KR20140004632A - DCC의 제 5 피브로넥틴 유형 III 도메인의 재조합 Fc-융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DCC-융합 단백질, DCC-융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및 그의 제조 방법 및 대장암, NSCLC 및 전이성 유방암과 같은 암의 치료에 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DCC-융합 단백질을 투여함으로써 대장암, NSCLC 및 전이성 유방암과 같은 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 대장암 결실부(Deleted in Colorectal Cancer, DCC)의 제 5 피브로넥틴 도메인(5-피브로넥틴 도메인) 및 항체 Fc 부분을 포함하는 DCC-융합 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자 및 암을 치료하기 위한 그의 제조 및 용도에 관한 것이다.
네트린(netrin)-1은 네트린 부류의 구성원이며, 유인성 및 반발성 맥락 둘 다에서 축색돌기 안내 신호(axon navigation cue)를 나타내고, 신경계 발생에서 중요한 역할을 한다(문헌 [Serafini, Cell 87:1001-1014 (1996)]). 네트린-1에 대한 주요 수용체는 DCC(대장암 결실부) 및 UNC5H(UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3)로, 이들은 모두 소위 의존성 수용체 부류에 속한다(문헌 [Keino-Masu, Cell 87:175-185 (1996); Ackermann, Nature 386:838-842 (1997); Hong, Cell 97:927-941 (1999); Mehlen, Nature 395:801-804 (1998)]). 의존성 수용체들은 그 각각의 리간드의 부재하에 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 능력을 공유하며, 이때 상기 능력은 각각의 리간드의 결합시 차단된다(문헌 [Mehlen, Cell Mol Life Sci 61:1854-1866 (2004); Bredesen, Cell Death Differ 12:1031-1043 (2005)]).
다양한 인간 암에서, DCC 발현의 감소 또는 소실 및 따라서, DCC-유도된 세포자멸의 감소 또는 소실이 관찰되었다(문헌 [Kinzler, Proc Natl Acad Sci 100:4173-4178 (1996)]). 또한, UNC5H 유전자도 또한 대부분의 대장 종양에서 하향조절되는 것으로 관찰되어, 의존성 수용체 UNC5H의 소실이 종양 세포의 선택적 이점을 나타냄을 시사한다(문헌 [Bernet, Gastroenterology 133:1840-1848 (2007); Shin, Gastroenterology 133:1849-1857 (2007)]). 그러나, 의존성 수용체 DCC 및 UNC5H의 하향조절은 다양한 종양 세포의 생존을 증대시킬 뿐 아니라, 그의 리간드 네트린-1의 자가분비(autocrine) 발현이 관찰되었다. 특히, 대부분의 유방 종양, 즉, 전이성 유방암은 네트린-1의 증가된 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다[Fitamant, Proc Natl Acad Sci 105:4850-4855 (2008)]. 지금까지, DCC의 세포외 부분의 어느 서브도메인(subdomain)이 네트린-1의 결합을 담당하는지는 아직 명확하지 않다. 그런 맥락에서 2개의 서브도메인, 즉 제 5 피브로넥틴-유형 III 도메인(문헌 [Geisbrecht, J Biol Chem 278:32561-32568 (2003)]) 및 제 4 피브로넥틴-유형 III 도메인(문헌 [Kruger, J Neurosci 24:10826-10834 (2004)])이 논의되었다.
앞에서 보았듯이, 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 갖는 DCC-5-피브로넥틴 융합 단백질(네트린-1 유인 단백질로도 작용함; 본원에서 DCC-5Fbn-GST로도 지칭됨)에 의한 네트린-1의 중화는 의존성 수용체 DCC 및 UNC5H를 발현하는 종양세포에서 세포자멸을 유도할 수 있다(EP-A1-1989546 호). FLAG-표지된 DCC-5-피브로넥틴 융합 단백질(DCC-5Fbn-GST)은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 재조합적으로 제조될 수 있으며, 2주의 기간동안 유방암 세포의 폐로의 전이를 감소시킬 수 있다(문헌 [Fitamant, Proc Natl Acad Sci 105:4850-4855 (2008)]). 또한, DCC-5Fbn-GST는 높은 수준의 네트린-1을 발현하는 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 세포주의 세포 사멸 비율을 증가시키는 것으로 나타났다(문헌 [Delloye-Bourgeois, J Natl Cancer Inst 101:237-247 (2009)]).
그러나, DCC-5Fbn-GST는 여전히 여러 약점을 가지며, 효과적이기 위해 종양내로 주사되어야만 한다. 이것은 아마도 낮은 혈장 반감기 및 빠른 분비와 같은 불리한 약리학적 성질에 기인한다. 따라서, 감소되거나 소실된 의존성 수용체-유도성 세포자멸과 관련된 암성 질환을 치료하기에 적합한 보다 효과적인 화합물에 대한 요구가 존재한다.
상기 기술적 문제는 본원에 제공된 태양들 및 특허청구범위에 제공된 해결책들에 의해 해결되었다.
본 발명은 대장암 결실부(DCC)의 제 5 피브로넥틴 도메인(5-피브로넥틴 도메인: Fn5) 및 항체 Fc-부분, 특히 인간 IgG1의 Fc를 포함하는 DCC-융합 단백질(본원에서 Fn5-Fc 융합 단백질로도 지칭됨)에 관한 것이다. 놀랍게도 본 발명에서 밝혀진 바와 같이, DCC의 제 5의 피브로넥틴-유형 III 도메인에 대한 인간 IgG1 분자의 Fc-부분의 C-말단 융합은, 선행 기술의 DCC-융합 단백질에 비해 DCC-융합 단백질의 약리학적 성질들의 개선을 유도한다. 특히, 본원에 제공된 DCC-융합 단백질은 DCC-5Fbn-GST 단백질에 비해 네트린-1에 대해 증가된 친화도를 나타낸다.
또한, 본원에서 상술하고 예시한 바와 같이, 본 발명의 DCC-융합 단백질은 일시적 발현시 HEK 293 세포에서 높은 효율하에 생성될 수 있다(>80 mg/l). 또한, 본 발명의 DCC-융합 단백질은 DCC의 제 5 피브로넥틴 유형 III-도메인의 적절한 폴딩(folding)을 가능하게 하여, DCC-5Fbn에 비해 네트린-1에 대한 DCC-융합 단백질의 보다 우수한 결합을 제공한다(본 발명의 DCC-융합 단백질의 KD는 DCC-5Fbn-GST 융합 단백질에 대해서보다 2배이상 더 낮다(문헌 [Keino-Masu, Cell 87(2):175-185 (1996)] 참조).
