KR101131429B1

KR101131429B1 - Ｖｅｇｆ 트랩 및 그것의 치료적 사용

Info

Publication number: KR101131429B1
Application number: KR1020057025383A
Authority: KR
Inventors: 토마스 제이. 달리; 제임스 피. 판들; 니콜라스 제이. 파파도폴로스
Original assignee: 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2012-07-27
Also published as: CA2529660A1; AU2004252175A1; UA105625C2; CY1109204T1; MXPA05013641A; NZ572107A; DE602004020474D1; WO2005000895A3; SI1639007T1; NO20060483L; IL172404A; UA90657C2; PT1947118E; RU2006102497A; EP1639007B1; BRPI0412125A; CA2529660C; SI1947118T1; US20100087632A1; US20050043236A1

Abstract

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합할 수 있는 핵산 분자 및 다중 결합 단백질. VEGF 트랩은 VEGF-관련 상태 및 질병을 치료하는데 치료적으로 유용하며 특히 특이적 기간, 조직, 및/또는 세포에 대한 국소적 투여에 대하여 설계되어 있는 것이 개시된다.

혈관 내피 성장 인자 (VEGF), VEGF 트랩.

Description

ＶＥＧＦ 트랩 및 그것의 치료적 사용{VEGF TRAPS AND THERAPEUTIC USES THEREOF}

본 발명은 특히 바람직한 특징들을 갖는 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), VEGF 과(family) 구성원, 및 스플라이스 변이체에 결합할 수 있는 융합 폴리펩티드, 및 사용의 치료적 방법을 포함한다.

발명의 개요

제 1의 양태에서, 본 발명은 수용체 성분(R1R2)_x 및/또는 (R1R3)_Y를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 단리 핵산 분자를 특징으로 하며, 이때 R1은 Flt-1(Flt1D2)의 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 수용체 성분 Ig 도메인 2이고, R2는 Flk-1 (Flk1D3)의 VEGF 수용체 성분 Ig 도메인 3이며, R3는 Flt-4(Flt1D3 또는 R3)의 VEGF 수용체 성분 Ig 도메인 3이고, 이때 X ≥ 1 및 Y ≥1이다.

관련한 제 2의 양태에서, 본 발명은 VEGF 수용체 성분(R1R2)_x 및/또는 (R1R3)_y를 포함하는 단일결합 VEGF 트랩 또는 융합 폴리펩티드를 특징으로 하며 이때 X ≥ 1, Y ≥ 1이고, R1, R2, 및 R3는 상기 정의되는 바와 같다. VEGF 수용체 성분 R1, R2, 및 R3는 서로 직접 연결되거나 하나 이상의 스페이서 서열을 통해 연결될 수도 있다. 하나의 특이적 구체예에서, 단일결합 VEGF 트랩은 (R1R2)_X이고, X=2였다. 더 특이적 구체예에서, 단일결합 VEGF 트랩은 SEQ ID NO : 24, 또는 그것의 기능상 동등한 아미노산 변이체이다. 본 발명은 필수적으로 VEGF 수용체 성분(R1R2)_x 및/또는 (R1R3)_y, 및 그것의 기능상 동등한 아미노산 변이체로 이루어진 단일결합 VEGF 트랩을 포함한다.

제 3의 양태에서, 본 발명은 VEGF 수용체 성분(R1R2)_x 및/또는 (R1R3)_y를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 다량체화 성분(MC), 혈청 단백질, 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 파트너(FP) 성분을 코딩하는 단리 핵산 분자를 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, FP는 다른 융합 폴리펩티드 상 다량체화 성분과 상호작용하여 다중결합 구조, 예를 들어, 이량체 또는 삼량체를 형성할 수 있는 다량체화 성분(MC)이다. 가장 바람직하게, MC는 (i) 개열가능 영역을 포함하는 다량체화 성분 (C-영역), (ii) 절두된 다량체화 성분 (iii) 적어도 1개의 시스테인 잔기를 갖는 길이가 1 내지 약 200 아미노산인 아미노산 서열 (iv) 류신 지퍼, (v) 나선형 루프 모티프, (vi) 코일-코일 모티프, 및 (vii) 면역글로불린 도메인으로 이루어진 구능로부터 선택된다. 또한 필수적으로 (R1R2)_x 및/또는 (R1R3)_y, 및 FP로 이루어진 융합 폴리펩티드가 포함된다. 바람직한 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 필수적으로 (R1R2)_x 및 MC로 이루어진다.

제 4의 양태에서, 본 발명은 상기 설명되는 바와 같이 VEGF 수용체 성분 (R1R2)_x 및/또는 (R1R3)_y, 및 FP를 포함하는 융합 폴리펩티드를 특징으로 한다. 수 용체 성분은 다른 순서, 예를 들어, (R1R2)_x-FP; (R1R2)_X-FP-(R1R2)_x; FP-(R2R1)_x 등으로 배열될 수도 있다. 융합 폴리펩티드의 성분은 서로 직접 연결되거나, 또는 스페이서 서열을 통해 연결될 수도 있다.

제 5의 양태에서, 본 발명은 VEGF 수용체 성분(R1R2)x 및/또는 (R1R3)y, 및 FP로 이루어진 둘 이상의 융합 폴리펩티드의 다량체를 포함하는 VEGF 트랩을 특징으로 하며, 이때 FP 성분은 C-영역을 포함하는 다량체화 성분(MC)이다. C-영역은 천연 발생 또는 인공일 수도 있으며, 다량체화 성분 내 어떤 지점에서 발생할 수도 있으며, 절두된 MC에 대하여 부모 MC의 개열를 허용하는 작용을 한다. 적어도 하나의 절두된 MC를 갖는 둘 이상의 융합 폴리펩티드로 이루어진 VEGF 트랩을 "절두된 미니트랩"이라 칭한다.

C-영역은 삽입, 결실, 또는 돌연변이에 의해 MC에서 생성될 수도 있으며, 효소적으로 또는 화학적으로 개열가능한 부위가 생성된다. C-영역은 어떤 MC 및 MC 내 어떤 위치에서 생성될 수도 있으며; 바람직하게는, C-영역은 완전한 길이 Fc 도메인, 또는 그것의 단편, 또는 C_H3 도메인에서 생성될 수도 있다. C-영역은 트롬빈, 피신(ficin), 펩신, 매트릴리신(matrilysin), 또는 프로리다제(prolidase)와 같은 효소에 의해 개열가능하거나 예를 들어, 포름산 또는 CuCl2에 의해 화학적으로 절두가능한 부위일 수도 있다.

제 6의 관련 양태에서, 본 발명은 (R1R2)x 및/또는 (R1R3)y로 이루어진 하나 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 다중결합 단백질인 절두된 VEGF 미니트랩 및C- 영역(tMC)을 포함하는 부모 MC로부터 개열에 의해 절두되는 다중결합 성분을 특징으로 한다.

제 7의 양태에서, 본 발명은 VEGF 수용체 성분 (R1R2)x 및/또는 (R1R3)y로 이루어진 융합 폴리펩티드 및 MC를 특징으로 하며, 이때 MC는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 길이가 약 1 내지 200 아미노산인 아미노산 서열이고, 이때 적어도 하나의 시스테인 잔기는 다른 융합 폴리펩티드(cMC)의 MC에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 이황화 결합을 형성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, cMC는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 길이가 1-50 아미노산인 아미노산 서열이다. 더 바람직한 구체예에서, cMC는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 길이가 1-15 아미노산인 아미노산 서열이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, cMC는 1-2 시스테인 잔기를 포함하는 길이가 1-10 아미노산인 아미노산 서열이다. 본 발명의 이 구체예의 한 예시는 신호 서열(1-26) 이후에 R1(27-129) 및 R2(130-231) 성분, 이어서 시스테인 잔기로 끝나는 9개의 아미노산 서열을 갖는 SEQ ID NO:27에 나타낸다. SEQ ID NO:28에서 보여준 다른 구체예에서, 신호 서열(1-26)에 이어서 R1 (27-129) 및 R2(130-231)성분, 이어서 시스테인 잔기로 끝나는 6개의 아미노산 서열이다.

제 8의 양태에서, 본 발명은 (R1R2)x 및/또는 (R1R3)y로 이루어진 둘 이상의 융합 폴리펩티드의 다량체 및 cMC를 포함하는 VEGF 미니트랩을 특징으로 한다. 더 특이적인 구체예에서, 미니트랩은 이량체이다. 본 발명의 미니트랩의 이 구체예의 한 실례는 SEQ ID NO:2에서 나타낸 이량체의 융합 폴리펩티드이며, 각각의 융합 폴 리펩티드(R1R2-cMC)는 23.0 kD의 분자량 및 9.22의 pI를 갖는다.

다른 구체예에서, cMC는 예를 들어, XCXC (SEQ ID NO:3)와 같은 2개의 시스테인 잔기로 이루어진 길이가 4 아미노산이다. 본 발명의 이 구체예의 한 실례에서, 미니트랩은 본 발명의 VEGF 수용체 성분, 및 ACGC(SEQ ID NO:4)으로 이루어진 cMC로 이루어져 있다. 본 발명의 이 구체예의 한 실례는 SEQ ID NO:5에서 나타낸 융합 폴리펩티드의 이량체이며, 이때 각각의 단량체는 23.2 kD의 분자량 및 9.22의 pI를 갖는다. 본 발명의 이 구체예의 다른 실례는 신호 서열 (1-26) 다음 R1(27-129) 및 R2(130-231) 성분, 이어서 CPPC로 끝나는 1개의 아미노산 서열을 갖는 SEQ ID NO:26에서 나타낸다.

본 발명의 VEGF 트랩의 모든 구체예에서(절두된 VEGF 미니트랩, VEGF 미니트랩, 및 단일결합 VEGF 미니트랩), 신호 서열(S)은 본 발명의 융합 폴리펩티드의 시작(또는 N-말단)에서 포함될 수도 있다. 신호 서열은 세포에 대하여 고유하거나, 재조합, 또는 합성적일 수도 있다. 신호 서열이 첫번째 수용체 성분의 N-말단에 첨가되는 때, 거기서 융합 폴리펩티드는 예를 들어, S(R1R2)_x로서 칭해질 수도 있다.

