配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識する薬剤を製造するための、(1)〜(26)のいずれかに記載のCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片の使用。
(97)CCR8とCCR8リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
(98)癌を治療するために用いる、(1)〜(26)のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
(99)配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識するために用いる、(1)〜(26)のいずれかに記載のCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
また、当該分野で公知の遺伝子操作的手法が利用可能である。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Forth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)、Current Protocols Essential Laboratory Techniques, Current Protocols (2012)に記載された方法等が挙げられる。
さらに、上記のモノクローナル抗体又はその抗体断片のうち、以下のモノクローナル抗体又はその抗体断片が好ましい。
ヒトCCR8のloop1に該当する、該アミノ酸配列の94位から107位の中の一以上のアミノ酸を認識するヒトCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
ヒトCCR8のloop2に該当する、該アミノ酸配列の172位から202位の中の一以上のアミノ酸を認識するヒトCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
ヒトCCR8のアミノ酸配列の20位のイソロイシン、22位のセリン、35位のリジン、181位のロイシン、183位のシステイン及び188位のアスパラギンのうち、1以上のアミノ酸を認識するヒトCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
ここで、上記の好ましい場合において、上記に示したエピトープのうち、任意に選択される複数のエピトープを認識していてもよい。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が、ヒトCCR8のアミノ酸配列における上記アミノ酸以外のアミノ酸をさらに認識していてもよい。
(1)軽鎖CDR1:配列番号2、14又は20。
(2)軽鎖CDR2:配列番号3、9、15又は21。
(3)軽鎖CDR3:配列番号4、10、16又は22。
(4)重鎖CDR1:配列番号5、8、12、17又は23。
(5)重鎖CDR2:配列番号6、18又は24。
(6)重鎖CDR3:配列番号7、11、13、19又は25。
さらに好ましくは、以下の配列を有している。
(1)軽鎖CDR1:配列番号2。
(2)軽鎖CDR2:配列番号3又は9。
(3)軽鎖CDR3:配列番号4又は10。
(4)重鎖CDR1:配列番号5、8又は12。
(5)重鎖CDR2:配列番号6。
(6)重鎖CDR3:配列番号7、11又は13。
最も好ましくは、以下の配列を有している。
(1)軽鎖CDR1:配列番号2。
(2)軽鎖CDR2:配列番号3。
(3)軽鎖CDR3:配列番号4。
(4)重鎖CDR1:配列番号5。
(5)重鎖CDR2:配列番号6。
(6)重鎖CDR3:配列番号7。
また、上記の各アミノ酸配列(配列番号2〜25)において、1又は2のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されていてもよい。
ここで、本発明のモノクローナル抗体におけるCDR配列中のアスパラギンはグルタミン又はリジンに、アスパラギン酸はグルタミン酸に、ロイシはンイソロイシンに、チロシンはフェニルアラニンに、セリンはトレオニンに、及び、グリシンはグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換されていてもよい。
好ましくは、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換。
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換。
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
D)配列番号3のアミノ酸配列の5番目のロイシンがイソロイシンに置換。
E)配列番号4のアミノ酸配列の4番目のロイシンがイソロイシンに置換。
F)配列番号4のアミノ酸配列の6番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
G)配列番号6のアミノ酸配列の16番目のセリンがトレオニンに置換。
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
より好ましくは、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い。
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換。
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
さらに好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い。
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
また、本発明のモノクローナル抗体が以下の配列を有している場合、
(1)軽鎖CDR1:配列番号2。
(2)軽鎖CDR2:配列番号9。
(3)軽鎖CDR3:配列番号10。
(4)重鎖CDR1:配列番号8。
(5)重鎖CDR2:配列番号6。
(6)重鎖CDR3:配列番号11。
以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい、
A)配列番号2のアミノ酸配列の2番目のセリンがトレオニンに置換。
B)配列番号2のアミノ酸配列の3番目のセリンがトレオニンに置換。
C)配列番号2のアミノ酸配列の5番目のセリンがトレオニンに置換。
D)配列番号10のアミノ酸配列の2番目のグルタミンがアスパラギンに置換。
E)配列番号8のアミノ酸配列の1番目のトレオニンがセリンに置換。
F)配列番号6のアミノ酸配列の14番目のアラニンがバリンに置換。
G)配列番号6のアミノ酸配列の18番目のリジンがアルギニンに置換。
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
I)配列番号11のアミノ酸配列の5番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
J)配列番号11のアミノ酸配列の12番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
「競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片」は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片(好ましくは、本願明細書の実施例記載の抗体。特に好ましくは、10A11。例えば、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換され、配列番号42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがアルギニンに置換されている抗体。)のヒトCCR8への特異的結合を阻害する抗体又はその抗体断片を意味する。あるモノクローナル抗体又はその抗体断片が本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合するかどうかを決定する。Isotype control抗体の共存下、抗原(ヒトCCR8)との結合が確認できた抗体のうち、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の共存下では結合シグナルが顕著に低下する抗体を、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗体として同定することができる。該結合シグナルの低下は、好ましくは50%、より好ましくは70%である。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗体の、該本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と抗原との結合に対するKi値は、好ましくは1×10−7M以下、より好ましくは1×10−8M以下、さらに好ましくは1×10−9M以下である。