일반적으로, 본 발명에서 제공되는 DCC-융합 단백질은 DCC의 제 5 피브로넥틴 도메인(5-피브로넥틴 도메인 또는 Fn5-도메인으로도 지칭됨) 및 인간 IgG1의 Fc-부분을 포함하는 결합 분자이다. 특히, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 서열번호 2의 아미노산 1 내지 19는 단일 펩티드 서열을 나타낸다. 서열번호 2의 아미노산 20 내지 353 및 서열번호 3은 성숙 DCC-융합 단백질을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DCC-융합 단백질(Fn5 변이체 1로도 지칭됨)에 관한 것이다. 서열번호 2의 아미노산 20 및 21, 및 서열번호 3의 아미노산 1 및 2는 Fn-5 도메인의 인접 천연 아미노산을 나타낸다. 서열번호 2의 아미노산 22 내지 118, 및 서열번호 3의 아미노산 3 내지 99는 DCC의 제 5 피브로넥틴 도메인(5-피브로넥틴 도메인 또는 Fn5-도메인)을 나타낸다. 서열번호 2의 아미노산 119 내지 122, 및 서열번호 3의 아미노산 100 내지 103은 Fn-5 도메인의 인접 천연 아미노산을 나타낸다. 서열번호 2의 아미노산 123 내지 252, 및 서열번호 3의 아미노산 104 내지 233은 인간 IgG1 Fc-부분을 나타낸다.
본원에 기술되고 예시된 바와 같이, 본 발명의 DCC-융합 단백질은 네트린-1에 대한 높은 결합 친화도를 갖는다. 따라서, 본 발명의 DCC-융합 단백질은 네트린-1과 결합하는 유인 분자로서 작용할 수 있으므로, 네트린-1과 네트린-1 수용체, 예를 들면, DCC 및 UNC5H(UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3)의 상호작용을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 의약품으로 사용하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 바람직하게, 치료될 암은, 암 세포가 표면상에서 의존성 수용체 DCC 및/또는 UNC5H를 발현시키거나, 또는 DCC(대장암 결실부) 유전자 발현[http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터의 유전자 ID 1630(2010년 8월 10일에 업데이트된 바와 같음)/DCC 단백질을 암호화하는 유전자(유니프롯(UniProt) ID/버전: P43146(2010년 5월 18일의 서열 버전 2, 2010년 8월 10일의 파일 버전 109)], 및/또는 UNC5H1(UNC5A) 유전자 발현(유전자 ID 90249(2010년 6월 26일자로 업데이트된 바와 같음)), 및/또는 UNC5H2(UNC5B) 유전자 발현(유전자 ID 219699(2010년 7월 2일자로 업데이트된 바와 같음)), 및/또는 UNC5H3(UNC5C) 유전자 발현(유전자 ID 8633(2010년 8월 7일자로 업데이트된 바와 같음), 및/또는 UNC5H4(UNC5D) 유전자 발현(http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터의 유전자 ID 137970(2010년 7월 2일자로 업데이트된 바와 같음)/UNC-5 동족 단백질을 암호화하는 유전자[유니프롯 ID/버전: Q6ZN44(엔트리 버전 74, 서열 버전 3), O08722(엔트리 버전 75, 서열 버전 1), O08747(엔트리 버전 79, 서열 버전 1) 및 Q6UXZ4(엔트리 버전 69, 서열 버전 1)]의 의미있는 상향조절을 나타내는 것을 특징으로 한다. 해당 세포가 표면상에서 의존성 수용체 DCC 및/또는 UNC5H를 발현하거나 또는 유전자 발현의 의미있는 상향조절을 나타내는지 여부를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 다음을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다: IHC(immunohistochemistry, 면역조직화학) 또는 FACS(Fluorescence activated cell sorting, 형광 활성화 세포 분류), 정량적 PCR(예를 들면, 6량체 프라이밍된 cDNA 사용) 또는 대안적으로 염색체 염료-기본 단백질 검출 기술(예를 들면, 은 또는 쿠마시 블루 염색)과 병행되는 웨스턴 블롯(Western Blot), 또는 용액중 및 겔, 블롯 및 미세배열 상의 단백질에 대한 형광- 및 발광-기본 검출 방법, 예를 들면, 면역염색 뿐 아니라, 면역침전, ELISA, 미세배열 및 질량 분석법. 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 DCC-융합 단백질에 의해 치료될 암에 대한 예는 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 기관지폐포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계(CNS)암, 척추 종양, 뇌간교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프구성 백혈병, 및 임의의 상기 암들의 난치성 버전, 또는 상기 암들의 하나 이상의 조합이다. 본 발명의 DCC-융합 단백질에 의해 치료될 암의 특정 예는 대장암, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 전이성 유방암이다.
따라서, 본 발명은 암을 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 암을 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 대장암을 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 NSCLC를 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 대장암을 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 NSCLC를 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 기술되고 제공된 DCC-융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자에 관한 것이다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 ORF를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자에 관한 것이다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 ORF를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공되고 기술된 바와 같은 DCC-융합 단백질의 도메인 구성을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 DCC-융합 단백질(Fn5-Fe; 도 1에 도시된 바와 같음) 발현 벡터 7800의 플라스미드 지도이다.
도 3은 본 발명에서 제공되고 기술된 바와 같은 DCC-융합 단백질(서열번호 3)의 닭 네트린-1에 대한 결합의 비아코어(BIAcore) 분석 결과이다. Fn5 변이체 1은 아민 커플링된 포획 분자에 의해 칩 표면상에 포획되었다. 일련의 증가하는 농도의 닭 네트린-1을 주사하고, 동적 결합 양태를 플라즈마 표면 공명 변화로 모니터링하였다. 대조군 칩에 대한 상대 단위(RU)로서의 상기 변화는 시간(x-축) 경과에 따라 y-축 상에 기록하였다.
도 4는 H358 세포를 사용한 카스파제(caspase)-3 활성화 분석 결과이다. 상이하게 처리된 세포의 용해물에서의 카스파제-3 활성을 완충액-처리된 대조군 세포(ctrl)로 표준화된 상대 단위로서 그래프로 나타낸다. 양성 대조군으로서, 세포를 DCC의 전체 세포외 도메인(DCC ECD)을 포함하는 Fc 융합 단백질로 처리하였다. 카스파제 활성에서의 동일한 최대 증가는 ≥2 ㎍/ml의 농도에서 Fn5 변이체 1 융합 단백질에 의해 유도될 수 있다. 과량의 재조합 네트린-1의 첨가는 10 ㎍/ml의 Fn5 변이체 1에 의한 카스파제-3 활성화를 둔화시킨다.
도 5는 H358 및 A549 이종이식편의 생체내 종양 성장 억제 결과이다. 누드 마우스에서 H358(상단 그래프) 및 A549(하단 그래프) 폐암 세포의 피하 이종이식편의 종양 성장. 캘리퍼 측정에 의해 측정된 종양 부피(mm3)(y-축)를 시간(제 0 일 = 접종일)(x-축) 경과에 따라 그래프로 나타내었다. 치료는 약 100 mm3 평균 종양 크기에서 시작되었다.