융합 폴리펩티드의 성분들은 서로 직접 연결되거나 스페이서를 통해 연결될 수도 있다. 특이적 구체예에서, 융합 폴리펩티드의 하나 이상의 수용체 및/또는 융합 파트서 성분들은 스페이서 없이 서로 직접 연결된다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 수용체 및/또는 융합 파트너 성분들은 스페이서와 함께 연결된다.

본 발명은 발현 억제 서열에 작동적으로 연결된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하여, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 융합 폴리펩티드의 생성을 위한 숙주-벡터 시스템을 포함하며, 이것은 적당한 숙주 세포 내 밸현 벡터를 포함한다; 적당한 숙주 세포가 세균, 효모, 곤충, 포유동물 세포인 숙주-벡터 시스템; E.Coli 세포, 또는 COS 또는 CHO 세포. 추가적으로 아세틸화 또는 페질레이션(pegylation)에 의해 변형된 본 발명의 VEGF 트랩이 포함된다. 단백질을 아세틸화 또는 페질화 하는 방법은 당업계 주지되어 있다.

관련 제 9의 양태에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터와 함께 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 그렇게 생산된 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 VEGF 트랩을 생성하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명의 VEGF 트랩은 VEGF의 제거, 억제, 또는 감소에 의해 향상, 경감, 또는 억제되는 어떤 질병 또는 상태를 치료하는데 치료적으로 유용하다. VEGF의 억제 또는 감소에 의해 향상된 특이적 조건의 대략적인 리스트는 예를 들어, 바람직하지 않은 혈장 누출 또는 혈관 투과성, 예를 들어, 종양에서와 같은 바람직하지 않은 혈관 성장, 건선 또는 관절염과 같은 염증성 질병과 관련된 부종으로서, 류마티스 관절염; 천식; 화상과 관련한 일반화 된 부종; 종양과 관련된 복수 및 늑막 삼출, 염증 또는 외상; 만성 기도 염증; 천식; 모세관 누출 증후군; 패혈증; 단백질의 증가된 누출과 관련한 신장 질병; 연령 관련 황반 변성 및 당뇨 망막증과 같은 안질환 및 췌장관 선암(PDAC)을 포함한다. VEGF 미니트랩은 특히 안질환, 및 녹내장 수술을 포함하는 눈 수술에 대한 애쥬번트로서; 및 유리체 내(intravitreal) 송달을 통하여, 예를 들어, 포도막 흑색종, 망막모세포종과 같은 안내 종양의 치료에 유용하다.

따라서, 제 10의 양태에서, 본 발명은 VEGF-관련 질병 또는 상태를 앓는 피험체에 본 발명의 VEGF 트랩을 투여하는 것을 포함하여, VEGF-관련 질병 또는 상태의 치료에 관한 치료적 방법을 특징으로 한다. 어떤 포유동물이 본 발명의 치료 방법에 의해 치료될 수 있지만, 피험체는 바람직하게는 VEGF 트랩으로 향상, 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질병을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 사람 환자이다.

제 11의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 미니트랩을 갖는 VEGF를 검출, 정량화, 및/또는 모니터링하기 위한 진단 및 예후 방법, 및 키트를 특징으로 한다.

제 12의 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 본 발명의 VEGF 트램을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 이러한 약학적 조성물은 이량체의 융합 폴리펩티드 트랩, 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수도 있다. 본 발명의 미니트랩은 더 작은 크기로 인하여 감소된 혈청 반감기(예를 들어, 더 빠른 청소), 및/또는 증가된 조직 침투를 갖는 VEGF 트랩이 바람직한 상태에서 특이적 사용을 발견한다. VEGF 미니트랩에 대한 특이적 적용은 예를 들어, 특이적 조직 또는 세포에 대한 국소 투여가 바람직한 질병을 포함한다. 이러한 상태 또는 질병의 예는 눈의 안질환이다.

다른 목적 및 이점은 다음의 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문에, 특정한 방법, 및 설명되는 실험 조건에 한정되지 않음이 이해된다. 또한, 본원에서 사용된 용어법은 단지 특정한 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구항만을 한정할 것이기 때문에 한정하고자 하지 않는다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "한(an)", 및 "그(the)" 는 문맥이 분명하게 달리 나타내지 않는다면 복수의 기준을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "하나의 방법"에 대한 기준은 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에서 설명된 유형의 단계를 포함하며 및/또는 이 개시 등을 읽어서 당업계 숙련자에게 명백할 것이다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계 숙련자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본원에서 설명된 바와 동일 또는 동등한 어떤 방법 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료들이 이제 설명된다. 본원에서 언급된 모든 문헌들은 문헌들이 인용되는 것과 함께 방법 및/또는 재료를 설명하기 위해 참고로서 본원에서 인용된다.

일반적 설명

본 발명은 VEGF 활성을 결합 및 억제할 수 있는 VEGF 트랩을 포함하며, 이것은 하나 이상의 융합 폴리펩티드의 단량체 또는 다량체이다. 본 발명의 분자는 VEGF의 생물학적 활성 및/또는 생리학적 작용 또는 반응을 결합 및 억제한다. VEGF-수용체-기재 길항체 VEGF 트랩 FltlD2.FlklD3.Fc△C1(a)(SEQ ID NO:7-8) 및 VEGFR1R2-Fc△C1(a)(SEQ ID NO:9-10)의 설명을 위해, 본원에서 참고로서 전체가 인용되는 PCT WO/0075319를 참조하시오.

본 발명의 미니트랩은 완전한 크기의 트랩보다 더 작은데, 예를 들어, 120 kD의 부모 트랩에 비해 약 50 - 60 kD이며, 필수적으로 VEGF 수용체 도메인(R1R2)x, (R1R3)y, 또는 그것의 조합으로 이루어진 단량체 트랩, 개열 영역(C-영역)을 함유하는 다량체화하는 융합 파트너 성분을 갖는 부모 다량체화 트랩의 일부를 개열함으로써; 또는 시스테인 잔기 또는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 아미놋나 서열을 수용체 성분 도메인에 또는 그 사이에 부착시킴으로써 생성된 트랩을 포함한다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 미니트랩은 SDS-PAGE 분석에 의해 측정되는 바와 같이 약 60 kD 이하; 더 바람직하게는 약 50 kD; 더욱 더 바람직하게는 약 20-30 kD이거나; 또는 약 25 kD이며 PCT/US00/14142에서 설명된 완전한 크기의 부모 트랩과 필적할만한 친화성으로 VEGF에 결합할 수 있다.

핵산 구성 및 발현

본 발명은 VEGF 단독 또는 다량체화 VEGF 트랩에 결합할 수 있는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 구성에 대하여 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 야생형 R1, R2, 및/또는 R3 수용체 성분, 또는 그것의 기능상 동등한 변이체를 암호화할 수도 있다. 본 발명의 트랩의 R1, R2 및/또는 R3 수용체 성분의 아미노산 서열 변이체는 또한 핵산 분자를 코딩함에 있어서 돌연변이를 생성시킴으로써 제조될 수도 있다. 이러한 변이체는 예를 들어, R1, R2 및/또는 R3의 아미노산 서열 내 아미노산 잔기의 결실, 또는 삽입 또는 치환을 포함한다. 어떤 조합의 결실, 삽입, 및 치환은 최종 구성에 도달하기 위해 만들어 질 수도 있으며, 단 최종 구성은 VEGF에 결합 및 억제하는 능력을 지닌다.

이들 핵산 분자는 적절한 숙주 세포로 도입되는 경우 융합 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터로 삽입된다. 적절한 숙주 세포는 이에 한정되지는 않지만, 세균, 효모, 곤충, 및 포유동물 세포를 포함한다. 벡터로 DNA 단편을 삽입하기 위한 당업계 숙련자에 공지된 어떤 방법은 전사/번역 제어 신호의 제어하에서 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 구성하는데 사용될 수도 있다.

본 발명의 핵산 분자의 발현은 제 2 핵산 서열에 의해 조절되어 분자는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주 내에서 발현된다. 예를 들어, 발현은 당업계 공지된 어떤 프로모터/인핸서 구성요소에 의해 제어될 수도 있다. 키메라 폴리펩티드 분자의 발현을 제어하기 위해 사용될 수도 있는 프로모터는 이에 한정되지는 않지만, 긴 말단 반복 (Squinto et al. (1991) Cell 65: 1-20); SV40 초기 프로모터 영역, CMV,M-MuLV, 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열; b-락타마제 프로모터, 또는 tac 프로모터와 같은 원핵생물 발현 벡터(또한, Scientific American (1980) 242: 74-94 참조); Gal 4 프로머터와 같은 효모 또는 기타 균류로부터의 프로모터 요소, ADH, PGK, 알칼라인 포스파타제, 및 엘라스타제 I과 같은 유전자로부터 유도된 조직-특이적 전사 억제 영역을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세균 또는 진핵생물 숙주에서 복제될 수 있는 발현 벡터는 숙주를 형질감염 시키는데 사용되고 이로써 이러한 핵산의 발현을 지시하여 본 발명의 융합 폴리펩티드를 생성하며, 이것은 VEGF에 결합할 수 있는 트랩을 형성한다. 형질감염된 세포는 본 발명의 VEGF 트랩을 순식간에 또는, 바람직하게는, 구조적으로 및 영구적으로 발현시킬 수도 있다.

본 발명의 트랩은 안정하고, 생물학적으로 활성인 트랩의 후속적 형성을 허용하는 어떤 기술에 의해 정제될 수도 있다. 예를 들어, 제한에 의하지 않고서, 인자들은 가용성 단백질로서 또는 봉입체로서 세포로부터 회수될 수도 있으며, 그들은 8M 염산 구아니디니움 및 투석에 의해 정량적으로 추출될 수도 있다(예를 들어, 미국 특허 제 5,663,304호 참조). 인자들을 더 정제하게 위해, 전통적인 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과가 사용될 수도 있다.