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗体のヒトCCR8の中和活性は、好ましくはIC50値が10nM以下である。
CCR8とCCR8リガンドの結合阻害能については、例えば、ヒトCCL1の場合、ヒトCCR8発現293細胞を用い、ヒトCCL1添加によるCa2+流入を測定し、ヒトCCL1非添加時のシグナルを阻害率100%、ヒトCCL1添加及び抗体非添加時のシグナルを阻害率0%として、IC50値を計算することにより決定することができる。他のCCR8リガンドの結合阻害能についても、上記ヒトCCL1の場合と同様に、決定することができる。
ヒト化モノクローナル抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的等でヒトに投与する場合に有用である。ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementarity determining region)をヒト抗体のフレームワーク領域(FR; framework region)へ移植したものである。従って、ヒト化モノクローナル抗体のFRは、ヒト由来のものである。適当なFRは、Kabat E.A.らの文献を参照すれば選択できる。この場合のFRとしては、CDRが良好な抗原結合部位を形成することができるものが選択される。必要に応じ、再構成したヒト化モノクローナル抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域のFRのアミノ酸を置換してもよい(Sato、K.ら, Cancer Res. 1993年、第53巻、851ページ)。置換されるFRのアミノ酸の割合は、全FR領域の0〜15%、好ましくは0〜5%である。
配列番号40、42、43、44、45若しくは47のアミノ酸配列又は
配列番号40、42、43、44、45若しくは47のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列又は
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む。
より好ましくは、
1)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
2)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
3)配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
4)配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
5)配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
6)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
7)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
8)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
9)配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
10)配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
11)配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;若しくは
12)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有していても良い。
A)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換。
B)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の34番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換。
C)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
D)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の59番目のロイシンがイソロイシンに置換。
E)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の97番目のロイシンがイソロイシンに置換。
F)配列番号40、42、43、44、45又は47のアミノ酸配列の99番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
G)配列番号41又は46のアミノ酸配列の65番目のセリンがトレオニンに置換。
H)配列番号41又は46のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
さらに好ましくは、
1)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;若しくは
2)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい。
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換。
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換。
C)配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
D)配列番号40又は42のアミノ酸配列の59番目のロイシンがイソロイシンに置換。
E)配列番号40又は42のアミノ酸配列の97番目のロイシンがイソロイシンに置換。
F)配列番号40又は42のアミノ酸配列の99番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
G)配列番号41のアミノ酸配列の65番目のセリンがトレオニンに置換。
H)配列番号41のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
特に好ましくは、
1)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;若しくは
2)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい。
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換。
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
C)配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
最も好ましくは、
1)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;若しくは
2)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い。
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換。