상단 그래프: 비히클-처리 동물(다이아몬드 부호)은 20 mg/kg의 Fn5 변이체 1 융합 단백질로 1주일에 1회 복강내 처리된 동물(사각형 부호)보다 더 빠른 H358 종양 세포 성장을 나타낸다. 시간 축 상의 화살표는 매주 처리를 나타낸다. 하단 그래프: 비히클-처리 동물(다이아몬드 부호)은 20 mg/kg의 Fn5 변이체 1 융합 단백질로 1주일에 2 복강내 처리된 동물(삼각형 부호)보다 더 빠른 A549 종양 세포 성장을 나타낸다. 동일 용량에서 1주일에 1회 처리는 중간 종양 성장(사각형 부호)을 야기하였다. "트랩(trap)"은 변이체 1 융합 단백질(서열번호 3)을 의미한다.
도 2는 DCC-융합 단백질(Fn5-Fe; 도 1에 도시된 바와 같음) 발현 벡터 7800의 플라스미드 지도이다.
도 3은 본 발명에서 제공되고 기술된 바와 같은 DCC-융합 단백질(서열번호 3)의 닭 네트린-1에 대한 결합의 비아코어(BIAcore) 분석 결과이다. Fn5 변이체 1은 아민 커플링된 포획 분자에 의해 칩 표면상에 포획되었다. 일련의 증가하는 농도의 닭 네트린-1을 주사하고, 동적 결합 양태를 플라즈마 표면 공명 변화로 모니터링하였다. 대조군 칩에 대한 상대 단위(RU)로서의 상기 변화는 시간(x-축) 경과에 따라 y-축 상에 기록하였다.
도 4는 H358 세포를 사용한 카스파제(caspase)-3 활성화 분석 결과이다. 상이하게 처리된 세포의 용해물에서의 카스파제-3 활성을 완충액-처리된 대조군 세포(ctrl)로 표준화된 상대 단위로서 그래프로 나타낸다. 양성 대조군으로서, 세포를 DCC의 전체 세포외 도메인(DCC ECD)을 포함하는 Fc 융합 단백질로 처리하였다. 카스파제 활성에서의 동일한 최대 증가는 ≥2 ㎍/ml의 농도에서 Fn5 변이체 1 융합 단백질에 의해 유도될 수 있다. 과량의 재조합 네트린-1의 첨가는 10 ㎍/ml의 Fn5 변이체 1에 의한 카스파제-3 활성화를 둔화시킨다.
도 5는 H358 및 A549 이종이식편의 생체내 종양 성장 억제 결과이다. 누드 마우스에서 H358(상단 그래프) 및 A549(하단 그래프) 폐암 세포의 피하 이종이식편의 종양 성장. 캘리퍼 측정에 의해 측정된 종양 부피(mm3)(y-축)를 시간(제 0 일 = 접종일)(x-축) 경과에 따라 그래프로 나타내었다. 치료는 약 100 mm3 평균 종양 크기에서 시작되었다.
상단 그래프: 비히클-처리 동물(다이아몬드 부호)은 20 mg/kg의 Fn5 변이체 1 융합 단백질로 1주일에 1회 복강내 처리된 동물(사각형 부호)보다 더 빠른 H358 종양 세포 성장을 나타낸다. 시간 축 상의 화살표는 매주 처리를 나타낸다. 하단 그래프: 비히클-처리 동물(다이아몬드 부호)은 20 mg/kg의 Fn5 변이체 1 융합 단백질로 1주일에 2 복강내 처리된 동물(삼각형 부호)보다 더 빠른 A549 종양 세포 성장을 나타낸다. 동일 용량에서 1주일에 1회 처리는 중간 종양 성장(사각형 부호)을 야기하였다. "트랩(trap)"은 변이체 1 융합 단백질(서열번호 3)을 의미한다.
본 발명의 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들은 또한 핵산 유사체, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 티오포스페이트, 치환된 리보-올리고뉴클레오티드, LNA 분자, PNA 분자, GNA(글리콜 핵산) 분자, TNA(트레오스 핵산) 분자, 모폴리노 폴리뉴클레오티드 또는 안타고미어(antagomir)(콜레스테롤-접합) 핵산 분자 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 그의 임의의 변형체일 수 있다(예를 들면, 변형체의 예에 대해 US 5,525 711 호, US 4,711,955 호, US 5,792,608 호 또는 EP 302175 호 참조). 본 발명의 맥락에서 핵산 분자는 천연 핵산 잔기 또는 인공적으로 생성된 핵산 잔기일 수 있다. 핵산 잔기에 대한 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T), 우라실(U), 잔틴(X) 및 하이포잔틴(HX)이다. 본 발명의 맥락에서, 티민(T) 및 우라실(U)은 핵산 분자의 각각의 유형에 따라 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 숙련된 자라면 잘 인지하듯이, DNA의 일부로서 티민(T)은 상응하는 전사된 mRNA의 일부로서 우라실(U)에 상응한다. 본 발명의 핵산 분자는 단일- 또는 이중-가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성일 수 있으며, 달리 언급되지 않는다면 임의의 크기 제한이 없다. 핵산 분자는 또한 본원 하기에서 더 상술하는 바와 같은 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 동종 또는 이종일 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 상기 프로모터의 조절하에 있다.
일반적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에 제공된 서열의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 벡터내에 클로닝될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 및 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 말한다. 바람직한 태양에서, 상기 벡터는 세포, 진균 세포와 같은 진핵 세포, 효모와 같은 미생물의 세포 또는 원핵 세포의 형질전환에 적합하다. 특히 바람직한 태양에서, 상기 벡터는, 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자를 전사시키기 위한, 세균 세포의 안정한 형질전환에 적합하다. 예를 들면, 벡터는 도 2에 나타내도 본원 실시예 1에 기술된 바와 같은 pUC18 또는 7800일 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 pUC18 또는 7800과 같은 벡터에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 pUC18 또는 7800과 같은 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 pUC18 또는 7800과 같은 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는 pUC18 또는 7800과 같은 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1740의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는 pUC18 또는 7800과 같은 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1740의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는 pUC18 또는 7800과 같은 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 벡터는 진핵 숙주 세포에서 상기 핵산 분자를 발현시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 제공된 바와 같은 벡터는 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 문헌에 광범위하게 기술되었다. 대체로, 상기 벡터들은 선택된 숙주내에 선택 마커 유전자 및 복제를 보장하는 복제-기원 뿐 아니라, 프로모터, 및 대부분의 경우에, 전사를 위한 종결 신호를 함유할 수 있다. 프로모터와 종결 신호 사이에, 바람직하게는 발현되길 목적하는 핵산 서열/분자의 삽입을 가능하게 하는 하나 이상의 제한효소 부위 또는 폴리링커가 존재한다.