VEGF 수용체 성분

VEGF 미니 트랩의 VEGF 수용체 성분은 Flt-1(FltlD2)(R1)의 Ig 도메인 2, Flk-1(FlklD3)(R2)(R1R2 함께), 및/또는 R1의 Ig 도메인 3 및 Flt-4(FltlD3)(R3)(R1R3 함께)의 Ig 도메인 3로 이루어져 있다. Flt-l, Flt-4, 또는 Flk-1의 용어 "Ig 도메인"은 완벽한 야생형 도메인 뿐 아니라, 실질적으로 손상되지 않은 도메인의 기능상의 특징을 보유하는 그것의 삽입, 결실, 및/또는 치환적 변이체를 포함하도록 의도된다. 상기 Ig 도메인의 수많은 변이체는 야생형 도메인과 동일한 기능상 특징들을 실질적으로 보유하는 것을 얻을 수 있음이 당업계 숙련자에게 즉시 명백할 것이다.

R1, R2, 또는 R3에 대한 기준으로 사용되는 경우 용어 "기능상 등가"는 적어도 하나의 변경, 예를 들어, 결실, 첨가, 및/또는 치환을 포함하는 R1, R2, 또는 R3 도메인을 포함하도록 의도되는데, 이것은 야생형 R1, R2, 또는 R3 도메인과 같은 동일한 기능상 특징을 실질적으로 보유하는데, 즉, VEGF에 결합하는 실질적으로 등가이다. 각종 아미노산 치환은 VEGF를 결합하고 불활성화하기 위한 이들 수용체 성분들의 능력에 관한 본 발명의 취지에서 멀어지지 않고 R1, R2, 또는 R3에서 만들어질 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 트랩의 기능상 특징은 바람직한 특성을 측정하기 위한 당업계 공지된 어던 적합한 스크리닝 분석에 의해 결정될 수도 있다. 이러한 분석의 예는 하기 실험 단락에서 설명되며 이것은 VEGF(Kd)에 대한 트랩의 결합 특성, 및 그들의 트랩-리간드 복합체(T1/2)의 분리의 반감기의 결정을 허용한다. 예를 들어, 다른 분석법, VEGF에 특이적으로 결합하는 능력의 변화는 경쟁-유형 VEGF 결합 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 열 안정성, 소수성, 단백질 가수개열적 개열에 대한 민감성, 또는 응집에 대한 경향과 같은 단백질 특성의 변형이 당업계 숙련자에 공지된 방법에 의해 측정될 수도 있다.

융합 폴리펩티드의 성분은 서로 직접 연결되거나 스페이서를 통하여 연결될 수도 있다. 일반적으로, 용어 "스페이서"(또는 링커)는 하나 이상의 분자, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-펩티드 부분을 의미하며, 이것은 하나 이상의 성분 도메인 사이에 삽입될 수도 있다. 예를 들어, 스페이서 서열은 조작의 용이성을 위해 성분들 상이에 관심있는 바람직한 부위를 제공하기 위해 사용될 수도 있다. 스페이서는 또한 숙주 세포로부터 융합 폴리펩티드의 발현을 증강시키기 위해 제공될 수 있어서, 공간배치적 방해를 감소시켜 성분이 그것의 최적의 3차 구조를 나타내고 및/또는 그것의 표적 분자와 적절히 상호작용할 수도 있다. 스페이서 및 바람직한 스페이서를 동정하기 위한 방법을 위해, 예를 들어, 본원에서 참고로서 구체적으로 인용된 문헌[George et al. (2003) Protein Engineering 15: 871-879]를 참조하시오. 스페이서 서열은 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수도 있고, 또는 융합 폴리펩티드의 발현을 증강시키고, 관심있는 특이적으로 바람직한 부위를 제공하고, 최적의 3차 구조를 형성하고 및/또는 그것의 표적 분자와 구성성분의 상호작용을 증강시키기 위해 성분 도메인을 허용하도록 하는데 서열을 첨가할 수도 있다. 한 구체예에서, 스페이서는 하나 이상의 구성성분 사이에 하나 이상의 펩티드 서열을 포함하는데 이것은 1-100 아미노산, 바람직하게는 1-25 사이이다.

가장 특이적인 구체예에서, R1은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 27-126, 또는 SEQ ID NO:8의 1-126(신호 서열 1-26을 포함); 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 27-129, 또는 SEQ ID NO:10의 1-129(1-26에서 신호 서열을 포함)이다. 가장 특이적인 구체예에서, R2는 SEQ ID NO:8의 아미노산 127-228, 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 130-231이다. 가장 특이적인 구체예에서, R3는 SEQ ID NO:13의 아미노산 127-225(신호 서열 없음)이다. 예를 들어, R2가 융합 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 경우, 신호 서열은 수용체 성분을 바람직하게 앞설수도 있다. 다량체화 성분에 첨부된 수용체 성분(들)이 스페이서 성분, 예를 들어, SEQ ID NO : 7의 아미노산 229-331의 GPG 서열을 더 포함할 수도 있다.

융합 파트너 및 다량체화 성분

융합 파트너는 융합 폴리펩티드의 기능성을 증강시키는 어떤 성분이다. 따라서, 예를 들어, 융합 파트너는 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성을 증강시키거나, 그것의 생산 및/또는 회수를 돕거나, 또는 예를 들어, 그것의 혈청 반감기, 조직 침투성, 면역원성의 결핍, 또는 안정성을 증강시킴으로써 융합 폴리펩티드의 약리학적 특성 또는 약물동역학적 프로파일을 증강시킬 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 융합 파트너는 다량체화 성분, 혈청 단백질, 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

융합 파트너가 혈청 단백질 또는 그것의 단편인 경우, 그것은 α-1-마이크로글로불린, AGP-1, 오로소뮤코이드, α-1-산 당단백질, 비타민 D 결합 단백질 (DBP), 헤모펙신, 사람 혈청 알부민 (hSA), 트랜스페린, 페리틴, 아파민, 햅토글로빈, α-태아 단백질 감상샘 글로불린, α-2-HS-당단백질, (3-2-당단백질, 히알루로난-결합 단백질, 신탁신, C1R, C1q 사슬, 젤라틴3-Mac2 결합 단백질, 피브리노겐, 폴리머 Ig 수용체 (PIGR), α-2-매크로글로불린, 요소 수송 단백질, 햅토글로빈, IGFBP, 대식세포 스캐빈저 수용체, 피브로넥틴, 지안틴(giantin), Fc, α-1-안티키로모트립신, α-1-안티트립신, 안티트롬빈 III, 아포지방단백질 A-1, 아포지방단백질 B, P-2-마이크로글로불린, 셀룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 성분 C3 또는 C4, CI 에스테라제 억제제, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, 및 단백질 C로부터 선택된다. 더 특이적인 구체예에서, 융합 파트너는 α-1-마이크로글로불린, AGP-1, 오로소뮤코이드, α-1-산 당단백질, 비타민 D 결합 단백질(DBP), 헤모펙신, 사람 혈청 알부민 (hSA), 아파민, 및 햅토글로빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 융합 파트너 성분의 함유는 바람직한 경우 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장할 수도 있다. 예를 들어, 혈청 알부민 융합 폴리펩티드에 대하여, 본원에서 전체가 참고로서 특이적으로 인용된 미국 특허 제 6,423,512, 5,876,969, 6,593,295, 및 6,548,653호를 참조하시오. hSA는 몸을 통해, 특히 장 및 혈액 성분에 널리 분포되며, 삼투압 및 혈장 부피의 유지에 이썽서 중요한 역할을 한다. 그것은 간에서 서서히 제거되며 전형적으로 사람에서 14-20일의 생체 내 반감기를 가진다(Waldmann et al. (1977) 알부민, Structure Function 및 Uses ; Pergamon Press; pp. 255-275).

융합 파트너가 혈청 단백질에 결합할 수 있는 분자인 경우, 분자는 합성 소분자, 지질 또는 리포좀, 압토머와 같은 합성 핵산, 펩티드, 또는 올리고당일 수도 있다. 또한 분자는 예를 들어, FcγR1, FcγR2, FcγR3, 폴리머 Ig 수용체(PIGR), ScFv, 및 혈청 단백질에 대하여 특이적인 다른 항체 단편과 같은 단백질일 수도 있다.

융합 파트너가 다량체화 성분(MC)인 경우, 그것은 다른 MC와 상호작용하여 더 높은 차원 구조, 예를 들어, 이량체, 상량체 등을 형성할 수 있는 어떤 천연 또는 합성적 서열이다. 적합한 MC는 c-jun 또는 c-fos로부터 유도된 류신 지퍼 도메인을 포함하는 류신 지퍼; 카파 또는 람다 광 사슬의 분변 영역으로부터 유도된 서열; 예를 들어 사선-루프-사선 모티프(Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432: 45-49), 코일-코일 모티프 등과 같은 합성 서열, 또는 당업계 공지된 다른 일반적으로 허용된 다량체화 도메인을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 융합 성분은 예를 들어, 사람 IgG, IgM 또는 IgA로부터의 면역글로불린-유도 도메인을 포함한다. 특이적 구체예에서, 면역글로불린-유도 도메인은 IgG의 Fc 도메인, IgG의 중쇄, 및 IgG의 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. IgG의 Fc 도메인은 동형 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 각각의 동형 그룹의 어떤 동종이형으로부터 선택될 수도 있다. 본 발명의 VEGF 트랩의 한 예에서, 다량체화 성분은 IgG4 Fc 도메인(SEQ ID NO:29)이다.

절두된 VEGF 미니트랩의 발생

본 발명의 트랩의 한 구체예엣, 본 발명의 둘 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 절두된 VEGF 미니트랩은 C-영역-함유 MC를 갖는 부모 트랩을 하나 이상의 C-영역-함유 MC가 개열되는 조건에 적용받도록 함으로써 발생된다. 결과의 절두된 미니트랩은 부모 트랩의 완전한 및 부분적인 개열 생성물일 수도 있다.

C-영역-함유 MC는 다른 MC와 상호작용하여 더 높은 차원 구조, 예를 들어, 이량체 또는 삼량체를 형성할 수 있는 어떤 MC일 수도 있다. C-영역은 어던 바람직한 위치에서 MC 내에서 생성될 수도 있다. 하기 실시예에서 제공되는 안내에 견주어, 당업계 숙련자는 결과의 절두 트랩의 바람직한 특성, 예를 들어, 분자량, 단량체 또는 다량체 등에 기초한 C-영역의 생성을 위한 바람직한 부위를 선택할 수도 있다.