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、配列番号42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがアルギニンに置換されているヒト化モノクローナル抗体が最も好ましい。
ここで、上記表1の「置換の種類」における各記号は、それぞれ以下の置換を意味する。
(1)配列番号40又は42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
A)アミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換。
B1)アミノ酸配列の34番目のグリシンがグルタミンに置換。
B2)アミノ酸配列の34番目のグリシンがトレオニンに置換。
B3)アミノ酸配列の34番目のグリシンがアラニンに置換。
B4)アミノ酸配列の34番目のグリシンがリジンに置換。
B5)アミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシンに置換。
B6)アミノ酸配列の34番目のグリシンがアルギニンに置換。
C)アミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
D)アミノ酸配列の59番目のロイシンがイソロイシンに置換。
E)アミノ酸配列の97番目のロイシンがイソロイシンに置換。
F)アミノ酸配列の99番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
(2)配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
G)アミノ酸配列の65番目のセリンがトレオニンに置換。
H)アミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
配列番号40、42、43、44、45若しくは47のアミノ酸配列又は
配列番号40、42、43、44、45若しくは47のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の26番目はセリン、27番目はリジン、30番目はロイシン及び98番目はグルタミン酸である軽鎖可変領域並びに
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列又は
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の33番目はアラニン、35番目はチロシン、52番目はアルギニン、56番目はアスパラギン、62番目はチロシン、102番目はアルギニン、103番目はフェニルアラニン、104番目はチロシン、109番目はグリシン及び113番目はアスパラギン酸である重鎖可変領域を含む。
より好ましくは、
配列番号40若しくは42のアミノ酸配列又は
配列番号40若しくは42のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の26番目はセリン、27番目はリジン、30番目はロイシン及び98番目はグルタミン酸である軽鎖可変領域並びに
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列又は
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の33番目はアラニン、35番目はチロシン、52番目はアルギニン、56番目はアスパラギン、62番目はチロシン、102番目はアルギニン、103番目はフェニルアラニン、104番目はチロシン、109番目はグリシン及び113番目はアスパラギン酸である重鎖可変領域を含む。
さらに好ましくは、
配列番号42のアミノ酸配列若しくは
配列番号42のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の26番目はセリン、27番目はリジン、30番目はロイシン及び98番目はグルタミン酸である軽鎖可変領域並びに
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列若しくは
配列番号41若しくは46のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の33番目はアラニン、35番目はチロシン、52番目はアルギニン、56番目はアスパラギン、62番目はチロシン、102番目はアルギニン、103番目はフェニルアラニン、104番目はチロシン、109番目はグリシン及び113番目はアスパラギン酸である重鎖可変領域を含む。
配列番号54、55若しくは56のアミノ酸配列又は
配列番号54、55若しくは56のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号57若しくは58のアミノ酸配列又は
配列番号57若しくは58のアミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む。
より好ましくは、
1)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
2)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
3)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
4)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
5)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
6)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい、
A)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の25番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の26番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の28番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号54、55又は56のアミノ酸配列の95番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号57又は58のアミノ酸配列の31番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号57又は58のアミノ酸配列の63番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号57又は58のアミノ酸配列の67番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号57又は58のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号57又は58のアミノ酸配列の99番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号57又は58のアミノ酸配列の105番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
さらに好ましくは、
配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、以下のいずれかの置換を1以上有していてもよい、