본원에 제공된 벡터가 본 발명의 맥락에서, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 DCC-융합 단백질의 발현에 사용되기에 적합한 프로모터를 이미 포함하는 선행 기술에서 공지된 발현 벡터의 이점을 취하여 제작된 경우, 핵산 분자는, 생성된 벡터가 바람직하게는 본 발명의 맥락에서 사용되기에 적합한 단 1개의 프로모터를 포함하는 방식으로 벡터내에 삽입되는 것으로 생각된다. 프로모터는 일반적으로 이종 또는 동종일 수 있다. 본원에 기술된 벡터는 또한 하나보다 많은 프로모터를 포함할 수 있으며, 각각의 프로모터는 이종 또는 동종일 수 있다. 숙련된 자는 상기 삽입을 실행할 수 있는 방법을 인지한다. 예를 들면, 프로모터를 핵산 구조물 또는 발혁 벡터로부터 절제한 후 접합시킬 수 있다.
본 발명에 따른 단백질은 바람직하게는 재조합 방법에 의해 생성된다. 바람직하게, 단백질 발현은 폴리펩티드의 후속 분리 및 통상적으로 약학적으로 허용되는 순도로의 정제하에 진핵 세포에서 이루어진다. 단백질 발현을 위해, 그 단백질을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터내에 삽입한다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포와 같은 적절한 안정한 진핵 숙주 세포에서 수행되며, 단백질을 세포(상등액 또는 용해후 세포)로부터 회수한다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 핵산 분자, 및/또는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드가 클로닝되는 벡터는 형질도입되거나, 형질전환되거나, 형질감염되거나, 또는 숙주 세포내에 도입될 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포, 바람직하게는 진핵 세포이다. 비-제한 예로서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 본원에 기술된 숙주 세포는 본 발명에서 기술되고 제공된 DCC-융합 단백질을 생성하는데 특히 유용한 것이다.
일반적으로, 전술한 숙주 세포는 본 발명에서 제공된 핵산 분자(예를 들면, 서열번호 1의 서열, 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074를 포함하거나 또는 이들로 이루어진) 또는 본원에 기술된 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포, 바람직하게는 진핵 세포, 또는 상기 세포로부터 유도되고 본원에 기술된 핵산 분자 또는 벡터를 함유하는 세포일 수 있다. 바람직한 태양에서, 숙주 세포는 게놈에 통합된 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자 또는 본원에 기술된 벡터를 포함한다, 즉, 이들에 의해 유전적으로 변형된다. 예를 들면, 본원에 기술된 상기 숙주 세포는 인간, 효모 또는 진균 세포일 수 있다. 한 특정 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 전사할 있다. 본원에 기술된 숙주 세포를 제조하기 위해 사용될 상이한 상응하는 발현 시스템의 예에 대한 개관은, 예를 들면, 문헌 [Methods in Enzymology 153, 385-516 (1987); Bitter, Methods in Enzymology 153, 516-544 (1987); Sawers, Applied Microbiology and Biotechnology 46, 1-9 (1996); Billman-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology 7, 500-504 (1996); Hockney, Trends in Biotechnology 12, 456-463 (1994); and Griffiths, Methods in Molecular Biology 75, 427-440 (1997)]에 포함되어 있다. 본 발명의 핵산 분자 또는 본원에 기술된 벡터를 사용한 숙주 세포의 형질전환 또는 유전 공학처리는, 예를 들면, 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA (2001); Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)]에 기술된 바와 같은 표준 방법에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 본원에 제공된 핵산 분자 또는 본원에 기술된 벡터를 포함하는 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일(Freestyle) 세포(인간 배아 신장 세포주 293, 인비트로겐(Invitrogen))일 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는, 본원에 기술되고 제공된 바와 같은 pUC18 또는 7800과 같은 벡터를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는, 본원에 기술되고 제공된 바와 같은 pUC18 또는 7800과 같은 벡터를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는, 본원에 기술되고 제공된 바와 같은 pUC18 또는 7800과 같은 벡터를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는, 본원에 기술되고 제공된 바와 같은 pUC18 또는 7800과 같은 벡터를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는, 본원에 기술되고 제공된 바와 같은 pUC18 또는 7800과 같은 벡터를 포함하는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 제공되고 기술된 바와 같은 핵산 분자를 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 DCC-융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 제공되고 기술된 바와 같은 DCC-융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포(예를 들면, HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포)에서 발현시키고 상기 세포 또는 세포 상등액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포(예를 들면, HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포)에서 발현시키고 상기 세포 또는 세포 상등액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 본원에 제공되거나 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 DCC-융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께, 의약품으로 사용하기 위한 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함하고 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 적합한 약학적 담체의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예를 들면, 오일/물 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균액 등이 포함된다. 상기 담체를 포함하는 약학 조성물은 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 상기 약학 조성물은 대상에게 적합한 용량으로, 즉, 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암이 치료되어야 하는 대상의 체중 kg 당 1 mg 이상, 예를 들면, 약 10 내지 약 100 mg/체중 kg으로 투여될 수 있다. 조성물의 투여는 상이한 방법들, 예를 들면, 장내, 경구(예를 들면, 환제, 정제, 구강정, 설하정, 붕해정, 캡슐, 박막, 액상 용액 또는 현탁액, 분말, 고체 결정 또는 액체), 직장(예를 들면, 좌약, 관장제), 주사에 의해(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 피내), 흡입에 의해(예를 들면, 기관지내), 국소, 질, 경피(epicutaneously) 또는 비강내로 수행되거나 투여될 수 있다. 투여법은 주치의 및 임상 요인들에 의해 결정된다. 의료 분야에서 공지되어 있듯이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강상태 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하여 많은 요인들에 따라 달라진다. 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 및/또는 숙주 세포 및 선택적으로 본원에 기술된 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 조성물 및 약학 조성물은 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 정맥내 또는 피하 투여이다. 상기 조성물 및 약학 조성물은 또한, 예를 들면, 내부 또는 외부 목표 부위로 바이오리스틱(biolistic) 전달에 의해 또는 동맥내 부위로 카테터에 의해, 목표 부위에 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올리에이트와 같은 주입가능한 유기 에스터이다. 수성 담체로는 식염수 및 완충 배지를 포함하여, 물, 알콜성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거(Ringer) 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액, 또는 불활성 오일(fixed oil)이 포함된다. 정맥내 비히클로는 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제(예를 들면, 링거 덱스트로스를 기재로 하는 보충제) 등이 포함된다. 방부제, 및 예를 들면, 항균제, 산화방지제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등과 같은 다른 첨가제도 또한 존재할 수 있다. 더욱, 전술한 예시적인 범위 미만 또는 이상의 용량도, 특히 전술한 요일들을 고려하여, 또한 포함된다.
이미 언급한 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 본원에 기술된 조성물은 대상에서 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이미 언급한 바와 같이, 약학 조성물은 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 DCC-융합 단백질 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는 기술된 바와 같은 벡터 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는 본원에 기술된 바와 같은 벡터 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 73 내지 1074의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 핵산 분자를 함유하는 본원에 기술된 바와 같은 벡터 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에서 제공되고 기술된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터를 함유하는 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포 및 전술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 유방암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 DCC-융합 단백질, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기술된 바와 같은 벡터 또는 숙주 세포를 그를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써, 대상에서 암, 특히 대장암, NSCLC 또는 전이성 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 상기 언급된 바와 같은 대상에게 투여될, 본원에 기술되고 제공된 바와 같은 화합물 및 조성물의 투여량은 본원에 명시되고 기술된 바와 같은 각각의 및 모든 약학적 태양 및 사용에 대해 선택될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 맥락에서 치료될 대상은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간이다.