특이적 구체예에서, C-영역은 Fc△C1 도메인으로 삽입되는 트롬빈 개열 부위(LVPRGS)(SEQID NO:6) 이어서 N-말단 CPPC 서열(SEQ ID NO:1)이다. 이 구체예에서, 완전한 크기의 부모 VEGF 트랩 구성은 Fc-태그된 단백질로서 세포에서 발현되고, 거기서 예를 들어, 단백질 A 컬럼에 의해 포획 및 정제를 허용한다. CPPC 서열(SEQ ID NO : 1)의 하나 이상의 시스테인 잔기 사이에 이량체 및 공유 결합을 형성한 후, 이량체를 하나 또는 둘의 Fc△C1 도메인을 개열하는 조건하에서 트롬빈에 노출시키며, 이러한 절두된 이량체 미니트랩은 약 5- kD-90kD의 분자량을 갖고, 부모 트랩의 것과 필적할 만한 VEGF에 대한 친화성을 갖도록 생성된다. 개열의 조건은 부분적인 개열 생성물 또는 완전한 개열 생성물의 형성을 촉진하기 위해 당업계 숙련자에 의해 제어될 수도 있는데, 상기 개열의 조건은 분자량과 같은 특이적 특성을 갖는 특정한 생성물에 대한 요구에 의해 선택된다.

특이적 구체예에서, C-영역은 CPPC 서열 (SEQ ID NO : 1)에 이르도록 Fc△C1 도메인 N-말단으로 삽입된 트롬빈 개열 부위(LVPRGS) (SEQID NO : 6)이다. CPPC 서열 (SEQ ID NO : 1)의 하나 이상의 시스테인 잔기 사이에 이량체 및 공유결합을 형성한 후, 이량체를 하나 또는 둘의 Fc△C1 도메인이 발생하는 조건하에 트롬빈을 노출시켜서 절두된 단량체 미니트랩이 생성된다. 여기서 생성된 단량체 절두된 미니트랩은 수용체 성분, 및 Fc의 작은 단편을 포함하며, 크기가 약 25 kD이고 절두된 이량체 트랩 및 완전한 길이의 부모 트렘에 비하여 감소된 VEGF에 대한 친화성을 보인다. 재조합 단백질로서 생성된 유사한 단량체 트랩은 약 1 nM의 K_D를 갖는 것으로 나타났다.

VEGF 미니트랩의 생성

한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 수용체 성분 도메인(R1R2)X 및/또는 R1R3)Y를 갖는 VEGF 미니트랩을 특징으로 하고, 이때 X ≥ 1, Y ≥ 1이며, R1, R2, 및 R3는 상기 정의되는 바와 같으며, 선택적으로, 융합 파트너는 바람직하게는 MC 도메인인데, 상기 MC 도메인은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 길이가 1 내지 약 200 아미노산인 아미노산 서열이며, 이때 적어도 하나의 시스테인 잔기는 다른 융합 폴리펩티드(cMC)의 MC에 존재하는 시스테인 잔기와 함꼐 이황화 결합을 형성할 수 있다. cMC는 융합 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서, 또는 두개의 수용체 성분 도메인 사이에서 발생할 수도 있다. 한 특이적 구체예에서, 시스테인을 VEGF 수용체 성분, 예를 들어, R1R2_C의 C-말단에 첨가시킨다. 이것은 융합 폴리펩티드가 하나의 융합 폴리펩티드의 C-말단의 시스테인 잔기와 다른 융합 폴리펩티드의 C-말단의 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합의 형성을 통하여 공유결합적 이량체를 형성하도록 한다. 이 실례에서, 미니트랩은 SEQ ID NO:2에서 나타낸 융합 폴리펩티드의 이량체이며, 이때 각각의 융합 폴리펩티드(R1R2-cMC 또는 R1R2_C)는 약 23.0 kD의 분자량을 갖는다.

다른 구체예에서, cMC는 4 아미노산(XXXX)(SEQ ID NO:11)의 서열인데, 이때 X는 어떤 아미노산이며 상기 서열은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 특이적 구체예에서, cMC를 수용체 성분 도메인의 C-말단에 첨가시킨다. 더 특이적인 구체예에서, 4 아미노산 서열은 ACGC (SEQ ID NO:4)이며 cMC는 2차 융합 폴리펩티드에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 2개의 이황화 결합을 형성한다. 하기 나타내는 바와 같이(표 2), 2개의 전형적인 미니트랩은 부모 트랩에 필저할만한 VEGF에 대한 친화성을 보인다.

치료적 사용

본 발명의 VEGF 미니트랩은 VEGF의 제거, 억제, 또는 감소에 의해 향상, 경감, 억제 또는 예방되는 어떤 질병 또는 상태를 치료하기에 치료적으로 유용하다. VEGF의 억제 또는 감소에 의해 향상된 구체적인 상태의 대략적인 리스트는

과도한 혈관 내피세포 증식, 혈관 투과성, 상처와 관련된 뇌 부종과 같은 부종 또는 염증, 발작 또는 종양; 건선 또는 관절염과 같은 염증성 질병과 관련된 부종으로서, 류마티스 관절염; 천식; 화상과 관련한 일반화 된 부종; 종양과 관련된 복수 및 늑막 삼출, 염증 또는 외상; 만성 기도 염증; 천식; 모세관 누출 증후군; 패혈증; 단백질의 증가된 누출과 관련한 신장 질병; 연령 관련 황반 변성 및 당뇨 망막증과 같은 안질환을 특징으로 하는 임상적 상태를 포함한다.

본 발명의 조성물은 증가된 VEGF 수준과 관련된 다양한 질병을 치료하기에 치료적으로 유용하다. 예를 들어, 비대해진 Th2 염증 및 기도 재형성은 천식의 발병의 특징이다(예를 들어, Elias et al.(1999) J. Clin. Invest. 104: 1001-6 참조). 상승된 VEGF 수준이 천식에 걸린 환자의 조직 및 생물학적 샘플에서 검출되었으며, 이것은 질병 활성과 직접 상호 관련되며(Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107: 1106-1108) 기도 직경 및 기도 반응성과 역으로 관련된다.

증가된 VEGF와 관련된 다른 질병은 췌장관 선암(PDAC)이다. 이 악성 종양은 종종 내피 세포 증식의 증가된 병소를 나타내고 빈번하게 VEGF를 과잉발현시킨다(Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543). PDAC는 위장 악성 종양으로 인한 사망의 20% 이상의 원인이 되는데, 그것은 미국 및 다른 산업화 국가에서 암 관련 사망의 4번째의 가장 일반적인 원인이다. 실험적 증거는 췌장암에 있어서 VEGF에 고나한 중요한 역할을 지지하며, 거기서, VEGF 억제제는 췌장 내 종양 성장 및 국소 및 말초적 전이를 약화시키기 위한 치료로서 가능성을 가진다.

E. coli에서 발현된 소규모 비글리코실화 미니트랩(실시예 4), CHO 세포에서 발현된 글리코실화 미니 트랩(실시예 5), 또는 수용체-기재 단량체 트랩 (실시예 6)은 국소 유리체/유리체 내(local/intra-vitreal) 송달을 위한 최적화된 특징, 즉, 더 신속한 청소 및 원치 않는 전신적 노출을 감소시키기 위한 더 짧은 혈청 반감기를 가진다. 또한 그것의 더 작은 크기로 인하여, 미니트랩은 눈에서 내부-한계 막(ILM)을 통하여 침투하고, 망막 질환을 치료하는데 도움이 되는 망막/망막의 내피(RPE) 층에 유리체를 통하여 확산시키는 능력을 갖는다. 또한, 미니트랩은 예를 들어, 맥락막혈관신생, 당뇨 반상 부종, 증식성 당뇨 망막증, 각막 혈관신생/이식 거부와 같은 안질환의 치료를 위해 국소 투여에 사용될 수 있다. 또한 더, 미니트랩은 VEGF의 일시적(단기간) 차단이 예를 들어, 건선의 치료에서와 같은 VEGF 봉쇄에 대한 만성 노출을 피하기 위해 요구되는 어떤 상황에서 사용될 수 있다.

녹내장 수술 이후 실패를 이끄는 심각한 문제는 초기 염증 및 엔지오제네시스(angiogenesis), 및 지나치게 적극적인 상처 치료이다. 따라서, 본 발명의 VEGF 트랩은 녹내장 수술에서 애쥬번트로서 유용하게 사용되어서 녹내장 수술 후 초기 헴-(hem-) 및 림판지오제네시스(lymphangiogenesis) 및 필터리그(filterig) 수포에 대한 대식세포 모집을 막고, 수술 결과를 향상시킨다.

조합 치료

수많은 구체예에서, VEGF 트랩은 2차 VEGF 트랩 분자, 화학요법제, 수술, 카테터 디바이스, 및 방사능을 포함하여, 하나 이상의 추가적 화합물 또는 치료법과 함께 투여될 수도 있다. 조합 치료법은 VEGF 트랩 및 하나 이상의 추가적 제제를 함유하는 단일 약학적 투약 제형의 투여; 및 그 자신의 분리 약학적 투약 제형 내에 VEGF 트랩 및 하나 이상의 추가적 제제의 투여를 포함한다. 예를 들어, VEGF 트랩 및 세포독성제제, 화학요법 제제 또는 성장 억제성 제제는 조합도니 제형과 같은 단일 투약 조성물로서 함께 환자에 투여될 수 있으며, 또는 각각의 제제는 분리 투약 제형으로 투여될 수 있다. 분리 투약 제형이 사용되는 곳에서, 본 발명의 VEGF-특이적 융합 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가적 제제가 동시에, 또는 분리된 엇갈리는 시간으로, 즉 순차적으로 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포독성 제제"는 세포의 기능을 억제 또는 예방하고 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질이다. 상기 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법 제제, 및 예를 들어, 세균, 균류, 식물 또는 동물 기원, 또는 그것의 단편의 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소를 포함하도록 의도된다.