A)配列番号56のアミノ酸配列の25番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号56のアミノ酸配列の26番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号56のアミノ酸配列の28番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号56のアミノ酸配列の95番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号57のアミノ酸配列の31番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号57のアミノ酸配列の63番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号57のアミノ酸配列の67番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号57のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号57のアミノ酸配列の99番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号57のアミノ酸配列の105番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の、CCR8とCCL1の結合に対する中和活性は、あらかじめCa2+指示薬を取り込ませたヒトCCR8発現293細胞に対し、培地で希釈した抗体希釈液を添加して測定することができる。CCR8とCCR8リガンドの親和性は、CCL1が最も強く、CCL1に対して高い阻害活性を有する抗体が有用である。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の中和活性は、IC50値が10nM以下であることが好ましい。中和活性は、より好ましくは、IC50値が5nM以下、さらに好ましくは2nM以下、特に好ましくは1nM以下、最も好ましくは0.5nM以下である。
ヒトCCR8のアミノ酸配列の17位のチロシンに加え、さらに、ヒトCCR8のloop1に該当する、該アミノ酸配列の94位から107位の中の一以上のアミノ酸及び/又はヒトCCR8のloop2に該当する、該アミノ酸配列の172位から202位の中の一以上のアミノ酸を認識する抗体又はその抗体断片がより好ましい。
また、ヒトCCR8のアミノ酸配列の17位のチロシンに加え、さらに、ヒトCCR8のアミノ酸配列の20位のイソロイシン、22位のセリン、35位のリジン、181位のロイシン、183位のシステイン及び188位のアスパラギンのうち、1以上のアミノ酸を認識する抗CCR8抗体又はその抗体断片がより好ましい。
a)WO2007/044756に記載された、414B、414C、414E、433H、459M、464A、464B、433B及び455ALで示される抗CCR8抗体。
b)Quらの論文(J. Exp. Med., (2004), 200(10), 1231-1241)に記載された、3B10、2D10及び5B11で示される抗CCR8抗体。
c)BioLegend社の品番L263G8の抗CCR8抗体。
d)R&D社の品番191704の抗CCR8抗体。
a)の抗CCR8抗体については、WO2007/044756において、エピトープ解析によりヒトCCR8のアミノ酸配列の1位から39位と結合することが開示されている。しかし、詳細なエピトープ部位については全く解析も開示もされていない。
b)〜d)の抗CCR8抗体については、エピトープ部位については全く開示されていない。すなわち、ヒトCCR8のアミノ酸配列の17位のチロシンを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片を、CCR8とCCR8リガンド(例えば、CCL1)の結合を阻害するために用いることができることは、いずれの文献にも開示も示唆もされていない。
また、本発明の「癌治療用医薬組成物」における「癌」は、腫瘍特異抗原を発現する癌が好ましい。
(1)本発明の医薬組成物の治療効果の補完及び/又は増強、
(2)本発明の医薬組成物の動態、吸収改善、投与量の低減及び/又は、
(3)本発明の医薬組成物の副作用の軽減、
のために他の薬剤と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。
ヒトCCR8(UniProtKB/Swiss−Prot:P51685)の全長をコードする遺伝子を抗原とし、A/J Jms Slc雌性マウスにDNA免疫した。DNA免疫は、2週間隔で2回又は3回繰り返し、最終免疫1週間後にヒトCCR8発現Expi293細胞を腹腔内投与することでブーストした。その3日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(p3×6363−Ag8.、東京腫瘤研究所)をPEG法を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地で選択した。抗ヒトCCR8抗体及び抗ヒトCCR8中和抗体はこの培養上清を用い、下記の方法により選抜した。
抗ヒトCCR8抗体は、培養上清をヒトCCR8発現Expi293細胞及びヒトCCR4発現Expi293細胞とそれぞれ反応させ、Alexa488標識抗マウスIgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で検出することにより、ヒトCCR8に対してのみ特異的に結合するクローンを選抜した。
抗ヒトCCR8中和抗体は、あらかじめCa2+指示薬を取り込ませたヒトCCR8発現293細胞に対して培養上清を十分に反応させたのちに、FLIPRにより200nM hCCL1(バイオレジェンド社製)添加によるCa2+流入を測定し、hCCL1刺激によるCa2+流入を阻害するクローンを選抜した。
特に強い中和活性を示すクローン(% inhibition>80%)と、中和活性をもたないクローンをそれぞれクローニングし、ハイブリドーマを樹立した。
免疫原であるヒトCCR8発現Rat−1細胞は、pQCXIP(クロンテック社)に
ヒトCCR8遺伝子をクローニングした発現ベクターをRat−1細胞にトランスフェクションしたのちに、ピューロマイシン(1ug/ml)で一ヶ月間薬剤選択することにより作製した。
ヒトCCR8発現Rat−1細胞をラットに一回免疫し、約2週間後にリンパ節を回収して常法によりハイブリドーマを作製した。
抗ヒトCCR8抗体は、ハイブリドーマ培養上清をヒトCCR8発現293細胞と293細胞にそれぞれ反応させ、Alexa647標識抗ラットIgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で検出することで、ヒトCCR8に特異的に結合可能なクローンを選抜した。
実施例1で樹立した抗ヒトCCR8抗体産生ハイブリドーマについて、無血清培地培養上清からProteinG精製及び、ゲル濾過精製により、40種類のクローンの精製抗体を得た。得られた40種類のクローンのうち、27種類の中和抗体及び13種類の非中和抗体の精製抗体を用い、下記の方法で抗原結合試験を実施することにより、中和活性に重要なエピトープを同定した。各クローンの中和活性は実施例1記載の方法で100nM hCCL1(バイオレジェンド社製)添加によるCa2+流入に対する阻害活性をFLIPRにより測定した。各中和抗体は、100nM hCCL1刺激によるCa2+流入阻害活性のIC50値が2nM以下であった。
ヒトCCR8(UniProtKB/Swiss−Prot:P51685 配列番号1)の全長をコードする遺伝子及びヒトCCR4(UniProtKB/Swiss−Prot:P51679 配列番号48)の全長をコードする遺伝子、マウスCCR8(UniProtKB/Swiss−Prot:P56484 配列番号39)の全長をコードする遺伝子をそれぞれpcDNA3.4ベクターにクローニングした。これをトランスフェクションすることで一過性にヒトCCR8、ヒトCCR4、マウスCCR8を発現させたExpi293細胞を作製した。この細胞に各クローンの精製抗体の希釈系列を反応させ、Alexa488標識抗マウスIgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で検出することにより、その結合性を評価した。その結果、いずれの抗体もヒトCCR8には結合するが、ヒトCCR4、マウスCCR8には全く結合しなかった。