실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
1:
Fn5
-
Fc
융합 단백질
플라스미드 제작
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 목적하는 유전자 절편은 유전자 합성으로 제조하였다. 합성된 유전자 단편들을 명시된 발현 벡터내에 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다.
발현 플라스미드 7800
벡터 7800은, 예를 들면, 인간 DCC(Deleted in Colorectal Cancer) 수용체의 제 5 세포외 피브로넥틴 유형 III 도메인이 임의의 변형 또는 인공적 링커 서열을 도입하지 않고 인간 IgG1 항체의 힌지 영역(Fc 불변 영역; 힌지-CH2-CH3)에 융합된 인공적 Ig Fc 융합 단백질의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드이다(도 2 참조).
1084 bp의 DNA 절편(서열번호 1)을 화학적 유전자 합성 및 목적 DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질)(서열번호 2)의 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF)을 암호화하는 PCR 기술에 의해 제조하였다. DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질)은 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(서열번호 2의 아미노산 1 내지 19); 인간 DCC 수용체의 제 5 세포외 피브로넥틴 유형 III 도메인(서열번호 2의 아미노산 22 내지 118); DCC의 아미노산 843 내지 939; Fn5 도메인의 N-말단(서열번호 2의 아미노산 20 내지 21) 및 C-말단(서열번호 2의 아미노산 119 내지 122)에서 제 5 피브로넥틴 유형 III 도메인(Fn5 도메인)의 인접 천연 아미노산을 포함하는 아미노산 서열: 유니프롯(UniProt) ID: P43146(서열 버전 2); 및 인간 IgG1 항체 Fc 불변 영역(서열번호 2의 아미노산 123 내지 353)으로 이루어진다. Fn5-Fc 발현 카세트의 용이한 제작을 위해, 화학적으로 제조된 DNA 절편을 5'- 및 3'-말단 각각에서 단일 HindIII 및 NheI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 측면배치시킨다. Fn5-Fc 구조 유전자(ORF; 서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074)를 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)로부터의 즉시형 초기(immediate early) 인핸서 및 프로모터, 및 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 부위에 연결시켰다.
DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질)을 위한 발현 카세트 이외에, 플라스미드는 다음을 포함한다:
- 에스케리치아 콜라이에서의 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및
- 에스케리치아 콜라이에서 암피실린 내성을 제공하는 β-락타마제 유전자.
DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질)의 암호화 서열(서열번호 1 참조)의 전사 단위는 하기의 요소들을 포함한다:
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉시형 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 항체 생식선 유전자의 5'-미번역 영역,
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- Fn5-Fc 융합 단백질 암호화 서열(서열번호 1의 뉴클레오티드 16 내지 1074), 및
- 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화("polyA") 신호 서열.
발현 플라스미드 7800의 플라스미드 지도는 도 2에 도시되어 있다. 성숙한 DCC-융합 단백질의 아미노산 서열(즉, 신호 서열 부재)은 서열번호 3(Fn5 변이체 2)에 나타내었다.
벡터 7809는, 서열번호 4에 나타낸 바와 같이 아미노산 위치 107에서 Cys의 Ala로의 치환(서열번호 3에 나타낸 바와 같은 성숙 DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질)과 비교해)을 야기하는, 항체 힌지 불변 영역내에서의 단일 점돌연변이에 의한 7800의 제작에 사용된 DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질; 성숙 단백질에 대한 서열번호 3)과 상이한 Fn5-Fc 융합 단백질 변이체에 대한 발현 플라스미드이다.
실시예
2: 일시적 형질감염 및 발현
실시예 1에 예시된 바와 같은 본 발명에 따른 재조합 단백질을 현탁액에서 성장하는 HEK293-프리스타일 세포(인간 배아 신장 세포주 293, 인비트로겐)의 일시적 형질감염에 의해 수득하였다. 형질감염된 세포를 30 내지 250 ml 배지의 규모로 진탕 플라스크에서 37 ℃에서 8% CO2 하에, 울트라-글루타민(바이오휘태크/론자(Biowhittake/Lonza))이든 또는 L-글루타민(시그마)이든 6 mM 글루타민으로 보충된 F17 배지(깁코(Gibco)) 또는 프리스타일 293 배지(인비트로겐)에서 배양하였다. 형질감염을 위해 펙틴(Fectin)(인비트로겐)을 4:3의 시약(㎕) 대 DNA(㎍)의 비로 사용하였다. 폴리펩티드 함유 세포 배양 상등액을 형질감염 6 내지 8 일후에 수거하였다. 예를 들면, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌 [Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75, 197-203 (2001)]에 제공되어 있다. DCC-융합 단백질(서열번호 3)은 HEK293-프리스타일 세포에서 일시적 발현시 100 mg/L 이상의 비율로 고효율하에 분비될 수 있다.
실시예
3:
SDS
-
PAGE
를 사용한 발현 분석
LDS 샘플 완충액, 4배 농축액(4xLDS): 4 g 글리세롤, 0.682 g 트리스(TRIS)(트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄), 0.666 g 트리스-HCl(트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄-하이드로클로라이드), 0.8 g LDS(리튬 도데실 설페이트), 0.006 g EDTA(에틸렌 다이아민 테트라산), 물 중 서바 블루(Serva Blue) G250의 1 중량%(w/w) 용액 0.75 ml, 페놀 레드의 1 중량%(w/w) 용액 0.75 ml에 10 ml의 총 부피를 만들기 위한 물을 가한다.
분비된 단백질을 함유하는 배양액을 원심분리하여 세포 및 세포 파편을 제거하였다. 정화된 상등액의 분취량을 1/4 부피(v/v)의 4xLDS 샘플 완충액 및 1/10 부피(v/v)의 0.5 M 1,4-다이티오트레이톨(DTT)과 혼합하였다. 이어서, 샘플을 75 ℃에서 10 분간 배양하고 SDS-PAGE로 단백질을 분리하였다. 뉴페이지(NuPAGE, 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 특히, 10% 뉴페이지(등록상표) 노벡스(Novex, 등록상표) 비스-트리스 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 뉴페이지(등록상표) MES 런닝 완충액을 사용하였다. 성숙 DCC-융합 단백질(Fn5 변이체 1: 서열번호 3; 및 돌연변이 Fn5 변이체 1: 서열번호 4)은 쿠마시 브릴리언트 염료(Coomassie Brilliant Dye)로 염색후 분명하게 검출할 수 있었다. 배양 상등액중 발현 수율은 >100 mg/L이었다. 비교로, Fn5 변이체 2(서열번호 6) 또는 Fn4 + Fn5 변이체 1 및 2(각각 서열번호 5 및 서열번호 7)(플라스미드 7801, 7802 및 7803을 기초로 상기 실시예 1에서 기술된 바와 유사하게 발현됨)를 포함하는 다른 구조물들의 발현 수율은 단지 낮은 발현 수율을 나타내었다. 결과는 표 1에 나타내었다.