"화학요법 제제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법 제제의 예는 예를 들어, 티오테파 및 시클로포스파미드(Cytoxan?)와 같은 알킬화 제제; 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 설폰산 알킬; 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트라테민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 염화수소산 산화물 메클로레타민, 멜팔란, 모벰비친, 페테스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드와 같은 질소 머스터드; 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로수레아; 예를 들어, 아칼시노마이신, 악티노마이신, 오티라마이신, 아제세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리체아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 칵티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 프토피로마이신, 푸로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조로비신과 같은 항생제; 예를 들어, 메토트렉사트 및 5-플루오로우라실(5-FU)와 같은 항-대사제; 예를 들어, 데도프테린, 메토트렉사트, 프테로프테린, 트리메트렉사트와 같은 포름산 유사체; 예를 들어, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 예를 들어, 클라우스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 예를 들어, 아미노글루테트이미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날제; 예를 들어, 프롤린산과 같은 포름산 공급제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락사트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴논; 엘포르니틴; 엘립티니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈리움 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스태틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK?; 라족산; 시조피란; 스피로제르마니움; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2, 2', 2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시노신; 아라비시노("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어, 파슬리탁셀(Taxol?; Aventis Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메라캅토퓨린; 메토트렉사트; 예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 위상 이성질화 효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 어떤 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 이 정의에서 항-호르몬 제제는 예를 들어, 타목시펜, 라록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미타졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY-117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항 에스트로겐제; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항 안드로겐제; 및 상기 어떤 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에서 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항 호르몬제이다.

본원에서 사용되는 경우 "성장 억제제"는 세포, 특히 시험관 내 또는 생체 내에서 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 성장 억제제의 예는 G1 정지 및 M-상 정지를 유도하는 제제와 같은, 세포 주기 진행(S 상 이외의 위치에서)을 차단하는 제제를 포함한다. 전통적인 M-상 차단제는 빈카스(빈크리시틴 및 빈블라스틴), Taxol?, 및 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신과 같은 토포 II 억제제를 포함한다. G1을 정지하는 그들 제제는 또한 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉사트, 5-플루오로우라실, 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제와 같은 S-상 정지로 넘쳐흐른다.

투여의 방법

본 발명은 본 발명의 유효량의 VEGF 트랩을 피험체에 투여하는 것을 포함하는 치료의 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 트랩은 실질적으로 정제된다(예를 들어, 그것의 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 생성하는 물질로부터 실질적으로 유리시킴). 피험체는 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람이다.

각종 송달 시스템이 공지되어 있으며 예를 들어, 리포좀 내 캡슐화, 극미립자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도사이토시스(예를 들어, Wu 및 Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 참조),레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부로서 핵산의 구성과 같은 본 발명의 제제를 투여하는데 사용될 수 있다. 도입의 방법은 장 또는 비경구적일 수 있으며 이에 한정되지는 않지만, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비내, 안내, 및 경구 루트를 포함한다. 화합물은 어떤 편리한 루트, 예를 들어, 주사 또는 볼러스 주사, 상피 또는 피부점막 내층을 통한 흡수(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)에 의해 투여될 수도 있고 기타 생물학적 활성제와 함게 투여될 수도 있다. 투여는 급성 또는 만성(예를 들어, 매일, 매주, 매월 등)이거나 또는 다른 제제와 조합될 수도 있다. 폐 투여는 또한 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화제를 이용한 제형화에 의해 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 활성제는 소포 내, 특히 리포좀 내, 억제된 방출 시스템에서, 또는 펌프에서 송달될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 활성제는 이것은 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 미국 특허 제 4,980,286호)의 사용에 의해, 직접 투여에 의해, 또는 극미립자 충격 요법, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체로의 코팅 또는 형질 감염제의 사용에 의하여, 핵산이 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 그것을 구성하고 그것이 세포내로 그것을 투여함으로써, 또는 핵에 들어가도록 공지된 호메오박스-유사 펩티드에 대하여 연결하여 그것을 투여함에 의하여 단백질을 코딩하는 핵산이다(예를 들어, Joliot et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 : 1864-1868 참조). 선택적으로, 핵산은 세포내로 도입되고 동종 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA 속으로 혼입될 수 있다.

특이적 구체예에서, 치료를 필요로 하는 부위에 국소적으로 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수도 있다; 이것은 예를 들어, 제한하지 않고서, 수술 중 국소 주입에 의해, 예를 들어 주사에 의한 국부 적용에 의해, 카테터에, 또는 이식물에 의해 달성될 수도 있는데, 이식물은 예를 들어, 시알라스틱(sialastic) 막, 섬유, 또는 상업상의 피부 대체물과 같은 막을 포함하여 삼투성, 비삼투성, 또는 젤라틴으로 된 재료이다.

본 발명의 방법을 실행하는데 유용한 조성물은 용액, 현탁액, 또는 둘 모두에 본 발명의 제제를 포함하는 액체일 수도 있다. 용어 "용액/현탁액"은 액체 조성물을 나타내며, 여기서 활성 제제의 제 1의 부분은 용액 내에 존재하고 활성 제제의 제 2의 부분은 액체 기질의 현탁액 내 미립자 형태로 존재한다. 액체 조성물은 또한 겔을 포함한다. 액체 조성물은 수성 또는 연고의 형태일 수도 있다. 또한, 조성물은 예를 들어, 눈과 눈꺼풀 사이와 같은 눈 안 또는 결막 낭 속으로 삽입될 수 있는 고체 물품의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 VEGF 트랩이 방출된다. 이러한 물품으로부터의 방출은 일반적으로 누액을 통하여 각막에서, 또는 고체 물품이 일반적으로 직접 접촉하는 각막 자체에 직접이다. 눈에서 이식을 위해 적합한 고체 물품은 일반적으로 주요하게 생체침식성 또는 비생체침식성 폴리머로 구성되어 있다. 수성 용액 및/또는 현탁액은 눈물의 형태일 수 있다. 활성 제제의 바람직한 투여는 눈으로 기지의 양의 방울을 투여함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 25㎕의 방울 부피인 1-6 방울의 투여는 25-150㎕의 조성물을 송달할 것이다.

본 발명의 방법을 실행하기에 유용한 수성 현탁액 또는 용액/현탁액은 부유제로서 하나 이상의 폴리머를 함유할 수도 있다. 유용한 폴ㄹ머는 예를 들어, 셀룰로스의 폴리머와 같은 수용성 폴리머 및 예를 들어, 교차 결합된 카르복실-함유 폴리머와 같은 불수용성 폴리머를 포함한다. 본 발명의 수성 현탁액 또는 용액/현탁액은 바람직하게는 점성 또는 점막-부착성, 또는 더욱 더 바람직하게, 점성 또는 점막부착성 모두이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법을 실행하기에 유용한 조성물은 정 위치에서 젤의 수성 조성물이다. 이러한 조성물은 눈 또는 누액과 접촉하여 젤화를 촉진하기에 유효한 농도의 응집제(gelling agent)를 포함한다. 적합한 응집제는 이에 한정되지는 않지만 열고정 폴리머를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 :정 위치에서 젤화"는 눈 또는 누액과 접촉하여 젤을 형성하는 낮은 점성의 액체를 포함할 뿐만 아니라, 눈에 투여함에 있어서 실질적으로 증가된 점성 또는 젤 단단함을 보이는 반-유체 및 요변성 젤과 같은 더 점성인 액체도 또한 포함하낟.

진단 및 스크리닝 방법

본 발명의 VEGF 트랩은 진단적으로 및/또는 스크리닝 방법에서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 트랩은 치료 효험을 평가하기 위해 임상적 연구 중에 VEGF의 수준을 모니터하는데 사용될 수도 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 예를 들어, 지나치게 높거나 지나치게 낮은 수준의 VEGF를 갖는 개체를 동정하기 위해 임상적 연구에 들어갈 개체를 스클닝하는데 사용된다. 트랩은 예를 들어, 이미징, 적절한 생리학적 샘플에서 그들의 수준을 측정하는 것, 진단적 방법 등과 같이 VEGF의 국소화 및 활성에 관한 당업계 공지된 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명의 트랩은 예를 들어, VEGF의 발현을 감소시킬 수 있는 테스트 제제를 동정하기 위한 스크리닝 방법에 있어서, 존재하는 비-결합 VEGF의 양을 정량화하기 위한 생체 내 및 시험관 내 스크리닝 분석법에서 사용될 수도 있다. 더 일반적으로, 본 발명의 트랩은 VEGF의 정량화 및/또는 단리가 바람직한 어떤 분석 또는 공정에서 사용될 수도 있다.

약학적 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 VEGF 미니트랩을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 미니트랩, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 용어 "약학적으로 허용가능한"은 동물, 및 더 특히 사람에서 사용을 위하여 연방 또는 주 정부의 조절국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에서 열거되 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료상 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 약학적 담체는 땅콩 오일, 대두유, 광유, 참깨 오일 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성적 기원의 것을 포함하는, 물 및 오일과 같은 살균 액체일 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 녹말, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 엿기름, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 활석, 염화 나트륨, 건조 찌끼 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 바람직하다면, 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences"by E. W. Martin]에서 설명되어 있다.

본 발명의 VEGF 미니트랩은 중성 또는 염 형태로서 제형될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노 기와 함께 형성된 것, 및 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 카르복실 기와 함께 형성된 것을 포함한다.

추가적으로 더욱, 본 발명의 방법을 실행하기에 유용한 수성 조성물은 안과적 친화성의 pH 및 삼투압을 갖는다. 하나 이상의 안과적으로 허용가능한 pH 조절제 및/또는 완충제가 예를 들어 아세트산, 붕산, 구연산, 젖산, 인산 및 염산과 같은 산; 예를 들어, 수산화 나트륨, 인산 나트륨, 보론산 나트륨, 구연산 나트륨, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨과 같은 염기; 및 예를 들어, 구연산염/덱스트로스, 중탄산 나트륨 및 염화암모늄과 같은 완충제를 포함하여 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 산, 염기, 및 완충제는 안과적으로 허용가능한 범위 내에 조성물의 pH를 유지시키기 위해 필요한 양으로 포함된다. 하나 이상의 안과적으로 허용가능한 염은 안과적으로 허용가능한 범위로 조성물의 삼투압을 이르게 하기에 충분한 양으로 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 염화물, 구연산염, 아스코르브산염, 보론산염, 인산염, 중탄산염, 황산염, 티오황산염, 중아황산염 음이온을 갖는 것을 포함한다.