そこで、ヒトCCR8の細胞外ドメインに相当するN末領域(配列番号1の1−35位アミノ酸)、loop1領域(配列番号1の94−107位アミノ酸)、loop2領域(配列番号1の172−202位アミノ酸)、loop3領域(配列番号1の264−280位アミノ酸)をそれに対応するヒトCCR4のN末領域(配列番号48の1−39位アミノ酸)、loop1領域(配列番号48の98−111位アミノ酸)、loop2領域(配列番号48の176−206位アミノ酸)、loop3領域(配列番号48の268−284位アミノ酸)に置換したキメラ体(図1)を作製し、上述の方法と同様の方法により、各抗体の結合性を評価した。
5ug/mL、0.5ug/mL、0.05ug/mLでの結合を評価し、野生型のヒトCCR8(hCCR8)と比較して、結合活性が顕著に低下しているものを△、結合が検出限界以下まで低下しているものを×で示した。空欄は、野生型のヒトCCR8(hCCR8)と同程度の結合活性を示すことを意味する。
その結果、表2に示すとおり、中和活性を有する抗体はいずれもN末領域をヒトCCR4(N−ter hCCR4−hCCR8)に置換することでその結合活性は検出限界以下となり、N末領域が中和活性発揮に重要なエピトープであることが明らかになった。さらに、loop1ヒトCCR4置換ヒトCCR8、及びloop2ヒトCCR4置換ヒトCCR8に対しても結合活性が低下した。以上のことから、強い中和活性を有する抗CCR8抗体はN末領域を強く認識し、かつloop1及びloop2にも結合するような立体構造認識をしていると考えられる。
なお、ヒトCCR8、ヒトCCR4及びマウスCCR8のいずれも認識しない抗体をコントロールとして使用したが、コントロール抗体は各抗原とは結合しなかった。また、各抗原のN末にタグを付与し、抗タグ抗体により検出することで、変異によりhCCR8の発現が低下しないことを確認した。
さらに、強い中和を有するすべてのクローンについて共通するエピトープ領域であるN末領域についてより詳細に解析すべく、表2に示すヒトCCR8点変異体を作製した。上述の方法と同様の方法で、この変異体に対する各クローンの結合活性を評価した結果、上記の27種類の中和抗体は、いずれもヒトCCR8の17位のYをAに置換した変異体(hCCR8(Y17A))に対する結合活性が著しく低下し検出限界以下となったことから、17位のYを認識していると考えられる。また、表2にはclone No. 8F7しか示していないが、ヒトCCR8の20位IをAに置換した変異体(hCCR8(I20A))に対する結合活性が低下している中和抗体も複数存在し、20位のイソロイシンにも結合するようなような立体構造認識をしている中和抗体も存在すると考えられる。
一方、上記の13種類の非中和抗体は、hCCR8(Y17A)に対する結合活性が低下しなかったことから、同じN末領域を認識しているが、17位のYは認識していないと考えられる。このことから、17位のYが中和活性発揮に極めて重要なアミノ酸であると考えられる。代表的な中和抗体(clone No. 10A11, 27G1, 1H4, 8F7, 2C7)及び非中和抗体(clone No. 5B5)についての結果を表2に示す。
樹立したクローンのうち、表3に示すマウス抗体及び表4に示すラット抗体について、ハイブリドーマ細胞より、常法に従って抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定した。
実施例4に記載したマウスハイブリドーマ由来、抗ヒトCCR8中和抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列について抗体配列解析ソフトウェアabYsisを用いたKabat numberingと、アライメントを実施した(図2、図3)。その結果、10A11、27G1、1H4、19D7,8F7のアミノ酸配列は以下に述べるとおりCDRに類似した配列を含むものであった。
軽鎖のCDR1は、配列番号2の16アミノ酸から構成されていた。
軽鎖のCDR2は、R−Xaa1−S−N−L−A−S(ここで、Xaa1は、M又はVである:配列番号49)の7アミノ酸から構成されていた(配列番号3又は9)。
軽鎖のCDR3は、M−Q−H−L−E−Y−P−Xaa1−T(ここで、Xaa1は、L又はFである:配列番号50)の9アミノ酸から構成されていた(配列番号4又は10)。
重鎖のCDR1は、Xaa1−Y−A−Xaa2−Y(ここで、Xaa1は、T又はPであり、Xaa2はL又はMである:配列番号51)の5アミノ酸から構成されていた(配列番号5、8又は12)。
重鎖のCDR2は、配列番号6の19アミノ酸から構成されていた。
重鎖のCDR3は10A11、27G1、1H4が共通した配列を有し、配列番号7の14アミノ酸から構成されていた。
樹立したハイブリドーマを無血清培地で培養し、その培養上清をProteinGアフィニティー精製及びゲル濾過精製を行うことで、精製抗体を得た。この精製抗体について下記の方法で中和活性を測定した。
あらかじめCa2+指示薬を取り込ませたヒトCCR8発現293細胞に対して培地で希釈した抗体希釈液を添加し、FLIPRにより200nM hCCL1(バイオレジェンド社製)添加によるCa2+流入を測定した。hCCL1非添加時のシグナルを阻害率100%、hCCL1添加及び抗体非添加時のシグナルを阻害率0%として阻害率を計算し、50%の阻害率を示す抗体濃度をIC50とした。少なくとも3回評価を行い、IC50をAverage±SDとして表記した。(表5)
10A11、2C7について、下記の方法でヒト化を実施した。
抗体配列解析ソフトabYsisを用いてKabatのnumbering及びCDRの定義を実施した。マウス抗体アミノ酸配列の重鎖及び軽鎖のV遺伝子領域配列に類似したヒト生殖系アクセプター配列を配列解析ソフトAbsisで検索し、選択した。またJ鎖領域については、マウス抗体DNA配列と相同性の高い配列をIMGT(http://www.imgt.org/)で検索しヒトフレームワーク配列とした。このヒトフレームワーク配列に対し、Kabat numbering(Wu,T.T.and Kabat,E.A.,J Exp.Med.Aug1;132(2):211−50.(1970))によって定義されたマウス抗体重鎖CDR1、CDR2、CDR3及びマウス抗体軽鎖CDR1,CDR2,CDR3を移植することでヒト化モノクローナル抗体配列を設計した(軽鎖;図4、重鎖;図5)。実施例6に示す方法により中和活性を測定した結果、表6に示すヒト化モノクローナル抗体が、マウス抗体と同等以上の親和性を示した。
19D7について、実施例7と同様の方法でヒト化を実施した(軽鎖;図6、重鎖;図7)。実施例6に示す方法により中和活性を測定した結果、表7に示すヒト化モノクローナル抗体が、マウス抗体と同等以上の親和性を示した。
図4及び図5に示すヒト化10A11について、CDRに相当するアミノ酸に点変異を導入した変異体を作製し、実施例6に示した方法により、各変異体の中和活性を算出した。各変異体について複数回中和活性評価を行い、そのIC50値をWTのIC50値との比として、IC50 ratio (WT IC50/ 変異体IC50)で表記した。
結果を表8及び表9に示す。n.d.(=not detectable)は、変異体のIC50値が測定系の限界値である10nM以上であり、検出限界以下まで活性が低下していることを示す。中和活性評価の結果、軽鎖については、KabatのnumberingによるL26、L27、L27c、L93アミノ酸部位において変異を有するS26T、K27R、L27cI、E93Dの各変異体は10倍以上活性が低下した(表8)。また重鎖については、KabatのnumberingによるH33、H35、H52、H53、H59、H96、H97、H98、H100c、H101アミノ酸部位において変異を有するA33V、Y35F、R52K、N53Q、Y59F、R96K、F97L、Y98F、G100cA、D101Eの各変異体で10倍以上活性が低下した(表9)。これらのアミノ酸は活性に極めて重要なアミノ酸である。
図6及び図7に示すヒト化19D7について、CDRに相当するアミノ酸に点変異を導入した変異体を作製し、実施例6に示した方法により、各変異体の中和活性を算出した。各変異体について複数回中和活性評価を行い、そのIC50値をWTのIC50値との比として、IC50 ratio (WT IC50/ 変異体IC50)で表記した。
結果を表10及び表11に示す。n.d.(=not detectable)は、変異体のIC50値が測定系の限界値である10nM以上であり、検出限界以下まで活性が低下していることを示す。