| 플라스 미드 번호 |
특징 |
서열 |
MG kDa |
발현수율 ㎍/ml (상등액,6일) |
웨스턴블롯 (상등액) |
웨스턴블롯 (세포) |
| 7800 | Fn5 변이체1 | 서열번호 3 | 37.5 | 118.2-125 | ok | ok |
| 7809 |
돌연변이 Fn5 변이체1; 아미노산위치 107에서 Cys에서 Ala로의 돌연변이 (C107A 돌연변이체) |
서열번호 4 |
37.5 |
134.5 |
ok |
ok |
| 7802 | Fn5 변이체2 | 서열번호 6 | 36.7 | 1.7 | ok | ok |
| 7801 | Fn4+Fn5 변이체1 | 서열번호 5 | 50.4 | 3.8 | ok, 단편 | ok, 단편 |
| 7803 | Fn4+Fn5 변이체2 | 서열번호 7 | 49.7 | 2.2 | ok, 단편 | ok, 단편 |
실시예
4: 친화도 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피에 의한 단백질 정제
단백질 A 친화도 크로마토그래피
발현 및 분비된 폴리펩티드를 단백질 A 친화성 물질 맵셀렉트슈어(MabSelectSure)(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 간략하게, 원심분리(10,000 g, 10 분) 및 0.45 ㎛ 필터를 통한 여과 후에, 폴리펩티드 함유 청정 배양 상등액을 PBS 완충액(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 맵셀렉트슈어 컬럼 상에 적용하였다. 평형화 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 폴리펩티드를 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 3.3)으로 용출시키고, 생성물 함유 분획을 1 M 트리스(pH 9.0)로 중화시켰다. 그런 다음, 4 ℃에서 용액을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCL, pH 6.0 완충액에 대해 투석시키고, 아미콘 센트리콘(Amicon Centricon) 농축 장치로 농축시키고, 추후 공정까지 얼음물 욕조에 저장하였다.
크기 배제 크로마토그래피
폴리펩티드 함유 용액을 동일한 히스티딘 완충액으로 평형화시킨 슈퍼덱스(Superdex)200 고부하 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 분획들을 수거하였다. 모든 분획들을 분석용 SEC(슈퍼덱스200, GE 헬쓰케어)로 분석하고, 순수하게 단량체성인 접합체를 갖는 분획들을 모아서 -80 ℃에서 냉동 저장하였다. 폴리펩티드의 완전성은 환원제의 존재 및 부재하에서의 SDS-PAGE, 및 앞 단락에서 기술한 바와 같은 쿠마시 브릴리언트 블루를 사용한 염색에 의해 분석하였다.
실시예
5: 표면
플라즈몬
공명에 의한 결합 분석
기기: 비아코어(Biacore) T100(GE 헬쓰케어)
소프트웨어: 비아코어 T100 컨트롤, 버전 2.02
비아코어 T100 이밸류에이션, 버전 2.02
분석포맷: 칩: CM5-칩
DCC-융합 단백질(Fn5 변이체 1; 서열번호 3)을 아민 커플링된 포획 분자에 의해 포획하였다. 일련의 증가하는 농도의 네트린-1을 주입하였다. 아민 커플링된 포획 분자 만을 갖는 칩 표면을 가능한 완충액-효과 또는 네트린-1의 비특이적 결합의 보정을 위한 참조 대조군 표면으로 사용하였다.
포획 분자: Fn5 변이체 1에 대해 항-인간 IgG 항체(양으로부터, 잭슨 임뮤노 리서치(Jackson Immuno Research) JIR 109-005-098).
포획 분자의 아민 커플링
제조사의 지시에 따른 표준 아민 커플링: 런닝 완충액: HBS-N 완충액, EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화, 5000 RU의 리간드 밀도의 목표; 포획-항체를 커플링 완충액 NaAc(pH 4,5)(c = 30 ㎍/ml)로 희석하고; 최종적으로 남은 활성화된 카복실기를 1 M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하였다.
25 ℃에서 DCC-융합 단백질(Fn5 변이체 1; 서열번호 3)에 대한 네트린-1 결합의 동적 특성화
런닝 완충액: PBS + 0.05%(v/v) 트윈 20
유동 셀 2 내지 4 상에 Fn5 변이체 1의 포획: 유량 5 ㎕/분, 접촉 시간 72 초, c(Fn5 변이체 1) = 100 nM, 런닝 완충액 + 1 mg/ml BSA로 희석.
분석물 샘플:
전형적인 농도 시리즈를 c = 400-1 nM 사이의 5 또는 6개의 증가하는 농도에서 분석물의 순차적 주입에 의해 50 ㎕/분의 유량에서 측정하였다. 분석물을 3 분간 주입한 후 20 분의 해리 단계가 이어졌다. 상이한 제조사들로부터의 다양한 네트린-1 샘플을 측정에 사용하였다(인간 네트린-1, 알렉시스(Alexis) 522-100-0000/인간 네트린-1 네트리스 파마(Netris Pharma)/닭 네트린 1, 알렉시스 522-106-2010).
재생은 10 mM 글리신(pH 1.5), 접촉 시간 2 분, 유량 30 ㎕/분을 이용하여 각각의 주기(= 각각의 농축) 후에 재생을 수행하였다.
도 3은, 예를 들면, 주입된 닭 네트린-1의 상이한 농도에서 포획 분석물 DCC-융합 단백질(Fn5 변이체 1; 서열번호 3)의 전형적인 결합 및 해리 곡선을 나타낸 것이다.
통상적인 이중 참조(대조군 참조: 포획 분자에 대한 분석물의 결합; 유동 셀: 블랭크로서 네트린-1 농도 "0"), 및 모델 "적정 동적 1:1 결합"을 사용한 계산을 이용하여 동적 파라미터들을 산출하였다.