트랩의 의도된 치료적 사용을 위해 유효한 트랩의 양은 본 명세서를 기초로 한 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 분석법은 선택적으로 시각적 투약 범위를 동정하도록 돕는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 정맥 내 투여를 위해 적당한 투약 범위는 일반적으로 1 킬로그램 체중 당 약 50-5000 마이크로그램의 활성화합물이다. 비내 투여를 위해 적당한 투약 범위는 일반적으로 1 mg/kg 체중에 대하여 약 0.01 pg/kg 체중이다. 효과적인 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도된 투여량-반응 곡선으로부터 추정될 수도 있다.

전신적 투여를 위해, 치료적으로 유효한 투여량은 시험관 내 분석법으로부터 초기에 평가될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 세포 배양에서 결정되는 바와 같은 IC₅₀을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형될 수 있다. 이러한 정보는 사람 내 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 초기 투여량은 또한 당업계 주지되어 있는 기술을 이용하여, 생체 내 데이타, 예를 들어 동물 모델로부터 평가될 수 이다. 당업자는 용이하게 동물 데이타를 기재로 하여 사람에 대한 투여를 최적화할 수 있다.

투여량 및 간격은 치료적 효과를 유지하기에 충분한 화합물의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조절될 수도 있다. 국소적 투여 또는 선택적인 흡수의 경우에 있어서, 화합물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도에 관련되지 않을 수도 있다. 당업자는 과도한 실험을 하지 않고서 치료적으로 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.

물론, 투여되는 화합물은 양은 치료되는 피험체, 피험체의 중량, 고통의 심각도, 투여의 방식, 및 처방하는 의사의 판단에 의존적일 것이다. 치료법은 증상이 검출가능한 동안 또는 그들이 검출가능하지 않은 경우에 조차도 간헐적으로 반복될 수도 있다. 치료법은 단독으로 또는 다른 약물과 함께 제공될 수도 있다.

세포 형질감염 및 유전자 치료법

본 발명은 시험관 내 및 생체 내 세포의 형질감염을 위한 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 사용을 포함한다. 이들 8핵산은 표적 세포 및 개체의 형질감염을 위해 어던 많은 주지된 벡터로 삽입될 수 있다. 핵산은 벡터 및 표적 세포의 상호작용을 통하여, 생체 외 및 생체 내에서 세포로 형질감염된다. 조성물은 치료적 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로 피험체에 투여된다(예를 들어, 근육 내 주사에 의해). 이를 완수하기 위해 적당한 양은 "치료적으로 효과적인 투여량 도는 양"으로서 정의된다.

다른 양태에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하는 사람 또는 기타 동물 내 VEGF 수준을 감소시키는 방법을 제공하는데, 이때 핵산은 융합 폴리펩티드 또는 미니트랩을 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 사람 질병의 치료 또는 예방에 있어서 유전자 치료 공정을 위해, 예를 들어, 문헌 [Van Brunt(1998) Biotechnology 6:1149-1154]를 참조하시오.

키트

본 발명은 또한 패키징 물질 및 패키징 물질 내 함유된 약학 제제를 포함하는 물품을 제공하며, 이때 약학 제제는 본 발명의 2 이상의 융합 폴리펩티드로 이루어진 적어도 하나의 VEGF 트랩을 포함하며, 이때 패키징 물질는 VEGF-특이적 융합 폴리펩티드가 VEGF-매개 질병 또는 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다.

유전자변환 동물

본 발명은 본 발명의 트랩을 발현시키는 유전자변환의 사람이 아닌 동물을 포함ㅎ나다. 유전자변환 동물은 예를 들어, 미량주사, 레트로바이러스 주사에 의해 핵산을 수정된 난모세포의 수컷 전핵속으로 도입하여, 난모세포가 가임신 암컷 육성 동물로 발전하도록 함으로써 생산될 수 있다. 발현 벡터에 유용한 어떤 조절 또는 기타 서열은 유전자변환 서열의 일부를 형성할 수 있다. 조직-특이적 조절 서열(들)은 특정 세포에 대한 변환유전자의 발현을 지시하도록 하는 변환유전자에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 미니트랩을 발현시키는 유전자변환의 사람이 아닌 동물은 이러한 융합 폴리펩티들르 생산하는 방법을 포함하여, 각종 적용에 있어서 유용하다. 또한, 변환유전자는 융합 폴리펩티드 또는 미니트랩의 발현이 예를 들어, 소분자의 투여에 의해 억제되는 유도성 프로모터의 억제하에 위치도리 수도 있다.

특이적 구체예

하기 설명되는 실험에서, 작은 VEGF 트랩을 생성하였고 VEGF에 결합하는 그들의 능력을 조사하였다. 이러한 미니트랩은 바람직하게는 특이적 적용에서 사용한다. 예를 들어, 특정 상태 또는 질병은 바람직하게는 전신적 투여보다는, 특정 기관, 조직, 또는 세포에 VEGF 트랩을 국소 투여하여 치료될 수도 있다. 본 발명의 미니트랩의 한 실례에서, 작은 VEGF 트랩은 Fc 도메인에서 발생된 개열 영역(C-영역)을 포함하는 이량체화 VEGF 트랩의 지시된 개열에 의해 생성되었다(실시예 2). 절두된 트랩은 완전한 크기의 부모 트랩과 필적할 만한 VEGF에 대한 친화성 및 반감기를 보였다. 실시예 3-5는 VEGF 수용체 성분 및 하나 또는 둘의 시스테인 잔기로 이루어진 다량체화 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드의 구성을 설명한다. 친화성 측정은 E. Coli에서 발현된 비글리코실화 융합 폴리펩티드 또는 CHO 세포에서 발현된 글리코실화 폴리펩티드가 완전한 크기의 부모 트랩과 필적할만한 VEGF에 대한 결합 친화성을 가졌음을 보여주었다. 실시예 6은 (R1R2)₂로 이루어진 VEGF에 결합하고 억제할 수 있는 단량체 VEGF 트랩을 예시한다. 실시예 7은 완전한 길이 트랩(SEQ ID NO:10)에 필적할 만한 VEGF에 대한 높은 친화성 결합을 보이는 VEGF 미니트랩(SEQ ID NO:26)의 구성을 설명한다.

본 발명의 기타의 특징들은 본 발명의 예시로서 제공되며 그것을 제한하고자 의도되지 않는 전형적인 구체예의 하기 설명중에 분명해질 것이다.

하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하도록 제시되며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 범주를 한정하려는 것은 아니다. 사용된 수치(예컨대, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 보장하려고 노력하였지만, 약간의 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 지적하지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고, 압력은 거의 대기압이다.

실시예 1. Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)의 구성

모체 VEGF 트랩, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO: 7-8), VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO: 9-10) 및 Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO: 12-13)의 구성은 PCT 공보 WO/0075319호에 상세하게 기재되어 있으며, 본 명세서에서 그 전체를 참고 인용한다. 또한, WO/0075319호에는 VEGF 트랩을 암호화하는 핵산 구성물의 구성 및 발현 방법, VEGF에 결합하는 VEGF 트랩의 검출 및 측정 방법, BIAcore 분석에 의해 결합하는 VEGF의 화학량론 결정 방법 및 약동학적 분석도 기재되어 있다.

실시예 2. 트롬빈 개열 이량체 VEGF 미니트랩

VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO: 9-10) 구성물은 Fc 도메인의 CPPC(SEQ ID NO: 1) 다음에 트롬빈 개열을 삽입함으로써 변성하였다. 정제된 VEGF 트랩(5 ㎍)을 20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂ 중의 트롬빈(Novagen)으로 16 시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다. 콘트롤은 개열 콘트롤 단백질(CCP) 및 트롬빈없이 항온 처리된 모체 VEGF 트랩 단백질을 포함하였다. SDS-PAGE 분석(Tris-글리신 4 내지 20% 겔; 레인 당 5 ㎍ 단백질)로 정확한 개열을 검증하였다(결과는 나타내지 않음).

친화도 결정. 각각의 VEGF 트랩의 hVEGF165에 대한 결합의 Kd를, 모체 VEGF 트랩, 트롬빈 개열 부위를 함유하는 미개열 VEGF 트랩("미개열 VEGF 트랩"), 개열된 VEGF 미니트랩 및 재조합 단량체 R1R2-myc myc his에 대하여 WO/0075319호에 기재된 바와 같이 결정하였다. 보다 구체적으로, VEGF₁₆₅ 의존성 수용체 인산화를 차단하는 트랩의 능력은 1차 사람 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 측정하였다. VEGF₁₆₅를 테스트 트랩의 여러 가지 농도의 존재 하에 항온 처리하고, 혼합물을 HUVEC에 가하여 VEGFR2의 티로신 인산화를 시뮬레이션하였다. VEGF 트랩의 부화학량론적 농도에서, 미결합 VEGF는 수용체 인산화를 유도한다. 그러나, VEGF 트랩 대 리간드의 더 큰 1:1 몰비에서, 수용체 시그널링의 완전한 차단이 관찰되었으며, 이는 트랩 이량체의 단일 분자가 사람 VEGF₁₆₅의 단일 분자를 차단할 수 있음을 입증하는 것이다. 따라서, VEGF 트랩의 VEGF에 대한 고 결합 친화도는 VEGF가 세포 표면 수용체와 상호작용하는 것을 방지하는 복합체의 형성을 초래한다. 동일한 결과가 모체 VEGF 트랩, 미개열 VEGF 트랩 및 개열된 VEGF 미니트랩에 대한 동일한 인산화 억제 실험에 대하여 얻어졌다. 결과는 표 1에 나타낸다.