実施例7により見出されたヒト化フレームワークに、実施例8により見出された活性向上変異と、脱アミド化リスク配列に相当する、KabatのnumberingによるL28アミノ酸部位のNとL29アミノ酸部位のGに対する変異を組み合わせることで、ヒト化10A11の最適化を行った。その結果、表12に示すヒト化10A11変異体を見出した。
実施例7−2により見出されたヒト化フレームワークに点変異を導入し、ヒト化19D7の最適化を行った。その結果、表13に示すヒト化19D7変異体を見出した。
(1)hCCR8−KI(KI/KI)マウスの作製
マウスCCR8遺伝子(Gene ID:12776)及びヒトCCR8遺伝子(Gene ID:1237)は、いずれも2つのエクソンから構成されており、第2番目のエクソン内にORF(オープンリーディングフレーム)全長が含まれている。マウスCCR8遺伝子のORF(CCDS ID:23621.1)全長を取り除くと同時にヒトCCR8遺伝子のORF(CCDS ID:2684.1)全長を挿入することで、発現するCCR8タンパク質を完全にヒト化したhCCR8−KI(KI/KI)マウスを作製した。
相同組換えアームとして使用するDNA断片は、マウスCCR8遺伝子のORFの上流下流それぞれ約2kb(キロベース)のマウスゲノム配列をPCR増幅することにより取得し、マウス由来のゲノム配列はORFのみが取り除かれるように設計した。先のヒトCCR8遺伝子のORF全長配列の前後に相同組換えアームをそれぞれ継ぎ目なく接続することでターゲティングベクターを作製し、相同組換えに供し、hCCR8−KI(KI/+)Balb/cマウスを作製した。作製したhCCR8−KI(KI/+)Balb/cマウスについては、マウスCCR8遺伝子のORF全長とヒトCCR8遺伝子のORF全長が正しく置き換わっており、かつ、余計な配列の挿入や欠失がないことをPCR及びDNA塩基配列解析により確認した。hCCR8−KI(KI/+)Balb/cマウスを通常交配で掛け合わせることでhCCR8−KI(KI/KI)マウスを作製した。
hCCR8−KI(KI/KI)マウス(6週齢、メス)の背部皮内に3.5x105個(50μL)のCT26細胞を移植し、移植17日目に、5例の個体より腫瘍を回収した(N=5)。CT26細胞の腫瘍塊を、ハサミで細かく切断し、市販キット(Tumor Dissociation Kit, mouse, Miltenyi社及びThe gentleMACS(TM) Dissociator, Miltenyi社)を用いて添付キットプロトコルに従い、腫瘍浸潤細胞を調製した。
調製された細胞は70umのセルストレイナーに通した後、2回10mM HEPES/HBSS/2%FBSで洗浄した。その後、赤血球溶解液(BD Biosciences社)で5分間処理し、赤血球を除去し、さらに2%FBS/10mM HEPES/HBSSバッファーで2回洗浄した。腫瘍浸潤細胞は以下の方法及び抗体により染色した。
浸潤細胞をZombie NIR Fixable Viability Kit(BioLegend)試薬を用いて、30分間氷中で染色した。2%FBS/10mM HEPES/HBSSで1回洗浄後、Bv510標識抗マウスCD45(30-F11、Biolegend)、 FITC標識抗マウスCD4(RM4-4、BioLegend)、PE/Cy7標識抗マウスCD8(53−6.7、BioLegend)、PerCP/Cy5.5標識抗マウスTCRβ(H57−597、BioLegend)、PE標識抗マウスCD25(PC61、BioLegend)、BV421標識抗ヒトCCR8抗体(433H、BD Biosciences)(又はBV421標識アイソタイプコントロール抗体)で染色した。染色は30分間氷中で実施した。2%FBS/HEPES/HBSSで2回洗浄後、フローサイトメーターを用いて細胞を解析した。
CD45+TCRβ+CD4+CD25+T細胞中のヒトCCR8発現を解析した。アイソタイプコントロール抗体での染色により陰性細胞領域を決定し、抗ヒトCCR8抗体で陽性となる細胞をヒトCCR8+細胞として移植17日後に存在頻度を算出した。その結果、マウス腫瘍内のCD45+TCRβ+CD4+CD25+細胞中の約47%にヒトCCR8が検出された。
hCCR8−KI(KI/KI)マウス(8週齢、メス)の背部皮内に4x105個の大腸癌由来CT26細胞(50uL)を移植した。腫瘍移植4日目及び11日目にヒト化10A11抗体(軽鎖可変領域:IGKV4−1 N53Q+G29R(配列番号59)/重鎖可変領域:IGHV3−15 T94R(配列番号41))を静脈内に100μg(100μL)又は200μg(100μL)投与した(N=10)。コントロールは媒体(りん酸緩衝生理食塩水)100μLを投与した(N=10)。腫瘍移植4、7、10、11、14、16、18、21、24日後に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(mm3)は長径(mm)x短径(mm)x短径(mm)/2で計量した。
その結果、移植11日目、14日目、16日目、18日目、21日目、24日目においていずれの用量の抗ヒトCCR8抗体投与群の腫瘍体積が有意に小さかった(図8、有意水準はWelch‘s t testを用い、いずれの用量においても10日目が**;p<0.01、11日目以降が、***;p<0.001)。また抗ヒトCCR8抗体投与群では、完全退縮を示す個体が出現し、24日目には100μg抗ヒトCCR8抗体投与群で10匹中5匹、200μg抗ヒトCCR8抗体投与群で10匹中6匹のマウスの腫瘍がほぼ完全に消失した。
ヒト化10A11抗体(軽鎖可変領域:IGKV4−1/重鎖可変領域:IGHV3−15 T94R)を用い、hCCR8との結合において、これと競合する抗体のスクリーニングを実施した。
実施例1に記載の方法と同様の方法で、ヒトCCR8(UniProtKB/Swiss−Prot:P51685)の全長をコードする遺伝子を抗原とし、A/J Jms Slc雌性マウスにDNA免疫してハイブリドーマを作製した。作製したハイブリドーマを96well plateに播種し、9日間培養後得られた培養上清のうち176wellについて、ヒト化10A11抗体との競合結合試験を実施した。競合試験は、実施例1の方法で作製したヒトCCR8発現Expi293細胞に対し、培養上清を10nMのヒト化10A11抗体もしくは、isotype controlと混合して、室温で3時間反応させ、PBSで3回洗浄したのちにAlexa488標識抗マウスIgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で検出することにより行った。Isotype controlの共存下、ハイブリドーマ由来抗体の結合が確認できたものを通常のヒトCCR8結合抗体であると定義した。またヒトCCR8結合抗体のうち、ヒト化10A11抗体の共存下では結合シグナルが顕著に低下する抗体をヒト化10A11抗体と競合する抗体として同定した。その結果、170well中56wellがヒトCCR8結合抗体であった。一方この56well中、7wellがヒト化10A11抗体と競合する抗体であった。
さらに、競合する抗体として同定したもののうち、代表して3クローンをクローン化し、クローン化後のハイブリドーマ培養上清より精製抗体を得た。この精製抗体についてヒトCCL1−ヒトCCR8に対する中和活性を実施例1の方法により測定した。その結果いずれの抗体も中和活性を有しており(表14)、ヒト化10A11抗体と競合する抗体が強い中和抗体であることが示された。
実施例3に記載の内容と同様、ヒト化10A11抗体、ヒト化19D7抗体について、エピトープ検証を実施した。実施例3で作製した、ヒトCCR4のキメラ体、ヒトCCR8N末領域の点変異体に加え、ヒトCCR8 loop1、loop2領域の点変異体についても結合評価を実施した。結合評価は各変異体をExpi293細胞に一過性発現させ、ヒト化10A11抗体(軽鎖可変領域:IGKV4−1/重鎖可変領域:IGHV3−15 T94R)又はヒト化19D7抗体(軽鎖可変領域:IGKV3−20/重鎖可変領域:IGHV3−15 T94R)を20μg/mLから3倍ずつ8段階希釈調製した抗体溶液を反応させることにより実施した。室温で3時間反応させたのちにAlexa488標識anti−human IgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)と反応させ、フローサイトメトリー解析を実施した。また各変異体の発現量は各変異体のN末にタグを付与し、同様の方法で抗タグ抗体により検出することで、補正した。