| ka | kd | t(1/2) | KD | |
| [M-1s-1] | [s-1] | [분] | [M] | |
| Fn5-Fc(IgG1) 융합단백질 서열번호 3 (Fn5 변이체1)/ 닭 네트린-1 |
7.9E+04 |
1.3E-04 |
92.1 |
1.6E-09 |
| Fn5-Fc(IgG1) 융합단백질 서열번호 3 (Fn5 변이체1)/ 인간 네트린-1 |
3.0E+05 |
5.7E-04 |
20.2 |
1.6E-09 |
실시예
6:
H358
세포를 사용한
카스파제
-3 활성화 분석
제 1 일에, 세포를 무혈청 배지에 도말하였다(웰당 1 ml 배지를 갖는 6-웰 플레이트에 웰 당 2x105 세포). 제 2 일에, 배지를 비히클(PBS) 단독 또는 1 ㎍/ml의 성숙 DCC-융합 단백질(Fn5 변이체 1, 서열번호 3) 또는 1 ㎍/ml Fn5 변이체 1과 150 ng/ml 네트린-1을 함유하는 새로운 무혈청 배지 1 ml로 교체하였다. 처리는 조건당 2개의 웰에 수행하였다. 제 3 일에, 2개의 동일하게 처리된 웰로부터 부유 및 모든 부착 세포를 하나의 풀(pool)로서 수거하였다. 세포 펠릿을 55 ㎕ 용해 완충액에 재현탁시키고 10 분간 얼음상에서 용해시켰다. 이어서, 용해물을 4 ℃에서 3 분간 최대 속도로 원심분리하여 예비-정화시켰다. 상등액을 새로운 튜브에 수거하고 단백질 농도 측정동안 얼음상에 유지시켰다. 백색의 96-웰 플레이트에, 30 ㎍ 단백질 분취량의 부피를 용해물 완충액을 사용하여 50 ㎕의 최종 부피로 조정하였다. 54 ㎕ 반응 완충액 및 1 ㎕ DEVD-AFC 및 0.5 ㎕ DTT로 이루어진 50 ㎕ 반응 혼합물을 각 웰에 첨가하였다. 총 1 시간동안 5 분마다 동적 측정치를 취하여 형광 발생(400 nm에서 여기, 510 nm에서 발광)을 모니터링하였다. 또는, 이것이 가능하지 않은 경우, 혼합물을 첨가한 직후에 초기 판독을 행하고, 최종 측정은 37 ℃에서 1 시간 배양(빛으로부터 차단)후에 수행하였다. 모든 값은 비히클 대조군 샘플로 표준화하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.
실시예
7:
H358
및 A549
이종이식편의
생체내
종양 성장 억제
H358 이종이식편:
5 주령의 암컷 무흉선증(athymic) nu/nu 마우스에게 마우스의 왼쪽 옆구리에 200 ㎕ PBS 중 5.0 x 106 H358 세포를 피하 주사하여 이식하여 마우스 당 1개의 종양을 만들었다. 종양이 약 100 mm3의 부피에 이르렀을 때, 20 mg/kg의 Fn5 변이체 1 융합 단백질(서열번호 3)(n = 11 마리 마우스) 또는 동일 부피의 완충액(n = 12 마리 마우스)을 연속되는 4 주동안 1 주일에 1회 복강내 주사하였다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피는 식 v = 0.5(l x w2)로 산출하였으며, 여기서 v는 부피이고, l은 길이이며, w는 너비이다.
A549 이종이식편:
5 주령의 암컷 무흉선증 nu/nu 마우스에게 A549 세포를 옆구리에 피하 주사하여 이식시켰다. 종양이 약 100 mm3의 부피에 이르렀을 때, 20 mg/kg 용량의 Fn5 변이체 1 융합 단백질(서열번호 3) 또는 동일 부피의 완충액을 연속되는 4 주동안 1 주일에 1회 또는 2회 복강내 주사하였다(n = 처리 군당 10 마리 마우스). 종양 크기는 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피는 식 v = 0.5(l x w2)로 산출하였으며, 여기서 v는 부피이고, l은 길이이며, w는 너비이다. 또한 도 5를 참조하시오("트랩"은 변이체 1 융합 단백질(서열번호 3)을 의미한다).
본 발명에 언급된 서열
서열번호 1
DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질) 7800 인공 서열을 암호화하는 DNA
서열번호 2
DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질) 7800 인공 서열의 아미노산 서열
서열번호 3
성숙 DCC-융합 단백질(Fn5-Fc 융합 단백질) 7800 인공 서열의 아미노산 서열
서열번호 4
성숙 Fn5-Fc 융합 단백질 7800 인공 서열의 아미노산 서열
서열번호 5
성숙 Fn4-Fn5-Fc 융합 단백질 7801 인공 서열의 아미노산 서열
서열번호 6
성숙 Fn5-Fc 융합 단백질 7802 인공 서열의 아미노산 서열
서열번호 7
성숙 Fn4-Fn5-Fc 융합 단백질 7803 인공 서열의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Netris Pharma
Centre Leon Berard, Centre regional de lutte contre le cancer
<120> Recombinant Fc-fusion protein of the fifth fibronectin type III domain of DCC
<130> S1802 PCT S3
<140> PCT/EP2011/064733
<141> 2011-08-26
<150> EP 10290459.6
<151> 2010-08-26
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1084
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Source
<223> /Note="Description of Artificial Sequence: DNA encoding the
DCC-fusion protein (Fn5-Fc fusion protein) 7800"
<400> 1
aagcttgccg ccaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60
ggtgtccact ccagcacccc catgctgcct ccagtgggcg tccaggccgt ggctctcaca 120
cacgacgcag tccgcgtgtc ctgggccgat aactctgttc ccaagaatca gaaaacctca 180
gaagtgagac tgtacactgt ccgctggcgg acatccttct ccgcttctgc aaagtataag 240
agtgaagaca ccactagcct ttcctacacc gccacagggc tgaaacctaa caccatgtat 300
gagttttctg tgatggtaac aaagaatagg agatcaagca cctggtccat gactgctcat 360
gcaacaacct acgaggccgc tccaaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg tccaccgtgc 420
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780
accctgcccc catcacggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtccccggg caaatgagct 1080
agcg 1084
<210> 2
<211> 353
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Source
<223> /Note="Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of
the DCC-fusion protein (Fn5-Fc fusion protein) 7800"
<400> 2
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ser Thr Pro Met Leu Pro Pro Val Gly Val Gln Ala Val
20 25 30
Ala Leu Thr His Asp Ala Val Arg Val Ser Trp Ala Asp Asn Ser Val
35 40 45
Pro Lys Asn Gln Lys Thr Ser Glu Val Arg Leu Tyr Thr Val Arg Trp
50 55 60
Arg Thr Ser Phe Ser Ala Ser Ala Lys Tyr Lys Ser Glu Asp Thr Thr
65 70 75 80
Ser Leu Ser Tyr Thr Ala Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Met Tyr Glu
85 90 95
Phe Ser Val Met Val Thr Lys Asn Arg Arg Ser Ser Thr Trp Ser Met
100 105 110
Thr Ala His Ala Thr Thr Tyr Glu Ala Ala Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
Lys
<210> 3
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Source
<223> /Note="Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of
mature DCC-fusion protein (Fn5-Fc fusion protein) 7800"
<400> 3
Ser Thr Pro Met Leu Pro Pro Val Gly Val Gln Ala Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
His Asp Ala Val Arg Val Ser Trp Ala Asp Asn Ser Val Pro Lys Asn
20 25 30
Gln Lys Thr Ser Glu Val Arg Leu Tyr Thr Val Arg Trp Arg Thr Ser
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Ala Lys Tyr Lys Ser Glu Asp Thr Thr Ser Leu Ser
50 55 60
Tyr Thr Ala Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Met Tyr Glu Phe Ser Val
65 70 75 80
Met Val Thr Lys Asn Arg Arg Ser Ser Thr Trp Ser Met Thr Ala His
85 90 95
Ala Thr Thr Tyr Glu Ala Ala Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
100 105 110
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
130 135 140
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
145 150 155 160
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
165 170 175
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
180 185 190
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
195 200 205
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
225 230 235 240
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
245 250 255
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
260 265 270
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
290 295 300
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
305 310 315 320
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 4
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Source
<223> /Note="Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of
mature Fn5-Fc fusion protein 7809"