트랩	동력학적 해리 속도(1/s)	T_1/2(시간)
모체 VEGF 트랩	5.51 x 10^-5 ± 0.94%	3.5
미개열 VEGF 트랩	4.93 x 10^-5 ± 0.94%	3.9
개열된 VEGF 미니트랩	5.46 x 10^-5 ± 0.94%	3.53
R1R2-myc myc his 단량체	6.74 x 10^-5 ± 0.94%	0.028

실시예 3. VEGF 미니트랩을 암호화하는 플라스미드의 구성

VEGF 미니트랩을, 세 개의 아미노산 글리신-알라닌-프롤린이 Flk1 D3과 FcΔC1(a) 간의 링커 역할을 하는, 모체 VEGF 트랩의 전구체, VEGFR1R2.FcΔC1(a)로부터 구성하였다. 이 플라스미드, pTE115를 VEGF 미니트랩의 구성에 사용하였는데, 그 이유는 링커 DNA 서열이 VEGF 트랩 공작으로 촉진하는 Srf I 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함하기 때문이다. 모든 다른 양태에서, pTE115에 의해 암호화된 VEGF 트랩은 PCT 공보 WO/0075319호에 상세하게 기재된 VEGF 트랩, VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO: 9-10)의 것과 동일하다.

플라스미드 pTE517은 pTE115 DNA를 Srf I 및 Not I으로 분해하여 발생된 690 bp 단편을 제거하고, 올리고 R1R2NC(SEQ ID NO: 14) 및 R1R2CC(SEQ ID NO: 15)의 어닐링에 의해 형성된 합성 DNA 단편을 삽입함으로써 이루어졌다. 생성된 플라스미드는 R1R2_C를 암호화하는데, 이는 Flt1D2.Flk1D3 도메인, 이어서 시스테인 잔기(SEQ ID NO: 23)로 구성되어 있다. 유사하게, 플라스미드 pTE518은 pTE115 DNA를 Srf I 및 Not I으로 분해하여 발생된 690 bp 단편을 제거한 후, 올리고 R1R2NACGC(SEQ ID NO: 16) 및 R1R2CACGC(SEQ ID NO: 17)의 어닐링에 의해 형성된 합성 DNA 단편으로 결찰함으로써 이루어졌다. 생성된 플라스미드는 R1R2_ACGC를 암호화하는데, 이는 Flt1D2.Flk1D3 도메인, 이어서 아미노산 ACGC(SEQ ID NO: 25)로 구성되어 있다.

또한, 플라스미드는 이. 콜리에게서 이러한 미니트랩이 발현하도록 구성되었다. 프라이머 R1R2N-Ncol(SEQ ID NO: 18) 및 R1R2CNot1(SEQ ID NO: 19)을 사용하여 모체 VEGF 트랩에 관하여 아미노산 G30 내지 K231을 암호화하는 pTE115로부터 유래하는 DNA 단편(SEQ ID NO: 10)을 증폭시켰다. 이 서열의 증폭은 5' 단부에서 개시 메티오닌 코돈의 융합 및 3' 단부에서 시스테인에 대한 코돈, 이어서 중지 코돈의 융합(SEQ ID NO: 2)을 가져왔다. 그 다음, 이 DNA 단편을 이. 콜리 발현 플라스미드 pRG663의 NcoI 및 Not I 부위로 클로닝하여 pRG1102를 얻어서 R1R2_C의 발현이 파지 T7 Φ1.1 프로모터로부터의 전사에 의존하도록 하였다. pRG1102로부터 유전자 발현을 유도하면, 이. 콜리 숙주 균주 RFJ238의 세포질 내에 R1R2cys가 축적된다. 유사하게, 프라이머 R1R2N-Ncol(SEQ ID NO: 18) 및 R1R2ACGC-Not1(SEQ ID NO: 20)을 사용하여 아미노산 G30 내지 K231을 암호화하는 pTE115로부터 유래하는 DNA 단편(SEQ ID NO: 10)을 증폭시킴으로써 5' 단부에서 개시 메티오닌 코돈의 융합 및 3' 단부에서 ACGC(SEQ ID NO: 4)에 대한 코돈, 이어서 중지 코돈의 융합(SEQ ID NO: 2)을 가져왔다. 그 다음, 이 단편은 이. 콜리 발현 플라스미드 pRG663의 NcoI 및 Not I 부위로 클로닝하여 pRG1103을 얻어서 R1R2_ACGC의 발현이 파지 T7 Φ1.1 프로모터로부터의 전사에 의존하도록 하였다. 유전자 발현을 pRG1102 및 pRG1103으로부터 유도하면, 이. 콜리 숙주 균주 RFJ238의 세포질 내에 각각 R1R2_C 또는 R1R2_ACGC가 축적된다.

실시예 4. 이. 콜리로부터의 VEGF 미니트랩의 정제 및 특성화

R1R2_C 및 R1R2_ACGC를 이. 콜리 내 세포질 단백질로서 발현하고, 동일한 방법에 의해 정제하였다. 이. 콜리 K12 숙주 RFJ238 내에서 pRG1102 또는 pRG1103에 대한 파지 T7 Φ1.1을 유도하면, 세포질 내에 단백질이 축적된다. 유도 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 50 Mm Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM EDTA에 재현탁하였으며, Niro-Soavi 세포 균질기에 통과시켜 용해시켰다. 봉입체를 원심분리에 의하여 용해된 세포로부터 수집하고, 증류 H2O로 1회 세척한 다음, 8 M 구아니디늄-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 100 mM 아황산나트륨, 10 mM 나트륨 테트라티오네이트에 용해시켰으며, 실온에서 16 시간 동안 항온 처리하였다. 정화된 상청액을, 6 M 구아니디늄-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5로 평형화된 S300 컬럼 상에서 분별하였다. R1R2_C를 함유하는 분획을 풀링하고, 6 M 우레아, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5로 투석하였다. 투석된 단백질을 2 M 우레아, 50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 2 mM 시스테인으로 희석한 다음, 7 일 동안 4℃에서 서서히 교반하였다. 재폴딩된 단백질을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5로 투석한 다음, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5로 평형화된 SP-세포로스 컬럼에 로딩하고, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 중에서 0에서 1 M의 NaCl 구배로 용출하였다. R1R2_C를 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하였으며, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl로 평형화된 Superdex 200 컬럼에 로딩하였다. 미니트랩 이량체를 함유하는 분획을 수집하고, 풀링하였다. 정제된 미니트랩의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 약 46 kD인 것으로 평가되었다.

BIAcore 어세이를 수행하여(WO/0075319호에 기재된 바와 같음) VEGF에 대한 트랩 친화도를 결정하였으며, 결과는 R1R2_C 및 R1R2_ACGC 미니트랩이 전체 길이 VEGF 트랩에 필적할 만한 VEGF 친화도를 가진 것으로 나타났다(표 2).

트랩	동력학적 해리 속도(1/s)	T_1/2(시간)
VEGF 트랩	4.23 x 10^-5	4.53
R1R2C	3.39 x 10^-5	5.68
R1R2ACGC	3.41 x 10^-5	5.65

실시예 5. CHO K1 내 VEGF 미니트랩의 발현

pTE517 및 pTE518에 의해 암호화된 VEGF 미니트랩의 발현은 사람 CMV-MIE 프로모터로부터의 전사에 의존하며, CHO 세포에서 발현될 때 미니트랩이 배양 배지로 분비된다. CHO K1에서 분비된 단백질로서 발현된 경우, 양 미니트랩이 상태조절된 배지에서 발견되었으며, SDS-PAGE에 의한 그 분자량의 평가는, 예상대로 단백질이 글리코실화되었음을 시사한다. 또한, SDS-PAGE에 의한 분석은 미니트랩이 C 말단 시스테인(들) 간의 분자내 이황화물(들)에 의하여 안정화된 단독이량체 분자를 형성할 수 있었음을 가리킨다. 구체적으로, R1R2_C 미니트랩은 CHO 세포 내에서 분비된 단백질로서 발현된 경우, 공유 이량체를 효율적으로 형성하였다.

실시예 6. 단쇄 VEGF 미니트랩의 구성 및 발현

다량체화 도메인(SEQ ID NO: 24)을 요하지 않는 VEGF 미니트랩도 구성하였다. 이 미니트랩은 탠덤 수용체 도메인(SEQ ID NO: 24의 아미노산 232-233) 간의 Gly-Pro 링커로 한 Flt1D2.Flk1D3 도메인(R1R2)(SEQ ID NO: 24의 아미노산 30-231)의 제2 Flt1D2.Flk1D3 도메인(R1R2)(SEQ ID NO: 24의 아미노산 234-435)으로의 직접 융합에 의해 구성하였다.

탠덤 Flt1D2.Flk1D3 도메인을 암호화하는 유전자를 구성하기 위하여, pTE115에서 발견되는 Flt1D2.Flk1D3 도메인 암호화 DNA로 DNA 상동을 최소화하는 한 Flt1D2.Flk1D3을 암호화하는 DNA 단편을 합성하였다(Blue Heron Biotechnology). 이 합성 DNA 단편을 Srf I-Not I 단편으로서 pTE115의 Srf I-Not I 부위로 클로닝하여 pTE570을 얻었는데, 이는 CMV-MIE 프로모터로부터 R1R2-R1R2 VEGF 미니트랩을 발현하였다. 이 플라스미드를 CHO K1 세포에 트랜스팩션할 경우, R1R2-R1R2 VEGF 미니트랩이 배양 배지에 축적된다.

실시예 7. VEGF 미니트랩의 구성 및 발현

VEGF 미니트랩을, CPPC에서 종결하는 C 말단 9 아미노산 서열로 한 Flt1D2.Flk1D3 도메인(R1R2)(SEQ ID NO: 26의 아미노산 30-231)의 직접 융합에 의하여 전술한 바와 같이 구성하였다. 이 플라스미드가 CHO K1 세포로 트랜스팩션될 경우, SEQ ID NO: 26의 VEGF 미니트랩이 배양 배지로 분비된다. 비환원 SDS-PAGE 전기영동뿐만 아니라, 본질적 광 산란 분석에 의한 후속 정제로 분자량이 대략 64 kDa인 트랩 분자를 확인하였다. 이 분자량은 공유 이량체가 SEQ ID NO: 26의 두 융합 폴리펩티드 사이에 형성되었음을 가리킨다. 유사한 실험을 SEQ ID NO: 27 및 28의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드로 수행하였으며, 유사하게 단독이량체 트랩을 형성한 이들 분자를 나타내었다. SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 26의 이량체로 구성된 EGF 트랩에 결합하는 사람 VEGF-165에 대한 친화도 결정은 표 3에 나타낸다.