結果を表15および16に示す。ヒトCCR8と比較して、その結合活性が70%以下になる変異体を△、20%以下になる変異体を×と示した。
Claims (21)
- 1)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号5のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域
(ここで、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換;
2)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
3)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号9のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号11のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;
(ここで、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の2番目のセリンがトレオニンに置換、
B)配列番号2のアミノ酸配列の3番目のセリンがトレオニンに置換、
C)配列番号2のアミノ酸配列の5番目のセリンがトレオニンに置換、
D)配列番号10のアミノ酸配列の2番目のグルタミンがアスパラギンに置換、
E)配列番号8のアミノ酸配列の1番目のトレオニンがセリンに置換、
F)配列番号6のアミノ酸配列の14番目のアラニンがバリンに置換、
G)配列番号6のアミノ酸配列の18番目のリジンがアルギニンに置換、
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
I)配列番号11のアミノ酸配列の5番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号11のアミノ酸配列の12番目のチロシンがフェニルアラニンに置換);
4)配列番号14のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号15のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号16のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号17のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号18のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号19のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域;若しくは
5)配列番号20のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号21のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号22のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号23のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号24のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号25のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域
を含む、CCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。 - 配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号3のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号4のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号5のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号7のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
請求項1記載の抗体又はその抗体断片。 - 配列番号3のアミノ酸配列の4番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い、
A)配列番号2のアミノ酸配列の10番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の11番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換、
請求項2記載の抗体又はその抗体断片。 - 配列番号2のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号9のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号10のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号8のアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号6のアミノ酸配列からなるCDR2及び
配列番号11のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号2のアミノ酸配列の2番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号2のアミノ酸配列の3番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号2のアミノ酸配列の5番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号10のアミノ酸配列の2番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号8のアミノ酸配列の1番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号6のアミノ酸配列の14番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号6のアミノ酸配列の18番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号6のアミノ酸配列の19番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号11のアミノ酸配列の5番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号11のアミノ酸配列の12番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
請求項1記載の抗体又はその抗体断片。 - ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
- 1)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
2)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
3)配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
4)配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
5)配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