<400> 4
Ser Thr Pro Met Leu Pro Pro Val Gly Val Gln Ala Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
His Asp Ala Val Arg Val Ser Trp Ala Asp Asn Ser Val Pro Lys Asn
20 25 30
Gln Lys Thr Ser Glu Val Arg Leu Tyr Thr Val Arg Trp Arg Thr Ser
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Ala Lys Tyr Lys Ser Glu Asp Thr Thr Ser Leu Ser
50 55 60
Tyr Thr Ala Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Met Tyr Glu Phe Ser Val
65 70 75 80
Met Val Thr Lys Asn Arg Arg Ser Ser Thr Trp Ser Met Thr Ala His
85 90 95
Ala Thr Thr Tyr Glu Ala Ala Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr
100 105 110
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
130 135 140
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
145 150 155 160
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
165 170 175
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
180 185 190
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
195 200 205
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
225 230 235 240
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
245 250 255
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
260 265 270
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
290 295 300
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
305 310 315 320
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 5
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Source
<223> /Note="Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of
mature Fn4-Fn5-Fc fusion protein 7801"
<400> 5
Gln Val Pro Asp Gln Pro Ser Ser Leu His Val Arg Pro Gln Thr Asn
1 5 10 15
Cys Ile Ile Met Ser Trp Thr Pro Pro Leu Asn Pro Asn Ile Val Val
20 25 30
Arg Gly Tyr Ile Ile Gly Tyr Gly Val Gly Ser Pro Tyr Ala Glu Thr
35 40 45
Val Arg Val Asp Ser Lys Gln Arg Tyr Tyr Ser Ile Glu Arg Leu Glu
50 55 60
Ser Ser Ser His Tyr Val Ile Ser Leu Lys Ala Phe Asn Asn Ala Gly
65 70 75 80
Glu Gly Val Pro Leu Tyr Glu Ser Ala Thr Thr Arg Ser Ile Thr Asp
85 90 95
Pro Thr Asp Pro Val Asp Tyr Tyr Pro Leu Leu Asp Asp Phe Pro Thr
100 105 110
Ser Val Pro Asp Leu Ser Thr Pro Met Leu Pro Pro Val Gly Val Gln
115 120 125
Ala Val Ala Leu Thr His Asp Ala Val Arg Val Ser Trp Ala Asp Asn
130 135 140
Ser Val Pro Lys Asn Gln Lys Thr Ser Glu Val Arg Leu Tyr Thr Val
145 150 155 160
Arg Trp Arg Thr Ser Phe Ser Ala Ser Ala Lys Tyr Lys Ser Glu Asp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Tyr Thr Ala Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Met
180 185 190
Tyr Glu Phe Ser Val Met Val Thr Lys Asn Arg Arg Ser Ser Thr Trp
195 200 205
Ser Met Thr Ala His Ala Thr Thr Tyr Glu Ala Ala Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 6
<211> 333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Source
<223> /Note="Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of
mature Fn5-Fc fusion protein 7802"
<400> 6
Ser Thr Pro Met Leu Pro Pro Val Gly Val Gln Ala Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
His Asp Ala Val Arg Val Ser Trp Ala Asp Asn Ser Val Pro Lys Asn
20 25 30
Gln Lys Thr Ser Glu Val Arg Leu Tyr Thr Val Arg Trp Arg Thr Ser
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Ala Lys Tyr Lys Ser Glu Asp Thr Thr Ser Leu Ser
50 55 60
Tyr Thr Ala Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Met Tyr Glu Phe Ser Val
65 70 75 80
Met Val Thr Lys Asn Arg Arg Ser Ser Thr Trp Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys
100 105 110
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
145 150 155 160
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
195 200 205
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
245 250 255
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
275 280 285
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
290 295 300
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
305 310 315 320
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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mature Fn4-Fn5-Fc fusion protein 7803"
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Gln Val Pro Asp Gln Pro Ser Ser Leu His Val Arg Pro Gln Thr Asn
1 5 10 15
Cys Ile Ile Met Ser Trp Thr Pro Pro Leu Asn Pro Asn Ile Val Val
20 25 30
Arg Gly Tyr Ile Ile Gly Tyr Gly Val Gly Ser Pro Tyr Ala Glu Thr
35 40 45
Val Arg Val Asp Ser Lys Gln Arg Tyr Tyr Ser Ile Glu Arg Leu Glu
50 55 60
Ser Ser Ser His Tyr Val Ile Ser Leu Lys Ala Phe Asn Asn Ala Gly
65 70 75 80
Glu Gly Val Pro Leu Tyr Glu Ser Ala Thr Thr Arg Ser Ile Thr Asp
85 90 95
Pro Thr Asp Pro Val Asp Tyr Tyr Pro Leu Leu Asp Asp Phe Pro Thr
100 105 110
Ser Val Pro Asp Leu Ser Thr Pro Met Leu Pro Pro Val Gly Val Gln
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Ala Val Ala Leu Thr His Asp Ala Val Arg Val Ser Trp Ala Asp Asn
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Gly Lys
450
Claims (11)
- 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 대장암 결실부(DCC)-융합 단백질.
- 제 1 항에 따른 DCC-융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
- 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 항에 따른 핵산 분자.
- 진핵 숙주 세포에서 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 핵산을 발현시킬 수 있는, 상기 핵산을 함유하는 벡터.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 핵산 분자 또는 제 4 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 진핵 숙주 세포에서 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 핵산을 발현시키고 상기 진핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포 배양 상등액으로부터 DCC-융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 DCC-융합 단백질의 제조 방법.
- 제 6 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 DCC-융합 단백질.
- 제 1 항에 따른 DCC-융합 단백질, 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 핵산 분자, 제 4 항에 따른 벡터, 또는 제 5 항에 따른 숙주 세포; 및 선택적으로, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 암의 치료에 사용하기 위한, 제 8 항에 따른 약학 조성물 또는 제 1 항 또는 제 7 항에 따른 DCC-융합 단백질.
- 암의 치료용 약제를 제조하기 위한, 제 8 항에 따른 약학 조성물 또는 제 1 항 또는 제 7 항에 따른 DCC-융합 단백질의 용도.
- 제 1 항 또는 제 7 항에 따른 DCC-융합 단백질을 그를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 대상에서 암을 치료하는 방법.
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