VEGF 트랩	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
SEQ ID NO: 10	2.73 x 10⁺⁷	1.79 x 10^-5	6.55 x 10^-13
SEQ ID NO: 26	2.00 x 10⁺⁷	6.56 x 10^-6	3.28 x 10^-13
SEQ ID NO: 26	2.61 x 10⁺⁷	5.77 x 10^-6	2.21 x 10^-13

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> VEGF Traps and Therapeutic Uses Thereof <130> RGE 710D2 <140> To Be Assigned <141> 2004-06-29 <150> 10/609,775 <151> 2003-06-30 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Cys Pro Pro Cys 1 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 1 5 10 15 His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser 20 25 30 Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile 50 55 60 Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Gln Thr Asn Thr 85 90 95 Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val 100 105 110 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 115 120 125 Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys 130 135 140 Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 145 150 155 160 Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln 165 170 175 Gly Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 180 185 190 Phe Val Arg Val His Glu Lys Cys 195 200 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> Xaa = Any AMino Acid <400> 3 Xaa Cys Xaa Cys 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Ala Cys Gly Cys 1 <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 1 5 10 15 His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser 20 25 30 Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile 50 55 60 Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Gln Thr Asn Thr 85 90 95 Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val 100 105 110 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 115 120 125 Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys 130 135 140 Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 145 150 155 160 Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln 165 170 175 Gly Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 180 185 190 Phe Val Arg Val His Glu Lys Ala Cys Gly Cys 195 200 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 1453 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc cccgggcgag ctcgaattcg 60 caaccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg ctcagctgtc 120 tgcttctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc 180 ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac 240 ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300 gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360 ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420 atcgacaaac caatacaatc atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat 480 ctgttggaga aaagcttgtc ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg 540 acttcaactg ggaataccct tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc 600 taaaaaccca gtctgggagt gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg 660 taacccggag tgaccaagga ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga 720 agaacagcac atttgtcagg gtccatgaaa agggcccggg cgacaaaact cacacatgcc 780 caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 840 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 900 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 960 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1020 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1080 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 1140 aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 1200 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 1260 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1320 atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 1380 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 1440 aatgagcggc cgc 1453 <210> 8 <211> 458 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu 20 25 30 Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu 50 55 60 Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile 65 70 75 80 Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu 85 90 95 Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys 100 105 110 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val 115 120 125 Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val 130 135 140 Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn 145 150 155 160 Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg 165 170 175 Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr 180 185 190 Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys 195 200 205 Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg 210 215 220 Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 9 <211> 1377 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 9 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttccggaag tgataccggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc 120 cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca 180 cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240 cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300 gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca 360 catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420 tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480 gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540 ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600 gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660 aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1377 <210> 10 <211> 458 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 11 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 12 <211> 1444 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 12 aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc cccgggcgag ctcgaattcg 60 caaccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg ctcagctgtc 120 tgcttctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc 180 ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac 240 ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300 gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360 ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420 atcgacaaac caatacaatc atagatatcc agctgttgcc caggaagtcg ctggagctgc 480 tggtagggga gaagctggtc ctcaactgca ccgtgtgggc tgagtttaac tcaggtgtca 540 cctttgactg ggactaccca gggaagcagg cagagcgggg taagtgggtg cccgagcgac 600 gctcccaaca gacccacaca gaactctcca gcatcctgac catccacaac gtcagccagc 660 acgacctggg ctcgtatgtg tgcaaggcca acaacggcat ccagcgattt cgggagagca 720 ccgaggtcat tgtgcatgaa aatggcccgg gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140 ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc 1320 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 1380 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgagcgg 1440 ccgc 1444 <210> 13 <211> 455 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu 20 25 30 Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu 50 55 60 Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile 65 70 75 80 Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu 85 90 95 Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys 100 105 110 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Ile Gln 115 120 125 Leu Leu Pro Arg Lys Ser Leu Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val 130 135 140 Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala Glu Phe Asn Ser Gly Val Thr Phe Asp 145 150 155 160 Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro Glu 165 170 175 Arg Arg Ser Gln Gln Thr His Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Ile 180 185 190 His Asn Val Ser Gln His Asp Leu Gly Ser Tyr Val Cys Lys Ala Asn 195 200 205 Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg Glu Ser Thr Glu Val Ile Val His Glu 210 215 220 Asn Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 14 gggctgttga gagagagaga gagc 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 15 ggccgctctc tctctctctc aacagccc 28 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 16 gggcgcatgc ggttgttgag agc 23 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 17 ggccgctctc aacaaccgca tgcgccc 27 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 18 gagagagacc atgggtagac ctttcgtaga gatgta 36 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 19 agagaggcgg ccgctttatc aacacttttc atggaccctg acaaatgt 48 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 20 agagaggcgg ccgctttatc aacaaccgca tgccttttca tggaccctga caaatgt 57 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 21 agttccggaa gtgccatggg tagacctttc gtagagatg 39 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 22 agagaggcgg ccgctgttat cacttctcgt gcacgcgcac gaag 44 <210> 23 <211> 235 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 23 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Arg Asp Leu Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Cys 225 230 235 <210> 24 <211> 435 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 24 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Arg Pro Phe Val Glu Met 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu 245 250 255 Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys 260 265 270 Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp 275 280 285 Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile 290 295 300 Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr 305 310 315 320 Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu 325 330 335 Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu 340 345 350 Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp 355 360 365 Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp 370 375 380 Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu 385 390 395 400 Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala 405 410 415 Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val 420 425 430 His Glu Lys 435 <210> 25 <211> 238 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 25 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asn Thr Leu Ile Pro Asn Gly Lys 65 70 75 80 Ala Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Ala Cys Gly Cys 225 230 235 <210> 26 <211> 240 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 26 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 <210> 27 <211> 240 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 27 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys 225 230 235 240 <210> 28 <211> 237 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 28 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys 225 230 235 <210> 29 <211> 434 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Glu Ser Lys 195 200 205 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 210 215 220 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 225 230 235 240 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 245 250 255 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 260 265 270 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 290 295 300 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 305 310 315 320 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 325 330 335 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 340 345 350 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 355 360 365 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 370 375 380 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 385 390 395 400 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 405 410 415 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 420 425 430 Gly Lys

Claims

성분(R1R2)_X 또는 (R1R3)_Y 및 융합 파트너(FP)로 구성되며, X ≥ 1, Y ≥ 1이고, R1은 Flt-1의 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 수용체 성분 Ig 도메인 2이며, R2는 Flk-1의 Ig 도메인 3이고, R3은 Flt-4의 Ig 도메인 3인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 융합 파트너(FP)는 다른 다량체화 성분(MC)과 상호작용하여 다량체 구조를 형성할 수 있는 다량체화 성분(MC)인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제2항에 있어서, MC는 (i) 개열 가능한 영역(C 영역)을 포함하는 다량체화 성분, (ii) 절두 다량체화 성분, (iii) 1 이상의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 200 아미노산 길이의 아미노산 서열, (iv) 루신 지퍼, (v) 나선형 루프 모티프, (vi) 코일-코일 모티프 및 (vii) 면역글로불린 도메인으로 구성된 군 중에서 선택되는 분리된 핵산 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 암호화된 융합 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, 형질전환된 숙주 세포에 유용한 복제 가능한 발현 벡터.
적당한 발현 시스템에 제6항의 발현 벡터를 도입하는 단계 및 VEGF 융합 폴리펩티드의 발현을 수행하는 단계를 포함하는, VEGF 융합 폴리펩티드의 제조 방법.
제4항의 융합 폴리펩티드가 2 이상인 다량체를 포함하는, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 트랩.
제8항에 있어서, 이량체인 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩.
SEQ ID NO: 26, 27 또는 28의아미노산 서열을 포함하는 2 개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 이량체 VEGF 트랩.
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수용체 성분(R1R2)_X 또는 (R1R3)_Y 및 다른 다량체화 성분(MC)과 상호작용하여 다량체 구조를 형성할 수 있는 다량체화 성분(MC)으로 구성되며, X ≥ 1, Y ≥ 1이고, R1은 Flt-1의 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 수용체 성분 Ig 도메인 2이며, R2는 Flk-1의 Ig 도메인 3이고, R3은 Flt-4의 Ig 도메인 3이고, 다량체화 성분(MC)은 (i) 개열 가능한 영역(C 영역)을 포함하는 MC, (ii) 절두 다량체화 성분, (iii) 1 이상의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 200 아미노산 길이의 아미노산 서열, (iv) 루신 지퍼, (v) 나선형 루프 모티프, (vi) 코일-코일 모티프 및 (vii) 면역글로불린 도메인으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제15항에 있어서, 수용체 성분은 (R1R2)_X이고, 다량체화 성분은 1 이상의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 200 아미노산 길이의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제16항에 있어서, 수용체 성분은 R1R2이고, X는 1이며, 다량체화 성분은 1 내지 2 개의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 15 아미노산 길이의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 암호화된 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
제18항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
수용체 성분(R1R2)_X 또는 (R1R3)_Y 및 다른 다량체화 성분(MC)과 상호작용하여 다량체 구조를 형성할 수 있는 다량체화 성분(MC)으로 구성되며, X ≥ 1, Y ≥ 1이고, R1은 Flt-1의 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 수용체 성분 Ig 도메인 2이며, R2는 Flk-1의 Ig 도메인 3이고, R3은 Flt-4의 Ig 도메인 3이고, 다량체화 성분(MC)은 (i) 개열 가능한 영역(C 영역)을 포함하는 MC, (ii) 절두 다량체화 성분, (iii) 1 이상의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 200 아미노산 길이의 아미노산 서열, (iv) 루신 지퍼, (v) 나선형 루프 모티프, (vi) 코일-코일 모티프 및 (vii) 면역글로불린 도메인으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
제20항에 있어서, 수용체 성분은 (R1R2)_X이고, 다량체화 성분은 1 이상의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 200 아미노산 길이의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
제21항에 있어서, 수용체 성분은 R1R2이고, X는 1이며, 다량체화 성분은 1 내지 2 개의 시스테인 잔기를 가진 1 내지 15 아미노산 길이의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드 중 2 개로 구성된 이량체 VEGF 트랩.
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