6)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
7)配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
8)配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
9)配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
10)配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
11)配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;若しくは
12)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含む、
以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換;請求項5記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。 - 配列番号40又は42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換;
C)配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
請求項6記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。 - 配列番号40又は42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
配列番号40又は42のアミノ酸配列の58番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い、
A)配列番号40又は42のアミノ酸配列の33番目のアスパラギンがリジンに置換;
B)配列番号40又は42のアミノ酸配列の34番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換、
請求項7記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。 - 1)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
2)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
3)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
4)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
5)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;
6)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、以下のいずれかの置換を1以上有していても良い、
A)配列番号56のアミノ酸配列の25番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号56のアミノ酸配列の26番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号56のアミノ酸配列の28番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号56のアミノ酸配列の95番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号57のアミノ酸配列の31番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号57のアミノ酸配列の63番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号57のアミノ酸配列の67番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号57のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号57のアミノ酸配列の99番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号57のアミノ酸配列の105番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
請求項5記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。 - 配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、以下のいずれかの置換を1以上有する、
A)配列番号56のアミノ酸配列の25番目のセリンがトレオニンに置換;
B)配列番号56のアミノ酸配列の26番目のセリンがトレオニンに置換;
C)配列番号56のアミノ酸配列の28番目のセリンがトレオニンに置換;
D)配列番号56のアミノ酸配列の95番目のグルタミンがアスパラギンに置換;
E)配列番号57のアミノ酸配列の31番目のトレオニンがセリンに置換;
F)配列番号57のアミノ酸配列の63番目のアラニンがバリンに置換;
G)配列番号57のアミノ酸配列の67番目のリジンがアルギニンに置換;
H)配列番号57のアミノ酸配列の68番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換;
I)配列番号57のアミノ酸配列の99番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
J)配列番号57のアミノ酸配列の105番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
請求項9記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。 - さらに、配列番号52のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域、及び、
配列番号53のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有し、
配列番号53のC末端にリジンが付加していてもしていなくてもよい、請求項5〜10のいずれかに記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。 - 請求項1〜11のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
- CCR8とCCR8リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、請求項1〜11のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
- 中和抗体として用いる、請求項1〜11のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の17位のチロシンを認識するために用いる、請求項1〜11のいずれかに記載のCCR8に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
- CCR8とCCR8リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、請求項15記載の医薬組成物。
- 抗体がADCC活性を有するものである、請求項12〜16のいずれかに記載の医薬組成物。
- 抗体がIgG抗体である、請求項12〜16のいずれかに記載の医薬組成物。
- 癌を治療するために用いる、請求項12〜18のいずれかに記載の医薬組成物。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項20記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
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